CN102851352A - 一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子检测领域，具体地，本发明涉及一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法。根据本发明的新型荧光实时定量检测miRNA的方法包括，所述方法利用miRNA、通用引物和特异性引物进行荧光定量PCR扩增1)设计靶标miRNA的特异性引物，包括直链和茎环引物，以及通用引物；2)以miRNA提供碱基堆积力，帮助特异性引物和通用引物结合，利用DNA聚合酶延伸特异性引物；3)以上述延伸的DNA链为模板继续延伸通用引物；4)根据荧光定量PCR结果判断检测样品中是否含有靶标miRNA。本发明的方法在整个操作过程中既无需反转录过程，也无需荧光标记探针，且操作简单，因此可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，适用于早期诊断和临床检测。

Description

一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体地，本发明涉及一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类长度在22个核苷酸(nt)左右的内源性非编码小分子单链RNA。越来越多的相关研究也同样清楚地显示miRNAs表达与多种人类恶性肿瘤相关，提示miRNAs代表着一种新型癌症生物标记信号。

成熟miRNA片段小，没有poly(A)尾巴，家族成员之间如let-7等通常只有一至少数几个碱基的差别，并且在细胞中的表达水平普遍较低，这些特性给miRNA定量检测方法的建立带来了困难和挑战。尽管如此，科研工作者还是开发出多种检测miRNA的方法，如Northern blotting，微阵列法，以及基于酶扩增的方法如基于PCR反应的检测方法，基于滚环扩增(Rolling Circle Amplification，)的检测方法，基于连接酶反应的方法，恒温指数扩增。Northern blot是验证和确认miRNA的重要方法，但该方法繁琐并且灵敏度较低，不适用于临床样本的高通量检测。芯片技术(microarray)检测方法可以实现快速、高通量的检测。目前已有多种类型的miRNA检测芯片可以选用。但是基因芯片检测方法的重现性和准确性比较差，一般多用于初筛，对获得的结果通常需要采用Northern blot和实时定量PCR进行验证。基于滚环扩增、连接酶反应和恒温指数扩增是近几年兴起的检测方法。也具有较好的灵敏度和特异性。在这些方法中，荧光定量PCR方法无疑是目前检测miRNA表达的最常用方法。常规的荧光定量检测方法中有基于茎-环的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)以及基于polyA加尾的RT-PCR方法。stem-loop RT-PCR的反转引物是由可以自身呈环茎状的特异序列+6到8个miRNA3’端反向互补碱基组成。polyA加尾的RT-PCR的反转引物由特异序列+(T)20左右+兼并碱基V或VN组成。所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的RT引物。这两种方法虽然有较好的灵敏度高和特异性，但仍有不足。对于stem-loop RT-PCR，一条miRNA特异对应一个茎环状结构的反转引物，因此在检测多种miRNA时，需要对该样品进行多次反转。而对于polyA加尾的RT-PCR方法，则需要在反转录前进行末端Poly(A)加尾。由于这两组方法需要多次的反转或加尾，使得这两种方法操作复杂且费用昂贵。因此获得高效，简单，以及经济适用的检测miRNA方法仍然需要分析专业研究者的进一步研究和开发。

碱基堆积杂交(Base Stacking Hybridization，BSH)是指当2条或多条连续的寡核苷酸链与一条长的互补的单链DNA或RNA杂交后，这些短的寡核苷酸链可以获得额外的稳定性。Mirzabekov′s实验室最早提出了碱基堆积杂交技术，他们把微阵列固定于凝胶上，并主要应用于杂交测序。2001年，他们课题组通过检测堆积杂交形成双链后熔解温度的提高，从而来检测堆积杂交的作用。Maldonado-Rodriguez等人把这项技术应用于单碱基突变位点的检测。Rangel-Lopez等人基于堆积作用发展了一种寡核苷酸阵列，用以检测TP53基因的9个突变位点。他们的结果显示用这种方法可以很特异的在多种DNA来源的样品中鉴定出TP53基因常见的突变位点。

鉴于miRNA在生物检测和医学临床上重要的应用价值，本发明利用miRNA的碱基堆积力帮助两条只有少数几个碱基配对的引物互补，在PCR的热循环下，互补的两条引物相互延伸，而无目标miRNA则由于在退火温度下无法稳定结合，因而难以发生扩增反应。整个实验过程，可以通过荧光信号积累实时监测，达到定量检测的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法。

根据本发明的新型荧光实时定量检测miRNA的方法，该方法，利用miRNA、通用引物和特异性引物进行荧光定量PCR扩增，其中

1)设计靶标miRNA的通用引物和特异性引物，其中特异性引物包括直链和茎环引物；

2)以miRNA提供碱基堆积力，帮助特异性引物和通用引物结合，利用DNA聚合酶延伸特异性引物；

3)以上述延伸的DNA链为模板继续延伸通用引物；

4)根据荧光定量PCR结果判断检测样品中是否含有靶标miRNA。

根据本发明的miRNA的荧光定量PCR的方法，可以根据所检测的靶标miRNA设计特异性直链引物或茎环引物，然后结合通用引物进行荧光定量扩增。

如图1所示，在进行PCR扩增时，所述直链或茎环引物首先与miRNA退火杂交，然后直链或茎环引物再与通用引物杂交，并完成第一链的合成，进而以第一链为模板合成第二链。

根据本发明的方法，所述通用引物可与所有miRNA特异性的直链引物或颈环引物反应。通用引物长度一般为15～60bp，可以人工设计序列并合成。在设计上该通用引物的3′端与特异直链或茎环引物有少数几个(4-7)碱基互补。5′端的序列可在避免与特异性的直链引物或颈环引物在其他区域上互补或通用引物自身的二级结构上自由设计。5′端引物的设计有一定程度的随机性。

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。根据本发明的方法，使用荧光染料可包括SYBR GREEN、ResoLight、LCGreen与EverGreen等荧光染料。也可使用荧光标记的引物如Taqman，荧光引物等。

根据本发明的方法，由于不完全互补的序列提供的碱基堆积力要远远弱于完全互补的序列，尤其是在碱基堆积的端头上，仅单个碱基的错配也会强烈的影响PCR的反应效率。因此用该方法可以很好的区分少数几个或单碱基错配。本发明利用miRNA的碱基堆积力帮助两条只有少数几个碱基配对的引物互补，在PCR的热循环下，互补的两条引物相互延伸，而无目标miRNA则由于在退火温度下无法稳定结合，因而难以发生扩增反应。

碱基堆积原理应用于miRNA的荧光定量检测的巧妙之处在于并非传统的PCR方法扩增模板，而是利用miRNA的帮助使得只有少数碱基互补的两条引物的相互扩增从而达到检测的目的。

根据本发明的实施例，通过检测标准样品来确定本发明的方法的灵敏度和特异性。在本发明中，通过检测稀释成不同浓度的miRNA标准品测定该方法的灵敏度；检测特异性主要包括两个方面a)miRNA成熟体与前体的区分；b)miRNA基因家族的区分。

在本发明的实施例中，还使用本发明的方法检测细胞、组织以及体液中的miRNA，最后通过对比传统现有定量检测miRNA方法的结果，发现本发明的方法可以检测500ng级别的样品(灵敏度)、以及区分单碱基差异的序列(特异性)。

在本发明的实施例中，将本发明的方法用于细胞、组织以及体液中miRNA的检测，并比较正常芯片、传统荧光检测方法以及本发明的方法的一致性，系统评估该方法的应用范围。

本发明的方法在整个操作过程中既无需反转录过程，也无需荧光标记探针，且操作简单，因此可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，适用于早期诊断和临床检测。此外，本项目的成功实施也可广泛的应用于生物等其它领域，具有广阔的应用前景和显著的经济与社会效益。

附图说明

图1本发明的方法的原理图。

图2为分析本发明的荧光实时定量PCR的灵敏度的结果图。

图3为利用本发明的方法区分miRNA基因家族的结果图。

图4为显示本发明的荧光实时定量PCR检测miRNA前体和成熟体的结果图。

图5为使用本发明的方法分析正常细胞和肿瘤细胞中miRNA表达的结果图。

具体实施方式

实施例1分析本发明的荧光实时定量PCR的灵敏度

灵敏度分析：采用本发明的方法检测梯度稀释的let-7d miRNA，引物序列如下：

特异性引物   5′-AACTATGCAACCTACTACCTCTAGCGA-3′

通用引物     5′-CAGAGACAGACACATACTCGCT-3′

let-7d       5′-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGU-3′

荧光定量PCR反应体系：

25μL PCR反应体系包括：12.5μL 2×RT-PCR Master Mix；1.2μM通用引物；1.2μM特异性引物；1μL目标miRNA

荧光定量PCR反应条件：

使用仪器ROCHR 480

反应程序

95℃  3分钟，

95℃10秒；55℃10秒；72℃10秒；40个循环

72℃延伸5分钟

实验结果表明本方法检测范围较宽(见图2)，能达5个数量级(5amol to 500fmol.)，且有较好的线性关系(R²＝0.995)，能准确的定量。

实施例2特异性分析

miRNA基因家族的区分

miRNA中有许多家族，而家族中的成员通常序列非常相近，有些甚至为单碱基的区别，如le-7家族(表1)，这些成员中let-7f与let-7a仅相差1个碱基；

le-7家族4个成员的序列：

let-7a    5′-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3′

let-7b    5′-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3′

let-7d    5′-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3′

let-7f    5′-UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU-3′

设计特异性引物以及通用引物序列：

Let-7f    5′-AACTATACAATCTACTACCTCAAGCGA-3′

Let-7a    5′-AACTATACAACCTACTACCTCAAGCGA-3′

Let-7b    5′-AACCACACAACCTACTACCTCAAGCGA-3′

Let-7d    5′-AACTATGCAACCTACTACCTCTAGCGA-3′

通用引物  5′-CAGAGACAGACACATACTCGCT-3′

荧光定量PCR反应体系：

25μL PCR反应体系包括：12.5μL 2×RT-PCR Master Mix；12μM通用引物；12μM特异性引物；1μL目标miRNA

荧光定量PCR反应条件：

使用仪器ROCHR 480

反应程序

95℃，3分钟，

95℃10秒；55℃10秒；72℃10秒；40个循环

72℃延伸5分钟

当设定完全匹配的效率为100％时，当碱基错配的效率仅为1.27％，而两个碱基左右错配的效率则更低(结果如图3所示)。根据以上结果表明本发明的方法有着非常好的特异性。

实施例3用本发明的方法区别miRNA前体和成熟体

成熟体与前体miRNA的序列：

mir-21     5′-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3′

           5′-UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACAC

Pre-mir-21 CAGUCGAUGGGCUGUCUGACA-3′

设计特异性引物以及通用引物序列：

mir-21      5′-AACTATACAACCTACTACCTCA AGCGA-3′

通用引物    5′-CAGAGACAGACACATACTCGCT-3′

荧光定量PCR反应体系：

25μL PCR反应体系包括：12.5μL 2×RT-PCR Master Mix；1.2μM通用引物；1.2μM特异性引物；1μL目标miRNA

荧光定量PCR反应条件：

使用仪器ROCHR 480

反应程序

95℃，3分钟，

95℃10秒；55℃10秒；72℃10秒；40个循环

72℃延伸5分钟

结果如图4所示，本发明的方法能清楚的区分miRNA的前体和成熟体。

实施例4用本方法评估分析正常细胞和肿瘤细胞中miRNA表达分析

拟选取人体肺癌细胞A549以及正常的肺成纤维细胞HLF作为研究对象，分析其miRNA表达的差异。

1)细胞的培养以及RNA的提取：细胞根据其生长不同需求，采用各自适宜的方式培养。在其生长状态最佳时，采用Trizol法提取总RNA

2)选择多组miRNA为研究对象：mir21，mir 29b，mir-23a，let-7，let7f

3)采用ROCHE Lightcyler 480荧光定量PCR仪高通量(384孔板)检测miRNA在不同细胞系中的表达谱，并以U6为内参。

设计特异性引物以及通用引物序列

mir-23a    5′-GGAAATCCCTGGCAATGTGATAGCGA-3′

mir-29b    5′-AACACTGATTTCAAArGGTGCTAAGCGA-3′

106a       5′-CTACCTGCACTGTAAGCACTTTTAGCGA-3′

Let-7b     5′-AACCACACAACCTACTACCTCAAGCGA-3′

Let-7f    5′-AACTATACAATCTACTACCTCAAGCGA-3′

U6-1      5′-TGTGCTGCCGAAGCGAGCACAGCGA-3′

通用引物  5′-CAGAGACAGACACATACACGCT-3′

荧光定量PCR反应体系：

25μL PCR反应体系包括：12.5μL 2×RT-PCR Master Mix；1.2μM通用引物；1.2μM特异性引物；200ng总RNA

荧光定量PCR反应条件：

使用仪器ROCHR 480

反应程序

95℃，3分钟，

95℃ 10秒；55℃10秒；72℃10秒；40个循环

72℃延伸5分钟

这个miRNA表达谱的分析与芯片以及其它文献报道中的趋势是一致的(见图5)，表明这种与其它方法具有一致性。

Claims (3)

1.一种新型检测miRNA荧光定量PCR方法，其特征在于，利用miRNA、通用引物和特异性引物进行荧光定量PCR扩增，其中，

1)设计靶标miRNA的通用引物和特异性引物，其中特异性引物包括直链和茎环引物；

2)以miRNA提供碱基堆积力，帮助特异性引物和通用引物结合，利用DNA聚合酶延伸特异性引物；

3)以上述延伸的DNA链为模板继续延伸通用引物；

4)根据荧光定量PCR结果判断检测样品中是否含有靶标miRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述miRNA为成熟miRNA或miRNA前体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述miRNA为来自同一基因家族的miRNA。

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