CN102925577B - 一种微小rna实时定量pcr检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微小RNA实时定量PCR检测方法及其应用。本发明通过设计与靶miRNA3’端序列互补的逆转录引物进行逆转录反应得到cDNA序列，然后设计第一正向引物进行overlapPCR反应，cDNA序列被延伸；最后，延伸的逆转录产物通过传统的TaqManPCR进行扩增、定量。该检测方法在低、中、高三个不同模板RNA浓度水平的批内、批间重复性较好，而且检测方法灵敏。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种微小RNA（MicroRNAs）实时定量PCR（聚合酶链式反应）检测的方法及其应用。
背景技术
MicroRNAs
(miRNAs)是进化上高度保守的长度约为22个核苷酸的小RNA，能以序列特异方式下调转录后的基因表达。多数miRNAs基因在核内先由RNA多聚酶II转录成pri-microRNA 转录本；然后pri-microRNA 在核内被核糖核酸酶Drosha
和DGCR8加工处理，而最终成为长度约为70个核苷酸的茎环RNA（pre-microRNA）；pre-microRNA 随后被核输出蛋白exportin
5 转运入胞质，接着被第二个核糖核酸酶Dicer 消化为21~25nt 的RNA二聚体，其中一条5’端有未配对碱基的RNA链为成熟miRNA，另一条RNA链则被降解。成熟miRNA可以结合RISC成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced
silencing complex，miRISC），miRISC与靶标mRNA 互补配对，从而调控mRNA 靶基因的表达。
由于microRNAs 在众多程序的调控，诸如生物发育、细胞增殖和凋亡以及近来被证明与肿瘤发生相关等领域发挥作用，因此microRNAs
的定性和定量研究成为迅速发展的一大研究领域。目前用于microRNAs检测的方法主要有以下几种：（1）Northern
blotting，主要用于对克隆或生物信息学分析得到的microRNAs进行验证和确认，其主要缺点是灵敏度低且不能进行高通量检测；（2）定性RT-PCR，一般定性RT-PCR主要用于microRNA前体的检测，但是由于microRNAs 分子序列较小，仅20nt 左右，一般定性RT-PCR很难获得理想的实验结果；（3）基因芯片技术，可以同时对多个microRNAs 分子进行高通量分析，但是其突出的弱点是其信息质量的稳定性和可重复性较差；（4）定量RT-PCR，既可以用于microRNA前体的检测，也可用于成熟microRNA的检测，可以用于对基因芯片识别的差异表达microRNAs进行验证和确认。已知的microRNA定量RT-PCR检测方法按照设计原理的不同又可以分为以下几类：①长引物延伸RT-PCR：该方法的主要特点是设计长引物进行逆转录反应。其主要缺点是特异性较差；②加poly(A)尾RT-PCR：该方法需要先通过poly(A)聚合酶在microRNA3’端加上poly(A)尾，然后通过oligo dT偶联引物进行逆转录反应，其缺点主要是增加了加poly(A)尾反应步骤，实验可能受到的干扰因素相应增加，此外，由于其使用SYBR Green染料结合方法进行定量，因此需要严格进行条件优化，避免非特异性扩增造成的非特异性；③stem-loop引物（茎环引物）定量RT-PCR：该方法的基本原理是先用茎环引物进行逆转录反应，而后应用microRNA特异的引物进行传统的TaqMan定量PCR反应，根据标准曲线对待测标本的目标microRNA进行定量。其主要特点是茎环引物设计，大大提高了方法学的特异性。其弱点是合成茎环引物的价格较高。
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺陷和不足创造性地发明了一种微小RNA（MicroRNAs）实时定量PCR检测方法。该检测方法在高、中、低三个不同模板RNA浓度水平的批内、批间重复性较好，而且检测方法灵敏。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种微小RNA实时定量PCR检测方法，包括如下步骤：
（1）设计与靶microRNA3’端互补的引物，进行逆转录反应，得到cDNA；
（2）设计第一正向引物与cDNA5’端部分序列进行杂交，进行Overlap PCR反应，得到5’端延长有外源DNA序列的双链DNA产物；
（3）设计第二正向引物、特异的探针和反向引物，进行荧光定量PCR反应；
其中步骤（2）中所述第一正向引物长40～50bp,其3’端前15～20个碱基序列与靶microRNA5’端互补；
步骤（3）中设计的特异的探针序列位于靶microRNA经逆转录得到的cDNA与外源DNA序列连接部位。
在优选实施例中，步骤（1）中所述逆转录引物长22～28bp,其3’端前6～8个碱基序列与靶microRNA3’端互补。
在优选实施例中，步骤（1）中所述逆转录引物与步骤（3）中设计的用于荧光定量PCR反应的反向引物序列相同。
在优选实施例中，步骤（2）中所述第一正向引物长45bp,其3’端前15个碱基序列与靶microRNA5’端互补。
在优选实施例中，步骤（3）中所述第二正向引物长18～25bp。
在优选实施例中，步骤（3）中所述特异的探针标记有荧光基团。
在优选实施例中，步骤（3）中所述特异的探针为特异的TaqMan MGB探针。
与现有技术相比，本发明提供的一种微小RNA实时定量PCR检测新方法，具有如下有益效果：
（1）方法的线性范围和敏感性
以miR499定量为例，合成的miR499标准品在1.0x10־4amol/μl (相当于6.0 x 101 copies /f反应) ~ 1.0x106amol/μl (相当于6.0 x1011 copies/反应)浓度范围内呈现良好的线性关系（见图2 A）。标准曲线的斜率（Slope）为-3.69，R2 =0.999（见图2 B）。
（2）方法的重复性 以miR499定量为例，在高、中、低三个不同浓度水平的批内、批间重复性试验中，批内CV不超过3.0%，批间CV不超过3.5%（见表1）。表明该方法具有较好的重复性。
附图说明
图1本发明对miRNAs进行实时定量PCR检测的技术路线图（该方法包括逆转录反应（RT），overlap PCR及定量PCR反应. 首先，逆转录引物与miRNA 分子的3’ 端部分序列杂交，在逆转录酶的作用下，miRNA被逆转录成cDNA；然后，经过overlap PCR反应cDNA被延伸；最后，延伸的逆转录产物通过传统的TaqMan
PCR进行扩增、定量。逆转录引物与定量PCR反应中反向引物相同）
图2 本发明的检测范围与敏感性，图2A为miR499的扩增曲线； 图2B为miR499的标准曲线
具体实施方式
下面结合附图和实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
一．材料：
合成的寡核苷酸miRNA和所有引物购自于中国大连宝生物工程有限公司；
TaqMan探针购自于上海基康生物技术有限公司；
血液样本是从广东总医院的17个住院患者和8个志愿者中采集到的；
试验中所用到的所有序列都罗列在表2中；
二．方法
1．引物的设计
1.1分别设计与Has-miR-499和Cel-miR-39的3’端互补的逆转录引物，引物序列见表2，用于Has-miR-499和Cel-miR-39的逆转录反应，得到各自的cDNA。
1.2设计第一正向引物与Has-miR-499和Cel-miR-39各自的cDNA5’端部分序列进行杂交，引物序列见表2，进行Overlap PCR反应，得到各自延长的双链DNA产物。
1.3各自设计用于荧光定量PCR（Real-time PCR）的第二正向引物、特异的探针和反向引物，其序列见表2。
2．RNA的制备
按照miRNeasy serum/plasma kit 提取试剂盒中的提取方法提取血浆中的总RNA。具体地，总RNA是从200μL的血浆中纯化出来，最后溶解在12 μL的无RNase水中。合成的秀丽隐杆线虫的miRNAs（cel-miR-39）作为标准qRT-PCR试验材料的内参基因。
3．逆转录反应
反应体系：首先，将5 μL 的 RNA, 2μL 的miR499特异的逆转录引物 (10 μM)，2μL 的miR39特异的逆转录引物 (10 μM), 和1μL 10 mM dNTP 混合，将混合物在65℃加热5分钟，冰上诱导2分钟。然后向混合物中加入2 μL 10x First-Strand Buffer, 4μL 25 mM MgCL2，2 μL 0.1 M DTT, 1μL
RNaseOUT™ Recombinant RNase Inhibitor, 1μL SuperScript™ III
RT (200 units/μl)。
反应条件：首先，16 ℃反应30分钟；然后，（30℃ 30秒，42℃ 30秒，50 ℃ 1秒）55个循环；最后，70 ℃加热 15分钟。
4．荧光定量PCR（Real-time PCR）
Has-miR-499和Cel-miR-39按下列反应体系和反应条件分别进行荧光定量PCR反应：
20 μl 的PCR反应体系含有2.0 μl的逆转录反应产物，1x Premix ExTaq buffer (Takara, Dalian)，0.2 μM TaqMan 探针，0.02 μM 第一正向引物，0.6 μM 第二正向引物 和0.4 μM 反向引物。
将上述反应体系在96孔板中95℃诱导反应30秒，然后，（95℃ 15秒，60℃ 30秒）55个循环。根据合成的miRNA 499的标准曲线将得到的TaqMan CT值转换成相对拷贝数。
5．统计学分析
Log miR-499值以mean±SD的形式表示。用单因素方差分析（ANOVA）来比较各组的miR-499的平均值。然后再利用最小显著性差异t检验（LSD-t）对任意两组数据进行显著性差异分析。P值小于0.05表示两组数据有显著性差异。所有的统计学分析都是用SPSS
11.0软件（SPSS, Chicago, IL, USA）完成的。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省人民医院
<120> 一种微小RNA实时定量PCR检测方法及其应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> miRNA-499逆转录引物
<400> 1
gagccgatgc atcttagtta
aacat
25
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> mRNA-499第一正向引物
<400> 2
gtcctacgac gatcgccaag catgccctag ttaagacttg
cagtg
45
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> mRNA-499第二正向引物
<400> 3
gtcctacgac
gatcgccaag
20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> mRNA-499反向引物
<400> 4
gagccgatgc atcttagtta
aacat
25
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> mRNA-499Taqman探针
<400> 5
atgccctagt taagacttg
19
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 合成的mRNA-499
<400> 6
uuaagacuug cagugauguu
u
21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> mRNA-39逆转录引物
<400> 7
cgagccgatg catcttagta
ttacc
25
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> mRNA-39第一正向引物
<400> 8
cgtcctacga cgatcgccaa gcatgcccta gagctgattt
cgtctt
46
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> mRNA-39第二正向引物
<400> 9
gtcctacgac
gatcgccaag
20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> mRNA-39反向引物
<400> 10
cgagccgatg catcttagta
ttacc
25
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> mRNA-39Taqman探针
<400> 11
atgccctaga
gctgatt
17
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> 合成的mRNA-39
<400> 12
agcugauuuc gucuugguaa
ua
22
Claims (5)
1.一种微小RNA实时定量PCR非诊断性检测方法，包括如下步骤：
（1）设计与靶microRNA3’端互补的引物，进行逆转录反应，得到cDNA；
（2）设计第一正向引物与cDNA5’端部分序列进行杂交，进行Overlap PCR反应，得到5’端延长有外源DNA序列的双链DNA产物；
（3）设计第二正向引物、特异的探针和反向引物，进行荧光定量PCR反应；
其中步骤（2）中所述第一正向引物长40～50bp,其3’端前15～20个碱基序列与靶microRNA5’端互补；
步骤（1）中所述逆转录引物长22～28bp，其3’端前6～8个碱基序列与靶microRNA3’端互补；
步骤（3）中设计的特异的探针序列位于靶microRNA经逆转录得到的cDNA与外源DNA序列连接部位；所述特异的探针为特异的TaqMan MGB探针。
2.如权利要求1所述一种微小RNA实时定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于步骤（1）中所述逆转录引物与步骤（3）中设计的用于荧光定量PCR反应的反向引物序列相同。
3.如权利要求1所述一种微小RNA实时定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于步骤（2）中所述第一正向引物长45bp,其3’端前15个碱基序列与靶microRNA5’端互补。
4.如权利要求1所述一种微小RNA实时定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于步骤（3）中所述第二正向引物长18～25bp。
5.如权利要求1所述一种微小RNA实时定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于步骤（2）所述overlap PCR和步骤（3）所述Real-time PCR可以在同一反应中进行。
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