CN100999765A - 以微小核糖核酸的变化鉴定结肠癌化程度的生物芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以微小核糖核酸的特异性变化鉴定结肠病变癌化程度的生物芯片。本发明需要解决的问题是确定一套最精简的探针库，以降低生物芯片的制作成本和简化生物芯片的制作工序。本发明的技术方案为用生物芯片和定量PCR将结肠病变中发生明显且稳定变化的那部分微小核糖核酸筛选出来，将其作为探针点制在芯片上，就制成了专门用于检测结肠癌病变的生物芯片。此芯片可以提高结肠癌的早期发现率，帮组诊断和治疗，把癌症的确诊和治疗推上一个新的台阶。
Description
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以微小核糖核酸的特异性变化鉴定结肠病变癌化程度的生物芯片。
二、背景技术
微小核糖核酸，英文名为microRNA，简写作miRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中，目前已在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸。微小核糖核酸可识别靶mRNA的3’端非翻译序列，与之不完全互补，从而抑制靶mRNA的翻译。
微小核糖核酸与动物的许多正常的生理活动相关，如生长发育、脂肪代谢等等。同时，微小核糖核酸也与癌症的发生及发展存在千丝万缕的联系，在发生某总癌症时总有一些微小核糖核酸的表达量是上调的，一些是下调的，上调的微小核糖核酸起到了原癌基因的作用，它诱导癌症的发生，反之，下调的微小核糖核酸则起到了肿瘤抑制因子的作用。微小核糖核酸与癌症的关联有两个层面：首先，微小核糖核酸是癌症的因，这是因为有些肿瘤抑制因子以及原癌基因是微小核糖核酸的靶位点，若微小核糖核酸这类调控因子本身发生了功能性紊乱，本来抑制原癌基因的微小核糖核酸表达量降低了，而抑制肿瘤抑制因子的微小核糖核酸表达量却升高了，那么其最终结果就是导致了下游一系列蛋白表达量的变化以及某一条调控通路的整体混乱，进而诱发肿瘤生成；其次，微小核糖核酸是癌症的果，由于癌症的发生，导致了染色体片段的丢失和基因的突变，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的下降。所以，微小核糖核酸完全可以作为一种新的肿瘤标志物，其在癌症中发生的特异性变化，可以帮助判断结肠病变是否有癌化的可能，以及帮助判断已癌化的组织癌化的程度，同时由于发生变化的是一系列的微小核糖核酸，所以用其对癌症进行鉴定比单一使用甲胎蛋白、癌胚抗原等传统手段更加准确。所以，对微小核糖核酸的深入研究将使我们更清楚地了解癌症的发生和发展，对微小核糖核酸的进一步探索将为我们提供诊疗癌症的新途径，把微小核糖核酸应用于癌症的诊断和治疗将是很有前景和效益的。我们可以大胆展望，微小核糖核酸将揭开癌症诊断治疗领域的新篇章。
结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，发病率很高。近几年随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，随着人们生活方式及膳食结构的改变，结肠癌的发病率呈逐年升高的趋势，已由10年前占恶性肿瘤的第6位上升到目前的第4位，仅次于胃癌、肝癌、食管癌，而且我国结肠癌的发病年龄还比国外提早了12～18年，值得注意。结肠癌的发病原因与结肠腺瘤、息肉病、慢性炎症病变有一定关系，同时结肠癌也与饮食结构有密切关系，致癌物质食入过多将导致癌症发生，故结肠癌的发生是遗传和环境因素长期相互作用的结果。
结肠癌是由结肠粘膜的病变(非典型增长腺瘤等)演变而来，研究表明，结肠癌的形成可能需要10年的时间，仅从内镜下可辨认的腺瘤发展成侵袭性癌就需要5年左右的时间。虽然结肠癌的形成时间长，但由于目前现有的检查方法的局限性，所发现的病例仍多属于中晚期肿瘤，使其术后五年生存率仍徘徊在50％左右。早期的结肠癌是可以治愈的，而进展期的结肠癌则预后较差，术后五年生存率低，因此，早期发现、早期诊断是改善结肠癌预后的关键，如何提高结肠癌的早期诊断率是一个急需解决的问题。
实际上目前临床大多数病例都不能得到早期诊断及治疗，结肠癌的误诊率相当高，有资料显示，临床误诊率可达46.3％，这是因为结肠癌早期表现缺乏特异性，甚至无明显症状，即使出现症状也常常与肠结核、溃疡性结肠炎、克隆氏病、慢性痢疾等常见肠道疾病相混淆，这是造成误诊的基本原因。结肠肿瘤常常会被误认为是结肠息肉，这与结肠息肉临床表现常与结肠肿瘤相似，有时甚至合并存在有关。
鉴于结肠癌发病趋势的增高以及其早期发现与诊断的困难，我们亟待找到一种比目前现有方法都更准确可靠同时又简单易行的新方法来鉴定结肠病变是否发生癌化及判断其癌化程度，因此，我们选取结肠癌作为研究对象，从微小核糖核酸的特异性变化这一新角度出发区分良性息肉与恶性肿瘤，预测结肠病变发展成癌症的风险度，建立一种更敏感更精确的在早期确诊结肠癌的全新技术。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是制备一种将微小核糖核酸的特异性变化应用于鉴定结肠癌化程度的生物芯片，以提高结肠癌的早期发现率以及确诊的准确性。
本发明的技术方案为：用生物芯片和定量PCR技术检测所有的微小核糖核酸在发生结肠癌时的变化趋势及变化量，将发生明显且稳定变化的那部分微小核糖核酸筛选出来，将其的反向互补序列作为探针点在芯片上，就制成了专门用于检测结肠癌病变的生物芯片。
本发明与原有鉴定结肠病变是否癌化及其癌化程度的技术相比，其优势在于：一、结果更准确。以若干微小核糖核酸分子的特殊变化预测结肠病变是否癌化，就好比是用一系列与癌症息息相关的基因的特殊改变来预测病变是否癌化，这从根本上探寻了癌症发生的分子生物学机制，从病源上把问题交待清楚，同时由于其监控的不是单一分子的变化，而是一整个网络的变化，所以其预测的结果更可信，更有说服力。二、简单易行，成本低廉。现我国的生物芯片技术正处在蓬勃发展的时期，已建成了一套成熟的检测微小核糖核酸的变化的生物芯片技术，同时此芯片相对普通生物芯片来说，将待检测的基因由成千上万个减少到几十个，也就是仅仅检测几十个微小核糖核酸的变化，大大减少了探针的制作成本，简化了制作工艺，使芯片的制作耗费降到很低，易制备。三、输出的结果简单明了。分析芯片结果不再是一件庞杂费力的工作，不再需要从大量的变化基因中找规律，做聚类分析等等，此芯片仅仅是比对选定的几十条微小核糖核酸发生的变化与预测的变化是否吻合而已，吻合度高即代表检测的临床样本癌化的风险高，操作简易。
四、附图说明
附图1为在发生癌变时上调的微小核糖核酸的定量PCR的实验结果。
附图2为在发生癌变时下调的微小核糖核酸的定量PCR的实验结果。
五、具体实施方式
1、微小核糖核酸的生物芯片实验
为了筛选稳定可信的微小核糖核酸探针，我们做了微小核糖核酸的生物芯片实验，该芯片包含人全部四百多个成熟体微小核糖核酸的探针，把这些探针用芯片点样仪SmartArrayTM点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括作为内标的U6、tRNA，人工制备的30个碱基长度的外标，Hex作为点样阳性对照，50％DMSO作为杂交阴性对照。整个点阵分成4个亚阵，每个亚阵有23行，21列，点间距为185μm，点的直径约为130μm，每条探针重复三次。
具体实验流程为：(1)组织块总RNA的提取：Trizol法提取结肠癌组织及正常组织的总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检总RNA的质量；(2)将六组结肠癌组织标本(tumor sample，简写作T)的总RNA等量混合，得到平均化的结肠癌组总RNA，将六组相对正常的癌旁组织标本(normal adjacent tissue，简写作N)的总RNA也等量混合，得到平均化的正常组总RNA；(3)微小核糖核酸的分离：取50-100μg总RNA用Ambion′s miRNA Isolation Kit(Cat#.1560)分离微小核糖核酸；(4)微小核糖核酸样品的荧光标记：利用T4RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(5)杂交与清洗：将RNA溶于16μL杂交液中(15％甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt′s solution)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4分钟，而后在0.2×SSC液体中室温洗4分钟，玻片甩干后即可用于扫描；(6)芯片扫描：芯片用LuxScan10K/A双通道激光扫描仪进行扫描；(7)数据提取及分析：采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因。
图像信号转化为数字信号并进行分析后得到的癌组织相对正常组织微小核糖核酸的变化量见下表。
生物芯片检测结肠病变样本癌组织相对正常组织微小核糖核酸的变化量
| 微小核糖核酸名称(上调) | 综合评分 | 变化倍数(癌/正常) |
| miR-31 | 31.1772899395189 | 51.9179027753709 |
| miR-155 | 6.47984986818203 | 3.66721223762161 |
| miR-203 | 6.26919805802025 | 2.61880219056673 |
| miR-34a | 6.09226275727596 | 3.40743636535029 |
| miR-25 | 4.98032938269073 | 1.8372761759202 |
| miR-222 | 4.79715264546871 | 2.775032949772 |
| miR-221 | 4.76681380404434 | 1.73244248351121 |
| miR-128a | 4.65764301352366 | 1.59206304070421 |
| miR-29a | 4.38908493673786 | 2.58958016270704 |
| miR-181b | 4.31969052333274 | 1.98864132877861 |
| miR-17-5p | 3.84766866070164 | 2.1948033545366 |
| miR-92 | 3.43505859290688 | 1.80434099550044 |
| miR-223 | 3.42 194385375966 | 1.50356043555949 |
| miR-19a | 3.1 6384063246763 | 1.3590071417769 |
| miR-106a | 3.05103082285629 | 2.46186523014489 |
| miR-106b | 2.87687275420222 | 1.2981177430767 |
| miR-16 | 2.84515029864272 | 2.15895563100562 |
| miR-21 | 2.83896558155507 | 1.35957121061334 |
| miR-10a | 2.61164076494228 | 3.21678054194732 |
| miR-191 | 2.5497256262678 | 2.0459648478663 |
| miR-107 | 2.38618266340398 | 1.22640475983746 |
| miR-141 | 2.28998266862534 | 2.17889404591765 |
| miR-103 | 1.9410664554669 | 1.86400951845713 |
| miR-200b | 1.74739278498845 | 1.59470948444168 |
| miR-20a | 1.70478488694712 | 1.29143754935691 |
| miR-24 | 1.51522334575966 | 1.39976835818285 |
| miR-93 | 0.870107659471557 | 1.45306842282405 |
| 微小核糖核酸名称(下调) | 综合评分 | 变化倍数(癌/正常) |
| miR-133a | -62.0308640782906 | 0.00856207879778562 |
| miR-133b | -33.1509114255849 | 0.0089913714116837 |
| miR-100 | -18.7519937350413 | 0.143327322345713 |
| miR-218 | -17.1143372993863 | 0.133863284747246 |
| miR-193a | -16.5077560264779 | 0.219150221977717 |
| miR-195 | -1 3.0270775065465 | 0.272404162556979 |
| miR-193b | -10.4107771538493 | 0.0738354516668593 |
| miR-143 | -8.49881231052578 | 0.550094789655016 |
| miR-152 | -6.84452510353768 | 0.196010507205681 |
| miR-30a-3p | -6.30995622190576 | 0.167244638388308 |
| miR-30d | -6.26273590482157 | 0.650965686869857 |
| miR-149 | -4.64260851904218 | 0.107664824557025 |
| miR-130a | -4.4943568772766 | 0.50093032604531 |
| miR-125a | -4.48952073289789 | 0.520645698616905 |
| miR-139 | -3.97854425322536 | 0.233864832864205 |
| let-7e | -3.95384026225459 | 0.361927685446765 |
| miR-125b | -3.06007046926795 | 0.59262909799707 |
| miR-145 | -1.55942938457732 | 0.761004275635288 |
| miR-30a-5p | -1.22120339281236 | 0.807243937920843 |
2、适用于结肠癌诊断的探针
综合考虑微小核糖核酸在结肠癌组织及正常组织的表达量和差异程度，选定以下一部分微小核糖核酸作为预测结肠病变是否发生癌变以及诊断结肠病变癌化程度的探针：anti-miR-10a、anti-miR-10b、anti-miR-16、anti-miR-17-5p、anti-miR-19a、anti-miR-20a、anti-miR-21、anti-miR-24、anti-miR-25、anti-miR-29a、anti-miR-29b、anti-miR-31、anti-miR-34a、anti-miR-92、anti-miR-93、anti-miR-103、anti-miR-106a、anti-miR-106b、anti-miR-107、anti-miR-128a、anti-miR-128b、anti-miR-141、anti-miR-155、anti-miR-181a、anti-miR-181b、anti-miR-191、anti-miR-200b、anti-miR-203、anti-miR-205、anti-miR-221、anti-miR-222、anti-miR-223用于检测在发生结肠癌时上调的微小核糖核酸，共32条；而anti-miR-7、anti-miR-26a、anti-miR-30a-3p、anti-miR-30a-5p、anti-miR-30d、anti-miR-100、anti-miR-125a、anti-miR-125b、anti-miR-130a、anti-miR-130b、anti-miR-133a、anti-miR-133b、anti-miR-136、anti-miR-138、anti-miR-139、anti-miR-143、anti-miR-144、anti-miR-145、anti-miR-149、anti-miR-152、anti-miR-192、anti-miR-193a、anti-miR-193b、anti-miR-194、anti-miR-195、anti-miR-212、anti-miR-215、anti-miR-218、anti-let-7a、anti-let-7b、anti-let-7c、anti-let-7e、anti-let-7g用于检测下调的微小核糖核酸，共33条。其中“anti”表示探针序列与微小核糖核酸序列反向互补。
3、微小核糖核酸的定量PCR
为验证选出的探针是准确可靠的，进行了微小核糖核酸的定量PCR。将结肠癌组织标本(tumor sample，简写作T)与与之同源的相对正常的癌旁组织标本(normal adjacent tissue，简写作N)设为同一组，比较在组内进行，共设了六组标本进行比较。具体步骤为：(1)提取癌组织标本和正常组织标本的总RNA，使用的试剂是TRIzol reagent(invitrogen)；(2)将总RNA分离纯化至200bp以下，使用的试剂盒为mirVanaTM miRNA Isolation(Ambion，Cat#1560)；(3)逆转录：取小分子RNA0.5μg，加入4μl5×AMV buffer，2μl10mM each dNTP mixture(Takara)，0.5μl RNase Inhibitor(Takara)，2μlAMV(Takara)以及4μl基因特异性反向引物，加DEPC-H20补足至20μl，16℃孵育15min，42℃反应60min以进行逆转录，85℃孵育5min使AMV酶失活；(4)定量PCR：将cDNA按1/50稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μl Taq酶(Takara)，0.2μl10μM正向引物，0.2μl10μM反向引物，1.2μl25mM MgCl2，1.6μl2.5mM each dNTP mixture(Takara)，2μl10×PCR buffer，1μlSYBR Green I，12.5μl H2O，20μl体系进行PCR，仪器使用的是ABI Prism 7000荧光定量PCR仪(Appied Biosystems)，PCR的反应条件是：95℃5min进行1个循环→95℃15sec，60℃1min进行40个循环，同时在定量PCR反应结束后要测定溶解曲线(Dissociation Curve)以检验产物纯度。数据处理方法使用的是ΔΔCT法，CT设为反应达到域值(threshold)时的循环数，则每个miRNA相对于标准内参U6的表达量可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT＝CTmiRNA-CTU6。
具体实验结果见附图1及附图2。由附图1可知：癌组织miRNA的量/正常组织miRNA的量＞1的微小核糖核酸，即在发生结肠癌时表达量上升的微小核糖核酸有36种：miR-10a(*)、miR-10b、miR-16(**)、miR-17-5p(*)、miR-19a(*)、miR-20(*)、miR-21(*)、miR-24、miR-25、miR-27a、miR-29a、miR-29b、miR-31(**)、miR-34a(*)、miR-92、miR-93(*)、miR-103(**)、miR-106a(*)、miR-106b、miR-107、miR-126*、miR-128a、miR-128b、miR-132、miR-141、miR-155、miR-181a(**)、miR-181b(*)、miR-189、miR-191、miR-200b(*)、miR-203(**)、miR-205(*)、miR-221、miR-222(*)、miR-223(*)；癌组织miRNA的量/正常组织miRNA的量＜1的微小核糖核酸，即在发生结肠癌时表达量下降的微小核糖核酸有37种：miR-7(**)、miR-9、miR-26a(**)、miR-30a-3p(**)、miR-30a-5p(**)、miR-30c、miR-30d(**)、miR-100(**)、miR-125a(**)、miR-125b(**)、miR-126(**)、miR-130a(**)、miR-130b(**)、miR-133a(**)、miR-133b(*)、miR-136(**)、miR-137、miR-138(*)、miR-139(*)、miR-143(**)、miR-144(**)、miR-145(**)、miR-149(**)、miR-152(**)、miR-192(**)、miR-193a(**)、miR-193b(**)、miR-194(**)、miR-195(**)、miR-212(**)、miR-215(**)、miR-218(**)、let-7a(**)、let-7b(**)、let-7c(**)、let-7e(**)、let-7g(**)。其中“*”代表p值小于0.05有显著性差异，“**”代表p值小于0.01有极其显著性差异。
由实验结果可知选定的探针是稳定可靠的，定量PCR做出的微小核糖核酸的变化趋势与芯片做出的结果基本一致，所以用这部分微小核糖核酸制成的探针可以很好的预测结肠病变发生癌化的趋势。
4、专门用于诊断结肠病变癌化程度的微小核糖核酸芯片的制作
专门用于诊断结肠病变癌化程度的微小核糖核酸芯片的制作工艺和操作流程与之前所诉的微小核糖核酸芯片的基本相同，唯一改动是将探针库简化为65条，由此将大大减少芯片的制作成本和生产时间，易于制备，增加了芯片的针对性和实用性。也就是说，此特殊芯片的价值在于，用最精简的探针库检测临床样本微小核糖核酸的变化趋势，再通过比对该变化趋势与发生结肠癌时微小核糖核酸的变化趋势的吻合程度，若变化趋势符合发生癌时预计的变化趋势，则可认为样本已发生癌化，若相距较远，则可认为样本更像良性息肉，所以此芯片可预测结肠病变是否发生癌化或确定样本癌化的程度。所以，将此芯片投入实践，可以在早期发现结肠病变发生癌化的潜在可能，帮组指导诊断和治疗，把癌症的确诊和治疗技术推上一个新的台阶。
Claims (3)
1.一种以微小核糖核酸的特异性变化鉴定结肠癌化程度的生物芯片，其特征是将65条探针作为全部的探针库点制在芯片上，用这个最精简的探针库检测样本中65个与结肠癌密切相关的微小核糖核酸的变化趋势。
2.根据权利要求1所述一种以微小核糖核酸的特异性变化鉴定结肠癌化程度的生物芯片在鉴定结肠病变癌化程度中的应用。
3.根据权利要求1所述一种以微小核糖核酸的特异性变化鉴定结肠癌化程度的生物芯片的应用方法，其特征是通过比对临床样本微小核糖核酸的变化趋势与发生结肠癌时微小核糖核酸的变化趋势的吻合程度，预测结肠病变是否发生癌化或确定样本癌化的程度，进而提高结肠癌的早期诊断率。
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-
2006
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