CN105462972A - 一种dna探针组合和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种DNA探针组合和试剂盒，该DNA探针组合包括：(1)miR-223探针和(2)miR-16探针；以及以下探针中的至少两种：(3)miR-21探针；(4)miR-29a探针；(5)miR-222探针；(6)miR-145探针；(7)miR-10b探针。本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括以下组分：(1)上述的DNA探针组合；(2)RCA指数扩增引物；(3)DNA聚合酶；(4)dNTP；(5)RCA反应液；(6)DNA荧光染料；其中，所述DNA探针组合中的各个DNA探针以相互独立的形式提供。本发明的试剂盒可以实现肝癌的早期测定，操作简便，成本低。

Description

一种DNA探针组合和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体地，涉及一种DNA探针组合和包括该DNA探针组合的试剂盒。
背景技术
微小RNA(miRNA)是一类小分子调控RNA，在肿瘤的发生与控制方面发挥着重要的作用。已经发现在肿瘤患者的循环核酸中存在源自肿瘤的miRNA分子，这一现象提示循环miRNA分子可能成为无创诊断癌症的一个有效的方法。研究表明miR-21，miR-145，miR-222，miR-223，miR-29a，miR-10b在肝癌肿瘤患者血清中明显过度表达，是评估疗效的潜在生物标志物。miR-16的表达稳定，可作为内参。
目前已有的血清中miRNA的检测方法主要是实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
但是这个方法需要先对miRNA进行逆转录，并且RT-PCR的过程需要完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环。操作繁琐，并且需要使用大型昂贵的仪器。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种DNA探针组合和包括该DNA探针组合的试剂盒。
本发明的发明人拟利用RCA技术对血清中miRNA进行检测，DNA滚环扩增(RCA)技术是一种等温信号扩增方法，可在室温下进行，使用两个引物就可实现指数滚环扩增，可用于极微量生物标记物的检测。RCA能直接扩增DNA或者RNA分子，所以将其用于血清中miRNA的检测具有快速、灵敏、特异的特点。此外，发明人发现如果只对某一特定的miRNA表达量进行分析，很容易出现假阳性或假阴性的结果。
基于此，本发明提供一种DNA探针组合，该DNA探针组合包括：
(1)miR-223探针，所述miR-223探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-GACAAACTGACA(SEQIDNO：1)X1TGGGGTATTT-3(SEQIDNO：2)’，X1为任意序列的DNA片段；
和(2)miR-16探针，所述miR-16探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-TACGTGCTGCTA(SEQIDNO：3)X2CGCCAATATT(SEQIDNO：4)-3’，X2为任意序列的DNA片段；
以及以下探针中的至少两种：
(3)miR-21探针，所述miR-21探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-TGATAAGCTA(SEQIDNO：5)X3TCAACATCAGTC(SEQIDNO：6)-3’，X3为任意序列的DNA片段；
(4)miR-29a探针，所述miR-29a探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-AGATGGTGCTA(SEQIDNO：7)X4TAACCGATTTC(SEQIDNO：8)-3’，X4为任意序列的DNA片段；
(5)miR-222探针，所述miR-222探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-CAGATGTAGCT(SEQIDNO：9)X5ACCCAGTAGC(SEQIDNO：10)-3’，X5为任意序列的DNA片段；
(6)miR-145探针，所述miR-145探针为40-80nt的的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-GGAAAACTGGAC(SEQIDNO：11)X6AGGGATTCCTG(SEQIDNO：12)-3’，X6为任意序列的DNA片段；
(7)miR-10b探针，所述miR-10b探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-TTCTACAGGGTA(SEQIDNO：13)X7CACAAATTCGG(SEQIDNO：14)-3’，X7为任意序列的DNA片段。
根据本发明，优选地，各探针长度为50-70nt。
根据本发明，各个探针中的任意序列可以为具有随机任意组合的一段DNA。
优选地，所述miR-223探针的序列为：
5’-GACAAACTGACAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACATGGGGTATTT-3’(SEQIDNO：15)。
优选地，所述miR-16探针的序列为：
5’-TACGTGCTGCTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACACGCCAATATT-3’(SEQIDNO：16)。
优选地，所述miR-21探针的序列为：
5’-TGATAAGCTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACATCAACATCAGTC-3’(SEQIDNO：17)。
优选地，所述miR-29a探针的序列为：
5’-AGATGGTGCTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACATAACCGATTTC-3’(SEQIDNO：18)。
优选地，所述miR-222探针的序列为：
5’-CAGATGTAGCTACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACAACCCAGTAGC-3’(SEQIDNO：19)。
优选地，所述miR-145探针的序列为：
5’-GGAAAACTGGACACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACAAGGGATTCCTG-3’(SEQIDNO：20)。
优选地，所述miR-10b探针的序列为：
5’-TTCTACAGGGTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACACACAAATTCGG-3’(SEQIDNO：21)。
理论上，用于检测的DNA探针数目越多，得到的结果的可靠性越高，但是基于简便性的要求，所述DNA探针组合中的DNA探针数目至少为4个即可。
本发明的上述DNA探针均为针对肝癌miRNA序列而设计。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括以下组分：
(1)上述的DNA探针组合；
(2)RCA指数扩增引物；
(3)DNA聚合酶；
(4)dNTP；
(5)RCA反应液；
(6)DNA荧光染料；
其中，所述DNA探针组合中的各个DNA探针以相互独立的形式提供。
本发明中，所述“各个DNA探针以相互独立的形式提供”的含义是指各个DNA探针不混合在一起，并不排除每个DNA探针与其他组分混合在一起的情形。
根据本发明，所述试剂盒包括的上述组分可以全部单独提供，也可以部分组合提供，例如，每个探针可以与用于RCA指数扩增的引物、dNTP和RCA反应液共同以检测溶液的形式提供，根据本发明，所述检测溶液的数目与所述DNA探针组合中DNA探针的数目相同。
本发明的检测原理如下：针对待检测的miRNA，分别设计了可以特异性与目标miRNA结合的DNA环状模板，以及用于RCA指数扩增的引物。miRNA结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶的作用下被延伸，产物是具有大量重复序列(与环状DNA完全互补)的线状单链DNA。用于RCA指数扩增的引物是一条与环状DNA的一段序列完全一致的引物(10-20个碱基)，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，置换下游杂交到扩增产物上的其它拷贝段的引物，其产物又可作为与环状DNA模板互补的引物。这样在很短的时间内，产物呈指数扩增。
最后将可以嵌入双链DNA的荧光染料加入扩增体系中，通过荧光信号的强弱对比来判断血清中miRNA的含量高低。
本发明中，所述RCA是指滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)，该术语的含义和技术步骤为本领域技术人员公知。
根据本发明，所述DNA探针组合中每个探针的量为0.1-1nmol；形成的所述检测溶液中，每个DNA探针的浓度为100-1000nM即可满足检测要求，进一步优选为200-600nM。
本发明中的所述DNA聚合酶优选为Phi29DNA聚合酶。
根据本发明，所述DNA荧光染料的作用是对DNA进行快速检测，因此，可实现该目的的DNA荧光染料皆可用于本发明。优选地，所述DNA荧光染料为SybrGreenDNA染料。该染料可通过商购获得。
根据本发明，所述RCA反应液可以为商购DNA聚合酶时所带的反应缓冲液，也可以为根据该反应原理配置而成的反应液。
根据本发明的原理，本领域技术人员能够设计合适的RCA指数扩增引物，如上所述，所述RCA指数扩增引物是一条与环状DNA的一段序列完全一致的引物，通常为10-20个碱基。根据本发明一种优选实施方式，每条探针序列都有一段共有的序列，可基于该序列设计RCA指数扩增引物，例如，可以为5’-ATCAAAGCCCATACTACA-3’(SEQIDNO：22)。
本发明的试剂盒可以实现肝癌的早期测定，操作简便，成本低。指数扩增的RCA反应灵敏度高，特异性好。多个生物标记物miRNA的同时特定也大大提高了检测的准确性。
具体地，根据本发明一种优选实施方式，所述试剂盒的使用方法如下：
(1)将从血清中提取出的miRNA分别加入到每一份检测溶液中，充分混匀后孵育；其中，所述每份检测溶液包括一种DNA探针、RCA指数扩增引物、dNTP和RCA反应液；所述RCA指数扩增引物、dNTP的浓度和所述miRNA的用量均可以根据实际需要确定；所述孵育的条件可以为常规条件，例如30℃孵育3h。
(2)终止反应后将DNA荧光染料加入到上述反应液中，用酶标仪读取荧光信号，所述DNA荧光染料的加入量也可以根据实际需要确定。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
通过实施例对本发明进行进一步的描述。
制备例1：制备检测溶液。
将miR-223探针、miR-21探针、miR-145探针和miR-16探针分别和dNTP以及RCA反应液混合，制成4管检测溶液。其中，4个探针的浓度都为500nM，dNTP的浓度为0.5mM。
其中，miR-223探针的序列为：
5’-GACAAACTGACAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACATGGGGTATTT-3’。
miR-21探针的序列为：
5’-TGATAAGCTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACATCAACATCAGTC-3’。
miR-145探针的序列为：
5’-GGAAAACTGGACACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACAAGGGATTCCTG-3’。
miR-16探针的序列为：
5’-TACGTGCTGCTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACACGCCAATATT-3’。
RCA指数扩增引物的序列为：
5’-ATCAAAGCCCATACTACA-3’。
实施例1
(1)将从医院(三甲医院，深圳北京大学医院、深圳市第一人民医院、深圳市第二人民医院)取回的确诊肝癌病人(临床确诊的M0和M1期各20例)以及健康人(20例)的全血在2000rpm转速下离心10min，取1mL上清液(血清)；
(2)提取出血清中的miRNA，将miRNA的浓度均调至10ng/μL。
(3)分别向4支新的EP管(1.5mL)里加入5μL提取出的miRNA。并向其中分别加入45μL含有不同探针的检测溶液、10UPhi29聚合酶，混匀，30℃孵育3h，90℃加热5min终止反应；
加入荧光染料，读取荧光值。
分别算出通过健康人、肝癌M0期病人、肝癌M1期病人(各20例)测得的miRNA荧光平均值。以此作为今后肝癌病人早期检测的参考值。
实施例2
(1)将从医院(三甲医院，深圳北京大学医院、深圳市第一人民医院、深圳市第二人民医院)取回的未确诊病人(20例)的全血在2000rpm转速下离心10min，取1mL上清液(血清)；
(2)提取出血清中的miRNA，将miRNA的浓度均调至10ng/μL。
(3)分别向4支新的EP管(1.5mL)里加入5μL提取出的miRNA。并向其中分别加入45μL含有不同探针的检测溶液、10UPhi29聚合酶，混匀，30℃孵育3h，90℃加热5min终止反应；
加入荧光染料，读取荧光值。
通过与参考值的对比粗略判断病人是否患有早期的肝癌。
初步判断结果与该20例病人后续临床诊断结果一致。说明本发明的方法可以用于初步判断病人是否患有早期的肝癌。

Claims (9)

1.一种DNA探针组合，其特征在于，该DNA探针组合包括：
(1)miR-223探针，所述miR-223探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-GACAAACTGACAX1TGGGGTATTT-3’，X1为任意序列的DNA片段；
和(2)miR-16探针，所述miR-16探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-TACGTGCTGCTAX2CGCCAATATT-3’，X2为任意序列的DNA片段；
以及以下探针中的至少两种：
(3)miR-21探针，所述miR-21探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-TGATAAGCTAX3TCAACATCAGTC-3’，X3为任意序列的DNA片段；
(4)miR-29a探针，所述miR-29a探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-AGATGGTGCTAX4TAACCGATTTC-3’，X4为任意序列的DNA片段；
(5)miR-222探针，所述miR-222探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-CAGATGTAGCTX5ACCCAGTAGC-3’，X5为任意序列的DNA片段；
(6)miR-145探针，所述miR-145探针为40-80nt的的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-GGAAAACTGGACX6AGGGATTCCTG-3’，X6为任意序列的DNA片段；
(7)miR-10b探针，所述miR-10b探针为40-80nt的通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：
5’-TTCTACAGGGTAX7CACAAATTCGG-3’，X7为任意序列的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的DNA探针组合，其中，
所述miR-223探针的序列为：
5’-GACAAACTGACAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACATGGGGTATTT-3’。
3.根据权利要求1所述的DNA探针组合，其中，
所述miR-16探针的序列为：
5’-TACGTGCTGCTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACACGCCAATATT-3’。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的DNA探针组合，其中，
所述miR-21探针的序列为：
5’-TGATAAGCTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACATCAACATCAGTC-3’；
所述miR-29a探针的序列为：
5’-AGATGGTGCTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACATAACCGATTTC-3’；
所述miR-222探针的序列为：
5’-CAGATGTAGCTACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACAACCCAGTAGC-3’；
所述miR-145探针的序列为：
5’-GGAAAACTGGACACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACAAGGGATTCCTG-3’；
所述miR-10b探针的序列为：
5’-TTCTACAGGGTAACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTACAACACACAAATTCGG-3’。
5.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：
(1)权利要求1-4中任意一项所述的DNA探针组合；
(2)RCA指数扩增引物；
(3)DNA聚合酶；
(4)dNTP；
(5)RCA反应液；
(6)DNA荧光染料；
其中，所述DNA探针组合中的各个DNA探针以相互独立的形式提供。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，每个DNA探针的量为0.1-1nmol。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶。
8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，所述DNA荧光染料为SybrGreenDNA染料。
9.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，所述RCA反应液为DNA聚合酶缓冲溶液。
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