JP6698696B2 - 核酸分子の検出 - Google Patents

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Description

本発明は、検出下限で核酸分子を検出する方法に関する。
被験体から採取された生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルは、特定の疾病又は疾患の有無及び／又は程度に関する指標となり得る。
例えば、マイクロRNA（miRNA）発現プロファイルの作成により、種々の疾病において健康な被験者と患者との間で特定のmiRNAの発現に明らかな変動が存在することが示された。miRNAは、遺伝子調節の複雑なネットワークに重要な役割を担う、高度に保存された短い非コーディングRNAである。miRNAは、メッセンジャーRNA（mRNA）に特異的に結合して、mRNAの安定性及び翻訳の調節を通じて遺伝子発現を制御する。一般的に、miRNAは、21ヌクレオチド〜23ヌクレオチドからなる。
診断に適した多くの核酸分子、例えば特定のmiRNAは、そのサイズが小さいこと、及びその生物学的試料中での濃度が一般的に低いことの両者のため、正確に定量化することが困難である。
特定のmiRNAの発現レベルを検出するために、miRNAは、通常、生物学的試料から単離され、合成DNA（cDNA）へと逆転写される。その後に、miRNA発現レベルは、定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）を使用して測定される。幾つかの場合に、実際の測定の前に、前増幅工程が行われる。この追加の工程が行われるのは、（i）幾つかの分子生物学的測定法（リアルタイムPCR、マイクロアレイ等）で使用するのに十分なmiRNA原材料が存在しない場合、及び／又は（ii）試料中のmiRNAの濃度が低すぎる場合（すなわち、前増幅を行わないと、リアルタイムPCRの間にシグナルが発生しないこととなる場合）である。
しかしながら、以下で比較例1に示されるように、この「古典的」なアプローチでは、ターゲット核酸分子が、検出下限の量、例えば1試料当たり1000分子未満しか存在しない場合には、発現レベルの正確で信頼することができる測定は不可能である。
したがって、本発明の課題は、生物学的試料中の特定の核酸分子、例えばmiRNAの検出下限での発現レベルの正確で信頼することができる測定を容易にする方法を提供することであった。
一態様においては、本発明は、生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルを測定する方法であって、該方法は、
（i）生物学的試料から単離／取得されたDNA又はcDNAを含むバッチAを準備する工程と、
（ii）工程（i）で準備されたバッチAの3つ以上のアリコートを準備して、該3つ以上のアリコートのそれぞれを用いて独立したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することで、特定の核酸分子を増幅させ、それにより増幅された特定の核酸分子を含む3つ以上のバッチBを準備する工程と、
（iii）等量の3つ以上のバッチBを混合することによりバッチCを準備して、該バッチCにおいてPCRベースのアプローチによって特定の核酸分子のレベルを測定する工程と、
を含み、ここで、工程（iii）で測定されるレベルが、生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルに相当する、方法に関する。
別の態様においては、本発明は、生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルを測定する方法であって、該方法は、
（i）生物学的試料から単離／取得されたDNA又はcDNAを含むバッチAを準備する工程と、
（ii）工程（i）で準備されたバッチAの3つ以上のアリコートを準備して、該3つ以上のアリコートのそれぞれを用いて独立したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することで、特定の核酸分子を増幅させ、それにより増幅された特定の核酸分子を含む3つ以上のバッチBを準備する工程と、
（iii）3つ以上のバッチBのそれぞれにおいてPCRベースのアプローチによって特定の核酸分子のレベルを測定する工程と、
を含み、ここで、工程（iii）で測定されるレベルの平均値が、生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルに相当する、方法に関する。
一実施の形態においては、生物学的試料中の特定の核酸分子の濃度は、1×10-11 M以下、又は1×10-12 M以下、又は1×10-13 M以下、又は1×10-14 M以下、又は1×10-15 M以下、又は1×10-16 M以下である。
一実施の形態においては、生物学的試料中の特定の核酸分子の濃度は、1×10-11 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-12 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-13 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-14 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-15 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-16 Mから1×10-17 Mの間である。
一実施の形態においては、特定の核酸分子は、特定のmiRNA、特定の無細胞循環DNA（例えば、特定の無細胞循環腫瘍DNA）、特定のmRNA、特定のsiRNA及び特定のsnRNAからなる群から選択される。
一実施の形態においては、特定の核酸分子は、特定のmiRNAである。
一実施の形態においては、特定のmiRNA分子は、miR-371a-3p、miR-93-5p、miR-372、miR-373、miR-367及びmiR-20a-5pからなる群から選択される。
一実施の形態においては、生物学的試料は、体液、組織、細胞、細胞溶解物及び細胞培養上清からなる群から選択される。
一実施の形態においては、体液は、血清、血漿、精漿、水瘤液、精液瘤液、全血、尿、羊水、滲出液、痰、唾液及び脳脊髄液からなる群から選択される。
一実施の形態においては、組織は、天然組織、急速凍結された組織及びホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）された組織からなる群から選択される。
一実施の形態においては、組織は、腫瘍組織である。
一実施の形態においては、バッチAは、生物学的試料から単離／取得されたcDNAを含む。
一実施の形態においては、工程（i）は、
（ia）生物学的試料からRNAを単離する工程と、
（ib）工程（ia）で単離されたRNAをcDNAへと変換し、それによりcDNAを含むバッチAを準備する工程と、
を含む。
一実施の形態においては、工程（ii）において、バッチAの3つのアリコートを準備する。
一実施の形態においては、PCRベースのアプローチは、定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）又はデジタルPCR（dPCR）である。
本発明による方法の概略図を示している（実施例1）。3回のqRT-PCRに引き続き、データの評価のために算術平均値を計算する。 本発明による方法の概略図を示している（実施例2）。3回の独立した前増幅反応からの等量の混合物を用いて1回だけqRT-PCRを行って、データの評価のために測定平均値を得る。
本発明は、前後で詳細に記載されているが、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されるものではなく、これらは変更することができると理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであると理解されるべきであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではなく、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることとなる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
以下で、本発明の特定の構成要素を記載することとする。これらの構成要素は、特定の実施形態をもって列挙されることがあるが、それらの構成要素を、あらゆる様式及びあらゆる数において組み合わせることで、更なる実施形態を作り出すことができると理解されるべきである。様々に記載される例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。この詳細な説明は、明示的に記載された実施形態と幾つもの開示された構成要素及び／又は好ましい構成要素とを合わせた実施形態をサポートし、かつ包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願に記載される全ての構成要素のあらゆる並び替え及び組み合わせも、内容により特に指示されない限り、本出願の詳細な説明によって開示されるものと考慮されるべきである。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「生物工学用語の多言語用語集（IUPAC推奨）（A multilingual glossary ofbiotechnological terms (IUPAC Recommendations)）」、H.G.W. Leuenberger、 B. Nagel及びH. Koelbl編、Helvetica Chimica Acta、スイス、CH-4010バーゼル、(1995)に記載されるように定義される。
本発明の実施では、特に示されない限り、当該分野での文献（例えば、モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第3版、J. Sambrook他編、ColdSpring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 2000を参照）に説明される化学、生化学、細胞生物学、免疫学及び組換えDNA技術の慣用の方法が使用されることとなる。
以降の本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、内容により特に必要とされない限り、用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の別形は、示された要素、整数若しくは工程又は複数の要素、複数の整数若しくは複数の工程の群を包含することを意味するが、その他のあらゆる要素、整数若しくは工程又は複数の要素、複数の整数若しくは複数の工程の群を除外することを意味するものではないと理解されることとなるが、幾つかの実施形態においては、そのようなその他の要素、整数若しくは工程又は複数の要素、複数の整数若しくは複数の工程の群が排除されることがある、すなわち、その対象は、示された要素、整数若しくは工程又は複数の要素、複数の整数若しくは複数の工程の群を包含することにある。数量が特定されていない語（The terms "a" and"an" and "the"）及び本発明の記載に関して（特に特許請求の範囲において）使用される同様の指示は、本明細書で特に示されない限り、又は内容により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと理解されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に含まれるそれぞれ別々の値を個別に指す略式法としての役割を果たすものと解釈されるにすぎない。本明細書で特に示されない限り、それぞれの個別の値は、その値が本明細書で個別に列挙されているかのごとく、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に示されない限り、又は内容により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書中で規定されるあらゆる例又は例示的な言い回し（例えば、「等の（such as）」）の使用は、単に本発明をより良く説明するものと解釈されるにすぎず、決してその他の点で規定される本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書中の言い回しは、本発明の実施に必須な何らかの規定されていない構成要素を示していると解釈されるべきではない。
本明細書で使用される用語「発現レベル」とは、相対的な発現レベル、すなわち、1種以上の参照核酸分子の1つ以上の発現レベルに対する特定の核酸分子の発現レベル、又は絶対的な発現レベル、すなわち特定の核酸分子の実際の量を指してよい。本発明によれば、「生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルの測定」とは、「生物学的試料中の特定の核酸分子の有無を測定すること」であってよい。一実施形態においては、生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベル（又は有無）は、該生物学的試料が得られる被験体における疾病又は疾患の有無及び／又は程度／進行度の指標である。一実施形態においては、該疾病又は疾患は、癌、例えば本明細書で定義される癌である。
特定の核酸分子は、本発明によれば、一本鎖又は二本鎖であり、かつ線状又は共有結合により閉じて環を形成した分子の形であってよい。一実施形態においては、特定の核酸分子は、DNA又はRNAである。
本発明においては、用語「DNA」は、デオキシリボヌクレオチド残基を含む分子であり、好ましくはデオキシリボヌクレオチド残基から全体的に又は本質的に構成される分子に関連する。「デオキシリボヌクレオチド」は、β-D-リボフラノシル基の2'位にヒドロキシル基を欠いたヌクレオチドに関連する。本明細書で使用される用語「相補的DNA（cDNA）」とは、逆転写酵素によって触媒される反応においてRNAテンプレートから合成される二本鎖DNAを指す。
本発明においては、用語「RNA」は、リボヌクレオチド残基を含む分子であり、好ましくはリボヌクレオチド残基から全体的に又は本質的に構成される分子に関連する。「リボヌクレオチド」は、β-D-リボフラノシル基の2'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関連する。
一実施形態において、特定の核酸分子は、特定のmiRNA、特定の無細胞循環DNA（例えば、特定の無細胞循環腫瘍DNA）、特定のmRNA、特定のsiRNA及び特定のsnRNAからなる群から選択される。
マイクロRNA（miRNA）は、21リボヌクレオチド〜23リボヌクレオチドからなる小さい非コーディングRNA分子であり、RNAサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する分子である。
用語「無細胞循環腫瘍DNA（ctDNA）」とは、死滅した腫瘍細胞によって血流中に放出される腫瘍DNAの小部分を指す。ctDNAの／ctDNAのためのスクリーニングは、患者の腫瘍の進行度を検出及び追跡することを可能にする。
メッセンジャーRNA（mRNA）は、遺伝情報をDNAから、遺伝子発現のタンパク質産物のアミノ酸配列を特定するリボソームへと伝える。
低分子干渉RNA（siRNA）は、相補ヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉する（RNA干渉、つまりRNAiとも呼ぶ）、長さ20塩基対〜25塩基対の或る種の二本鎖RNA分子である。
核内低分子RNA（snRNA）は、約150ヌクレオチドの平均長さを有する、例えば真核細胞の細胞核におけるプレメッセンジャーRNA（hnRNA）のプロセシングに関与する低分子RNA分子である。また、この用語には、核小体低分子RNA（snoRNA）も含まれる。
一実施形態においては、特定の核酸分子は、特定のDNA分子又はRNA分子、好ましくは500（デオキシ-）リボヌクレオチド未満の、又は400（デオキシ-）リボヌクレオチド未満の、又は300（デオキシ-）リボヌクレオチド未満の、又は200（デオキシ-）リボヌクレオチド未満の、又は100（デオキシ-）リボヌクレオチド未満の、又は50（デオキシ-）リボヌクレオチド未満の長さを有する特定のRNA分子である。
一実施形態においては、特定の核酸分子は、特定のmiRNAであり、ここで、好ましくは特定のmiRNA分子は、miR-371a-3p、miR-93-5p、miR-372、miR-373、miR-367及びmiR-20a-5pからなる群から選択される。一実施形態においては、特定のmiRNAは、miR-371a-3pである。
本発明による方法は、特定の核酸分子の検出下限での検出を可能にする。一実施形態においては、用語「検出下限」とは、PCRベースのアプローチによって、例えば定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）又はデジタルPCR（dPCR）によって規定される検出下限を指す。
一実施形態においては、用語「検出下限」は、生物学的試料中の特定の核酸分子の濃度が、1×10-11 M以下、又は1×10-12 M以下、又は1×10-13 M以下、又は1×10-14 M以下、又は1×10-15 M以下、又は1×10-16 M以下であることを意味する。一実施形態においては、用語「検出下限」は、生物学的試料中の特定の核酸分子の濃度が、1×10-11 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-12 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-13 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-14 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-15 Mから1×10-17 Mの間、又は1×10-16 Mから1×10-17 Mの間であることを意味する。
一実施形態においては、用語「検出下限」は、生物学的試料中の特定の核酸分子の数が、10000個以下、又は5000個以下、又は2500個以下、又は1000個以下、又は500個以下、又は250個以下であることを意味する。一実施形態においては、用語「検出下限」は、生物学的試料中の特定の核酸分子の数が、20個から10000個の間、又は20個から5000個の間、又は20個から2500個の間、又は20個から1000個の間、又は20個から500個の間、又は20個から250個の間であることを意味する。一実施形態においては、用語「検出下限」は、生物学的試料中の特定の核酸分子の数が、50個から10000個の間、又は50個から5000個の間、又は50個から2500個の間、又は50個から1000個の間、又は50個から500個の間、又は50個から250個の間であることを意味する。一実施形態においては、用語「検出下限」は、生物学的試料中の特定の核酸分子の数が、100個から10000個の間、又は100個から5000個の間、又は100個から2500個の間、又は100個から1000個の間、又は100個から500個の間、又は100個から250個の間であることを意味する。
一実施形態においては、本明細書で列挙される1種以上の特定の核酸分子の濃度又は数とは、生物学的試料（ここで、特定のRNA分子は、相応のcDNA分子に変換される）から単離／取得されたDNA又はcDNAを含むバッチA中の1種以上の特定の核酸分子の濃度又は数を指す。一実施形態においては、本明細書で列挙される1種以上の特定の核酸分子の濃度又は数とは、生物学的試料から単離／抽出されたRNA中の1種以上の特定の核酸分子の濃度又は数を指す。
一実施形態においては、本発明による方法の工程（ii）における3つ以上のアリコートのそれぞれを用いて実施される独立したPCRは、前増幅PCR反応である。
本発明による好ましい生物学的試料は、体液、組織、細胞、細胞溶解物及び細胞培養上清からなる群から選択される。
好ましくは、体液は、血清、血漿、精漿、水瘤液、精液瘤液、全血、尿、羊水、滲出液、痰、唾液及び脳脊髄液からなる群から選択される。一実施形態においては、体液は、血清である。
組織は、好ましくは、天然組織、急速凍結された組織及びホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）された組織からなる群から選択される。
特定の実施形態において、組織は、腫瘍組織である。
本明細書で使用される用語「腫瘍」とは、悪性（癌性）又は良性にかかわらず、新生細胞成長及び増殖を基礎とする集塊を指す。一実施形態においては、腫瘍は、充実性腫瘍である。一実施形態においては、腫瘍は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、睾丸癌、膀胱癌、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳癌、子宮頸癌、腸癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸管癌、頭頸部癌、胃腸癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉（ENT）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌及び肺癌並びにそれらの転移からなる群から選択される癌から得られる。一実施形態においては、癌は、睾丸癌である。
一実施形態においては、バッチAは、生物学的試料から単離／取得されたcDNAを含む。
一実施形態においては、工程（i）は、
（ia）生物学的試料からRNAを単離する工程と、
（ib）工程（ia）で単離されたRNAをcDNAへと変換し、それによりcDNAを含むバッチAを準備する工程と、
を含む。
RNA、例えばトータルRNA又はmiRNAを生物学的試料から単離（又は抽出）するための手段及び方法は、当業者に知られており、それには、市販のキット、例えばRNeasy Mini Kit及びmiRNeasy Mini Kit（両者ともQiagen社製）が含まれる。
RNAをcDNAに変換する工程は、好ましくは、逆転写酵素を使用する逆転写（RT）によって行われる。逆転写及びcDNAの合成のための手段及び方法は、当業者に知られており、それには市販のキット、例えばTaqMan（商標）microRNA RT Kit（Life Technologies社製）が含まれる。
本発明による好ましいPCRベースのアプローチは、定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）及びデジタルPCR（dPCR）である。
一実施形態においては、qRT-PCRは、蛍光標識されたプローブの使用を含む蛍光ベースのqRT-PCRである。一実施形態においては、蛍光標識されたプローブは、蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチド（＝デュアル標識プローブ）からなる。適切な蛍光レポーター色素／部及びクエンチャー色素／部は、当業者に良く知られており、それには、限定されるものではないが、レポーター色素／部の6-FAM（商標）、JOE（商標）、Cy5（商標）及びCy3（商標）並びにクエンチャー色素／部のdabcyl、TAMRA（商標）及びBHQ（商標）-1、BHQ（商標）-2又はBHQ（商標）-3が含まれる。プローブ特異的な産物の増幅は、プローブの開裂を引き起こし（＝増幅に媒介されるプローブの退去）、それによりリポーター蛍光の増大が起こる。蛍光ベースのqRT-PCRで使用するためのその他の適切な蛍光色素には、EvaGreen（商標）及びSYBR（商標）Greenが含まれる。一般的に、反応における蛍光の増大（リアルタイムで測定される）は、ターゲット増幅物の増大と正比例している。
dPCRは、核酸分子の絶対的定量化及び検出のための従来のqRT-PCRに対する代替法である。dPCRは、DNA又はcDNAの試料を多くの個々の並行したPCR反応へと分割することによって作動し、これらの反応の幾つかは、ターゲット核酸分子を含む（陽性）が、その他は含まない（陰性）。単一の分子は、百万倍以上に増幅され得る。増幅の間に、色素標識されたプローブを使用することで、配列特異的なターゲットが検出される。ターゲット配列が存在しない場合に、シグナルは累積しない。PCR分析に続き、陰性反応画分を使用することで、標準物又は内在性コントロールを必要とすることなく、試料中のターゲット分子数の絶対数が導き出される。
本発明はまた、被験体において疾病若しくは疾患を検出する方法又は被験体において疾病若しくは疾患の程度／進行度を測定する方法であって、（a）被験体から生物学的試料を取得することと、（b）生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルを、本明細書で定義される方法で測定することとを含み、ここで、生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルが、被験体における疾病又は疾患の有無及び／又は程度／進行度の指標である、方法を提供する。一実施形態においては、該疾病又は疾患は、癌、例えば本明細書で定義される癌である。
本明細書で使用される用語「被験体」は、あらゆる生物、例えば脊椎動物、特にヒト及びそれ以外の哺乳類の両方を含むあらゆる哺乳類、例えば齧歯類、ウサギ等の動物又は非ヒトの霊長類（例えばサル）に関連する。齧歯類は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はチンチラであってよい。好ましくは、被験体は、ヒトである。一実施形態においては、被験体は、疾病又は疾患、特に本明細書で規定された疾病若しくは疾患を伴う又はそれらの疾病若しくは疾患を有すると疑われる被験体であり、本明細書では、「患者」とも呼ばれる。
本発明を、以下の実施例によって更に説明するが、実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
比較例1
a）RNA単離
血清試料から、トータルRNAを、QIAGEN社製のmiRNeasy Mini Kitを使用して製造元の使用説明書に従って血清試料について若干の変更を加えて単離した：200 μlの血清に対して1 mlのQIAzol及び200 μlのクロロホルムを使用した。
b）cDNA合成
血清試料中のmiR-371a-3pの定量化のために、6 μlのトータルRNAを、TaqMan（商標）microRNART Kit（Life Technologies社製）並びにmiR-371a-3p及びmiR-93-5p（正規化のため）（Life Technologies、アッセイID：002124（miR-371a-3p）及び000432（miR-93-5p））に関するステムループプライマーそれぞれ1 μlからなるプライマープールを使用して逆転写した。
c）前増幅
血清中のRNA/miRNAの濃度が低いため、qRT-PCRの前に、前増幅工程を実施した。前増幅反応物は、4 μlの逆転写（RT）産物、1.12 μlの分析物（1：100希釈）（miR-371a-3p及びmiR-93-5pのそれぞれ）、4 μlの5×Real Time ready cDNA Pre-Amp Master（Roche、ドイツ、マンハイム）及びヌクレアーゼ不含の水からなっており、その水は20 μlの全反応容量になるまで加えられる。前増幅は、95℃で1分間に引き続き、95℃で15秒及び60℃で4分間を14サイクルで行った。次いで、前増幅産物を、ヌクレアーゼ不含の水中で1：2希釈し、その希釈された前増幅産物5 μlを、qRT-PCRのために使用した。
d）TaqMan（商標）プローブを使用する定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によるmiRNAの検出
qRT-PCR反応物は、10 μlのFASTstart Universal Probe Master（Roche、ドイツ、マンハイム）、1 μlの特定の分析物、及びヌクレアーゼ不含の水からなっており、全反応容量は20 μlであった。qRT-PCRは、7500Fast Real-Time PCR System（Life Technologies社製）において、以下のサイクル条件：95℃で10分間、次いで95℃で15秒及び60℃で1分間を40サイクルで行った。相対量（RQ）は、ΔΔCt法を使用して計算した。
qRT-PCR法の検出下限で測定が行われる場合には、前増幅工程の間にしばしば問題が生ずる。miRNA分子は、ピペット操作でcDNA合成に入れられ、1：1でcDNA分子へと転写された。つまり、最初にmiRNA分子が少量しか存在しない場合に、これはまた、同じく少量のcDNAしかもたらさないことを意味する。別の実験の間に結果を再現すべき場合に、前増幅のために正確に同量のcDNA/miRNA分子をピペット操作で反応チューブに再び入れることは統計学的に不可能である。これについての解釈は、例えば10個のmiRNA又はcDNA分子が全ての反応チューブに存在するということである。特定のアリコートを、前増幅のために、そのチューブからピペット操作で取り出して後続の反応チューブに入れる場合に、その統計学的確率のため、毎回同量のcDNA/miRNA分子を取り出すことは不可能である。このため、1回のピペット操作工程の間に、5個のcDNA/miRNA分子、8個のcDNA/miRNA分子、3個のcDNA/miRNA分子が後続の前増幅反応へと移されるか、又はそのcDNA/miRNA分子が一切移されないことさえ考えられる。本発明の実験は、これが、検出下限での再現的結果が非常に困難であるか、又は不可能でさえある理由であることを裏付けている。
表1には、RNA単離後に個別のcDNA合成、前増幅及びqRT-PCRによって別々に2回（A及びB）処理された1つの試料のmiRNA分析の結果が示されている。ここでは、実行「A」における試料のmiRNA-371a-3pのCt値が、実行「B」で得られる値とは本質的に異なることを明らかに理解することができる。それに対して、同じ試料のmiRNA-93のCt値は、それぞれの実行において殆ど同一である。これにより、同じ試料について、ターゲットmiRNA-371a-3pの実行「A」及び「B」についての完全に異なる発現レベルがもたらされる。この現象は、極めて少量のmiRNA分子の統計学的分布によるものであり、例えばcDNA合成のために使用される1005個の分子に対して1002個のmiRNA分子がある場合に、前増幅及びqRT-PCR後のCt値における差は殆ど分からない。しかしながら、ピペット操作で前増幅反応に入れられる5個の分子に対して2個の分子しか存在しない場合に、その差は、前増幅プロセスのサイクル（例えば14サイクル）の間に指数関数的に増大し、qRT-PCR後には発現レベル及びCt値それぞれにおいて莫大な差が検出される。各サイクルの間の増幅の効率が100%であると仮定して、14サイクルの前増幅後に、2分子は16384分子になり、5分子は6103515625分子になる。
表1：qRT-PCRにおける測定の再現性を試験する実験のまとめ（A及びBは、同じ試料の異なる実行である）；ターゲット名＝測定されるmiRNA；Ct＝閾値サイクル；Ct平均＝3回のqRT-PCRの平均値）。
これらの差は、表2でも確認することができ、そこでは、通常miRNA-371a-3pを非常に高いレベルで発現する細胞系統（HT 27）は、検出下限に達するまで希釈されているので、Ct値の変動が生ずる。
表2：miRNAの希釈列；ターゲット名＝測定されるmiRNA；Ct＝閾値サイクル；Ct平均＝2回のqRT-PCRの平均値；検出不可能＝qRT-PCRの間に検出可能なシグナルなし）。
別の実験において、規定量の合成miRNA、いわゆるcel-miRNA-39を、例としてcDNA合成のために使用する。結果を、表3に示す。ここでも、約100個のmiRNA分子（約0.0000000002ピコモル）において、Ct値に関して大きな差が生ずることを確認することができる。
表3：分子レベルでのmiRNAcel-miRNA-39希釈；ターゲット名＝測定されるmiRNA；Ct＝閾値サイクル；Ct平均＝2回のqRT-PCRの平均値；Ct MV＝同じ試料の3回の前増幅実行の平均値；理論的Ct＝最高濃度の値に基づいて数学的に決定されたCt値；ud＝検出不可能、つまりqRT-PCRの間に検出可能なシグナルなし）。
e）まとめ
上記データは、検出下限での信頼することができる結果をもたらすという課題が前増幅工程に関連していることを示している。1つの試料について1回の前増幅が実施され、かつこの前増幅産物がqRT-PCRを使用して測定される場合に、これは、毎回一定の結果をもたらす（表1、表2及び表3における3回／2回のqRT-PCRアッセイを参照）。しかしながら、数回の前増幅が、1つのcDNA反応チューブのなかで実施され、かつこれらの前増幅が、統計学によって種々の量のcDNA分子を含む場合に、これは、後続のqRT-PCRにおけるCt値に顕著な差異をもたらす。最良の混合手順であっても、cDNA合成からの少量のcDNA分子を均等な部で前増幅の反応チューブに分配することは不可能である。その後に、誤差が現れ、Ct値の大きな変動が起こる。このことは、14サイクルのそれぞれで分子数が2倍になることによって説明される。
実施例1
前増幅プロセスのために、試料をcDNA合成の後に3つの反応チューブに分けた。その後に、qRT-PCRを、3つの反応チューブのそれぞれで別々に実施した（表4及び図1を参照）。Ct値の偏差及び得られた種々の発現レベル（ここでは、例としてmiR-371a-3pについて）を検討するために、3つのRQ値の平均値を、数学的に決定した（算術平均）（RQ＝相対量＝発現）。
表4：qRT-PCRの結果；RQ＝相対量；数学的RQ-MVCt＝RQの数学的平均値；平均＝3回のqRT-PCRの平均値；検出不可能＝qRT-PCRの間に検出可能なシグナルなし。
実施例2
試料を、実施例1のようにcDNA合成後に、前増幅のために3つの反応チューブに分けた。その後に、同一容量を、3つの前増幅反応チューブのそれぞれから取り、一緒にしてピペット操作で1つの反応チューブに入れ、そして単回の後続のqRT-PCRのために良く混合した（図2を参照）。
Ct値及び測定された発現レベルにおける差をそれぞれ補償するために、3回の前増幅を行った。これらの差は、RQ値の平均値の計算によるか（実施例1＝計算された平均値／算術平均）、又は実施例2のように、3つの前増幅反応物を混合して、その混合物を後続のqRT-PCR分析において使用することによって補償することができ、こうして結果の解釈のために方法的な平均値／測定された平均が導き出される。この研究結果を、表5に列挙する。
表5：qRT-PCRの結果；RQ＝相対量；数学的RQ-MVCt＝RQの数学的平均値；Ct平均＝3回のqRT-PCRの平均値；検出不可能＝qRT-PCRの間に検出可能なシグナルなし；Zus＝試料は、実施例2のプロトコルにより処理された（方法的な平均値）。
総合すると、本発明の方法は、約0.0000000002ピコモルの検出下限でさえも特定の核酸分子を正確かつ信頼性高く分析する可能性をもたらす。

Claims (15)

  1. 生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルを測定する方法であって、該方法は、
    （i）前記生物学的試料から単離／取得されたDNA又はcDNAを含むバッチAを準備する工程と、
    （ii）工程（i）で準備されたバッチAの3つ以上のアリコートを準備して、該3つ以上のアリコートのそれぞれを用いて独立したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することで、前記特定の核酸分子を増幅させ、それにより増幅された特定の核酸分子を含む3つ以上のバッチBを準備する工程と、
    （iii）等量の前記3つ以上のバッチBを混合することによりバッチCを準備して、該バッチCにおいてPCRベースのアプローチによって前記特定の核酸分子のレベルを測定する工程と、
    を含み、ここで、工程（iii）で測定されるレベルが、前記生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルに相当する、方法。
  2. 前記生物学的試料中の特定の核酸分子の濃度は、1×10-11 M以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生物学的試料中の特定の核酸分子の濃度は、1×10-11 Mから1×10-17 Mの間である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記特定の核酸分子は、特定のmiRNA、特定の無細胞循環DNA、特定の無細胞循環腫瘍DNA、特定のmRNA、特定のsiRNA及び特定のsnRNAからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記特定の核酸分子は、特定のmiRNAである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記特定のmiRNA分子は、miR-371a-3p、miR-93-5p、miR-372、miR-373、miR-367及びmiR-20a-5pからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記生物学的試料は、体液、組織、細胞、細胞溶解物及び細胞培養上清からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記体液は、血清、血漿、精漿、水瘤液、精液瘤液、全血、尿、羊水、滲出液、痰、唾液及び脳脊髄液からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記組織は、天然組織、急速凍結された組織及びホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）された組織からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記組織は、腫瘍組織である、請求項７又は９に記載の方法。
  11. バッチAは、前記生物学的試料から単離／取得されたcDNAを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 工程（i）は、
    （ia）前記生物学的試料からRNAを単離する工程と、
    （ib）工程（ia）で単離された前記RNAをcDNAへと変換し、それにより該cDNAを含むバッチAを準備する工程と、
    を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 工程（ii）において、バッチAの3つのアリコートを準備する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記PCRベースのアプローチは、定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）又はデジタルPCR（dPCR）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 被験体において疾病若しくは疾患を検出する方法又は被験体において疾病若しくは疾患の程度／進行度を測定する方法であって、該方法は、
    （a）前記被験体から生物学的試料を取得する工程と、
    （b）前記生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルを、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法で測定する工程と、
    を含み、ここで、前記生物学的試料中の特定の核酸分子の発現レベルが、前記被験体における疾病又は疾患の有無及び／又は程度／進行度の指標である、方法。
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