CN107873058B - 核酸分子的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于以较低检测限检测核酸分子的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于以较低检测限检测核酸分子的方法。
背景技术
取自测试对象的生物样品中特定核酸分子的表达水平可以是特定疾病或病症的存在、不存在和/或程度的指标。
例如,微RNA(miRNA)表达谱的产生已经表明,在不同的疾病中,健康测试者与患者之间的特定miRNA的表达存在明显的变化。miRNA是短的、高度保守的非编码RNA,其在基因调控的复杂网络中起重要作用。它们通过调控mRNA稳定性和翻译特定结合信使RNA(mRNA)并控制基因表达。通常地,miRNA由21至23个核苷酸组成。
许多诊断相关的核酸分子(例如特定miRNA),难以准确地定量,由于它们的小尺寸和它们通常在生物样品中的低浓度两者。
为了检测特定miRNA的表达水平,miRNA通常从生物样品分离并逆转录成合成DNA(cDNA)。然后使用定量实时PCR(qRT-PCR)确定miRNA表达水平。在一些情况下,在实际测量之前进行预扩增步骤。如果(i)不存在足够的miRNA原料用于几种分子生物测定方法(实时PCR,微阵列等)中,和/或(ii)样品中miRNA的浓度太低(即,在没有预扩增的情况下,在实时PCR期间不会产生信号),则进行这个附加步骤。
然而,如下面的比较例1中所示,如果靶核酸分子以较低检测限下的量(例如每个样品小于1000个分子)存在,则这种“经典”方法无法准确和可靠地确定表达水平。
因此,本发明的一个目的是提供便于准确和可靠地确定生物样品中在较低检测限下的特定核酸分子(例如miRNA)的表达水平的方法。
发明内容
在一方面中,本发明涉及确定生物样品中特定核酸分子的表达水平的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)提供包含从所述生物样品分离/获得的DNA或cDNA的批次(batch)A;
(ii)提供步骤(i)中提供的批次A的三个或更多个等分试样,并用所述三个或更多个等分试样中的每一个进行独立的聚合酶链式反应(PCR)以扩增所述特定核酸分子,从而提供包含经扩增的特定核酸分子的三个或更多个批次B;以及
(iii)将等量的所述三个或更多个批次B混合,从而提供批次C,并通过基于PCR的方法确定批次C中所述特定核酸分子的水平,
其中在步骤(iii)中确定的水平对应于所述生物样品中所述特定核酸分子的表达水平。
在另一方面中,本发明涉及确定生物样品中特定核酸分子的表达水平的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)提供包含从所述生物样品分离/获得的DNA或cDNA的批次A;
(ii)提供步骤(i)中提供的批次A的三个或更多个等分试样,并用所述三个或更多个等分试样中的每一个进行独立的聚合酶链式反应(PCR)以扩增所述特定核酸分子,从而提供包含经扩增的特定核酸分子的三个或更多个批次B;以及
(iii)通过基于PCR的方法确定所述三个或更多个批次B的每一个中所述特定核酸分子的水平,
其中在步骤(iii)中确定的水平的平均值对应于所述生物样品中所述特定核酸分子的表达水平。
在一个实施方案中,生物样品中特定核酸分子的浓度为≤1×10-11M、或≤1×10- 12M、或≤1×10-13M、或≤1×10-14M、或≤1×10-15M、或≤1×10-16M。
在一个实施方案中,生物样品中特定核酸分子的浓度为1×10-11M至1×10-17M、或1×10-12M至1×10-17M、或1×10-13M至1×10-17M、或1×10-14M至1×10-17M、或1×10-15M至1×10-17M、或1×10-16M至1×10-17M。
在一个实施方案中,特定核酸分子选自特定miRNA、特定无细胞循环DNA(例如,特定无细胞循环肿瘤DNA)、特定mRNA、特定siRNA和特定snRNA。
在一个实施方案中,特定核酸分子是特定miRNA。
在一个实施方案中,特定miRNA分子选自miR-371a-3p、miR-93-5p、miR-372、miR-373、miR-367和miR-20a-5p。
在一个实施方案中,生物样品选自体液、组织、细胞、细胞裂解物和细胞培养物上清液。
在一个实施方案中,体液选自血清、血浆、精浆、水囊肿液(hydrocele fluid)、精囊肿液(spermatocele fluid)、全血、尿、羊水、渗出液(exudate)、痰、唾液和脑脊液。
在一个实施方案中,组织选自天然组织、速冻组织以及福尔马林固定和石蜡包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded,FFPE)的组织。
在一个实施方案中,组织是肿瘤组织。
在一个实施方案中,批次A包含从生物样品分离/获得的cDNA。
在一个实施方案中,步骤(i)包括以下步骤:
(ia)从生物样品分离RNA;以及
(ib)将步骤(ia)中分离的RNA转化成cDNA,从而提供包含cDNA的批次A。
在一个实施方案中,在步骤(ii)中提供批次A的三个等分试样。
在一个实施方案中,基于PCR的方法是定量实时PCR(qRT-PCR)或数字PCR(dPCR)。
附图说明
图1示出了根据本发明的方法的一个示意图(实施例1)。在三次qRT-PCR之后,计算算术平均值用于数据的评估。
图2示出了根据本发明的方法的一个示意图(实施例2)。用来自三个独立预扩增反应的等量的混合物仅进行一次qRT-PCR,以获得测量平均值用于数据的评估。
具体实施方式
虽然在上文和下文中对本发明进行了详细地描述,但是应当理解,本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂,因为这些可以变化。还应当理解,本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的,并不旨在限制本发明的范围,本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。
在下文中,将描述本发明的某些要素。这些要素可以与具体实施方案一起列出,然而,应当理解,它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明限于仅是明确描述的实施方案。应该理解本说明书支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外,本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应被视为通过本申请的描述而公开,除非上下文另外说明。
优选地,本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,和H.编,Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland,(1995)中所述而定义。
除非另外说明,否则本发明的实践将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法,这些方法在本领域的文献中进行解释(参见例如,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,J.Sambrook等编,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 2000)。
在本说明书及所附权利要求通篇中,除非上下文另外需要,否则应理解词语“包含”和变化形式如“包括”和“含有”表明包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组,但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组,虽然在一些实施方案中可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组,即主题包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非在本文中另外说明或与上下文明显矛盾,否则在描述本发明的上下文中所使用的无数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。本文值的范围的记载仅用于作为单独地参考落在范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另外说明,否则每个单独值被并入说明书中,如同在本文中单独地记载一样。除非本文另外说明或以其他方式明确地与上下文相矛盾,否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如,“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明,并且不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为表示对本发明的实践至关重要的任何非要求保护的要素。
本文使用的术语“表达水平”可以指特定核酸分子的相对表达水平,即特定核酸分子相对于一个或更多个参照核酸分子之表达水平的表达水平,或者指特定核酸分子的绝对表达水平,即实际量。根据本发明,“确定生物样品中特定核酸分子的表达水平”可为“确定生物样品中特定核酸分子的存在或不存在”。在一个实施方案中,生物样品中特定核酸分子的表达水平(或者存在或不存在)指示从其中获得生物样品的对象中的疾病或病症的存在、不存在和/或程度/进展。在一个实施方案中,疾病或病症是癌症,例如本文所述的癌症。
根据本发明,特定核酸分子可以是分子的形式,其是单链或双链的并且线性或共价闭合以形成环。在一个实施方案中,特定核酸分子是DNA或RNA。
在本发明的上下文中,术语“DNA”涉及包含脱氧核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由脱氧核糖核苷酸残基构成的分子。“脱氧核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2′-位处缺少羟基的核苷酸。本文使用的术语“互补DNA(cDNA)”是指在酶逆转录酶催化的反应中由RNA模板合成的双链DNA。
在本发明的上下文中,术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2′-位处具有羟基的核苷酸。
在一个实施方案中,特定核酸分子选自特定miRNA、特定无细胞循环DNA(例如,特定无细胞循环肿瘤DNA)、特定mRNA、特定siRNA和特定snRNA。
微RNA(miRNA)是由21至23个核糖核苷酸组成的小非编码RNA分子,其在基因表达的RNA沉默和转录后调控中起作用。
术语“无细胞循环肿瘤DNA(ctDNA)”是指由濒死肿瘤细胞释放到血流中的小片肿瘤DNA。ctDNA的筛选允许检测并跟踪患者肿瘤的进展。
信使RNA(mRNA)将来自DNA的遗传信息传递给核糖体,在那里它指定了基因表达的蛋白质产物的氨基酸序列。
小干扰RNA(siRNA)是一类长度为20至25个碱基对的双链RNA分子,其干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达(称为RNA干扰,RNAi)。
小核RNA(snRNA)是平均长度为约150个核苷酸的小RNA分子,其例如参与真核细胞的细胞核中前信使RNA(hnRNA)的处理。此外,该术语还包括核仁小RNA(snoRNA)。
在一个实施方案中,特定核酸分子是特定DNA或RNA分子,优选具有长度小于500个(脱氧-)核糖核苷酸、或小于400个(脱氧-)核糖核苷酸、或小于300个(脱氧-)核糖核苷酸、或小于200个(脱氧-)核糖核苷酸、或小于100个(脱氧-)核糖核苷酸、或小于50个(脱氧-)核糖核苷酸的特定RNA分子。
在一个实施方案中,特定核酸分子是特定miRNA,其中,优选地,特定miRNA分子选自miR-371a-3p、miR-93-5p、miR-372、miR-373、miR-367和miR-20a-5p。在一个实施方案中,特定miRNA是miR-371a-3p。
根据本发明的方法允许在较低检测限下检测特定核酸分子。在一个实施方案中,术语“较低检测限”是指通过基于PCR的方法,例如定量实时PCR(qRT-PCR)或数字PCR(dPCR)提供的较低检测限。
在一个实施方案中,术语“较低检测限”意指生物样品中特定核酸分子的浓度为≤1×10-11M、或≤1×10-12M、或≤1×10-13M、或≤1×10-14M、或≤1×10-15M、或≤1×10-16M。在一个实施方案中,术语“较低检测限”意指生物样品中特定核酸分子的浓度为1×10-11M至1×10-17M、或1×10-12M至1×10-17M、或1×10-13M至1×10-17M、或1×10-14M至1×10-17M、或1×10-15M至1×10-17M、或1×10-16M至1×10-17M。
在一个实施方案中,术语“较低检测限”意指生物样品中特定核酸分子的数目为≤10000、或≤5000、或≤2500、或≤1000、或≤500、或≤250。在一个实施方案中,术语“较低检测限”意指生物样品中特定核酸分子的数目为20至10000、或20至5000、或20至2500、或20至1000、或20至500、或20至250。在一个实施方案中,术语“较低检测限”意指生物样品中特定核酸分子的数目为50至10000、或50至5000、或50至2500、或50至1000、或50至500、或50至250。在一个实施方案中,术语“较低检测限”意指生物样品中特定核酸分子的数目为100至10000、或100至5000、或100至2500、或100至1000、或100至500、或100至250。
在一个实施方案中,本文所述的特定核酸分子的浓度或数目是指在包含从生物样品(其中特定RNA分子被转化成相应的cDNA分子)分离/获得的DNA或cDNA的批次A中的特定核酸分子的浓度或数目。在一个实施方案中,本文所述的特定核酸分子的浓度或数目是指从生物样品分离/提取的RNA中特定核酸分子的浓度或数目。
在一个实施方案中,用根据本发明方法的步骤(ii)中的三个或更多个等分试样中的每一个进行的独立PCR是预扩增PCR反应。
根据本发明的优选的生物样品选自体液、组织、细胞、细胞裂解物和细胞培养物上清液。
优选的体液选自血清、血浆、精浆、水囊肿液、精囊肿液、全血、尿、羊水、渗出液、痰、唾液和脑脊液。在一个实施方案中,体液是血清。
组织优选地选自天然组织、速冻组织以及福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的组织。
在一些具体的实施方案中,组织是肿瘤组织。
本文使用的术语“肿瘤”是指无论为恶性(癌性)或良性的基于赘生细胞生长和增殖的块。在一个实施方案中,肿瘤是实体肿瘤。在一个实施方案中,肿瘤衍生自选自以下的癌症:白血病,精原细胞瘤,黑素瘤,畸胎瘤,淋巴瘤,神经母细胞瘤,神经胶质瘤,睾丸癌,膀胱癌,直肠癌,子宫内膜癌,肾癌,肾上腺癌,甲状腺癌,血癌,皮肤癌,脑癌,宫颈癌,肠的癌(intestinal cancer),肝癌,结肠癌,胃癌,肠癌(intestine cancer),头颈癌,胃肠癌,淋巴结癌,食管癌,结肠直肠癌,胰腺癌,耳、鼻和喉咙(ENT)癌症,乳腺癌,前列腺癌,子宫癌,卵巢癌和肺癌,及其转移。在一个实施方案中,癌症是睾丸癌。
在一个实施方案中,批次A包含从生物样品分离/获得的cDNA。
在一个实施方案中,步骤(i)包括以下步骤:
(ia)从生物样品分离RNA;以及
(ib)将步骤(ia)中分离的RNA转化成cDNA,从而提供包含所述cDNA的批次A。
用于从生物样品中分离(或提取)RNA(例如总RNA或miRNA)的方式和方法是本领域技术人员已知的,并且包括市售的试剂盒,例如RNeasy Mini试剂盒和miRNeasy Mini试剂盒(两者均来自Qiagen)。
将RNA转化成cDNA的步骤优选通过使用酶逆转录酶的逆转录(RT)进行。用于逆转录和合成cDNA的方式和方法是技术人员已知的,并且包括市售试剂盒,例如microRNA RT试剂盒(Life Technologies)。
根据本发明的优选的基于PCR的方法是定量实时PCR(qRT-PCR)和数字PCR(dPCR)。
在一个实施方案中,qRT-PCR是包括使用荧光标记的探针之基于荧光的qRT-PCR。在一个实施方案中,荧光标记的探针由用荧光报道染料和猝灭染料两者标记的寡核苷酸组成(=双标记探针)。合适的荧光报道和淬灭染料/部分是本领域技术人员已知的,并且包括但不限于报道染料/部分6-FAMTM、JOETM、和以及淬灭染料/部分dabcyl、TAMRATM和BHQTM-1、BHQTM-2或BHQTM-3。探针特异性产物的扩增导致探针的切割(=扩增介导的探针置换),从而产生报道物荧光的增加。用于基于荧光的qRT-PCR的其他合适荧光染料包括和Green。通常,反应中荧光的增加(实时测量)与靶标扩增的增加成正比。
dPCR是用于核酸分子的绝对定量和检测的常规qRT-PCR的替代方法。dPCR通过将DNA或cDNA的样品分成许多单独的平行PCR反应来工作;这些反应中的一些包含靶核酸分子(阳性),而另一些没有(阴性)。单个分子可以被扩增百万倍或更多。在扩增期间,染料标记的探针用于检测序列特异性靶标。当不存在靶序列时,没有信号累积。在PCR分析之后,使用阴性反应的分数(fraction)来产生样品中靶分子数的绝对计数,而不需要标准物或内源对照。
本发明还提供了检测对象中的疾病或病症或者确定对象中的疾病或病症的程度/进展的方法,所述方法包括(a)从所述对象获得生物样品,以及(b)用本文所述的方法确定所述生物样品中特定核酸分子的表达水平,其中所述生物样品中所述特定核酸分子的表达水平指示所述对象中所述疾病或病症的存在、不存在和/或程度/进展。在一个实施方案中,所述疾病或病症是癌症,例如本文所述的癌症。
如本文所使用的术语“对象”涉及任何生物体,例如脊椎动物,特别是任何哺乳动物,包括人和另一种哺乳动物(例如动物如啮齿类动物、兔或非人灵长类动物(例如,猴))两者。啮齿类动物可以是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或者栗鼠。优选地,对象是人。在一个实施方案中,对象是具有或疑似具有疾病或病症,特别是本文所述疾病或病症的对象,其在本文中也被称为“患者”。
本发明通过以下实施例进一步举例说明,其不被解释为限制本发明的范围。
实施例
比较例1
a)RNA分离
从血清样品中,使用QIAGEN miRNeasy Mini试剂盒根据制造商的说明书(进行微小修改)对血清样品分离总RNA:对于200μl血清,使用1ml的QIAzol和200μl氯仿。
b)cDNA合成
为了定量血清样品中的miR-371a-3p,使用microRNA RT试剂盒(LifeTechnologies)以及由miR-371a-3p和miR-93-5p(用于归一化)的1μl每种茎环引物组成的引物库(Life Technologies,测定ID:002124(miR-371a-3p)和000432(miR-93-5p))逆转录6μl的总RNA。
c)预扩增
因为血清中的低浓度RNA/miRNA,所以在qRT-PCR之前进行了预扩增步骤。预扩增反应由4μl的逆转录(RT)产物,miR-371a-3p和miR-93-5p各1.12μl测定剂(assay)(1∶100稀释),4μl 5x Real Time ready cDNA Pre-Amp Master(Roche,Mannheim,德国)和加至总反应体积为20μl的无核酸酶的水组成。预扩增在95℃下进行1分钟,随后在95℃下15秒并且在60℃下4分钟进行14个循环。然后将预扩增产物在无核酸酶的水中以1∶2稀释,并将5μl稀释的预扩增产物用于qRT-PCR。
qRT-PCR反应由10μl的FASTstart Universal Probe Master(Roche,Mannheim,德国)、1μl的特异性测定剂和20μl总反应体积中的无核酸酶的水组成。qRT-PCR在7500 FastReal-Time PCR系统(Life Technologies)上以以下循环条件进行:在95℃下10分钟,然后在95℃下15秒并且在60℃下1分钟进行40个循环。使用ΔΔCt方法计算相对数量(RQ)。
在预扩增步骤期间,如果确定发生在qRT-PCR方法的较低检测限下,则常常会出现问题。将miRNA分子吸移到cDNA合成中,并以1∶1转录为cDNA分子。这意味着如果最初只有少量的miRNA分子,这也只能产生相同少量的cDNA。如果在另一个实验期间重现该结果,那么统计学上不可能将相同准确量的cDNA/miRNA分子吸移到反应管中用于再次预扩增。对此的解释是,例如,在完整的反应管中存在10个miRNA或cDNA分子。如果将某一等分试样从该管吸移出到用于预扩增的下一个反应管中,那么由于统计概率,每次都不可能取出相同量的cDNA/miRNA分子。由此可能的是,在一个吸移步骤期间,5个cDNA/miRNA分子、8个分子、3个分子或甚至没有一个分子被转移到下一个预扩增反应中。我们的实验已经示出,这就是为什么在较低检测限下的可重现结果是非常困难或者甚至不可能的原因。
在表1中,示出了一个样品的miRNA分析结果,其通过单独的cDNA合成、预扩增和qRT-PCR分别在RNA分离两次(A和B)之后进行处理。这里可以清楚地看出在“A”运行中的样品的miRNA-371a-3p的Ct值与“B”运行中获得的那些明显不同。相比之下,相同样品的miRNA-93的Ct值在每次运行中几乎相同。这导致相同样品的靶miRNA-371a-3p的运行“A”和“B”之完全不同的表达水平。这种现象是由于极少量的miRNA分子的统计学分布:如果与用于cDNA合成的1005个分子相比,例如存在1002个miRNA分子,则预扩增和qRT-PCR之后的Ct值差异几乎不可见。但是,如果与吸移到预扩增反应中的5个分子相比只存在2个分子,则差异在预扩增过程的循环(例如,14个循环)期间呈指数增长,并且表达水平差异巨大(各自的Ct值在qRT-PCR之后检测)。假设在每个循环期间100%效率的复制,则在预扩增的14个循环之后,2个分子变成16,384个分子并且5个分子变成6,103,515,625个分子。
表1:测试qRT-PCR中测量的重现性的实验总结(A和B是相同样品的不同运行);靶标名称=测量的miRNA;Ct=阈值循环;Ct平均值=qRT-PCR一式三份的平均值)。
样品名称 | 靶标名称 | Ct | Ct平均值 |
8594 A | miR-371a-3p | 43.377 | 43.458 |
8594 A | miR-371a-3p | 43.520 | 43.458 |
8594 A | miR-371a-3p | 43.476 | 43.458 |
8594 B | miR-371a-3p | 29.493 | 29.460 |
8594 B | miR-371a-3p | 29.479 | 29.460 |
8594 B | miR-371a-3p | 29.408 | 29.460 |
8594 A | miR-93-5p | 12.780 | 12.791 |
8594 A | miR-93-5p | 12.814 | 12.791 |
8594 A | miR-93-5p | 12.779 | 12.791 |
8594 B | miR-93-5p | 12.580 | 12.631 |
8594 B | miR-93-5p | 12.644 | 12.631 |
8594 B | miR-93-5p | 12.670 | 12.631 |
这些差异也可以在表2中看出,其中将通常表达非常高水平的miRNA-371a-3p的细胞系(HT 27)稀释直到达到较低检测限,以使得发生Ct值的变化。
表2:miRNA的稀释系列;靶标名称=测量的miRNA;Ct=阈值循环;Ct平均值=qRT-PCR一式两份的平均值;检测不到=qRT-PCR期间无可检测的信号)。
样品名称 | 靶标名称 | Ct | Ct平均值 | 稀释 |
1)HT 27(1) | miR-371a-3p | 11.931 | 11.883 | 1∶250 |
1)HT 27(1) | miR-371a-3p | 11.836 | 11.883 | |
1)HT 27(2) | miR-371a-3p | 12.101 | 11.998 | |
1)HT 27(2) | miR-371a-3p | 11.896 | 11.998 | |
1)HT 27(3) | miR-371a-3p | 11.985 | 11.975 | |
1)HT 27(3) | miR-371a-3p | 11.964 | 11.975 | |
2)HT 27(1) | miR-371a-3p | 15.277 | 15.310 | 1∶2500 |
2)HT 27(1) | miR-371a-3p | 15.342 | 15.310 | |
2)HT 27(2) | miR-371a-3p | 15.394 | 15.386 | |
2)HT 27(2) | miR-371a-3p | 15.378 | 15.386 | |
2)HT 27(3) | miR-371a-3p | 15.426 | 15.419 | |
2)HT 27(3) | miR-371a-3p | 15.412 | 15.419 | |
3)HT 27(1) | miR-371a-3p | 18.596 | 18.582 | 1∶25000 |
3)HT 27(1) | miR-371a-3p | 18.569 | 18.582 | |
3)HT27(2) | miR-371a-3p | 18.552 | 18.548 | |
3)HT 27(2) | miR-371a-3p | 18.544 | 18.548 | |
3)HT 27(3) | miR-371a-3p | 18.797 | 18.758 | |
3)HT 27(3) | miR-371a-3p | 18.720 | 18.758 | |
4)HT 27(1) | miR-371a-3p | 22.241 | 22.258 | 1∶250000 |
4)HT 27(1) | miR-371a-3p | 22.274 | 22.258 | |
4)HT 27(2) | miR-371a-3p | 21.958 | 21.924 | |
4)HT 27(2) | miR-371a-3p | 21.889 | 21.924 | |
4)HT 27(3) | miR-371a-3p | 21.961 | 21.958 | |
4)HT 27(3) | miR-371a-3p | 21.955 | 21.958 | |
5)HT 27(1) | miR-371a-3p | 25.487 | 25.516 | 1∶2500000 |
5)HT 27(1) | miR-371a-3p | 25.546 | 25.516 | |
5)HT 27(2) | miR-371a-3p | 25.355 | 25.328 | |
5)HT 27(2) | miR-371a-3p | 25.301 | 25.328 | |
5)HT 27(3) | miR-371a-3p | 25.064 | 25.038 | |
5)HT 27(3) | miR-371a-3p | 25.013 | 25.038 | |
6)HT 27(1) | miR-371a-3p | 26.831 | 26.826 | 1∶25000000 |
6)HT 27(1) | miR-371a-3p | 26.820 | 26.826 | |
6)HT 27(2) | miR-371a-3p | 34.186 | 34.218 | |
6)HT 27(2) | miR-371a-3p | 34.251 | 34.218 | |
6)HT 27(3) | miR-371a-3p | 29.800 | 29.785 | |
6)HT 27(3) | miR-371a-3p | 29.769 | 29.785 | |
7)HT 27(1) | miR-371a-3p | 检测不到 | 检测不到 | 1∶250000000 |
7)HT 27(2) | miR-371a-3p | 检测不到 | 检测不到 | |
7)HT 27(2) | miR-371a-3p | 检测不到 | 检测不到 | |
7)HT 27(3) | miR-371a-3p | 检测不到 | 检测不到 | |
7)HT 27(3) | miR-371a-3p | 检测不到 | 检测不到 |
在另一个实验中,限定量的人造miRNA(所谓的cel-miRNA-39)示例性地用于cDNA合成。结果示于表3中。再次,可以看到在约100个miRNA分子(大约0.0000000002皮摩尔)下出现关于Ct值的主要差异。
表3:分子水平的miRNA cel-miRNA-39稀释;靶标名称=测量的miRNA;Ct=阈值循环;Ct平均值=qRT-PCR一式两份的平均值;Ct MV=相同样品三个预扩增运行的平均值;理论Ct=基于最高浓度的值,以数学方式确定的Ct值;ud=检测不到,qRT-PCR期间无可检测的信号)。
e)总结
上述数据表明,在较低检测限下产生可靠结果的问题与预扩增步骤相关。如果对样品进行预扩增,并使用qRT-PCR测量该预扩增产物,则这导致每次一致的结果(参见表1、表2和表3中一式三份/一式两份的qRT-PCR测定)。然而,如果在一个cDNA反应管中进行几个预扩增,并且根据统计学,这些预扩增包括不同量的cDNA分子,则这导致后续qRT-PCR中Ct值的显著差异。尽管最佳混合过程,不可能将来自cDNA合成的少量cDNA分子等份地分配到预扩增的反应管中。此后,出现错误,并且存在变化很大的Ct值。这由14个循环每一个的分子数加倍来解释。
实施例1
对于预扩增过程,在cDNA合成之后将样品分到三个反应管中。然后,分别用这三个反应管的每一个进行qRT-PCR(参见表4和图1)。为了考虑Ct值的偏差和所得到的不同表达水平(此处示例性地用于miR-371a-3p),以数学方式确定三个RQ值的平均值(算术平均值)(RQ=相对数量=表达)。
表4:qRT-PCR的结果;RQ=相对数量;数学RQ-MV Ct=RQ的数学平均值;平均值=qRT-PCR一式三份的平均值;检测不到=qRT-PCR期间无可检测的信号。
样品 | RQ | 数学RQ-MV | 371a-3p的Ct平均值 | 93的Ct平均值 |
90(1) | 0.000 | 检测不到 | 11.179 | |
90(2) | 9.389 | 3.130 | 30.289 | 11.442 |
90(3) | 0.000 | 检测不到 | 11.548 | |
71(1) | 14.986 | 31.809 | 13.637 | |
71(2) | 22.193 | 12.393 | 31.249 | 13.644 |
71(3) | 0.000 | 检测不到 | 13.651 |
实施例2
如实施例1在cDNA合成之后将样品分到三个用于预扩增的反应管中。之后,从三个预扩增反应管的每一个中取出相同的体积,并将其一起吸移到一个反应管中,并充分混合用于单个后续qRT-PCR(参见图2)。
进行了一式三份的预扩增以分别补偿Ct值和确定的表达水平中的差异。这些差异可以通过计算RQ值的平均值(实施例1=计算的平均值/算术平均值)或者如实施例2中通过混合三种预扩增反应并在后续qRT-PCR分析中使用混合物来补偿,从而产生用于解释结果的方法平均值/测量平均值。该研究的结果列于表5中。
表5:qRT-PCR的结果;RQ=相对数量;数学RQ-MV Ct=RQ的数学平均值;Ct平均值=qRT-PCR一式三份的平均值;检测不到=qRT-PCR期间无可检测的信号;Zus=根据实施例2的方案处理样品(方法平均值)。
综上所述,本发明的方法提供了甚至在~0.0000000002皮摩尔的较低检测限下以准确和可靠的方式分析特定核酸分子的可能性。
Claims (18)
1.确定生物样品中靶核酸分子的水平的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)提供包含从所述生物样品分离/获得的靶核酸的批次A;
(ii)提供步骤(i)中提供的批次A的三个或更多个等分试样,并用所述三个或更多个等分试样中的每一个进行独立的聚合酶链式反应以扩增所述靶核酸分子,从而提供包含经扩增的靶核酸分子的三个或更多个批次B;以及
(iii)将等量的所述三个或更多个批次B混合,从而提供批次C,并通过基于PCR的方法确定批次C中所述靶核酸分子的水平,
其中在步骤(iii)中确定的水平对应于所述生物样品中所述靶核酸分子的水平。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述生物样品中所述靶核酸分子的浓度为1×10- 11M至1×10-17M。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述生物样品中所述靶核酸分子的浓度为1×10- 12M至1×10-17M。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述生物样品中所述靶核酸分子的浓度为1×10- 13M至1×10-17M。
5.根据权利要求2所述的方法,其中所述生物样品中所述靶核酸分子的浓度为1×10- 14M至1×10-17M。
6.根据权利要求2所述的方法,其中所述生物样品中所述靶核酸分子的浓度为1×10- 15M至1×10-17M。
7.根据权利要求2所述的方法,其中所述生物样品中所述靶核酸分子的浓度为1×10- 16M至1×10-17M。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述靶核酸分子选自靶miRNA、靶无细胞循环DNA、靶mRNA、靶siRNA和靶snRNA。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述靶无细胞循环DNA是靶无细胞循环肿瘤DNA。
10.根据权利要求8所述的方法,其中所述靶核酸分子是靶miRNA。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述生物样品选自体液、组织、细胞、细胞裂解物和细胞培养物上清液。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述体液选自血清、血浆、精浆、水囊肿液、精囊肿液、全血、尿、羊水、渗出液、痰、唾液和脑脊液。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述组织选自天然组织、速冻组织以及福尔马林固定和石蜡包埋的组织。
14.根据权利要求11所述的方法,其中所述组织是肿瘤组织。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中批次A包含从所述生物样品分离/获得的cDNA。
16.根据权利要求15所述的方法,其中步骤(i)包括以下步骤:
(ia)从所述生物样品分离RNA;以及
(ib)将步骤(ia)中分离的所述RNA转化成cDNA,从而提供包含所述cDNA的批次A。
17.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中在步骤(ii)中提供批次A的三个等分试样。
18.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述基于PCR的方法是定量实时PCR或数字PCR。
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