CN113278701B - 一组外泌体中miRNAs在制备肾细胞癌标志物中的应用及其试剂盒 - Google Patents

一组外泌体中miRNAs在制备肾细胞癌标志物中的应用及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备肾细胞癌标志物，尤其涉及一组外泌体中miRNAs在制备肾细胞癌标志物中的应用及其试剂盒。外泌体中miR‑23b‑5p、miR‑34c‑5p、miR‑210‑3p、miR‑508‑3p在制备诊断和预示前列腺癌标志物中的联合应用，该方法使用Taqman荧光RT‑PCR法，在单管中实现对外泌体miRNA靶标miR‑23b‑5p、miR‑34c‑5p、miR‑210‑3p、miR‑508‑3p的检测，根据检测后得到的Ct值，通过二元Logistic线性回归拟合，获得肾癌发生概率的计算公式。该试剂盒具有取样简便、操作简单、耗时短、经济实用、结果客观的有点，且临床性能优于现有的肾癌诊断技术，具有良好的应用前景。

Description

一组外泌体中miRNAs在制备肾细胞癌标志物中的应用及其试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种制备肾细胞癌标志物，尤其涉及一组外泌体中miRNAs在制备肾细胞癌标志物中的应用及其试剂盒。
背景技术
肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC)，简称肾癌，是最常见的肿瘤之一，在我国泌尿生殖系统肿瘤中占第二位，仅次于膀胱肿瘤，约占成人恶性肿瘤的3％，也是泌尿系统中恶性度较高的肿瘤，肾癌对放、化疗均不敏感。手术切除仍然是目前治疗肾癌唯一有效的方法，但术后仍有20％～40％的患者会复发，病死率超过40％。肾癌亦缺乏用于早期诊断的肿瘤标志物，探寻新的有效的肿瘤标志物，对于肾癌的诊疗而言已是刻不容缓。
目前，对肾癌的临床检测方法主要依赖于尿潜血检测、生化检查以及包括MRI和CT扫描在内的影像学方法。这些方法均具有明显的局限性。其中尿潜血检测对RCC的尿潜血检查许多是基于对尿液中少量血液的检测，然而在许多病例中只有当肾脏肿瘤达到相当巨大的程度时才会出现尿血的症状，灵敏度低。生化检查缺乏特异性，只能反应身体的总体情况，而难以对肾癌进行明确的鉴别。而影像学检查难以发现早期肾癌肿瘤，且价格较贵，需要大型仪器进行检查，操作繁琐。
外泌体(Exosomes)是大小为30-150nm、由活细胞分泌的小囊泡。肾肿瘤细胞分泌的外泌体是和外界细胞信息传递的重要介质，通过携带并传递生物活性物质(如miRNA，incRNA，蛋白质)发挥作用，在肾肿瘤发生，进展，转移及耐药中发挥着重要作用。通过分析外泌体可以直接获得癌细胞的基本信息，且无基因组背景的干扰，因此，外泌体及其内容物已成为肾癌早期诊断的新型生物标记物。
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码的小分子单链RNA，长约19～25个核苷酸，具有转录后水平的基因表达调控作用。miRNAs通过与其目标mRNA3’端非编码区(3’UTR)的碱基互补配对结合，可引起翻译的抑制和(或)目标mRNA的降解。miRNAs可调控包括细胞增殖、分化、周期以及肿瘤形成在内的多种关键性的细胞行为。近年来，大量的研究表明在肿瘤中经常会发生miRNAs的异常表达，其中的一些miRNAs具有抑癌或致癌的作用。由于外泌体中miRNAs具有组织和疾病特异性表达的特性且具有巨大的调控潜能，外泌体miRNAs已被认为具有成为新的有效的肿瘤标志物的潜能。
发明内容
本发明主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种标志物、试剂盒，可用于肾癌辅助诊断，具有灵敏度高，特异性好，样本采集方便，操作简单的优点的一组外泌体中miRNAs在制备肾细胞癌标志物中的应用及其试剂盒。
本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：
一组外泌体中miRNAs在制备肾细胞癌标志物中的应用及其试剂盒，一组引物、探针组合，包括特异性反转录miR-23b-5p靶标的反转录引物R-23b，荧光PCR检测使用的通用正向引物Ge-F、特异性反向引物23b-R、特异性探针23b-P；特异性反转录miR-34c-5p靶标的反转录引物R-34c，荧光PCR检测使用的通用正向引物Ge-F、特异性反向引物34c-R、特异性探针34c-P；特异性反转录miR-210-5p靶标的反转录引物R-210，荧光PCR检测使用的通用正向引物Ge-F、特异性反向引物210-R、特异性探针210-P；特异性反转录miR-508-5p靶标的反转录引物R-508，荧光PCR检测使用的通用正向引物Ge-F、特异性反向引物508-R、特异性探针508-P。
联合应用方法，按以下步骤进行：
外泌体中miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p在制备诊断和预示肾癌标志物中的四种靶标联合应用，通过miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p联合检测，并建立Logistic回归模型，作为肾癌早期诊断指标，提高诊断和预示肾癌的检测性能；
miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p联合应用的判断公式：p＝1/[1+exp(-z)]，z＝52.3-0.18*A-0.33*B-0.79*C-0.76*D,其中A为miR-23b-5p检测的Ct值，B为miR-34c-5p检测的Ct值，C为miR-210-3p检测的Ct值，D为miR-508-3p检测的Ct值。
外泌体中的miRNAs靶标的检测方法，按以下步骤进行：
包括miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p联合检测肾癌的试剂盒；
其组分包括：反转录试剂、引物探针混合试剂、PCR试剂、阳性质控品、阴性质控品；
经过前处理的受检者尿液样本，只需反转录及PCR上机两个步骤，即可在同管样本中完成四个靶点的检测，根据检测结果，代入回归公式：
i-Score＝1/[1+exp(-z)]，z＝52.3-0.18*A-0.33*B-0.79*C-0.76*D,其中A为miR-23b-5p检测的Ct值，B为miR-34c-5p检测的Ct值，C为miR-210-3p检测的Ct值，D为miR-508-3p检测的Ct值；
即可得出Mi-Score，当检测的Mi-Score大于0.65时，表明受检者患肾癌风险较高，当检测的Mi-Score小于0.65时，表明受检者患肾癌风险较低。
效果：
一种检测快速方便、准确率高，可以实现肾癌早期的辅助诊断的外泌体miRNA检测试剂盒，以及提供外泌体中miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p联合使用作为肾癌分子标记物的应用。
在于提供尿液外泌体中miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p联合检测肾癌的试剂盒，该试剂盒使用多重qRT-PCR技术，在一份尿液样本中同时检测外泌体中miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p四种标志物。此外还制定了miRNA的阳性质控品及阴性质控品，以控制试剂盒整个检测过程。阳性质控品为合成的miRNA混合物，阴性质控品为超纯水。
目的是提供一种外泌体中miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p在制备诊断和预示前列腺癌标志物中的联合应用，该方法使用Taqman荧光RT-PCR法，在单管中实现对外泌体miRNA靶标miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p的检测，根据检测后得到的Ct值，通过二元Logistic线性回归拟合，获得肾癌发生概率的计算公式。
一组联合检测肾癌外泌体中的miRNA靶标，靶标包括miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p，并以此四个靶点建立了Logistic回归模型，该模型可得出肾癌风险指数Mi-Score，可作为肾癌早期诊断指标，提高诊断和预示肾癌的检测性能。
此外，本发明还提供一种基于以上技术的检测试剂盒及其应用，该试剂盒具有取样简便、操作简单、耗时短、经济实用、结果客观的有点，且临床性能优于现有的肾癌诊断技术，具有良好的应用前景。
附图说明
图1肾癌外泌体miRNA检测miR-23b-5p靶标扩增图；
图2肾癌外泌体miRNA检测miR-34c-5p靶标扩增图；
图3肾癌外泌体miRNA检测miR-210-3p靶标扩增图；
图4肾癌外泌体miRNA检测miR-508-3p靶标扩增图；
图5四靶点联合指标Mi-Score与单靶点指标检测的ROC曲线比较。
具体实施方式
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例1：如图所示，试剂盒的组成：本实施例的肾癌外泌体miRNA检测试剂盒，包括用于配制反转录反应体系的试剂、用于配制PCR体系的引物探针混合试剂及PCR试剂，用于质控检测过程的阳性质控品和阴性质控品。
1、反转录试剂：
即为5×AMV RT Buffer，其组分构成如下：AMV RT(10U/μl)、0.05μM R-23b、0.05μM R-34c、0.05μM R-210、0.05μM R-508、250mM Tris-HCl(pH 8.3)、250mM KCl、50mMMgCl2、2.5mM精胺、50mM DTT、2.5mM dNTP each。
2、引物探针混合试剂：
组分构成如下：
1μM Ge-F、0.25μM 23b-R、0.25μM 34c-R、0.25μM 210-R、0.25μM 508-R、0.25μM23b-P、0.25μM 34c-P、0.25μM 210-P、0.25μM 508-P。
3、PCR试剂：
即为2×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶(2U/μl)、200mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、60mmol/L MgCl2、350mmol/L KCl、2.5mmol/L DTT、5mM dNTP each。
3、阳性质控品：
合成的模拟miRNA片段组合，其组分构成、浓度及序列如下：
0.1pg/mL miR-23b-5p mimics(5′-AUCACAUUGCCAGGGAUUACCAC-3′)
0.1pg/mLmiR-34c-5p mimics(5′-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3′)
0.1pg/mLmiR-210-3p mimics(5′-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3′)
0.1pg/mLmiR-508-3p mimics(5′-UGAUUGUAGCCUUUUGGAGUAGA-3′)
4、阴性质控品：为分装的超纯水。
实施例2：标准物质配制及线性验证：
1、合成的模拟miRNA片段组合，其组分构成、浓度及序列如下：
10pg/mL miR-23b-5p mimics(5′-AUCACAUUGCCAGGGAUUACCAC-3′)
10pg/mLmiR-34c-5p mimics(5′-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3′)
10pg/mLmiR-210-3p mimics(5′-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3′)
10pg/mLmiR-508-3p mimics(5′-UGAUUGUAGCCUUUUGGAGUAGA-3′)
按以上成分进行配制，并充分混匀，即得到高浓度miRNA标准物质E1,以E1为原液使用超纯水进行10倍稀释，得到E2，以此类推，以10倍为稀释梯度，进行共6次稀释，分别得到E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7共7个浓度的标准物质。
按照以下配方进行反转录：
组分 体积
标准物质 8μL
反转录试剂 2μL
2、荧光PCR上机检测：
配制完成后，16℃下恒温孵育30min，反转录得到延长序列后的cDNA片段。反转录完毕后，按以下配方进行荧光PCR扩增：
组分 体积
cDNA 10μL
引物探针混合试剂 5μL
PCR试剂 15μL
配制完成后，使用以下程序，进行PCR检测：
Figure BDA0003120525460000061
结果如图1-图4所示，miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p四个通道的荧光曲线均呈标准S型，线性相关系数r分别为0.999、0.997、0.987、0.981，有优秀的线性关系。表明本发明建立的多重RT-qPCR在模拟miRNA样本检测中，体现出优良的分析检测性能。
实施例3：
尿液样本肾癌外泌体miRNA检测：
1、尿液外泌体miRNAs提取及反转录：
取受检者尿液约5mL，使用exoEasy Maxi Kit(QIAGEN，CAT:76064)提取尿液中的外泌体，使用Universal microRNA Purification Kit(EZ Bioscience，CAT:EZB-miRN1)提取外泌体中的miRNA提取物。按照以下配方进行反转录：
Figure BDA0003120525460000071
2、荧光PCR上机检测：
配制完成后，16℃下恒温孵育30min，反转录得到延长序列后的cDNA片段。反转录完毕后，按以下配方进行荧光PCR扩增：
组分 体积
cDNA 10μL
引物探针混合试剂 5μL
PCR试剂 15μL
配制完成后，使用以下程序，进行PCR检测：
Figure BDA0003120525460000072
3、代入回归公式与结果判读：
根据荧光PCR的检测结果，代入以下公式：
Mi-Score＝1/[1+exp(-z)]，z＝52.3-0.18*A-0.33*B-0.79*C-0.76*D,其中A为miR-23b-5p检测的Ct值，B为miR-34c-5p检测的Ct值，C为miR-210-3p检测的Ct值，D为miR-508-3p检测的Ct值。当检测的Mi-Score大于0.65时，表明受检者患肾癌风险较高，当检测的Mi-Score小于0.65时，表明受检者患肾癌风险较低。
实施例4：临床样本实验1(训练集)：
从浙江大学附属第一医院收集拟进行肾穿刺活检术的患者尿液247例，使用实施。同时根据实施例3，对尿液外泌体中miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p靶点进行检测，计算得出Mi-Score。以肾穿刺活检术结果作为金标准(247例样本中肾癌为113例，非肾癌为134例)，使用Logistic回归模型计算各miRNA联合判断公式，并绘制ROC曲线(如图5所示)。最终得到Mi-Score的公式为：Mi-Score＝1/[1+exp(-z)]，z＝52.3-0.18*A-0.33*B-0.79*C-0.76*D,其中A为miR-23b-5p检测的Ct值，B为miR-34c-5p检测的Ct值，C为miR-210-3p检测的Ct值，D为miR-508-3p检测的Ct值。同时，以肾穿刺活检术结果作为金标准，以单个外泌体miRNA检测的Ct值作为变量，绘制ROC曲线(如图5所示)，比较四靶点联合检测的性能与单靶点检测的性能发现，其AUC值分别如下：miR-23b-5p+miR-34c-5p+miR-210-3p+miR-508-3p(AUC＝0.908)>miR-23b-5p(AUC＝0.783)>miR-34c-5p(AUC＝0.751)>miR-210-3p(AUC＝0.732)>miR-210-3p(AUC＝0.696)。根据ROC曲线，选取灵敏度为90％附近时，比较各检测体系的特异性等数据，归总如下表1：
Figure BDA0003120525460000081
Figure BDA0003120525460000091
实施例5：临床样本实验2(测试集)：
从浙江大学附属第一医院收集拟进行肾穿刺活检术的患者尿液132例，使用实施。同时根据实施例3，对尿液外泌体中miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p靶点进行检测，计算得出Mi-Score。以肾穿刺活检术结果作为金标准(132例样本中肾癌为67例，非肾癌为65例)，绘制二联表，计算外泌体miRNA肾癌检测的灵敏度、特异性、阴性预测值、阳性预测值等数据(表2)。同时，收集CT扫描图像诊断的信息，共收集CT诊断信息109例，以肾穿刺活检术为金标准，计算肾癌CT检测的灵敏度、特异性、阴性预测值、阳性预测值(表3)。比较肾癌miRNA检测与CT检测的检测性能发现，肾癌miRNA的检测性能明显优于CT扫描图像(表3)。表明肾癌外泌体miRNA具有优良的检测性能，结合其取样简便，操作简单，耗时短，费用低的优势，肾癌外泌体miRNA检测具有广阔的应用前景。
表2
Figure BDA0003120525460000092
表3
Figure BDA0003120525460000093
Figure BDA0003120525460000101
序列：
反转录引物：
R-23b:5’-GTGCTAAGCACAGCAGGGTCCGAGGTATTCGCTGTGCTTAGCACGTGGTA-3’
R-34c:5’-CACGATTCGTGAGCAGGGTCCGAGGTATTCGCTCACGAATCGTGGCAATC-3’
R-210:5’-TGCATCAGATGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACATCTGATGCATCAGCC-3’
R-508:5-CGTACAGTCCAGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCTGGACTGTACGTCTACTC-3’
Ge-F：5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’
23b-R：5’-CATCACATTGCCAGGGAT-3’
34c-R：5’-GCAGGCAGTGTAGTTAGCT-3’
210-R：5’-GGCTGTGCGTGTGACAGC-3’
508-R：5’-GCTGATTGTAGCCTTTTG-3’
23b-P：5’FAM-ACCACGTGCTAAGCACAG-MGB 3’
34c-P：5’VIC-GATTGCCACGATTCGTGAGC-MGB3’
210-P：5’ROX-GCTGATGCATCAGATGTG-MGB 3’
508-P：5’CY5-AGTAGACGTACAGTCCAGG-MGB 3’

Claims (3)

1.一组检测外泌体中miRNAs的引物、探针组合在制备检测肾细胞癌的试剂盒中应用，其特征在于：引物、探针组合，由特异性反转录miR-23b-5p靶标的反转录引物R-23b，荧光PCR检测使用的通用正向引物Ge-F、特异性反向引物23b-R、特异性探针23b-P；特异性反转录miR-34c-5p靶标的反转录引物R-34c，荧光PCR检测使用的通用正向引物Ge-F、特异性反向引物34c-R、特异性探针34c-P；特异性反转录miR-210-3p靶标的反转录引物R-210，荧光PCR检测使用的通用正向引物Ge-F、特异性反向引物210-R、特异性探针210-P；特异性反转录miR-508-3p靶标的反转录引物R-508，荧光PCR检测使用的通用正向引物Ge-F、特异性反向引物508-R、特异性探针508-P组成，
上述反转录引物的序列：
R-23b: 5’-GTGCTAAGCACAGCAGGGTCCGAGGTATTCGCTGTGCTTAGCACGTGGTA-3’
R-34c: 5’-CACGATTCGTGAGCAGGGTCCGAGGTATTCGCTCACGAATCGTGGCAATC-3’
R-210:5’-TGCATCAGATGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACATCTGATGCATCAGCC-3’
R-508:5-CGTACAGTCCAGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCTGGACTGTACGTCTACTC-3’
Ge-F：5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’
23b-R：5’-CATCACATTGCCAGGGAT-3’
34c-R：5’-GCAGGCAGTGTAGTTAGCT-3’
210-R：5’-GGCTGTGCGTGTGACAGC-3’
508-R：5’-GCTGATTGTAGCCTTTTG-3’
23b-P：5’FAM-ACCACGTGCTAAGCACAG-MGB 3’
34c-P：5’VIC-GATTGCCACGATTCGTGAGC-MGB3’
210-P：5’ROX-GCTGATGCATCAGATGTG-MGB 3’
508-P：5’CY5-AGTAGACGTACAGTCCAGG-MGB 3’。
2.基于权利要求1所述的应用，其特征在于试剂盒的使用方法按以下步骤进行：
通过miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p联合检测，并建立Logistic回归模型，作为肾癌早期诊断指标，提高诊断和预示肾癌的检测性能；
miR-23b-5p、miR-34c-5p、miR-210-3p、miR-508-3p联合应用的判断公式：p＝1/[1+exp(-z)]，z=52.3-0.18*A-0.33*B-0.79*C-0.76*D,其中A为miR-23b-5p检测的Ct值，B为miR-34c-5p检测的Ct值，C为miR-210-3p检测的Ct值，D为miR-508-3p检测的Ct值。
3.基于权利要求1所述的应用，其特征在于：
组分包括：反转录试剂、引物探针混合试剂、PCR试剂、阳性质控品、阴性质控品；
经过前处理的受检者尿液样本，只需反转录及PCR上机两个步骤，即可在同管样本中完成四个靶点的检测，根据检测结果，代入回归公式：
Mi-Score＝1/[1+exp(-z)]，z=52.3-0.18*A-0.33*B-0.79*C-0.76*D,其中A为miR-23b-5p检测的Ct值，B为miR-34c-5p检测的Ct值，C为miR-210-3p检测的Ct值，D为miR-508-3p检测的Ct值；
即可得出Mi-Score，当检测的Mi-Score大于0.65时，表明受检者患肾癌风险较高，当检测的Mi-Score小于0.65时，表明受检者患肾癌风险较低。
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