CN105256014B - 乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒 - Google Patents

乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒，研究发现RECQL、RECQL4及RECQL5基因可以作为联合标志物用于制备乳腺癌检测和/或疗效评价试剂。本发明提供的根据以上标志物以及以GAPDH作为内参基因设计的特异性RT‑PCR引物和探针组成试剂盒，能够通过实时荧光定量PCR的方法测定患者外周血单核细胞中以及尿液中游离的RECQL、RECQL4及RECQL5基因mRNA的含量，进行乳腺癌的诊断和疗效评估。与常规诊断方法相比，本发明的方法具有创伤小，快速、高通量、灵敏和特异性好等特点，能更好地进行乳腺癌的早期诊断及疗效评价。

Description

乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物化学与分子生物学领域，具体涉及乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒。
背景技术
中国癌症负担在不断增加，每年有160万人被诊断为癌症，120万人死于癌症。和其他很多国家一样，乳腺癌是中国女性最常见的癌症，在全球范围内，中国占据新诊断乳腺癌病例的12.2％，占据乳腺癌死亡的9.6％。
乳腺癌属于全身性疾病，发病率呈逐年上升、发病年龄呈逐渐年轻化的趋势,作为一种高度异质性肿瘤，早期可出现淋巴或血行转移，是女性常见的恶性肿瘤之一。
虽然目前中国乳腺癌发病率低，但是从90年代以来，中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的两倍多，城市地区尤为显著。目前，乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症，癌症死亡原因位居第六。截至2008年，中国总计169452例新发浸润性乳腺癌，44908例死于乳腺癌，分别占到全世界的12.2％和9.6％。
中国乳腺癌全年检出人数是欧洲(2008年共计332000例，总人口四亿九千八百万)的一半，与美国(2008年共计182000例，总人口三亿零四百万)基本相当。如果这一趋势保持不变，到2021年，中国乳腺癌患者将高达250万，发病率将从不到60例/10万女性(年龄在55岁到69岁之间)增加到超过100例/10万女性。(Lancet Oncol 2014；15(7):e279-e289)
目前，国际上对乳腺癌的预警和早期诊断的技术主要有以下三种：
1.临床体格检查：定期接受临床体格检查是早期发现乳腺癌的有效方法之一。始于1963年纽约的健康保险计划(HIP)，历经18年研究发现，接受定期临床体格检查的妇女乳腺癌死亡率比对照组低23％。我国也开展了一系列乳腺癌的预防工作，但是，乳腺癌普查耗资巨大，成本/效果比高。
2.影像学诊断法：影像学检查是以钼靶X线摄片为主要手段，辅以超声扫描和MRI扫描。钼靶X线摄片方法能发现细小钙化点，如果表现为泥沙样钙化或细颗粒样钙化，或者每1cm2内＜0.5mm的超过5枚则可提示乳腺癌。但对于不典型的病变，尤其是致密型乳腺内的病变及近胸壁的病变易漏诊。2014年2月11日发表在著名的《英国医学杂志》上一项研究报告40～59岁女性的每年乳腺钼靶X线检查并不能降低乳腺癌的死亡率，也不优于普通体检的诊断率，而且有22％的女性因为乳腺钼靶X线检查被过度诊断了(British MedicalJournal,2014,348.)。另外，我国女性乳腺小而致密，这也会降低患者接受钼靶检查的阳性率。
3.生物靶标早期检测：包括乳腺癌相关基因普查，例如BRCA1和BRCA2的突变分析；乳头溢液特异物检测及血清肿瘤标志物的测定。Her-2/neu癌基因在乳腺癌中过度表达，在血清中可以检测到Her-2蛋白片断。通过酶联免疫反应测定血清Her-2水平，可以作为诊断乳腺癌的指标之一。但目前分子诊断研究大多关注基因多态性与乳腺癌的关系，只能给出患者的易感风险，不适用于临床疾病的诊断。
因此，本领域迫切需要建立新的乳腺癌检查技术，能够早期客观、灵敏和稳定的诊断乳腺癌,以便进行及时、有针对性的治疗，提高患者的生存质量和生存率，降低医疗成本，节约社会资源。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中检测手段的上述缺陷，提供新的乳腺癌联合诊断标志物。
本发明的另一目的是提供基于上述标志物制备的检测试剂盒，与常规诊断方法相比，本发明试剂盒检测方法具有创伤小、检测快速、高通量、灵敏性和特异性好等特点，能更好地进行乳腺癌的早期诊断及疗效评价。
本发明提供了RECQL、RECQL4及RECQL5基因作为联合标志物在制备乳腺癌检测和/或疗效评价试剂中的应用。
人类RecQ旋解酶是一种多功能DNA旋解酶，能利用水解三磷酸核苷(NTPs)产生的能量分离双核苷酸链，在DNA代谢的多个方面发挥重要作用，参与各种类型的DNA修复，包括错配修复、核苷酸切除修复和直接修复酶。
RECQL、RECQL4及RECQL5基因均是RecQ DNA解旋酶家族的成员。研究表明RECQL基因突变与肿瘤易感性密切相关，如：乳腺癌、骨肉瘤及可切除胰腺癌等。RECQL4广泛参与DNA的复制和损伤修复。早期研究证实，RECQL4突变会导致RTS，BGS和RAPA 3种综合症，其中RTS和BGS患者都有很高的骨肉瘤和淋巴瘤发生倾向。此外，RECQL4还可通过维持线粒体和端粒的基因稳定避免多种肿瘤发生，RECQL4也被认为与血液恶性肿瘤爆发相关。最近的一项研究表明，RECQL5基因位点突变与乳腺癌相关(Tumor Biol.2014；35:12201–12204)。上述基因作为肿瘤的易感基因，目前的研究重点为DNA位点突变与疾病的相关性，但是易感基因位点突变多用来提供某种疾病的患病风险，只检测易感基因的位点突变并不适用于临床进行疾病的诊断和疗效评估。基于此，我们对上述易感基因的表达量与乳腺癌的关系进行了考察。
我们发现并通过研究证实外周血单核细胞中和尿液游离的RECQL、RECQL4及RECQL5基因的mRNA表达水平在患者体液尤其是外周血单核细胞和尿液中发生显著变化，并且这种变化与乳腺癌的发生和治疗密切相关，RECQL、RECQL4及RECQL5基因的mRNA表达可以作为乳腺癌早期诊断及疗效评价的生物标志物。
本发明还提供乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，包括RECQL、RECQL4及RECQL5基因的特异性扩增引物及探针，探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团，非5’端连接有荧光淬灭基团，其中
RECQL扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO1～2所示，
RECQL特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
RECQL4扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示，
RECQL4特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
RECQL5扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示，
RECQL5特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明筛选的上述引物及探针序列，能够高效特异地扩增相应基因，只需采取待检测者的外周血和晨尿即可，可广泛运用于乳腺癌患者RECQL、RECQL4及RECQL5基因扩增水平的检测，采用RT-PCR技术进行三个靶基因的定量测定，具有特异性和灵敏度高、操作简单及易于大通量筛查的优点。
优选地，上述乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，还包括内参基因GAPDH的特异性扩增引物及探针，
GAPDH扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:10～11所示，
GAPDH特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团，非5’端连接有荧光淬灭基团。
GAPDH主要目的是作为内参，以矫正检测偏差，进一步提高引物组的检测精准度。
优选地，上述任一乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。FAM即6-羧基荧光素，TAMRA即6-羧基四甲基罗丹明。
本发明还提供一种乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，包括以上任一所述的检测乳腺癌的特异性RT-PCR引物和探针。
优选地，上述乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒中，还包括阳性模板，阳性模板包括纯化后的：RECQL基因扩增产物、RECQL4基因扩增产物、RECQL5基因扩增产物和GAPDH基因扩增产物。
该四种基因扩增产物的阳性模板，主要用于标准曲线的绘制，方便对检测结果进行定量分析。
优选地，上述乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，分为RECQL、RECQL4、RECQL5和GAPDH这4个基因的实时荧光定量PCR反应体系和这4个基因的阳性模板体系，其中，
每个基因的实时荧光定量PCR反应体系19.0μL，包括PCR反应缓冲液10μL、浓度10μM的该基因扩增引物各0.8μL、浓度2μM的该基因特异性探针1.0μL和RNase-free water 7.2μL；
每个基因的阳性模板体系包括浓度为1×109拷贝/μL的纯化后的该基因扩增产物。
其中PCR反应缓冲液至少含有DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+等，可直接购买市售商品，例如ABI公司产品，也可以自行配制。
本发明还提供以上所述的乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
将RECQL、RECQL4、RECQL5和GAPDH这4个基因的阳性模板进行梯度稀释后加入实时荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应，根据稀释拷贝数和扩增Ct值，绘制每个基因的定量标准曲线；
待检测样本提取总RNA后逆转录为cDNA，以该cDNA为荧光定量PCR模板，加入实时荧光定量PCR反应体系后，进行荧光定量PCR反应，所得扩增Ct值带入相应基因的定量标准曲线，得到样本中该基因的初始表达量；
待检测样本的测定结果用该样本的内参基因GAPDH的结果进行归一化处理，处理后按方程y＝x1+42.016×x2+7.87×x3计算RECQL、RECQL4和RECQL5三个标志物基因的联合预测因子，其中y表示联合预测因子，x1表示样本RECQL基因的表达量，x2表示样本RECQL4基因的表达量，x3表示样本RECQL5基因的表达量；
y小于0.006时待检测样本为阳性，y大于0.006时待检测样本为阴性。
优选地，上述乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒的使用方法中，荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃扩增30s，进行45个循环。
优选地，上述乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒的使用方法中，待检测样本为外周血和/或尿液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过研究发现RECQL、RECQL4及RECQL5基因联合作为乳腺癌标志物使用可以高准确度的检测出疾病，并且，提供的引物和由该引物组成的试剂盒测定样本为外周血和尿液，取材方便，创伤小或无创伤，安全；采用RT-PCR技术进行三个靶基因的定量测定，具有特异性和灵敏度高、操作简单及易于大通量筛查的优点。
本发明可广泛运用于乳腺癌患者RECQL、RECQL4及RECQL5基因扩增水平的检测，可用于乳腺癌的早期诊断和疗效评价，提高病理检测的可重复性和准确性，避免过度组织活检，更准确地筛查出乳腺癌患者，早期治疗干预，可以大大地降低医疗成本和费用，减少医疗资源的浪费，延长部分患者生存期，提高患者生存质量。
附图说明
图1是3个靶基因和1个看家基因的标准曲线；
图2是靶基因在正常对照和治疗前后患者样本中表达的箱线图；
图3是三个靶基因的ROC曲线分析结果；
图4是三个靶基因整合后ROC曲线分析结果；
图5是治疗前后患者样本靶基因表达的ROC曲线分析结果；
图6 RECQL和RECQL5在乳腺癌患者尿液表达的箱线图；
图7 RECQL4在正常对照及乳腺癌患者尿液中的表达箱线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒
试剂盒1
包括8个体系，分别为RECQL、RECQL4、RECQL5和GAPDH这4个基因的实时荧光定量PCR反应体系和这4个基因的阳性模板体系，其中，
每个基因的实时荧光定量PCR反应体系19.0μL，包括PCR反应缓冲液10μL、浓度10μM的该基因扩增引物各0.8μL、浓度2μM的该基因特异性探针1.0μL和RNase-free water 7.2μL；
每个基因的阳性模板体系包括浓度为1×109拷贝/μL的纯化后的该基因扩增产物。
RECQL上游引物：5’-ACAAAGGGCAATCAGGAATCA-3’；
RECQL下游引物：5’-CATTGGCTGACCATTTTCTATGAAC-3’；
RECQL探针序列：5’-AATTCATGCAGGTGCTTACCATGCCAA-3’；
RECQL4上游引物：5’-TCTCTCCCCTGCTGTCACTCA-3’；
RECQL4下游引物：5’-GACAGATTCCCGTTGCTTCCT-3’；
RECQL4探针序列：5’-CTGGCCTGCCACCGTGTCTCAAG-3’；
RECQL5上游引物：5’-AGAAGGTCCCTGTAATTGTTGCA-3’；
RECQL5下游引物：5’-GCCATAGACTTGGCAATATTCCA-3’；
RECQL5探针序列：5’-AAGCCAATGTCAGGTTTGTCGCCCA-3’；
GAPDH上游引物：5’-GCATCCTGGGCTACACTGAG-3’；
GAPDH上游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；
GAPDH探针序列：5’-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACCC-3’。
RECQL、RECQL4、RECQL5和GAPDH特异性的探针的5’端结合有荧光发生基团FAM，3’端结合有荧光淬灭基团TAMRA。
所述PCR反应缓冲液为Taqman反应液(商品名称
Figure BDA0000813948090000071
Universal PCRMaster Mix)。
该试剂盒检测时，加入待检测样本的cDNA。
试剂盒2
包括以下体系：
①RECQL基因特异性引物(上下游引物预混)，10μM；特异荧光探针，2μM；
②RECQL4基因特异性引物(上下游引物预混)，10μM；特异荧光探针，2μM；
③RECQL5基因特异性引物(上下游引物预混)，10μM；特异荧光探针，2μM；
④GAPDH基因特异性引物(上下游引物预混)，10μM；特异荧光探针，2μM；
⑤、⑥、⑦、⑧均为定量阳性模板：分别含有纯化后的RECQL、RECQL4、RECQL5及GAPDH基因的扩增产物，浓度109拷贝/μL。
Figure BDA0000813948090000072
Universal PCR Master Mix，购自ABI公司；
RNase-free water，购自天根生化科技(北京)有限公司。
实施例2本发明所述试剂盒的使用方法
(1)实时荧光定量PCR反应
本发明试剂盒还可以仅包括四个基因的引物和探针，以及四个基因的扩增产物阳性模板，然后辅助现有的实时荧光定量PCR试剂盒一起进行检测。
单一基因实时荧光定量PCR反应体系
反应试剂 体积(μL)
PCR反应缓冲液 10
引物Primer F/R(10μM) 0.8
探针(2μM) 1.0
cDNA 1.0
RNase-free water 7.2
总体积 20
注：上述反应试剂采用美国ABI公司Taqman荧光定量试剂盒，也可用其他公司同类型产品。
PCR的扩增条件为：95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃扩增30s，进行45个循环。
(2)绘制标准曲线
将试剂盒中提供的已知浓度的定量阳性模板按10倍稀释法稀释成浓度范围为103～107拷贝/μL的5个浓度梯度，按照上述反应体系和扩增条件进行反应，结束后根据稀释拷贝数和扩增Ct值，获知标准曲线y＝A×log x+B，R2，其中x表示起始模板拷贝数，y表示Ct值，A和B为具体数值，要求R2值要大于0.99(R2表示所建立方程相关系数，越接近于1，表明所建立的方程越好)。
(3)样本检测
采用Trizol法(Invitrogen,USA)从患者的1mL新鲜EDTA抗凝外周血提取总RNA，然后使用美国Thermo Scientific公司的第一链cDNA合成试剂盒(RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit)将上述总RNA反转录为cDNA，以该cDNA作为荧光定量PCR的模板，依照上述反应体系和扩增条件进行反应即可，反应结果带入上述标准曲线进行计算，可得到样本中靶基因的初始拷贝值。
(4)结果判断
待检测样本的测定结果用该样本的内参基因的结果进行归一化处理，处理后按方程y＝x1+42.016×x2+7.87×x3计算三个靶基因的联合预测因子，其中y表示联合预测因子，x1表示样本RECQL基因的表达量，x2表示样本RECQL4基因的表达量，x3表示样本RECQL5基因的表达量。
y小于0.006时为阳性，大于0.006时为阴性。
实施例3三个靶基因标准曲线的建立及方法重复性：
(1)标准曲线的制备
模板：采用本发明试剂盒的定量阳性模板绘制定量标准曲线，检测试剂盒的测定重复性。
仪器：美国ABI公司7300型实时荧光定量PCR仪。
方法：分别将三个靶基因(RECQL、RECQL4、RECQL5)及一个看家基因(GAPDH)的阳性模板10倍倍比稀释，依次稀释到107、106、105、104及103拷贝/μL。各取1μL进行实时荧光定量PCR反应。
标准曲线见附图1，RECQL标准曲线方程为：y＝-3.8833x+41.323，相关系数R2＝0.9969；RECQL4标准曲线方程为：y＝-4.036x+37.778，相关系数R2＝0.9990；RECQL5标准曲线方程为：y＝-3.95x+38.905，相关系数R2＝0.9978；GAPDH标准曲线方程为：y＝-3.7331x+43.275，相关系数R2＝0.9979。
从图1可以看出，用阳性模板所作的标准曲线和Ct值与初始拷贝数有很好的线性关系。
实施例4试剂盒检测体系的批内和批间重复性
随机取任一样本，在一次实验中重复6次同时检测，考察批内重复性；随机取任一样本，在不同时间重复6次反应，考察批间重复性，结果见表2。
表2批内和批间基因重复性
Figure BDA0000813948090000091
由表2可知，该试剂盒检测方法体系的批内基因绝对量的RSD为0.54％，批间基因绝对量的RSD为1.37％，均小于5％。以上数据充分说明所建立的检测方法体系具有很好的批内和批件重复性，可以保证测定结果的准确可靠。
实施例5临床血液样本检测
(1)临床样本收集：
本研究共收集到50例健康志愿者样本，49例乳腺癌患者样本(II期，手术前)及22例治疗后患者样本(II期，手术后)。
(2)新鲜外周血中总RNA的提取：
1)EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝的全血1mL，5000rpm离心10min，弃血浆，加入红细胞裂解液1mL，充分混匀，置冰上反应15min，5000rpm离心5min；
2)弃上清液，加入PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)1mL，充分混匀，5000rpm离心5min；重复操作三次，至上清液透明，弃上清液；
3)下层沉淀细胞中加入1mL Trizol试剂，充分混匀，室温放置5min；
4)加入氯仿200μL，充分混匀30s，室温放置3min，10000rpm离心20min；
5)取上清液500μL，至新的PE管中，加入异丙醇500μL，混匀后-80℃放置过夜；
6)从-80℃取出PE管，室温溶化后，10000rpm离心30min，弃上清液，加入1mL、75％乙醇－DEPC水(V/V，DEPC为焦碳酸二乙酯)溶解，充分混匀，7500rpm离心10min；
7)弃上清液，沉淀室温风干，加入22μL的DEPC水溶解,得总RNA溶液，待用，或-80℃保存。
(3)cDNA的合成：
1)取2μL总RNA溶液，50倍稀释，经紫外分光光度仪测定OD(吸光度)，计算上述提取所得总RNA的浓度，并检测OD260/280≥1.8确定纯度；
2)取0.2μg总RNA和逆转录试剂，按表3的cDNA合成反应体系，加样进行反应；所述试剂采用美国Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，也可用其他公司同类型产品；
表3：cDNA合成的反应体系
反应试剂 体积(μL)
10×Buffer RT 2
dNTP Mix(2.5mM each dNTP) 2
Oligo-dT Primer(10μm) 2
Quant Reverse Transcriptase 1
RNasin-free water 12
样品总RNA(0.2μg) 1
总体积 20
3)将反应体系置于37℃孵化60min，cDNA产物-20℃保存。
(4)样本定量检测
以样本cDNA作为模板，采用Taqman反应法，在ABI Prism 7300实时荧光PCR扩增仪中进行反应，反应体系及反应条件见表1。PCR的扩增条件为：95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃扩增30s，进行45个循环。
采用建立标准曲线的绝对定量法对RECQL、RECQL4及RECQL5基因表达水平进行检测，发现乳腺癌患者血液样本中靶基因RECQL、RECQL4及RECQL5的表达量(与内参进行归一化)显著低于正常样本，且经过手术和放化疗治疗后，其表达水平可得到一定程度的恢复，结果见图2所示。
由图2可知，与正常对照组相比，RECQL基因在治疗前和治疗后患者样本中表达显著降低(P<0.05)；RECQL4和RECQL5基因也有相似的表达变化趋势，且表达差异均具有显著性(P<0.05)。同时，对比发现经过手术和放化疗治疗后的患者样本中，三个靶基因的表达有增高的趋势，并且RECQL基因在治疗后患者中的表达升高具有显著性(P<0.05)。综上所述，RECQL、RECQL4和RECQL5基因在外周血单核细胞中的表达可以作为早期乳腺癌诊断和疗效评价的潜在生物标志物。
对于上述三个基因的对乳腺癌患者的诊断能力及疗效评价能力，本研究采用受试者工作特征(Receiver operatin characteristic，ROC)曲线进行了评价。ROC曲线是用以评价标志物准确度的一种重要工具。可以得到的两个主要指标包括：灵敏度(sensitivity)，或真阳性率，评价其在选择特定疾病病人中的表现。在筛选测试中一般要求有高灵敏度以排除没有疾病的人；特异性(specificity)，或真阴性率，指示其在正确选择没有疾病的人中的能力。在诊断中一般要求有高特异性以获得较低的假阳性率。首先对三个靶基因进行ROC曲线分析，结果如图3所示。其中，横坐标为100-特异性，即假阳性率，纵坐标为灵敏度，即真阳性率。
由图3可知，三个靶基因在区分正常对照(50例)和乳腺癌患者(49例)时，诊断准确率均能达到80％以上，RECQL和RECQL4基因具有更高的特异性，RECQL5基因则具有更高的诊断灵敏度。进一步研究发现，将试剂盒中的三个靶基因进行整合，相较于单个基因，其诊断能力得到显著提高。首先通过建立logistic回归模型，得到联合预测因子，预测因子的表达式为：y＝x1+42.016×x2+7.87×x3，其中y表示联合预测因子，x1表示样本RECQL基因的表达量，x2表示样本RECQL4基因的表达量，x3表示样本RECQL5基因的表达量。将每个样本三个靶基因的表达量测定结果带入预测因子方程，得到各个样本的预测因子，并以其为分析指标，进行双正态模型ROC曲线分析，结果如4所示，通过3个基因的测定值计算，当联合预测因子y小于0.006时为阳性，诊断为乳腺癌；当y大于0.006时为阴性，该样本为正常样本。
由图4可知，三个靶基因进行整合后，其诊断灵敏度和特异性均得到改善，整合后得的预测因子进行乳腺癌诊断的灵敏度和特异性分别达到80.00％和95.83％，且ROC曲线下面积为0.941(P<0.0001)，说明三个靶基因整合后用于乳腺癌诊断具有94.1％的诊断准确率，具有临床诊断应用价值。
对试剂盒测定的三个靶基因用于乳腺癌疗效评价的能力也采用ROC曲线进行了分析。对49例治疗前乳腺癌患者和22例治疗后乳腺癌患者样本中三个靶基因的表达进行ROC曲线分析，发现RECQL基因用于乳腺癌患者的疗效评价能力最佳(P<0.0001，具有显著性)，AUC达到0.816，优于RECQL4和RECQL5基因，可以作为临床疗效评价的辅助指标。ROC曲线分析结果见图5。
综上所述，RECQL、RECQL4和RECQL5可以作为乳腺癌临床早期诊断的生物标志物，且其联合诊断准确率高达94.1％；而在乳腺癌患者疗效评价过程中，RECQL基因表达与疗效的相关性最好，其评判准确率可达到81.6％，特别是对治疗有效性的判定，可达到90.91％的准确率。
此外，该整合基因标志物组也可考虑作为未来药物研发的治疗靶点和评价指标，进行药物筛选和新药研发。
实施例6临床尿液样本检测
(1)临床样本收集：
本研究共收集到30例健康志愿者尿液样本，30例乳腺癌患者尿液样本，尿液样本均为晨尿，收集后立即进行游离RNA提取。
(2)尿液前处理：
1)收集新鲜尿液后立即12000g，4℃，离心10分钟后，收集上清。
2)上清再次12000g，4℃，离心10分钟，收集上清，完全除去细胞成分。
(3)尿液上清液中总RNA的提取：
采用miRNeasy Serum/Plasma Kit(QIAGEN，也可采用其他品牌的同类型产品)试剂盒提取尿液上清液中的游离RNA，主要操作步骤如下：
1)取350μL上清尿液后，加入添加5倍体积的QIAzol裂解试剂，涡旋3-5s后，置室温(15-25℃)内裂解5min。
2)加入3.5μL的miRNeasy血清/血浆内参(浓度为1.6×108拷贝/μL)，混匀后加入350μL氯仿，涡旋3-5s，室温放置3min。
3)1200g，4℃离心15min，小心吸取上层清液到新的PV管中并加入1.5倍体积的无水乙醇后，混匀。
4)吸取700μL样品置纯化小柱中，8500g，4℃离心15s，弃离心液，剩余样品重复上述步骤。
5)离心纯化小柱中加入700μL的Buff RWT，清洗小柱，8500g,4℃，离心15s，弃离心液。
6)纯化小柱中再次加入500μL 80％乙醇，8500g,4℃，离心2min后，将纯化小柱放到新的PV管中，打开小柱盖子，全速离心5min以干燥小柱。
7)将纯化小柱转移至新的PV管中，加入14μL的RNase-free water到小柱膜的中心，轻轻盖上盖子，全速离心1min以洗脱RNA。
8)将收集的RNA放置-80℃保存，备用。
(3)cDNA的合成方法同血液中提取RNA的cDNA合成方法。
(4)样本定量检测
以样本cDNA作为模板，采用Taqman反应法，在ABI Prism 7300实时荧光PCR扩增仪中进行反应，反应体系及反应条件见表1。PCR的扩增条件为：95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃扩增30s，进行45个循环。
采用建立标准曲线的绝对定量法对RECQL、RECQL4及RECQL5基因表达水平进行检测，发现在正常人尿液游离核苷酸中，只有RECQL4可检测到，RECQL和RECQL5均未检测到，为阴性表达。而在乳腺癌患者尿液样本中靶基因RECQL和RECQL5均可检测到阳性表达，表达结果见图6；RECQL4的含量相较于正常对照，在乳腺癌患者中显著降低(图7所示)，此结果与该基因在患者血液中的测定结果一致。该结果表明RECQL、RECQL4及RECQL5可以作为尿液标志物应用于乳腺癌的诊断，可为患者提供了一种无创伤监测诊断癌症的方法。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 王，义明
<120> 乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaaagggca atcaggaatc a 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cattggctga ccattttcta tgaac 25
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aattcatgca ggtgcttacc atgccaa 27
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctctcccct gctgtcactc a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacagattcc cgttgcttcc t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctggcctgcc accgtgtctc aag 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agaaggtccc tgtaattgtt gca 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gccatagact tggcaatatt cca 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aagccaatgt caggtttgtc gccca 25
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
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gcatcctggg ctacactgag 20
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<213> 人工序列
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tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcctctgact tcaacagcga caccc 25

Claims (10)

1.RECQL、RECQL4及RECQL5基因的mRNA表达作为联合标志物在制备乳腺癌检测和/或疗效评价试剂中的应用。
2.乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，其特征在于，包括RECQL、RECQL4及RECQL5基因的特异性扩增引物及探针，探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团，非5’端连接有荧光淬灭基团，其中
RECQL扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO1~2所示，
RECQL特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
RECQL4扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:4 ~5所示，
RECQL4特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
RECQL5扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:7 ~8所示，
RECQL5特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
3.根据权利要求2所述的乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，其特征在于，还包括内参基因GAPDH的特异性扩增引物及探针，
GAPDH扩增引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:10~11所示，
GAPDH特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团，非5’端连接有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求2或3所述的乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，其特征在于，探针的核苷酸序列5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
5.一种乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，其特征在于，包括权利要求2~4任一所述的检测乳腺癌的特异性RT-PCR引物和探针。
6.根据权利要求5所述的乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，其特征在于，还包括阳性模板，阳性模板包括纯化后的：RECQL基因扩增产物、RECQL4基因扩增产物、RECQL5基因扩增产物和GAPDH基因扩增产物。
7.根据权利要求6所述的乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，其特征在于，分为RECQL、RECQL4、RECQL5和GAPDH这4个基因的实时荧光定量PCR反应体系和这4个基因的阳性模板体系，其中，
每个基因的实时荧光定量PCR反应体系19.0μL，包括PCR反应缓冲液10μL、浓度10μM的该基因扩增引物各0.8μL、浓度2μM的该基因特异性探针1.0μL和RNase-free water7.2μL；
每个基因的阳性模板体系包括浓度为1×109拷贝/μL的纯化后的该基因扩增产物。
8.RECQL、RECQL4及RECQL5基因的mRNA表达作为联合标志物在制备乳腺癌检测和/或疗效评价试剂中的应用，其特征在于，所述试剂采用权利要求6或7所述的乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，试剂盒的使用包括以下步骤：
将RECQL、RECQL4、RECQL5和GAPDH这4个基因的阳性模板进行梯度稀释后加入实时荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应，根据稀释拷贝数和扩增Ct值，绘制每个基因的定量标准曲线；
待检测样本提取总RNA后逆转录为cDNA，以该cDNA为荧光定量PCR模板，加入实时荧光定量PCR反应体系后，进行荧光定量PCR反应，所得扩增Ct值带入相应基因的定量标准曲线，得到样本中该基因的初始表达量；
待检测样本的测定结果用该样本的内参基因GAPDH的结果进行归一化处理，处理后按方程y=x1+42.016×x2+7.87×x3计算RECQL、RECQL4和RECQL5三个标志物基因的联合预测因子，其中y表示联合预测因子，x1表示样本RECQL基因的表达量，x2表示样本RECQL4基因的表达量，x3表示样本RECQL5基因的表达量；
y小于0.006时待检测样本为阳性，y大于0.006时待检测样本为阴性。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃扩增30s，进行45个循环。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，待检测样本为外周血和/或尿液。
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