CN110628908B

CN110628908B - 用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物及检测试剂盒

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Publication number: CN110628908B
Application number: CN201910888327.XA
Authority: CN
Inventors: 孔关义; 陈苏红; 秦宏亮; 陈亚庆; 刘翔; 赵立波
Original assignee: Beijing Echo Biotech Co ltd
Current assignee: Beijing Echo Biotech Co ltd
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110628908A

Abstract

本发明提供了用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物及检测试剂盒。所述生物标志物为AMACR、PCA3、ACSM1、SPON2、PCAT14、OR51E2、ERG和RPL7P16基因至少一种。本发明试剂盒能诊断前列腺癌，诊断模型性能AUC达0.75，灵敏度及NPV为0.97和0.94，结合tPSA诊断AUC达0.84；区分前列腺癌级别时AUC为0.79，灵敏度及NPV为0.93和0.91，结合tPSA诊断AUC达0.85；用于诊断PSA样本良恶性时AUC达0.8，灵敏度及NPV为0.9和0.96。本发明试剂盒检测样本可避免患者穿刺检测所遭受的痛苦和可能引起的感染，具有较好的临床应用价值。

Description

用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术与医学技术领域，具体地说涉及涉及一种用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物及检测试剂盒。

背景技术

前列腺癌是泌尿系统常见恶性肿瘤之一，发病率在全球男性发病率中位于第二，死亡率居第5位。报告显示在2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。随着生活方式的改变和人口老龄化，我国前列腺癌的发病率和死亡率逐年上升，其增长率已跃居男性第一。前列腺癌的发病率在不同地区、年龄、人种中也有明显差异。此外，家族史、饮食习惯、肥胖、吸烟、职业暴露、前列腺炎及性传播疾病都是前列腺癌的危险因素。

前列腺癌的临床诊断目前主要依靠直肠指诊、血清PSA(PSA为前腺癌的特异性标志物)、经直肠前列腺超声、盆腔MRI检查和穿刺活检术。直肠指诊简单易行，但其诊断敏感性低，且容易受医生水平、经验等因素的影响，其阳性预测值仅为10％左右。与直肠指诊相比，经直肠前列腺超声检查可显著提高前列腺癌检出率，目前直肠超声引导下行穿刺活检是临床前列腺癌确诊金标准，但穿刺操作是有创的，且有受到感染的可能。血清PSA是目前临床常规检测项目，但其敏感性和特异性一直饱受诟病，PSA检测导致了不必要的活检数量的增加和对惰性疾病患者的过度诊断。一般情况下，直肠指诊和PSA异常者需要进行穿刺活检来确诊，但PSA灰区4-10.0ng/ml的情况下，穿刺活检阳性率不高，仅有20％左右。这样的结果预示着70％-80％的穿测活检可能是不必要的，这既增加了患者的痛苦，又浪费了大量的医疗资源。因此，非常有必要探寻敏感性和特异性双高、检测简便无创的前列腺癌筛查诊断方法，以提高前列腺癌早期诊断率、减少不必要的活检。

新的无创的尿液检查替代穿刺活检诊断前列腺癌一直是研究的热点。基于尿液的前列腺癌抗原3(PCA3)基因检测试剂(Progensa PCA3，Hologic Inc.，Marlborough，MA，USA)于2012年被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于诊断前列腺癌，但特异性和敏感性不是非常理想；Bio-Techne公司的ExoDx Prostate IntelliScore产品于今年通过FDA的突破性医疗器械认证，是一款基于尿液中外泌体(Extracellular Vesicles,EVs)的用于预测PSA位于灰区2-10ng/ml的患者是否有前列腺癌风险的产品，尽管敏感性较高，但其特异性一般。

Evs是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，是细胞内、细胞间通讯的信息载体。不同来源外泌体所携带的信息不同，从而能发挥不同的生物学功能。例如，肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生、肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，与肿瘤的发生、发展及预后等多方面相关。由于其独特的生物学特征，在疾病诊断、预后评估、用药指导和复发转移等领域均具有巨大前景。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。尿液作为一种主要的体液来源，其中的EVs生物标志物在泌尿系统肿瘤诊断、预后评估及复发监控等方面有着重要的应用。

因此，可以基于尿液外泌体建立更精准的、无创或微创的前列腺癌诊断分级和良恶性预测的方法，从而指导临床选择合适的处置方案。

发明内容

本发明的目的在于提供用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物及检测试剂盒。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物，所述生物标志物为以下基因的至少一种AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16；或，所述生物标志物为至少含有AMACR的前述任两个或多个基因的组合。

进一步地，所述生物标志物为以下基因AMACR、ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2和ERG中的至少一种。

所述生物标志物为如下任一组或多组：

(1)基因AMACR和ERG；

(2)基因AMACR和ACSM1；

(3)基因AMACR和SPON2；

(4)基因AMACR、OR51E2和ERG；

(5)基因AMACR、SPON2和OR51E2；

(6)基因AMACR、SPON2和PCA3；

(7)基因AMACR和ACSM1、SPON2；

(8)基因AMACR和PCA3、ACSM1；

(9)基因AMACR和ACSM1、ERG；

(10)基因AMACR、SPON2、ERG和OR51E2；

(11)基因AMACR、PCA3、ERG和OR51E2；

(12)基因AMACR、PCA3、SPON2和OR51E2；

(13)基因AMACR和ACSM1、SPON2、PCA3；

(14)基因AMACR和PCA3、SPON2、ERG；

(15)基因AMACR和ACSM1、ERG、PCA3；

(16)基因AMACR和ACSM1、OR51E2、PCA3、SPON2；

(17)基因AMACR和ERG、OR51E2、PCA3、SPON2；

(18)基因AMACR和ACSM1、ERG、PCA3、SPON2；

(19)基因AMACR和ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16。

第二方面，本发明提供用于检测所述生物标志物的引物：

用于检测AMACR的上下游引物分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；

用于检测ACSM1的上下游引物分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示；

用于检测PCA3的上下游引物分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示；

用于检测ERG的上下游引物分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示；

用于检测SPON2的上下游引物分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示；

用于检测OR51E2的上下游引物分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示；

用于检测PCAT14的上下游引物分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示；

用于检测RPL7P16的上下游引物分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23所示。

第三方面，本发明提供用于检测所述生物标志物的探针，对应于AMACR、ACSM1、PCA3、ERG、SPON2、OR51E2、PCAT14和RPL7P16，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21和24所示。

第四方面，本发明提供了含有上述引物和/或探针的检测试剂或试剂盒。

进一步地，所述的检测试剂或试剂盒中还包含用有检测内参基因的引物和/或探针，所属内参基因为SLC25A和NKX3-1，优选SLC25A。

用于检测SLC25A的上、下游引物分别如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26所示；

用于检测NKX3-1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29所示；和/或

对应于SLC25A和NKX3-1，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27和30所示。

第五方面，本发明提供于所述试剂盒配套的PCR反应体系，所述反应体系如下：

以上试剂来自Takara公司的Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)试剂盒。

逆转录反应体系如下：

以上试剂来自Takara公司的PrimerScript^TM RT reagent Kit(Perfect RealTime)试剂盒。

本发明所述检测试剂或试剂盒，其工作步骤为：

(1)先提取待测尿液外泌体RNA，RNA加尾、合成cDNA；

(2)通过实时荧光定量PCR的方法，利用检测试剂或试剂盒中的引物和探针对待测尿液样品中的外泌体RNA进行检测；

(3)利用内参基因对标志物的表达水平进行归一化：根据检测生物标志物目标基因Ct值，并根据任一内参SLC25A或NKX3-1，计算ΔCt，使用逻辑回归模型得到判定分数；

或在计算ΔCt之后，再结合tPSA数值，使用逻辑回归模型得到判定分数；

根据判定分数和阈值判断受试者是否患有前列腺癌及确定前列腺癌的高低级别。

第六方面，本发明提供所述前列腺癌生物标志物的使用方法，包括以下步骤：a)采集受试者的随机尿液样本，b)从尿液样本中分离外泌体，c)提取尿液外泌体中一种或者多种RNA，d)检测标志物的RNA的表达水平，e)利用内参基因对标志物的表达水平进行归一化，f)使用逻辑回归模型得到判定分数，g)根据判定分数和阈值判断受试者是否患有前列腺癌及确定前列腺癌的高低级别。

进一步地，步骤a)中所述的随机尿液样本为晨尿或者憋尿2小时以上的首段尿液，体积>30ml。

进一步地，步骤b)中所述囊泡分离方法包括：超速离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀、色谱法、免疫磁珠捕获法等。

进一步地，步骤d)中检测标志物表达水平的方法为实时荧光PCR法。

进一步地，步骤e)中所述的内参基因为SLC25A和NKX3-1中的至少一种。优选的内参基因为SLC25A。

优选地，所述生物标志物在尿液外泌体中被检测。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明的提供的生物标志物组合及其组合，能够较为准确地确定个体是否患有前列腺癌，其诊断模型性能的AUC达0.75，灵敏度及NPV分别为0.97和0.94，结合tPSA组合诊断AUC可达0.84；用于区分前列腺癌高低级别时，其AUC为0.79，灵敏度及NPV分别为0.93和0.91，结合tPSA组合诊断AUC可达0.85；用于诊断PSA 4-20ng/ml样本的良恶性时，其AUC达0.8，灵敏度及NPV分别为0.9和0.96。

(二)本发明基于尿液外泌体进行生物标志物检测，实现了非侵入性筛查诊断前列腺癌的功能，可有效避免患者因进行穿刺活检所遭受的痛苦和可能的感染，操作过程中省时省力，节省人力和物力成本，具备较好的临床应用价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1A-图1E分别为实施例1中不同外泌体分离方法RNA检测2100结果。

图2-图9分别为实施例3中AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16的扩增曲线结果，曲线中1、2、3、4、5分别代表初始RNA稀释100、1000、10000、100000和1000000倍时对应的扩增曲线。

图10-图17分别为实施例5中AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16的诊断性能评估ROC曲线。

图18为实施例5中AMACR和ACSM1组合诊断分级性能评估ROC曲线。

图19为实施例5中AMACR、OR51E2和ERG组合诊断分级性能评估ROC曲线。

图20为实施例5中AMACR、SPON2、ERG和OR51E2组合诊断分级性能评估ROC曲线。

图21为实施例5中AMACR、PCA3、ERG和OR51E2组合诊断分级性能评估ROC曲线。

图22为实施例5中AMACR、PCA3、ERG、OR51E2和SPON2组合诊断分级性能评估ROC曲线。

图23-图28为实施例6中AMACR、ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2、ERG分别和tPSA组合的诊断分级性能评估ROC曲线。

图29为实施例6中AMACR、ACSM1和tPSA组合的诊断分级性能评估ROC曲线。

图30为实施例6中AMACR、SPON2、OR51E2和tPSA组合的诊断分级性能评估ROC曲线。

图31为实施例6中AMACR、SPON2、PCA3和tPSA组合的诊断分级性能评估ROC曲线。

图32-图37为本发明实施例7中ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2和ERG等基因预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图38为实施例7中AMACR和ACSM1组合预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图39为实施例7中AAMACR、ACSM1和PCA3组合预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图40为实施例7中AMACR、ACSM1和ERG组合预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图41为实施例7中AMACR、ACSM1、PCA3和ERG组合预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图42为实施例7中AMACR、PCA3、SPON2和OR51E2组合预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图43为实施例7中AMACR、ACSM1、PCA3、ERG和SPON2组合预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图44-图49为实施例8中AMACR、ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2、ERG分别和tPSA组合测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图50为实施例8中AMACR、ACSM1分别和tPSA组合测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图51为实施例8中AMACR、ACSM1、PCA3和tPSA组合测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图52为实施例8中AMACR、ACSM1、ERG和tPSA组合测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图53为实施例8中AMACR、ACSM1、PCA3、ERG和tPSA组合测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图54为实施例8中AMACR、PCA3、ACSM1、OR51E2和tPSA组合测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图55-图60为实施例9中AMACR、ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2和ERG等基因.预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性的性能评估ROC曲线。

图61为实施例9中AMACR和ACSM1组合预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性的性能评估ROC曲线。

图62为实施例9中AMACR、ACSM1和SPON2组合预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性的性能评估ROC曲线。

图63为实施例9中AMACR、ACSM1和ERG组合预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性的性能评估ROC曲线。

图64为实施例9中AMACR、ACSM1、PCA3和SPON2组合预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性的性能评估ROC曲线。

图65为实施例9中AMACR、PCA3、SPON2和ERG组合预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性的性能评估ROC曲线。

图66为实施例9中AMACR、ACSM1、PCA3、OR51E和SPON2组合预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性的性能评估ROC曲线。

图67为实施例5中AMACR和SPON2组合诊断分级性能评估ROC曲线。

图68为实施例7中AMACR和ERG组合预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

图69为实施例10中以NKX3-1为内参，AMACR、ACSM1、PCA3、ERG和SPON2组合预测前列腺癌良恶性的性能评估ROC曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1尿液外泌体的分离

1、UC法：40ml人晨尿样本，低速离心去除细胞，17000g离心30min去除细胞残骸及凋亡小体等，100000g超速离心2h后去上清，用PBS重悬再次100000g离心2h，100ul PBS重悬沉淀得到外泌体。

2、超滤法：样品解冻后，17000xg离心30min；离心后样品依次经过0.45um 0.22um；准备两支超滤离心管，每个超离管中各取15ml经过滤膜过滤的样品，4500xg室温离心15min；小心取出离心管，丢弃超滤管底部的液体，然后用5ml剩余的过滤尿液和10ml1XPBS重悬保留物，倒转3-4次将样品混匀，4500xg室温离心10min；小心取出超滤管，小心取出离心管，丢弃超滤管底部的液体，将上层保留物重悬在15ml 1XPBS中，倒转超滤管3-4次混匀样品，4500xg室温离心10min；小心取出超滤管，小心取出离心管，丢弃超滤管底部的液体，将上层保留物重悬在15ml 1XPBS中，倒转超滤管3-4次混匀样品，4500xg室温离心14min，上层保留的液体在100-200ul。如果液体大于200ul，可以室温4500xg继续离心。离心时间看保留液体的体积来确定。将上层液体转移到新的1.5mlEP管中。

3、PEG法：15ml/人，加入终浓度为8％的PEG6000，混匀后4℃过夜孵育，3000g离心20min，沉淀溶于200ul PBS。

4、Exoeasy法：15ml/人，1:1将样本与XBP混匀后过柱，500g离心1min，弃废液，加入3.5ml XWP，5000g离心5min，弃废液，加入700ul tirzol，5000g离心5min，-20℃保存待提RNA。

5、Exocolumn法：15ml/人，各两个重复。按照20um筛板/0.48g SAX-2-100/20um筛板的顺序依次装填离心柱，不添加任何平衡溶液，500xg离心，分离EVs。

以上所有样本提取RNA，2100检测RNA逆转并检测看家基因表达量，结果见图1A和图1E，表明多种不同外泌体分离方法均可用于检测尿液外泌体RNA。

实施例2差异表达基因的筛选

为了筛选到与前列腺相关的尿液外泌体标志物前列癌患者(包括PSA>20ng/ml和4-20ng/ml前列腺癌患者)和对照(正常人和前列腺炎、前列腺肥大等干扰样本)各20例，取晨尿不少于30ml，用经典超速离心方法分离尿液中的外泌体并提取RNA，得到的RNA分别进行miRNA及长RNA建库测序(包括mRNA、LncRNA和CircRNA)。得到的数据进行生物信息学的分析，比较前列腺癌患者及对照中差异表达的RNA，挑选差异表达倍数4倍以上的基因与TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中组织的miRNA测序及转录组测序数据进行关联分析，得到两者一致性较高的差异表达基因，再经PCR验证，排除表达丰度特别低的基因(前列癌患者和对照组的CT值均大于35的基因)，最后获得来源于肿瘤的尿液外泌体差异RNA包括AMACR等(如表1所示)。

表1差异表达基因列表

实施例3通过实时荧光PCR验证所选基因标志物

1.引物探针的设计和合成

结合Primer Premier 5软件和Primer-BLAST(NCBI)设计了表1所列8个前列腺癌标志物和3个内参基因的引物和探针，序列见表2。设计原则如下：1)扩增片段小于150bp；2)至少一个引物跨越外显子-外显子边界；3)探针的Tm值比引物至少高5度。设计好以后交给有合成资质的公司合成，其中探针5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ1。

表2本发明前列腺癌标志物和内参基因的引物探针序列

*标注为内参基因。

2.反转录和qPCR检测

采用takara公司的PrimeScript^TMRT reagent Kit(Perfect Real Time)和PremixEx Taq^TM(Probe qPCR)试剂盒进行反转录和qPCR检测。

按下列组份配制反转录反应体系(反应液配制在冰上进行)，然后放入PCR仪进行反应，反应条件为37℃60min，85℃5s，12℃∞，反转录结束后加入50ul DEPC-H₂O稀释,取3ul作为模板，进行PCR反应。

表3反转录反应体系

按下列组分配制qPCR反应体系(反应液配制在冰上进行)，设置无模板对照作为阴性对照。然后放入实时荧光PCR仪(ABI7500)按如下反应条件进行扩增检测。

表4 qPCR反应体系

表5 qPCR反应条件

为了验证这些基因的表达情况，用1个前列腺癌细胞系、3个健康人和8个前列腺癌标本进行了初步验证，结果显示各个引物均能够有效扩增，其扩增效率均大于95％。其中不同基因引物在前列腺癌细胞系RNA不同稀释梯度下的扩增曲线如图2-图10所示。结合起始RNA的浓度及拷贝数，得出各对引物探针的检测限为10个拷贝。

实施例4前列腺癌诊断分级和良恶性预测的多基因检测实验方案及性能评估

1.样本的采集

用无菌容器采集晨尿或憋尿2小时的随机尿>30m，并密封盖好。采集后及时送检，室温下保存时间不应超过2小时，如不能及时运送，可在4度暂时保存(不超过8小时)，长期保存在低温冰箱(<-20度)。长途运输采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

2.样本的处理

取尿液30ml，3000g离心15min去掉细胞后，13000g离心30min去掉凋亡小体和大型囊泡，再用超速离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀、色谱法、免疫磁珠不获发等分离外泌体，得到外泌体后使用TRIzol Reagent、Ultrapure RNA Kit等RNA提取试剂盒提取总RNA，并用50ul无核酸酶水洗脱备用。

3.RT-PCR扩增

按表6配制RT-PCR反应液，并按表7的条件进行qPCR扩增检测，用无核酸酶的水作为阴性对照，扩增引物探针如表2所示。

表6 RT-PCR反应体系配制

表7 RT-PCR反应条件

4.数据分析

实验结束后，根据仪器的软件进行分析，调节阈值至基线荧光值以上，使阴性对照Ct值不出现任何数值，记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。检测结果为Undetermined或高于40的Ct视为低于检测限，将其转变为40，然后计算ΔCt(ΔCt＝检测基因的Ct-内参基因SLC25A6的Ct)。

用各个基因ΔCt进行逻辑回归建模。利用glmuti包(R版本)，包括相互作用项，筛选所有可能的模型，以发现最佳模型，并用AUC、灵敏度和NPV等评估模型的诊断性能。

实施例5前列腺癌诊断分级性能评估(不结合tPSA)

为了验证实施例2筛选得到的生物标志物在前列腺癌诊断分级上的性能，在125例前列腺癌患者(GS＝6的24例，GS≥7的121例)尿液样本分别采用实施例3的引物和实施例4的方法参数进行上述标志物检测，其效能评估如下：

(1)基于AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16等基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16等基因的ROC曲线分别如图10-图17所示，结果表明，在95％的可信区间(CI)内，基于这些标志物生成的分析方法可以较为准确地预测前列腺癌的高低级别。

(2)基于AMACR和ACSM1等基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR和ACSM1两个基因组合的AUC为0.78，灵敏度为88.1％，NPV为86.8％，ROC曲线如图18所示，结果表明，基于AMACR和ACSM1生成的分析方法可以较为准确地预测前列腺癌的高低级别。

(3)基于AMACR和SPON2等基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR和SPON2两个基因组合的AUC为0.78，灵敏度为86.1％，NPV为85.4％，ROC曲线如图67所示，结果表明，基于AMACR和SPON2生成的分析方法可以较为准确地预测前列腺癌的高低级别。

(4)基于AMACR、OR51E2和ERG基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、OR51E2和ERG三个基因组合的AUC为0.78，灵敏度为92.1％，NPV为90.1％，ROC曲线如图19所示，结果表明，基于AMACR、OR51E2和ERG三个基因生成的分析方法可以较为准确地预测前列腺癌的高低级别。

(5)基于AMACR、SPON2、ERG和OR51E2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、SPON2、ERG和OR51E2四个基因组合的AUC为0.79，灵敏度为94.1％，NPV为92.2％，ROC曲线如图20所示，结果表明，基于AMACR、SPON2、ERG和OR51E2生成的分析方法可以较为准确地预测前列腺癌的高低级别。

(6)基于AMACR、PCA3、ERG和OR51E2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、PCA3、ERG和OR51E2四个基因组合的AUC为0.78，灵敏度为94.1％，NPV为92.0％，ROC曲线如图21所示，结果表明，基于AMACR、PCA3、ERG和OR51E2生成的分析方法可以较为准确地预测前列腺癌的高低级别。

(7)基于AMACR、PCA3、ERG、OR51E2和SPON2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、PCA3、ERG、OR51E2和SPON2五个基因组合的AUC为0.79，灵敏度为93.1％，NPV为91.0％，ROC曲线如图22所示，结果表明，基于AMACR、PCA3、ERG、OR51E2和SPON2生成的分析方法可以较为准确地预测前列腺癌的高低级别。

实施例6前列腺癌诊断分级性能评估(结合tPSA)

为了验证实施例2筛选得到的与前列腺癌相关的生物标志物结合tPSA(由临床检验科采用总前列腺特异抗原(tPSA)测定试剂盒测定后提供)在前列腺癌诊断分级上的性能，在125例前列腺癌患者(GS＝6的24例，GS≥7的121例)尿液样本分别采用实施例3的引物和实施例4的方法参数进行上述标志物检测，其效能评估如下：

(1)基于AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，然后再结合tPSA数值，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2、ERG分别和tPSA组合的ROC曲线如图23-图28所示，结果表明，结合tPSA和生物标志物生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升(AUC值高说明性能提升)，能更好地预测前列腺癌的高低级别。

(2)基于AMACR和ACSM1基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，然后再结合tPSA数值，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1和tPSA组合的组合的AUC为0.84，灵敏度为83.2％，NPV为85.1％，ROC曲线如图29所示，结果表明，结合tPSA和AMACR、ACSM1两个基因生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测前列腺癌的高低级别。

(3)基于AMACR、SPON2和OR51E2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、SPON2、OR51E2三个基因和tPSA组合的AUC为0.85，灵敏度为94.1％，NPV为93.0％，ROC曲线如图30所示，结果表明，结合tPSA和AMACR、SPON2、OR51E2三个基因生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测前列腺癌的高低级别。

(4)基于AMACR、SPON2和PCA3基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、SPON2、PCA3三个基因和tPSA组合的AUC为0.85，灵敏度为92.1％，NPV为91.3％，ROC曲线如图31所示，结果表明，结合tPSA和AMACR、SPON2和PCA3三个基因生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测前列腺癌的高低级别。

实施例7前列腺癌良恶性预测性能评估(不结合tPSA)

为了验证实施例2筛选得到的与前列腺癌相关的生物标志物预测前列腺良恶性上的性能，在118例非前列腺癌和130例前列腺癌患者尿液样本分别采用实施例3的引物和实施例4的方法参数进行上述标志物检测，其效能评估如下：

(1)基于AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2和ERG等基因的ROC曲线分别如图32-图37所示，结果表明，基于这些标志物生成的分析方法可以较为准确地预测是否患有前列腺癌。

(2)基于AMACR和ACSM1基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR和ACSM1两个基因组合的AUC为0.74，灵敏度为96.1％，NPV为91.5％，ROC曲线如图38所示，结果表明，基于AMACR和ACSM1两个基因生成的分析方法可以较为准确地预测是否患有前列腺癌。

(3)基于AMACR和ERG基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR和ERG两个基因组合的AUC为0.74，灵敏度为96.9％，NPV为92.8％，ROC曲线如图68所示，结果表明，基于AMACR和ERG两个基因生成的分析方法可以较为准确地预测是否患有前列腺癌。

(4)基于AMACR、ACSM1和PCA3基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1和PCA3三个基因组合的AUC为0.75，灵敏度为97.7％，NPV为94.5％，ROC曲线如图39所示，结果表明，基于AMACR、ACSM1和PCA3三个基因生成的分析方法可以较为准确地预测是否患有前列腺癌。

(5)基于AMACR、ACSM1和ERG基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1和ERG三个基因组合的AUC为0.75，灵敏度为97.7％，NPV为94.6％，ROC曲线如图40所示，结果表明，基于AMACR、ACSM1和ERG三个基因生成的分析方法可以较为准确地预测是否患有前列腺癌。

(6)基于AMACR、ACSM1、PCA3和ERG基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、PCA3和ERG四个基因组合的AUC为0.75，灵敏度为94.6％，NPV为90.0％，ROC曲线如图41所示，结果表明，基于AMACR、ACSM1、PCA3和ERG四个基因生成的分析方法可以较为准确地预测是否患有前列腺癌。

(7)基于AMACR、PCA3、SPON2和OR51E2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、PCA3、SPON2和OR51E2四个基因组合的AUC为0.74，灵敏度为95.4％，NPV为90.8％，ROC曲线如图42所示，结果表明，基于AMACR、PCA3、SPON2和OR51E2四个基因生成的分析方法可以较为准确地预测是否患有前列腺癌。

(8)基于AMACR、ACSM1、PCA3、ERG和SPON2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、PCA3、ERG和SPON2五个基因组合的AUC为0.75，灵敏度为96.9％，NPV为93.7％，ROC曲线如图43所示，结果表明，基于AMACR、ACSM1、PCA3、ERG和SPON2五个基因生成的分析方法可以较为准确地预测是否患有前列腺癌。

实施例8前列腺癌良恶性预测性能评估(结合tPSA)

为了验证实施例2筛选得到的与前列腺癌相关的生物标志物结合tPSA预测前列腺癌良恶性上的性能，在118例非前列腺癌和130例前列腺癌患者尿液样本分别采用实施例3的引物和实施例4的方法参数进行上述标志物检测，其效能评估如下：

(1)基于AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，然后再结合tPSA数值，根据逻辑回归得到ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2、ERG分别和tPSA组合的ROC曲线如图44-图49所示，结果表明，结合tPSA和生物标志物生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测是否患有前列腺癌。

(2)基于AMACR和ACSM1基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，然后再结合tPSA数值，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1两个基因和tPSA组合的AUC为0.83，ROC曲线如图50所示，结果表明，结合tPSA和AMACR和ACSM1两个基因生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测是否患有前列腺癌。

(3)基于AMACR、ACSM1和PCA3基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，然后再结合tPSA数值，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、PCA3三个基因和tPSA组合的AUC为0.84，ROC曲线如图51所示，结果表明，结合tPSA和AMACR、ACSM1和PCA3三个基因生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测是否患有前列腺癌。

(4)基于AMACR、ACSM1和ERG基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，然后再结合tPSA数值，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、ERG三个基因和tPSA组合的AUC为0.84，ROC曲线如图52所示，结果表明，结合tPSA和AMACR、ACSM1和ERG三个基因生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测是否患有前列腺癌。

(5)基于AMACR、ACSM1、PCA3和ERG基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，然后再结合tPSA数值，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、PCA3、ERG四个基因和tPSA组合的AUC为0.84，ROC曲线如图53所示，结果表明，结合tPSA和AMACR、ACSM1、PCA3和ERG四个基因生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测是否患有前列腺癌。

(6)基于AMACR、PCA3、ACSM1和OR51E2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，然后再结合tPSA数值，根据逻辑回归得到AMACR、PCA3、ACSM1、OR51E2四个基因和tPSA组合的AUC为0.84，ROC曲线如图54所示，结果表明，结合tPSA和AMACR、PCA3、ACSM1和OR51E2五个基因生成的分析方法性能较单用基因标志物有提升，能更好地预测是否患有前列腺癌。

实施例9预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性的性能评估

为了验证实施例2筛选得到的与前列腺癌相关的生物标志物预测tPSA介于4-20ng/ml样本良恶性上的性能，对159例tPSA介于4-20ng/ml的尿液样本分别采用实施例3的引物和实施例4的方法参数进行上述标志物检测，其效能评估如下：

(1)基于AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2和ERG等基因的ROC曲线分别如图55-图60所示，结果表明，基于上述标志物生成的分析方法能较好地预测tPSA介于4-20ng/ml样本的良恶性。

(2)基于AMACR和ACSM1基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR和ACSM1两个基因组合的AUC为0.79，灵敏度为80.0％，NPV为93.75％，ROC曲线如图61所示，结果表明，基于AMACR和ACSM1两个基因生成的分析方法能较好地预测tPSA介于4-20ng/ml样本的良恶性。

(3)基于AMACR、ACSM1和SPON2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1和SPON2三个基因组合的AUC为0.80，灵敏度为90.0％，NPV为96.2％，ROC曲线如图62所示，结果表明，基于AAMACR、ACSM1和SPON2三个基因生成的分析方法能较好地预测tPSA介于4-20ng/ml样本的良恶性。

(4)基于AMACR、ACSM1和ERG基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1和ERG三个基因组合的AUC为0.79，灵敏度为90.0％，NPV为96.2％，ROC曲线如图63所示，结果表明，基于AMACR、ACSM1和ERG三个基因生成的分析方法能较好地预测tPSA介于4-20ng/ml样本的良恶性。

(5)基于AMACR、ACSM1、PCA3和SPON2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、PCA3和SPON2四个基因组合的AUC为0.80，灵敏度为90.0％，NPV为96.2％，ROC曲线如图64所示，结果表明，基于AMACR、ACSM1、PCA3和SPON2四个基因生成的分析方法能较好地预测tPSA介于4-20ng/ml样本的良恶性。

(6)基于AMACR、PCA3、SPON2和ERG基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、PCA3、SPON2和ERG四个基因组合的AUC为0.78，敏度为90.0％，NPV为96.3％,ROC曲线如图65所示，结果表明，基于AMACR、PCA3、SPON2和ERG四个基因生成的分析方法能较好地预测tPSA介于4-20ng/ml样本的良恶性。

(7)基于AMACR、ACSM1、PCA3、OR51E2和SPON2基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、PCA3、OR51E和SPON2五个基因组合的AUC为0.80，灵敏度为90.0％，NPV为96.2％，ROC曲线如图66所示，结果表明，基于AMACR、ACSM1、PCA3、OR51E2和SPON2五个基因生成的分析方法能较好地预测tPSA介于4-20ng/ml样本的良恶性。

实施例10内参基因的选择

基于实施例5-9中获得的各基因Ct值，并分别根据内参SLC25A6和NKX3-1计算ΔCt，根据逻辑回归得到AMACR、ACSM1、SPON2、PCA3、OR51E2和ERG等基因组合的AUC，灵敏度和NPV，以SLC25A6为内参的性能均优于NKX3-1。如预测前列腺癌良恶性时，以NKX3-1为内参时AMACR、ACSM1、PCA3、ERG和SPON2五基因组合的AUC为0.74，灵敏度为77.7％，NPV为70.7％，ROC曲线如图69所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京恩泽康泰生物科技有限公司

<120> 用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物及检测试剂盒

<130> KHP191114306.6

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtctgtgcaa gcggtcgg 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatccactca gcctggcata a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtgctgct ggagcccttc cg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagatgg caaaacactc c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agatgtcttc aggctccgta at 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttacaacc ctccttccca ggaa 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acctgtaccc ctacgacgc 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaggaggac gttatctcgg tc 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaaggtgaa gccgctgtcc g 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggtcagcct tgcgacat 18

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctggataca cctgtagact gg 22

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcgattgggg tgtctccatc tccaca 26

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acaaaaggaa gcacagagat cc 22

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agggcgaggc tcatcgat 18

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgcccggcc gccatcttgg gt 22

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aggaacaggc cgaactgct 19

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgaggagggg tgactgga 18

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tatgggctct actgccagtg tgacct 26

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcctcagtt agatccttat cagatt 26

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atctggccac tgcctgga 18

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cttggaccaa caagtagccg ccttgc 26

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aagaaggttc ctgctgtgcc 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcctttagaa gcatcttttg gg 22

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttctcaggcg cttgatcttc agctc 25

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggcctacttc ggcgtgtac 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cgaaggggta ggacaccacg 20

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcacggtctg cgcgatcatc ca 22

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cagagaccga gccagaaagg c 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atcacctgag tgtgggagaa gg 22

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttggggtctt atctgttgga ctctgaa 27

Claims

1.用于前列腺癌诊断分级和良恶性预测的生物标志物的检测引物和探针，其特征在于，所述生物标志物为基因：AMACR、ACSM1、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG和RPL7P16；

用于检测AMACR的上下游引物分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；

用于检测ACSM1的上下游引物分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示；

用于检测PCA3的上下游引物分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示；

用于检测ERG的上下游引物分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示；

用于检测RPL7P16的上下游引物分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23所示；

对应于AMACR、ACSM1、PCA3、ERG、SPON2、OR51E2、PCAT14和RPL7P16的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21和24所示。

2.含有权利要求1所述检测引物和探针的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含用于检测内参基因的引物和探针，所述内参基因为SLC25A和NKX3-1。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为SLC25A。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，

用于检测NKX3-1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29所示；对应于SLC25A和NKX3-1的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27和30所示。

6.根据权利要求2-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒工作步骤为：

（1）先提取待测尿液外泌体RNA，RNA加尾、合成cDNA；

（2）通过实时荧光定量PCR的方法，利用检测试剂或试剂盒中的引物和探针对待测尿液样品中的外泌体RNA进行检测；

（3）利用内参基因对标志物的表达水平进行归一化：根据检测生物标志物目标基因Ct值，并根据任一内参SLC25A或NKX3-1，计算ΔCt，使用逻辑回归模型得到判定分数；

7.权利要求1所述的检测引物和探针在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒为以下任一或多种试剂盒：

（1）前列腺癌诊断试剂盒；

（2）前列腺癌分级诊断试剂盒；

（3）前列腺癌良性、恶性评价试剂盒；

（4）前列腺癌术后愈后评价试剂盒；

（5）前列腺癌用药指导试剂盒。