CN109576370A - 用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒。所述生物标志物为基因UBE2C，以及如下基因BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1中的至少一种。本发明提供的生物标志物及其组合，能够准确地确诊个体是否患有膀胱癌以及是否有复发的可能，具有较高的灵敏性，其复发监控模型性能的AUC达0.955，灵敏度和NPV为100％时，特异可达80％以上；其诊断模型性能的AUC达0.99，灵敏度及NPV均为98％以上时，特异性达92％，本发明基于尿液检测提供了一种无创的检测方法，可有效避免患者频繁使用膀胱镜所遭受的痛苦。

Description

用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，涉及用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒。
背景技术
膀胱癌是我国泌尿生殖系统肿瘤中最常见的肿瘤，60～69岁为发病高峰，近些年来随着工业化程度的加快和个人饮食，吸烟等生活习惯的改变，其发病呈现逐年递增及年轻化趋势。膀胱镜检查和细胞学检查仍然是目前膀胱癌诊断的主要技术，但前者是有创检查及费用高，后者的敏感性低。经尿道膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)可同时做到膀胱癌的诊断、治疗，并明确病理分期，是治疗膀胱癌的首选术式，但患者TUR-BT术后复发率极高，有10-70％的患者会在1年内复发，术后5年内有24％-84％的病人复发，其中部分病例伴有肿瘤恶性程度增加或浸润能力增强，严重影响患者的生存期。因此如何降低膀胱癌患者术后复发风险、延长其生存期，一直是临床关注的重点。目前医院预防复发的手段，普遍采取术后随访检查，其手段为包括B超，膀胱内窥镜和脱落细胞检查。B超易受膀胱其他疾病如膀胱息肉、膀胱粘膜下出血等影响，并且容易漏检大小在5mm以下的肿瘤或平铺在黏膜表面不向腔内突出的病例；而膀胱内窥镜为侵入性检查，同时对操作者技术依赖较高，且价格较贵；此外，尿脱落细胞形态学检查检出率较低，且对早期Ta、T1期膀胱癌检出率为0。如果能发展一种新的无创、有效且可用于膀胱癌复发监测的膀胱癌诊断方法，其能在早期发现是否患有膀胱癌，且在患者膀胱癌发现后就能对患者膀胱癌复发的可能性提供早期判断，对膀胱癌复发风险高的患者和低风险患者提供针对性的手术和化疗，并分别对不同患者进行不同密度的跟踪随访，将对膀胱癌高复发患者人群，大大的提高其治疗效果，减少其复发的可能性，延长其术后生存时间；对膀胱癌低复发患者人群，在提高其治疗效果的同时，将减少某些不必的治疗步骤，减少其术后随访的密度，大大降低其经济上的负担。
无创尿液检查替代膀胱镜诊断膀胱癌、监测复发及判断预后，一直是研究的热点。除尿细胞学外，目前通过尿液检查诊断和检测膀胱癌复发主要有尿核基质蛋白22、膀胱癌肿瘤抗原、免疫-细胞检查等方法，但敏感性和特异性均不理想。
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs；以下囊泡均代表细胞外囊泡)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(MicroVesicles,MVs)和外泌体(exosomes)组成，微囊泡是细胞激活或损伤后从细胞膜脱落的小囊泡。由于细胞外囊泡独特的生物学特征，其在疾病诊断中有着重要的意义。细胞外囊泡是细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中发挥了重要作用。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。尿液作为一种主要的体液来源，其中的囊泡生物标志物在泌尿系统肿瘤诊断、预后及复发监控等方面有着重要的应用。
因此，可以基于尿液囊泡建立更精准的、无创或微创的膀胱癌诊断和复发监控的方法，从而指导临床选择合适的膀胱癌治疗方案。
发明内容
本发明的目的是提供用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物，所述生物标志物为基因UBE2C，以及如下基因BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1中的至少一种。
进一步地，所述生物标志物为基因UBE2C，以及如下基因CDK1、UCA1、TK1、TPX2、MYBL2和FOXM1中的至少一种。
所述生物标志物优选为如下I～XIII中的任一个：
I：基因UBE2C和CCNB1；
II：基因UBE2C和TK1；
III：基因UBE2C和CDC20；
IV：基因UBE2C、CCNB1和TK1；
V：基因UBE2C、CDC20和TK1；
VI：基因UBE2C、CCNB1和CDK1；
VII：基因UBE2C、CCNB1、FOXM1和TK1；
VIII：基因UBE2C、CDC20、CNNB1和TK1；
IX：基因UBE2C、CNNB1、TK1和TPX2；
X：基因UBE2C、CNNB1、FOXM1、TK1和UCA1；
XI：基因UBE2C、CDC20、CNNB1、MMP11和TK1；
XII：基因UBE2C、CNNB1、FOXM1、TK1和TPX2；
XIII：基因UBE2C、BIRC5、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1。
第二方面，本发明提供用于检测所述生物标志物的引物：
用于检测BIRC5的上、下游引物分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；
用于检测UBE2C的上、下游引物分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5；
用于检测CDK1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示；
用于检测MMP11的上、下游引物分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示；
用于检测TPX2的上、下游引物分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示；
用于检测CDC20的上、下游引物分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示；
用于检测MYBL2的上、下游引物分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示；
用于检测TK1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23所示；
用于检测CCNB1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26所示；
用于检测FOXM1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29所示；
用于检测UCA1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示。
第三方面，本发明提供用于检测所述生物标志物的探针，对应于BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、CCNB1、FOXM1、和UCA1，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30和33所示。
第四方面，本发明提供含有所述引物和/或所述探针的检测试剂或试剂盒。
进一步地，所述检测试剂或试剂盒中还包含用于检测内参基因的引物和/或探针，所述内参基因为S100P、SLC25A或PGK1，优选S100P。
用于检测S100P的上、下游引物分别如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35所示；
用于检测SLC25A的上、下游引物分别如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38所示；
用于检测PGK1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41所示。
对应于S100P、SLC25A和PGK1，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:36、39和42所示。
第五方面，本发明提供与所述试剂盒配套的PCR反应体系，所述反应体系如下：
以上试剂来自Takara公司的Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂盒。
逆转录反应体系如下：
以上试剂来源于Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect RealTime)试剂盒。
第六方面，本发明提供所述膀胱癌生物标志物的使用方法，包括以下步骤：
a)采集受试者的随机尿液样本；b)从尿液样本中分离囊泡；c)提取尿液囊泡中一种或者多种RNA；d)检测标志物的mRNA的表达水平；e)利用内参基因对标志物的表达水平进行归一化；f)使用逻辑回归模型得到判定分数；g)根据判定分数和阈值判断受试者是否患有膀胱癌或是否为膀胱癌复发。
进一步地，步骤a)中所述的随机尿液样本为晨尿或者憋尿2小时以上的尿液，体积>20ml。
进一步地，步骤b)中所述囊泡分离方法包括：超速离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀、色谱法、免疫磁珠捕获法等。
进一步地，步骤d)中检测标志物表达水平的方法为实时荧光PCR法。
进一步地，步骤e)中所述的内参基因为S100P、SLC25A和PGK1中的至少一种。优选内参基因为S100P。
优选地，所述生物标志物在尿液囊泡中被检测。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的生物标志物及其组合，能够准确地确诊个体是否患有膀胱癌以及是否有复发的可能，具有较高的灵敏性，其复发监控模型性能的AUC达0.955，灵敏度和NPV为100％时，特异可达80％以上；其诊断模型性能的AUC达0.99，灵敏度及NPV均为98％以上时，特异性达92％。
(二)本发明基于尿液囊泡进行生物标志物检测，实现了非侵入性膀胱癌辅助诊断和复发监控的功能，可有效避免患者频繁使用膀胱镜所遭受的痛苦。
附图说明
图1A和图1B为本发明实施例1中不同囊泡分离方法RNA检测2100结果。
图2-图12分别为本发明实施例3中BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1、UCA1引物扩增曲线结果。
图13-图23分别为本发明实施例4中BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1、UCA1复发监控性能评估ROC曲线。
图24为本发明实施例4中UBE2C和TPX2组合复发监控性能评估ROC曲线。
图25为本发明实施例4中FOXM1、UBE2C和TPX2组合复发监控性能评估ROC曲线。
图26为本发明实施例4中MYBL2、UBE2C和TPX2组合复发监控性能评估ROC曲线。
图27为本发明实施例4中FOXM1、MYBL2、TPX2和UBE2C组合复发监控性能评估ROC曲线。
图28为本发明实施例4中FOXM1、TPX2、UBE2C和UCA1组合复发监控性能评估ROC曲线。
图29为本发明实施例4中CDK1、TK1、TPX2和UBE2C组合复发监控性能评估ROC曲线。
图30为本发明实施例4中CDK1、FOXM1、TK1、TPX2和UBE2C组合复发监控性能评估ROC曲线。
图31为本发明实施例4中CDK1、FOXM1、MYBL2、TPX2和UBE2C组合复发监控性能评估ROC曲线。
图32为本发明实施例4中FOXM1、MYBL2、TPX2、UBE2C和UCA1组合复发监控性能评估ROC曲线。
图33为本发明实施例4中BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1组合复发监控性能评估ROC曲线。
图34-图44分别为本发明实施例4中BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1、UCA1诊断模型性能评估ROC曲线。
图45为本发明实施例4中CNNB1和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图46为本发明实施例4中TK1和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图47为本发明实施例4中CDC20和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图48为本发明实施例4中CNNB1、TK1和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图49为本发明实施例4中CDC20、TK1和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图50为本发明实施例4中CDK1、CNNB1和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图51为本发明实施例4中CNNB1、FOXM1、TK1和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图52为本发明实施例4中CDC20、CNNB1、TK1和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图53为本发明实施例4中CNNB1、TK1、TPX2和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图54为本发明实施例4中CNNB1、FOXM1、TK1、UBE2C和UCA1诊断模型性能评估ROC曲线。
图55为本发明实施例4中CDC20、CNNB1、MMP11、TK1和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图56为本发明实施例4中CNNB1、FOXM1、TK1、TPX2和UBE2C诊断模型性能评估ROC曲线。
图57为本发明实施例4中BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1诊断模型性能评估ROC曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1尿液囊泡的分离方法
1、UC法：40ml人晨尿样本，低速离心去除细胞，17000g离心30min去除细胞残骸及凋亡小体等，100000g超速离心2h后去上清，用PBS重悬再次100000g离心2h，100ul PBS重悬沉淀得到囊泡。
2、超滤法：样品解冻后，17000×g离心30min；离心后样品依次经过0.45um0.22um；准备两支超滤离心管，每个超离管中各取15ml经过滤膜过滤的样品，4500×g室温离心15min；小心取出离心管，丢弃超滤管底部的液体，然后用5ml剩余的过滤尿液和10ml1XPBS重悬保留物，倒转3-4次将样品混匀，4500×g室温离心10min；小心取出超滤管，小心取出离心管，丢弃超滤管底部的液体，将上层保留物重悬在15ml 1×PBS中，倒转超滤管3-4次混匀样品，4500×g室温离心10min；小心取出超滤管，小心取出离心管，丢弃超滤管底部的液体，将上层保留物重悬在15ml 1XPBS中，倒转超滤管3-4次混匀样品，4500×g室温离心14min，上层保留的液体在100-200ul。如果液体大于200ul，可以室温4500×g继续离心。离心时间看保留液体的体积来确定。将上层液体转移到新的1.5mlEP管中。
3、PEG法：15ml尿样/人，加入终浓度为8％的PEG6000，混匀后4℃过夜孵育，3000g离心20min，沉淀溶于200ul PBS。
4、Exoeasy法：15ml尿样/人，1:1将样本与XBP混匀后过柱，500g离心1min，弃废液，加入3.5ml XWP，5000g离心5min，弃废液，加入700ul tirzol，5000g离心5min，-20℃保存待提RNA。
5、Exocolumn法：15ml/尿样人，各两个重复。按照20um筛板/0.48g SAX-2-100/20um筛板的顺序依次装填离心柱，不添加任何平衡溶液，500×g离心，分离Evs。
以上所有样本提取RNA，并用Agilent 2100生物分析仪对所提取RNA进行分析，结果见图1A和图1B，表明多种不同囊泡分离方法均可用于检测尿液囊泡RNA。
实施例2差异表达基因的筛选
为了筛选到与膀胱癌相关的尿液囊泡标志物，膀胱癌患者(包括初诊的膀胱癌患者和术后复发的患者)和对照(正常人和术后未复发的患者)各15例，取晨尿不少于50ml，用经典超速离心方法分离尿液中的囊泡并提取RNA，得到的RNA分别进行miRNA及长RNA建库测序(包括mRNA、LncRNA和CircRNA)。得到的数据进行生物信息学分析，比较膀胱癌患者及对照中差异表达的RNA，并与TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)中公布的miRNA测序及转录组测序数据进行关联分析，筛选到的来源于肿瘤的尿液囊泡差异RNA包括UBE2C等(表1)。
表1差异表达基因列表
实施例3通过实时荧光PCR验证所选基因标志物的引物
1、引物探针的设计和合成
结合Primer Premier 5软件和Primer-BLAST(NCBI)设计了表1所列11个膀胱癌标志物和3个内参基因的引物和探针。设计原则如下：1)扩增片段小于150bp；2)至少一个引物跨越外显子-外显子边界；3)探针的Tm值比引物至少高5℃。将设计好的引物和探针序列交由公司合成，其中探针5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ1。
表2膀胱癌标志物和内参基因的引物探针序列(SEQ ID NO:1-42)
*：内参基因。
2、反转录和qPCR检测
采用Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)和PremixEx TaqTM(Probe qPCR)试剂盒进行反转录和qPCR检测。
按下列组份配制反转录反应体系(反应液配制在冰上进行)，然后放入PCR仪进行反应，反应条件为：37℃60min，85℃5s，12℃∞，反转录结束后加入50ul DEPC-H2O稀释，取3ul作为模板，进行PCR反应。
表3反转录反应体系
按下列组分配制qPCR反应体系(反应液配制在冰上进行)，设置无模板对照作为阴性对照。然后放入实时荧光PCR仪(ABI7500)按如下反应条件进行扩增检测。
表4 qPCR反应体系
表5 qPCR反应条件
为了验证这些基因的表达情况，用3个膀胱癌细胞系、5个健康人和13个膀胱癌标本进行了初步验证，结果显示各个引物均能够有效扩增，并具备高于0.98的扩增效率。其中不同基因引物在膀胱癌细胞系RNA不同稀释梯度下的扩增曲线如图2～图12所示。结合起始RNA的浓度及拷贝数，得出各对引物探针的检测线为5～10个拷贝。
实施例4膀胱癌诊断和复发监测的多基因检测实验方案及性能评估
1、样本的采集
用无菌容器采集晨尿或憋尿超过2小时的随机尿>30ml,并密封盖好。采集后及时送检，室温下保存时间不应超过2小时，如不能及时运送，可在4℃暂时保存(不超过8小时)，长期保存在低温冰箱(<-20℃)。长途运输采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
2、样本的处理
取尿液20ml，3000g离心15min去掉细胞后，13000g离心30min去掉凋亡小体和大型囊泡，再用自超离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀、色谱法、免疫磁珠捕获法等分离囊泡，得到囊泡后使用TRIzol Reagent、Ultrapure RNA Kit等RNA提取试剂盒提取总RNA，并用50ul无核酸酶水洗脱备用。
3、RT-PCR扩增
按表6配制RT-PCR反应液，并按表7的条件进行qPCR扩增检测,用无核酸酶的水作为阴性对照，扩增引物如表2所示。
表6 RT-PCR反应体系配制
表7 RT-PCR反应条件
4、数据分析
实验结束后，根据仪器的软件进行分析，调节阈值至基线荧光值以上，使阴性对照Ct值不出现任何数值，记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。检测结果为未检出或高于40的Ct视为低于检测限，将其转变为40,然后计算ΔCt(ΔCt＝检测基因的Ct-内参基因SLC25A6的Ct)。
用各个基因ΔCt进行逻辑回归建模。利用glmulti包(R版本)，包括相互作用项，筛选所有可能的模型，以发现最佳模型，并以AUC、灵敏度和NPV等评估模型的诊断性能。
5、膀胱癌复发监控模型性能评估
为了验证上述标志物在膀胱癌复发监控的性能，在71例膀胱癌术后患者尿液中分别进行金标准膀胱镜病理检测(结果显示其中25例复发，46例未复发)和上诉标志物检测，其效能评估如下：
(1)基于BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1等基因的ROC曲线分别如图13～图23所示。
(2)基于UBE2C和TPX2等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到UBE2C和TPX2两个基因组合的AUC为0.83，灵敏度为80％，特异性为82.61％，ROC曲线如图24所示。
(3)基于FOXM1、UBE2C和TPX2等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到FOXM1、UBE2C和TPX2等3个基因组合的AUC为0.86，灵敏度为92％，特异性为73.91％，ROC曲线如图25所示。
(4)基于MYBL2、UBE2C和TPX2等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到MYBL2、UBE2C和TPX2等3个基因组合的AUC为0.86，灵敏度为84％，特异性为80.43％，ROC曲线如图26所示。
(5)基于FOXM1、MYBL2、TPX2和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到FOXM1、MYBL2、TPX2和UBE2C等4个基因组合的AUC为0.892，灵敏度为92％，特异性为78.26％，ROC曲线如图27所示。
(6)基于FOXM1、TPX2、UBE2C和UCA1等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到FOXM1、TPX2、UBE2C和UCA1等4个基因组合的AUC为0.89，灵敏度为92％，特异性为71.73％，ROC曲线如图28所示。
(7)基于CDK1、TK1、TPX2和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CDK1、TK1、TPX2和UBE2C等4个基因组合的AUC为0.888，灵敏度为92％，特异性为86.61％，ROC曲线如图29所示。
(8)基于CDK1、FOXM1、TK1、TPX2和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CDK1、FOXM1、TK1、TPX2和UBE2C等5个基因组合的AUC为0.924，灵敏度为92％，特异性为82.61％，ROC曲线如图30所示。
(9)基于CDK1、FOXM1、MYBL2、TPX2和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CDK1、FOXM1、MYBL2、TPX2和UBE2C等5个基因组合的AUC为0.913，灵敏度为96％，特异性为73.91％，ROC曲线如图31所示。
(10)基于FOXM1、MYBL2、TPX2、UBE2C和UCA1等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到FOXM1、MYBL2、TPX2、UBE2C和UCA1等5个基因组合的AUC为0.913，灵敏度为92％，特异性为76.09％，ROC曲线如图32所示。
(11)基于BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1等11基因组合的AUC为0.955，当灵敏度和NPV为100％时，其特异性可达80％，ROC曲线如图33所示。
6、膀胱癌诊断模型性能评估
对57例初诊膀胱癌患者、48例正常人和17例非膀胱癌的泌尿系统疾病患者的尿液进行检测。验证上述标志物在膀胱癌诊断应用中的性能：
(1)基于BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1等基因诊断模型的ROC曲线分别如图34～图44所示。
(2)基于CNNB1和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CNNB1和UBE2C两个基因组合诊断模型的AUC为0.96，灵敏度为89.47％，特异性为93.85％，ROC曲线如图45所示。
(3)基于TK1和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到TK1和UBE2C两个基因组合诊断模型的AUC为0.95，灵敏度为89.47％，特异性为94.73％，ROC曲线如图46所示。
(4)基于CDC20和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CDC20和UBE2C两个基因组合诊断模型的AUC为0.93，灵敏度为89.47％，特异性为86.15％，ROC曲线如图47所示。
(5)基于CNNB1、TK1和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CNNB1、TK1和UBE2C等三个基因组合诊断模型的AUC为0.977，灵敏度为96.49％，特异性为92.31％，ROC曲线如图48所示。
(6)基于CDC20、TK1和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CDC20、TK1、UBE2C等三个基因组合诊断模型的AUC为0.974，灵敏度为92.98％，特异性为93.84％，ROC曲线如图49所示。
(7)基于CDK1、CNNB1和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CDK1、CNNB1和UBE2C等三个基因组合诊断模型的AUC为0.96，灵敏度为91.23％，特异性为90.77％，ROC曲线如图50所示。
(8)基于CNNB1、FOXM、TK1和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CNNB1、FOXM、TK1和UBE2C等4两个基因组合诊断模型的AUC为0.983，灵敏度为96.49％，特异性为95.38％，ROC曲线如图51所示。
(9)基于CDC20、CNNB1、TK1和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CDC20、CNNB1、TK1和UBE2C等4个基因组合诊断模型的AUC为0.982，灵敏度为96.88％，特异性为93.84％，ROC曲线如图52所示。
(10)基于CNNB1、TK1、TPX2和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CNNB1、TK1、TPX2和UBE2C等4个基因组合诊断模型的AUC为0.982，灵敏度为94.73％，特异性为96.92％，ROC曲线如图53所示。
(11)基于CNNB1、FOXM1、TK1、UBE2C和UCA1等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CNNB1、FOXM1、TK1、UBE2C和UCA1等5个基因组合诊断模型的AUC为0.985，灵敏度为96.49％，特异性为95.38％，ROC曲线如图54所示。
(12)基于CDC20、CNNB1、MMP11、TK1和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CDC20、CNNB1、MMP11、TK1和UBE2C等5个基因组合诊断模型的AUC为0.985，灵敏度为94.74％，特异性为95.38％，ROC曲线如图55所示。
(13)基于CNNB1、FOXM1、TK1、TPX2和UBE2C等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到CNNB1、FOXM1、TK1、TPX2和UBE2C等5个基因组合诊断模型的AUC为0.985，灵敏度为94.74％，特异性为98.46％，ROC曲线如图56所示。
(14)基于BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1等基因Ct值，并根据内参S100P计算ΔCt，根据逻辑回归得到BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1等11个基因组合诊断模型的AUC为0.99，灵敏度及NPV均为98％以上时，特异性达92％，ROC曲线如图57所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京恩泽康泰生物科技有限公司
<120> 用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒
<130> KHP181118788.3
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccagtgttt cttctgcttc aa 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttcttggc tctttctctg tcc 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccagatgacg accccataga ggaaca 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttcccaaa accgcgacc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcctgctgt agccttttgc c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acccagccgc cactagcgtc gc 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatctaccat acccattgac taact 25
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acctgtagtt ttgtgtctac cc 22
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctccataggt accttctcca attttctc 28
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagaggttcg tgctttctgg 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcacatcgct ccataccttt ag 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgggagaag acggacctca cct 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cattccagac cttgccctac t 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttcgtcctc ttcctcatct tc 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttccaatcac cgtccccaag tcac 24
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acaaaatgcg ccagagggtt a 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccaatccaca aggttcaggt aat 23
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttccttccct gccagaccgt atcct 25
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttgtggatga ggatgtgaag c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgaggctgga agagtttgaa g 21
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgtccacac tgcccaagtc tctatcc 27
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctcgctacag cagcagcttc t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctcgcagaac tccacgatgt c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cctgctccga gacgtggccc a 21
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggctttctct gatgtaattc ttgc 24
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggtattttgg tctgactgct tgc 23
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcagctccat cttctgcatc cacatc 26
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgcagctagg gatgtgaatc 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aagccactgg atgttggata g 21
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cctttgcgag cagaaacggg aga 23
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcttcgggta actcttacgg tg 22
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggcagttggt gtgctataaa tgac 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agcctcaatg gaccagaccc tacc 24
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aggtgctgat ggagaaggag c 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gcagccacga acacgatga 19
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cactgaagtc cacctgggca tctcc 25
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gaaggagctg aactactttg caa 23
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tttgtccagc atattattga tgagc 25
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caactttagc tccgcccagg atg 23
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggcctacttc ggcgtgtac 19
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gaaggggtag gacaccacg 19
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcacggtctg cgcgatcatc ca 22

Claims (10)

1.用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为基因UBE2C，以及如下基因BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为基因UBE2C，以及如下基因CDK1、UCA1、TK1、TPX2、MYBL2和FOXM1中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为如下I～XIII中的任一个：
I：基因UBE2C和CCNB1；
II：基因UBE2C和TK1；
III：基因UBE2C和CDC20；
IV：基因UBE2C、CCNB1和TK1；
V：基因UBE2C、CDC20和TK1；
VI：基因UBE2C、CCNB1和CDK1；
VII：基因UBE2C、CCNB1、FOXM1和TK1；
VIII：基因UBE2C、CDC20、CNNB1和TK1；
IX：基因UBE2C、CNNB1、TK1和TPX2；
X：基因UBE2C、CNNB1、FOXM1、TK1和UCA1；
XI：基因UBE2C、CDC20、CNNB1、MMP11和TK1；
XII：基因UBE2C、CNNB1、FOXM1、TK1和TPX2；
XIII：基因UBE2C、BIRC5、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1。
4.用于检测权利要求1-3任一项所述生物标志物的引物，其特征在于，
用于检测BIRC5的上、下游引物分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；
用于检测UBE2C的上、下游引物分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5；
用于检测CDK1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示；
用于检测MMP11的上、下游引物分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示；
用于检测TPX2的上、下游引物分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示；
用于检测CDC20的上、下游引物分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示；
用于检测MYBL2的上、下游引物分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示；
用于检测TK1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23所示；
用于检测CCNB1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26所示；
用于检测FOXM1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29所示；
用于检测UCA1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示。
5.用于检测权利要求1-3任一项所述生物标志物的探针，其特征在于，对应于BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、CCNB1、FOXM1、和UCA1，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30和33所示。
6.含有权利要求4所述引物和/或权利要求5所述探针的检测试剂或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的检测试剂或试剂盒，其特征在于，还包含用于检测内参基因的引物和/或探针，所述内参基因为S100P、SLC25A或PGK1，优选S100P。
8.根据权利要求7所述的检测试剂或试剂盒，其特征在于，
用于检测S100P的上、下游引物分别如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35所示；
用于检测SLC25A的上、下游引物分别如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38所示；
用于检测PGK1的上、下游引物分别如SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41所示；和/或
对应于S100P、SLC25A和PGK1，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:36、39和42所示。
9.与权利要求5-8任一项所述试剂盒配套的PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系如下：
。
10.根据权利要求9所述的PCR反应体系，其特征在于，所述样品来自尿液。
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