JPWO2019117269A1 - 膵がんの検出を補助する方法 - Google Patents
膵がんの検出を補助する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2019117269A1 JPWO2019117269A1 JP2019559213A JP2019559213A JPWO2019117269A1 JP WO2019117269 A1 JPWO2019117269 A1 JP WO2019117269A1 JP 2019559213 A JP2019559213 A JP 2019559213A JP 2019559213 A JP2019559213 A JP 2019559213A JP WO2019117269 A1 JPWO2019117269 A1 JP WO2019117269A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mirna
- seq
- abundance
- nos
- pancreatic cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 24
- 108091027558 IsomiR Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 230000002946 anti-pancreatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 2
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 2
- 108091090987 miR-425 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091082652 miR-425-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108010058566 130-nm albumin-bound paclitaxel Proteins 0.000 description 1
- 108091070482 Caenorhabditis elegans miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 108091043994 let-7g stem-loop Proteins 0.000 description 1
- -1 levofolinate Chemical compound 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108091048131 miR-425-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
要約本発明は、膵がんを高精度に検出することを補助する方法を提供することを目的とする。本発明は、生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８、２２〜３８のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (MiscRNA)の少なくとも１種の存在量を指標とする膵がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１〜２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは転移RNA断片の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２１〜３８のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは非コードRNA断片 (MiscRNA)の存在量が健常者よりも少ないことが、膵がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法を提供する。
Description
本発明は、膵がんの検出を補助する方法に関する。
がんの中でも、膵がんは年々増加傾向にあり、この原因として、食事の欧米化が指摘されている。膵がんは初期症状がほとんどなく、高い増殖能・浸潤性から、年度別の発症数と死亡数がほぼ等しく、生存率が著しく低いのが現状である。膵臓は、腹部の奥深くに位置するため、Ｘ線撮影等の検査方法によっては、なかなか発見されにくい。
このため、血漿中のマイクロRNA（以下、「miRNA」）の存在量を指標として膵がんを検出する方法が提案されている（特許文献１〜４）。
上記の通り、種々のmiRNAが、膵がん検出のための指標として提案されているが、より正確に膵がんを検出することができれば有利であることは言うまでもない。
したがって、本発明の目的は、膵がんを高精度に検出することを補助する、膵がんの検出を補助する方法を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、膵がんにおいて存在量が増大又は減少するmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、miRNA前駆体、転移ＲＮＡ断片(tRF)および非コードRNA断片 (MiscRNA)を新たに見出し、これらを指標とすることにより、高精度に膵がんが可能になることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1) 生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８、２２〜３８のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (MiscRNA)の少なくとも１種の存在量を指標とする膵がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１〜２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは転移RNA断片の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２１〜３８のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは非コードRNA断片 (MiscRNA)の存在量が健常者よりも少ないことが、膵がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2) 塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、又は転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(3) 塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９、２０及び２１のいずれかで示されるmiRNA又はisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする(2)記載の方法。
(4) 塩基配列が配列番号１〜４、６及び７のいずれかで示されるmiRNA又はisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする(2)又は(3)に記載の方法。
(1) 生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８、２２〜３８のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (MiscRNA)の少なくとも１種の存在量を指標とする膵がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１〜２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは転移RNA断片の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２１〜３８のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは非コードRNA断片 (MiscRNA)の存在量が健常者よりも少ないことが、膵がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2) 塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、又は転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(3) 塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９、２０及び２１のいずれかで示されるmiRNA又はisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする(2)記載の方法。
(4) 塩基配列が配列番号１〜４、６及び７のいずれかで示されるmiRNA又はisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする(2)又は(3)に記載の方法。
本発明の方法によれば、高精度に、かつ、それでいて簡便に膵がんを検出することが可能であるので、膵がんの検出に大いに寄与する。
上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれる特定のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片（tRF）、非コードRNA断片 (MiscRNA)（以下、便宜的に「miRNA等」と呼ぶことがある）の存在量を指標とする。これらのmiRNA等の塩基配列は配列表に示すとおりである。本発明の方法に用いるmiRNA等の一覧を下記表１−１〜表１−２に示す。
これらのmiRNA等のうち、塩基配列が配列番号１〜２１で示されるmiRNA等（以下、便宜上、例えば「塩基配列が配列番号１で示されるmiRNA等」を単に「配列番号１のmiRNA等」や「配列番号１のもの」と呼ぶことがある）は、血漿中に存在するものである。これらのmiRNA等のうち、塩基配列が配列番号２２〜３８で示されるmiRNA等は、血清中に存在するものである。
これらのmiRNA等は、全て、膵がん患者の血漿中の存在量と、健常者の血漿中の存在量との比の対数（底が２の対数で「log FC」（FCは、fold change）と呼ばれる）の絶対値が2.0超のものであり（すなわち、比が約4倍以上又は約4分の１以下）、統計学的に有意(t検定でp<0.05)のものである。
配列番号１〜２０のmiRNA等は、膵がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも多いものであり、配列番号２１〜３８のmiRNA等は、膵がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも少ないものである。
これらの中でも、配列番号１〜４、６、７のmiRNA等は、log FCの絶対値が4.0以上のものであり、特に感度の高い指標となるものであり、好ましい。
がんマーカーの精度を示す指標としてROC曲線下面積(AUC(Area Under Curve))が用いられており、一般的にAUCが0.7以上のものががんマーカーとして有効であると言われている。AUCが0.90以上のものは高精度であり、0.97以上は非常に高精度、0.99以上は極めて高精度、1.00で完璧（偽陽性及び偽陰性が全くない）である。したがって、本発明においても、AUCが0.90のものが好ましく、さらに0.97以上のものが好ましく、さらに0.99以上のものが好ましく、1.00のものが最も好ましい。配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１のものは、下記実施例に具体的に記載するとおり、AUCが1.00であり、特に好ましいものである。
被検試料としては、miRNAを含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。血清中に存在する配列番号２２〜３８のものは、血清又は血漿を被検試料とすることが簡便で好ましい。血清又は血漿中の全ＲＮＡの抽出方法は周知であり、下記実施例に具体的に記載されている。血清又は血漿中のエクソソームからの全ＲＮＡの抽出方法自体も公知であり、詳細は下記実施例に具体的に記載されている。
各miRNA等の存在量の測定（定量）は、次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。次世代シーケンサーのように配列を読む機器であれば、機種を特定しない。下記実施例に具体的に記載されるように、本発明の方法では、定量するmiRNA等には、例えば、通常の成熟型miRNAの5’末端および／または3’末端からわずか１塩基以上が欠失または付加されているだけのisomiRを、基本となるmiRNAと区別して定量する必要があるので、精度の観点から、miRNAの定量に広く用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。具体的には下記実施例において詳細に記載するが、簡単に述べると、この定量方法は、次のようにしておこなうことができる。血清或いは血漿中に存在するRNAが一定である場合、それらを用いた次世代シークエンス解析において読まれたリード数を100万リード数に換算して、100万リード数当たりのそれぞれのisomiRや成熟型miRNAのリード数を測定値とする。疾患によって健常人に比較して血清中または血漿中のRNAが変化する場合は、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAを用いる場合がある。なお、血清又は血漿中のmiRNA等を定量する場合には、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAであるlet-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のmiRNAを内部標準として用いることが好ましい。
判定に用いる、各miRNA等の存在量のカットオフ値としては、各miRNA等について、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるLog2 リード数（カットオフ値）を各miRNA等について設定することができ、例えば、いくつかの各miRNA等におけるカットオフ値(log2リード数)は表２に示すとおりである。なお、表２に示されるカットオフ値は、単なる例に過ぎず、統計学的有意差が出る限り、他の値をカットオフ値として採用することができる。また、データを採取する患者及び健常者の集団が異なれば、最良のカットオフ値も異なる。もっとも、通常、表２に示されるカットオフ値の±２０％の範囲内、特には±１０％の範囲内でカットオフ値を設定することができる。
また、膵がんが疑われるか又は膵がんに罹患するヒトの被検試料中のmiRNA等の存在量を検出する方法も提供される。
すなわち、膵がんが疑われる又は膵がんに罹患するヒトの被検試料中の塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８、２２〜３８のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (MiscRNA)の少なくとも１種の存在量を検出する方法であって、
ヒトから血液試料を得る工程、及び
次世代シーケンサーまたはqRT-PCRを用いて、前記血液試料内のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、又は非コードRNA断片の存在量を測定する工程を含み、
ここで、塩基配列が配列番号１〜２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは転移RNA断片の存在量が健常者よりも多い、又は塩基配列が配列番号２１〜３８のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは非コードRNA断片 (MiscRNA)の存在量が健常者よりも少ない、方法、も提供される。
すなわち、膵がんが疑われる又は膵がんに罹患するヒトの被検試料中の塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８、２２〜３８のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (MiscRNA)の少なくとも１種の存在量を検出する方法であって、
ヒトから血液試料を得る工程、及び
次世代シーケンサーまたはqRT-PCRを用いて、前記血液試料内のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、又は非コードRNA断片の存在量を測定する工程を含み、
ここで、塩基配列が配列番号１〜２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは転移RNA断片の存在量が健常者よりも多い、又は塩基配列が配列番号２１〜３８のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは非コードRNA断片 (MiscRNA)の存在量が健常者よりも少ない、方法、も提供される。
また、上記した本願発明の方法により、膵がんが検出された場合、膵がんが検出された患者に有効量の抗膵がん剤を投与することにより、膵がんを治療することができる。抗膵がん剤としては、ゲムシタビン、フォルフィリノックス（フルオロウラシル・レボホリナート・イリノテカン・オキサリプラチン併用）、ゲムシタビン・ナブパクリタキセル(Gem/nabPTX)、ティーエスワン（S1）等を挙げることができる。
以下、本発明を実施例及び比較例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１〜３８
１． 材料及び方法
(1) 臨床検体
膵がん患者５例、健常者５例の血漿を用いた。
膵がん患者７５例、健常者１１１例の血清を用いた。
１． 材料及び方法
(1) 臨床検体
膵がん患者５例、健常者５例の血漿を用いた。
膵がん患者７５例、健常者１１１例の血清を用いた。
(2) 血漿・血清中のＲＮＡの抽出
血漿・血清中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血漿・血清サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬ を新しい 1.5 mL チューブ に移した。
3) 1000 μＬ の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブ に移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬ の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬ の Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブ に移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブ に移し、50 μＬ の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。
血漿・血清中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血漿・血清サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬ を新しい 1.5 mL チューブ に移した。
3) 1000 μＬ の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブ に移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬ の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬ の Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブ に移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブ に移し、50 μＬ の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。
(3) miRNA等の定量
miRNA等の定量は、次のようにして行った。
二群等でmiRNA等の定量を行う場合は、同様の方法で回収した細胞外小胞(エクソソームを含む)を用いて同様の方法でRNAを精製してcDNAライブラリーを作成して次世代シークエンス解析を行う。次世代シークエンス解析は、配列を読む機器であれば機器を限定しない。
miRNA等の定量は、次のようにして行った。
二群等でmiRNA等の定量を行う場合は、同様の方法で回収した細胞外小胞(エクソソームを含む)を用いて同様の方法でRNAを精製してcDNAライブラリーを作成して次世代シークエンス解析を行う。次世代シークエンス解析は、配列を読む機器であれば機器を限定しない。
(4) カットオフ値及びAUCの算出
定量結果からのカットオフ値及びAUCの算出は、具体的に次のようにして行った。
JMP Genomics 8を用いてロジスティック回帰分析を実施し、ROC曲線とAUCの算出を行った。また、ROC曲線の左上隅の点（感度1.0, 特異度 1.0）との距離が最小となる点をカットオフ値とした。
定量結果からのカットオフ値及びAUCの算出は、具体的に次のようにして行った。
JMP Genomics 8を用いてロジスティック回帰分析を実施し、ROC曲線とAUCの算出を行った。また、ROC曲線の左上隅の点（感度1.0, 特異度 1.0）との距離が最小となる点をカットオフ値とした。
２． 結果
結果を表２−１及び表２−２に示す。
結果を表２−１及び表２−２に示す。
これらの結果からわかるように、配列番号１〜２０のmiRNA等は、膵がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に多く、配列番号２１〜３８のmiRNA等は、膵がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に少なかった。本発明の方法（実施例１〜３８）によれば、高精度に膵がんの検出が可能であることが示された。また、実施例１〜３８のt検定によるp値はいずれも0.05未満であり、膵がんの検出に有効であることが示された。
また、配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９、２０及び２１のものは、AUCが1.00であり、特に好ましいものであることが明らかになった。
Claims (4)
- 生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８、２２〜３８のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (MiscRNA)の少なくとも１種の存在量を指標とする膵がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１〜２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは転移RNA断片の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２１〜３８のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは非コードRNA断片 (MiscRNA)の存在量が健常者よりも少ないことが、膵がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
- 塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９〜２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、又は転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項１記載の方法。
- 塩基配列が配列番号１、４、６〜１０、１２、１５、１７、１９、２０及び２１のいずれかで示されるmiRNA又はisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項２記載の方法。
- 塩基配列が配列番号１〜４、６及び７のいずれかで示されるmiRNA又はisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項２又は３に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023094590A JP2023113877A (ja) | 2017-12-13 | 2023-06-08 | 膵がんの検出を補助する方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017238839 | 2017-12-13 | ||
| JP2017238839 | 2017-12-13 | ||
| PCT/JP2018/045993 WO2019117269A1 (ja) | 2017-12-13 | 2018-12-13 | 膵がんの検出を補助する方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023094590A Division JP2023113877A (ja) | 2017-12-13 | 2023-06-08 | 膵がんの検出を補助する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2019117269A1 true JPWO2019117269A1 (ja) | 2021-02-18 |
| JP7298914B2 JP7298914B2 (ja) | 2023-06-27 |
Family
ID=66819331
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019559213A Active JP7298914B2 (ja) | 2017-12-13 | 2018-12-13 | 膵がんの検出を補助する方法 |
| JP2023094590A Pending JP2023113877A (ja) | 2017-12-13 | 2023-06-08 | 膵がんの検出を補助する方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023094590A Pending JP2023113877A (ja) | 2017-12-13 | 2023-06-08 | 膵がんの検出を補助する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230167504A1 (ja) |
| EP (1) | EP3725881A1 (ja) |
| JP (2) | JP7298914B2 (ja) |
| WO (1) | WO2019117269A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522262B (zh) * | 2020-11-12 | 2023-06-20 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 一种与胰腺癌相关的tRF及其应用 |
| EP4245301A4 (en) * | 2020-11-13 | 2024-08-21 | Ono Pharmaceutical Co | CANCER TREATMENT BY COMBINED USE OF AN EP4 ANTAGONIST AND AN IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009521952A (ja) * | 2006-01-05 | 2009-06-11 | ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション | 膵内分泌腫瘍及び膵腺房腫瘍におけるマイクロｒｎａ発現異常 |
| JP2009528070A (ja) * | 2006-03-02 | 2009-08-06 | ザ オハイオ ステイト ユニバーシティ | 膵臓癌に関連するマイクロｒｎａ発現プロファイル |
| WO2014003053A1 (ja) * | 2012-06-27 | 2014-01-03 | 独立行政法人国立がん研究センター | 膵臓がんの検出方法及び検出用キット |
| JP2015502176A (ja) * | 2011-12-19 | 2015-01-22 | ヴァリー ヘルス システム | 癌を患うリスクのある被検体を診断するための方法およびキット |
| WO2015182781A1 (ja) * | 2014-05-30 | 2015-12-03 | 東レ株式会社 | 膵臓がんの検出キット又はデバイス及び検出方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101827941B (zh) | 2007-04-30 | 2014-07-16 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于区分胰腺癌与正常胰腺功能和/或慢性胰腺炎的方法 |
| WO2013107459A2 (en) * | 2012-01-16 | 2013-07-25 | Herlev Hospital | Microrna for diagnosis of pancreatic cancer and/or prognosis of patients with pancreatic cancer by blood samples |
| WO2015091897A1 (en) * | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Comprehensive Biomarker Center Gmbh | Determination of platelet-mirnas |
| JP6489583B2 (ja) * | 2014-03-04 | 2019-03-27 | 国立大学法人広島大学 | 膵がんの検出を補助する方法 |
-
2018
- 2018-12-13 JP JP2019559213A patent/JP7298914B2/ja active Active
- 2018-12-13 US US16/772,625 patent/US20230167504A1/en not_active Abandoned
- 2018-12-13 EP EP18888263.3A patent/EP3725881A1/en not_active Withdrawn
- 2018-12-13 WO PCT/JP2018/045993 patent/WO2019117269A1/ja active Search and Examination
-
2023
- 2023-06-08 JP JP2023094590A patent/JP2023113877A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009521952A (ja) * | 2006-01-05 | 2009-06-11 | ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション | 膵内分泌腫瘍及び膵腺房腫瘍におけるマイクロｒｎａ発現異常 |
| JP2009528070A (ja) * | 2006-03-02 | 2009-08-06 | ザ オハイオ ステイト ユニバーシティ | 膵臓癌に関連するマイクロｒｎａ発現プロファイル |
| JP2015502176A (ja) * | 2011-12-19 | 2015-01-22 | ヴァリー ヘルス システム | 癌を患うリスクのある被検体を診断するための方法およびキット |
| WO2014003053A1 (ja) * | 2012-06-27 | 2014-01-03 | 独立行政法人国立がん研究センター | 膵臓がんの検出方法及び検出用キット |
| WO2015182781A1 (ja) * | 2014-05-30 | 2015-12-03 | 東レ株式会社 | 膵臓がんの検出キット又はデバイス及び検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019117269A1 (ja) | 2019-06-20 |
| US20230167504A1 (en) | 2023-06-01 |
| JP7298914B2 (ja) | 2023-06-27 |
| EP3725881A1 (en) | 2020-10-21 |
| JP2023113877A (ja) | 2023-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109777874B (zh) | 一种适用于胰腺导管腺癌诊断及预后判断的血浆外泌体miRNA标志物及应用 | |
| Lin et al. | Aberrant expression of microRNAs in serum may identify individuals with pancreatic cancer | |
| CN111826444B (zh) | 一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物、探针及其应用 | |
| Peng et al. | Circulating microRNAs for the diagnosis of hepatocellular carcinoma | |
| Elhendawy et al. | MicroRNA signature in hepatocellular carcinoma patients: identification of potential markers | |
| US9909190B2 (en) | Method for assisting detection of pancreatic cancer | |
| Zhou et al. | Combination of serum miRNAs with Cyfra21-1 for the diagnosis of non-small cell lung cancer | |
| Tóth et al. | Circadian rhythm of methylated septin 9, cell-free DNA amount and tumor markers in colorectal cancer patients | |
| JP2023113877A (ja) | 膵がんの検出を補助する方法 | |
| CN113337613B (zh) | 一种与肝癌相关的血清外泌体tsRNA标志物、探针及其应用 | |
| JP2023113881A (ja) | 乳がんの検出を補助する方法 | |
| CN107523647A (zh) | 检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒 | |
| JP7390002B2 (ja) | 頭頸部がんの検出を補助する方法 | |
| Xu et al. | Comprehensive assessment of plasma Circ_0004771 as a novel diagnostic and dynamic monitoring biomarker in gastric cancer | |
| Zhuo et al. | Plasma microRNA expression signature involving miR-548q, miR-630 and miR-940 as biomarkers for nasopharyngeal carcinoma detection | |
| CN104694623A (zh) | 一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物及应用 | |
| TWI571514B (zh) | 評估罹患大腸直腸癌風險的方法 | |
| CN116083579A (zh) | 用于非小细胞肺癌诊断的circRNA-miRNA-mRNA调控网络及其应用 | |
| CN102021169A (zh) | 一种血清/血浆miRNA组合物及其应用 | |
| CN113584169A (zh) | 一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物、探针及其应用 | |
| WO2016185451A1 (en) | Method and kit for the diagnosis of colorectal cancer | |
| JPWO2019117306A1 (ja) | アルツハイマー病の検出を補助する方法 | |
| CN109371129A (zh) | hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标记物的应用 | |
| LU503615B1 (en) | Serodiagnosis marker for gastric cancer (gc), and determination method | |
| WO2024002599A1 (en) | Novel signatures for lung cancer detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200619 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200702 |
|
| AA64 | Notification of invalidation of claim of internal priority (with term) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764 Effective date: 20200908 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200909 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211115 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221101 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221219 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230224 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230511 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230608 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7298914 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |