JP7298914B2

JP7298914B2 - 膵がんの検出を補助する方法

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Publication number: JP7298914B2
Application number: JP2019559213A
Authority: JP
Inventors: 栄俊田原
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2038-12-13
Also published as: US20230167504A1; JPWO2019117269A1; WO2019117269A1; JP2023113877A; EP3725881A1

Description

本発明は、膵がんの検出を補助する方法に関する。

がんの中でも、膵がんは年々増加傾向にあり、この原因として、食事の欧米化が指摘されている。膵がんは初期症状がほとんどなく、高い増殖能・浸潤性から、年度別の発症数と死亡数がほぼ等しく、生存率が著しく低いのが現状である。膵臓は、腹部の奥深くに位置するため、Ｘ線撮影等の検査方法によっては、なかなか発見されにくい。

このため、血漿中のマイクロRNA（以下、「miRNA」）の存在量を指標として膵がんを検出する方法が提案されている（特許文献１～４）。

WO 2014/003053 A1 特表2009-521952号公報特表2009-528070号公報特表2010-527235号公報

上記の通り、種々のmiRNAが、膵がん検出のための指標として提案されているが、より正確に膵がんを検出することができれば有利であることは言うまでもない。

したがって、本発明の目的は、膵がんを高精度に検出することを補助する、膵がんの検出を補助する方法を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、膵がんにおいて存在量が増大又は減少するmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、miRNA前駆体、転移ＲＮＡ断片(tRF)および非コードRNA断片 (MiscRNA)を新たに見出し、これらを指標とすることにより、高精度に膵がんが可能になることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、６～１０、１５、１７、１９～２１のいずれかで示されるmiRNA又はそのアイソフォーム(isomiR)の少なくとも１種の存在量を指標とする膵がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１、６～１０、１５、１７、１９～２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA若しくはisomiRの存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２１のisomiRの存在量が健常者よりも少ないことが、膵がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2)塩基配列が配列番号１、６～８、１０、１５、１９～２１のいずれかで示されるmiRNA又はそのisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(3)塩基配列が配列番号１、６及び７のいずれかで示されるisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする(2)記載の方法。
(4)塩基配列が配列番号８、１０、１５及び２０のいずれかで示されるmiRNA又はisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする(2)記載の方法。

本発明の方法によれば、高精度に、かつ、それでいて簡便に膵がんを検出することが可能であるので、膵がんの検出に大いに寄与する。

上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれる特定のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片（tRF）、非コードRNA断片 (MiscRNA)（以下、便宜的に「miRNA等」と呼ぶことがある）の存在量を指標とする。これらのmiRNA等の塩基配列は配列表に示すとおりである。本発明の方法に用いるmiRNA等の一覧を下記表１－１～表１－２に示す。

これらのmiRNA等のうち、塩基配列が配列番号１～２１で示されるmiRNA等（以下、便宜上、例えば「塩基配列が配列番号１で示されるmiRNA等」を単に「配列番号１のmiRNA等」や「配列番号１のもの」と呼ぶことがある）は、血漿中に存在するものである。これらのmiRNA等のうち、塩基配列が配列番号２２～３８で示されるmiRNA等は、血清中に存在するものである。

これらのmiRNA等は、全て、膵がん患者の血漿中の存在量と、健常者の血漿中の存在量との比の対数（底が２の対数で「log FC」（FCは、fold change）と呼ばれる）の絶対値が2.0超のものであり（すなわち、比が約4倍以上又は約4分の１以下）、統計学的に有意(t検定でp<0.05)のものである。

配列番号１～２０のmiRNA等は、膵がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも多いものであり、配列番号２１～３８のmiRNA等は、膵がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも少ないものである。

これらの中でも、配列番号１～４、６、７のmiRNA等は、log FCの絶対値が4.0以上のものであり、特に感度の高い指標となるものであり、好ましい。

がんマーカーの精度を示す指標としてROC曲線下面積(AUC(Area Under Curve))が用いられており、一般的にAUCが0.7以上のものががんマーカーとして有効であると言われている。AUCが0.90以上のものは高精度であり、0.97以上は非常に高精度、0.99以上は極めて高精度、1.00で完璧（偽陽性及び偽陰性が全くない）である。したがって、本発明においても、AUCが0.90のものが好ましく、さらに0.97以上のものが好ましく、さらに0.99以上のものが好ましく、1.00のものが最も好ましい。配列番号１、４、６～１０、１２、１５、１７、１９～２１のものは、下記実施例に具体的に記載するとおり、AUCが1.00であり、特に好ましいものである。

被検試料としては、miRNAを含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。血清中に存在する配列番号２２～３８のものは、血清又は血漿を被検試料とすることが簡便で好ましい。血清又は血漿中の全ＲＮＡの抽出方法は周知であり、下記実施例に具体的に記載されている。血清又は血漿中のエクソソームからの全ＲＮＡの抽出方法自体も公知であり、詳細は下記実施例に具体的に記載されている。

各miRNA等の存在量の測定（定量）は、次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。次世代シーケンサーのように配列を読む機器であれば、機種を特定しない。下記実施例に具体的に記載されるように、本発明の方法では、定量するmiRNA等には、例えば、通常の成熟型miRNAの5’末端および／または3’末端からわずか１塩基以上が欠失または付加されているだけのisomiRを、基本となるmiRNAと区別して定量する必要があるので、精度の観点から、miRNAの定量に広く用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。具体的には下記実施例において詳細に記載するが、簡単に述べると、この定量方法は、次のようにしておこなうことができる。血清或いは血漿中に存在するRNAが一定である場合、それらを用いた次世代シークエンス解析において読まれたリード数を100万リード数に換算して、100万リード数当たりのそれぞれのisomiRや成熟型miRNAのリード数を測定値とする。疾患によって健常人に比較して血清中または血漿中のRNAが変化する場合は、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAを用いる場合がある。なお、血清又は血漿中のmiRNA等を定量する場合には、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAであるlet-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のmiRNAを内部標準として用いることが好ましい。

判定に用いる、各miRNA等の存在量のカットオフ値としては、各miRNA等について、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるLog2 リード数（カットオフ値）を各miRNA等について設定することができ、例えば、いくつかの各miRNA等におけるカットオフ値(log₂リード数)は表２に示すとおりである。なお、表２に示されるカットオフ値は、単なる例に過ぎず、統計学的有意差が出る限り、他の値をカットオフ値として採用することができる。また、データを採取する患者及び健常者の集団が異なれば、最良のカットオフ値も異なる。もっとも、通常、表２に示されるカットオフ値の±２０％の範囲内、特には±１０％の範囲内でカットオフ値を設定することができる。

また、膵がんが疑われるか又は膵がんに罹患するヒトの被検試料中のmiRNA等の存在量を検出する方法も提供される。
すなわち、膵がんが疑われる又は膵がんに罹患するヒトの被検試料中の塩基配列が配列番号１、４、６～１０、１２、１５、１７、１９～２１、２、３、５、１１、１３、１４、１６、１８、２２～３８のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (MiscRNA)の少なくとも１種の存在量を検出する方法であって、
ヒトから血液試料を得る工程、及び
次世代シーケンサーまたはqRT-PCRを用いて、前記血液試料内のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、又は非コードRNA断片の存在量を測定する工程を含み、
ここで、塩基配列が配列番号１～２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは転移RNA断片の存在量が健常者よりも多い、又は塩基配列が配列番号２１～３８のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、若しくは非コードRNA断片 (MiscRNA)の存在量が健常者よりも少ない、方法、も提供される。

また、上記した本願発明の方法により、膵がんが検出された場合、膵がんが検出された患者に有効量の抗膵がん剤を投与することにより、膵がんを治療することができる。抗膵がん剤としては、ゲムシタビン、フォルフィリノックス（フルオロウラシル・レボホリナート・イリノテカン・オキサリプラチン併用）、ゲムシタビン・ナブパクリタキセル(Gem/nabPTX)、ティーエスワン（S1）等を挙げることができる。

以下、本発明を実施例及び比較例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１～３８
１．材料及び方法
(1) 臨床検体
膵がん患者５例、健常者５例の血漿を用いた。
膵がん患者７５例、健常者１１１例の血清を用いた。

(2) 血漿・血清中のＲＮＡの抽出
血漿・血清中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血漿・血清サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬを新しい 1.5 mL チューブに移した。
3) 1000 μＬの QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブに移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬの 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬの Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬのBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬのBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブに移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブに移し、50 μＬの RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。

(3) miRNA等の定量
miRNA等の定量は、次のようにして行った。
二群等でmiRNA等の定量を行う場合は、同様の方法で回収した細胞外小胞(エクソソームを含む)を用いて同様の方法でRNAを精製してcDNAライブラリーを作成して次世代シークエンス解析を行う。次世代シークエンス解析は、配列を読む機器であれば機器を限定しない。

(4) カットオフ値及びAUCの算出
定量結果からのカットオフ値及びAUCの算出は、具体的に次のようにして行った。
JMP Genomics 8を用いてロジスティック回帰分析を実施し、ROC曲線とAUCの算出を行った。また、ROC曲線の左上隅の点（感度1.0, 特異度 1.0）との距離が最小となる点をカットオフ値とした。

２．結果
結果を表２－１及び表２－２に示す。

これらの結果からわかるように、配列番号１～２０のmiRNA等は、膵がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に多く、配列番号２１～３８のmiRNA等は、膵がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に少なかった。本発明の方法（実施例１～３８）によれば、高精度に膵がんの検出が可能であることが示された。また、実施例１～３８のt検定によるp値はいずれも0.05未満であり、膵がんの検出に有効であることが示された。

また、配列番号１、４、６～１０、１２、１５、１７、１９、２０及び２１のものは、AUCが1.00であり、特に好ましいものであることが明らかになった。

Claims

生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、６～１０、１５、１７、１９～２１のいずれかで示されるmiRNA又はそのアイソフォーム(isomiR)の少なくとも１種の存在量を指標とする膵がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１、６～１０、１５、１７、１９～２０のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA若しくはisomiRの存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２１のisomiRの存在量が健常者よりも少ないことが、膵がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
塩基配列が配列番号１、６～８、１０、１５、１９～２１のいずれかで示されるmiRNA又はそのisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項１記載の方法。
塩基配列が配列番号１、６及び７のいずれかで示されるisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項２記載の方法。
塩基配列が配列番号８、１０、１５及び２０のいずれかで示されるmiRNA又はisomiRの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項２記載の方法。