CN112522262B - 一种与胰腺癌相关的tRF及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与胰腺癌相关的tRF,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明发现了一个具有高表达显著抑制胰腺癌细胞的恶性表型功能的tRNA来源的片段tRF‑21‑VBY,其具有抑制细胞增殖和迁移、侵袭能力,并且促进细胞凋亡,抑制皮下移植瘤的生长和胰腺癌原位肿瘤生长,并且能够指示胰腺癌病人的预后的功能。因此tRF‑21‑VBY或其激活剂可用于制备治疗胰腺癌的药物,或用于筛选适合于治疗胰腺癌的药物;检测tRF‑21‑VBY的试剂可用于制备胰腺癌预后预测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及胰腺癌技术领域,更具体地,涉及一种与胰腺癌相关的tRF及其应用。
背景技术
胰腺癌是一种消化系统的恶性肿瘤,5年生存率不足9%。很多胰腺癌在诊断时已是晚期,丧失了手术治愈的机会。容易发生化疗药物耐受,预后极差。易发生局部侵犯,也可通过淋巴道和血行转移至远处脏器。因此,阐明胰腺癌发生发展的潜在机制并寻找新的治疗靶点,对于胰腺癌的治疗至关重要。
近年来,非编码RNA与肿瘤的研究非常广泛,在肿瘤的发生发展过程中发挥非常重要的作用。tRNA-derived fragment(tRNA来源片段,后称为tRF)是小RNA的种类之一,在大多数生物体中普遍存在。在某些特定的应激条件下,t RFs由tRNA剪切产生,剪切酶包括Dicer、Angiogenin和RNase Z等。根据tR NA上的剪切位点,tRFs被分为四类,即tRF-5、tRF-3、tRF-1和i-tRF。已有文献报道,tRFs在多种肿瘤中发挥重要作用,并且作用模式多样。tRFs可以发挥类似miRNA的作用,CU1276来源于tRNAGlyGCC,结合Argonaute蛋白,抑制R PA1表达进而抑制B细胞淋巴瘤细胞的增殖。tRFs也可以与蛋白结合,低氧条件下,乳腺癌细胞中产生增多的4种i-tRF,能够与YBX1结合,使得YBX1从促癌转录本上脱离,从而导致促癌转录本降解。另外,tRF可以改变mRNA的二级结构,LeuCAG3’tsRNA结合RPS28的mRNA,打开其二级结构从而促进翻译过程。中国专利CN201910800013X公开了一种具有显著的促进NSCLC细胞肿瘤活性的能力的tRF,抑制该tRF的表达可显著抑制NSCLC细胞的增殖。但是,目前尚未有tRFs调控胰腺癌的发生发展的报道。
目前,胰腺癌仍缺乏较为准确的预测指标和有效的治疗方案。因此,寻找新的靶标来指示胰腺癌病人的预后情况并能够在动物模型上进行初步的试验性治疗,将会为胰腺癌的治疗提供扎实的理论依据和实验基础。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足,提供一种与胰腺癌相关的tRF及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种与胰腺癌相关的tRF。
本发明的第二个目的是提供检测所述的tRF的试剂在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述的tRF的试剂在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种胰腺癌预后预测试剂盒。
本发明的第五个目的是提供所述的tRF和/或其激活剂在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种治疗胰腺癌的药物。
本发明的第七个目的是提供所述的tRF作为筛选治疗胰腺癌疾病的药物的靶点的应用。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案予以实现的:
本发明发现了一个具有高表达显著抑制胰腺癌细胞的恶性表型功能的tRNA来源的片段RNA,即tRF-21-VBY。其具有抑制细胞增殖和迁移侵袭能力,并且促进细胞凋亡,抑制皮下移植瘤的生长和胰腺癌原位肿瘤生长;能够指示胰腺癌病人的预后的功能,tRF-21-VBY高表达的病人,生存期显著延长。tRF-21-VBY在癌组织中的表达显著低于癌旁组织,晚期胰腺癌病人的表达显著低于早期胰腺癌病人。在多种动物模型的试验性治疗均取得较为显著的效果。agotRF-21-VBY(tRF-21-VBY模拟物)显著抑制胰腺癌原位肿瘤的生长、癌细胞肺部定植能力和PDX的生长。
因此本发明要求保护以下内容:
一种与胰腺癌相关的tRF,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,
SEQ ID No.1:UAGAAUUCUCGCCUGCCACGC。
检测所述的tRF的试剂在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用。
所述的tRF的试剂在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用。
优选地,tRF-21-VBY的表达量与患者的生存期正相关。
本发明还要求保护一种胰腺癌预后预测试剂盒,包括检测所述的tRF试剂。
优选地,还包括所述的tRF作为阳性对照。
本发明还要求保护所述的tRF和/或其激活剂在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
优选地,所述的tRF抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞迁移、侵袭和/或促进癌细胞凋亡。
本发明还要求保护一种治疗胰腺癌药物,含有所述的tRF和/或其激活剂。
本发明还要求保护所述的tRF作为筛选治疗胰腺癌药物靶点的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明发现了一个具有高表达显著抑制胰腺癌细胞的恶性表型功能的tRNA来源的片段tRF-21-VBY,其具有抑制细胞增殖和迁移侵袭能力,并且促进细胞凋亡,抑制皮下移植瘤的生长和胰腺癌原位肿瘤生长,并且能够指示胰腺癌病人的预后的功能。因此tRF-21-VBY或其激活剂可用于制备治疗胰腺癌的药物,或用于筛选适合于治疗胰腺癌的药物;检测tRF-21-VBY的试剂可用于制备胰腺癌预后预测试剂盒。
附图说明
图1为Kaplan-Meier生存曲线,提示在广州、北京胰腺癌队列和集合队列中,tRF-21-VBY高表达的胰腺癌病人的生存期显著延长。
图2为广州、北京胰腺癌队列和集合队列227对癌与癌旁组织中tRF-21-VBY的表达。
图3为过表达或敲降tRF-21-VBY的表达对胰腺癌细胞恶性表型的影响。a:CCK8法检测扰动tRF-21-VBY对胰腺癌细胞增殖能力的影响;b:平板克隆实验检测扰动tRF-21-VBY对细胞增殖能力的影响;c:流式细胞术检测扰动tRF-21-VBY对胰腺癌细胞凋亡的影响,柱状图显示凋亡细胞数的相对百分比;d:Transwell法检测扰动tRF-21-VBY对胰腺癌细胞系迁移、侵袭能力的影响,柱形图显示迁移、侵袭细胞数的定量。
图4为扰动tRF-21-VBY的表达对胰腺癌细胞移植瘤生长的影响。a,b:扰动tRF-21-VBY时,皮下移植瘤的大体照和生长曲线;c:扰动tRF-21-VBY时胰腺癌细胞原位肿瘤的生长;d:柱状图是荧光值的定量统计。
图5为agotRF-21-VBY在三种动物模型上进行试验性治疗。a:胰腺癌细胞原位移植模型治疗方案模式图,对照(含tRF-21-VBY对照序列的生理盐水)和agotRF-21-VBY均通过尾静脉注射;b:agotRF-21-VBY显著抑制胰腺癌细胞原位肿瘤的生长;c:肺转移模型治疗方案模式图,对照(含tRF-21-VBY对照序列的生理盐水)和agotRF-21-VBY均通过尾静脉注射;d:agotRF-21-VBY显著抑制胰腺癌细胞肺部定植能力;e:3例PDX模型治疗方案模式图,对照(含tRF-21-VBY对照序列的生理盐水)和agotRF-21-VBY均通过瘤内注射;f:agotRF-21-VBY显著抑制胰腺癌PDX生长。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 tRF-21-VBY与胰腺癌病人临床数据的相关性
一、样本的采集
收集了广州、北京胰腺癌队列共227对癌与癌旁组织,提取总RNA,使用tRF特异的逆转录引物进行逆转录并采用茎环引物法PCR检测了tRF-21-VBY(其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示)的表达,U6作为内参。特异的引物如表1所示。
表1 tRF-21-VBY逆转录引物、PCR引物和U6的PCR引物:
二、tRF-21-VBY与胰腺癌病人的较好预后显著相关
1、实验方法
采用Kaplan-Meier方法分析了高表达和低表达tRF-21-VBY与广州队列158例胰腺癌病人的生存期的相关性。
2、实验结果
结果如图1所示,在广州胰腺癌队列人群中进行了检验,结果提示,只有tRF-21-VBY与胰腺癌病人的预后显著相关。另外验证了tRF-21-VBY与北京胰腺癌队列病人以及两个中心的集合队列病人预后的相关性,均发现高表达的tRF-21-VBY预示着更好的预后。
三、tRF-21-VBY表达量与胰腺癌进展相关
1、实验方法
采用qRT-PCR的方法,检测了广州队列、北京队列和集合队列共227例胰腺癌病人癌组织与配对的癌旁组织中tRF-21-VBY的表达量。并分析了不同分期病人组织之间的tRF-21-VBY表达量的差异。
2、实验结果
结果如图2所示,tRF-21-VBY的表达量,在癌组织中显著低于癌旁组织(图2a),并且,晚期胰腺癌病人显著低于早期胰腺癌病人(图2b)。
实施例2 tRF-21-VBY对胰腺癌细胞恶性表型的影响
一、体外实验
1、实验方法
将合成的tRF-21-VBY(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)或它的反义序列分别插入pLKD-CMV-mcherry-2A-Neo-U6-shRNA载体上,分别构建稳定过表达和敲降的胰腺癌细胞株,体外实验方法考察胰腺癌细胞恶性表型的变化。
采用CCK8试剂盒检测细胞的增殖能力,将胰腺癌细胞种植于96孔板,37℃连续培养,在特定间隔的时间向培养基中加入CCK8检测试剂,酶标仪记录细胞的吸光度值。流式细胞术检测凋亡肿瘤细胞的比例,将种植于细胞培养皿的胰腺癌细胞全部消化收集,先后加入Annexin-FITC和PI染料进行染色,流式细胞仪进行分析,将处于早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例之和记录为凋亡的百分比。transwell检测肿瘤细胞的迁移、侵袭能力,将胰腺癌细胞铺在transwell的上层小室(有或无Matrigel胶),37度培养,特定时间后收集小室,固定和染色小室下层生物膜上的细胞,并拍照计数。
2、实验结果
结果如图3所示,结果显示,与对照组相比,tRF-21-VBY过表达,胰腺癌细胞的增殖能力更弱(图3a和3b);凋亡细胞比例更大(图3c);迁移、侵袭的细胞数更少(图3d)。反之,tRF-21-VBY敲降,得到相反的结果。简而言之,tRF-21-VBY显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移侵袭能力,并促进细胞凋亡。
二、体外实验
1、实验方法
将稳定过表达或敲降tRF-21-VBY的肿瘤细胞扩大培养,以每只鼠2×106的细胞数接种在裸鼠的一侧后背皮下,构建皮下移植瘤模型,并定期测量肿瘤大小。Luciferase标记的稳定过表达或敲降tRF-21-VBY的胰腺癌细胞,以每只2×106的细胞数接种在小鼠胰腺原位,构建原位移植瘤模型,并通过定期采集生物荧光来检测原位肿瘤的生长情况。
2、实验结果
结果如图4所示,结果显示,与对照组相比,tRF-21-VBY过表达,皮下肿瘤的体积更小(图4a和4b);原位胰腺癌的负荷也更小(图4c和4d)。这表明,tRF-21-VBY显著抑制肿瘤的生长。
实施例3 tRF-21-VBY在胰腺癌动物模型的试验性治疗
一、实验方法
使用Luciferase标记的稳定敲降tRF-21-VBY的胰腺癌细胞,构建了胰腺癌原位移植模型、肺转移模型和PDX等3个动物模型。2×106个稳定敲降tRF-21-VBY的胰腺癌细胞通过外科手术的方式接种在小鼠胰腺组织,7天后将小鼠随机分为2组。1×106个稳定敲降tRF-21-VBY的胰腺癌细胞通过尾静脉注射到小鼠体内,使其在肺部定植,第2天将小鼠随机分为2组。将3个胰腺癌病人胰腺癌组织,种植在免疫缺陷小鼠皮下进行传代,当传代至第3代(F3)时,当肿瘤生长到200mm3时,随机分为2组。
在以上动物模型,我们分别给两组小鼠注射含tRF-21-VBY对照序列的生理盐水(对照组)和agotRF-21-VBY(经胆固醇特殊化学修饰的tRF-21-VBY,合成定制)(治疗组)。治疗结束后,我们采用生物发光成像检测了胰腺癌细胞的原位肿瘤生长情况和肺部定植能力,并通过剥取并测量肿瘤大小来确定PDX的生长。
二、实验结果
结果如图5所示,结果显示,与对照组相比,agotRF-21-VBY治疗组,原位胰腺癌的肿瘤负荷更小(图5a和5b);肺部定植能力更差(图5c和5d);PDX生长更慢(图5e和5f)。总之,tRF-21-VBY能显著抑制胰腺癌的生长和转移能力,结果如图5所示。
序列表
<110> 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所)
<120> 一种与胰腺癌相关的tRF及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
uagaauucuc gccugccacg c 21
Claims (3)
1.检测核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的tRF表达量的试剂在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述tRF表达量与患者的生存期正相关。
3.ago修饰的tRF在制备治疗胰腺癌药物中的应用,其特征在于,所述tRF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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GR01 | Patent grant | ||
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