CN105247371A - 通过转录因子tsc22d4的抑制剂治疗胰岛素抵抗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及TSC22D4的活性或表达的调节剂，特别是其抑制剂，以及它们在哺乳动物中，用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病，和/或用于提高胰岛素敏感性的用途。本发明还涉及鉴定这些调节剂的筛选方法、所鉴定的调节剂在这些疾病的诊断中的用途，以及包含用于实施本发明的方法的材料的试剂盒。

Description

通过转录因子TSC22D4的抑制剂治疗胰岛素抵抗
本发明涉及TSC22D4的活性或表达的调节剂，特别是其抑制剂，以及它们在哺乳动物中用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病，和/或用于提高胰岛素敏感性的用途。本发明还涉及鉴定这些调节剂的筛选方法、所鉴定的调节剂在这些疾病的诊断中的用途，以及包含用于实施本发明的方法的材料的试剂盒。
发明背景
在人类中，脂质的过度贮积与其移除的减少的组合导致超重和相关的合并症(co-morbidities)，包括胰岛素抵抗、心血管并发症以及血脂异常(LanginD.Inandout:adiposetissuelipidturnoverinobesityandhyslipidemia.CellMetab.2011Nov2；14(5):569-70)，其现在世界范围内影响了超过15亿人(FinucaneMM,etal.National,regional,andglobaltrendsinbody-massindexsince1980:systematicanalysisofhealthexaminationsurveysandepidemiologicalstudieswith960country-yearsand91millionparticipants.Lancet.2011Feb12；377(9765):557-67)。确实，胰岛素抵抗代表了所谓的代谢综合征的核心部分，其最终导致代谢功能紊乱的发生，如葡萄糖耐受不良、胰岛β细胞衰竭以及最终的2型糖尿病。
胰岛素分泌(β细胞)受损、肝脏葡萄糖产生(肝脏)增加以及周围(肌肉)葡萄糖利用减少，构成了导致2型糖尿病的发生和发展的常规主要缺陷。现在已知，最终导致胰岛素分泌减少的β细胞衰竭在2型糖尿病的自然史中比最初据信的要更早发生。此外，对2型糖尿病的病理生理学的更好理解，揭示了现在被称为发病八重奏(ominousoctet)的经典三联症(triad)之外的其它病原学机制。除β细胞、肝脏和肌肉之外，其它致病机制包括脂肪细胞胰岛素抵抗(脂解增加)、肠降血糖素分泌/敏感性降低(胃肠的)、胰高血糖素分泌增加(α细胞)、葡萄糖重吸收增强(肾脏)以及神经递质功能障碍导致的中枢神经系统胰岛素抵抗(脑部)。当前，2型糖尿病的管理着重于通过降低血糖(禁食和餐后)以及血红蛋白A(1c)来进行葡萄糖控制。然而，治疗的目的应当是延缓疾病的进程，以及最终的治疗失败。治疗应当靶向疾病已知的致病性障碍(disturbances)(即降低β细胞功能的退化和增强胰岛素敏感性)。近年来，治疗策略着重于发展影响多种导致2型糖尿病的缺陷的新型治疗方式，以及发展通过钝化疾病进程来提供持久的葡萄糖控制的新型治疗方式。2型糖尿病的优化管理应当包括利用具有不同作用机制的多种药物的组合在早期开始治疗(DeFronzoRA.(Currentissuesinthetreatmentoftype2diabetes.Overviewofneweragents:wheretreatmentisgoing.AmJMed.2010Mar；123(3Suppl):S38-48)。
特别是主要的代谢器官(包括肝脏、骨骼肌和脂肪组织)针对胰岛素作用的敏感性，极大地促进了疾病进程以及药物介入的最终需求，以预防糖尿病晚期并发症。因此，有效和安全的胰岛素敏化仍是抗糖尿病疗法的有吸引力的靶标和目的。
转录辅助因子复合物已经被确定为不同组织包括肝脏和白色脂肪组织(WAT)中的代谢程序协调中的重要检验点(参见综述：SommerfeldA,Krones-HerzigA,HerzigS.Transcriptionalco-factorsandhepaticenergymetabolism.MolCellEndocrinol.2011Jan30；332(1-2):21-31)。
KesterHA,etal.(in:Transforminggrowthfactor-beta-stimulatedclone-22isamemberofafamilyofleucinezipperproteinsthatcanhomo-andheterodimerizeandhastranscriptionalrepressoractivity.JBiolChem.1999Sep24；274(39):27439-47)描述了，TGF-β-刺激的克隆-22(TSC-22)编码在进化中高度保守的包含亮氨酸拉链的蛋白。
此外，Jonesetal.(inJones,A.,etal.,Transforminggrowthfactor-beta1StimulatedClone-22D4isamolecularoutputofhepaticwastingmetabolism.EMBOMolMed.2013Feb；5(2):294-308)描述了，作为恶病质的分子输出通路，转录因子转化生长因子β1刺激的克隆(TSC)22D4的肝脏水平在癌症恶病质中是增加的。在健康肝脏中模拟TSC22D4的高恶病质水平导致肝脏VLDL释放和脂肪生成基因的抑制，以及在正常和高脂肪的饮食情况下全身VLDL水平的降低。因此，肝脏的TSC22D4活性可能表示患有代谢消耗性疾病(包括癌症恶病质)的对象周围能量不足的分子机理。
Kulozik,Ph.,etal.(Hepaticdeficiencyintranscriptionalco-factorTBLIpromotesliversteatosisandhypertriglycerdemia.2011CellMetab.13:389-400)描述了，转录辅助因子转导素β样(TBL)-1在肝脏中的受损表达代表了单基因和多基因脂肪肝小鼠模型的共同特征。在正常和高脂肪的饮食状况下，健康小鼠中TBL1基因表达的肝脏特异性消融促进了高甘油三酯血症和肝脏脂质沉积。由于发现TBL1表达水平也与人类患者中肝脏脂肪含量负相关，因而肝脏TBL1/TBLR1辅助因子活性的不足可能代表了患有肥胖和代谢综合征的对象中的肝脏脂质沉积的分子机理。
BerrielDiaz,M.,etal.(Nuclearreceptorco-factorRIP140controlslipidmetabolismduringwastinginmice.2008.Hepatology48:782-791)描述了，通过阻止肝脏TG贮存的调动，肝脏中RIP140的诱导提供了饥饿、败血症或癌症恶病质中的肝脏脂质沉积的分子机理。因此，肝脏中RIP140转录活性的抑制可能在这些病况的治疗中提供有吸引力的辅助方案。
Fareseetal.(in:Theproblemofestablishingrelationshipsbetweenhepaticstreatosisandhepaticinsulinresistance.CellMetab.2012May2；15(5):570-3)描述了，肝脏中脂肪的过度沉积(肝脏脂质沉积)经常伴随肝脏胰岛素抵抗。
抗糖尿病和/或胰岛素敏化药物的主要种类包括：磺酰尿素酶、二甲双胍、噻唑烷二酮、α-葡糖苷酶抑制剂、肠降血糖素模拟物以及二肽基肽酶-4抑制剂，其全部与严重的局限性相关(参见综述：Moller,Metabolicdiseasedrugdiscovery-"hittingthetarget"iseasiersaidthandone.CellMetab.2012Jan4；15(1):19-24)。
尽管胰岛素抵抗在2型糖尿病的发病机制中发挥关键作用，仍然缺乏有效和安全的胰岛素增敏剂。确实，当前噻唑烷二酮家族的药物显示出中等功效特征并且伴随很大的副反应，包括体重增加、心脏衰竭风险增加、膀胱癌风险可能增加以及心肌梗塞风险增加，例如导致罗格列酮近期退出市场。
因此，本发明的目的是提供新型靶标和策略，以预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病，和/或增强胰岛素敏感性。
根据本发明的第一方面，通过鉴定用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或I型或2型糖尿病，和/或用于增强胰岛素敏感性(例如哺乳动物肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性)的调节剂的方法，上述目的得以实现，所述方法包括下述步骤：a)提供包含TSC22D4的编码核酸序列或TSC22D4的基因表达产物的生物样品，b)将所述样品与所述TSC22D4的编码核酸序列或TSC22D4的基因表达产物的至少一种推定的调节剂接触，和c)检测所述至少一种推定的调节剂与所述TSC22D4的编码核酸序列或TSC22D4的基因表达产物的结合，以及d)鉴定所述TSC22D4的编码核酸序列或TSC22D4的基因表达产物的所述调节剂。
本发明的发明人已经表明，转录调节因子转化生长因子β1刺激的克隆22D4(TSC22D4)控制肝脏和全身的胰岛素敏感性。因此，TSC22D4代表了明确的分子和器官特异性靶标，其调节胰岛素信号级联反应的一些关键节点，从而增强肝脏和全身的胰岛素敏感性并使糖尿病高血糖症正常化。转录TSC22D4复合物作为基于干扰的策略的新型分子靶标发挥作用，可以操作该策略以增强胰岛素敏感性并在糖尿病病况中恢复葡萄糖稳态。此外，在本发明背景下实施的实验中，肝脏特异性TSC22D4丧失显著增强了葡萄糖耐受和胰岛素敏感性，并抵消了高胰岛素血症。TSC22D4复合物被确定为是肝脏和全身胰岛素敏化中的新型分子检验点，并且已经开发了敲低策略(由shRNA、siRNA以及miRNA技术介导的)。在肝脏中用肝脏特异性靶标方法进行TSC22D4操作(例如，基于siRNA的敲低策略)应该能避免其它组织中的副作用。
更详细地，健康动物中与高通量TSC22D4靶标转录组研究相组合的TSC22D4(NM_030935)顺反组的ChlP-序列分析显示，胰岛素信号通路中的主要节点被TSC22D4直接或间接靶向，最主要的是脂质运载蛋白13、Grb14以及SOCS2/3。如为响应急性胰岛素暴露而分别通过将Akt/PKB激酶在Ser473磷酸化和将GSK3β在Ser9磷酸化所确定的，在原代小鼠肝细胞以及野生型小鼠中TSC22D4的下调或过表达分别导致了细胞内胰岛素信号通路的上调或下调。
在糖尿病db/db小鼠中TSC22D4的肝脏失活，增强了这些动物的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗，并将血糖正常化至基本健康的水平。与糖尿病动物中代谢状态的整体改善一致，在肝脏特异性TSC22D4缺乏的小鼠中促炎性细胞因子和抵抗素的循环水平显著更低。值得注意的是，肝癌细胞中TSC22D4的失活并未增加细胞生长而是降低了增殖，暗示了TSC22D4的胰岛素敏化功能未导致受影响的细胞/器官中癌症易感性的增加。
优选地，本发明的方法还包括在所述调节剂存在和不存在的情况下评估TSC22D4活性和/或表达的步骤，其中在所述调节剂存在的情况下测量的TSC22D4的活性或表达与在所述调节剂不存在的情况下测量的TSC22D4的活性或表达相比的降低，表明所述调节剂可用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病，和/或用于增强胰岛素敏感性，例如哺乳动物中肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性。更优选地，所述TSC22D4活性或表达为肝脏的活性或表达，即在肝脏细胞或组织中的活性和/或表达。
更优选地，根据本发明的方法，其中所述TSC22D4的活性或表达为肝脏的活性或表达。因此，在肝脏细胞或组织中测试所述活性和/或表达。
在一个实施方案中，在体外或体内，将根据本发明的方法的生物样品与候选化合物接触。
在根据本发明的方法的另一方面，所述方法包括下述步骤：分析所述调节剂在预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病，和/或在增强胰岛素敏感性(例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性)中的效果。优选地，本发明的方法还包括下述步骤：分析来自所述哺乳动物的生物样品中的血液葡萄糖、促炎性细胞因子和/或抵抗素的循环水平。此类测试可包括分析取自待测对象的生物样品中的标志物，例如胰岛素浓度、c-肽浓度、白介素-6浓度、瘦素浓度、抵抗素浓度、TNFα浓度、胰高血糖素浓度和/或PYY浓度，优选在所述调节剂存在或不存在的情况下分析。各自的分析对技术人员而言是已知的。
优选地，根据本发明的方法，其中所述调节剂为选自下述化合物的候选化合物：肽库分子、适配子、组合库分子、细胞提取物来源的分子、小分子药物、细菌代谢物、噬菌体展示分子、抗体或其片段、蛋白、蛋白片段、多核苷酸、寡核苷酸(特别是miRNA、siRNA或shRNA)，以及它们的组合，其优选靶向和调节TSC22D4的表达，因此还可改变基因产物的相应的活性。为清楚起见，“靶向”包括直接或间接与基因产物或此种产物的功能位点结合(例如，抗体结合和中和TSC22D4，从而调节它的活性)。
在一个方面，生物活性剂利用“RNA干扰(RNAi)”。RNAi是由双链RNA(dsRNA)或siRNA引发的序列特异性、转录后基因沉默的过程。RNAi在多种有机体中都存在，如果蝇、线虫、真菌和植物，并且被认为参与抗病毒防御、转座子活性的调节以及基因表达的调节。在RNAi过程中，dsRNA或siRNA引起靶标mRNA的降解，伴随着随之发生的基因表达的序列特异性抑制。如本文所使用的，“小干扰RNA”(siRNA)是靶向TSC22D4基因的核苷酸RNA双链体。“RNA双链体”指由RNA分子两个区域之间的互补配对所形成的结构。由于siRNA双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补，因而siRNA“靶向”基因。在一些实施方案中，siRNAs双链体的长度少于30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为19-25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可以是发卡结构的一部分。除双链体部分之外，发卡结构可包含位于形成所述双链体的两条序列之间的环部分。环的长度可以不同。在一些实施方案中，环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发卡结构还可包含3'和/或5'突出部分。在一些实施方案中，所述突出为长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3'和/或5'突出。siRNA可由核酸序列编码，并且所述核酸序列还可包含启动子。所述核酸序列还可包含多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号为合成的最小多聚腺苷酸化信号。
在如上文所述的方法的另一实施方案中，评估TSC22D4的活性包括酶活性分析、免疫分析或Western印迹，优选地，至少一种用于转录因子功能分析的方法，例如报告基因分析。在一个实施方案中，评估TSC22D4的表达包括Northern印迹、微阵列分析、RNA杂交、甲基化分析和/或RT-PCR。评估酶的活性或评估基因的表达包括技术人员已知的用于评估酶(在此为转录因子)活性的所有方法。
相应地，作为备选，可通过评估由TSC22D4调节的酶或酶的表达活性，间接地评估酶或TSC22D4的表达活性。因此，此类测试可包括对取自待测对象中的生物样品的标志物进行分析，例如，胰岛素浓度、c-肽浓度、白介素-6浓度、瘦素浓度、抵抗素浓度、TNFα浓度、胰高血糖素浓度和/或PYY浓度，优选地，在所述调节剂存在或不存在的情况下分析。各自的分析对技术人员而言是已知的。根据本发明的其它方法是微阵列分析，以及技术人员已知的适合于检测基因表达或酶活性的任何方法。
然后，本发明另一个方面涉及TSC22D4特异性调节剂，其是根据如本文所述的本发明方法鉴定的，其中所述调节剂选自：肽库分子、适配子、组合文库分子、细胞提取物来源的分子、小分子药物、细菌代谢物、噬菌体展示分子、抗体或其片段、蛋白、蛋白片段、多核苷酸、寡核苷酸(特别是miRNA、siRNA或shRNA)，以及它们的组合。优选地，所述调节剂选自TSC22D4表达和/或生物活性的抑制剂。
在一个实施方案中，TSC22D4的抑制剂选自：反义DNA-和/或RNA-寡核苷酸、反义2'-O-甲基寡核糖核苷酸、含有硫代磷酸连接的反义寡核苷酸、小干扰RNA、miRNA、包含锁核酸碱基的反义寡核苷酸、吗啉反义寡核苷酸、PPAR-γ激动剂、miRNA拮抗剂(antagomir)及其混合物，特别是TSC22D4的miRNA拮抗剂。
在本发明的另一个方面，所述调节剂可以是融合蛋白的一部分，是任选地包含与所述调节剂相连的至少一种抗糖尿病药剂，例如化学治疗剂、肽、小分子药物和/或放射性核苷酸的载体分子的一部分，和/或为任选地包含至少一种可检测部分的诊断剂的一部分。这在本发明的诊断背景下，和/或对于与其它抗糖尿病药剂共同治疗更有效，优选具有协同作用方面具有特别的优势。
还通过用于产生药物组合物的方法实现了本发明的目的，所述方法包括下述步骤：a)任选地，实施如上文所述的根据本发明的方法，和b)用至少一种药学可接受的赋形剂配制所鉴定的所述至少一种调节剂或根据本发明的调节剂。所述药物组合物的载体和/或赋形剂必须是与药剂的其它成分可相容意义上的“可接受的”，并且对其接受者是无害的。
还通过根据本发明生产的药物组合物实现了本发明的目的。在另一实施方案中，本发明的药物组合物是用于施用的和/或将其经口服施用、直肠施用、经粘膜施用、经皮施用、肠道内施用、肠道外施用、肌肉内施用、鞘内施用、直接心室内施用、静脉内施用、腹腔内施用、鼻内施用、眼内施用或皮下施用。
还通过用于疾病的诊断和/或用于疾病的预防、调节和/或治疗的本发明的调节剂或本发明的药物组合物实现了本发明的目的。优选地，根据本发明使用的调节剂或药物组合物，其中所述疾病选自：胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病。更优选地，根据本发明使用的调节剂或药物组合物选自：肽库分子、适配子、组合文库分子、细胞提取物来源的分子、小分子药物、细菌代谢物、噬菌体展示分子、抗体或其片段、蛋白、蛋白片段、多核苷酸、寡核苷酸(特别是miRNA、siRNA或shRNA)，以及它们的组合。在一个实施方案中，TSC22D4的抑制剂选自：反义DNA-和/或RNA-寡核苷酸、反义2'-O-甲基寡核糖核苷酸、包含硫代磷酸连接的反义寡核苷酸、小干扰RNA、miRNA、包含锁核酸碱基的反义寡核苷酸、吗啉反义寡核苷酸、PPAR-γ激动剂、miRNA拮抗剂及其混合物，特别是TSC22D4的miRNA拮抗剂。
还通过用于检测和任选地诊断疾病的存在或风险的方法，所述疾病选自：胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病，和/或用于增强胰岛素敏感性(例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性)的方法，实现了本发明的目的，所述方法包括下述步骤：测量从疑似患有此类疾病的对象获得的生物样品中TSC22D4的表达和/或生物活性；其中所述样本中测量的TSC22D4的活性或表达与来自健康对象的样品中测量的TSC22D4的活性或表达相比的降低表明疾病的存在或风险，所述疾病选自：胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病，和/或增强胰岛素敏感性，例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性。优选地，所述检测包括检测根据本发明的调节剂的结合。优选地，根据本发明的方法，其中所述样品为生物样品，优选地选自：血液、血浆、尿液、细胞以及组织样品，例如包括肝脏、乳房、前列腺、骨、软骨、肺或脑组织的活组织检查。“生物样品”是任何生物来源的样本。生物来源可以是任何天然存在的或基因修饰的有机体。生物样品可以来源于但不限于：组织、细胞培养物、粗提物、体液，以及来源于基因表达产物、核苷酸、蛋白或肽的溶液，或者来源于作为固体物质的核苷酸、蛋白或肽。
还通过在有需要的对象中治疗和/或预防选自胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病的疾病的方法，实现了本发明的目的，所述方法包括下述步骤：向所述需要的患者施用有效量的本发明的调节剂或本发明的药物组合物。优选地，所述调节剂选自：肽库分子、适配子、组合文库分子、细胞提取物来源的分子、小分子药物、细菌代谢物、噬菌体展示分子、抗体或其片段、蛋白、蛋白片段、多核苷酸、寡核苷酸(特别是miRNA、siRNA或shRNA)，以及它们的组合。在一个实施方案中，TSC22D4的抑制剂选自：反义DNA-和/或RNA-寡核苷酸、反义2'-O-甲基寡核糖核苷酸、包含硫代磷酸连接的反义寡核苷酸、小干扰RNA、siRNA、miRNA、包含锁核酸碱基的反义寡核苷酸、吗啉反义寡核苷酸、PPAR-γ激动剂、miRNA拮抗剂及其混合物，特别是TSC22D4的miRNA拮抗剂。
还通过诊断性或治疗性试剂盒实现了本发明的目的，所述试剂盒包括用于实施本发明的方法的材料，如用于诊断的酶或缓冲液，任选地还包括所述试剂盒的使用说明书。用于检测TSC22D4多肽的试剂盒，优选地包含特异性结合TSC22D4多肽的抗体和/或miRNA。用于检测TSC22D4mRNA的试剂盒，优选地包含与TSC22D4mRNA特异性杂交的一种或多种核酸(例如，一种或多种寡核苷酸引物或探针、DNA探针、RNA探针或用于产生RNA探针的模板)。基本上同样适用于治疗性试剂盒，优选地，其包含TSC22D4多肽和/或mRNA的药学可接受的调节剂。
TSC22D4功能和/或表达的“调节剂”是调节或改变TSC22D4的功能和/或表达的物质。此类调节剂可直接或间接影响TSC22D4的功能和/或表达。TSC22D4的功能和/或表达可通过，例如但不限于，与TSC22D4蛋白的结构域结合，或者增强或抑制TSC22D4的基因表达来改变或调节。本发明的调节剂，还可通过调节或改变基因的功能和/或表达来间接调节或改变TSC22D4的功能和/或表达，所述基因调节TSC22D4或受TSC22D4调节。
根据本发明的“基因表达产物”包括但不限于：纯化的、重组的、天然的、人工的或合成的核苷酸序列(如DNA、cDNA、RNA或mRNA)或蛋白或肽。根据本发明的“基因表达产物”包括但不限于：纯化的、重组的、天然的、人工的或合成的基因表达产物，或者它们的修饰物。根据本发明的核酸序列是本领域已知的编码TSC22D4的任何核酸序列或其互补序列，或在严格条件下与之杂交的核苷酸序列，以及它们的修饰物。
“抑制剂”是可降低催化反应中催化剂(非生物催化剂或酶)的效力的物质。本文所提及的抑制剂可降低酶活性的效力；而且本文所提及的抑制剂还可降低酶表达的效力。抑制剂可以是但不限于：重组的、天然的、人工的或合成的核苷酸序列(如DNA、cDNA、RNA、miRNA或mRNA)；或蛋白(例如抗体)或肽或者它们的修饰物。抑制剂可以是但不限于：任何核酸序列或互补序列，或在严格条件下与本领域已知的编码TSC22D4的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，以及它们的修饰物。
根据本发明的“细胞”可以是原核细胞或真核细胞。根据本发明的“细胞”优选选自但不限于肝脏细胞。哺乳动物细胞可优选选自：人、兔子、小鼠或大鼠。优选地，所述细胞为人细胞。术语“细胞”还包括动物模型的细胞。此外，细胞可以是组织培养物的一部分。
在本发明的背景下的术语“预防”应被理解为药物干预，所述药物干预旨在避免很可能导致患有疾病的患者的病况恶化，或导致健康对象和/或患病对象的损伤或死亡的消极事件的发生。
“有需要的对象”可以是但不限于遭受疼痛，特别是神经性疼痛的任何动物或人。优选地，所述有需要的对象为人。
TSC22D4的肝细胞特异性失活增强了肝脏和骨骼肌中的胰岛素信号通路，而肝脏TSC22D4的过表达减弱了胰岛素组织应答。因此，肝脏的TSC22D4抑制分别在不同的糖尿病小鼠模型中预防和逆转了高血糖症、葡萄糖耐受不良以及胰岛素抵抗。如体内染色质募集和遗传挽救(geneticrescue)实验所证明的，TSC22D4被发现部分通过小的分泌蛋白脂质运载蛋白(LCN)13的转录调节来发挥其对全身葡萄糖稳态的影响。由于发现在人糖尿病患者中肝脏TSC22D4水平提高，其与胰岛素敏感性的降低和高血糖症有关，本发明确立了将TSC22D4的抑制作为1型或2型糖尿病治疗中，以及在胰岛素抵抗、代谢综合征和/或增强胰岛素敏感性(例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性)的治疗中的有吸引力的胰岛素敏化选择。
下述的图、序列以及实施例仅用于阐明本发明，并且不应被理解为将本发明的范围限制于实施例中描述的本发明的具体实施方案。为了本发明的目的，将文本中引用的所有参考文献在此全部并入本文。
图1显示在原代小鼠肝细胞中敲低TSC22D4增强了胰岛素信号转导。利用完全-Akt抗体以及磷酸化-Akt(Ser473)抗体(Cellsignaling)，将用对照或TSC22D4shRNA腺病毒处理的原代(1°)小鼠肝细胞进行Western印迹。将原代小鼠肝细胞与PBS或胰岛素孵育10分钟。shRNA介导的TSC22D4敲低导致Akt-磷酸化增加。
图2显示在野生型小鼠中，肝脏的TSC22D4敲低增强了胰岛素信号转导。利用完全-Akt抗体以及磷酸化-Akt(Ser473)抗体(Cellsignaling)，将来自注射对照或TSC22D4shRNA腺病毒7天后的雌性C57Bl/6小鼠的肝脏提取物进行Western印迹。在采集器官之前20分钟，向小鼠腹腔内注射PBS或胰岛素。在注射之前将小鼠禁食4小时。shRNA-介导的TSC22D4敲低导致胰岛素刺激之后的Akt-磷酸化的增加。
图3显示在野生型小鼠中，肝脏TSC22D4的丧失控制了胰岛素信号通路的不同部分。在如图4所示的禁食状态或重喂食状态下，注射对照或TSC22D4shRNA腺病毒的野生型雌性C57Bl/6小鼠的肝脏中，进行下述项目的定量PCR分析：A)转录因子转化生长因子β1刺激的克隆22D4(TSC22D4)，B)脂质运载蛋白13(Lcn13)，C)生长因子受体结合蛋白14(Grb14)，D)细胞因子信号转导抑制蛋白3(SOCS3)，E)腺苷酸环化酶1(ADCY1)(平均数±SEM,n＝7)。统计检验A-E：学生t-检验。
图4显示在野生型小鼠中，TSC22D4的肝细胞特异性失活增强了葡萄糖耐受、胰岛素敏感性，并降低了胰岛素水平。向低脂饮食饲养的C57Bl6小鼠长期注射对照或TSC22D4miRNA腺相关病毒，以及肝细胞特异性敲低TSC22D4。A)注射病毒八周后，在通过每kg体重腹腔内注射1g葡萄糖来进行葡萄糖耐受测试之前，将小鼠禁食四小时。B)注射病毒9周后，在通过每kg体重腹腔内注射1U胰岛素来进行胰岛素耐受测试之前，将小鼠禁食四小时。腹腔内胰岛素注射之后，TSC22D4的敲低导致与对照动物相比血糖水平显著降低(p<.001RM双向方差分析；Holm–Sidak事后分析)，显示胰岛素敏感性增强。统计检验A–B、D:RM双向方差分析；Holm–Sidak事后分析。统计检验C:学生t-检验。
图5显示在低脂饮食条件和高脂饮食条件下，长期敲低TSC22D4，胰岛素敏感性都增强。与图6相同的动物以及相应的高脂饮食饲养组中的胰岛素抵抗指数(HOMA)。(平均数±SEM,n＝7)。
图6显示肝脏的TSC22D4的敲低增强了胰岛素敏感性，并使遗传性糖尿病小鼠正常化。向11周龄的db/db小鼠(肥胖的基因小鼠模型)注射对照或TSC22D4shRNA腺病毒。A)注射病毒后7天，在通过每kg体重腹腔内注射2U胰岛素来进行胰岛素耐受测试之前，将小鼠禁食四小时。腹腔内胰岛素注射之后，TSC22D4的敲低导致与对照动物相比血糖水平显著降低(p＝0.004RM双向方差分析；Holm–Sidak事后分析)，显示胰岛素敏感性增强。B)注射病毒后13天，在通过每kg体重腹腔内注射1g葡萄糖来进行葡萄糖耐受测试之前，将小鼠禁食四小时。TSC22D4的敲低导致与对照动物相比，对腹腔内葡萄糖注射的代谢应答增强(p<0.001；RM双向方差分析；Holm–Sidak事后分析)，显示胰岛素敏感性增强。C)在禁食状态(持续18小时)、重喂食状态(禁食18小时后6小时重喂食)或随机状态下处死小鼠。在禁食状态、重喂食状态或随机喂食状态下的血糖水平(mg/dl)(平均数±SEM,n＝4)。D)db/db小鼠每日的水摄取(克)(平均数±SEM,n＝12)。统计检验A–B:RM双向方差分析；Holm–Sidak事后分析。统计检验C–D:学生t-检验。
图7显示TSC22D4敲低时，db/db小鼠的身体成分标志物。向11周龄db/db小鼠(与图8中相同的动物)注射对照或TSC22D4shRNA腺病毒。在禁食(持续18小时)、重喂食(禁食18小时后6小时重喂食)或随机喂食状态下处死小鼠。A)以克计的体重(平均数±SEM,n＝4)。B)以克计的肝脏重量(平均数±SEM,n＝4)。C)血清丙氨酸-氨基转移酶水平(ALT；平均数±SEM,n＝4)。D)肝脏糖原水平(每g肝脏组织mg糖原；平均数±SEM,n＝4)。E)肝脏甘油三酯水平(每g肝脏组织mg甘油三酯；平均数±SEM,n＝4)。E)肝脏糖原水平(每g肝脏组织mg糖原；平均数±SEM,n＝4)。E)血清甘油三酯水平(每ml血清mg甘油三酯；平均数±SEM,n＝4)。统计检验A–E:学生t-检验。
图8显示在糖尿病db/db小鼠中，肝脏TSC22D4的缺乏增强了炎症标志物的表达。向11周龄的db/db小鼠(与图8中相同的动物)注射对照或TSC22D4shRNA腺病毒。在禁食(持续18小时)、重喂食(禁食18小时后6小时重喂食)或随机喂食状态下处死小鼠。A)以pg/ml计的血清胰岛素水平(平均数±SEM,n＝4)。B)以pg/ml计的血清C-肽水平(平均数±SEM,n＝4)。C)以pg/ml计的血清白介素-6水平(平均数±SEM,n＝4)。D)以pg/ml计的血清瘦素水平(平均数±SEM,n＝4)。E)以pg/ml计的血清抵抗素水平(平均数±SEM,n＝4)。F)以pg/ml计的血清TNFα水平(平均数±SEM,n＝4)。统计检验A–H:学生t-检验。
图9显示在糖尿病动物中，肝脏TSC22D4的敲低使胰岛素敏化基因上调。在随机状态、禁食状态(18h)以及重喂食状态(禁食18h然后在接下来的6h重喂食)下，在注射对照或TSC22D4shRNA腺病毒的db/db糖尿病小鼠(与图8中同样的动物)肝脏中进行下述项目的定量PCR分析：A)转录因子转化生长因子β1刺激的克隆22D4(TSC22D4)，B)脂质运载蛋白13(Lcn13)，C)生长因子受体结合蛋白14(Grb14)，D)细胞因子转导通路抑制蛋白3(SOCS3)，E)腺苷酸环化酶1(ADCY1)，(平均数±SEM,n＝7)。统计检验A–D:学生t-检验。
图10显示在糖尿病小鼠的肝脏中，TSC22D4的丧失增强了胰岛素信号转导。来自注射了对照或TSC22D4shRNA腺病毒的11周龄db/db小鼠(与图8中相同的动物)的肝脏提取物的Western印迹。注射后7天，用完全-Akt抗体以及磷酸化-Akt(Ser473)抗体(Cellsignaling)对肝脏裂解物进行印迹。在禁食(持续18小时)或重喂食(禁食18小时后6小时重喂食)状态下处死小鼠。在禁食条件以及重喂食条件下，shRNA介导的TSC22D4敲低都导致Akt-磷酸化增加。
图11显示在糖尿病倾向小鼠中，TSC22D4的肝细胞特异性失活预防了高血糖症。在明显的高血糖症发作之前，在5周龄(图表中表示为0周)向db/db小鼠注射表达AAV的TSC22D4miRNA。在注射病毒时，以及在注射病毒后2周和4周，测量葡萄糖(mg/dl)。在进行葡萄糖测量之前，将小鼠禁食4小时。(平均数±SEM,n＝7)。
图12显示TSC22D4通过LCN13内分泌系统发挥作用，并且与人的胰岛素敏感性相关。(a)通过针对野生型小鼠肝脏中TSC22D4的抗体进行LCN13启动子区(1-3)的染色质免疫共沉淀。通过qPCR检测相对于阴性对照IgG的倍数富集。区域4代表阴性PCR对照(n＝2-3)。通过使用不同的TSC22D4抗体得到了类似的结果。(b)注射了对照或TSC22D4shRNA腺病毒的野生型C57Bl/6小鼠(左)、db/db小鼠(中)以及NZO小鼠(右)肝脏中的LCN13的定量PCR分析(平均数±SEM,每次实验的n≥6)。(c)用LCN13抗体对来自注射对照(NCshRNA)或TSC22D4(D4shRNA)shRNA腺病毒七天后的C57Bl/6小鼠的血清进行免疫共沉淀，并且用LCN13抗体进行免疫印迹。将白蛋白抗体用作上样对照。(d)利用完全-Akt抗体、磷酸化-Akt(Ser473)抗体以及VCP抗体对来自用对照(PBS)或LCN13(200nM)处理的C2C12肌细胞提取物进行代表性的Western印迹。分别显示了LCN13(3h)和胰岛素处理15分钟(30nM)。显示密度计分析。**表示胰岛素的效果，##表示LCN13的效果。(e)注射对照(对照shRNA)、LCN13(LCN13shRNA)、TSC22D4(TSC22D4shRNA)、TSC22D4加LCN13(TSC22D4+LCN13shRNA)shRNA腺病毒一周后，db/db小鼠的葡萄糖耐受测试。以每kg体重1g葡萄糖的浓度经腹腔内注射葡萄糖。*表示NC组与TSC22D4组之间的显著性；#表示TSC22D4组与TSC22D4+LCN13组之间的显著性；$表示NC组与TSC22D4+LCN13组之间的显著性。(f)与(e)中相同的动物的HOMAIR指数。(g)与(e)中相同的动物的血清葡萄糖水平。(h)患2型糖尿病(T2D,n＝26)或具有正常葡萄糖耐受(NGT,n＝40)的患者肝脏中TSC22D4mRNA表达的定量PCR分析。(i)与(h)中相同的患者的肝脏中TSC22D4mRNA的表达与空腹血糖之间的关联。(j)与(h)中相同的患者在高胰岛素-正常血糖钳夹研究(hyperinsulemic-euglycemicclampstudy)中，人肝脏中TSC22D4mRNA的表达与葡萄糖输注率(GIR)之间的关联。a、c-f的统计分析：学生t-检验，g-i的统计分析：皮尔逊相关系数，*:p≤0.05；**:p≤0.01；***:p≤0.001。
图13显示，(a)患2型糖尿病(n＝26)或具有正常葡萄糖耐受(n＝40)的患者的人肝脏中LCN13(Obp2a)的表达与TSC22D4mRNA水平的关联。(b)患2型糖尿病(T2D,n＝26)或具有正常葡萄糖耐受(NGT,n＝40)的患者肝脏中LCN13(Obp2a)mRNA表达的定量PCR分析。(c)与(a)中相同的患者在高胰岛素-正常血糖钳夹研究中，人肝脏中LCN13(Obp2a)mRNA的表达与葡萄糖输注率(GIR)的关联。(d)与(a)中相同的患者的肝脏中LCN13(Obp2a)mRNA的表达与空腹血糖的关联。a、c、d的统计分析：皮尔逊相关系数，b的统计分析：学生t-检验，*:p≤0.05；**:p≤0.01；***:p≤0.001。
序列ID号1至4显示用于本发明的实验中的寡核苷酸。
实施例
重组病毒
利用BLOCK-iT腺病毒RNAi表达系统(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)克隆了受U6启动子控制的表达TSC22D4或非特异性shRNA的腺病毒，或受CMV启动子控制的表达TSC22D4cDNA的腺病毒。如之前所述的，通过氯化铯方法纯化病毒，并且在向动物注射之前将纯化的病毒在含有10％甘油的磷酸盐缓冲液中透析(HerzigS,HedrickS,MorantteI,KooSH,GalimiF,MontminyM.CREBcontrolshepaticlipidmetabolismthroughnuclearhormonereceptorPPAR-gamma.Nature.2003；426:190–193.HerzigS,LongF,JhalaUS,HedrickS,QuinnR,BauerA,RudolphD,YoonC,PuigserverP,SpiegelmanB,etal.CREBregulateshepaticgluconeogenesisthroughthecoactivatorPGC-1.Nature.2001；413:179–183)。如之前所述，确立了受肝细胞特异性启动子控制的AAVs编码对照或TSC22D4特异性miRNAs(RoseAJ,FrosigC,KiensB,WojtaszewskiJF,RichterEA.EffectofenduranceexercisetrainingonCa2+calmodulin-dependentproteinkinaseIIexpressionandsignalinginskeletalofhumans.JPhysiol.2007；583:785–795)。
动物实验
从CharlesRiver实验室(Brussels,Belgium)获得雄性8–12周龄的C57Bl/6小鼠和10周龄的db/db小鼠，将其在12h昼夜循环和常规的不限饮食的条件下饲养。在胰岛素和葡萄糖耐受测试之前，将动物禁食4小时。或者，自由饲喂动物并使其可自由获得水。对于腺病毒注射，经由尾静脉注射施用1–2×109噬斑形成单位(pfu)/重组病毒。对于AAV实验，经由尾静脉注射5×1011病毒。在每次实验中，使6–12只动物接受相同的处理，并如所指明的，在禁食(禁食18小时)、随机喂食或喂食(禁食18小时之后6小时重喂食)条件下进行分析。在特定时间段之后收集器官，包括肝脏、附睾和腹部脂肪垫以及腓肠肌，将其称重、速冻并用于进一步的分析。通过EchoMRI身体成分分析仪(EchoMedicalSystems,Houston,USA)测定总的身体脂肪含量。依照NIH指南进行动物操作和实验，并得到了地方当局的批准。
对于胰岛素耐受测试，利用0.9％的氯化钠制备1U胰岛素/mL的储备溶液。在实验之前将小鼠禁食4小时。测定所有动物的体重，并通过用剃须刀片切断尾巴来测量血糖水平。将血滴置于血糖仪条上并进行测量。向C57Bl/6小鼠腹腔内注射1U胰岛素/kg体重，向db/db小鼠腹腔内注射1.5U胰岛素/kg体重。在20、40、60、80以及120分钟后监测血糖水平。
对于葡萄糖耐受测试，利用0.9％的氯化钠制备20％葡萄糖的储备溶液。在实验之前将小鼠禁食4小时。测定所有动物的体重，并通过用剃须刀片切断尾巴来测量血糖水平。将血滴置于血糖仪条上并进行测量。向C57Bl/6小鼠和db/db小鼠腹腔内注射5μL每克的20％葡萄糖溶液。在20、40、60、80以及120分钟后监测血糖水平。
人类对象
发明人研究了肝脏组织样品中TSC22D4mRNA表达，所述肝脏组织样品是从66个被广泛表征的经受过RouxenY旁路术、袖状胃切除术、选择性胆囊切除术或剖腹检查的开腹手术的高加索肥胖的和瘦的男性以及女性中获得的。通过口腔葡萄糖耐受测试，发明人确定了患有2型糖尿病(n＝26)或具有正常葡萄糖耐受(n＝40)的个体。如所述的，利用正常血糖-高胰岛素钳夹方法来评估胰岛素敏感性。在过夜禁食后8-10am之间收集所有的基线样品。所有的研究方案都经莱比锡大学伦理委员会批准(363-10-13122010和017-12-230112)。在参与本研究之前，所有参与者都给出了书面的知情同意。
血液代谢物
利用自动葡萄糖监测仪(OneTouch,Lifescan,Neckargemünd,Germany)或商品化的试剂盒(分别为Sigma,Munich,Germany；RANDOX,Crumlin,NorthernIreland；WAKO,Neuss,Germany)测定葡萄糖和甘油三酯(TG)的血清水平。利用小鼠胰岛素酶联免疫吸附分析(Mercodia,Uppsala,Sweden)测定胰岛素水平。
组织脂质提取
如前所述提取肝脏中的脂质(HerzigS,HedrickS,MorantteI,KooSH,GalimiF,MontminyM.CREBcontrolshepaticlipidmetabolismthroughnuclearhormonereceptorPPAR-gamma.Nature.2003；426:190–193)。
组织化学
将肝脏组织包埋进TissueTek最佳切割温度复合物(Sakura,Torrance,USA)中。如前所述，用苏木精和伊红或者油红O将5微米的冰冻切片染色(PeetDJ,TurleySD,MaW,JanowskiBA,LobaccaroJM,HammerRE,MangelsdorfDJ(1998)CholesterolandbileacidmetabolismareimpairedinmicelackingthenuclearoxysterolreceptorLXRalpha.Cell93:693-704)。
定量TaqmanRT-PCR
利用Qiazol试剂(Qiagen,Hilden,Germany)，从均化的小鼠肝脏或细胞裂解液中提取总RNA。利用M-MuLV酶以及寡聚dT引物(Fermentas,St.Leon-Rot,Germany)，通过逆转录制备cDNA。利用Assay-on-Demand试剂盒和ABIPRISM7700序列检测器(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)扩增cDNA。将RNA表达数据标准化为TATA盒结合蛋白(TBP)RNA的水平。
利用TaqMan分析，在荧光温度循环仪中(fluorescenttemperaturecycler)，通过定量实时RT-PCR测量人TSC22D4mRNA的表达，并且在ABIPRISM7000序列检测器上(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)检测荧光。利用TRIzol(Lifetechnologies,GrandIsland,NY)分离总RNA，并且用标准试剂(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)将1μgRNA逆转录。对于每次RT-PCR，根据制造商的说明书，利用来自Stratagene(LaJolla,CA)的BrilliantSYBRgreenQPCRCore试剂盒，在26μlPCR反应中扩增了2μl。在ABIPRISM7000序列检测器中孵育样品，在95℃起始变性持续10分钟，然后进行40个PCR循环，每个循环由以下构成：5℃持续15s，60℃持续1分钟，以及72℃持续1分钟。计算相对于次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)mRNA表达的人TSC22D4和Obp2a(LCN13)(分别通过Hs00229526_m1以及Hs01062934_g1检测)(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)mRNA的表达，所述次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)mRNA表达通过HPRT1的预混合的AssayonDemand(Hs01003267_m1)(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)检测。在每次PCR结束时，通过熔解曲线特征确认特定转录本的扩增(将样品冷却至68℃并缓慢加热至95℃，伴随着荧光测量)。通过将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进一步验证PCR的特异性。
蛋白分析
从冰冻的器官样品或细胞裂解缓冲液中的培养的肝细胞中提取蛋白(RoseAJ,FrosigC,KiensB,WojtaszewskiJF,RichterEA.EffectofenduranceexercisetrainingonCa2+calmodulin-dependentproteinkinaseIIexpressionandsignalinginskeletalofhumans.JPhysiol.2007；583:785–795)，将20μg蛋白上样于4–12％的SDS-聚丙烯酰氨凝胶，并印迹至硝酸纤维素膜上。如所述的，利用TSC22D4(Abcam,Cambridge,UKorSigma,Munich,Germany)、AKT、p-AKT、GSK、p-GSK(Cellsignaling,Danvers,USA)或VCP(Abcam)特异性抗体实施Western印迹分析(Herzigetal,2001)。
质粒以及RNA干扰
对于shRNA实验，将靶向小鼠TSC22D4的寡核苷酸(GCCTGGTTGGCATTGACAACACGAATG；SEQIDNo.1)退火，并克隆进pENTR/U6shRNA载体(Invitrogen)。在所有实验中，将与任何哺乳动物基因序列都不具有显著同源性的非特异性寡核苷酸(5′-GATCTGATCGACACTGTAATG-3′SEQIDNo.2)用作非沉默对照。对于miRNA实验，将靶向小鼠TSC22D4的寡核苷酸(5′-GACAGCGATGACGATAGTGGT-3′SEQIDNo.3)，以及非特异性寡核苷酸(5′-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3′SEQIDNo.4)克隆进pdsAAV-LP1载体。
细胞培养以及瞬时转染分析
如所述分离并培养原代小鼠肝细胞(KlingmullerU,BauerA,BohlS,NickelPJ,BreitkopfK,DooleyS,ZellmerS,KernC,MerfortI,SparnaT,etal.Primarymousehepatocytesforsystemsbiologyapproaches:astandardizedinvitrosystemformodellingofsignaltransductionpathways.IEEProcSystBiol.2006；153:433–447)。简言之，通过腹腔内注射100mg/kg体重的盐酸氯胺酮以及5mg/kg体重的盐酸甲苯噻嗪，麻醉8–12周龄的雄性C57Bl/6小鼠。打开腹腔之后，在37℃用HANKSI(1L蒸馏水中8gNaCl、0.4gKCl、3.57gHepes、0.06gNa2HPO4×2H2O、0.06gKH2PO4,2.5mMEGTA,0.1％葡萄糖，调节pH至7.4)，经由门静脉灌注肝脏持续5分钟，随后用HANKSII(1L蒸馏水中8gNaCl、0.4gKCl、3.57gHepes、0.06gNa2HPO4×2H2O、0.06gKH2PO4,0.1％葡萄糖,3mg/ml胶原酶CLSII,5mMCaCl2，调节pH至7.4)灌注持续5–7分钟，直至观察到肝脏结构崩解。移出肝包膜，并通过100μm的网孔过滤细胞悬液。洗涤细胞，然后通过台盼蓝染色测定细胞活力。以1000000个活细胞/孔接种于胶原I包被的六孔板。24h之后，以100的感染复数用重组腺病毒感染细胞。对于刺激实验，用PBS(对照媒介物)或100nM/6-孔浓度的胰岛素处理原代肝细胞10分钟。感染48小时后收集细胞。
肝脏TSC22D4的顺反组分析
通过显著性来分选染色质免疫共沉淀测序(Chip-Sequencing)结果的KEGG-通路分析。发现胰岛素信号通路被显著调节(p＝0.00005)。对来自Flag-TSC22D4cDNA腺病毒注射7天后的C57Bl/6雄性小鼠的肝脏提取物实施免疫共沉淀测序。
为了测试人的情况中结果的相关性，发明人分析了一组(acohortof)66个具有正常的葡萄糖耐受(NGT)或患2型糖尿病(T2D)的患者。与NGT对应物相比，T2D患者肝脏中的TSC22D4mRNA显著增加(图12h)。与TSC22D4在小鼠中的胰岛素敏化和葡萄糖调节功能一致，肝脏TSC22D4mRNA水平与该组人的空腹葡萄糖水平以及胰岛素敏感性显著相关(图12i)，后者通过高胰岛素-正常血糖钳夹中的葡萄糖输注率(GIR)来测定(图12j)。TSC22D4mRNA水平与循环的TG以及促炎性细胞因子水平正相关，因而进一步支持了来自动物模型的结果。重要的是，患者组的LCN13表达研究揭示了TSC22D4与LCN13mRNA水平之间极显著的相关性，并证明了与非糖尿病对象相比，糖尿病患者中LCN13的表达整体较低。此外，在人类中，肝脏LCN13mRNA水平与GIR以及空腹葡萄糖水平相关，总体概括了动物模型中TSC22D4-LCN13-胰岛素敏化的联系。
综上所述，数据将TSC22D4确立为全身葡萄糖代谢和胰岛素敏感性的重要节点。考虑到其对LCN13内分泌系统的上游调节功能和随后多器官的胰岛素敏感性以及葡萄糖储存的增强，显而易见的是，TSC22D4抑制代表了预防性和治愈性2型糖尿病疗法和胰岛素敏化中有吸引力的可选方法。

Claims (14)

1.鉴定在哺乳动物中用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病，和/或用于增强胰岛素敏感性例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性的调节剂的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供包含TSC22D4的编码核酸序列或TSC22D4的基因表达产物的生物样品，
b)将所述样品与所述TSC22D4的编码核酸序列或TSC22D4的基因表达产物的至少一种推定的调节剂接触，和
c)检测所述至少一种推定的调节剂与所述TSC22D4的编码核酸序列或TSC22D4的基因表达产物之间的结合，以及
d)鉴定所述TSC22D4的编码核酸序列或TSC22D4的基因表达产物的所述调节剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括下述步骤：在所述调节剂存在或不存在的情况下，评估TSC22D4的活性或表达中的至少一项，其中在所述调节剂存在的情况下测量的TSC22D4的活性或表达与在所述调节剂不存在的情况下测量的TSC22D4的活性或表达相比之间的降低，表明所述调节剂可用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病，和/或用于增强胰岛素敏感性，例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述TSC22D4的活性或表达为肝脏中的活性或表达。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括下述步骤：分析所述调节剂在用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病，和/或用于增强胰岛素敏感性例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性中的效果。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述调节剂选自：肽库分子，适配子，组合文库分子，细胞提取物来源的分子，小分子药物，细菌代谢物，噬菌体展示分子，抗体或其片段，蛋白，蛋白片段，多核苷酸，寡核苷酸特别是miRNA、siRNA或shRNA，以及它们的组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中评估TSC22D4的活性包括：酶活性分析、免疫分析、报告基因分析和/或Western印迹，和/或其中评估所述TSC22D4的表达包括：Northern印迹、微阵列分析和/或RT-PCR。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括下述步骤：分析来自所述哺乳动物的生物样品中的血液葡萄糖、促炎性细胞因子和/或抵抗素的循环水平。
8.按照权利要求1至7中任一项所述的方法鉴定的TSC22D4特异性调节剂，其中所述调节剂选自：肽库分子，适配子，组合文库分子，细胞提取物来源的分子，小分子药物，细菌代谢物，噬菌体展示分子，抗体或其片段，蛋白，蛋白片段，多核苷酸，寡核苷酸特别是miRNA、siRNA或shRNA，以及它们的组合，优选地，其中所述调节剂选自TSC22D4的表达和/或生物活性的抑制剂。
9.生产药物组合物的方法，其包括下述步骤：
a)任选地，实施权利要求1至7中任一项所述的方法，和
b)用至少一种药学可接受的赋形剂配制所鉴定的所述至少一种调节剂或权利要求8所述的调节剂。
10.按照权利要求9生产的药物组合物，其中所述药物组合物优选经口服施用、直肠施用、经粘膜施用、经皮施用、肠道施用、肠道外施用、肌肉内施用、鞘内施用、直接心室内施用、静脉内施用、腹腔内施用、鼻内施用、眼内施用或皮下施用。
11.根据权利要求8所述的调节剂或者根据权利要求10所述的药物组合物，其用于疾病的诊断和/或用于疾病的预防、调节和/或治疗，和/或用于增强胰岛素敏感性，例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性，其中所述疾病优选选自：胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病。
12.检测选自胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病的疾病的方法，其包括下述步骤：测量从疑似患有此类疾病的对象获得的生物样品中的TSC22D4的表达和/或生物活性；其中与来自健康对象的样品中测量的TSC22D4活性或表达相比，所述样品中测量的TSC22D4的活性或表达的降低表明疾病的存在或风险，所述疾病选自：胰岛素抵抗、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病，和/或用于增强胰岛素敏感性，例如肿瘤疾病情况下的胰岛素敏感性。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述检测包括检测权利要求8所述的调节剂的结合。
14.诊断性或治疗性试剂盒，其包括用于实施权利要求1至7或者12或者13中所述的方法的材料，任选地还包括合适的缓冲液和赋形剂以及使用说明书。
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