CN107278229A - 用于治疗胰岛素抵抗的靶向转录因子tsc22d4的寡核苷酸序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及TSC22D4活性或表达的寡核苷酸抑制剂,及其在哺乳动物中用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病和/或提高胰岛素敏感性的用途。
Description
本发明涉及TSC22D4活性或表达的寡核苷酸抑制剂,及其在哺乳动物中用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病和/或提高胰岛素敏感性的用途。
发明背景
在人类中,过量脂质储存和减低移除的组合导致超重和相关的共存疾病,包括胰岛素抵抗、心血管并发症和血脂异常(Langin D.In and out:adipose tissue lipidturnover in obesity and dyslipidemia.Cell Metab.2011 Nov 2;14(5):569-70),现今在全世界影响超过15亿人(Finucane MM等人,National,regional,and global trends inbody-mass index since 1980:systematic analysis of health examination surveysand epidemiological studies with 960 country-years and 91 millionparticipants.Lancet.2011 Feb 12;377(9765):557-67)。确实,胰岛素抵抗代表所谓的代谢综合征的核心部分,最终导致代谢功能障碍的发展,如葡萄糖耐受不良、胰腺β细胞衰竭和最终的2型糖尿病。
受损的胰岛素分泌(β-细胞)、增加的肝葡萄糖生成(肝脏)和降低的外周(肌肉)葡萄糖利用构成了导致2型糖尿病的发展和进展的常规的主要缺陷。现在已知,在2型糖尿病的自然史中,最终导致降低的胰岛素分泌的β-细胞衰竭比最初认为的发生地早的多。此外,对于2型糖尿病的病理生理学的更好的了解揭示了现在被称为发病八重奏(ominousoctet)的经典三联症(triad)之外的其它病因学机制。除了β-细胞、肝脏和肌肉之外,其它致病机制包括脂肪细胞胰岛素抵抗(增加的脂解作用)、降低的肠降血糖素分泌/敏感性(胃肠的)、增加的胰高血糖素分泌(α-细胞)、增强的葡萄糖重吸收(肾脏)以及由神经递质功能障碍导致的中枢神经系统胰岛素抵抗(脑)。当前,2型糖尿病的管理集中于经降低血糖(空腹和餐后)和血红蛋白A(1c)控制葡萄糖。但是,疗法的目标应该是延缓疾病进展和最终的治疗失败。治疗应靶向疾病已知的致病性干扰(即降低β-细胞功能的退化并提高胰岛素敏感性)。近年来,治疗策略已集中于影响促成2型糖尿病的多种缺陷以及通过钝化疾病进展提供持久的葡萄糖控制的新型治疗选择的发展。2型糖尿病的最佳管理应该包括早期起始利用具有不同作用机制的多种药物的组合疗法(DeFronzo RA.(Current issues in thetreatment of type 2 diabetes.Overview of newer agents:where treatment isgoing.Am J Med.2010 Mar;123(3Suppl):S38-48)。
特别地,针对胰岛素作用的主要代谢器官的不敏感性(包括肝脏、骨骼肌和脂肪组织)在很大程度上导致疾病进展和对于药物介入以预防糖尿病晚期并发症的最终需求。因此,有效且安全的胰岛素敏化在抗-糖尿病疗法中仍是具有吸引力的目标和目的。
转录辅助因子复合物已被鉴定为不同组织(包括肝脏和白脂肪组织(WAT))中代谢程序的协调中的重要检验点(关于综述,参见Sommerfeld A,Krones-Herzig A,HerzigS.Transcriptional co-factors and hepatic energy metabolism.Mol CellEndocrinol.2011 Jan 30;332(1-2):21-31)。
Kester HA等人(在Transforming growth factor-beta-stimulated clone-22is a member of a family of leucine zipper proteins that can homo-andheterodimerize and has transcriptional repressor activity.J Biol Chem.1999Sep 24;274(39):27439-47中)描述了,TGF-β-刺激的克隆-22(TSC-22)编码在进化中高度保守的包含亮氨酸拉链的蛋白。
此外,Jones等人(在Jones,A.等人,Transforming growth factor-beta1Stimulated Clone-22 D4 is a molecular output of hepatic wastingmetabolism.EMBO Mol Med.2013 Feb;5(2):294-308中)描述了,作为分子恶病质输出通路,转录因子转化生长因子β1-刺激的克隆(TSC)22 D4的肝脏水平在癌症恶病质中增加。在健康肝脏中模拟高恶病质水平的TSC22D4导致肝脏VLDL释放和脂肪生成基因的抑制,并减弱了正常和高脂肪饮食条件下的全身VLDL水平。因此,肝脏TSC22D4活性可以表示患有代谢消耗性疾病(包括癌症恶病质)的对象中外围能量缺乏的分子理论基础。
Kulozik,Ph.等人(Hepatic deficiency in transcriptional co-factor TBLIpromotes liver steatosis and hypertriglyceridemia.2011 Cell Metab.13:389-400)描述了,转录辅助因子转导素β样(TBL)1的受损的肝脏表达代表单-和多基因脂肪肝小鼠模型的共同特征。在正常和高脂肪饮食条件下,健康小鼠中TBL1基因表达的肝脏特异性切除促进了高甘油三酯血症和肝脂肪变性。由于发现TBL1表达水平也与人患者中的肝脏脂肪含量负相关,因此肝脏TBL1/TBLR1辅助因子活性的缺乏可以表示患有肥胖和代谢综合征的对象中肝脂肪变性的分子理论基础。
Berriel Diaz,M.等人(Nuclear receptor co-factor RIP140 controls lipidmetabolism during wasting in mice.2008.Hepatology 48:782-791)描述了,通过预防肝脏TG储存的动员,肝脏中RIP140的诱导提供了饥饿、败血症或癌症恶病质中肝脂肪变性的分子理论基础。因此,在这些病况的治疗中,肝脏RIP140转录活性的抑制可以提供有吸引力的辅助方案。
Farese等人(在The problem of establishing relationships betweenhepatic steatosis and hepatic insulin resistance.Cell Metab.2012 May 2;15(5):570-3中)描述了,脂肪在肝脏中的过度沉积(肝脂肪变性)通常伴随着肝脏胰岛素抵抗。
抗-糖尿病和/或胰岛素敏化药物的主要类别包括磺酰脲、二甲双胍、噻唑烷二酮、α-葡萄糖苷酶抑制剂、肠降血糖素模拟物和二肽基-肽酶4抑制剂,其均与严重的限制相关(关于综述,参见Moller,Metabolic disease drug discovery-"hitting the target"iseasier said than done.Cell Metab.2012 Jan 4;15(1):19-24)。
尽管胰岛素抵抗在2型糖尿病的发病机制中具有重要作用,但是仍然缺乏有效且安全的胰岛素敏化剂。确实,当前噻唑烷二酮家族的药物显示出适度的功效特征,并且伴随着很大的副作用,包括体重增加、心脏衰竭的风险增加、膀胱癌的风险可能增加以及心肌梗塞的风险增加,例如导致罗格列酮最近退出市场。
WO 2013/076501公开了鉴定可用于治疗和/或预防与胰岛素抵抗和/或葡萄糖耐受不良相关的疾病的药剂的筛选方法,其包括下述步骤:研究测试药剂抑制Vps34信号转导通路和/或RhoIota3κ-02β信号转导通路的能力。类似地,WO 2005/059564公开了筛选调控视黄醇结合蛋白4(RBP4)的活性的分子的方法,并描述了其在胰岛素抵抗的治疗中的用途。还描述了通过检测RBP4活性的调控来诊断胰岛素抵抗和相关病况的方法。
WO 2012/158123涉及通过施用蛋白激酶RNA-样内质网激酶(PERK)基因或其功能变体的抑制剂或者PERK蛋白或其功能变体的抑制剂治疗或预防动物体中的胰岛素抵抗综合征的方法,或者通过施用蛋白激酶RNA-样内质网激酶(PERK)基因或其功能变体的抑制剂或者PERK蛋白或其功能变体的抑制剂降低FOXO家族(Foxo 1、3a、4和6)的转录因子的活性的方法。
WO 2014/202602通常涉及TSC22D4活性或表达的调节剂,特别是抑制剂,及其在哺乳动物中用于预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病和/或提高胰岛素敏感性的用途。WO 2014/202602还涉及筛选方法以鉴定这些调节剂。
尽管通过病毒递送指向TSC22D4的shRNA或miRNA构建体的实验性敲低已证实有效改善糖尿病动物的代谢状态,但是还未鉴定出在通过不同技术递送时,适合在不同物种中高效且特异性敲低TSC22D4的siRNA构建体。
考虑到以上所述的背景技术中的缺陷,本发明的目的是提供预防、治疗和/或调节胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病和/或提高胰岛素敏感性的新的治疗性策略。
在本发明的第一方面,通过提供TSC22D4的表达和/或生物活性的抑制剂实现以上目的,所述抑制剂选自寡核苷酸、其反义序列或其功能变体,所述寡核苷酸为包含下述序列中的至少一种的干扰核糖核酸、PNA(蛋白核酸)或LNA(锁核酸):5’-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3’(SEQ ID No.1);5’-GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3’(SEQ IDNo.2);5’-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3’(SEQ ID No.3)。
mhD4-siRNA1:(NM_030935.3_siRNA_1024;ORF)
正义:5’-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3’(SEQ ID No.1);
反义:5’-UAAACAUCCACACACGUCCdTdT-3’(SEQ ID No.4);
GC:47%(w/o TT-突出)
mD4-siRNA2:(NM_023910.6_siRNA_993;ORF)
正义:GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3’(SEQ ID No.2);
反义:AUCUCUCUCGUAAACAUCCdTdT-3’(SEQ ID No.5);
GC:42.1%(w/o TT-突出)
mhD4-siRNA3:
正义:5’-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3’(SEQ ID No.3);
反义:5’-GCAAACAUGAGGUGGGACUdTdT-3’(SEQ ID No.6);
GC:52.6%(w/o TT-突出)
最近,本发明的发明人表明,转录调节物转化生长因子β1刺激的克隆22D4(TSC22D4)控制肝脏和全身胰岛素敏感性。在野生型小鼠中,肝脏特异性的TSC22D4损失显著改善了葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性,并中和了高胰岛素血症。健康动物中与高通量TSC22D4目标转录组研究组合的TSC22D4顺反组的ChlP-Seq分析揭示,TSC22D4直接或间接靶向胰岛素信号转导通路中的主要节点,最显著的是脂质运载蛋白13。
确实,在针对急性胰岛素暴露的应答中,如分别通过Akt/PKB激酶在Ser473位和GSK3β在Ser9位的磷酸化所确定的,原代小鼠肝细胞以及野生型小鼠中TSC22D4的下调或过表达导致细胞内胰岛素信号转导通路的上调或下调。有趣地,在糖尿病db/db小鼠中,TSC22D4的肝脏失活改善了这些动物中的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗,并使血糖正常化至几乎健康的水平。与糖尿病动物中代谢状态的整体改善一致,在具有肝脏特异性的TSC22D4缺陷中的小鼠中,促炎性细胞因子和抵抗素的循环水平显著降低。
尽管通过病毒递送指向TSC22D4的shRNA或miRNA构建体的实验性敲低已证实有效改善糖尿病动物的代谢状态,但是还未鉴定出通过不同技术递送时,适合在不同物种中高效且特异性敲低TSC22D4的siRNA构建体。
肝癌细胞中TSC22D4的失活未增加细胞生长,但是降低了增殖,这表明TSC22D4的胰岛素敏化功能未导致受影响的细胞/或器官中增加的癌症易感性。此外,TSC22D4的肝脏失活也未引起低血糖。
“抑制剂”是可以降低催化反应中催化剂的有效性的物质(非生物催化剂或酶)。本文提及的抑制剂可以降低酶的活性的有效性;并且本文提及的抑制剂可以降低酶表达的有效性。在本发明的背景下,优选的抑制剂是寡核苷酸。
术语“寡核苷酸”通常指干扰核糖核酸(iRNA)或蛋白核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。术语“寡核苷酸”通常指由共价连接在一起的超过19个核苷酸亚基构成的单链核苷酸聚合物。同样如下述进一步所述,优选存在19至100个核苷酸单元,最优选将19至50个核苷酸单元连接在一起。
核苷酸亚基的糖基可以是核糖、脱氧核糖或其修饰的衍生物,如2'-0-甲基核糖。寡核苷酸的核苷酸亚基可以通过磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键或者通过不阻止寡核苷酸的杂交的其它罕见的或非天然存在的键连接。此外,寡核苷酸可以含有不常见的核苷酸或非核苷酸部分。
在本说明书的背景下,术语“寡核苷酸”也可以指本领域已知的那些的核酸类似物(例如锁核酸(LNA))或其混合物。术语“寡核苷酸”包括由天然存在的核碱基、糖和核苷(骨架)间的键组成的寡核苷酸以及含有具有类似功能或具有特别改善的功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。因为完全或部分修饰或取代的寡核苷酸的一些期望特性,如例如能够穿透细胞膜、针对细胞外和细胞内核酶的良好抗性、针对核酸靶标的高亲和力和特异性,相对于天然形式,此类寡核苷酸通常是优选的。以此种方式修饰寡核苷酸的方法在本领域是已知的。
在一些寡核苷酸中(有时称为寡核苷酸模拟物),核苷酸单元的糖和核苷间的键,即骨架均被新的基团置换。保留碱基单元以与合适的核酸靶标化合物杂交。一种此类寡聚化合物是已显示具有极好杂交特性的寡核苷酸模拟物,其被称为蛋白核酸(PNA)。在PNA化合物中,寡核苷酸的糖骨架被包含酰胺的骨架,特别是氨乙基甘氨酸骨架置换。核碱基被保留,并且其与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。
其它修饰包括锁核酸(LNA),其中2’-羟基与糖环的3’或4’碳原子相连,从而形成双环糖部分。键优选是桥接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-CH2-)n基团,其中n是1或2。术语“LNA”通常指含有一个双环核苷类似物的核苷酸(也被称为LNA单体),或者含有一个或多个双环核苷类似物的寡核苷酸。
优选根据本发明的抑制剂,其中干扰核糖核酸是小干扰核糖核酸(siRNA)或小发卡核糖核酸(shRNA)或微小核糖核酸(miRNA)或者它们的组合。
还优选根据本发明的抑制剂,其中siRNA的长度为19至30个核苷酸。
一方面,生物活性剂利用“RNA干扰(RNAi)”。RNAi是由双链RNA(dsRNA)或siRNA引发的序列特异的、转录后基因沉默的方法。RNAi见于多种有机体中,如果蝇、线虫、真菌和植物,并且被认为参与抗病毒防御、转座子活性的调控以及基因表达的调节。在RNAi期间,dsRNA或siRNA引起靶标mRNA的降解,随后伴随着基因表达的序列特异性抑制。本文使用的“小干扰RNA”(siRNA)是靶向TSC22D4的基因的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”指通过RNA分子的两个区域的互补配对形成的结构。siRNA“靶向”基因,这是因为siRNA双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中,siRNA双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中,双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施方案中,双链体的长度是19-25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可以是发卡结构的一部分。除双链体部分之外,发卡结构可以包含位于形成双链体的两条序列之间的环部分。环的长度可以不同。在一些实施方案中,环的长度是5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发卡结构也可以包含3’和/或5’突出部分。在一些实施方案中,突出是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3’和/或5’突出。siRNA可由核酸序列编码,并且该核酸序列还可以包含启动子。核酸序列还可以包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中,聚腺苷酸化信号是合成的最小聚腺苷酸化信号。
本文使用的术语“siRNA”指能够引导或介导RNA干扰通路的包含约19至50个核苷酸(或核苷酸类似物)的核糖核酸(RNA)或RNA类似物。这些分子的长度可以不同,并且在其反义链中可以包含针对靶标信使RNA(mRNA)的不同程度的互补性。术语“siRNA”包括两条单独的链的双链体(即双链RNA)以及可以形成由双链体区域组成的发卡结构的单链。siRNA的长度可以是约19至50个核苷酸、或者约25至50个核苷酸、或者约30至50个核苷酸、或者约35至50个核苷酸、或者约40至50个核苷酸。在一个实施方案中,siRNA的长度为19至30个核苷酸。
将siRNA用于下调其靶标mRNA的活性在本领域是已知的。在一些实施方案中,当siRNA的反义链或引导链引导包含RNA核酸内切酶Ago2的RNA诱导的沉默复合物(RISC)切割含有互补序列的其靶标mRNA时,发生mRNA降解。因此,siRNA可与PERK基因的不同长度的任何部分互补。siRNA还可以与TSC22D4基因的正义链和/或反义链互补。因此,可将siRNA处理用于沉默TSC22D4基因,从而消耗下游的TSC22D4蛋白。
本文使用的术语“shRNA”指能够进行RNAi并含有随从链、环和引导链的单分子RNA。随从链和引导链可以互相基本互补。术语“shRNA”还可以包括含有除核糖核苷酸部分之外的部分的核酸,包括但不限于:修饰的核苷酸、修饰的核苷酸间的键、非核苷酸、脱氧核苷酸以及核苷酸的类似物。
miRNA下调其靶标mRNA。术语“miRNA”通常指单链分子,但是在特定实施方案中,其也可以涵盖与同一单链分子的另一区域或者与另一核酸部分(链长10%至50%互补)、基本(链长大于50%但小于100%互补)或完全互补的区域或其它链。因此,核酸可以涵盖这样的分子:其包含一条或多条互补链或自身互补链,或者分子所包含的特定序列的“互补物”。例如,前体miRNA可以含有高至100%互补的自身互补区域。本发明的miRNA探针或核酸可以包含其靶标,可以是其靶标或者可以与其靶标至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互补。
最优选根据本发明的抑制剂,其中siRNA由如SEQ ID No.1至3所述序列其反义序列组成。
还优选根据本发明的抑制剂,其中其功能变体包含至少一个修饰的或取代的核苷酸。术语“功能变体”也包括片段、基于简并核酸密码的变体或化学衍生物。功能变体可以含有保守改变,其中取代的核酸与被置换的核酸具有类似的结构或化学特性。功能变体还可以含有一个或多个核酸的缺失和/或插入。应该理解,功能变体至少部分保留TSC22D4基因的生物活性(例如,功能),或者甚至显示出改善的生物活性。
修饰的寡核苷酸的实例包括但不限于:含有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸(参见上述)和含有杂原子骨架的寡核苷酸,以及特别是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然的磷酸二酯骨架表示为-O-P-O-CH2-]。具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸也是可用的。用作干扰核糖核酸的修饰的寡核苷酸还可以包含一个或多个取代的糖部分。优选的寡核苷酸包含位于2’位的下述之一:OH;F;O-、S-或N-烷基;O-、S-或N-烯基;O-、S-或N-炔基;或者O-烷基-O-烷基,其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或者C2至C10烯基和炔基。具体实例包括但不限于:O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2,其中n和m为1至约10。其它示例性寡核苷酸包含位于2’位的下述之一:C1至C10低级烷基,取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基,SH,SCH3,OCN,Cl,Br,CN,CF3,OCF3,SOCH3,SO2CH3,ONO2,NO2,N3,NH2,杂环烷基,杂环烷芳基,氨基烷基氨基,聚烷基氨基,取代的甲硅烷基,RNA切割基团,报告基团,嵌入剂,用于改善寡核苷酸的药代动力学特性的基团,或者用于改善寡核苷酸的药效动力学特性的基团,以及具有类似特性的其它取代基。一种示例性修饰包含2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3,也被称为2’-O-(2-甲氧乙基)或2’-MOE),即烷氧基烷氧基基团。
此外,另一方面涉及包含根据本发明的寡核苷酸的重组载体。一般而言,将寡核苷酸插入表达载体(如质粒)中,用于表达。如果必要,可将寡核苷酸与期望的宿主识别的合适的转录和翻译调节控制核苷酸序列连接,尽管此类控制在表达载体中通常是可用的。然后通过标准技术将载体引入宿主。
在哺乳动物细胞中表达siRNA的载体通常使用RNA聚合酶III启动子来驱动模拟siRNA的结构的短的发卡RNA的表达。将编码该发卡的插入物设计为含有通过短的间隔序列分开的两个反向重复序列。一个反向重复序列与siRNA所靶向的mRNA互补。添加至3’端的一连串胸苷作为pol III转录终止位点。一旦位于细胞内部,则载体组成型表达诱导靶基因的沉默的发卡RNA。
其它合适的载体包括病毒载体,如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒或者各自的表达系统(参见,例如Catanotto,D.等人(2002)Functional siRNA expression fromtransfected PCR products.RNA 8,1454-1460;Barton,G.M.等人(2002)Retroviraldelivery of small interfering RNA into primary cells.Proc Natl Acad SciUSA.99(23):14943-5.Abbas-Terki,T.等人(2002)Lentiviral-mediated RNAinterference.Hum.Gene Ther.13,2197-2201,以及Xia,H.等人(2002)siRNA-mediategene silencing in vitro and in vivo.Nat.Biotechnol.20,1006-1010)。
一般而言,并非所有的宿主均被载体转化。因此,选择用于转化的宿主细胞将是必要的。一种选择技术涉及将编码转化的细胞中的选择性特征,如抗生素抗性的DNA序列以及任何必要的控制元件并入表达载体。可选地,此类选择性特征的基因可以位于用于共转化期望的宿主细胞的另一载体上。然后参考本公开的教导,在本领域技术人员已知的合适条件下将转化有本发明的寡核苷酸的宿主细胞培养足够的时间,以允许多肽的表达,然后可以回收所述多肽。
其它实例可见于参考文献,例如Yang J.等人(Design,preparation andapplication of nucleic acid delivery carriers.”Biotechnol Adv.2014 Jul-Aug;32(4):804-17)中。
通过多种方法可将本文所述的各类核酸(例如,寡核苷酸和/或载体)引入细胞。在脂质介导的转染中,细胞通过内吞作用吸收核酸与脂质或聚合物试剂之间的非共价复合物。电穿孔利用短暂的电脉冲来引起细胞质膜的破坏或穿孔,核酸通过这进入。这些方法均成功递送除病毒载体之外的任何RNAi核酸。病毒载体递送仅通过用相应的病毒感染细胞而发生,通常使用辅助病毒。用病毒感染期望的细胞系引入了siRNA或shRNA,并敲低了基因表达。
此外,本发明另一方面涉及包含根据本发明的寡核苷酸或根据本发明的重组载体的重组细胞,优选重组肝细胞。根据本发明的“细胞”可以是原核细胞或真核细胞。根据本发明的“细胞”优选但不限于选自肝细胞。哺乳动物细胞可以优选选自人、兔、小鼠或大鼠。优选地,细胞是人细胞,例如肝细胞。术语“细胞”还包括动物模型的细胞。此外,细胞可以是组织培养物的一部分。
还通过生产药物组合物的方法来实现本发明的目的,所述方法包括用至少一种药学可接受的赋形剂配制所述至少一种根据本发明的抑制剂的步骤。药物组合物的载体和/或赋形剂必须是从与制剂的其它成分兼容且对于其接受者无害的意义而言“可接受的”。
此外,本发明另一方面涉及包含根据本发明的抑制剂、根据本发明的重组载体和根据本发明的重组细胞中的至少一种以及药学可接受的载体的药物组合物。优选根据本发明的药物组合物,其中所述药物组合物用于口服施用、直肠施用、经粘膜施用、经皮施用、肠部施用、肠胃外施用、肌内施用、鞘内施用、直接心室内施用、静脉内施用、腹腔内施用、鼻内施用、眼内施用或者皮下施用。
此外,本发明另一方面涉及根据本发明的抑制剂、根据本发明的表达载体、根据本发明的重组细胞或者根据本发明的药物组合物,其用于预防、调节和/或治疗疾病的用途。
胰岛素抵抗综合征组成了广泛的临床表现,并且其被定义为与胰岛素抵抗相关的任何异常。诸如针对胰岛素的抗性、糖尿病、高血压、血脂异常和心血管疾病的异常构成了胰岛素抵抗综合征。
胰岛素抵抗综合征可以是饮食诱导的胰岛素抵抗和/或肥胖诱导的胰岛素抵抗。饮食诱导的胰岛素抵抗意为,针对胰岛素的抗性是由含有高饱和脂肪和碳水化合物含量的饮食诱导的。肥胖诱导的胰岛素抵抗意为,针对胰岛素的抗性是由肥胖的遗传素质或者由饮食习惯导致的肥胖诱导的。
因此本发明另一方面涉及根据本发明的抑制剂,根据本发明的表达载体、根据本发明的重组细胞或者根据本发明的药物组合物,其用于预防、调节和/或治疗选自下述的疾病的用途和/或用于提高胰岛素敏感性(如例如在肿瘤疾病背景下的胰岛素敏感性):胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、冠状动脉疾病、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病。优选地,胰岛素抵抗综合征是饮食诱导的胰岛素抵抗和/或肥胖诱导的胰岛素抵抗。
还通过治疗和/或预防有需要的对象中的选自胰岛素抵抗、代谢综合征和/或糖尿病的疾病的方法来实现目的,所述方法包括向是有需要的患者施用有效量的根据本发明的抑制剂或者根据本发明的药物组合物的步骤。
可将公开的方法用于治疗由胰岛素抵抗综合征引起的下述病况中的任何一种:胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、2型糖尿病或冠状动脉疾病。
本发明背景下的术语“预防”应被理解为,旨在避免最可能导致患有疾病的患者的病况恶化或者导致健康和/或患病对象的损伤或死亡的不良事件的发生的医疗干预。“有需要的患者”可以是但不限于,罹患胰岛素抵抗综合征相关的疾病,特别是胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、2型糖尿病或冠状动脉疾病的任何动物或人。优选地,有需要的对象是人。
还通过治疗性试剂盒实现本发明的目的,所述试剂盒包含根据本发明的抑制剂、根据本发明的重组载体、根据本发明的重组细胞或者根据本发明的药物组合物,其任选地还包含合适的缓冲剂和赋形剂以及使用说明书。
还通过用于预防、调节和/或治疗疾病的用途和/或用于提高胰岛素敏感性(如例如在肿瘤疾病背景下的胰岛素敏感性)的根据本发明的治疗性试剂盒实现目的,其中所述疾病选自胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、冠状动脉疾病、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病。
最近,本发明的发明人表明,转录调节物转化生长因子β1刺激的克隆22D4(TSC22D4)控制肝脏和全身胰岛素敏感性。在野生型小鼠中,肝脏特异性的TSC22D4损失显著改善了葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性,并中和了高胰岛素血症。健康动物中与高通量TSC22D4目标转录组研究组合的TSC22D4顺反组的ChlP-Seq分析揭示,TSC22D4直接或间接靶向胰岛素信号转导通路中的主要节点,最显著的是脂质运载蛋白13。确实,在针对急性胰岛素暴露的应答中,如分别通过Akt/PKB激酶在Ser473位和GSK3β在Ser9位的磷酸化所确定的,原代小鼠肝细胞以及野生型小鼠中TSC22D4的下调或过表达导致细胞内胰岛素信号转导通路的上调或下调。
有趣地,在糖尿病db/db小鼠中,TSC22D4的肝脏失活改善了这些动物中的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗,并使血糖正常化至几乎健康的水平。与糖尿病动物中代谢状态的整体改善一致,在具有肝脏特异性的TSC22D4缺陷中的小鼠中,促炎性细胞因子和抵抗素的循环水平显著降低。
肝癌细胞中TSC22D4的失活未增加细胞生长,但是降低了增殖,这表明TSC22D4的胰岛素敏化功能未导致受影响的细胞/或器官中增加的癌症易感性。此外,TSC22D4的肝脏失活也未引起低血糖。
尽管通过病毒递送指向TSC22D4的shRNA或miRNA构建体的实验性敲低已证实有效改善糖尿病动物的代谢状态,但是还未鉴定出通过不同技术递送时,适合在不同物种中高效且特异性敲低TSC22D4的siRNA构建体。为了解决该问题,本发明的发明人已利用如本文所公开的鼠Hepa1.6以及人Huh7肝癌细胞,在体外敲低研究中对针对TSC22D4mRNA序列的多种siRNA进行了鉴定、功能测试和验证。
下述图、序列和实施例仅用于阐明本发明,并且不应被解释为将本发明的范围限于实施例中描述的本发明的具体实施方案。出于本发明的目的,在此将文本中引用的所有参考文献整体并入。
图1显示了鼠肝癌细胞中颜色编码的所选指向TSC22D4的siRNA的敲低效率。显示了相对mRNA水平。在这些实验中,所有其它测试的siRNA序列均未显示任何显著的TSC22D4敲低(未显示)。
图2显示了转染进鼠Hepa1-6肝癌细胞时,mhD4-siRNA1对鼠TSC22D4的敲低效率。显示了相对mRNA水平。
图3显示了转染进人Huh7肝癌细胞时,mhD4-siRNA1对人TSC22D4的敲低效率。显示了相对mRNA水平。
序列ID NO.1至6显示了根据本发明的寡核苷酸序列。
实施例
重组病毒
利用BLOCK-iT腺病毒RNAi表达系统(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)克隆受U6启动子控制的表达TSC22D4或非特异性shRNA的腺病毒或者受CMV启动子控制的表达TSC22D4cDNA的腺病毒。如前所述,通过氯化铯方法纯化病毒,并在向动物注射之前,将纯化的病毒在含有10%甘油的磷酸盐缓冲盐水缓冲液进行透析(Herzig S,Hedrick S,Morantte I,Koo SH,Galimi F,Montminy M.CREB controls hepatic lipid metabolismthrough nuclear hormone receptor PPAR-gamma.Nature.2003;426:190–193.Herzig S,Long F,Jhala US,Hedrick S,Quinn R,Bauer A,Rudolph D,Yoon C,Puigserver P,Spiegelman B,等人,CREB regulates hepatic gluconeogenesis through thecoactivator PGC-1.Nature.2001;413:179–183)。如前所述建立受肝细胞特异性启动子控制的编码对照或者TSC22D4特异性miRNA的AAV(Rose AJ,Frosig C,Kiens B,WojtaszewskiJF,Richter EA.Effect of endurance exercise training on Ca2+calmodulin-dependent protein kinase II expression and signaling in skeletal muscle ofhumans.J Physiol.2007;583:785–795)。
动物实验
从查尔斯河实验室(Brussels,Belgium)获得雄性8–12周龄的C57Bl/6以及10周龄的db/db小鼠,并用常规无限制饮食在12h昼夜循环下对其进行饲喂。在胰岛素和葡萄糖耐受性测试之前,使动物禁食4h。除此以外,随意饲喂动物并使其自由获得水。对于腺病毒注射,经尾静脉注射施用1-2×109个噬斑形成单位(pfu)/重组病毒。对于AAV实验,经尾静脉注射5×1011个病毒。在各实验中,6–12只动物接受相同的处理,并在如所指示的禁食(18hr禁食)、随意饲喂或者饲喂(18hr禁食,随后6hr重新饲喂)条件下进行分析。在特定时间段之后收集器官,包括肝脏、附睾和腹部脂肪垫以及腓肠肌,将其称重、速冻并用于进一步分析。通过Echo MRI身体成分分析仪(Echo Medical Systems,Houston,USA)测定总的身体脂肪含量。根据NIH的指南并经地方当局批准进行动物处理和实验。
对于胰岛素耐受性测试,利用0.9%氯化钠制备1U胰岛素/mL的储备液。在实验前使小鼠禁食4小时。测定所有动物的体重,并通过用刀片割尾测量血糖水平。将血滴置于血糖仪条上并进行测量。向C57Bl/6腹腔内注射1U胰岛素/kg体重,并向db/db小鼠腹腔内注射1.5U胰岛素/kg体重。在20、40、60、80和120min之后监测血糖水平。
对于葡萄糖耐受性测试,利用0.9%氯化钠制备20%葡萄糖的储备液。在实验前使小鼠禁食4小时。测定所有动物的体重,并通过用刀片割尾测量血糖水平。将血滴置于血糖仪条上并进行测量。向C57Bl/6和db/db小鼠腹腔内注射5μL/g 20%葡萄糖溶液。在20、40、60、80和120min之后监测血糖水平。
定量Taqman RT-PCR
利用Qiazol试剂(Qiagen,Hilden,Germany),从匀浆的小鼠肝脏或细胞裂解物中提取总RNA。利用M-MuLV酶和Oligo dT引物(Fermentas,St.Leon-Rot,Germany),通过反转录准备cDNA。利用Assay-on-Demand试剂盒和ABIPRISM 7700序列检测仪(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)扩增cDNA。将RNA表达数据标准化为TATA-框结合蛋白(TBP)RNA的水平。
利用TaqMan分析,在荧光温度循环仪中通过定量实时RT-PCR测量人TSC22D4mRNA的表达,并在ABI PRISM 7000序列检测仪(Applied Biosystems,Darmstadt,Germany)上检测荧光。利用TRIzol(Life technologies,Grand Island,NY)分离总RNA,并用标准试剂(Life Technologies,Grand Island,NY)反转录1μg RNA。对于每次RT-PCR,根据制造商的说明书,利用来自stratagene(La Jolla,CA)的Brilliant SYBR green QPCR Core试剂盒在26μl PCR反应中扩增2μl。将样品在ABI PRISM 7000序列检测仪中孵育以在95℃下起始变性持续10min,随后进行40个PCR循环,每个循环由下述组成:95℃,持续15s;60℃,持续1min;以及72℃,持续1min。计算相对于次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)mRNA表达的人TSC22D4和Obp2a(LCN13)(分别由Hs00229526_m1和Hs01062934_g1确定)(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)的mRNA表达,所述次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)mRNA表达通过对HPRT1(Hs01003267_m1)的预混合的Assay-on-Demand(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)确定的。在各PCR结束时,通过熔解曲线特征(将样品冷却至68℃,并缓慢加热至95℃,同时测量荧光)确认特定转录本的扩增。通过将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进一步验证PCR的特异性。
蛋白分析
从细胞裂解缓冲液中的冷冻器官样品或培养的肝细胞提取蛋白(Rose AJ,FrosigC,Kiens B,Wojtaszewski JF,Richter EA.Effect of endurance exercise training onCa2+calmodulin-dependent protein kinase II expression and signaling inskeletal muscle of humans.J Physiol.2007;583:785–795),将20μg蛋白上样至4–12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中,并印迹至硝酸纤维素膜上。利用TSC22D4(Abcam,Cambridge,UK orSigma,Munich,Germany)、AKT、p-AKT、GSK、p-GSK(Cell signaling,Danvers,USA)或VCP(Abcam)的特异性抗体,如(Herzig等人,2001)所述进行蛋白质印迹分析。
质粒和RNA干扰
对于shRNA实验,将靶向小鼠和TSC22D4(SEQ ID No.1至3)的寡核苷酸克隆进pENTR/U6shRNA载体(Invitrogen)中。
细胞培养和瞬时转染分析
如(Klingmuller U,Bauer A,Bohl S,Nickel PJ,Breitkopf K,Dooley S,Zellmer S,Kern C,Merfort I,Sparna T等人,Primary mouse hepatocytes for systemsbiology approaches:a standardized in vitro system for modelling of signaltransduction pathways.IEE Proc Syst Biol.2006;153:433–447)所述分离并培养原代小鼠肝细胞。简言之,通过腹腔注射100mg/kg体重的盐酸氯胺酮和5mg/kg体重的盐酸塞拉嗪麻醉8–12周龄的雄性C57Bl/6小鼠。打开腹腔之后,在37℃下,经门静脉用HANKS I(含8gNaCl、0.4g KCl、3.57g Hepes、0.06g Na2HPO4×2H2O、0.06g KH2PO4的1L蒸馏H2O,2.5mMEGTA,0.1%葡萄糖,调节至pH 7.4)灌注肝脏,持续5min,随后用HANKS II(含8g NaCl、0.4gKCl、3.57g Hepes、0.06g Na2HPO4×2H2O、0.06g KH2PO4的1L蒸馏水,0.1%葡萄糖,3mg/ml胶原酶CLSII,5mM CaCl2,调节至pH 7.4)灌注,持续5–7min,直至观察到肝脏结构瓦解。移除肝包膜,并经100μm的网过滤细胞悬液。洗涤细胞,并随后通过台盼蓝染色测定细胞活力。将1 000 000个活细胞/孔接种至胶原I-包被的六孔板上。24h之后,以100的感染复数用重组腺病毒感染细胞。对于刺激实验,用PBS(对照介质)或100nM/6-孔的浓度的胰岛素处理原代肝细胞,持续10分钟。在感染之后48h收获细胞。
肝脏TSC22D4的顺反组分析
通过显著性对芯片测序结果的KEGG-通路分析进行分选。发现胰岛素信号转导通路明显被调节(p=0.00005)。在来自注射后7天的Flag-TSC22D4cDNA腺病毒注射的雄性C57Bl/6小鼠的肝脏提取物中进行芯片测序。
结果
如在4次独立实验中所示,序列对于小鼠和人TSC作用十分有效(参见附图)。存在与各序列连接的非特异性dTdT突出。序列与小鼠和人TSC序列均100%匹配。
基于这些结果,由于根据本发明的序列(SEQ ID No.1至3)显示出针对TSC22D4的优良的敲低效率,并靶向多个物种(包括小鼠、非人的灵长类和人),选择其作为用于治疗目的的主要候选物。利用鼠Hepa1.6以及人Huh7肝癌细胞在体外敲低研究中对针对TSC22D4mRNA序列的多种siRNA的序列进行鉴定、功能测试和验证。具体地,mhD4-siRNA1显示出针对TSC22D4的优良的敲低效率,并靶向多个物种,包括小鼠、非人的灵长类和人。
mhD4-siRNA1:(NM_030935.3_siRNA_1024;ORF)
正义:5’-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3’(SEQ ID No.1);
反义:5’-UAAACAUCCACACACGUCCdTdT-3’(SEQ ID No.4);
GC:47%(w/o TT-突出)
mD4-siRNA2:(NM_023910.6_siRNA_993;ORF)
正义:GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3’(SEQ ID No.2);
反义:AUCUCUCUCGUAAACAUCCdTdT-3’(SEQ ID No.5);
GC:42.1%(w/o TT-突出)
mhD4-siRNA3:
正义:5’-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3’(SEQ ID No.3);
反义:5’-GCAAACAUGAGGUGGGACUdTdT-3’(SEQ ID No.6);
GC:52.6%(w/o TT-突出)。
序列表
<110> 德国癌症研究公共权益基金会(Deutsches KrebsforschungszentrumStiftung des 鰂fentlichen Rechts)
<120> 用于治疗胰岛素抵抗的靶向转录因子TSC22D4的寡核苷酸序列
<130> D31385WO
<150> 15160259.6
<151> 2015-03-23
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 1
ggacgugugu ggauguuua 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
uaaacaucca cacacgucc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
ggauguuuac gagagagau 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
aucucucucg uaaacaucc 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 5
agucccaccu cauguuugc 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 6
gcaaacauga ggugggacu 19
Claims (14)
1.TSC22D4的表达和/或生物活性的抑制剂,其选自寡核苷酸、其反义序列或其功能变体,所述寡核苷酸为包含下述序列中的至少一种的干扰核糖核酸、PNA(蛋白核酸)或LNA(锁核酸):
5’-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3’(SEQ ID No.1);
5’-GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3’(SEQ ID No.2);
5’-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3’(SEQ ID No.3)。
2.如权利要求1所述的抑制剂,其中所述干扰核糖核酸是小干扰核糖核酸(siRNA)或小发卡核糖核酸(shRNA)或微小核糖核酸(miRNA)或者它们的组合。
3.如权利要求1或2所述的抑制剂,其中所述siRNA的长度为19至30个核苷酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抑制剂,其中所述siRNA由根据SEQ ID No.1至3的序列组成。
5.如权利要求1至3中任一项所述的抑制剂,其中所述其功能变体包含至少一个修饰的或取代的核苷酸。
6.重组载体,其包含权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸。
7.重组细胞,优选重组肝细胞,其包含权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸或权利要求6所述的重组载体。
8.药物组合物,其包含权利要求1至5中任一项所述的抑制剂、权利要求6所述的重组载体和权利要求7所述的重组细胞中的至少一种,以及药学可接受的载体。
9.如权利要求8所述的药物组合物,其中所述药物组合物用于口服施用、直肠施用、经粘膜施用、经皮施用、肠部施用、肠胃外施用、肌内施用、鞘内施用、直接心室内施用、静脉内施用、腹腔内施用、鼻内施用、眼内施用或者皮下施用。
10.权利要求1至5中任一项所述的抑制剂、权利要求6所述的重组载体、权利要求7所述的重组细胞或者权利要求8或9所述的药物组合物,其用于预防、调节和/或治疗疾病的用途。
11.如权利要求1至5中任一项所述的抑制剂、权利要求6所述的重组载体、权利要求7所述的重组细胞或者权利要求8或9所述的药物组合物,其用于根据权利要求10所述的用途和/或用于提高胰岛素敏感性,如例如肿瘤疾病背景下的胰岛素敏感性,其中所述疾病选自:胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、冠状动脉疾病、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病。
12.如权利要求1至5中任一项所述的抑制剂、权利要求6所述的重组载体、权利要求7所述的重组细胞或者权利要求8或9所述的药物组合物,其用于根据权利要求11所述的用途,其中所述胰岛素抵抗综合征是饮食诱导的胰岛素抵抗和/或肥胖诱导的胰岛素抵抗。
13.治疗性试剂盒,其包含权利要求1至5中任一项所述的抑制剂、权利要求6所述的重组载体、权利要求7所述的重组细胞或者权利要求8或9所述的药物组合物,任选地合适的缓冲剂和赋形剂,以及使用说明书。
14.权利要求13所述的治疗性试剂盒,其用于预防、调节和/或治疗疾病的用途和/或用于提高胰岛素敏感性,如例如肿瘤疾病背景下的胰岛素敏感性,其中所述疾病选自胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、冠状动脉疾病、代谢综合征和/或1型或2型糖尿病。
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