ES2363500T3 - Arn interferente para el gen znfn3a1 como método para inhibir el crecimiento de células cancerosas. - Google Patents
Arn interferente para el gen znfn3a1 como método para inhibir el crecimiento de células cancerosas. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1 para su uso en tratar un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1 en un sujeto, en donde dicho ARNip comprende un ácido nucleico ZNFN3A1 sentido y un ácido nucleico ZNFN3A1 antisentido, y en donde dicho ARNip es específico para una diana de ZNFN3A1 seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, en donde dicho ARNip de ZNFN3A1 tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.
Description
La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo de investigación en cáncer. En particular, la presente invención se refiere a una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1.
El carcinoma hepatocelular (CHC) está entre los cinco tipos más frecuentes de cánceres y es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en el mundo. Aunque recientes avances médicos han hecho gran progreso en diagnosticar la enfermedad, un gran número de pacientes con CHC son aún diagnosticados en fases avanzadas. La mayoría de los pacientes no se curan por resección quirúrgica debido a la grave disfunción del hígado, tumores expandidos y/o múltiples, o alta incidencia de recaída. Por tanto el desarrollo de fármacos de gran eficacia quimioterapéutica y estrategias preventivas son asuntos de interés apremiante.
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que ARN interferentes pequeños (ARNip) selectivos para ZNFN3A1 son eficaces para inhibir el crecimiento celular de varias células cancerosas, incluyendo las implicadas en CHC.
La invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento celular. Entre los métodos proporcionados están los que comprenden poner en contacto una célula con una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1. La invención también proporciona métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales. Tales métodos incluyen el uso de una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1. Otro aspecto de la invención proporciona métodos para inhibir la expresión del gen ZNFN3A1 en una célula de una muestra biológica. La expresión del gen se puede inhibir mediante la introducción de una molécula de ácido ribonucleico (ARN) bicatenario en la célula en una cantidad suficiente para inhibir la expresión del gen ZNFN3A1. Otro aspecto de la invención se refiere a productos que incluyen secuencias de ácido nucleico y vectores así como composiciones que los comprenden, útiles, por ejemplo, en los métodos proporcionados. Entre los productos proporcionados están moléculas de ARNip que tienen la propiedad de inhibir la expresión del gen ZNFN3A1 cuando se introducen en una célula que expresa dicho gen. Entre tales moléculas están las que comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, en donde la hebra sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de ZNFN3A1, y en donde la hebra antisentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que es complementaria a dicha hebra sentido. Las hebras sentido y antisentido de la molécula hibridan entre sí para formar una molécula bicatenaria.
Como se usa aquí el término “organismo” se refiere a cualquier entidad viva que comprende al menos una célula. Un organismo vivo puede ser tan simple como, por ejemplo, un única célula eucariota o tan complejo como un mamífero, incluyendo un ser humano.
Como se usa aquí, el término “muestra biológica” se refiere a un organismo entero o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, líquidos corporales, incluyendo pero no limitados a sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre de cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). “Muestra biológica” se refiere además a un homogenado, lisado, extracto, cultivo celular o cultivo de tejido preparado de un organismo entero o un subconjunto de sus células, tejidos o partes componentes, o una fracción o parte de los mismos. Por último, “muestra biológica” se refiere a un medio, tal como un caldo nutriente o gel en el que se ha propagado un organismo, que contiene componentes celulares, tales como proteínas o polinucleótidos.
La invención presenta métodos de inhibir el crecimiento celular. El crecimiento celular se inhibe poniendo en contacto una célula con una composición de un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1. ZNFN3A1 es una proteína con dedos de zinc que se sobreexpresa en tumores tales como carcinoma hepatocelular o adenocarcinoma colorrectal. El crecimiento de la célula que expresa ZNFN3A1 se puede inhibir por la presente invención. La célula se pone en contacto además con un agente potenciador de la transfección. La célula se suministra in vitro, in vivo o ex vivo. El sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca. La célula es una célula hepática o una célula de colon. De forma alternativa, la célula es una célula tumoral (es decir, célula cancerosa) tal como una célula de cáncer colorrectal o una célula de cáncer de hígado. Por ejemplo, la célula es una célula de adenocarcinoma colorrectal o una célula de carcinoma hepatocelular. Mediante inhibir el crecimiento celular se quiere decir que la célula tratada prolifera a una velocidad menor o tiene una viabilidad disminuida que una célula sin tratar. El crecimiento celular se mide mediante ensayos de proliferación conocidos en la técnica.
Mediante el término “ARNip” se quiere decir una molécula bicatenaria de ARN que previene la traducción de un ARNm diana. Se usan técnicas estándar de introducir ARNip en la célula, incluyendo esas en las que el ADN es un molde partir del que se transcribe ARN. El ARNip incluye una secuencia de ácido nucleico de ZNFN3A1 sentido, una secuencia de ácido nucleico de ZNFN3A1 antisentido o ambas. El ARNip se construye de modo que un único transcrito tiene las secuencias tanto sentido como antisentido complementaria del gen diana, por ejemplo, una horquilla.
El método se usa para alterar la expresión génica en una célula en la que la expresión de ZNFN3A1 está aumentada, por ejemplo, como resultado de transformación maligna de las células. La unión del ARNip a un transcrito de ZNFN3A1 en la célula diana produce una reducción en la producción de ZNFN3A1 por la célula. La longitud del oligonucleótido es al menos de 10 nucleótidos y puede ser tan larga como el transcrito ZNFN3A1 natural. Preferiblemente, el oligonucleótido tiene de 19-25 nucleótidos de longitud. Lo más preferiblemente, el oligonucleótido tiene menos de 75, 50 o 25 nucleótidos de longitud. Ejemplos de oligonucleótidos ARNip de ZNFN3A1 que inhiben la expresión de ZNFN3A1 en células de mamífero incluyen oligonucleótidos que contienen secuencias diana, por ejemplo, los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO: 1.
Se conocen métodos para diseñar ARN bicatenarios que tengan la capacidad de inhibir la expresión génica en una célula diana. (Véase, por ejemplo, la patente de EE UU No. 6.506.559). Por ejemplo, un programa de ordenador para diseñar ARNip está disponible del sitio web a Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html).
El programa de ordenador selecciona secuencias de nucleótidos para la síntesis de ARNip basado en el siguiente protocolo.
Selección de sitios diana de ARNip
- 1.
- Empezando con el codón de iniciación AUG del transcrito, rastrear en dirección 3’ para secuencias de dinucleótidos AA. Registrar la aparición de cada AA y los 19 nucleótidos adyacentes en 3’ como potenciales sitios diana del ARNip. Tuschl y col. recomiendan en contra de diseñar ARNip en las regiones 5’ y 3’ no traducidas (UTR) y regiones cerca del codón de iniciación (en 75 bases) ya que pueden ser más ricas en sitios de unión de proteínas reguladoras. Las proteínas de unión a las UTR y/o complejos de iniciación de la traducción pueden interferir con la unión del complejo ARNip endonucleasa.
- 2.
- Comparar los potenciales sitios diana con la base de datos genómica apropiada (humana, de ratón, rata, etc.) y eliminar de consideración cualquier secuencia diana con homología significativa a otras secuencias codificantes. Se sugiere usar BLAST, que se puede encontrar en el servidor del NCBI en: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
- 3.
- Seleccionar secuencias dianas cualificadas para síntesis. Es típico seleccionar varias secuencias diana en la longitud del gen para evaluar.
También se incluyen en la invención polinucleótidos aislados que incluyen las secuencias de ácido nucleico de secuencias diana, por ejemplo, los nucleótidos 451-471 (SEQ ID NO: 58), 532-552 (SEQ ID NO: 60), 623-643 (SEQ ID NO: 61), 625-645 (SEQ ID NO: 62), 636-656 (SEQ ID NO: 63), 726-746 (SEQ ID NO: 64), 923-943 (SEQ ID NO: 66), 1065-1085 (SEQ ID NO: 68) y 1258-1278 (SEQ ID NO: 69) de SEQ ID NO: 1 o un polinucleótido que es complementario a la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO: 1. Como se usa aquí, un “ácido nucleico aislado” es un ácido nucleico extraído de su entorno original (por ejemplo, el medio ambiente natural si se da de forma natural) y por tanto, alterado de forma sintética de su estado natural. En la presente invención, ácido nucleico aislado incluye ADN, ARN y derivados de los mismos. Cuando el ácido nucleico aislado es ARN o derivados del mismo, la base “t” se debe sustituir con “u” en las secuencias de nucleótidos. Como se usa aquí, el término “complementario” se refiere a apareamiento de bases de Watson-Crick o Hoogsteen entre unidades de nucleótidos de un polinucleótido, y el término “unión” significa la interacción física o química entre dos polipéptidos o compuestos o polipéptidos o compuestos asociados o combinaciones de los mismos. Las secuencias de ácido nucleico complementarias hibridan en condiciones apropiadas para formar dúplex estables que contienen pocos o ningún mal emparejamiento. Además, la hebra sentido y la hebra antisentido del nucleótido aislado de la presente invención, pueden formar un nucleótido bicatenario o estructura de horquilla con bucle por la hibridación. En una forma de realización preferida, tales dúplex contienen no más de 1 mal emparejamiento por cada 10 emparejamientos. En una forma de realización especialmente preferida, donde las hebras del dúplex son totalmente complementarias, tales dúplex no contienen malos emparejamientos. El polinucleótido tiene menos de 1622 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, el polinucleótido tiene menos de 500, 200 o 75 nucleótidos de longitud. También se incluye en la invención un vector que contiene uno o más de los ácidos nucleicos descritos aquí, y una célula que contiene los vectores. Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención son útiles para ARNip contra ZNFN3A1 o ADN que codifica el ARNip. Cuando se usan los ácidos nucleicos para ARNip o ADN codificante del mismo, la hebra sentido es preferiblemente más larga de 19 nucleótidos y más preferiblemente más larga de 21 nucleótidos.
La invención se basa en parte en el descubrimiento de que el gen que codifica una proteína con dedos de zinc, ZNFN3A1 se sobreexpresa en carcinoma hepatocelular (CHC) comparado con tejido hepático no canceroso. El ADNc de ZNFN3A tiene 1622 nucleótidos de longitud. La ORF de 1284 codifica una proteína de 428 aminoácidos 5 con un motivo de dedos de zinc. Las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de ZNFN3A1 se muestran en las tablas 1 y 2. En la tabla 1, la región sin traducir 5’ y 3’ se muestra en cursiva, los codones de inicio y terminación están en negrita. La localización subcelular de la proteína ZNFN3A1 se altera durante la progresión del ciclo celular y por la densidad de células cultivadas. La proteína ZNFN3A1 se acumula en el núcleo cuando las células están en fase S de media a tardía o cultivadas en condiciones dispersas. Mientras que, la proteína ZNFN3A1 se localiza en el
10 citoplasma así como en el núcleo cuando las células están en otras fases del ciclo celular o han crecido en una condición densa. ZNFN3A1 forma un complejo ternario con la proteína KIAA0054 y la ARN polimerasa II in vivo, que activa la transcripción de genes posteriores incluyendo receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mediante unión directa del complejo con un elemento de “5’-CCCTCC-3’” en la región flanqueante 5’.
La expresión exógena de ZNFN3A1 en células NIH3T3 produjo crecimiento celular aumentado. Por el contrario, la supresión de su expresión con S-oligonucleótidos antisentido produjo una inhibición de crecimiento de células de 5 hepatoma.
Métodos de inhibición del crecimiento celular
La presente invención se refiere a la inhibición del crecimiento celular, por ejemplo, crecimiento de células
10 cancerosas inhibiendo la expresión de ZNFN3A1. La expresión de ZNFN3A1 se inhibe por ARN interferente pequeño (ARNip) que se dirige específicamente al gen ZNFN3A1. Una diana de ZNFN3A1 incluye, por ejemplo, los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO: 1.
15 En células de no mamífero, se ha mostrado que el ARN bicatenario (ARNbc) ejerce un efecto de silenciamiento fuerte y específico sobre la expresión génica, que se denomina interferencia de ARN (ARNi) (3). El ARNbc se procesa a ARNbc de 20-23 nucleótidos denominado ARN interferente pequeño (ARNip) por una enzima que contiene un motivo RNasa III. El ARNip se dirige específicamente al ARNm complementario con un complejo nucleasa multicomponente (4, 5). En células de mamífero, se ha mostrado que ARNip compuesto de ARNbc de 20
20 o 21-meros con 19 nucleótidos complementarios y dímeros 3’ terminales no complementarios de timidina o uridina tienen un efecto específico de disminución de un gen sin inducir cambios globales en la expresión génica (6). Además, plásmidos que contienen promotor de ARN nuclear pequeño (ARNnp) U6 o ARN polimerasa III H1 producen de forma eficaz tal reclutamiento de ARN pequeño de clase de tipo III de ARN polimerasa III y por tanto pueden suprimir de forma constitutiva su ARNm diana (7,8).
25 Se construyeron 13 plásmidos de expresión diferentes para expresar ARNip-ZNFN3A1 horquilla con bucle (véase el ejemplo 2). Se probó la capacidad de los plásmidos de inhibir el crecimiento celular. Cuatro plásmidos (psiU6BXZNFN3A1-4, -8, -12 y -13) suprimieron de forma marcada y cinco plásmidos (psiU6BX-ZNFN3A1-2, -5, -6, -7 y -10) de forma moderada la expresión de ZNFN3A1 endógena, mientras que los restantes cuatro plásmidos (psiU6BXZNFN3A1-1, -3, -9 y -11) mostraron poco o ningún efecto sobre la expresión (figura 1). Varias células de cáncer colorrectal y de hepatoma humanos transfectadas con psiU6BX-siZNFN3A1-12, mostraron un número reducido de células supervivientes comparado con plásmidos control. El análisis por FACS reveló que su muerte era debida a apoptosis.
El crecimiento de células se inhibe al poner en contacto una célula con una composición que contiene un ARNip de ZNFN3A1. La célula se pone en contacto además con un agente de transfección. En la técnica se conocen agentes de transfección adecuados. Mediante inhibición del crecimiento celular se quiere decir que la célula prolifera a una velocidad menor o tiene viabilidad disminuida comparada con una célula no expuesta a la composición. El crecimiento celular se mide por métodos conocidos en la técnica, tal como el ensayo de proliferación celular con MTT.
El ARNip-ZNFN3A1 se dirige a una única secuencia diana del gen ZNFN3A1. De forma alternativa, el ARNip se dirige a múltiples secuencias diana del gen ZNFN3A1. Por ejemplo, la composición contiene ARNip-ZNFN3A1 dirigido a dos, tres, cuatro o cinco o más secuencias diana de ZNFN3A1. Mediante secuencia diana de ZNFN3A1 se quiere decir una secuencia de nucleótidos que es idéntica a una parte del gen ZNFN3A1. La secuencia diana puede incluir la región 5’ sin traducir (UT), el marco abierto de lectura (ORF) o la región 3’ sin traducir del gen ZNFN3A1 humano. De forma alternativa, el ARNip es una secuencia de ácido nucleico complementaria a un modulador anterior o posterior de la expresión del gen ZNFN3A1. Ejemplos de modulares anteriores o posteriores incluyen, un factor de transcripción que se une a promotor del gen ZNFN3A1, una quinasa o fosfatasa que interacciona con el polipéptido ZNFN3A1, un promotor o potenciador de ZNFN3A1.
El ARNip-ZNFN3A1 que hibrida con el ARNm diana disminuye o inhibe la producción del producto polipeptídico ZNFN3A1 codificado por el gen ZNFN3A1 mediante asociación con el transcrito de ARNm normalmente monocatenario, interfiriendo así con la traducción y por tanto, la expresión de la proteína. El ARNip tiene menos de 500, 200, 100, 50 o 25 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, el ARNip tiene de 19-25 nucleótidos de longitud. Secuencias de ácidos nucleico de ejemplo para la producción de ARNip-ZNFN3A1 incluyen las secuencias de nucleótidos 451-471 (SEQ ID NO: 58), 532-552 (SEQ ID NO: 60), 623-643 (SEQ ID NO: 61), 625-645 (SEQ ID NO: 62), 636-656 (SEQ ID NO: 63), 726-746 (SEQ ID NO: 64), 923-943 (SEQ ID NO: 66), 1065-1085 (SEQ ID NO: 68) o 1258-1278 (SEQ ID NO: 69) de SEQ ID NO: 1 como secuencia diana. Además, para aumentar la actividad de inhibición del ARNip, se puede añadir el nucleótido “u” al extremo 3’ de la hebra antisentido de la secuencia diana. El número de “u”es que se van a añadir es de al menos 2, en general de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 5. Las “u”es añadidas forman una hebra individual en el extremo 3’ de la hebra antisentido del ARNip.
La célula es cualquier célula que expresa o sobreexpresa ZNFN3A1. La célula es una célula hepática o una célula epitelial tal como una célula de colon. De forma alternativa, la célula es una célula tumoral tal como un carcinoma, adenocarcinoma, blastoma, leucemia, mieloma o sarcoma. La célula es una célula de carcinoma hepatocelular o de adenocarcinoma colorrectal.
Un ARNip-ZNFN3A1 se introduce directamente en las células en una forma que es capaz de unirse a los transcriptos de ARNm. De forma alternativa, el ADN que codifica el ARNip-ZNFN3A1 está en un vector.
Los vectores se producen, por ejemplo, clonando una secuencia diana de ZNFN3A1 en un vector de expresión operativamente unido a secuencias reguladoras que flanquean la secuencia ZNFN3A1 de una manera que permita la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de ambas hebras (Lee, N.S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M.-J., Ehsani, A., Salvaterra, P. y Rossi, J. (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20: 500-505). Una molécula de ARN que es antisentido al ARNm de ZNFN3A1 se transcribe por un primer promotor (por ejemplo, una secuencia promotora en 3’ del ADN clonado) y una molécula de ARN que es la hebra sentido para el ARNm de ZNFN3A1 se transcribe por un segundo promotor (por ejemplo, una secuencia promotora en 5’ del ADN clonado). Las hebras sentido y antisentido hibridan in vivo para generar construcciones ARNip para silenciar el gen ZNFN3A1. De forma alternativa, se utilizan dos construcciones para crear las hebras sentido y antisentido de una construcción ARNip. El ZNFN3A1 clonado puede codificar una construcción que tenga estructura secundaria, por ejemplo, horquillas, en donde un único transcrito tiene las secuencias tanto sentido como antisentido complementaria del gen diana.
Se puede localizar una secuencia bucle que consista en una secuencia arbitraria de nucleótidos entre la secuencia sentido y antisentido para formar la estructura de horquilla con bucle. De esta manera, la presente invención también proporciona un ARNip que tiene la fórmula general 5’-[A]-[B]-[A’]-3’, en donde [A] es una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en nucleótidos 451-471 (SEQ ID NO: 58), 532-552 (SEQ ID NO: 60), 623-643 (SEQ ID NO: 61), 625-645 (SEQ ID NO: 62), 636-656 (SEQ ID NO: 63), 726-746 (SEQ ID NO: 64), 923-943 (SEQ ID NO: 66), 1065-1085 (SEQ ID NO: 68) o 1258-1278 (SEQ ID NO: 69) de SEQ ID NO: 1,
[B] es una secuencia de ribonucleótidos que consiste en 3 a 23 nucleótidos, y
[A’] es una secuencia de ribonucleótidos que consiste en la secuencia complementaria a [A].
La región [A] hibrida con [A’] y entonces se forma un bucle que consiste en la región [B]. La secuencia bucle puede tener preferiblemente de 3 a 23 nucleótidos de longitud. La secuencia bucle, por ejemplo, se puede seleccionar del grupo que consiste en las siguientes secuencias (http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html). Además, una secuencia bucle que consiste en 23 nucleótidos también proporciona ARNip activo (Jacque, J.-M., Triques, K. y Stevenson, M. (2002) Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature 418: 435-438).
AUG: Sui, G., Soohoo, C., Affar, E.B., Gay, F., Shi, Y., Forrester, W.C. y Shi, Y. (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8): 5515-5520.
CCC, CCACC o CCACACC: Paul, C.P., Good, P.D., Winer, I. y Engelke, D.R. (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20: 505-508.
UUCG: Lee, N.S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M.-J., Ehsani, A., Salvaterra, P. y Rossi, J. (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20: 500-505.
CTCGAG o AAGCUU: Editores de Nature Cell Biology (2003) Whither RNAi? Nat Cell Biol. 5:489-490.
UUCAAGAGA: Yu, J.-Y., DeRuiter, S.L. y Turner, D.L. (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9): 6047-6052.
Por ejemplo, a continuación se muestran los ARNip preferibles que tienen estructura de horquilla con bucle de la presente invención. En la siguiente estructura, la secuencia bucle se puede seleccionar del grupo que consiste en AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC y UUCAAGAGA. La secuencia bucle preferida es UUCAAGAGA (“ttcaagaga” en ADN).
aaucagagaagcuuuacucau-[B]-augaguaaagcuucucugauu (para la secuencia diana de SEQ ID NO:58) aacucguaaugacauuucaac-[B]-guugaaaugucauuacgaguu (para la secuencia diana de SEQ ID NO: 60) aaaagugaucugcaacucuuu-[B]-aaagaguugcagaucacuuuu (para la secuencia diana de SEQ ID NO: 61) aagugaucugcaacucuuuca-[B]-ugaaagaguugcagaucacuu (para la secuencia diana de SEQ ID NO: 62) aacucuuucaccaucuguaau-[B]-auuacagauggugaaagaguu (para la secuencia diana de SEQ ID NO: 63 aacuguucgauuguguucaau-[B]-auugaacacaaucgaacaguu (para la secuencia diana de SEQ ID NO: 64) aacuggugaugagcaaguaug-[B]-cauacuugcucaucaccaguu (para la secuencia diana de SEQ ID NO: 66) aacaucuaccagcugaaggug-[B]-caccuucagcugguagauguu (para la secuencia diana de SEQ ID NO: 68) aagcaaugaagaaucugagac-[B]-gucucagauucuucauugcuu (para la secuencia diana de SEQ ID NO: 69).
Las secuencias reguladoras que flanquean la secuencia ZNFN3A1 son idénticas o son diferentes, de modo que su expresión se puede modular de forma independiente, o de una forma temporal o espacial. Los ARNip se transcriben intracelularmente clonando moldes del gen ZNFN3A1 en un vector que contiene, por ejemplo, una unidad de transcripción de ARN pol III de ARN nuclear pequeño (ARNnp) U6 o el promotor de ARN H1 humano. Para introducir el vector en la célula, se puede usar un agente potenciador de la transfección. FuGENE (Rochediagnostices), Lipofectamin 2000 (Invitrogen), Oligofectamin (Invitrogen) y Nucleofactor (Wako pure Chemical) son útiles como agente potenciador de la transfección.
Se probó la capacidad in vitro de oligonucleótidos y oligonucleótidos complementarios a varias partes del ARNm de ZNFN3A1 de disminuir la producción de ZNFN3A1 en células tumorales (por ejemplo, usando la línea celular de carcinoma hepatocelular (CHC) Alexander y HepG2 y la línea de células de cáncer colorrectal HCT116 y SW948) según métodos estándar. Se detecta una reducción en el producto del gen ZNFN3A1 en células puestas en contacto con la composición de ARNip candidato comparado con células cultivadas en ausencia de la composición candidata usando anticuerpos específicos para ZNFN3A1 u otras estrategias de detección. Se prueban luego los efectos inhibidores de las secuencias que disminuyen la producción de ZNFN3A1 en ensayos in vitro con células o sin células sobre el crecimiento celular. Las secuencias que inhiben el crecimiento celular en un ensayo in vivo con células se prueban en ratas o ratones in vivo para confirmar la producción disminuida de ZNFN3A1 y crecimiento tumoral disminuido en animales con neoplasias malignas.
Métodos de tratar tumores malignos
Se tratan pacientes con tumores caracterizados como que sobreexpresan ZNFN3A1 mediante administración de ARNip-ZNFN3A1. Se usa terapia de ARNip para inhibir la expresión de ZNFN3A1 en pacientes que padecen o tienen riesgo de desarrollar, por ejemplo, carcinomas hepatocelulares o cáncer colorrectal. Tales pacientes se identifican por métodos estándar del tipo particular de tumor. El carcinoma hepatocelular se diagnostica por ejemplo, por agrandamiento del hígado, tomografía, ultrasonido o biopsia. El cáncer colorrectal se diagnostica, por ejemplo, por sangre en las heces, colonoscopia, sigmoidoscopia flexible, ensayo CEA, escáner TAC con enema de bario de doble contraste, tomografía o biopsia.
El tratamiento es eficaz si el tratamiento produce beneficio clínico tal como, una reducción en la expresión de ZNFN3A1 o una disminución en el tamaño, prevalencia o potencial metastásico del tumor en el sujeto. Cuando el tratamiento se aplica de forma profiláctica, “eficaz” significa que el tratamiento retrasa o previene que se formen tumores o previene o alivia un síntoma de síntoma clínico del tumor. La eficacia se determina junto con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el tipo de tumor particular.
La terapia de ARNip se lleva a cabo administrando a un paciente un ARNip mediante vectores estándar y/o sistemas de distribución de genes. Los sistemas de distribución de genes adecuados pueden incluir liposomas, sistemas de distribución mediados por receptor o vectores víricos tales como virus del herpes, retrovirus, adenovirus y virus adenoasocidos, entre otros. Una reducción en la producción de ZNFN3A1 produce una disminución en la formación de complejos de ZNFN3A1 con la proteína KIAA0054 y ARN polimerasa II o una disminución en la expresión de la proteína ZNFN3A1. Una composición terapéutica de ácido nucleico se formula en un soporte farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica también puede incluir un sistema de distribución de genes como se ha descrito anteriormente. Los soportes farmacéuticamente aceptables son vehículos biológicamente compatibles que son adecuados para la administración a un animal, por ejemplo, solución salina fisiológica. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto es una cantidad que es capaz de producir un resultado médicamente deseable tal como producción reducida de un producto del gen ZNFN3A1, reducción del crecimiento celular, por ejemplo, proliferación, o una reducción en crecimiento tumoral en un animal tratado.
Se puede usar administración parenteral, tal como las vías de administración intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal, para administrar composiciones de ARNip-ZNFN3A1. Para el tratamiento de tumores hepáticos, la infusión directa en la vena porta es útil.
La dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, el ácido nucleico particular que se va a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, estado general de salud y otros fármacos que se administran al mismo tiempo. La dosis para la administración intravenosa de ácidos nucleicos es desde aproximadamente 106 hasta 1022 copias del polinucleótido.
Los polinucleótidos se administran por métodos estándar, tal como por inyección en el espacio intersticial de tejidos tales como músculos o piel, introducción en la circulación o en cavidades corporales o por inhalación o insuflación. Los polinucleótidos se inyectan o administran de otra manera al animal con un soporte líquido farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un soporte líquido, que es acuoso o parcialmente acuoso. Los polinucleótidos se asocian con un liposoma (por ejemplo, un liposoma catiónico o aniónico). El polinucleótido incluye información genética necesaria para la expresión por una célula diana, tal como un promotor.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que el que entiende normalmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solo y no pretenden ser limitantes.
La figura 1 es una fotografía de una inmunotransferencia que muestra el efecto de los ARNip de ZNFN3A1 en la expresión de ZNFN3A1 exógena en células COS-7.
La figura 2 es una fotografía de una inmunotransferencia que muestra la expresión de la proteína ZNFN3A1 en líneas de células de hepatoma y cáncer de colon.
La figura 3 es una fotografía de una inmunotransferencia que muestra el efecto de los ARNip de ZNFN3A1 en la expresión de ZNFN3A1 endógena en células SNU475 transfectadas con los plásmidos psiU6BX-ZNFN3A1-1, -4, -12
o psiU6BX-vacio.
Las figuras 4A-B son diagramas de barras que muestran el efecto de los ARNip de ZNFN3A1 sobre el crecimiento celular en células SNU475. Se midió la viabilidad de las células transfectadas mediante ensayo con MTT, 6 (panel A) y 9 (panel B) días después de la transfección.
La figura 5 son diagramas de barras que muestran el efecto supresor del crecimiento de los ARNip de ZNFN3A1 en varias células de hepatoma y cáncer de colon humanos. Se midió la viabilidad de las células transfectadas mediante ensayo con MTT, 9 y 12 días después de la transfección.
La figura 6 es una ilustración que muestra la muerte celular en respuesta los ARNip de ZNFN3A1 en células SNU475 detectada por análisis de FACS.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el ámbito de la invención descrita en las reivindicaciones.
Líneas celulares y muestras de tejidos
Se obtuvieron las líneas de células de hepatoma humano Alexander y HepG2, las líneas de cáncer de colon humano HCT116 y SW948 y la línea de fibroblastos de mono COS7 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). La línea de células de hepatoma humano Huh7 se obtuvo de la Colección Japonesa de Biorrecursos de Investigación (JCRB). Las líneas celulares de hepatoma humano SNU398, SNU423, SNU449 y SNU475 se obtuvieron del banco de líneas celulares de Corea. Todas estas células están públicamente disponibles.
Todas la líneas celulares se hicieron crecer en monocapas en medios apropiados: medio de Eagle modificado por Dulbecco para Alexander, Huh7, HepG2 y COS7; de McCoy 5A para HCT116; de Leibovitz L-15 para SW948; RPMI1640 para SNU398, SNU423, SNU449 y SNU475 suplementados con suero bovino fetal al 10% y solución de antibióticos/antimicóticos al 1% (Sigma). Todas las células se mantuvieron a 37ºC en aire húmedo con CO2 al 5% (Alexander, Huh7, HepG2, SNU398, SNU423, SNU449, SNU475, HCT116 y COS7) o sin CO2 (SW948).
Clonación de ZNFN3A1
La clonación de ZNFN3A1 se hizo mediante PCR usando KOD-plus (TOYOBO). Para la expresión en E. coli, la región codificante de ZNFN3A1 se clonó en el sitio EcoRI-KpnI de pET21a. Para la expresión en células de mamífero, la región codificante de ZNFN3A1 se clonó en el sitio EcoRI-KpnI de pcDNA3.1 (+) y (-) (Invitrogen), sitio EcoRI-KpnI de pFLAG y sitio EcoRI-KpnI de pEGFP (Clontech). La región codificante de KIAA0054 se clonó en el sitio EcoRI-XhoI de pCMV-HA (Clontech).
Producción de anticuerpo policlonal contra ZNFN3A1
Se generó un anticuerpo policlonal de conejo anti-ZNFN3A1. Se amplificó la secuencia codificante completa de ZNFN3A1 mediante reacción de PCR usando ADNc de testículo como molde y se clonó en pET21 a (Novagen). El vector clonado se transfectó en células competentes BL21-CodonPlus® (Stratagene). La proteína recombinante ZNFN3A1 se indujo por IPTG 1,0 mM a 30ºC durante 6 horas. Se purificó la proteína de fusión His-ZNFN3A1 usando la resina Pro Bond™ (Invitrogen). Los conejos se inmunizaron diez veces con His-ZNFN3A1. La inmunotransferencia con este anticuerpo policlonal mostró una única banda de 50 kD de ZNFN3A1 etiquetada con FLAG, que era un patrón idéntico al detectado usando anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma) (datos no mostrados).
Preparación de ARN y RT-PCR
Se extrajo ARN total con reactivo Trizol (Life technologies) según el protocolo del fabricante. Se sometieron alícuotas de 10 microgramos de ARN total a transcripción inversa para ADNc monocatenario usando el cebador poli dT12-18 (Amersham Biosciences) con la transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies). Cada ADNc monocatenario se diluyó para la posterior amplificación por PCR. La RT-PCR estándar se llevó a cabo en un volumen de 20 µl de tampón de PCR (TAKARA) y se amplificó durante 4 minutos a 94ºC para desnaturalización, seguido por 20 (para GADPH) o 30 (para ZNFN3A1) ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos, en el sistema de PCR Gene Amp 9700 (Perkin-Elmer). Las secuencias de los cebadores fueron como sigue, para GADPH
directo 5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3' (SEQ ID NO: 29) e
inverso 5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3' (SEQ ID NO: 30), para ZNFN3A1
directo 5'-TTCCCGATATCAACATCTACCAG-3' (SEQ ID NO: 31) e
inverso 5'-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT-3' (SEQ ID NO: 32).
Construcción del plásmido psiU6BX6
El fragmento de ADN que codifica el ARNip se insertó en el hueco en el nucleótido 485-490 como indica (-) en la siguiente secuencia de plásmido (SEQ ID NO: 33).
Se ha descrito que el gen de ARNnp U6 se transcribe por la ARN polimerasa III, que produce transcritos cortos con uridinas en el extremo 3’. Se amplificó por PCR el fragmento genómico del gen ARNnp U6 que contiene la región promotora usando un conjunto de cebadores,
5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’ (SEQ ID No: 34), y
5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’ (SEQ ID No: 35) y ADN humano de placenta como molde. El producto se purificó y se clonó en un vector plásmido pCR usando un kit de clonación TA según el protocolo del suministrador (Invitrogen). El fragmento BamHI, XhoI que contenía el gen ARNnp U6 se purificó y clonó en el fragmento del nucleótido 1257 a 56 del plásmido pcDNA3.1(+), que se amplificó por PCR con un conjunto de cebadores, 5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’ (SEQ ID No: 36) y 5'- CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3' (SEQ ID No: 37). El ADN ligado se usó como molde de PCR con los cebadores, 5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’ (SEQ ID No: 38) y 5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’ (SEQ ID No: 39). El producto se digirió con HindIII, que posteriormente se autoligó para producir el plásmido vector psiU6BX. Para el control, se preparó psiU6BXEGFP clonando oligonucleótidos bicatenarios de 5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID No: 40) y 5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID No: 41) en el sitio BbsI en el vector psiU6BX.
Inmunotransferencia
El anticuerpo policlonal contra ZNFN3A1 se purificó previamente de suero de conejos inmunizados con proteína recombinante ZNFN3A1 etiquetada con His. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE al 10% y se inmunotransfirieron con el anticuerpo anti-ZNFN3A1. IgG de cabra anti-conejo conjugada con HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) sirvió como el anticuerpo secundario para el sistema de detección de ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). La inmunotransferencia con el anticuerpo anti-ZNFN3A1 mostró una única banda de 50 kD de ZNFN3A1 etiquetada con FLAG, que era un patrón idéntico al detectado usando anticuerpo anti-FLAG.
Ensayo con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT)
Las células se transfectaron psiU6BX-ZNFN3A1ip o plásmidos control y se mantuvieron en el medio de cultivo suplementado con concentración óptima de geneticina. De seis a doce días después de la transfección, el medio se sustituyó con medio reciente que contenía MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma) 500 µg/ml y las placas se incubaron durante cuatro horas a 37ºC. Posteriormente, las células se lisaron mediante la adición de 1 ml de HCl 0,01 N/SDS al 10% y se midió la absorbancia de los lisados con un lector de placas de ELISA a una longitud de onda de prueba de 570 nm (referencia, 630 nm). La viabilidad celular se representó por la absorbancia comparada con la de células control.
Citometría de flujo
Se determinó el efecto de ZNFN3A1 en la progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo. Las células se sembraron a una densidad de 1X105 células/placa de 100 mm. Las células se tripsinizaron en la evolución temporal determinada, se recogieron en PBS y se fijaron en etanol frío al 70%. Después de tratamiento con RNasa, las células se tiñeron con yoduro de propidio (50 µg/ml) en PBS. La citometría de flujo se realizó en un FACScan de Becton Dickinson y se analizó mediante el software CellQuest y ModFit (Verity Software House). Se determinaron los porcentajes de núcleos en las fases G0/G1, S y G2/M del ciclo celular y cualquier población sub-G1 a partir de al menos 20.000 células no restringidas.
Para examinar el papel de los ARNip-ZNFN3A1 en el ciclo celular, 1x105 células SNU475 transfectadas con plásmidos psiU6BX-ZNFN3A1 o control se recogieron por tripsinización 5 días después de la transfección. Después de fijar en etanol frío al 70%, las células se trataron con RNasa y yoduro de propidio (50 µg/ml) en PBS y se analizaron mediante un FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Se determinaron los porcentajes de células en las fases G0/G1, S y G2/M del ciclo celular y cualquier población sub-G1 a partir de al menos 20.000 células no restringidas usando el software ModFit (Verity Software House).
La secuencia codificante completa de ZNFN3A1 se amplificó con un conjunto de cebadores, 5’- GGGGTACCAGGATGGAGCCGCTGAAGGTGG-3’ (SEQ ID No: 42), y 5’-GGGAATTCTTAGGATGCTCTGATGTTGGCGTCG-3’ (SEQ ID No: 43) y se clonó en los sitios de clonación apropiados del vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen) (pcDNA-ZNFN3A1). Se prepararon plásmidos que expresaban ARNip de ZNFN3A1 mediante clonación de oligonucleótidos bicatenarios en el vector psiU6BX.
Las secuencias de nucleótidos de los ARNip se diseñaron usando un programa informático de diseño de ARNip disponible del sitio web de Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). Brevemente, las secuencias de nucleótidos para la síntesis de ARNip se seleccionan usando el siguiente protocolo.
Selección de sitios diana de ARNip
- 1.
- Empezando con el codón de iniciación AUG del transcrito ZNFN3A, rastrear en dirección 3’ para secuencias de dinucleótidos AA. La aparición de cada AA y los 19 nucleótidos adyacentes en 3’ se registran como potenciales sitios diana de ARNip. Tuschl y col. recomiendan en contra de diseñar ARNip en las regiones in traducir (UTR) 5’ y 3’ y regiones cerca del codón de iniciación (en 75 bases) ya que estas pueden ser más ricas en sitios de unión de proteínas reguladoras. Las proteínas de unión a UTR y/o complejos de iniciación de la traducción pueden interferir con la unión del complejo endonucleasa de ARNip.
- 2.
- Los potenciales sitios diana se comparan con las bases de datos genómicas apropiadas (humana, de ratón, rata, etc.) para eliminar secuencias diana con homología significativa a otras secuencias codificantes.
- 3.
- Las secuencias diana calificadas se seleccionan para síntesis. Se seleccionan varias secuencias diana en la longitud del gen para evaluación.
Los oligonucleótidos usados para los ARNip de ZNFN3A1 se muestran posteriormente. Se prepararon psiU6BXZNFN3A1 1-13 (ARNip 1-13) clonando los siguientes oligonucleótidos bicatenarios en el sitio BbsI del vector psiU6. La posición de los nucleótidos correspondientes relativa a la secuencia de ácido nucleico de ZNFN3A1 de SEQ ID NO: 1 se enumera para cada secuencia de oligonucleótidos. Cada oligonucleótido es una combinación de una secuencia de nucleótidos sentido y una secuencia de nucleótidos antisentido de la secuencia diana de ZNFN3A1. Las secuencias de nucleótidos de la estructura de horquilla con bucle y secuencia diana de ARNip 1 a 13 se muestran en SEQ ID NO: 44 a SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 69, respectivamente (los sitios de reconocimiento de endonucleasas están eliminados de cada secuencia de estructura horquilla bucle).
psiU6BX-ZNFN3A1-1/ARNip1: (números de nucleótidos 426-446 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAAACTTATGGATGGAGCACCTTTCAAGAGAAGGTGCTCCATCCATAAGTTT-3' (SEQ ID NO: 3) y 5’-AAAAAAACTTATGGATGGAGCACCTTCTCTTGAAAGGTGCTCCATCCATAAGTTT-3’ (SEQ ID NO: 4)
psiU6BX-ZNFN3A1-2/ARNip2: (números de nucleótidos 451-471 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAATCAGAGAAGCTTTACTCATTTCAAGAGAATGAGTAAAGCTTCTCTGATT-3’ (SEQ ID NO: 5) y 5’-AAAAAATCAGAGAAGCTTTACTCATTCTCTTGAAATGAGTAAAGCTTCTCTGATT-3’ (SEQ ID NO: 6)
psiU6BX-ZNFN3A1-3/ARNip3 : (números de nucleótidos 495-515 de SEQ ID No: 1) ARNip2; 5’-CACCAACAAACTGACTGAAGATAAGTTCAAGAGACTTATCTTCAGTCAGTTTGTT-3’ (SEQ ID NO: 7) y 5’-AAAAAACAAACTGACTGAAGATAAGTCTCTTGAACTTATCTTCAGTCAGTTTGTT-3' (SEQ ID NO: 8)
psiU6BX-ZNFN3A1-4/ARNip4: (números de nucleótidos 532-552 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAACTCGTAATGACATTTCAACTTCAAGAGAGTTGAAATGTCATTACGAGTT-3’ (SEQ ID NO: 9) y 5 -AAAAAACTCGTAATGACATTTCAACTCTCTTGAAGTTGAAATGTCATTACGAGTT-3’ (SEQ ID NO: 10)
psiU6BX-ZNFN3A1-5/ARNip5: (números de nucleótidos 623-643 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAAAAGTGATCTGCAACTCTTTTTCAAGAGAAAAGAGTTGCAGATCACTTTT-3’ (SEQ ID NO: 11) y 5’-AAAAAAAAGTGATCTGCAACTCTTTTCTCTTGAAAAAGAGTTGCAGATCACTTTT-3’(SEQ ID NO: 12)
psiU6BX-ZNFN3A1-6/ARNip6: (números de nucleótidos 625-645 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAAGTGATCTGCAACTCTTTCATTCAAGAGATGAAAGAGTTGCAGATCACTT-3' (SEQ ID NO: 13) y 5’-AAAAAAGTGATCTGCAACTCTTTCATCTCTTGAATGAAAGAGTTGCAGATCACTT-3’ (SEQ ID NO: 14)
psiU6BX-ZNFN3A1-7/ARNip7: (números de nucleótidos 636-656 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAACTCTTTCACCATCTGTAATTTCAAGAGAATTACAGATGGTGAAAGAGTT-3’ (SEQ ID NO: 15) y 5'-AAAAAACTCTTTCACCATCTGTAATTCTCTTGAAATTACAGATGGTGAAAGAGTT-3' (SEQ ID NO: 16)
psiU6BX-ZNFN3A1-8 /ARNip8: (números de nucleótidos 726-746 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAACTGTTCGATTGTGTTCAATTTCAAGAGAATTGAACACAATCGAACAGTT-3’ (SEQ ID NO: 17) y 5’-AAAAAACTGTTCGATTGTGTTCAATTCTCTTGAAATTGAACACAATCGAACAGTT-3’ (SEQ ID NO: 18)
psiU6BX-ZNFN3A1-9/ARNip9: (números de nucleótidos 906-926 de SE0 ID No: 1) 5’-CACCAAGGATGCTGATATGCTAACTTTCAAGAGAAGTTAGCATATCAGCATCCTT-3’ (SEQ ID NO: 19) y 5’-AAAAAAGGATGCTGATATGCTAACTTCTCTTGAAAGTTAGCATATCAGCATCCTT-3’ (SEQ ID NO: 20)
psiU6BX-ZNFN3A1-10/ARNip10: (números de nucleótidos 923-943 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAACTGGTGATGAGCAAGTATGTTCAAGAGACATACTTGCTCATCACCAGTT-3' (SEQ ID NO: 21) y 5’-AAAAAACTGGTGATGAGCAAGTATGTCTCTTGAACATACTTGCTCATCACCAGTT-3' (SEQ ID NO: 22)
psiU6BX-ZNFN3A1-11/ARNip11: (números de nucleótidos 937-957 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAAGTATGGAAGGAAGTTCAAGTTCAAGAGACTTGAACTTCCTTCCATACTT-3’ (SEQ ID NO: 23) y 5’-AAAAAAGTATGGAAGGAAGTTCAAGTCTCTTGAACTTGAACTTCCTTCCATACTT-3’ (SEQ ID NO: 24)
psiU6BX-ZNFN3A1-12/ARNip12: (números de nucleótidos 1065-1085 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAACATCTACCAGCTGAAGGTGTTCAAGAGACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3’ (SEQ ID NO: 25) y 5’-AAAAAACATCTACCAGCTGAAGGTGTCTCTTGAACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3’ (SEQ ID NO: 26)
psiU6BX-ZNFN3A1-13/ARNip13: (números de nucleótidos 1258-1278 de SEQ ID No: 1) 5’-CACCAAGCAATGAAGAATCTGAGACTTCAAGAGAGTCTCAGATTCTTCATTGCTT-3’ (SEQ ID NO: 27) y 5’-AAAAAAGCAATGAAGAATCTGAGACTCTCTTGAAGTCTCAGATTCTTCATTGCTT-3’ (SEQ ID NO: 28)
Se transfectaron plásmidos psiU6BX-ZNFN3A1ip o psiU6BX-vacios con pcDNA-ZNFN3A1 en células COS7 usando el reactivo FuGENE6 según las recomendaciones del suministrador (Roche). Los plásmidos se transfectaron únicamente en células SNU479 que expresan una cantidad abundante de ZNFN3A1 endógena. Se lisaron extractos enteros de las células 2 días después de la transfección y se utilizaron para análisis de inmunotransferencia.
Entre los 13 plásmidos de expresión diferentes que expresan los ARNip de ZNFN3A1, psiU6BX-ZNFN3A1-8, -12 y 13 redujeron lo más significativamente la expresión de ZNFN3A1 exógena mediante análisis de inmunotransferencia, cuando se transfectaron en células COS7 junto con pcDNA-ZNFN3A1. Entre otros plásmidos, psiU6BX-ZNFN3A1-4 mostró marcada reducción y psiU6BX-ZNFN3A1-2, -5, -6, -7 y -10 ejercieron supresión moderada, mientras que psiU6BX-ZNFN3A1-1, -3, -9 y -11 tuvieron poco o ningún efecto sobre la expresión (figura 1). Para examinar adicionalmente la actividad iARN de los ARNip de ZNFN3A1, se transfectaron psiU6BXZNFN3A1-1, -4, -12 o psiU6BX-ZNFN3A1-vacío en células SNU475 que expresan una cantidad abundante de ZNFN3A1 (figura 2). El análisis por inmunotransferencia usando los extractos de las células transfectadas demostró una reducción marcada de ZNFN3A1 endógena por psiU6BX-ZNFN3A1-12 y supresión moderada por psiU6BXZNFN3A1-4 comparada con células transfectadas con psiU6BX-ZNFN3A1-vacío. Por otra parte la transfección con psiU6BX-ZNFN3A1-1 no afectó a la expresión de ZNFN3A1 (figura 3).
Para probar si la supresión de ZNFN3A1 podía producir supresión de crecimiento de células de hepatoma, se transfectaron células SNU475 con psiU6BX-ZNFN3A1-12, el vector que demostró el mayor efecto de disminución en la expresión; psiU6BX-ZNFN3A1-4 que demostró un efecto de silenciamiento moderado; psiU6BX-ZNFN3A1-1 que no demostró efecto de silenciamiento o psiU6BX-vacío. Los ensayos con MTT tanto a 6 días como a 9 días de transfección mostraron que psiU6BX-ZNFN3A1-12 tenía el mayor efecto de inhibición de crecimiento y que psiU6BX-ZNFN3A1-1 no cambió el número de células supervivientes comparadas con las células transfectadas con psiU6BX-vacío (figura 4). El efecto inhibidor del crecimiento se correlacionó con su actividad silenciadora de genes. Para demostrar adicionalmente el efecto inhibidor de crecimiento de los ARNip-ZNFN3A1, psiU6BX-ZNFN3A1-12; psiU6BX-EGFP Para el control se preparó psiU6BX-EGFP clonando el siguiente oligonucleótido bicatenario 5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID No: 40) y 5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID No: 41) en el sitio BbsI del vector psiU6BX.
o psiU6BX-vacío se transfectó en varias líneas celulares de hepatoma incluyendo SNU398, SNU423, SNU449, Huh7, Alexander y HepG2 y dos líneas celulares de cáncer de colon, SW948 y HCT116. La transfección de psiU6BX-ZNFN3A1-12 redujo significativamente el número de células supervivientes comparado con la de psiU6BXEGFP o psiU6BX-vacío (figura 5). Además, el análisis por FACS demostró que la transfección de psiU6BXZNFN3A1-12 aumentó el número de células en fase subG1 (figura 6). Estos resultados indican que ZNFN3A1 contribuye al crecimiento y/o supervivencia celular anormal en una amplia gama de células cancerosas humanas.
Los presentes inventores han mostrado que el crecimiento celular se suprime por ARN interferentes pequeños (ARNip) que se dirigen específicamente al gen ZNFN3A1. De esta manera, estos nuevos ARNip son dianas útiles para el desarrollo de medicamentos anticancerosos. Por ejemplo, los agentes que bloquean la expresión de ZNFN3A1 o previenen su actividad pueden encontrar utilidad terapéutica como agentes anticancerosos, particularmente agentes anticancerosos para el tratamiento de cáncer de hígado o cáncer de colon, tal como CHC o adenocarcinoma colorrectal.
Mientras que la invención se ha descrito en detalle y con referencia a formas de realización específicas de la misma, será aparente para el experto en la materia que se pueden hacer varios cambios y modificaciones en la misma sin separarse del ámbito de la invención.
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Claims (16)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1 para su uso en tratar un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1 en un sujeto, en donde dicho ARNip comprende un ácido nucleico ZNFN3A1 sentido y un ácido nucleico ZNFN3A1 antisentido, y en donde dicho ARNip es específico para una diana de ZNFN3A1 seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, en donde dicho ARNip de ZNFN3A1 tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.
-
- 2.
- Uso de una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1 en un sujeto, en donde dicho ARNip comprende un ácido nucleico ZNFN3A1 sentido y un ácido nucleico ZNFN3A1 antisentido, y en donde dicho ARNip es específico para una diana de ZNFN3A1 seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, en donde dicho ARNip de ZNFN3A1 tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.
-
- 3.
- La composición para uso de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en donde dicho ARNip tiene la fórmula general 5’-[A]-[B]-[A’]-3’, en donde [A] es una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1,
[B] es una secuencia de ribonucleótidos que consiste en de 3 a 23 nucleótidos, y [A’] es una secuencia de ribonucleótidos que consiste en la secuencia complementaria de [A]. -
- 4.
- La composición para uso de la reivindicación 3 o el uso de la reivindicación 3, en donde dicha composición comprende un agente potenciador de la transfección.
-
- 5.
- Un polinucleótido para el uso en el tratamiento de un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1, en donde el polinucleótido comprende una combinación de un ácido nucleico de cadena sentido y un ácido nucleico de cadena antisentido, en donde dicho ácido nucleico de cadena sentido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, y dicho ácido nucleico de cadena antisentido consiste en la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, en donde dicho polinucleótido es un oligonucleótido que tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.
-
- 6.
- El polinucleótido para uso de la reivindicación 5, en donde dichos ácido nucleico de cadena sentido y ácido nucleico de cadena antisentido están en la misma cadena.
-
- 7.
- Un vector para uso en el tratamiento de un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1, en donde el vector comprende un polinucleótido que comprende una combinación de secuencia de un ácido nucleico de cadena sentido y un ácido nucleico de cadena antisentido, en donde dicho ácido nucleico de cadena sentido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, y dicho ácido nucleico de cadena antisentido consiste en la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, en donde dicho polinucleótido es un oligonucleótido que tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.
-
- 8.
- El vector para uso de la reivindicación 7, en donde dicho polinucleótido tiene la fórmula general 5’-[A]-[B]-[A’]3’, en donde [A] es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1,
[B] es una secuencia de nucleótidos que consiste en de 3 a 23 nucleótidos, y [A’] es una secuencia de nucleótidos que consiste en la secuencia complementaria de [A]. -
- 9.
- Una composición para uso en el tratamiento de un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1, en donde la composición comprende al menos un ARNip que comprende una combinación de un ácido nucleico de cadena sentido y un ácido nucleico de cadena antisentido, en donde dicho ácido nucleico de cadena sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, y dicho ácido nucleico de cadena antisentido consiste en la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, en donde dicho ARNip tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.
-
- 10.
- Una molécula bicatenaria para su uso en el tratamiento de un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1, en donde la molécula bicatenaria comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de ZNFN3A1, y en donde la cadena antisentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que es
complementaria a dicha cadena sentido, en donde dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido hibridan entre sí para formar dicha molécula bicatenaria, en donde dicha molécula bicatenaria, cuando se introduce en una célula que expresa el gen ZNFN3A1, inhibe la expresión de dicho gen, y en donde dicha secuencia diana de ZNFN3A1 se selecciona del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, y dicha molécula bicatenaria es un oligonucleótido de entre 19 y 25 nucleótidos de longitud. -
- 11.
- La molécula bicatenaria para uso de la reivindicación 10, en donde un único transcrito de ribonucleótidos comprende la cadena sentido y la cadena antisentido, dicha molécula bicatenaria comprende además una secuencia monocatenaria de ribonucleótidos que une dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido.
-
- 12.
- Un vector que codifica la molécula bicatenaria de la reivindicación 10 o 11, para uso de la reivindicación 10.
-
- 13.
- El vector para uso de la reivindicación 12, en donde el vector codifica un transcrito que tiene una estructura secundaria, en donde el transcrito comprende la cadena sentido y la cadena antisentido.
-
- 14.
- El vector para uso de la reivindicación 13, en donde el transcrito comprende además una secuencia monocatenaria de ribonucleótidos que une dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido.
-
- 15.
- La composición para uso de la reivindicación 1 o 11, el uso de la reivindicación 2, el polinucleótido para uso de la reivindicación 5, el vector para uso de la reivindicación 7 o la molécula bicatenaria para uso de la reivindicación 10, en donde dicho tumor es un cáncer colorrectal o cáncer de hígado.
-
- 16.
- La composición para uso, el uso, el polinucleótido para uso, el vector para uso o la molécula bicatenaria para uso de la reivindicación 15, en donde
- (a)
- el cáncer colorrectal es un adenocarcinoma; o
- (b)
- el cáncer de hígado es un carcinoma hepatocelular.
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