ES2837085T3

ES2837085T3 - Secuencias de oligonucleótidos que se dirigen al factor de transcripción TSC22D4 para el tratamiento de la resistencia a la insulina

Info

Publication number: ES2837085T3
Application number: ES16704222T
Authority: ES
Inventors: Stephan Herzig; Diaz Mauricio Berriel; Tobias Schafmeier
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2016-02-12
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2036-02-12
Also published as: JP2018513841A; WO2016150618A1; US10676739B2; CA2979115A1; BR112017016021A2; RU2017131900A3; CN107278229A; US20200255834A1; MX2017012231A; EP3072969A1; KR20170128348A; US20180023078A1; EP3274455B1; US11053499B2; RU2017131900A; EP3274455A1; DK3274455T3; RU2723091C2

Abstract

Un inhibidor de la expresión de TSC22D4 que es un ácido ribonucleico de interferencia, que comprende al menos una de las siguientes secuencias: 5'- GGACGUGUGUGGAUGUUUA-3' (SEQ ID No. 1); 5 5'- GGAUGUUUACGAGAGAGAU-3' (SEQ ID No. 3); 5'- AGUCCCACCUCAUGUUUGC-3' (SEQ ID No. 5); o una secuencia antisentido de las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencias de oligonucleótidos que se dirigen al factor de transcripción TSC22D4 para el tratamiento de la resistencia a la insulina

La presente invención se refiere a inhibidores de oligonucleótidos de la actividad o expresión de TSC22D4 y sus usos para la prevención, tratamiento y/o regulación de la resistencia a la insulina, síndrome metabólico y/o diabetes y/o para mejorar la sensibilidad a la insulina en un mamífero.

Antecedentes de la invención

En los seres humanos, una combinación de almacenamiento excesivo de lípidos y disminución de la eliminación conduce a sobrepeso y comorbilidades asociadas, incluida la resistencia a la insulina, complicaciones cardiovasculares y dislipidemia (Langin D. In and out: adipose tissue lipid turnover in obesity and dyslipidemia. Cell Metab. 2011 Nov 2; 14 (5): 569-70), que ahora afecta a más de 1,5 billones de personas en todo el mundo (Finucane MM, y otros. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 91 million participants. Lancet. 2011 Feb 12; 377 (9765): 557-67). De hecho, la resistencia a la insulina representa el componente central del llamado síndrome metabólico, que en última instancia conduce al desarrollo de disfunción metabólica, tal como intolerancia a la glucosa, insuficiencia de las células beta pancreáticas y, finalmente, diabetes tipo 2.

La secreción deficiente de insulina (células beta), el aumento de la producción de glucosa hepática (hígado) y la disminución de la utilización de glucosa periférica (músculo) constituyen los defectos primarios tradicionales responsables del desarrollo y progresión de la diabetes mellitus tipo 2. Ahora se sabe que la insuficiencia de las células beta, que en última instancia conduce a una disminución de la secreción de insulina, ocurre mucho antes en la historia natural de la diabetes tipo 2 de lo que se creía originalmente. Además, una mejor comprensión de la fisiopatología de la diabetes tipo 2 revela otros mecanismos etiológicos más allá de la tríada clásica, ahora conocida como el octeto ominoso. Además de las células beta, el hígado y el músculo, otros mecanismos patogénicos incluyen resistencia a la insulina de los adipocitos (aumento de la lipólisis), secreción/sensibilidad reducida de incretinas (gastrointestinal), aumento de la secreción de glucagón (células alfa), reabsorción de glucosa mejorada (riñón), y resistencia a la insulina del sistema nervioso central resultante de la disfunción de neurotransmisores (cerebro). Actualmente, el tratamiento de la diabetes tipo 2 se centra en el control de la glucosa mediante la disminución de la glucosa en sangre (en ayunas y pospandrial) y la hemoglobina A (lc). Sin embargo, el objetivo de la terapia debe ser retrasar la progresión de la enfermedad y el eventual fracaso del tratamiento. El tratamiento se debe dirigir a las alteraciones patogénicas conocidas de la enfermedad (es decir, reducir el deterioro de la función de las células beta y mejorar la sensibilidad a la insulina). En los últimos años, las estrategias de tratamiento se han centrado en el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas que afectan a muchos de los defectos que contribuyen a la diabetes tipo 2 y que proporcionan un control duradero de la glucosa a través de una reducción de la progresión de la enfermedad. El manejo óptimo de la diabetes tipo 2 debe incluir el inicio temprano de la terapia utilizando múltiples fármacos, con diferentes mecanismos de acción, en combinación (DeFronzo rA. (Current issues in the treatment of type 2 diabetes. Overview of newer agents: where treatment is going. Am J Med. 2010 Mar; 123 (3 Suppl): S38-48).

Especialmente la insensibilidad de los principales órganos metabólicos contra la acción de la insulina, incluidos el hígado, el músculo esquelético y el tejido adiposo, contribuye sustancialmente a la progresión de la enfermedad y a la necesidad última de intervención farmacológica para prevenir las complicaciones tardías de la diabetes. Por tanto, la sensibilización a la insulina eficaz y segura sigue siendo un objetivo atractivo y un objetivo en la terapia antidiabética.

Los complejos de cofactores transcripcionales se han identificado como puntos de control importantes en la coordinación de programas metabólicos en varios tejidos, lo que incluye el hígado y el tejido adiposo blanco (WAT) (para una revisión, véase Sommerfeld A, Krones-Herzig A, Herzig S. Transcriptional cofactors and hepatic energy metabolism. Mol Cell Endocrinol. 2011 Jan 30; 332 (1-2): 21-31).

Kester HA y otros. (en: Transforming growth factor-beta-stimulated clone-22 is a member of a family of leucine zipper proteins that can homo- and heterodimerize and has transcriptional repressor activity. J Biol Chem. 1999 Sep 24; 274 (39): 27439-47) describen que el clon 22 estimulado por TGF-beta (TSC-22) codifica una proteína que contiene cremallera de leucina que está altamente conservada durante la evolución.

Además, Jones y otros. (en Jones, A., y otros, Transforming growth factor-betal Stimulated Clone-22 D4 is a molecular output of hepatic wasting metabolism. EMBO Mol Med. 2013 Feb; 5 (2): 294-308) describen que, como vía de salida de la caquexia molecular, los niveles hepáticos del clon 22 D4 estimulado por el factor de crecimiento transformante del factor de transcripción beta 1 (TSC) aumentaron en la caquexia por cáncer. La imitación de altos niveles caquécticos de TSC22D4 en hígados sanos condujo a la inhibición de la liberación de VLDL hepática y genes lipogénicos, y disminuyó los niveles sistémicos de VLDL tanto en condiciones dietéticas normales como altas en grasas. Por lo tanto, la actividad de TSC22D4 hepática puede representar un fundamento molecular para la privación de energía periférica en sujetos con enfermedades de desgaste metabólico, incluida la caquexia por cáncer.

Kulozik, Ph. y otros. (Hepatic deficiency in transcriptional co-factor TBLI promotes liver steatosis and hypertriglyceridemia. 2011 Cell Metab. 13: 389-400) describen que la alteración de la expresión hepática del cofactor transcripcional transducina tipo beta 1 (TBL) representa una característica común de los modelos de ratón con hígado graso mono y multigénico. La ablación específica del hígado de la expresión del gen TBL1 en ratones sanos promovió hipertrigliceridemia y esteatosis hepática tanto en condiciones dietéticas normales como altas en grasas. Como se encontró que los niveles de expresión de TBL1 también se correlacionan inversamente con el contenido de grasa hepática en pacientes humanos, la falta de actividad del cofactor hepático TBL1/TBLR1 puede representar un fundamento molecular para la esteatosis hepática en sujetos con obesidad y síndrome metabólico.

Berriel Diaz, M. y otros. (Nuclear receptor co-factor RIP140 controls lipid metabolism during wasting in mice. 2008. Hepatology 48: 782-791) describen que al prevenir la movilización de los depósitos de TG hepáticos, la inducción de RIP140 en el hígado proporciona un fundamento molecular para la esteatosis hepática en casos de inanición, sepsis o caquexia por cáncer. La inhibición de la actividad transcripcional de RIP140 hepática podría, por lo tanto, proporcionar un esquema adjunto atractivo en el tratamiento de estas afecciones.

Farese y otros. (en: The problem of establishing relationships between hepatic steatosis and hepatic insulin resistance. Cell Metab. 2012 May 2; 15 (5): 570-3) describen que el depósito excesivo de grasa en el hígado (esteatosis hepática) suele ir acompañado de resistencia a la insulina hepática.

Las principales clases de fármacos antidiabéticos y/o sensibilizantes a la insulina incluyen sulfonilureas, metformina, tiazolidina dionas, inhibidores de la alfa-glucosidasa, miméticos de incretinas e inhibidores de la dipeptidil-peptidasa 4, todos los cuales están asociados con limitaciones graves (para una revisión, véase Moller, Metabolic disease drug discovery- "hitting the target" is easier said than done. Cell Metab. 2012 Ene 4; 15(1): 19-24).

A pesar del papel clave de la resistencia a la insulina en la patogénesis de la diabetes tipo 2, todavía faltan sensibilizadores a la insulina eficaces y seguros. De hecho, los fármacos actuales de la familia de las tiazolidinediona muestran un perfil de eficacia moderada y se acompañan de efectos secundarios sustanciales, que incluyen aumento de peso, aumento del riesgo de insuficiencia cardíaca, posible aumento del riesgo de cáncer de vejiga y aumento del riesgo de infarto de miocardio, por ejemplo, que conduce a la reciente retirada del mercado de rosig-litazona.

El documento WO 2013/076501 divulga un procedimiento de cribado para identificar agentes útiles en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada con la resistencia a la insulina y/o la intolerancia a la glucosa, que comprende el paso de investigar la capacidad de un agente de prueba para inhibir la vía de señalización de Vps34 y/o la vía de señalización de RhoIota3Kappa-02beta. De manera similar, WO 2005/059564 divulga un procedimiento para escanear moléculas que modulan la actividad de la proteína de unión al retinol 4 (RBP4) y se describe su uso en el tratamiento de la resistencia a la insulina. También se describen procedimientos para diagnosticar la resistencia a la insulina y afecciones relacionadas mediante la detección de la modulación de la actividad de RBP4.

El documento WO 2012/158123 se refiere a un procedimiento para tratar o prevenir el síndrome de resistencia a la insulina en el cuerpo de un animal mediante la administración de un inhibidor del gen quinasa del retículo endoplásmico similar al ARN de la proteína quinasa (PERK), o una variante funcional de la misma, o un inhibidor de la proteína PERK o una variante funcional de la misma o un procedimiento para reducir la actividad de los factores de transcripción de la familia FOXO (Foxo 1, 3a, 4 y 6) mediante la administración de un inhibidor del gen quinasa del retículo endoplásmico similar al ARN de la proteína quinasa (PERK), o una variante funcional del mismo, o un inhibidor de la proteína PERK o una variante funcional de la misma.

El documento WO 2014/202602 generalmente se refiere a moduladores, en particular inhibidores, de la actividad o expresión de TSC22D4 y sus usos para la prevención, tratamiento y/o regulación de la resistencia a la insulina, síndrome metabólico y/o diabetes y/o para mejorar la sensibilidad a la insulina en un mamífero. WO 2014/202602 se refiere además a procedimientos de cribado para identificar estos moduladores.

Si bien se ha demostrado que la eliminación experimental mediante la entrega viral de construcciones de shARN o miARN dirigidas por TSC22D4 mejora eficientemente el estado metabólico de los animales diabéticos, las construcciones de siARN adecuadas para la eliminación eficiente y específica de TSC22D4 en varias especies tras la administración mediante diferentes tecnologías aún no ha sido identificado.

En vista de los defectos descritos anteriormente en la técnica anterior, el objetivo de la presente invención es proporcionar una nueva estrategia terapéutica para prevenir, tratar y/o regular la resistencia a la insulina, el síndrome metabólico y/o la diabetes y/o mejorar la sensibilidad a la insulina.

En un primer aspecto de la presente invención, el objetivo anterior se resuelve proporcionando un inhibidor de la expresión y/o actividad biológica de TSC22D4 que es un ácido ribonucleico de interferencia, que comprende al menos una de las siguientes secuencias: 5'-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3' (s Eq ID No. 1); 5'-GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3' (SEQ ID No. 3); 5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3' (SEQ ID No. 5); o una secuencia antisentido del mismo. m mGj

mhD4-siARN1: (NM 030935.3 siARN 1024; ORF)

Sentido: 5'-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3' (SEQ ID No. 1);

Antisentido: 5'-UAAACAUCCACACACGUCCdTdT -3' (SEQ ID No. 2)

GC: 47 % (c/s TT-saliente)

mD4-siARN2: (NM 023910.6 siARN 993; ORF)

Sentido: GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3' (SEQ ID No. 3)

Antisentido: AUCUCUCUCGUAAACAUCCdTdT -3' (SEQ ID No. 4)

GC: 42,1 % (c/s TT-saliente)

mhD4-siARN3:

Sentido: 5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3' (SEQ ID No. 5);

Antisentido: 5'- GCAAACAUGAGGUGGGACUdTdT -3' (SEQ ID No. 6);

GC: 52,6 % (c/s TT-saliente)

Recientemente, los inventores han demostrado que el clon 22 D4 (TSC22D4) estimulado por el factor de crecimiento transformante beta1 del regulador transcripcional controla la sensibilidad a la insulina hepática y sistémica. La pérdida específica de TSC22D4 del hígado mejoró significativamente la tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina y contrarrestó la hiperinsulinemia en ratones de tipo salvaje. El análisis de ChlP-Seq del cistroma de TSC22D4 en combinación con estudios de transcriptoma de alto rendimiento del TSC22D4 diana en animales sanos reveló que los principales nodos de la vía de señalización de la insulina se dirigieron directa o indirectamente por TSC22D4, sobre todo lipocalina 13.

De hecho, la regulación baja o la sobreexpresión de TSC22D4 en hepatocitos primarios de ratón, así como en ratones de tipo salvaje, condujo a la regulación alta o baja de la vía de señalización de la insulina intracelular, determinada mediante la fosforilación de la quinasa Akt/PKB en Ser473 y de GSK3beta en Ser9, en respuesta a la exposición aguda a la insulina, respectivamente. Curiosamente, la inactivación hepática de TSC22D4 en ratones db/db diabéticos mejoró la intolerancia a la glucosa y la resistencia a la insulina en estos animales y normalizó la glucosa en sangre a niveles casi saludables. En congruencia con una mejora general del estado metabólico en animales diabéticos, los niveles circulantes de citocinas proinflamatorias y resistina fueron significativamente más bajos en ratones con deficiencia de TSC22D4 específica del hígado.

La inactivación de TSC22D4 en células de hepatoma no aumentó el crecimiento celular, sino que disminuyó la proliferación, lo que sugiere que la función de sensibilización a la insulina de TSC22D4 no da como resultado una mayor susceptibilidad al cáncer en las células u órganos afectados. Además, la inactivación hepática de TSC22D4 tampoco provocó hipoglucemia.

Un "inhibidor" es una sustancia que puede reducir la eficacia de un catalizador en una reacción catalizada (ya sea un catalizador no biológico o una enzima). En el contexto de la presente invención, un inhibidor es un oligonucleótido.

El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido ribonucleico de interferencia (ARNi). El término "oligonucleótido" generalmente se refiere a un polímero de nucleótidos monocatenario formado por más de 19 subunidades de nucleótidos unidas covalentemente entre sí. Preferentemente, están presentes entre 19 y 100 unidades de nucleótidos, con la máxima preferencia entre 19 y 50 unidades de nucleótidos que se unen entre sí, como también se explica más adelante.

Se prefiere el inhibidor de acuerdo con la presente invención, en el que el ácido ribonucleico de interferencia es un ácido ribonucleico de interferencia pequeño (siARN) o ácido ribonucleico de horquilla pequeño (shRNA) o micro ácido ribonucleico (miRNA) o combinaciones de los mismos.

Se prefiere además el inhibidor de acuerdo con la presente invención, en el que el siARN tiene una longitud de entre 19 y 30 nucleótidos.

En un aspecto, el agente bioactivo utiliza "ARN de interferencia (ARNi)". El ARNi es un procedimiento de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia que se inicia mediante ARN bicatenario (dsARN) o siARN. El ARNi se ve en varios organismos como Drosophila, nemátodos, hongos y plantas, y se cree que participa en la defensa antiviral, la modulación de la actividad de los transposones y la regulación de la expresión génica. Durante el ARNi, el dsARN o siARN inducen la degradación del ARNm diana con la consecuente inhibición específica de secuencia de la expresión génica. Como se usa en la presente memoria, un "ARN de interferencia pequeño" (siARN) es un dúplex de nucleótidos de ARN que se dirige al gen de TSC22D4. Un "dúplex de ARN" se refiere a la estructura formada por el apareamiento complementario entre dos regiones de una molécula de ARN. El siARN se "dirige" a un gen porque la secuencia de nucleótidos de la porción dúplex del siARN es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen diana. En algunas realizaciones, la longitud del dúplex del siARN es menor de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el dúplex puede tener 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la longitud del dúplex es de 19-25 nucleótidos de longitud. La porción dúplex de ARN del siARN puede ser parte de una estructura de horquilla. Además de la parte dúplex, la estructura de horquilla puede contener una parte de bucle situada entre las dos secuencias que forman el dúplex. El bucle puede variar en longitud. En algunas realizaciones, el bucle tiene una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 nucleótidos. La estructura de horquilla también puede contener partes salientes 3' y/o 5'. En algunas realizaciones, el saliente es un saliente 3' y/o 5' de 0, 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. El siARN se puede codificar por una secuencia de ácido nucleico y la secuencia de ácido nucleico también puede incluir un promotor. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir una señal de poliadenilación. En algunas realizaciones, la señal de poliadenilación es una señal de poliadenilación mínima sintética.

Como se usa en la presente memoria, el término "siARN" se refiere a un ácido ribonucleico (ARN) que comprende entre aproximadamente 19 y 50 nucleótidos (o análogos de nucleótidos) capaces de dirigir o mediar la vía de interferencia del ARN. Estas moléculas pueden variar en longitud y pueden contener diversos grados de complementariedad a su ARNm diana en la cadena antisentido. El término "siARN" incluye dúplex de dos cadenas separadas, es decir, doble cadena

de ARN, así como hebras simples que pueden formar estructuras en horquilla que comprenden una región dúplex. El siARN puede tener una longitud de entre aproximadamente 19 y 50 nucleótidos, o entre aproximadamente 25 y 50 nucleótidos, o entre aproximadamente 30 y 50 nucleótidos, o entre aproximadamente 35 y 50 nucleótidos, o entre aproximadamente 40 y 50 nucleótidos. En una realización, el siARN tiene una longitud de entre 19 y 30 nucleótidos.

La aplicación de siARN para regular negativamente la actividad de su ARNm diana se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la degradación del ARNm se produce cuando la hebra antisentido, o hebra guía, del siARN dirige el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que contiene el ARN de la endonucleasa Ago2 para escindir su ARNm diana que lleva una secuencia complementaria. Por consiguiente, el siARN puede ser complementario a cualquier porción de longitudes variables en el gen PERK. El siARN también puede ser complementario de la hebra sentido y/o la hebra antisentido del gen TSC22D4. Por consiguiente, el tratamiento con siARN se puede usar para silenciar el gen TSC22D4, agotando así la proteína TSC22D4 corriente abajo.

El término "shARN", como se usa en la presente memoria, se refiere a un ARN unimolecular que es capaz de realizar ARNi y que tiene una hebra pasajera, un bucle y una hebra guía. La hebra pasajera y la hebra guía pueden ser sustancialmente complementarios entre sí. El término "shARN" también puede incluir ácidos nucleicos que contienen restos distintos de los restos de ribonucleótidos, que incluye, entre otros, nucleótidos modificados, enlaces internucleotídicos modificados, no nucleótidos, desoxinucleótidos y análogos de los nucleótidos.

Los miARN regulan negativamente sus ARNm diana. El término "miARN" generalmente se refiere a una molécula monocatenaria, pero en realizaciones específicas, también puede abarcar una región o una cadena adicional que es parcialmente (entre el 10 % y el 50 % complementaria a lo largo de la cadena), sustancialmente (mayor que el 50 % pero menos del 100 % complementario a lo largo de la cadena) o completamente complementario a otra región de la misma molécula monocatenaria o a otro ácido nucleico. Por tanto, los ácidos nucleicos pueden abarcar una molécula que comprende una o más hebras complementarias o autocomplementarias o "complementos" de una secuencia particular que comprende una molécula. Por ejemplo, el miARN precursor puede tener una región autocomplementaria, que es hasta un 100 % complementaria. Las sondas de miARN o ácidos nucleicos de la invención pueden incluir, pueden ser o pueden ser al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementario a su diana.

Con la máxima preferencia es el inhibidor de acuerdo con la presente invención, en el que el siARN tiene una hebra sentido que consiste en una secuencia: de acuerdo con las SEQ ID No. 1, 3 o 5 o una secuencia antisentido de la misma.

Otro aspecto se refiere a un vector recombinante, que comprende un oligonucleótido de acuerdo con la presente invención. Generalmente, el oligonucleótido se inserta en un vector de expresión, tal como un plásmido, para su expresión. Si es necesario, el oligonucleótido se puede unir a las secuencias de nucleótidos de control reguladores de la transcripción y la traducción apropiadas que se reconocen por el huésped deseado, aunque tales controles están generalmente disponibles en el vector de expresión. Luego, el vector se introduce en el hospedero mediante técnicas estándares.

Los vectores que expresan el siARN dentro de células de mamíferos suelen utilizar un promotor de ARN polimerasa III para impulsar la expresión de un ARN en horquilla corta que imita la estructura de un siARN. El inserto que codifica esta horquilla está diseñado para tener dos repeticiones invertidas separadas por una secuencia espadadora corta. Una repetición invertida es complementaria del ARNm al que se dirige el siARN. Una cadena de timidinas que se adicionan al extremo 3' sirve como sitio de terminación de la transcripción de la pol III. Una vez dentro de la célula, el vector expresa constitutivamente el ARN en horquilla, que induce el silenciamiento del gen diana.

Otros vectores adecuados incluyen vectores virales, tales como virus adenovirales, retrovirales y lentivirales o los respectivos sistemas de expresión (véase, por ejemplo Catanotto, D. y otros (2002) Functional siRNA expression from transfected PCR products. RNA 8, 1454-1460; Barton, GM y otros (2002) Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (23): 14943-5. Abbas-Terki, T. y otros (2002) Lentiviral-mediated RNA interference. Hum.Gene Ther. 13, 2197-2201y Xia, H. y otros. (2002) siRNA-mediate gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol.20,1006-1010).

Generalmente, el vector no transformará todos los hospederos. Por lo tanto, será necesario seleccionar células hospederas transformadas. Una técnica de selección involucra incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN, con cualquier elemento de control necesario, que codifica un rasgo que se selecciona en la célula transformada, tal como la resistencia a los antibióticos. Alternativamente, el gen para tal rasgo seleccionable puede estar en otro vector, que se usa para co-transformar la célula huésped deseada. Las células hospederas que han sido transformadas por el oligonucleótido de la invención luego se cultivan durante un tiempo suficiente y en condiciones apropiadas conocidas por los expertos en la técnica en vista de las enseñanzas divulgadas en la presente memoria para permitir la expresión del polipéptido, que luego se puede recuperar.

Otros ejemplos se pueden encontrar en la literatura, por ejemplo, en Yang J. y otros. (Design, preparation and application of nucleic acid delivery carriers." Biotechnol Adv. 2014 Jul-Ago; 32 (4): 804-17).

Cada una de las clases de ácidos nucleicos que se describen en la presente memoria (por ejemplo, los oligonucleótidos y/o los vectores) se puede introducir en las células mediante varios procedimientos. En la transfección mediada por lípidos, las células absorben complejos no covalentes entre el ácido nucleico y un reactivo lipídico o polimérico mediante endocitosis. La electroporación utiliza un breve pulso eléctrico para provocar interrupciones o agujeros en la membrana plasmática de las células a través de la cual ingresa el ácido nucleico. Ambos procedimientos administran con éxito cualquiera de los ácidos nucleicos de ARNi que se esperan de los vectores virales. La entrega del vector viral solo ocurre mediante infección de células con el virus correspondiente, usualmente usando virus auxiliares. La infección con virus de la línea celular deseada introduce el siARN o shARN y anula la expresión génica.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una célula recombinante, preferentemente una célula hepatocítica recombinante, que comprende un oligonucleótido de acuerdo con la presente invención, o un vector recombinante de acuerdo con la presente invención. Una "célula" de acuerdo con la invención puede ser una célula procariota o eucariota. Una "célula" de acuerdo con la invención es preferentemente seleccionada, sin limitarse a ella, de células hepáticas. Las células de mamífero pueden ser preferentemente seleccionadas de un ser humano, conejo, ratón o rata. Preferentemente, la célula es una célula humana, por ejemplo, una célula hepatocítica. El término "célula" también incluye células de un modelo animal. Además, una célula puede formar parte de un cultivo de tejidos.

Se divulga un procedimiento para producir una composición farmacéutica, que comprende las etapas de formular dicho al menos un inhibidor de acuerdo con la presente invención con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. El vehículo y/o excipiente de la composición farmacéutica deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de la misma.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, que comprende al menos uno del inhibidor de acuerdo con la presente invención, el vector recombinante de acuerdo con la presente invención y la célula recombinante de acuerdo con la presente invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se prefiere una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, en la que dicha composición farmacéutica es para administración por vía oral, rectal, transmucosal, transdérmica, intestinal, parenteral, intramuscular, intratecal, directa intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular o subcutánea.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al inhibidor de acuerdo con la presente invención, el vector de expresión de acuerdo con la presente invención, la célula recombinante de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para su uso en la prevención, regulación y/o tratamiento de enfermedades.

El síndrome de resistencia a la insulina constituye un amplio espectro clínico y se define como cualquier anomalía asociada con la resistencia a la insulina. Anormalidades como la resistencia a la insulina, diabetes, hipertensión, dislipidemia y enfermedad cardiovascular constituyen el síndrome de resistencia a la insulina.

El síndrome de resistencia a la insulina puede ser resistencia a la insulina inducida por la dieta y/o resistencia a la insulina inducida por la obesidad. La resistencia a la insulina inducida por la dieta significa que la resistencia a la insulina se induce por una dieta rica en grasas saturadas y carbohidratos. La resistencia a la insulina inducida por obesidad significa que la resistencia a la insulina se induce por una predisposición genética a la obesidad o la obesidad que se debe a los hábitos alimentarios.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al inhibidor de acuerdo con la presente invención, el vector de expresión de acuerdo con la presente invención, la célula recombinante de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para su uso en la prevención, regulación y/o tratamiento de una enfermedad que se selecciona de resistencia a la insulina, hipertensión, dislipidemia, enfermedad de las arterias coronarias, síndrome metabólico y/o diabetes tipo 1 o 2, y/o para mejorar la sensibilidad a la insulina, tal como, por ejemplo, la sensibilidad a la insulina en el contexto de una enfermedad tumoral. Preferentemente, el síndrome de resistencia a la insulina es la resistencia a la insulina inducida por la dieta y/o la resistencia a la insulina inducida por la obesidad.

Se divulga un procedimiento para tratar y/o prevenir una enfermedad seleccionada de resistencia a la insulina, síndrome metabólico y/o diabetes en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención a dicho paciente que lo necesite.

Los procedimientos divulgados se pueden usar para tratar una cualquiera de las siguientes afecciones que son provocadas por el síndrome de resistencia a la insulina: resistencia a la insulina, hipertensión, dislipidemia, diabetes de tipo 2 o enfermedad de las arterias coronarias.

El término "prevención" en el contexto de la presente invención se debe entender como una intervención médica que tiene como objetivo evitar la ocurrencia de un evento negativo que muy probablemente conduce al empeoramiento de la condición de un paciente que tiene una enfermedad, o a la lesión o la muerte de un sujeto sano y/o enfermo. El "paciente que lo necesita" puede ser, sin limitarse a ello, cualquier animal o ser humano que padezca una enfermedad relacionada con el síndrome de resistencia a la insulina, especialmente resistencia a la insulina, hipertensión, dislipidemia, diabetes tipo 2 o enfermedad de las arterias coronarias. Preferentemente, el sujeto que lo necesita es un ser humano.

El objeto se resuelve además mediante un kit terapéutico para su uso en la prevención, regulación y/o tratamiento de una enfermedad, en el que dicho kit comprende el inhibidor de acuerdo con la presente invención, el vector recombinante de acuerdo con la presente invención, la célula recombinante de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, opcionalmente juntos con tampones y excipientes e instrucciones adecuadas para su uso, en el que dicha enfermedad se selecciona de resistencia a la insulina, hipertensión, dislipidemia, enfermedad de las arterias coronarias, síndrome metabólico y/o diabetes tipo 1 o 2, y/o en el que el uso comprende mejorar la sensibilidad a la insulina, opcionalmente para mejorar la sensibilidad a la insulina en el contexto de una enfermedad tumoral

Recientemente, los inventores han demostrado que el clon 22 D4 (TSC22D4) estimulado por el factor de crecimiento transformante beta 1 del reguladortranscripcional controla la sensibilidad a la insulina hepática y sistémica. La pérdida específica de TSC22D4 del hígado mejoró significativamente la tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina y contrarrestó la hiperinsulinemia en ratones de tipo salvaje. El análisis de ChlP-Seq del cistroma de TSC22D4 en combinación con estudios de transcriptoma de alto rendimiento del TSC22D4 diana en animales sanos reveló que los principales nodos de la vía de señalización de la insulina se dirigieron directa o indirectamente por TSC22D4, sobre todo lipocalina 13. De hecho, la regulación baja o la sobreexpresión de TSC22D4 en hepatocitos primarios de ratón, así como en ratones de tipo salvaje, condujo a la regulación alta o baja de la vía de señalización de la insulina intracelular, determinada mediante la fosforilación de la quinasa Akt/PKB en Ser473 y de GSK3beta en Ser9, en respuesta a la exposición aguda a la insulina, respectivamente.

Curiosamente, la inactivación hepática de TSC22D4 en ratones db/db diabéticos mejoró la intolerancia a la glucosa y la resistencia a la insulina en estos animales y normalizó la glucosa en sangre a niveles casi saludables. En congruencia con una mejora general del estado metabólico en animales diabéticos, los niveles circulantes de citocinas proinflamatorias y resistina fueron significativamente más bajos en ratones con deficiencia de TSC22D4 específica del hígado.

La inactivación de TSC22D4 en células de hepatoma no aumentó el crecimiento celular sino más bien disminuyó la proliferación, lo que sugiere que la función de sensibilización a la insulina de TSC22D4 no da como resultado una mayor susceptibilidad al cáncer en las células/o ansas afectadas. Además, la inactivación hepática de TSC22D4 tampoco provocó hipoglucemia.

Si bien se ha demostrado que la eliminación experimental mediante la entrega viral de construcciones de shARN o miARN dirigidas por TSC22D4 mejora eficientemente el estado metabólico de los animales diabéticos, las construcciones de siARN adecuadas para la eliminación eficiente y específica de TSC22D4 en varias especies tras la administración mediante diferentes tecnologías aún no ha sido identificado. Para superar este problema, los inventores han identificado, probado funcionalmente y validado varios estudios de eliminación de siARN dirigidos contra la secuencia de ARNm de TSC22D4 in vitro usando Hepa1,6 murino así como células de hepatoma Huh7 humano como se divulga en la presente memoria.

Las siguientes figuras, secuencias y ejemplos sirven simplemente para ilustrar la invención y no deben interpretarse como que restringen el ámbito de la invención a las realizaciones particulares de la invención descritas en los ejemplos.

La Figura 1 muestra la eficacia de eliminación de los siARN seleccionados, codificados por colores, dirigidos a TSC22D4 en células de hepatoma murino. Se muestran los niveles relativos de ARNm. Todas las demás secuencias de siARN probadas no mostraron ninguna caída significativa de TSC22D4 en estos experimentos (no mostrados).

La Figura 2 muestra la eficacia de eliminación de mhD4-siARN1 tras la transfección en células de hepatoma Hepa1-6 murino hacia TSC22D4 murino. Se muestran los niveles relativos de ARNm.

La Figura 3 muestra la eficacia de eliminación de mhD4-siARN1 tras la transfección en células de hepatoma Huh7 humano hacia TSC22D4 humano. Se muestran los niveles relativos de ARNm.

Núms. de ID de secuencia. 1 a 6 muestran secuencias de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención.

Ejemplos

Virus recombinantes

Los adenovirus que expresan un TSC22D4 o un shARN no específico bajo el control del promotor U6, o el ADNc de TSC22D4 bajo el control del promotor CMV se clonaron usando el sistema de expresión BLOCK-iT Adenoviral RNAi (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Los virus se purificaron mediante el procedimiento del cloruro de cesio y se dializaron contra tampón salino tamponado con fosfato que contenía glicerol al 10 % antes de la inyección en animales, como se describió anteriormente (Herzig S, Hedrick S, Morantte I, Koo SH, Galimi F, Montminy M. CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPAR-gamma. Nature. 2003; 426: 190-193. Herzig S, Long F, Jhala US, Hedrick S, Quinn R, Bauer A, Rudolph D, Yoon C, Puigserver P, Spiegelman B, y otros. CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature. 2001; 413: 179-183). Los AAV que codifican el control o los miARN específicos de TSC22D4 bajo el control de un promotor específico de hepatocitos se establecieron como se describió anteriormente (Rose AJ, Frosig C, Kiens B, Wojtaszewski JF, Richter EA. Effect of endurance exercise training on Ca2+ calmodulin-dependent protein kinase II expression and signaling in skeletal muscle of humans. J Physiol. 2007; 583: 785-795).

Experimentos con animales

Se obtuvieron ratones C57Bl/6 machos de 8-12 semanas de edad y db/db de 10 semanas de Charles River Laboratories (Bruselas, Bélgica) y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h con una dieta regular sin restricciones. Antes de las pruebas de tolerancia a la insulina y la glucosa, los animales se mantuvieron en ayunas durante 4 h. De lo contrario, los animales se alimentaron ad libitum y tuvieron libre acceso al agua. Para inyecciones de adenovirus, se administraron 1-2 * 109 unidades formadoras de placa (ufp) por virus recombinante mediante inyección en la vena de la cola. Para experimentos AAV, se inyectaron 5 * 1011 virus a través de la vena de la cola. En cada experimento, de 6-12 animales recibieron tratamientos idénticos y se analizaron en ayunas (18 horas de ayuno), alimentados al azar o alimentados (18 horas de ayuno seguido de 6 horas de realimentación) como se indica. Los órganos, incluidos el hígado, las almohadillas de grasa abdominal y epididimaria y los músculos gastrocnemio, se recogieron después de períodos de tiempo específicos, se pesaron, se congelaron y se utilizaron para análisis adicionales. El contenido de grasa corporal total se determinó mediante un analizador de composición corporal Echo MRI (Echo Medical Systems, Houston, EE. UU.). La manipulación y experimentación de animales se realizó de acuerdo con las pautas de los NIH y se aprobó por las autoridades locales.

Para las pruebas de tolerancia a la insulina se preparó una solución madre de 1U de insulina/ml utilizando cloruro de sodio al 0,9 %. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas antes del experimento. Se determinó el peso corporal de todos los animales y se midieron los niveles de glucosa en sangre cortando la cola con una cuchilla de afeitar. La gota de sangre se colocó en una tira de glucómetro y se midió. Se inyectó 1 U de insulina/kg de peso corporal a C57Bl/6 y se inyectaron 1,5 U de insulina/kg de peso corporal a ratones db/db por vía intraperitoneal. Los niveles de glucosa en sangre se controlaron después de 20, 40, 60, 80 y 120 min.

Para las pruebas de tolerancia a la glucosa se preparó una solución madre de glucosa al 20 % usando cloruro de sodio al 0,9 %. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas antes del experimento. Se determinó el peso corporal de todos los animales y se midieron los niveles de glucosa en sangre cortando la cola con una cuchilla de afeitar. La gota de sangre se colocó en una tira de glucómetro y se midió. Se inyectaron 5 pl por gramo de solución de glucosa al 20 % a ratones C57B1/6 y db/db por vía intraperitoneal. Los niveles de glucosa en sangre se controlaron después de 20, 40, 60, 80 y 120 min.

RT-PCR cuantitativa de Taqman

El ARN total se extrajo de lisados de células o hígado de ratón homogeneizados usando reactivo Qiazol (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADNc se preparó mediante transcripción inversa utilizando la enzima M-MuLV y el cebador Oligo dT (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania). Los ADNc se amplificaron usando kits de ensayo a pedido y un detector de secuencias ABIPRISM 7700 (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Los datos de expresión de ARN se normalizaron a los niveles de ARN de la proteína de unión a la caja TATA (TBP).

La expresión de ARNm de TSC22D4 humano se midió mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real en un ciclador de temperatura fluorescente utilizando el ensayo TaqMan, y se detectó la fluorescencia en un detector de secuencia ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). El ARN total se aisló usando TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY), y se realizó una transcripción inversa de 1 |jg de ARN con reactivos estándar (Life Technologies, Grand Island, NY). De cada RT-PCR, se amplificaron 2 j l en una reacción de PCR de 26 j l usando el kit de reactivos Brilliant SYBR green QPCR Core de stratagene (La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se incubaron en el detector de secuencia ABI PRISM 7000 para una desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de PCR, cada ciclo que consiste en 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 minuto. La expresión de ARNm de TSC22D4 y Obp2a (LCN13) humanos (determinada por Hs00229526_m1 y Hs01062934_g1, respectivamente) (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) se calculó en relación con la expresión de ARNm de hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1), determinada mediante un ensayo premezclado de demanda para HPRT1 (Hs01003267_m1) (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). La amplificación de transcriptos específicos se confirmó mediante la fusión de los perfiles de la curva (enfriando la muestra a 68 °C y calentando lentamente a 95 °C con medición de fluorescencia) al final de cada PCR. La especificidad de la PCR se verificó además sometiendo los productos de amplificación a electroforesis en gel de agarosa.

Análisis de proteínas

La proteína se extrajo de muestras de órganos congelados o de hepatocitos cultivados en tampón de lisis celular (Rose AJ, Frosig C, Kiens B, Wojtaszewski JF, Richter EA. Effect of endurance exercise training on Ca2+ calmodulindependent protein kinase II expression and signaling in skeletal muscle of humans. J Physiol. 2007; 583: 785-795) y se cargaron 20 jg de proteína en geles de SDS-poliacrilamida al 4-12 % y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Los ensayos de transferencia Western se realizaron como se describe (Herzig y otros, 2001) utilizando anticuerpos específicos para TSC22D4 (Abcam, Cambridge, Reino Unido o Sigma, Munich, Alemania), AKT, p-AKT, GSK, p-GSK (Cell signaling, Danvers, EE. UU.) o VCP (Abcam).

Plásmidos y ARN de interferencia

Para los experimentos de shARN, se clonaron oligonucleótidos dirigidos a ratón y TSC22D4 (SEQ ID No. 1, 3 y 5) en el vector shARN pENTR/U6 (Invitrogen).

Ensayos de cultivo celular y transfección transitoria

Los hepatocitos primarios de ratón se aislaron y cultivaron como lo describió (Klingmuller U, Bauer A, Bohl S, Nickel PJ, Breitkopf K, Dooley S, Zellmer S, Kern C, Merfort I, Sparna T, y otros. Primary mouse hepatocytes for systems biology approaches: a standardized in vitro system for modelling of signal transduction pathways. IEE Proc Syst Biol.

2006; 153: 433-447). Brevemente, se anestesiaron ratones C57Bl/6 machos de 8-12 semanas de edad mediante inyección ip de hidrocloruro de ketamina 100 mg/kg de peso corporal y de hidrocloruro de xilazina 5 mg/Kg de peso corporal. Después de abrir la cavidad abdominal, el hígado se perfundió a 37 °C con HANKS I (8 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 3,57 g de Hepes, 0,06 g de Na2HPO4 x 2 H2O, 0,06 g KH2PO4 en 1 L de H2O destilada, EGTA2,5 mM, glucosa al 0,1 %, ajustado a pH 7,4) a través de la vena porta durante 5 min y posteriormente con HANKS II (8 g NaCl, 0,4 g KCl, 3,57 g Hepes, 0,06 g Na2HPO4 x 2 H2O, 0,06 g KH2PO4 en 1 L de H2O destilada, glucosa al 0,1 %, 3 mg/ml de colagenasa CLSII, CaCl 5 mM2, ajustado a pH 7,4) durante 5-7 min hasta que se observó la desintegración de la estructura del hígado. Se retiró la cápsula de hígado y se filtró la suspensión celular a través de una malla de 100 jm . Las células se lavaron y, posteriormente, se determinó la viabilidad de las células mediante tinción con azultripán. Se sembraron 1.000.000 de células vivas/pocillo en placas de seis pocillos recubiertas de colágeno I. Después de 24 h, las células se infectaron con adenovirus recombinantes con una multiplicidad de infección de 100. Para los experimentos de estimulación, los hepatocitos primarios se trataron con PBS (medio de control) o insulina a una concentración de 100 nM/6 pocillos durante 10 minutos. Las células se recolectaron 48 h después de la infección.

Análisis de cistroma de TSC22D4 hepático

El análisis de la ruta KEGG de los resultados de la secuenciación en chips se clasificaron por significancia. Se encontró que la vía de señalización de la insulina estaba significativamente regulada (p = 0,00005). La secuenciación en chip se realizó en extractos de hígado de ratones C57Bl/6 macho inyectados con adenovirus de ADNc de Flag-TSC22D4 7 días después de la inyección.

Resultados

Las secuencias funcionaron de manera muy eficiente tanto para el TSC de ratón como para el humano, como se ve en 4 experimentos independientes (véase Figuras). Hay un saliente de dTdT inespecífico adjunto a cada secuencia. Las secuencias coincidían tanto con la secuencia de TSC de ratón como con la humana al 100 %.

En base a estos resultados, las secuencias de acuerdo con la presente invención (SEQ ID No. 1, 3 y 5) se eligieron como candidatas primarias para su uso con fines terapéuticos, ya que muestra una eficacia de eliminación superior

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de la expresión de TSC22D4 que es un ácido ribonucleico de interferencia, que comprende al menos una de las siguientes secuencias:

5'- GGACGUGUGUGGAUGUUUA-3' (SEQ ID No. 1);

5'- GGAUGUUUACGAGAGAGAU-3' (SEQ ID No. 3);

5'- AGUCCCACCUCAUGUUUGC-3' (SEQ ID No. 5);

o una secuencia antisentido de las mismas.

2. El inhibidor de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ácido ribonucleico de interferencia es un ácido ribonucleico de interferencia pequeño (siARN) o ácido ribonucleico de horquilla pequeño (shARN) o ácido micro ribonucleico (miARN) o combinaciones de los mismos.

3. El inhibidor de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el siARN tiene una longitud de entre 19 y 30 nucleótidos.

4. El inhibidor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el siARN consiste en una secuencia:

de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID No. 1, 3 o 5.

5. Un vector recombinante, que comprende un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Una célula recombinante, preferentemente una célula hepatocítica recombinante, que comprende un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una composición farmacéutica, que comprende al menos uno del inhibidor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 y la célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicha composición farmacéutica es para administración por vía oral, rectal, transmucosal, transdérmica, intestinal, parenteral, intramuscular, intratecal, directa intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular o subcutánea.

9. El inhibidor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, la célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para su uso en la prevención, regulación y/o tratamiento de enfermedades.

10. El inhibidor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, la célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha enfermedad se selecciona de resistencia a insulina, hipertensión, dislipidemia, enfermedad de las arterias coronarias, síndrome metabólico y/o diabetes tipo 1 o 2, y/o para mejorar la sensibilidad a la insulina, tal como por ejemplo la sensibilidad a la insulina en el contexto de una enfermedad tumoral.

11. El inhibidor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, la célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el síndrome de resistencia a la insulina es la resistencia a la insulina inducida por la dieta y/o resistencia a la insulina inducida por obesidad.

12. Un kit terapéutico para su uso en la prevención, regulación y/o tratamiento de una enfermedad, en el que dicho kit comprende el inhibidor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, la célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 u 8,

opcionalmente junto con tampones y excipientes adecuados e instrucciones para su uso,

en el que dicha enfermedad se selecciona de resistencia a la insulina, hipertensión, dislipidemia, enfermedad de las arterias coronarias, síndrome metabólico y/o diabetes tipo 1 o 2, y/o en el que el uso comprende mejorar la sensibilidad a la insulina, opcionalmente para mejorar la sensibilidad a la insulina en el contexto de una enfermedad por tumor.