KR20170128348A

KR20170128348A - 인슐린 내성의 치료를 위한 전사 인자 tsc22d4를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR20170128348A
Application number: KR1020177026584A
Authority: KR
Inventors: 스테판 헤르지크; 디아즈 마우리치오 베르릴; 토비아스 샤프마이어
Original assignee: 도이체스크레브스포르슝스젠트룸스티프퉁데스외펜트리헨레크츠
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2016-02-12
Publication date: 2017-11-22
Also published as: EP3274455A1; RU2017131900A; US20200255834A1; CN107278229A; WO2016150618A1; CA2979115A1; MX2017012231A; US10676739B2; DK3274455T3; JP2018513841A; EP3274455B1; EP3072969A1; US11053499B2; ES2837085T3; BR112017016021A2; RU2017131900A3; US20180023078A1; RU2723091C2

Abstract

본 발명은 TSC22D4 활성 또는 발현의 올리고뉴클레오타이드 억제제, 및 포유동물에서, 인슐린 내성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병의 예방, 치료 및/또는 조절, 및/또는 인슐린 민감성의 개선을 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

인슐린 내성의 치료를 위한 전사 인자 TSC22D4를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 서열

인간에서, 과량의 지질 저장 및 감소된 제거의 조합은 과체중 및 관련된 동반이환(co-morbidity), 예컨대 인슐린 내성, 심혈관 합병증 및 이상지혈증(문헌[Langin D. In and out: adipose tissue lipid turnover in obesity and dyslipidemia, Cell Metab. 2011 Nov 2; 14(5):569-70])을 야기하고, 현재 전세계적으로 150억 초과의 사람들에게 영향을 준다(문헌[Finucane MM, et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 91 million participants. Lancet. 2011 Feb 12; 377(9765):557-67]). 실제로, 인슐린 내성은 소위 대사 증후군의 핵심 요소를 나타내고, 궁극적으로 대사성 장애, 예컨대 내당능, 췌장 베타 세포 부전, 및 결과적으로 제2형 당뇨병의 발생을 야기한다.

손상된 인슐린 분비(베타 세포), 증가된 간의 포도당 생산(간) 및 감소된 말초(근육) 포도당 이용은 제2형 진성 당뇨병의 발생 및 진행을 야기하는 전통적인 주요 결함을 구성한다. 궁극적으로 감소된 인슐린 분비를 야기하는 베타-세포 부전은 원래 믿어졌던 것보다 제2형 당뇨병의 자연적인 생장에서 훨씬 조기에 발생하는 것으로 현재 공지되어 있다. 또한, 제2형 당뇨병의 병리생리학의 보다 양호한 이해는 전통적인 3중주 이론(triad)을 넘어서는 다른 병인 기전을 밝혀냈고, 현재 당뇨병 8중주 이론(the ominous octet)으로 지칭된다. 베타 세포, 간 및 근육 이외에, 다른 병원성 기전은 지방세포 인슐린 내성(증가된 지방분해), 감소된 인크레틴 분비/민감성(위장), 증가된 글루카곤 분비(알파 세포), 강화된 포도당 재흡수(신장) 및 신경전달물질 기능장애로부터 유발되는 중추신경계 인슐린 내성(뇌)을 포함한다. 현재, 제2형 당뇨병의 관리는 혈당(금식 및 식후) 및 헤모글로빈 A(1c)의 저하에 의한 포도당 제어에 초점을 맞춘다. 그러나, 치료법의 목적은 질병 진행 및 결과적인 치료 실패를 지연시키는 것이어야 한다. 치료는 질병의 공지된 병원성 혼란을 표적으로 하여야 한다(즉, 베타 세포 기능의 악화를 감소시키고 인슐린 민감성을 개선하여야 한다). 최근 수년간, 치료 전략은 제2형 당뇨병에 기여하는 많은 결함에 영향을 주고 질병 진행의 둔화를 통해 지속가능한 포도당 제어를 제공하는 신규한 치료 옵션의 개발에 초점을 맞추었다. 제2형 당뇨병의 최적 관리는 상이한 작용 기전을 갖는 다수의 약물을 병용으로 사용하는 치료법의 조기 개시를 포함하여야 한다(문헌[DeFronzo RA. Current issues in the treatment of type 2 diabetes. Overview of newer agents: where treatment is going. Am J Med. 2010 Mar;123(3 Suppl):S38-48]).

특히, 인슐린 작용에 대한 주요 대사 기관, 예컨대 간, 골격근 및 지방 조직의 둔감성은 질병 진행, 및 당뇨병성 만성 합병증을 예방하기 위한 약리학적 조정을 위한 궁극적인 요구에 실질적으로 기여한다. 따라서, 효율적이고 안전한 인슐린 민감화가 매력적인 표적으로 남아있고, 항-당뇨병 요법의 목적이다.

전사 보조-인자 복합체는 다양한 조직, 예컨대 간 및 백색 지방 조직(WAT)에서의 대사 프로그램의 조정에서 중요한 체크포인트로서 확인되었다(검토를 위하여, 문헌[Sommerfeld A, Krones-Herzig A, Herzig S. Transcriptional co-factors and hepatic energy metabolism. Mol Cell Endocrinol. 2011 Jan 30;332(1-2):21-31]을 참고한다).

문헌[Kester HA, et al., Transforming growth factor-beta-stimulated clone-22 is a member of a family of leucine zipper proteins that can homo- and heterodimerize and has transcriptional repressor activity. J Biol Chem. 1999 Sep 24;274(39):27439-47]은 TGF-베타-자극된 클론-22(TSC-22)가 발생 중에 고도로 보전되는 류신 지퍼-함유 단백질을 코팅하는 것으로 기술한다.

또한, 문헌[Jones et al., Transforming growth factor-beta1 Stimulated Clone-22 D4 is a molecular output of hepatic wasting metabolism. EMBO Mol Med. 2013 Feb; 5(2):294-308]은 분자 악액질 배설 경로로서, 전사 인자 형질전환 성장 인자 베타 1-자극된 클론(TSC) 22 D4의 간 수준이 암 악액질에서 증가되었음을 기술한다. 건강한 간에서의 TSC22D4의 높은 악액질 수준을 모방하는 것은 간 VLDL 방출 및 지방형성 유전자의 억제, 및 정상 및 고지방 식이 조건 둘 다에서의 감소된 전신 VLDL 수준을 야기하였다. 따라서, 간 TSC22D4 활성은 대사 소모성 질병, 예컨대 암 악액질을 갖는 대상에서의 말초 에너지 상실에 대한 분자의 이론적 해석을 나타낼 수 있다.

문헌[Kulozik, Ph., et al., Hepatic deficiency in transcriptional co-factor TBLI promotes liver steatosis and hypertriglyceridemia. 2011 Cell Metab. 13: 389-400]은 전사 보조-인자 트랜스듀신 베타-유사(TBL) 1의 손상된 간 발현이 단유전자 및 다유전자 지방 간 마우스 모델의 통상적인 특징을 나타냄을 기술한다. 건강한 마우스에서의 TBL1 유전자 발현의 간-특이적인 절제는 정상 및 고지방 식이 조건 둘 다에서의 고중성지질혈증 및 간 지방증을 촉진하였다. TBL1 발현 수준이 또한 인간 환자에서의 간 지방 함량과 반비례 관계가 있는 것으로 밝혀졌으므로, 간 TBL1/TBLR1 보조-인자 활성의 결핍은 비만 및 대사 증후군을 갖는 환자에서의 간 지방증에 대한 분자의 이론적 해석을 나타낼 수 있다.

문헌[Berriel Diaz, M., et al., Nuclear receptor co-factor RIP140 controls lipid metabolism during wasting in mice. 2008. Hepatology 48: 782-791]은 간 TG 스토어의 가동화를 방지함으로써, 간에서의 RIP140의 유도가 기아, 패혈증 또는 암 악액질에 대한 분자의 이론적 해석을 제공함을 기술한다. 이에 의해, 간 RIP140 전사 활성화의 억제는 이러한 병태의 치료에서 매력적인 부가 방안을 제공할 수 있다.

문헌[Farese et al., The problem of establishing relationships between hepatic steatosis and hepatic insulin resistance. Cell Metab. 2012 May 2;15(5):570-3]은 간에서의 지방의 과량의 침착(간 지방증)이 간 인슐린 내성에 의해 빈번하게 수반됨을 기술한다.

항-당뇨병 및/또는 인슐린 민감화 약물의 주요 부류는 설포닐 우레아, 메트포민, 티아졸리딘 다이온, 알파-글루코시다제 억제제, 인크레틴 모방제 및 다이펩티딜-펩티다제 4 억제제(이들 모두는 심각한 제한과 관련됨)를 포함한다(검토를 위하여 문헌[Moller, Metabolic disease drug discovery- "hitting the target" is easier said than done. Cell Metab. 2012 Jan 4;15(1):19-24]을 참고한다).

제2형 당뇨병의 병인론에서 인슐린 내성의 중요한 역할에도 불구하고, 효과적이고 안전한 인슐린 민감화제는 여전히 모자란다. 실제로, 티아졸리딘다이온 계열의 현재 약물은 중간의 효능 프로파일을 나타내고, 실질적인 부작용, 예컨대 체중 증가, 심부전의 증가된 위험, 가능한 방광암의 증가된 위험 및 심근경색의 증가된 위험을 수반하고, 예컨대 로시글리타존의 최근의 시장 철수를 야기하였다.

국제특허공개 제2013/076501호는 Vps34 신호전달 경로 및/또는 RhoIota3Kappa-02beta 신호전달 경로를 억제하는 시험 약품의 용량을 조사하는 단계를 포함하는, 인슐린 내성 및/또는 내당능과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방에 유용한 약품을 확인하기 위한 선별 방법을 개시한다. 유사하게, 국제특허공개 제2005/059564호는 레티놀 결합 단백질 4(RBP4)의 활성을 조절하는 분자를 스캐닝하는 방법을 개시하고, 인슐린 내성의 치료에서 이의 용도를 기술한다. RBP4 활성의 조절을 검출함으로써, 인슐린 내성 및 관련 병태를 진단하는 방법이 또한 기술된다.

국제특허공개 제2012/158123호는 단백질 키나제 RNA-유사 세포질 망상구조 키나제(PERK) 유전자의 억제제 또는 이의 기능적 변이체, 또는 PERK 단백질의 억제제 또는 이의 기능적 변이체를 투여함으로써, 동물 신체의 인슐린 내성 증후군을 치료하거나 예방하는 방법, 또는 단백질 키나제 RNA-유사 세포질 망상구조 키나제(PERK) 유전자의 억제제 또는 이의 기능적 변이체, 또는 PERK 단백질의 억제제 또는 이의 기능적 변이체를 투여함으로써, FOXO 계열(Foxo 1, 3a, 4 및 6)의 전사 인자의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

국제특허공개 제2014/202602호는 일반적으로 TSC22D4 활성 또는 발현의 조절제, 특히 억제제, 및 포유동물에서, 인슐린 내성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병의 예방, 치료 및/또는 조절을 위한, 및/또는 인슐린 민감성의 개선을 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 국제특허공개 제2014/202602호는 또한 이러한 조절제를 확인하기 위한 선별 방법에 관한 것이다.

TSC22D4-지향 shRNA 또는 miRNA 구축물의 바이러스성 전달에 의한 실험적인 녹다운(knockdown)이 당뇨병에 걸린 동물의 대사 상태를 효율적으로 개선함이 입증되었지만, 상이한 기술에 의한 전달시 다양한 종에서 TSC22D4의 효율적이고 특이적인 녹다운에 적합한 siRNA 구축물은 아직 확인되지 않았다.

배경기술의 상기 결함에 비추어, 본 발명의 목적은 인슐린 내성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병을 예방하고/거나 치료하고/거나 조절하고/거나, 인슐린 민감성을 개선하기 위한 신규한 치료 전략을 제공하는 것이다.

본 발명의 제1 양상에서, 상기 목적은 하기 서열 중 하나 이상을 포함하는, 간섭 리보핵산, PNA(단백질 핵산) 또는 LNA(잠금 핵산)인 올리고뉴클레오타이드로부터 선택되는 TSC22D4의 발현 및/또는 생물학적 활성의 억제제, 이의 안티센스 서열 또는 이의 기능적 변이체를 제공함으로써 해결된다:

5'-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3' (서열번호 1);

5'-GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3' (서열번호 2);

5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3' (서열번호 3).

mhD4-siRNA1: (NM_030935.3_siRNA_1024; ORF)

센스: 5'-GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3' (서열번호 1);

안티센스: 5'-UAAACAUCCACACACGUCCdTdT-3' (서열번호 4);

GC: 47%(w/o TT-오버행).

mD4-siRNA2: (NM_023910.6_siRNA_993; ORF)

센스: GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3' (서열번호 2);

안티센스: AUCUCUCUCGUAAACAUCCdTdT-3' (서열번호 5);

GC: 42.1% (w/o TT-오버행).

mhD4-siRNA3:

센스: 5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3' (서열번호 3);

안티센스: 5'-GCAAACAUGAGGUGGGACUdTdT-3' (서열번호 6);

GC: 52.6% (w/o TT-오버행).

최근에, 본 발명자들은 전사 조절자 형질전환 성장 인자 베타1 자극된 클론 22 D4(TSC22D4)가 간 및 전신 인슐린 민감성을 제어하는 것을 발견하였다. TSC22D4의 간 특이적 손실은 야생형 마우스에서, 내당능 및 인슐린 민감성을 유의하게 개선하였고, 고인슐린혈증을 중화시켰다. 건강한 동물에서의 고 처리량 TSC22D4 표적 전사체 연구와 조합되는 TSC22D4 시스트롬의 ChlP-Seq 분석은 인슐린 신호전달 경로의 주요 노드(node)가 TSC22D4, 가장 현저하게는 리포칼린 13에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 표적화됨을 나타냈다.

실제로, 1차 마우스 간세포 및 야생형 마우스에서의 TSC22D4의 하향-조절 또는 과발현은, 각각 급성 인슐린 노출에 반응하여, Ser473에서의 Akt/PKB 키나제 및 Ser9에서의 GSK3beta의 인산화에 의해 측정되는 바와 같이, 세포간 인슐린 신호전달 경로의 상향-조절 또는 하향-조절을 야기하였다. 흥미롭게도, 당뇨병 db/db 마우스에서 TSC22D4의 간 불활성화는 이들 동물에서의 내당능 및 인슐린 내성을 개선하였고, 혈당을 거의 건강한 수준까지 정상화시켰다. 당뇨병에 걸린 동물에서 대사 상태의 전반적인 개선과 함께, 전-염증성 사이토킨 및 레시스틴의 순환 수준은 간-특이적 TSC22D4 결핍을 갖는 마우스에서 유의하게 저하되었다.

TSC22D4-지향 shRNA 또는 miRNA 구축물의 바이러스성 전달에 의한 실험적인 녹다운이 당뇨병에 걸린 동물의 대사 상태를 효율적으로 개선하는 것으로 입증되었지만, 상이한 기술에 의한 전달시 다양한 종에서 TSC22D4의 효율적이고 특이적인 녹다운에 적합한 siRNA 구축물은 아직 확인되지 않았다.

간암 세포에서 TSC22D4의 불활성화는 세포 성장을 증가시키지 않았지만, 오히려 증식을 감소시켰고, 이는 TSC22D4의 인슐린 민감화 기능이 병에 걸린 세포 또는 기간의 증가된 암 감수성을 야기하지 않음을 시사한다. 또한, TSC22D4의 간 불활성화는 저혈당증을 야기하지도 않는다.

"억제제"는 촉매화된 반응에서 촉매(비-생물학적 촉매 또는 효소)의 효능을 감소시킬 수 있는 물질이다. 본원에 언급된 억제제는 효소의 활성의 효율을 감소시킬 수 있고, 또한 본원에 언급된 억제제는 효소의 발현의 효율을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 바람직한 억제제는 올리고뉴클레오타이드이다.

용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 간섭 리보핵산(iRNA), 단백질 핵산(PNA) 또는 잠금 핵산(LNA)을 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 함께 공유적으로 접합된 19개 초과의 뉴클레오타이드 아단위로 이루어진 단일-가닥 뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 바람직하게는, 19 내지 100개의 뉴클레오타이드 단위가 존재하고, 가장 바람직하게는 19 내지 50개의 뉴클레오타이드 단위가 또한 하기 설명된 바와 같이 함께 접합된다.

뉴클레오타이드 아단위의 당 기는 리보스, 데옥시리보스 또는 이의 변형된 유도체, 예컨대 2'-0-메틸 리보스일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 아단위는 포스포다이에스터 연결기, 포스포로티오에이트 연결기, 메틸 포스포네이트 연결기, 또는 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 제공하지 않는 드물게 발생하거나 자연적으로 발생하지 않는 연결기에 의해 접합될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 통상적이지 않은 뉴클레오타이드 또는 비-뉴클레오타이드 잔기를 가질 수 있다.

용어 "올리고뉴클레오타이드"는 또한, 명세서의 맥락에서, 당해 분야에 공지된 핵산 유사체, 예를 들어 잠금 핵산(LNA), 또는 이들의 혼합물을 지칭할 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 천연-발생 핵염기, 당 및 뉴클레오사이드간(골격) 연결기로 구성되는 올리고뉴클레오타이드, 및 유사하게 기능하거나 개선된 특이적 기능을 갖는 비-천연-발생 부분을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 완전히 또는 부분적으로 변형되거나 치환된 올리고뉴클레오타이드는 종종, 이러한 올리고뉴클레오타이드의 여러 바람직한 특성, 예컨대 세포 막을 침투하는 능력, 세포외 및 세포내 뉴클레아제에 대한 양호한 내성, 핵산 표적에 대한 높은 친화도 및 특이성에 기인하여, 천연 형태보다 바람직하다. 이러한 방식에 의한 올리고뉴클레오타이드의 변형 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

일부 올리고뉴클레오타이드(종종 올리고뉴클레오타이드 모방체로 지칭됨)에서, 뉴클레오타이드 단위의 당 및 뉴클레오사이드간 연결기(즉, 골격) 둘 다는 새로운 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 하나의 이러한 올리고머성 화합물이 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 올리고뉴클레오타이드 모방체는 단백질 핵산(PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-골격은 아미드-함유 골격, 구체적으로 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵염기가 보유되고, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.

추가 변형은 2'-하이드록실 기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되고, 이에 의해 이환형 당 잔기를 형성하는 잠금 핵산(LNA)을 포함한다. 연결기는 바람직하게는 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 가교하는 메틸렌(-CH₂-)_n 기(이때, n은 1 또는 2임)이다. 용어 "LNA"는 일반적으로 하나의 이환형 뉴클레오사이드 유사체를 함유하는 뉴클레오타이드(LNA 단량체로도 지칭됨), 또는 하나 이상의 이환형 뉴클레오사이드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.

간섭 리보핵산이 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 작은 헤어핀 리보핵산(shRNA), 마이크로 리보핵산(miRNA) 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 억제제가 바람직하다.

19 내지 30개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 본 발명에 따른 억제제가 더욱 바람직하다.

하나의 양상에서, 생체활성제는 "RNA 간섭(RNAi)"을 이용한다. RNAi는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 또는 siRNA에 의해 개시되는 서열-특이적 전사후 유전자 침묵 공정이다. RNAi는 초파리, 선충류, 균류 및 식물과 같은 다수의 유기체에서 발견되고, 항-바이러스 방어, 트랜스포손 활성의 조절 및 유전자 발현의 조절에 관여하는 것으로 여겨진다. RNAi 동안, dsRNA 또는 siRNA는 유전자 발현의 결과적인 서열-특이적 억제에 의한 표적 mRNA의 열화를 유도한다. 본원에 사용된 "작은 간섭 RNA"(siRNA)는 TSC22D4의 유전자를 표적으로 하는 뉴클레오타이드의 RNA 듀플렉스이다. "RNA 듀플렉스"는 RNA 분자의 2개의 영역 사이의 상보적 페어링(complementary pairing)에 의해 형성되는 구조를 지칭한다. siRNA는 siRNA의 듀플렉스 부분의 뉴클레오타이드 서열이 표적화된 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 유전자를 "표적화"한다. 일부 양태에서, siRNA의 듀플렉스의 길이는 30개 미만의 뉴클레오타이드이다. 일부 양태에서, 듀플렉스의 길이는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양태에서, 듀플렉스의 길이는 19 내지 25개 뉴클레오타이드이다. siRNA RNA 듀플렉스 부분은 헤어핀 구조의 부분일 수 있다. 듀플렉스 부분 이외에, 헤어핀 구조는 듀플렉스를 형성하는 2개의 서열 사이에 위치하는 루프 부분을 함유할 수 있다. 상기 루프는 길이가 변할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 루프의 길이는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 뉴클레오타이드이다. 헤어핀 구조는 또한 3' 및/또는 5' 오버행 부분을 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 오버행은 3' 및/또는 5' 오버행 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오타이드 길이이다. siRNA는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, 핵산 서열은 또한 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 또한 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리아데닐화 신호는 합성적인 최소 폴리아데닐화 신호이다.

본원에 사용된 용어 "siRNA"는 RNA 간섭 경로를 지향하거나 매개할 수 있는 약 19 내지 50개 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함하는 리보핵산(RNA) 또는 RNA 유사체를 지칭한다. 이러한 분자는 길이가 변할 수 있고 안티센스 가닥에서 이의 표적 메신저 RNA(mRNA)에 대한 다양한 정도의 상보성을 함유할 수 있다. 용어 "siRNA"는 2개의 별개 가닥의 듀플렉스, 즉 이중-가닥 RNA, 및 듀플렉스 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일 가닥을 포함한다. siRNA는 약 19 내지 50개 뉴클레오타이드, 약 25 내지 50개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 50개 뉴클레오타이드, 약 35 내지 50개 뉴클레오타이드, 약 40 내지 50개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 하나의 양태에서, siRNA는 19 내지 30개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.

siRNA를 적용하여 이의 표적 mRNA의 활성을 하향-조절하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 양태에서, mRNA 열화는, siRNA의 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥이 RNA 엔도뉴클레아제 Ago2를 함유하는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)를 지향하여 상보적 서열을 갖는 이의 표적 mRNA를 분열시키는 경우에, 발생한다. 따라서, siRNA는 PERK 유전자 상의 변화하는 길이의 임의의 부분에 상보적일 수 있다. siRNA는 또한 TSC22D4 유전자의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 상보적일 수 있다. 따라서, siRNA 치료는 TSC22D4 유전자를 침묵시키는데 사용될 수 있고, TSC22D4 단백질 다운스트림을 소모시킨다.

본원에 사용된 용어 "shRNA"는 RNAi를 수행할 수 있고 패신저 가닥, 루프 및 가이드 가닥을 갖는 단분자 RNA를 지칭한다. 패신저 및 가이드 가닥은 실질적으로 서로 상보적일 수 있다. 용어 "shRNA"는 또한 리보뉴클레오타이드 잔기 이외의 잔기, 예컨대, 비제한적으로, 변형된 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드간 연결기, 비-뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 및 뉴클레오타이드의 유사체를 포함할 수 있다.

miRNA는 이의 표적 mRNA를 하향-조절한다. 용어 "miRNA"는 일반적으로 단일 가닥 분자를 지칭하지만, 특정 양태에서, 동일한 단일-가닥 분자 또는 다른 핵산에 대해 부분적으로(가닥 길이 전체에 대해 10 내지 50% 상보적임), 실질적으로(가닥 길이 전체에 대해 50% 초과 및 100% 미만 상보적임) 또는 완전히 상보적인 영역 또는 추가적인 가닥을 포함할 수도 있다. 따라서, 핵산은 하나 이상의 상보적 또는 자가-상보적 가닥을 포함하는 분자, 또는 분자를 포함하는 특정 서열의 "상보체"를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전구체 miRNA는 100% 이하 상보적인 자가-상보적 영역을 가질 수 있고, 본 발명의 miRNA 프로브 또는 핵산은 이의 표적에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적일 수 있다.

서열번호 1 내지 3에 따른 서열 또는 이의 안티센스 서열로 이루어진 본 발명에 따른 억제제가 가장 바람직하다.

이의 기능적 변이체가 하나 이상의 변형되거나 치환된 뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명에 따른 억제제가 또한 바람직하다. 용어 "기능적 변이체"는 또한 단편, 퇴행성 핵산 코드에 기초하는 변이체 또는 화학적 유도체를 포함한다. 기능적 변이체는 치환된 핵산이 대체된 핵산과 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 보존적 변화를 가질 수 있다. 기능적 변이체는 또한 하나 이상의 핵산의 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 기능적 변이체가 TSC22D4 유전자의 생물학적 활성, 예컨대 기능을 적어도 부분적으로 보유하거나, 심지어 개선된 생물학적 활성을 나타냄이 이해된다.

변형된 올리고뉴클레오타이드의 예는, 비제한적으로 포스포로티오에이트 골격(상기 참조)을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 및 헤테로원자 골격, 구체적으로 -CH₂-NH-O-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-, -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- 및 -O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-[이때, 천연 포스포다이에스터 골격은 -O-P-O-CH₂-로 표시됨]를 갖는 올리고뉴클레오사이드를 포함한다. 모폴리노 골격 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 또한 이용가능하다. 간섭 리보핵산으로서 사용되는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 치환된 당 잔기를 함유할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에서, OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; O-, S- 또는 N-알킨일; 및 O-알킬-O-알킬(이때, 상기 알킬, 알켄일 및 알킨일 중 하나는 치환된 또는 비치환된 C₁-C₁₀ 알킬 또는 C₂-C₁₀ 알켄일 및 알킨일일 수 있음) 중 하나를 포함한다. 구체적인 예는, 비제한적으로 O[(CH₂)_nO]_mCH₃, 0(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂ 및 O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂(이때, n 및 m은 1 내지 약 10임)를 포함한다. 다른 예시적인 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에서, C₁-C₁₀ 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알켄일, 알킨일, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 분열기, 리포터 기, 삽입제, 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 올리고뉴클레오타이드의 약력학 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기 중 하나를 포함한다. 하나의 예시적인 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH₂CH₂OCH₃)(또한, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지됨), 즉, 알콕시알콕시 기를 포함한다.

이때, 다른 양상은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 발현을 위해 발현 벡터, 예컨대 플라스미드에 삽입된다. 필요에 따라, 하기 제어가 일반적으로 발현 벡터에 이용가능함에도 불구하고, 올리고뉴클레오타이드는 목적 숙주에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조정 제어 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 이때, 벡터는 표준 기술을 통해 숙주에 도입된다.

포유동물 세포 내에서 siRNA를 발현하는 벡터는 전형적으로 RNA 폴리머라제 III 프로모터를 사용하여 siRNA의 구조를 모방하는 짧은 헤어핀 RNA의 발현을 구동한다. 이러한 헤어핀을 코딩하는 삽입은 짧은 스페이서 서열에 의해 분리되는 2개의 반전된 반복체(inverted repeat)를 갖도록 고안된다. 하나의 반전된 반복체는 siRNA가 표적화되는 mRNA에 상보적이다. 3' 말단에 첨가되는 일련의 티미딘은 pol III 전사 종결 부위로서 역할을 한다. 세포 내부에서, 벡터가 헤어핀 RNA를 구성적으로 발현하면, 이는 표적 유전자의 침묵을 유도한다.

다른 적합한 벡터는 바이러스성 벡터, 예컨대 아데노바이러스성, 레트로바이러스성 및 렌티바이러스성 바이러스 또는 각각의 발현 시스템을 포함한다(예를 들어, 문헌[Catanotto, D. et al.(2002) Functional siRNA expression from transfected PCR products. RNA 8, 1454-1460; Barton, G.M. et al. (2002) Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl Acad Sci USA. 99(23):14943-5. Abbas-Terki, T. et al.(2002) Lentiviral-mediated RNA interference. Hum.Gene Ther. 13, 2197-2201], 및 문헌[Xia, H. et al. (2002) siRNA-mediate gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol.20,1006-1010] 참고).

일반적으로, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되는 것은 아니다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 것이 필수적일 수 있다. 하나의 선택 기술은 형질전환된 세포에서 선택가능한 특색, 예컨대 항생제 내성을 코딩하는 DNA 서열을 임의의 필수적인 제어 요소와 함께 발현 벡터에 혼입하는 것을 포함한다. 다르게는, 이러한 선택가능한 특색을 위한 유전자는 다른 벡터 상에 존재할 수 있고, 목적 숙주 세포를 공동-형질전환하는데 사용된다. 이때, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본원에 개시된 교시에 비추어 당업자에게 공지된 충분한 시간 및 적절한 조건 하에 배양되어 폴리펩티드의 발현을 허용하고, 이어서 회수될 수 있다.

다른 예는 문헌[Yang J. et al., Design, preparation and application of nuclei acid delivery carriers." Biotechnol Adv. 2014 Jul-Aug;32(4):804-17]에서 발견될 수 있다.

각각의 부류의 본원에 기술된 핵산(예컨대, 올리고뉴클레오타이드 및/또는 벡터)은 다수의 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다. 지질-매개된 형질감염에서, 세포는 핵산과 지질 또는 중합체 시약 사이에 엔도시토시스에 의해 비-공유 복합체를 취한다. 전기천공법은 단순한 전기 펄스를 이용하여 핵산이 도입되는 세포의 플라즈마 막에 혼란(disruption) 또는 구멍(hole)을 야기한다. 이들 방법은 둘 다 바이러스성 벡터를 제외한 임의의 RNAi 핵산을 성공적으로 전달한다. 바이러스성 벡터 전달은 통상적으로 헬퍼 바이러스를 사용하는, 상응하는 바이러스에 의한 세포의 감염에 의해서만 발생한다. 바이러스에 의한 목적 세포주의 감염은 siRNA 또는 shRNA 및 녹다운 유전자 발현을 유도한다.

이때, 본 발명의 다른 양상은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포, 바람직하게는 재조합 간세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 "세포"는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 "세포"는 바람직하게는, 비제한적으로, 간 세포로부터 선택된다. 포유동물 세포는 바람직하게는 인간, 토끼, 마우스 및 래트로부터 선택된다. 바람직하게는, 세포는 인간 세포, 예컨대 간세포이다. 용어 "세포"는 또한 동물 모델의 세포를 포함한다. 또한, 세포는 조직 배양물의 일부일 수 있다.

본 발명의 목적은 또한 상기 본 발명에 따른 하나 이상의 억제제를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화시키는 단계를 포함하는, 약학 조성물의 제조 방법에 의해 해결된다. 약학 조성물의 담체 및/또는 부형제는 제형의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에게 해롭지 않은 의미로 "허용되는" 것이어야 한다.

이때, 본 발명의 다른 양상은 본 발명에 따른 억제제, 본 발명에 따른 재조합 벡터 및 본 발명에 따른 재조합 세포 중 하나 이상을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 경구, 직장, 경점막, 경피, 창자, 비경구, 근육내, 척추강내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안구내 또는 피하 투여를 위한 약학 조성물이 바람직하다.

이때, 본 발명의 다른 양상은 질병의 예방, 조절 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 억제제, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 재조합 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.

인슐린 내성 증후군은 광범위한 임상 스펙트럼을 구성하고, 인슐린 내성과 관련된 임의의 비정상 상태로서 정의된다. 인슐린에 대한 내성, 당뇨병, 고혈압, 이상지혈증 및 심혈관 질병과 같은 비정상 상태가 인슐린 내성 증후군을 구성한다.

인슐린 내성 증후군은 식이-유발 인슐린 내성 및/또는 비만-유발 인슐린 내성일 수 있다. 식이-유발 인슐린 내성은 인슐린에 대한 내성이 높은 포화 지방 및 탄수화물의 식이에 의해 유발됨을 의미한다. 비만-유발 인슐린 내성은 인슐린에 대한 내성이 비만에 대한 유전적 소인 또는 식이 습관에 기인한 비만에 의해 유발됨을 의미한다.

이와 같이, 본 발명의 다른 양상은 인슐린 내성, 고혈압, 이상지혈증, 관상 동맥 질환, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병로부터 선택되는 질병의 예방, 조절 및/또는 치료에 사용하기 위한, 및/또는 인슐린 민감성, 예를 들어, 종양 질환과 관련된 인슐린 민감성의 개선을 위한, 본 발명에 따른 억제제, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 재조합 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 인슐린 내성 증후군은 식이-유발 인슐린 내성 및/또는 비만-유발 인슐린 내성이다.

상기 목적은 또한 본 발명에 따른 억제제 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 효과량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 인슐린 내성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병으로부터 선택되는 질병의 치료 및/또는 예방 방법에 의해 해결된다.

개시된 방법은 인슐린 내성 증후군에 의해 유발되는 인슐린 내성, 고혈압, 이상지혈증, 제2형 당뇨병 및 관상 동맥 질환 중 어느 하나의 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

용어 "예방"은 본 발명의 맥락에서 질병을 갖는 환자의 병태의 악화 또는 건강한 및/또는 아픈 대상의 상해 또는 사망을 유발할 가능성이 가장 큰 부정적인 사건의 발생을 피하는 것을 목적으로 하는 의학적 개입으로서 이해되어야 한다. "이를 필요로 하는 환자"는, 비제한적으로, 인슐린 내성 증후군과 관련된 질병, 특히 인슐린 내성, 고혈압, 이상지혈증, 제2형 당뇨병 또는 관상 동맥 질환과 관련된 질병을 앓는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 바람직하게는, 이를 필요로 하는 대상은 인간이다.

상기 목적은 또한 본 발명에 따른 억제제, 본 발명에 따른 재조합 벡터, 본 발명에 따른 재조합 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을, 선택적으로 적합한 완충제 및 부형제, 및 사용 설명서와 함께 포함하는 치료용 키트에 의해 해결된다.

상기 목적은 또한 질병의 예방, 조절 및/또는 치료에 사용하기 위한(이때, 상기 질병은 인슐린 내성, 고혈압, 이상지혈증, 관상 동맥 질환, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병으로부터 선택됨), 및/또는 인슐린 민감성, 예를 들어, 종양 질환과 관련된 인슐린 민감성의 개선을 위한, 본 발명에 따른 치료용 키트에 의해 해결된다.

최근에, 본 발명자들은 전사 조절자 형질전환 성장 인자 베타 1 자극된 클론 22 D4(TSC22D4)가 간 및 전신 인슐린 민감성을 조절함을 밝혀냈다. TSC22D4의 간 특이적인 손실은 야생형 마우스에서 내당능 및 인슐린 민감성을 유의하게 개선하였고 고인슐린혈증을 중화시켰다. 건강한 동물에서의 고 처리량 TSC22D4 표적 전사체 연구와 조합되는 TSC22D4 시스트롬의 ChlP-Seq 분석은 인슐린 신호전달 경로의 주요 노드가 TSC22D4, 가장 현저하게는 리포칼린 13에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 표적화됨을 나타냈다. 실제로, 1차 마우스 간세포 및 야생형 마우스에서의 TSC22D4의 하향-조절 또는 과발현은, 각각 급성 인슐린 노출에 반응하여, Ser473에서의 Akt/PKB 키나제 및 Ser9에서의 GSK3beta의 인산화에 의해 측정되는 바와 같이, 세포간 인슐린 신호전달 경로의 상향-조절 또는 하향-조절을 야기하였다.

흥미롭게도, 당뇨병 db/db 마우스에서 TSC22D4의 간 불활성화는 이들 동물에서의 내당능 및 인슐린 내성을 개선하였고, 혈당을 거의 건강한 수준까지 정상화시켰다. 당뇨병에 걸린 동물에서 대사 상태의 전반적인 개선과 함께, 전-염증성 사이토킨 및 레시스틴의 순환 수준은 간-특이적 TSC22D4 결핍을 갖는 마우스에서 유의하게 저하되었다.

TSC22D4-지향 shRNA 또는 miRNA 구축물의 바이러스성 전달에 의한 실험적인 녹다운이 당뇨병에 걸린 동물의 대사 상태를 효율적으로 개선하는 것으로 입증되었지만, 상이한 기술에 의한 전달시 다양한 종에서 TSC22D4의 효율적이고 특이적인 녹다운에 적합한 siRNA 구축물은 아직 확인되지 않았다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 본원에 개시된 바와 같이 뮤린 Hepa1.6 및 인간 Huh7 간암 세포를 사용하는 시험관내 녹다운 연구에서 TSC22D4 mRNA 서열을 지향하는 다양한 siRNA를 동정하고 기능적으로 시험하고 확인하였다.

하기 도면, 서열 및 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범주를 실시예에 기술된 본 발명의 구체적인 양태로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 발명의 목적을 위하여, 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 이들의 전체내용이 본원에 참고로서 혼입된다.

도 1은 뮤린 간암 세포에서 색-코드의 선택된 TSC22D4-지향 siRNA의 녹다운 효율을 도시한다. 상대적인 mRNA 수준이 도시된다. 모든 다른 시험된 siRNA 서열은 이러한 실험에서 어떠한 유의한 TSC22D4 녹다운도 나타내지 않았다(도시하지 않음).
도 2는 뮤린 TSC22D4를 지향하는 뮤린 Hepa1-6 간암 세포 내로의 형질감염시 mhD4-siRNA1의 녹다운 효율을 도시한다. 상대적인 mRNA 수준이 도시된다.
도 3은 인간 TSC22D4를 지향하는 인간 Huh7 간암 세포 내로의 형질감염시 mhD4-siRNA1의 녹다운 효율을 도시한다. 상대적인 mRNA 수준이 도시된다.

서열번호 1 내지 6은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

실시예

재조합 바이러스

U6 프로모터의 제어 하에 TSC22D4 또는 비-특이적 shRNA, 또는 CMV 프로모터의 제어 하에 TSC22D4 cDNA를 발현하는 아데노바이러스를 BLOCK-iT 아데노바이러스성 RNAi 발현 시스템(인비트로겐(Invitrogen), 독일 칼스루에 소재)로 클로닝하였다. 종래 기술된 바와 같이, 세슘 클로라이드 방법에 의해 바이러스를 정제하고, 동물 주입 전에 10% 글리세롤을 함유하는 포스페이트-완충된-염수 완충제에 대해서 투석하였다(문헌[Herzig S, Hedrick S, Morantte I, Koo SH, Galimi F, Montminy M. CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPAR-gamma. Nature. 2003; 426: 190-193. Herzig S, Long F, Jhala US, Hedrick S, Quinn R, Bauer A, Rudolph D, Yoon C, Puigserver P, Spiegelman B, et al. CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature. 2001; 413: 179-183]). 간세포-특이적 프로모터의 제어 하에 AAV 코팅 제어 또는 TSC22D4-특이적 miRNA를 종래 기술된 바와 같이 확립하였다(문헌[Rose AJ, Frosig C, Kiens B, Wojtaszewski JF, Richter EA. Effect of endurance exercise training on Ca2+ calmodulin-dependent protein kinase II expression and signaling in skeletal muscle of humans. J Physiol. 2007; 583: 785-795]).

동물 실험

수컷 8 내지 12주령 C57Bl/6 및 10 주령 db/db 마우스를 찰스 리버 래보러토리스(Charles River Laboratories, 벨기에 브뤼셀 소재), 규칙적인 무제한 식이와 함께 12시간 광-암 사이클에서 유지시켰다. 인슐린 내성 및 내당능 시험 전에, 동물을 4시간 동안 금식시켰다. 그렇지 않으면, 동물에게 무제한 급식하고, 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 아데노바이러스 주사를 위하여, 재조합 바이러스 당 1 내지 2 x 10⁹ 플라크-형성 단위(pfu)를 꼬리 정맥 주사에 의해 투여하였다. AAV 실험을 위하여, 5 x 10¹¹ 바이러스를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 각각의 실험에서, 6 내지 12마리 동물이 동일한 치료를 수용하였고, 지시된 바와 같이 금식(18시간 금식), 임의 급식 또는 급식(18시간 금식, 및 이어서 6시간 재급식) 조건 하에 분석하였다. 간, 정소상체 및 복부 지방 패드, 및 비장근을 비롯한 기관을 특정 시간 후에 수집하고, 칭량하고, 스냅-프리징(snap-freezing)하고, 추가 분석에 사용하였다. 총 신체 지방 함량을 에코(Echo) MRI 신체 조성 분석기(에코 메디컬 시스템스(Echo Medical Systems), 미국 휴스턴 소재)로 측정하였다. 동물 취급 및 실험을 NIH 지침에 따라 수행하고, 연방 정부에 의해 승인받았다.

인슐린 내성 시험을 위하여, 0.9% 나트륨 클로라이드를 사용하여 1 U 인슐린/mL의 저장 용액을 준비하였다. 마우스는 실험 전에 4시간 동안 금식시켰다. 모든 동물의 체중을 측정하고, 혈당 수준을 레이저 블레이드로 꼬리를 절단함으로써 측정하였다. 혈액 방울을 글루코미터(glucometer) 스트립 상에 위치시키고, 측정하였다. 복막내로, 1 U 인슐린/kg 체중을 C57Bl/6에게 주사하고, 1.5 U 인슐린/kg 체중을 db/db 마우스에게 주사하였다. 혈당 수준을 20, 40, 60, 80 및 120분 후에 모니터링하였다.

내당능 시험을 위하여, 0.9% 나트륨 클로라이드를 사용하여 20% 포도당의 저장 용액을 준비하였다. 마우스는 실험 전에 4시간 동안 금식시켰다. 모든 동물의 체중을 측정하고, 혈당 수준을 레이저 블레이드로 꼬리를 절단함으로써 측정하였다. 혈액 방울을 글루코미터 스트립 상에 위치시키고, 측정하였다. 복막내로, 1 U 인슐린/kg 체중을 C57Bl/6에게 주사하고, 5 μL/g의 20% 포도당 용액을 C57Bl/6 및 db/db 마우스에게 복막내로 주사하였다. 혈당 수준을 20, 40, 60, 80 및 120분 후에 모니터링하였다.

정량적인 Taqman RT-PCR

퀴아졸(Qiazol) 시약(퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴 소재)을 사용하여 총 RNA를 균질화된 마우스 간 또는 세포 용해물로부터 추출하였다. M-MuLV 효소 및 올리고(Oligo) dT 프라이머(퍼멘타스(Fermentas), 독일 상크트 레온-로트 소재)를 사용하는 역 전사에 의해 cDNA를 준비하였다. 어세이-온-디맨드 키트(assay-on-demand kit) 및 에이비아이 프리즘(ABI PRISM) 7700 서열 검출기(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 독일 다름스타트 소재)를 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. RNA 발현 데이터를 TATA-박스 결합 단백질(TBP) RNA의 수준으로 정규화시켰다.

TaqMan 어세이를 사용하는 형광 온도 사이클러에서 정량적인 실시간 RT-PCR에 의해 인간 TSC22D4 mRNA 발현을 측정하고, 형광을 에이비아이 프리즘 7000 서열 검출기(어플라이드 바이오시스템즈, 독일 다름스타트 소재) 상에서 검출하였다. 트라이졸(TRIzol)(라이프 테크놀로지스(Life technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)을 사용하여 전체 RNA를 단리하고, 1 μg RNA를 표준 시약(라이프 테크놀로지스, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)으로 역 전사시켰다. 제조사의 설명서에 따라서 스트라타젠(stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)으로부터의 브릴런트 SYBR 그린 QPCR 코어(Brilliant SYBR green QPCR Core) 시약 키트를 사용하여, 각각의 RT-PCR로부터 2 μL를 26 μL PCR 반응 중에 증폭시켰다. 95℃에서 10분 동안의 초기 변성, 및 이어서 40 PCR 사이클(각각의 사이클은 95℃에서 15초, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 이루어짐) 동안, 샘플을 에이비아이 프리즘 7000 서열 검출기에서 항온처리하였다. 인간 TSC22D4 및 Obp2a(LCN13)(각각 Hs00229526_m1 및 Hs01062934_g1에 의해 측정됨)(어플라이드 바이오시스템즈, 독일 다름스타트 소재) mRNA 발현을, HPRT1을 위한 요구시 사전혼합된 어세이(Hs01003267_m1)(어플라이드 바이오시스템즈, 독일 다름스타트 소재)에 의해 측정된 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1(HPRT1)의 mRNA 발현을 기준으로 계산하였다. 특이적인 트랜스크립트(transcript)의 증폭을 각각의 PCR 종결시 용융 곡선 프로파일(형광을 측정하면서 샘플을 68℃까지 냉각하고 95℃까지 천천히 가열함)에 의해 확인하였다. 증폭 생성물이 라가로스 겔 전기영동을 거치게 함으로써, PCR의 특이성을 더욱 입증하였다.

단백질 분석

단백질은 세포 용해 완충액 중 냉동된 기관 샘플 또는 배양된 간세포로부터 추출하고(문헌[Rose AJ, Frosig C, Kiens B, Wojtaszewski JF, Richter EA. Effect of endurance exercise training on Ca2+ calmodulin-dependent protein kinase II expression and signaling in skeletal muscle of humans. J Physiol. 2007; 583: 785-795]), 20 μg의 단백질을 4 내지 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 니트로셀룰로스 막 상에 블로팅(blotting)하였다. TSC22D4(압캠(Abcam), 영국 캠브리지 소재, 또는 시그마(Sigma), 독일 뮌헨 소재), AKT, p-AKT, GSK, p-GSK(셀 시그널링(Cell signaling), 미국 댄버스 소재) 또는 VCP(압캠)에 특이적인 항체를 사용하여, 웨스턴 블롯 어세이를 문헌[Herzig et al, 2001]에 기술된 바와 같이 수행하였다.

플라스미드 및 RNA 간섭

shRNA 실험을 위하여, 마우스 및 TSC22D4(서열번호 1 내지 3)를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 pENTR/U6 shRNA 벡터(인비트로겐) 내로 클로닝하였다.

세포 배양물 및 일시적인 형질감염 어세이

1차 마우스 간세포를 단리하고, 문헌[Klingmuller U, Bauer A, Bohl S, Nickel PJ, Breitkopf K, Dooley S, Zellmer S, Kern C, Merfort I, Sparna T, et al. Primary mouse hepatocytes for systems biology approaches: a standardized in vitro system for modelling of signal transduction pathways. IEE Proc Syst Biol. 2006; 153: 433-447]에 기술된 바와 같이 배양하였다. 간략하게, 수컷 8 내지 12주령 C57Bl/6 마우스를 100 mg/kg 체중 케타민 하이드로클로라이드 및 5 mg/kg 체중 자일라진 하이드로클로라이드의 i.p. 주사에 의해 마취하였다. 복강을 개방한 후, 간 구조의 붕해가 관찰될 때까지, 간을 37℃에서 HANKS I(8 g NaCl, 0.4 g KCl, 3.57 g Hepes, 0.06 g Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1 L 증류된 H₂O 중 0.06 g KH₂PO₄, 2.5 mM EGTA, 0.1% 포도당, pH 7.4로 조정됨)로 문맥을 통해 5분 동안, 및 이어서 HANKS II(8 g NaCl, 0.4 g KCl, 3.57 g Hepes, 0.06 g Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1 L 증류된 H₂O 중 0.06 g KH₂PO₄, 0.1% 포도당, 3 mg/ml 콜라게나제 CLSII, 5 mM CaCl₂, pH 7.4로 조정됨)로 5 내지 7분 동안 관류하였다. 간 캡슐을 제거하고, 세포 현탁액을 100 μm 메쉬를 통해 여과하였다. 세포를 세척하고, 이어서 세포의 생존율을 트립판 블루 염색에 의해 측정하였다. 1,000,000 생 세포/웰을 콜라겐 I-코팅된 6-웰 플레이트 상에 시딩하였다. 24시간 후, 세포를 100의 간염의 다중도로 재조합 아데노바이러스로 감염시켰다. 자극 실험을 위하여, 1차 간세포를 100 nM/6-웰의 농도에서 10분 동안 PBS(대조군 매질) 또는 인슐린으로 처리하였다. 감염 후 48시간에 세포를 수확하였다.

간 TSC22D4의 시스트롬 분석

칩-시퀀싱(Chip-Sequencing) 결과의 KEGG-경로 분석을 유의성에 의해 분류하였다. 인슐린 신호전달 경로는 유의하게 조절되는 것으로 밝혀졌다(p = 0.00005). 칩-시퀀싱을 주사후 7일에 Flag-TSC22D4 cDNA 아데노바이러스-주사된 수컷 C57Bl/6 마우스로부터의 간 추출물에서 수행하였다.

결과

시퀀스는 4개의 독립적인 실험에서 보는 바와 같이 마우스 및 인간 TSC 둘 다에 대해 매우 효율적으로 작동하였다(도면 참고). 각각의 서열에 부착된 비-특이적 dTdT 오버행이 존재한다. 이러한 서열은 마우스 및 인간 TSC 서열 둘 다에 100%까지 부합된다.

이러한 결과에 기초하여, 본 발명에 따른 서열(서열번호 1 내지 3)이 TSC22D4에 대하여 우수한 녹다운 효능을 나타내고 마우스, 비-인간 영장류 및 인간을 비롯한 다양한 종을 표적으로 하므로, 이러한 서열을 치료 목적에 사용되는 1차 후보군으로 선택하였다. 이러한 서열을 동정하고, 기능적으로 시험하고, 뮤린 Hepa1.6 및 인간 Huh7 간암 세포를 사용하는 시험관내 녹다운 연구에서 TSC22D4 mRNA 서열을 지향하는 다양한 siRNA를 확인하였다. 구체적으로, mhD4-siRNA1은 TSC22D4에 대한 우수한 녹다운 효율을 나타냈고, 마우스, 비-인간 영장류 및 인간을 비롯한 다양한 종을 표적으로 한다.

mhD4-siRNA1: (NM_030935.3_siRNA_1024; ORF)

센스: 5'- GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3' (서열번호 1);

안티센스: 5'-UAAACAUCCACACACGUCCdTdT-3' (서열번호 4);

GC: 47% (w/o TT-오버행)

mD4-siRNA2: (NM_023910.6_siRNA_993; ORF)

센스: GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3' (서열번호 2);

안티센스: AUCUCUCUCGUAAACAUCCdTdT-3' (서열번호 5);

GC: 42.1% (w/o TT-오버행)

mhD4-siRNA3:

센스: 5'-AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3' (서열번호 3);

안티센스: 5'-GCAAACAUGAGGUGGGACUdTdT-3' (서열번호 6);

GC: 52.6% (w/o TT-오버행)

SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Offentlichen Rechts <120> Oligonucleotide sequences targeting transcription factor TSC22D4 for the treatment of insulin resistance <130> D31385WO <140> PCT/EP2016/053050 <141> 2016-02-12 <150> EP 15160259.6 <151> 2015-03-23 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 1 ggacgugugu ggauguuua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> mus musculus <400> 2 uaaacaucca cacacgucc 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> mus musculus <400> 3 ggauguuuac gagagagau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> mus musculus <400> 4 aucucucucg uaaacaucc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 5 agucccaccu cauguuugc 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 6 gcaaacauga ggugggacu 19

Claims

하기 서열 중 하나 이상, 이의 안티센스 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하되, 간섭 리보핵산, 단백질 핵산(PNA) 또는 잠금 핵산(LNA)인 올리고뉴클레오타이드로부터 선택되는, 발현 및/또는 생물학적 활성의 억제제:
5'- GGACGUGUGUGGAUGUUUAdTdT-3' (서열번호 1);
5'- GGAUGUUUACGAGAGAGAUdTdT-3' (서열번호 2);
5'- AGUCCCACCUCAUGUUUGCdTdT-3' (서열번호 3).
제1항에 있어서,
간섭 리보핵산이 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 작은 헤어핀 리보핵산(shRNA), 마이크로 리보핵산(miRNA) 또는 이들의 조합인, 억제제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
siRNA가 19 내지 30개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 억제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
siRNA가 서열번호 1 내지 3에 따른 서열로 이루어진, 억제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
기능적 변이체가 하나 이상의 변형되거나 치환된 뉴클레오타이드를 포함하는, 억제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오타이드 또는 제6항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포, 바람직하게는 재조합 간세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 억제제, 제6항에 따른 재조합 벡터 및 제7항에 따른 재조합 세포 중 하나 이상을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
제8항에 있어서,
경구, 직장, 경점막, 경피, 창자, 비경구, 근육내, 척추강내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안구내 또는 피하 투여를 위한 약학 조성물.
질병의 예방, 조절 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 억제제, 제6항에 따른 재조합 벡터, 제7항에 따른 재조합 세포, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
질병이 인슐린 내성, 고혈압, 이상지혈증, 관상 동맥 질환, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병으로부터 선택되는 제10항에 기재된 용도를 위한, 및/또는 인슐린 민감성, 예를 들어 종양 질환과 관련된 인슐린 민감성의 개선을 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 억제제, 제6항에 따른 재조합 벡터, 제7항에 따른 재조합 세포, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
인슐린 내성 증후군이 식이-유발 인슐린 내성 및/또는 비만-유발 인슐린 내성인 제11항에 기재된 용도를 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 억제제, 제6항에 따른 재조합 벡터, 제7항에 따른 재조합 세포, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 억제제, 제6항에 따른 재조합 벡터, 제7항에 따른 재조합 세포, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 약학 조성물을, 선택적으로 적합한 완충제, 부형제 및 사용 설명서와 함께 포함하는 치료용 키트.
제13항에 있어서,
인슐린 내성, 고혈압, 이상지혈증, 관상 동맥 질환, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병으로부터 선택되는 질병의 예방, 조절 및/또는 치료에 사용하기 위한, 및/또는 인슐린 민감성, 예를 들어, 종양 질환과 관련된 인슐린 민감성의 개선을 위한 치료용 키트.