ES2618203T3

ES2618203T3 - Procedimiento para la estimulación de la angiogénesis, la vascularización o la reparación vascular o para la inhibición de la angiogénesis tumoral

Info

Publication number: ES2618203T3
Application number: ES08844273.6T
Authority: ES
Inventors: Stefanie Dimmeler; Andreas M. Zeiher; Angelika Bonauer; Carmen Urbich
Original assignee: T2cure GmbH
Current assignee: T2cure GmbH
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2017-06-21
Anticipated expiration: 2028-10-30
Also published as: ES2651287T3; US20150018407A1; CA2704290C; PT2684955T; JP2018083817A; US8912158B2; US9862949B2; NO2684955T3; DE102007052114A1; DE102007052114B4; EP2217704A1; WO2009056116A1; US8258113B2; DK2217704T3; PL2217704T3; JP2011500858A; HRP20170346T1; EP2684956B1; EP2217704B1; SI2684955T1

Abstract

Procedimiento in vitro para la estimulación de la vascularización o la reparación vascular, que presenta los siguientes pasos: - puesta a disposición de una célula; e - introducción en la célula de una molécula antisentido contra miR-92.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Procedimiento para la estimulacion de la angiogenesis, la vascularizacion o la reparacion vascular o para la inhibicion de la angiogenesis tumoral

La invencion se refiere a un procedimiento para la influencia de la expresion de miR-92 en una celula, en particular para la estimulacion de la angiogenesis, vascularizacion o reparacion vascular o para la inhibicion o el bloqueo de la angiogenesis tumoral, asi como al uso de un procedimiento de este tipo para la terapia de una enfermedad o de un estado. La invencion se refiere ademas de ello, a una composicion farmaceutica para la estimulacion de la angiogenesis, vascularizacion o reparacion vascular o para la inhibicion o el bloqueo de la angiogenesis tumoral en una celula.

El endotelio tiene una importancia particular en el mantenimiento de la integridad y la funcionalidad de los vasos. El crecimiento de nuevos vasos se produce en el adulto mediante arteriogenesis, angiogenesis o vasculogenesis. Mientras que la arteriogenesis se define como el crecimiento de vasos colaterales, con angiogenesis se entiende el crecimiento de nuevos vasos sanguineos a partir de vasos ya existentes. Durante la angiogenesis se activan celulas endoteliales inactivas mediante factores angiogenicos y comienzan a migrar, se perfilan y se organizan en estructuras tubulares (2). El termino vasculogenesis describia originalmente la conformacion de vasos sanguineos nuevos en el embrion a partir de angioblastos, pero se refiere no obstante actualmente tambien, a la conformacion de vasos sanguineos a partir de celulas progenitoras endoteliales u otras celulas madre (1) adultas. La angiogenesis y la vasculogenesis representan procesos de desarrollo fisiologicos, los cuales tienen una importancia esencial en el restablecimiento del flujo sanguineo en tejidos isquemicos y representan un paso basico en el crecimiento de tumores. La estimulacion de la angiogenesis y la neovascularizacion fueron identificadas en pacientes afectados por isquemia, como posible estrategia terapeutica. En la angiogenesis tumoral, la inhibicion de estos procesos conduce a la represion del crecimiento tumoral.

Los microARNs (miARNs) son pequenos ARNs no codificantes, que regulan (3) la expresion genetica en el plano postranscripcional mediante degradacion del ARNm diana o mediante represion traslacional. A diferencia de pequenos ARNs de interferencia (ARN de silenciamiento), que se unen a secuencias ARNm complementarias, la union del miARN a un diana no se produce solo a un ARN complementario, sino que conforma estructuras ARN- ARN mas complejas, las cuales se prefieren (4) termodinamicamente. Esta union “incompleta” permite que una molecula miARN pueda unirse a diferentes moleculas ARNm. La regulacion de un conjunto de genes (a diferencia de la monoterapia mediante un gen o un factor de crecimiento) puede representar una ventaja, cuando puede influirse debido a ello en procesos de regulacion complejos. Hasta ahora se han identificado en el genoma humano mas de 400 miARNs, pero la relevancia de la mayoria de estos miARNs para la funcion celular en procesos fisiologicos y patologicos continua sin estar clara. Mientras que se ha descrito en el estado de la tecnica, que la inactivacion de las enzimas Dicer y Drosha con procesamiento de miARN influye en la angiogenesis (5 - 7), se han descrito solo pocos miARNs especificos, los cuales influyen en funciones celulares endoteliales y en la angiogenesis. miR-221 y miR-222 bloquean la migracion celular endotelial, la proliferacion y la angiogenesis in vitro mediante la interaccion con el receptor de factor celular madre c-kit y regulacion de la expresion eNOS de forma indirecta (6, 8). A diferencia de ello, la expresion de let7-f y miR-27b contribuye a la angiogenesis in vitro (7).

En el estado de la tecnica se le ha atribuido al cluster miARN miR-17-92 una fuerte actividad de estimulacion de la angiogenesis tumoral. El cluster miR-17-92 consiste en miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b y miR-92-1 (9). Este cluster miR-17-92 esta activado en tumores inducidos por Myc y los miARNs individuales miR- 18 y miR-19 pudieron identificarse como moleculas, las cuales interactuan especificamente con la expresion de proteinas antiangiogenicas. Una evaluacion especifica de las dianas de estos miARNs, mostro que miR-18 suprime preferiblemente la expresion del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), mientras que miR-19 interactua (10) con el fuerte inhibidor de angiogenesis trombospondina-1 (TSP-1).

Segun la invencion se ha descubierto sorprendentemente, que miR-92 no estimula la angiogenesis tal como se describe en el estado de la tecnica, sino que atenua fuertemente la migracion y la conformacion de tubos de celulas endoteliales in vitro y la neovascularizacion in vivo. La inhibicion de miR-92 aumenta la neovascularizacion. Como consecuencia de ello, miR-92 tiene una actividad antiangiogenica y no como se ha descrito hasta ahora en el estado de la tecnica, una actividad proangiogenica.

Esta actividad antiangiogenica esta relacionada con la inhibicion de proteinas clave, las cuales controlan la angiogenesis y la actividad endotelial, incluyendo el oxido nitrico sintasa endotelial (eNOS) y la sirtuina (SIRT1), los cuales son ambos esenciales (11 a 13) para las funciones endoteliales posnatales, e integrina a5, la cual controla (14) la motilidad celular endotelial y la interaccion con la matriz. La inhibicion de miR-92 mediante inhibidores miR-92 representa una nueva estrategia terapeutica para la mejora de la funcion celular endotelial y la neovascularizacion. Al mismo tiempo se ha descubierto que la sobreexpresion de miR-92 reduce la neovascularizacion.

Descripcion de la invencion

La invencion se basa en que con miR-92 se desarrolla una actividad biologica antiangiogenica, y no como se ha descrito hasta ahora en el estado de la tecnica, una actividad proangiogenica.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En especial la invencion se refiere a un procedimiento para la influencia de la expresion de miR-92 en una celula, en particular en el marco de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis. Segun la invencion, el procedimiento presenta los siguientes pasos:

a) puesta a disposicion de una celula; y

b1) reduccion de la expresion de miR-92 en la celula, para la estimulacion de la angiogenesis, de la vascularizacion y/o de la reparacion vascular, mediante la introduccion de una molecula antisentido contra miR- 92 en la celula, o

b2) aumento de la expresion de miR-92 en la celula, para la inhibicion de la angiogenesis tumoral mediante la introduccion de una construccion en la celula, presentando la construccion una secuencia miR-92 expresable. Es posible igualmente, introducir miR-92 en la celula.

En una forma de realizacion preferida, el procedimiento es un procedimiento in vitro.

El termino reducir o aumentar la expresion de miR-92 en la celula, se basa en una comparacion con la expresion de miR-92 en una celula tipo silvestre, como puede llevarse a cabo por ejemplo, mediante RT-PCR o PCR en tiempo real. La correspondiente modificacion de la expresion puede determinarse tambien mediante los efectos funcionales de la fuerza de expresion modificada de miR-92 en las propiedades de la celula.

La molecula antisentido es una molecula monocatenaria, la cual presenta una secuencia complementaria esencialmente reversa a un ARN (en este caso miR-92) y que inhibe la funcion biologica de miR-92 mediante hibridizacion con miR-92. La molecula antisentido es preferiblemente un ARN inverso, el cual puede presentar opcionalmente modificaciones quimicas.

La construccion puede ser un plasmido, un cosmido, un virus o un precursor miARN, presentando la construccion ventajosamente un medio para la transcripcion de la secuencia miR-92 expresable contenida, como por ejemplo, un promotor, el cual esta unido funcionalmente con la secuencia miR-92.

El termino utilizado en este caso “miR-92” abarca tanto moleculas precursoras como pre-92a-1, pre-92a-2 y pre-92b, como tambien moleculas procesadas como miR-92a, y miR-92b (veanse tambien las secuencias segun SEQ ID NO 1 a 5).

La introduccion de una molecula o de una construccion puede producirse tanto mediante metodos fisicos (como microinyeccion o electroporacion), mediante metodos quimicos (como con fosfato de calcio o lipofeccion), o mediante metodos virales (mediante virus).

En una forma de realizacion preferida de la invencion, resulta de la influencia de la expresion de miR-92 en la celula, la influencia de la expresion de una proteina en la celula, la cual esta elegida del grupo consistente en: eNOS, SIRT1, integrina alfa 5, integrina beta 1, integrina alfa v, Sprouty 2, TIMP 4, Tie 2, ANG 2, MKK 4, KLF 2, PCAF, EDG 1 y RAP 1B. Todas estas proteinas estan asociadas con el control de la funcion celular endotelial, la proteccion arterial y/o la neovasculacion posnatal. SIRT 1 esta asociada ademas de ello, con enfermedades relacionadas con la edad.

La puesta a disposicion de una celula comprende la puesta a disposicion tanto de una celula de forma aislada, como por ejemplo, una celula con una linea celular clonal, como tambien la puesta a disposicion de una celula, la cual es parte de un tejido, organo o de un organismo.

La celula puesta a disposicion puede comprender basicamente cualquier tipo de celula. La celula puesta a disposicion es preferiblemente una celula vascular, una celula hematopoyetica, una celula de musculo cardiaco, una celula inflamatoria y/o una celula neuronal. Esto incluye correspondientemente todas las celulas precursoras y madre de las celulas mencionadas. En una forma de realizacion preferida del procedimiento, la celula madre no es ninguna celula madre embrionaria humana. La celula puesta a disposicion puede presentarse ademas de ello, tanto de forma individualizada, como tambien en union con un tejido o un organo. En una forma de realizacion, el procedimiento puede llevarse a cabo tambien in vivo.

La celula puesta a disposicion es originaria preferiblemente de un metazoario, en particular de un mamifero (por ejemplo, un roedor como raton o rata), un mono, un simio, una vaca, un cerdo, un perro o un gato o, de forma particularmente preferida, de un humano.

Reduccion de la expresion de miR-92

Siempre y cuando el procedimiento conduce a una reduccion de la expresion de miR-92 en la celula, frente a la expresion normal de miR-92 en una celula de tipo salvaje, se produce la reduccion de la expresion mediante la puesta a disposicion de una molecula, la cual esta elegida del grupo consistente en moleculas antisentido, inhibidores miR-92 sinteticos e inhibidores de factor de transcripcion. Esta reduccion de la expresion de miR-92 tiene como consecuencia por ejemplo, un refuerzo de la vascularizacion y de la reparacion vascular en el tejido.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En una forma de realizacion del procedimiento segun la invencion, la molecula antisentido es una molecula, la cual hibrida con una molecula de ARN segun una de las SEQ ID NO 1 a 5, tanto en el caso de condiciones estrictas como tambien menos estrictas. Esto incluye la posibilidad de que la molecula antisentido presente en el estado hibridado frente a miR-92, “incompatibilidades”, las cuales no anulan sin embargo, la funcion como molecula antisentido. Se produce de esta manera, a pesar de emparejamiento(s) erroneos(s) de bases, la inhibicion o la estructuracion de miR-92. La molecula antisentido puede presentar en particular una longitud de hasta 80 nucleotidos, preferiblemente de hasta 30 nucleotidos, de manera particularmente preferida de 15 a 22 nucleotidos. En particular para la inhibicion de los precursores miR-90 no maduros, la molecula antisentido puede presentar hasta 80 nucleotidos, en particular hasta 30 nucleotidos. La longitud minima de una molecula antisentido de este tipo es preferiblemente de 12 nucleotidos, preferiblemente de 15 nucleotidos.

En una forma de realizacion preferida, la molecula antisentido presenta una secuencia, que es complementaria de forma reversa a una secuencia segun una de las SEQ ID NO 1 a 5. Debido a ello no se da la conformacion de emparejamiento(s) erroneo(s) de bases, lo cual tiene como consecuencia una inhibicion eficiente de miR-92. En una configuracion preferida de la invencion, la molecula antisentido es una molecula con una secuencia segun SEQ ID NO 6 u 8. Es posible que la molecula antisentido presente al menos una modificacion quimica, por ejemplo, al menos un grupo de 2’ O-metilo, de colesterol, de fosforotioato y/o de 2’-O-metoximetilo-2’-fluor. La molecula antisentido puede presentar tambien o adicionalmente componentes de acido nucleico bloqueado (LNA, del ingles locked nucleic acid). Una forma de realizacion muy preferida de la molecula antisentido con una secuencia segun SEQ ID NO 6 con modificaciones quimicas es por ejemplo, la siguiente molecula:

CtAtGGCCGGGACAAGUGCAtAtUtAt-Chol (SEQ ID NO 9), representando las letras mayusculas nucleotidos modificados de 2’ O-metilo, la sub t (“t”) un enlace de fosforotioato entre nucleotidos adyacentes, y “Chol” un grupo de colesterol.

Una forma de realizacion muy preferida de la molecula antisentido con una secuencia segun SEQ ID NO 8 con modificaciones quimicas es la siguiente molecula: AtCtAtGGCCGGGACAAGUGCAtAtUtAt-Chol (SEQ ID NO 10), representando las letras mayusculas nucleotidos modificados de 2’ O-metilo, la sub t (“t”) un enlace de fosforotioato entre nucleotidos adyacentes, y “Chol” un grupo de colesterol.

Es preferida igualmente una molecula antisentido con una secuencia segun SEQ ID NO 11, la cual presenta solo nucleotidos modificados de 2’ O-metilo.

Los procedimientos para la sintesis de este tipo de moleculas antisentido son conocidos por el experto.

Un procedimiento del tipo mencionado anteriormente para la estimulacion de la angiogenesis, la vascularizacion y la reparacion vascular puede usarse para la terapia de una enfermedad o de un estado. La enfermedad o el estado (eventualmente patologico) se eligen del grupo consistente en isquemia (como infarto de miocardio, enfermedad cardiaca isquemica cronica, oclusion de arterias perifericas o del corazon, infarto isquemico, ictus), angiogenesis patologica (como angiogenesis tumoral, desarrollo de metastasis, retinopatia diabetica, enfermedades inflamatorias cronicas), arteriosclerosis, secuelas patologicas o de la arteriosclerosis (sindrome coronario agudo, infarto de miocardio, ictus, cardiomiopatia) o envejecimiento (prematuro) o enfermedades relacionadas con la edad, asi como enfermedades neurodegenerativas, como Alzheimer y Parkinson.

El procedimiento descrito puede usarse igualmente para el tratamiento de celulas madre o de celulas progenitoras (como celulas proangiogenicas, celulas progenitoras especificas de organos, celulas derivadas de la medula o celulas precursoras circulantes).

De esta manera, el procedimiento puede usarse tanto en vivo, como tambien en ex vivo o in vitro, por ejemplo, para la produccion de material de sustitucion vascular, en particular para la terapia de sustitucion de tejido, o en la investigacion.

Aumento de la expresion de miR-92

Siempre y cuando en el procedimiento la expresion de miR-92 se aumente en una celula, por ejemplo, en una celula endotelial, frente a la expresion normal de miR-92 en una celula de tipo salvaje, esto puede producirse mediante el aumento de la expresion mediante la introduccion en la celula de una construccion que presenta la secuencia miR- 92 expresable. En una forma de realizacion preferida del procedimiento segun la invencion, la construccion miR-92 presenta una secuencia expresable segun una de las SEQ ID NO 1 a 5 o puede expresar una secuencia de este tipo. Las configuraciones ventajosas de una construccion de este tipo se han descrito arriba. Alternativamente puede introducirse tambien miR-92 directamente en la celula.

Un procedimiento del tipo descrito en ultimo lugar para la inhibicion de la angiogenesis tumoral puede usarse para la terapia de una enfermedad o de un estado (patologico), el cual se elige del grupo consistente en desorden de angiogenesis, angiogenesis no deseada, tumores e inflamaciones cronicas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Composicion farmaceutica

La invencion se refiere ademas, a una composicion farmaceutica, comprendiendo o bien un medio para la reduccion de la actividad o de la expresion de miR-92 en una celula en forma de una molecula antisentido contra miR-92, un inhibidor, eventualmente sintetico, y/o un inhibidor de factor de transcripcion; o un medio para el aumento de la expresion de miR-92 en una celula en forma de una construccion para la expresion de miR-92. En este caso, la construccion puede presentar o comprender una secuencia expresable segun una de las SEQ ID NO 1 a 5. La molecula antisentido contra miR-92 comprendida en la composicion farmaceutica presenta en una forma de realizacion una secuencia segun SEQ ID NO 6, 8 u 11. Para otras configuraciones preferidas de la construccion o de la molecula antisentido, se remite a la descripcion contenida arriba y aqui.

La invencion se refiere ademas de ello, a un procedimiento para la produccion de las composiciones farmaceuticas descritas arriba.

La composicion farmaceutica segun la invencion puede presentarse en forma de pastillas, grageas, pildoras, granulados, aerosoles, soluciones en infusion, emulsiones, suspensiones, soluciones o, en o sobre el material de revestimiento de un dispositivo medico implantable, por ejemplo, de una endoprotesis.

El uso conforme a la invencion del medio o de la composicion farmaceutica puede producirse mediante formulaciones conocidas adecuadas.

El uso segun la invencion de los medios puede llevarse de manera conocida a las formulaciones habituales, como pastillas, grageas, pildoras, granulados, aerosoles, emulsiones, suspensiones y soluciones, mediante el uso de excipientes o diluyentes inertes, no toxicos, adecuados farmaceuticamente. En este caso, la concentracion de medio eficaz terapeuticamente, en relacion con los compuestos eficaces terapeuticamente, ha de presentarse correspondientemente en una concentracion de aproximadamente 0,1 % en peso a 95 % en peso, de forma preferida de aproximadamente 0,5 % en peso a 90 % en peso de la mezcla total, es decir, en cantidades, las cuales son suficientes para lograr las concentraciones de principio activo necesarias en el tejido diana.

Las formulaciones se producen por ejemplo, mediante estirado de los medios con diluyentes y/o excipientes, eventualmente mediante el uso de agentes emulgentes y/o de agentes de dispersion, pudiendo usarse por ejemplo, en el caso del uso de agua como medio de dilucion, eventualmente diluyentes organicos como excipientes.

Como excipientes se mencionan por ejemplo, agua, diluyentes no toxicos, como parafina (por ejemplo, fracciones de petroleo), aceites vegetales (por ejemplo, aceite de cacahuete, sesamo), alcoholes (por ejemplo, alcohol etilico, glicerina), excipientes, como harinas de roca (por ejemplo, caolinas, arcilla, talco, carbonato de calcio), harinas de roca sinteticas (por ejemplo, acido silicico altamente disperso, silicatos), azucar (por ejemplo, azucar de cana, lactosa y glucosa), agentes emulgentes (por ejemplo, esteres de acidos grasos de polioxietileno, eteres de alcoholes grasos de polioxietileno), agentes de dispersion (por ejemplo, lignina, lejias al sulfito, metilcelulosa, almidon y polivinilpirrolidona) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, acido estearico y sulfato de sodio).

La aplicacion se produce habitualmente de forma preferida oral o parenteralmente, en particular de forma perlingual o intravenosa. En el caso de la aplicacion oral de los medicamentos segun la invencion, las pastillas pueden comprender naturalmente, ademas de los excipientes mencionados, tambien aditivos, como citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato de dicalcio junto con diferentes agentes aditivos, como almidon, preferiblemente fecula de patata, gelatina y similares. Pueden usarse ademas de ello tambien, para la conformacion de pastillas, agentes lubricantes, como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco. En el caso de suspensiones acuosas, los principios activos pueden mezclarse ademas de con los excipientes mencionados mas arriba, con diferentes agentes de mejora del sabor o colorantes. Para el caso del uso parenteral, pueden usarse soluciones de los principios activos mediante el uso de materiales excipientes liquidos adecuados.

Procedimiento para la terapia o profilaxis

La invencion se refiere ademas de ello, a un procedimiento para la terapia o profilaxis de un individuo, en particular de un paciente, mediante el uso de miR-92 o de un antagonista miR-92 (por ejemplo, una molecula antisentido o un inhibidor de factor de transcripcion) o de una composicion farmaceutica segun la descripcion anterior o aqui comprendida. En el marco de un procedimiento de este tipo, pueden suministrarse cantidades de principio activo de entre 0,001 mg a 200 mg por kg de peso corporal por dia.

Molecula antisentido contra miR-92

La invencion se refiere tambien a una molecula antisentido contra miR-92 presentando una secuencia, la cual hibrida con una molecula de una secuencia segun SEQ ID NO 1 a 5, presentando la molecula hasta 80 nucleotidos, en particular de 15 a 22 nucleotidos o consistiendo en ellos. Una molecula antisentido de este tipo presenta ventajosamente al menos 12 nucleotidos, preferiblemente al menos 15 nucleotidos. La hibridacion puede producirse en condiciones estrictas o menos estrictas. El experto conoce procedimientos para la determinacion de la hibridacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Una molecula de este tipo puede presentar eventualmente modificaciones quimicas. Es particularmente preferida una molecula segun sEq ID NO 6, 8 u 11, la cual presenta al menos una de las modificaciones quimicas mencionadas arriba. Las moleculas antisentido preferidas con modificaciones quimicas son las moleculas segun SEQ ID NO 9 y 10, las cuales se derivan de las moleculas segun SEQ ID NO 6 u 8.

Una molecula de este tipo puede usarse segun la invencion, para la estimulacion de la angiogenesis, la vascularizacion y la reparacion vascular. miR-92 o una molecula con una secuencia segun una de las SEQ ID NO 1 a 5 puede usarse segun la invencion, para la inhibicion de la angiogenesis tumoral y particularmente para la produccion de una composicion farmaceutica descrita anteriormente.

En particular, en una forma de realizacion preferida, la invencion no se refiere a ningun procedimiento para clonar seres humanos o a procedimientos para la modificacion de la identidad genetica de la linea germinal del ser humano, asi como tampoco al uso de embriones humanos para fines industriales o comerciales o a procedimientos para la modificacion de la identidad genetica de animales, los cuales son adecuados para producir sufrimiento de estos animales sin utilidad medica esencial para la persona o el animal, asi como de los animales producidos con la ayuda de estos procedimientos.

La invencion se explica con mayor detalle mediante ejemplos, sin limitarse a estos ejemplos. Los resultados de las pruebas descritas en los ejemplos se representan en las figuras.

Figuras

Muestran

La figura 1: efectos de la sobreexpresion de miR-92 en funciones in vitro de celulas endoteliales (como celulas puestas a disposicion).

(A) sobreexpresion de miR-92 en celulas endoteliales transfectadas con pre-miR-92.

(B/C) inhibicion de conformacion de brotes en un esferoide (B) y en un “ensayo Matrigel” (C).

(D/E/F) efecto de pre-miR-92 en la viabilidad (D) migracion (E) y adhesion (F).

La figura 2: el efecto de la sobreexpresion de miR-92 en la angiogenesis in vivo.

(B/C/D) inhibicion de la angiogenesis in vivo. Las HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical) se transfectaron con una muestra de control o con pre-miR-92 y se implantaron 1x106 celulas en “soportes Matrigel” in vivo. La angiogenesis se determino en cortes H&E (B/C) y la perfusion se determino (D) mediante la medicion de la hemoglobina.

La figura 3: el efecto de la inhibicion de miR-92 en la angiogenesis in vitro e in vivo.

(A) estimulacion de la gemacion in vitro mediante oligonucleotidos de 2’ O-metilo, que bloquean miR-92. (B/C/D/E) el efecto de la fusion sistemica de un antagomir sobre la neovascularizacion in vivo. (B) diseno experimental, (C) expresion de miR-92 en diferentes organos (corazon, aorta, bazo, higado). (D) efectos en la perfusion segun los resultados de medicion de la concentracion de hemoglobina, (E) imagenes representativas (tincion H&E) para la representacion de conformacion de vasos.

La figura 4: la identificacion de moleculas diana de miR-92.

(A) perfil de expresion genetica HUVEC tras tratamiento con pre-miR-92.

(B/C) confirmacion de la falta de regulacion de la expresion de proteina mediante Western blot en HUVEC tras transfeccion de pre-miR-92.

(D/E) deteccion del efecto de pre-miR-92 en la expresion de integrina mediante FACS.

La figura 5: influencia de miR-92a en la angiogenesis in vitro (a-c) e in vivo (d-f). In vitro: pre-miR-92 se sobreexpreso en HUVEC y la angiogenesis se determino en el modelo esferoide (a) y ensayo Matrigel (b) in vitro. N>3, *p<0.05 versus muestra de control (Co). El panel C muestra ejemplos representativos.

In vivo: se mezclaron con Matrigel HUVEC transfectadas con pre-miR-92a o microARN de control (Co) y se trasplantaron en ratones sin pelo. La conformacion de vasos se determino mediante la deteccion de las celulas integradas (d), la determinacion del/de los vaso(s) (e) perfundidos en lectina in vivo y mediante la deteccion del contenido de hemoglobina. N>4, *p<0.05 versus muestra de control (Co).

La figura 6: influencia de inhibicion de miR-92 en la angiogenesis in vitro.

a/b) miR-92a se bloqueo mediante sobre expresion de oligoribonucleotidos antisentido de 2’ O-metilo y se determino la angiogenesis en el modelo esferoide in vitro. N>3, *p<0.05 versus oligonucleotido de control (Co) (2’OMeGFP).

c) se inhibio miR-92a mediante la incubacion con antagomir-92a y se determino la angiogenesis en el modelo esferoide in vitro. N=5, *p<0.05 versus muestra de control PBS.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La figura 7: influencia de antagomir-92a en la conformacion de vasos en el modelo Matrigel (a-c) y modelo de isquemia de extremidades posteriores (d-f).

Se inyectaron de forma intravenosa antagomir-92a, dos diferentes antagomirs de control o el diluyente PBS los dias 1, 3, 5 (8 mg/kg de peso corporal) y se explanaron los soportes Matrigel el dia 7. Se determinaron las cantidades de celulas inmigradas (H&E, a), de vasos positivos en lectina perfundidos (b) y el contenido de hemoglobina (c). N>4, p<0.05 versus PBS o muestras de control antagomir (Co). Antagomir-92a o muestras de control se inyectaron de forma intravenosa en los dias 0, 2, 4, 7, 9 tras isquemia de extremidades posteriores y se determino el riego sanguineo mediante laser Doppler (d, ejemplo E). La ilustracion F muestra la especificidad de antagomir-92a en la expresion de miR-92a y diversos otros microARNs. N>3, p<0.05 versus muestras de control (Co).

La figura 8: ilustracion 4: influencia de antagomir-92a en la funcion cardiaca tras infarto de miocardio. El antagomir-92a, el antagomir de control (antagomir-Co) o el diluyente PBS se inyectaron de forma intravenosa (8 mg/kg de peso corporal) tras la induccion del infarto cardiaco los dias 0, 2, 4, 7, 9, y se determino la funcion cardiaca el dia 14 mediante cateter Millar. a-c muestra la determinacion de parametros de funcion cardiaca (a: contractilidad, b: presion, c: constante de relajacion). Los animales tratados con antagomir-92a muestran sin excepcion mejores parametros de funcionamiento cardiacos en comparacion con el grupo antagomir-Co y PBS. D) muestra el aumento significativo de los capilares en diferentes regiones del corazon tras tratamiento con antagomir-92a. E) muestra la reduccion de la magnitud de infarto y de la transformacion fibrosa en el grupo tratado con antagomir-92a. Todos los experimentos N>5, *p<0.05 versus muestra de control (Co).

La figura 9: influencia de los componentes individuales del cluster miR-17-92 en la angiogenesis in vitro.

a) efecto directo de la sobreexpresion de los microARNs individuales en la angiogenesis en muestra esferoide (N>3, *p<0.05).

b) efecto paracrino de celulas tumorales, las cuales se transfectaron con miR-17 o miR-18, en la angiogenesis de celulas endoteliales. Como se representa, se transfectaron celulas tumorales y entonces el sobrenadante se paso a celulas endoteliales (HUVEC), para comprobar el efecto de factores paracrinos. La sobreexpresion de miR-17 conduce a un aumento de la angiogenesis.

Ejemplos

Material y metodos Cultivo celular

Se obtuvieron celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano (HUVEC) de Cambrex y se cultivaron hasta la tercera pasada habiendoseles anadido en medio basal (EBM; Cambrex), hidrocortisona, extracto de cerebro bovino, factor de crecimiento epidermico y 10 % de suero de ternero fetal (FCS; Gibco). Tras la separacion con tripsina se cultivaron las celulas en placas de cultivo de 6 cm durante al menos 24 a 48 horas.

Transfeccion

Para la inhibicion de miR-92 se cultivaron HUVEC antes de la transfeccion con el inhibidor especifico hasta una confluencia de 60 % a 70 %. Se sintetizaron oligoribonucleotidos 2’O-metilo antisentido contra miR-92 (5’- CAGGCCGGGACAAGUGCAAUA-3’, SEQ ID NO 11) o GFP (5’- AAGGCAAGCUGACCCUGAAGUU -3’, SEQ ID NO 7) de VBC Biotech y se transfectaron 50 nmol/l con GeneTrans II® (MoBiTec) segun el protocolo del fabricante. Para la sobreexpresion de miR-92 se cultivaron HUVEC hasta una confluencia del 50 %. 10 nmol/l de pre-miR-92 o de pre-miR de control (Ambion) se transfectaron con Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) segun el protocolo del fabricante.

Estrategia antagomir

El ARN monocatenario utilizado en este caso consistio en 21 a 23 nucleotidos y fue sintetizado por VBC Biotech como se ha descrito (13). Todos los modelos animales se mantuvieron en un fondo C57BL/6J. Se inyectaron a ratones de ocho semanas de edad subcutaneamente a lo largo de la linea central abdominal dos “soportes Matrigel Basement Matrix” el dia 0 y obtuvieron inyecciones de vena de cola de una solucion salina o de un antagomir 92 los dias 1,3 y 5. Antagomir 92 se suministro en dosis de 8 mg por kg de peso corporal en 0,2 ml de solucion tampon de fosfato salino (PBS) por inyeccion. El sexto dia se recogieron tejido y los “soportes Matrigel”. El tejido se congelo en nitrogeno liquido y se guardo para el analisis de ARN a -80 0C. Para el analisis de la hemoglobina se retiro un “soporte Matrigel” tras siete dias y se homogeneizo en 130 gl de agua desionizada. Tras la centrifugacion se uso el sobrenadante en una muestra Drabkin (Sigma-Aldrich) para la medicion de la concentracion de la hemoglobina. Se usaron concentraciones madre de la hemoglobina para la produccion de una curva estandar. Los resultados se expresan en relacion con la proteina total en el sobrenadante. El segundo “soporte Matrigel” se uso para la cuantificacion de celulas entrantes mediante tincion H&E.

Analisis Western Blot

Para el analisis Western Blot se lisaron HUVEC en tampon de lisado RIPA (Sigma) durante 20 minutos en hielo. Tras un centrifugado de minutos a 20.000 x g (4 0C) se determino el contenido de proteinas de las muestras

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

mediante el metodo Bradford. Se cargaron cantidades de proteina iguales en un gel de poliacrilamida SDS y se transfirieron a una membrana PVDF o de nitrocelulosa. Los Western Blots se llevaron a cabo mediante el uso de anticuerpos con integrina a5 (anticuerpos policlonales antiintegrina a5 de conejo; 1:250, Chemikon), MKK4 (anti MKK4 policlonal de conejo, 1:1.000, Cell Signaling), eNOS (anti-eNOS monoclonal de raton, 1:2.500, BD), SIRT 1 (anti-SIRTI policlonal de conejo, 1:1.000, Upstate) o tubulina (anti-tubulina monoclonal de raton; 1:1.500, Dianova).

RT-PCR

Para determinar la expresion miARN diferencial en HUVEC, las cuales se transfectaron con oligoribonucleotidos antisentido de 2’ O-metilo contra miR-92 o pre-miR-92, 24 horas tras la transfeccion, se aislo la totalidad de ARN mediante el uso de TRIzol (Invitrogen) segun el protocolo del fabricante. Se llevo a cabo una RT-PCR mediante el uso del kit de deteccion mirVana™ qRT-PCR miARN (Ambion) y sets primarios, los cuales son especificos para la amplificacion de hsa-miR-92 (Ambion) (un ciclo: 3 minutos a 95 0C, 25 ciclos: 15 segundos a 95 0C, 30 segundos a 60 0C).

Ensayo de migracion

Para determinar la migracion de celulas endoteliales, se separaron con tripsina HUVEC, se cultivaron mediante centrifugacion y se resuspendieron en 500 pl de EBM con 0,1 de BSA, se contaron y se dispusieron en la camara superior de una camara de Boyden modificada (5 x 104 celulas por camara, tamanos de poro 8 pm, BD Biosciences), la cual estaba revestida con 2,5 pg/l de fibronectina. La camara se dispuso en una placa de cultivo con 24 pocillos, los cuales contenian EBM con 0,1 % de BSA y factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF, 50 ng/ml). Tras una incubacion durante 5 horas a 37 0C, se retiraron mecanicamente las celulas no migrantes del lado superior de la camara y las celulas restantes en el lado inferior se fijaron con 4 % de formaldehido. Para la cuantificacion se tineron los nucleos celulares con 4’6-diaminofenilindol (DABI). Las celulas migrantes en el lado inferior de la camara se contaron manualmente en cinco campos microscopicos elegidos arbitrariamente.

Ensayo de formacion de vasos

Las HUVEC (7 x 104) se cultivaron en una placa con 12 pocillos (Grenier) revestidos de 200 pl de “Matrigel Basement membrane Matrix” (DB Biosciences). Las reticulaciones endoteliales conformadas se cuantificaron tras 24 horas en cinco campos microscopicos elegidos arbitrariamente, mediante un microscopio controlado por ordenador, mediante el uso del programa KS300 3.0 (Zeiss).

Ensayo de angiogenesis basado en esferoide

Los esferoides celulares endoteliales de cantidad celular definida se produjeron tal como se ha descrito (22, 23). La angiogenesis in vitro se determino mediante medicion de la longitud acumulativa de las estructuras resultantes, que crecieron de cada esferoide, y en concreto mediante el uso de un software de imagen digital (Axioplan, Zeiss), fueron analizados 10 esferoides por grupo experimental y experimento.

Ensayo de viabilidad MTT

La medicion de la viabilidad celular se produjo mediante el uso del (bromuro de 3-(3,4-dimetiltiazol-2-il)-2,5-d ifenil- 2H-tetrazolio) (ensayo MTT). 48 horas tras la transfeccion se introdujeron 0,5 mg/ml de MTT en cada pocillo y las celulas se incubaron durante 4 horas a 37 0C. Las celulas se lavaron con PBS y se lisaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con tampon de lisado (40 nmol/l HCI en isopropanol). La absorcion se midio fotometricamente a 550 nm.

Adhesion de matriz celular

Se revistieron placas de cultivo celular con 96 pocillos durante la noche a 4 0C de 1 pg/ml de colageno I humano recombinante soluble (Roche, Mannheim, Alemania) o de 2,5 pg/ml de fibronectina humana (Roche, Mannheim, Alemania) en PBS y se incubaron entonces durante una hora a temperatura ambiente con 3 % (peso/porcentaje en volumen) de albumina serica humana (HSA) inactiva por calor (2 horas, 56 0C). Las HUVEC se tineron con 2’,7’-bis- (2-carboxietil)-5-(y 6)-ester acetoximetilico de carboxifluoresceina (BCECF-AM) o Cell Tracker Green (Molecular Probes, Eugene, Oregon) y despues de la separacion se resuspendieron con tripsina en EBM con 0,05 % de HSA. Entonces se seleccionaron 50.000 celulas por pocillo en 100 pl de EBM con 0,05 % de HSA en los pocillos revestidos y se incubaron durante 60 minutos a 37 0C. Tras el lavado de celulas no adherentes con EBM caliente, las celulas adherentes se cuantificaron triplemente con un dispositivo de lectura de placa de fluorescencia (Fluostat, BMG Lab Technologies, Offeburg, Alemania).

Analisis de citometri'a de flujo

Para la permeabilizacion se separaron con tripsina HUVEC transfectadas con pre-miR-92 o muestra de control, se fijaron en 4 % de formaldehido durante 10 minutos y se trataron con 0,1 % de TritonX-100. Las celulas (permeabilizadas y no permeabilizadas) se bloquearon mediante el uso de 1 % de BSA y se tineron con anticuerpos de integrina a5 (Anti-CD49e-FITC 1:10, Immunotech) o integrina b1 (Anti-CD29-APC 1:20, BD). Las celulas se

analizaron con un dispositivo FACS Canto II (BD).

Ensayo “soporte Matrigel” in vivo

Este ensayo se llevo a cabo como se ha descrito (24), no obstante, con las siguientes modificaciones:

Se transfectaron HUVEC con pre-miR-92 o para el control, como se ha descrito arriba. 18 horas tras la 5 transfeccion se marcaron las celulas con “cell Tracker CM-Dil” (Invitrogen), se separaron, se lavaron y se

contaron. 1 x 106 celulas se resuspendieron en 30 gl de PBS y se mezclaron con 500 gl de “Matrigel Basement Membrane Matrix” (DB Biosciences) comprendiendo 15 unidades de heparina (Sigma-Aldrich). La mezcla de celulas-Matrigel se inyecto subcutaneamente en ratones sin pelo (Harlan) atimicos hembra de seis a ocho semanas de edad, a lo largo de la linea central abdominal. El analisis de la hemoglobina y la tincion H&E se 10 llevaron a cabo como se ha descrito arriba.

Perfilado de ARNm Affymetrix

Se transfectaron HUVECS con pre-miR-92 o para el control. La totalidad del ARN se aislo tras 48 horas y se midio el perfil de expresion genetica mediante un ensayo de expresion de chip de gen Affymetrix.

Resultados

15 Pre-miR-92 bloquea funciones celulares endoteliales in vitro e in vivo

Para examinar el efecto de miR-92 en celulas endoteliales, se transfectaron HUVEC con el precursor miR-92 pre- miR-92 y se determino el efecto de esta transfeccion en diferentes ensayos in vitro. La sobreexpresion eficiente de miR-92 se comprobo en primer lugar mediante RT-PCR (figura 1A). La sobreexpresion miR-92 bloqueo de manera significativa la formacion de estructuras de vaso en un ensayo esferoide (figura 1B) e inhibio la formacion de una 20 reticulacion vascular en Matrigeles (figura 1C), circunstancia que pone de manifiesto que miR-92 es un regulador negativo de la angiogenesis in vitro. Para determinar un posible efecto toxico de miR-92, se midio la viabilidad celular. En este caso no pudieron determinarse tras la transfeccion de pre-miR-92 en comparacion con celulas no transfectadas, diferencias significativas (figura 1D). Dado que la migracion celular endotelial para la actividad de angiogenesis de celulas in vitro es de gran importancia, se determino adicionalmente la migracion de HUVEC en 25 condiciones basales y como respuesta a VEGF. Pre-miR-92 redujo la migracion (figura 1E) y la adhesion de las celulas a fibronectina (figura 1F). Debido a ello, pre-miR-92 no muestra ningun efecto toxico directo, sino que bloquea la respuesta celular endotelial, que se requiere para la angiogenesis. Se determino ademas de ello, el efecto de pre-miR-92 en la angiogenesis in vivo. Para ello se implantaron HUVEC transfectadas con pre-miR-92 en un “soporte Matrigel” en ratones sin pelo in vivo. La eficiencia de la inhibicion se controlo respectivamente en una 30 subfraccion de las celulas implantadas (figuras 2A). Como se muestra en las imagenes representativas de la figura 2B y la cuantificacion de la figura 2C, pre-miR-92 bloquea el crecimiento de los vasos in vivo de forma eficiente. Ademas de ello, la perfusion esta significativamente reducida, lo cual pudo demostrarse mediante medicion de la concentracion de hemoglobina en los “soportes Matrigel” explantados (figura 2B).

La inhibicion de miR-92 aumenta la angiogenesis in vitro e in vivo

35 Se examino ademas de ello, si la inhibicion de miR-92 tenia como consecuencia la estimulacion del crecimiento de vasos. miR-92 fue inhibido mediante oligoribonucleotidos antisentido de 2’ O-metilo (O-metilo-miR-92) y la formacion de estructuras de vasos in vitro se determino mediante un ensayo esferoide. O-metilo-miR-92 aumento la formacion de brotes in vitro (figura 3A), circunstancia que pone de manifiesto que la inhibicion de miR-92 podria representar una nueva estrategia terapeutica para la mejora de la angiogenesis. Para comprobar esta hipotesis, se inhibio 40 sistemicamente miR-92 mediante el uso de llamados “antagomirs”, oligonucleotidos de ARN monocatenarios, que presentan una secuencia complementaria frente a miARNs especificos. Modificaciones quimicas conducen a una estabilidad aumentada y conjugacion de colesterol para una absorcion mejorada en las celulas (15). Antagomirs orientados contra miR-92 se suministraron como se representa en la figura 3B en tres dias. La entrega sistemica de antagomirs mejoro el crecimiento de vasos y la perfusion del “soporte Matrigel” in vivo (figuras 3C/D). Como 45 resultado, la inhibicion de miR-92 aumenta funciones celulares endoteliales in vitro y mejora el crecimiento de vasos in vivo.

Identificacion de genes diana de miR-92

Los miARNs controlan genes diana mediante degradacion del ARNm diana o mediante represiones translacionales. Para poder determinar los ARNms diana, los cuales se degradan como respuesta a la sobreexpresion de miR-92, se 50 llevo a cabo un analisis de chip con una matriz de expresion de gen ARNm Affymetrix con 54.681 genes (HG-U133 Plus 2). El analisis de los ARNms regulados identifico diferentes enzimas clave, las cuales controlan la funcion endotelial, incluyendo eNOS, SIRT1, integrinas y factores de crecimiento como angiopoyetina 2 (figura 4A). Una parte de los genes inactivados son compatibles con un analisis llevado a cabo in silico de potenciales dianas de miR- 92 (tabla 1). Para confirmar los resultados de la filtracion, se detecto la expresion de proteina de los 55 correspondientes genes mediante Western Blot o analisis FACS. En consonancia con los resultados pronosticados, se reprimio de forma significativa la expresion de proteina de eNOS, SIRT1 e integrina a5 mediante pre-miR-92

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(figuras 4B a E).

Tabla 1: pronostico in silico de moleculas diana de miR-92, a traves de las cuales se transmite el efecto

biologico de miR-92

miR-92 - dianas

Integrina a5 Integrina av SIRT1 MKK4 KLF 2 PCAF EDG 1 RAP1B

Como resultado, miR-92 muestra un fuerte efecto antiangiogenico e influye en funciones celulares endoteliales in vitro e in vivo. En consonancia con ello, el bloqueo de miR-92 mediante infusion sistemica de un antagomir, conduce a un crecimiento de vasos mejorado in vivo. Este resultado es sorprendente, dado que se encuentra (10) en oposicion a la actividad proangiogenica descrita del miR-17-92 del cluster.

Los presentes datos muestran que miR-92 influye en la expresion de diferentes proteinas, las cuales se conocen por tener una importancia decisiva en la biologia celular endotelial. Entre los genes identificados mediante una micromatriz, pudo confirmarse en particular la inactivacion de eNOS, SIRT1 e integrina a5 a nivel de las proteinas. Los ratones, los cuales son deficientes para estas proteinas, muestran una funcion vascular perjudicada y/o una capacidad perjudicada para la neovascularizacion postnatal.

eNos tiene una importancia en el mantenimiento de la reactividad vascular y bloquea apoptosis de celulas endoteliales (16). La histona deacetilasa SIRT1 estimula la longevidad en organismos modelo y controla la neovascularizacion y la maduracion vascular en mamiferos (13, 17). La falta de regulacion de integrinas puede tener un efecto negativo en la interaccion con la matriz celular y puede perjudicar de esta manera la senalizacion antiapoptotica y la migracion celular (14, 18). El factor de crecimiento angiopoyetina 2, su receptor Tie2 y los inhibidores de proteasa como TIMP4 controlan la maduracion vascular (19, 20). Como consecuencia de ello, miR-92 interactua con una serie de genes, los cuales controlan en diferentes niveles funciones celulares endoteliales. La capacidad de miR-92 de influir en diferentes efectores, representa una ventaja de la estrategia terapeutica basada en miARN y contribuye a superar la capacidad terapeutica limitada de una terapia basada en un unico factor de crecimiento o en un unico gen, de una enfermedad isquemica, dado que los procesos complejos del crecimiento vascular, de la maduracion vascular y del mantenimiento funcional de los vasos, presuponen de forma conocida una regulacion finamente adaptada de una serie de genes.

Como resultado, la influencia de miR-92 representa una estrategia terapeutica nueva para el control de funciones celulares endoteliales. En particular, el uso sistemico aqui mostrado de antagomirs es adecuado para la influencia de las funciones miARN. La inhibicion de miR-92 mediante antagomirs aumenta el crecimiento vascular y contribuye a la mejora de la neovascularizacion y de la reparacion vascular. En relacion con los genes, los cuales se conocen por su efecto arterioprotector, como por ejemplo, eNOS, el bloqueo de miR-92 es provechoso en la terapia antiarteriosclerotica. Dado que a SIRT 1 se le atribuye (25) tambien una funcion neuroprotectiva en enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, Parkinson), los antagomirs miR-92 pueden usarse exitosamente tambien en este cuadro clinico. A diferencia de ello, la sobreexpresion de miR-92 es util por ejemplo, para el bloqueo de la angiogenesis tumoral, dado que mediante ella, se reduce fuertemente el crecimiento vascular.

Referencias

1 Carmeliet, P. (2000) Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 6 (4), 389-395.

2 Adams, R.H. and Alitalo, K. (2007) Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol 8 (6), 464-478

3 Bartel, D.P. (2004) MicroARNs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116 (2), 281-297

4 Hofacker, I.L. (2007) How microARNs choose their targets. Nat Genet 39 (10), 1191-1192

5 Yang, W.J. et al. (2005) Dicer is required for embryonic angiogenesis during mouse development. J Biol Chem 280 (10), 9330-9335

6 Suarez, Y. et al. (2007) Dicer dependent microARNs regulate gene expression and functions in human endothelial cells. Circ Res 100 (8), 1164-1173

7 Kuehbacher, A. et al. (2007) Role of Dicer and Drosha for endothelial microARN expression and angiogenesis. Circ Res 101 (1), 59-68

8 Poliseno, L. et al. (2006) MicroARNs modulate the angiogenic properties of HU-VECs. Blood 108 (9), 30683071

9 Venturini, L. et al. (2007) Expression of the miR-17-92 polycistron in chronic myeloid leukemia (CML) CD34+ cells. Blood 109 (10), 4399-4405

10 Dews, M. et al. (2006) Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microARN cluster. Nat Genet 38 (9), 1060-1065

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

11 Murohara, T. et al. (1998) Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response to tissue ischemia. J Clin Invest 101 (11), 2567-2578

12 Aicher, A. et al. (2003) Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nat Med 9 (11), 1370-1376

13 Potente, M. et al. (2007) SIRT1 controls endothelial angiogenic functions during vascular growth. Genes Dev 21 (20), 2644-2658

14 Kim, S. et al. (2000) Regulation of integrin alpha vbeta 3-mediated endothelial cell migration and angiogenesis by integrin alpha5beta1 and protein kinase A. J Biol Chem 275 (43), 33920-33928.

15 Krutzfeldt, J. et al. (2005) Silencing of microARNs in vivo with ’antagomirs’. Nature 438 (7068), 685-689

16 Dimmeler, S. and Zeiher, A.M. (1999) Nitric oxide - an endothelial cell survival factor. Cell Death Differ 6, 964968

17 Imai, S. et al. (2000) Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NADdependent histone deacetylase. Nature 403 (6771), 795-800.

18 Zhang, Z. et al. (1995) The alpha 5 beta 1 integrin supports survival of cells on fibronectin and up-regulates Bcl-2 expression. Proc Natl Acad Sci U S A 92 (13), 6161 -6165

19 Asahara, T. et al. (1998) Tie2 receptor ligands, Angiopoietin-1 and Angiopoietin-2, modulate VEGF-induced postnatal neovascularization. Circ Res 83, 233-240

20 Sang, Q.X. (1998) Complex role of matrix metalloproteinases in angiogenesis. Cell Res 8 (3), 171-177

21 Care, A. et al. (2007) MicroARN-133 controls cardiac hypertrophy. Nat Med 13 (5), 613-618

22 Korff, T. and Augustin, H.G. (1998) Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J Cell Biol 143 (5), 1341-1352

23 Diehl, F. et al. (2007) The histone methyltransferase MLL is an upstream regulator of endothelial cell sprout formation. Blood 109 (4), 1472-1478

24 Potente, M. et al. (2005) Involvement of FoxO transcription factors in angiogenesis and postnatal neovascularization. J Clin Invest 115(9), 2382-2392.

25 Dillin, A. and Kelly, J.W. (2007) The yin-yang of sirtuins. Science 317 (5837), 461-462 <110> Johann Wolfgang Goethe-Universitat Frankfurt am Main

<120> Procedimiento para la estimulacion de la angiogenesis, vascularizacion o reparacion vascular o para la inhibicion de la angiogenesis tumoral

<130> U60023PCT

<150> DE 10 2007 052 114.8 <151 >

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 78

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 1

cuuucuacac agguugggau cgguugcaau geuguguuuc uguaugguau ugcacuuguc 60

ccggccuguu gaguuugg 78

<210>2

<211> 75

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 2

ucaucccugg guggggauuu guugcauuac uuguguucua uauaaaguau ugcacuuguc 60

ccggccugug gaaga 75

<210>3 <211> 96 <212> ARN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<213> Homo sapiens <400>3

cgggccccgg gcgggcggga gggacgggac gcggugcagu guuguuuuuu cccccgccaa 60

uauugcacuc gucccggceu ecggccccoc cggocc 96

<210>4

<211> 22

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 4

uauugcacuu gucccggccu gu 22

<210>5

<211> 22

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 5

uauugcacuc gucccggccu cc 22

<210>6 <211> 21 <212> ARN <213> artificial

<220>

<223> Oligoribonucleotido antisentido contra miR-92 <400> 6

caggccggga caagugcaau a 21

<210>7 <211> 22 <212> ARN <213> artificial

<220>

<223> Oligoribonucleotido antisentido 2’O-metilo contra GFP <220>

<221 > misc_feature <222> (11 )..(22)

<223> Nucleotido modificado con 2’O-metilo <400> 7

aaggcaagcu gacccugaag uu 22

<210>8 <211> 22 <212> ARN <213> Artificial

<220>

<223> Oligoribonucleotido antisentido contra miR-92 <400> 8

acaggccggg acaagugcaa ua 22

<210>9 <211> 21 <212> ARN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213> Artificial <220>

<223> Oligoribonucleotido antisentido modificado con 2’O-metilo contra miR-92 <220>

<221 > misc_feature <222> (11 )..(2)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (2)..(3)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (18)..(19)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (19)..(20)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (20)..(21)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (21 )..(21)

<223> grupo colestero 3'

<220>

<221 > misc_feature <222> (21 )..(21)

<223> fosfotioato

<400> 9

caggccggga caagugcaau a 21

<210> 10 <211> 22 <212> ARN <213> Artificial

<220>

<221 > misc feature <222> (11 )..(2)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > mise feature <222> (2)..(3)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (3)..(4)

<223> Enlace fosfotioato

5

10

15

20

25

30

35

40

<220>

<221 > misc_feature <222> (19)..(20)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (20)..(21)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (21 )..(22)

<223> Enlace fosfotioato

<220>

<221 > misc_feature <222> (22)..(22)

<223> grupo colestero 3'

<220>

<221 > misc_feature <222> (22)..(22)

<223> fosfotioato

<400> 10

acaggccggg acaagugcaa ua 22

<210> 11 <211> 21 <212> ARN <213> Artificial

<220>

<221 > misc_feature <222> (1)..(21)

<223> Nucleotido modificado con 2’O-metilo <400> 11

caggccggga caagugcaau a 21

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro para la estimulacion de la vascularizacion o la reparacion vascular, que presenta los siguientes pasos:

- puesta a disposicion de una celula; e

- introduccion en la celula de una molecula antisentido contra miR-92.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, procediendo la celula puesta a disposicion de un metazoo, en particular de un mamifero.
3. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 o 2, siendo la celula puesta a disposicion una celula vascular, una celula hematopoyetica, una celula de musculo cardiaco, una celula inflamatoria, una celula neuronal, una celula progenitora o una celula madre, no siendo la celula madre ninguna celula madre embrionaria humana.
4. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 3, siendo la molecula antisentido una molecula que hibrida con una molecula de ARN segun una de las SEQ ID NO 1 a 5.
5. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 3, siendo la molecula antisentido una molecula con una secuencia segun SEQ ID NO 6, 8 u 11.
6. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 5, presentando la molecula antisentido una secuencia que es complementaria a una secuencia segun una de las SEQ ID NO 1 a 5.
7. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 6, presentando la molecula antisentido una longitud de hasta 30 nucleotidos, en particular de 15 a 22 nucleotidos.
8. Uso de un procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 7 para la preparacion de material de sustitucion vascular.
9. Uso in vitro de una molecula antisentido para la estimulacion de la vascularizacion y de la reparacion vascular, presentando la molecula antisentido una secuencia que hibrida con una molecula de una secuencia segun SEQ ID NO 1 a 5, presentando la molecula antisentido hasta 30 nucleotidos.
10. Uso de una molecula antisentido para la preparacion de una composicion farmaceutica, para el tratamiento de isquemia, de angiogenesis patologica, de arteriosclerosis, de secuelas patologicas de la arteriosclerosis o de enfermedades asociadas a la edad, asi como de enfermedades neurodegenerativas, presentando la molecula antisentido una secuencia que hibrida con una molecula de una secuencia segun SEQ ID NO 1 a 5, presentando la molecula antisentido hasta 30 nucleotidos.
11. El uso segun la reivindicacion 10, eligiendose la isquemia de entre infarto de miocardio, enfermedad cardiaca isquemica cronica, oclusiones de arterias perifericas o cardiacas, infarto isquemico o ictus; o eligiendose una secuela patologica de la arteriosclerosis de entre sindrome coronario agudo, infarto de miocardio, ictus y cardiomiopatia; o eligiendose la enfermedad neurodegenerativa de entre Alzheimer y Parkinson.
12. El uso segun las reivindicaciones 10 u 11, siendo la molecula antisentido una molecula con una secuencia segun SEQ ID NO 6, 8 u 11.
13. Molecula antisentido para el uso en la terapia de una enfermedad elegida de entre isquemia, angiogenesis patologica, arteriosclerosis, secuelas patologicas de la arteriosclerosis o enfermedades asociadas a la edad, asi como enfermedades neurodegenerativas, presentando la molecula antisentido una secuencia que hibrida con una molecula de una secuencia segun SEQ ID NO 1 a 5 y presentando la molecula antisentido hasta 30 nucleotidos.
14. La molecula antisentido para el uso segun la reivindicacion 13, eligiendose la isquemia de entre infarto de miocardio, enfermedad cardiaca isquemica cronica, oclusion de arterias perifericas o cardiacas, infarto isquemico o ictus; o eligiendose una secuela patologica de la arteriosclerosis de entre sindrome coronario agudo, infarto de miocardio, ictus y cardiomiopatia; o eligiendose la enfermedad neurodegenerativa de entre Alzheimer y Parkinson.
15. La molecula antisentido para el uso segun las reivindicaciones 13 o 14, siendo la molecula antisentido una molecula con una secuencia segun SEQ ID NO 6, 8 u 11.