CN105189751B - 桥接双环核苷 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及2’‑C‑桥接双环核苷和核苷酸，以及包含至少一个2’‑C‑桥接双环核苷酸的寡核苷酸。本发明进一步提供包含所述核苷，核苷酸，以及寡核苷酸的药物组合物，以及它们相应的使用和合成方法。

Description

桥接双环核苷
相关申请
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/791,704的优先权和权益，通过提及将其完整收入本文。
发明领域
本发明涉及经修饰的核苷，核苷酸，以及寡核苷酸，当施用到患者时，具有合成，效力，递送效率，目标特异性，稳定性，和/或毒性的优势。
发明背景
反义寡核苷酸抑制物的寡核苷酸化学模式或基序具有改善抑制物的递送，稳定性，效力，特异性和/或毒性概况的潜能，并且这是需要的，用于在治疗背景中有效地靶向RNA功能。
发明概述
本发明涉及经修饰的核苷，核苷酸，和寡核苷酸，其包含至少一个2’-C-桥接双环核苷酸(CBBN)，以及包含经修饰的寡核苷酸的药物组合物。本发明还提供这些寡核苷酸，以及合成中间物的使用和合成的方法。在多个实施方案中，寡核苷酸为反义抑制剂，其提供效力，递送效率，目标特异性，稳定性，和/或毒性的优势。
在一个方面，本发明提供具有式I结构的2’-C-桥接双环核苷或核苷酸(CBBN)：
其中X为N或S；W1和W2独立地为H，醇保护基团，磷酸酯，硫代磷酸酯，二或三磷酸酯(di-or tri-phosphate)，或亚磷酸胺；W3独立地为不存在(null)，H，O，胺保护基团，亚磷酸胺，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯(phosphordiamidate ester)，甲基，烷基，环烷基，氨甲酰(carboxamide)，糖，脂肪酸，或本文的其它共轭分子，–C1-4(O)R，或–COOR，其中R为芳基，线性或环烷基或烯基，糖，脂肪酸，或其它分子缀合物，如药物缀合物；B为核碱基。在一些实施方案中，核碱基是嘧啶碱基。在其它实施方案中，核碱基是嘌呤碱基。
在另一个方面，本发明提供寡核苷酸，其包含至少一个2’-C-桥接双环核苷酸。寡核苷酸中2’-C-桥接双环核苷酸的数量可以不同。例如，2’-C-桥接双环核苷酸的数量可以为至少约10％的核苷酸，至少约25％的核苷酸，至少约50％的核苷酸，或至少约75％的核苷酸。寡核苷酸的长度也可以不同。例如，本发明的寡核苷酸长度可以为从约5个至约50个核苷酸，或长度为约10至约25个核苷酸。在其它实施方案中，寡核苷酸长度可能少于约10个核苷酸(例如，从约5个至约10个核苷酸)或长度少于约8个核苷酸(例如，从约5个至约8个核苷酸)。
寡核苷酸还可以包括至少一个具有2’修饰的核苷酸，2’修饰选自2’-脱氧，2’-O-甲基，2’-氟代，和2’至4’桥接结构。在特定实施方案中，寡核苷酸还包含骨架修饰，例如硫代磷酸酯连接和/或二氨基磷酸连接。在其它实施方案中，寡核苷酸包括至少一个嘌呤和/或嘧啶碱基修饰。例如，碱基修饰可以在嘧啶碱基的C-5位置和/或嘌呤碱基的C-8位置。在一些实施方案中，寡核苷酸包括一个或多个吗啉代核苷酸。
在多个实施方案中，寡核苷酸包含与人微小RNA的核苷酸序列至少基本相同或互补的核苷酸序列。例如，寡核苷酸可以包含与人miR-15a,miR-15b,miR-29,miR-92,miR-143,miR-145,miR-195,miR-206,miR-208a,miR-208b,miR-378,miR-451和/或miR-499序列基本互补的核苷酸序列。在又进一步的实施方案中，寡核苷酸包含与人微小RNA的核苷酸序列完全相同或互补的核苷酸序列。在多个实施方案中，寡核苷酸的序列可以经设计使得模仿miRNA或通过反义抑制靶向miRNA。
在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含有效量的本文所述的寡核苷酸，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。药学上可接受的载体可以包括胶体分散系统，大分子复合物，纳米胶囊，微球体，珠，水包油乳剂，胶束，混合胶束，或脂质体。在一个实施方案中，药物组合是水性制剂。
在又一个方面，本发明提供通过反义作用降低或抑制RNA的方法，包括在细胞中降低或抑制mRNA目标或微小RNA目标。方法包含使细胞接触本文公开的寡核苷酸。在多个实施方案中，细胞可以是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，细胞可以是例如心脏细胞。在另一个实施方案中，细胞可以在体内或离体接触寡核苷酸。
在进一步的方面，本发明提供在受试者中预防或治疗与微小RNA相关或由微小RNA介导的状况的方法，包含向受试者施用如本文所述的包含靶向miRNA的寡核苷酸的药物组合物。在多个实施方案中，通过肠胃外施用或直接注射到目标组织中来施用药物组合物。在其它实施方案中，通过口服，经皮，持续释放，受控释放，延迟释放，栓剂，导管，或舌下施用来施用药物组合物。
在再一个方面，本发明提供合成2’-C-桥接双环核苷，2’-C-桥接双环核苷酸或对应的亚磷酸胺，或含有2’-C-桥接双环核苷酸的寡核苷酸的方法。方法包含使用例如核糖作为起始材料，转化为甲基4,4-双甲磺酰基氧基甲基-2-羟基甲基呋喃糖(methyl 4,4-bismesyloxymethyl-2-hydroxymethylfuranose)衍生物，接着是衍生物的糖基化。糖基化的材料的2-羟基甲基基团接着转化为受保护的胺，其接着在核苷的α表面与对应的4-甲磺酰基氧基甲基基团环化以给出完全受保护的氮杂双环核苷，其易于通过标准的保护基化学转化为核苷亚磷酰胺。用于合成的替代方法描述于2014年3月16日提交的，Kurt Vagle的题目为“双环核苷的合成”的美国临时专利申请，其通过提述完整并入本文。
通过下面的发明详述和实施例，本发明的其它方面和实施方案将是明显的。
附图简述
图1示出了胺2’-C-桥接双环核苷的合成。
图2示出了通过二氨基磷酸酯连接所连接的2’-C-桥接双环核苷。
图3A示出了示例性的二甲氧基三苯甲基(DMTr)-保护的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺。图3B示出了DMTr-保护的胺2’-C-桥接双环核苷的内部亚磷酰胺衍生物。图3C示出了示例性的DMTr-和三氟乙酸-保护的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺。图3D示出了示例性的DMTr-保护的脂肪酸缀合的2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺。图3E示出了示例性的DMTr-保护的糖缀合的2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺。
图4A示出了示例性的二甲氧三苯甲基(DMTr)-保护的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺的合成。图4B示出了DMTr-保护的胺2’-C-桥接双环核苷的内部亚磷酰胺衍生物的合成。图4C示出了示例性的DMTr-保护的脂肪酸缀合的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺的合成。图4D示出了示例性的DMTr-保护的糖缀合的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺的合成。
图5A提供了锁定核苷(LNA)，其aminoLNA对应物，以及2’-O,4-C-乙烯-桥接核苷(oxoENA)和其aminoENA对应物的亲和力增加(ΔTm,C/修饰)的对比图。图5B提供了胺2’C-桥接双环核苷(aminoCBBN)与其oxoCBBN对应物对应物的亲和力增加(ΔTm,C/修饰)对比图。如所示，胺2’C-桥接双环核苷赋予比其oxoCBBN对应物多得多的亲和力每修饰。此外，寡核苷酸中单个和多个aminoCBBN修饰赋予相等或大于那些LNA核苷的亲和力的亲和力。
图6描述了双重萤光素酶报告基因试验测量的各种miR-208a抑制物对miR-208a表达的效力。测量了化合物M-10591，M-10101，M-11919，和M-11920的活性。化合物M-10591是非靶向对照。化合物M-10101(混合的9LNA/7DNA硫代磷酸寡核苷酸)是一种优化的miR208a抑制物。M10101化合物描述于美国专利号8,642,751，其通过提述完整并入本文。化合物M-10919和M-11920是混合的LNA/DNA/aminoCBBN硫代磷酸寡核苷酸，其中亲本化合物(M-10101)的LNA胸苷分别使用1或2个aminoCBBN残基取代。如显示的，化合物M-11920(其中多个LNA残基用aminoCBBN残基取代)保留了优化的M-10101化合物的全部活性。
发明详述
本发明涉及2’-C-桥接双环核苷和核苷酸，以及包含至少一个2’-C-桥接双环核苷酸的寡核苷酸。本发明进一步提供包含修饰的寡核苷酸的药物组合物，以及这些寡核苷酸的使用和合成方法。
在多个实施方案中，本发明的寡核苷酸可以提供合成，效力，递送效率，目标特异性，稳定性，和/或毒性的优势。在一个示例性的实施方案中，本发明的寡核苷酸提供新的缀合策略，通过将配体和/或药物化合物附接到桥接部分(如胺)而允许靶向细胞或组织方面的优势。在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸在效力，稳定性，和/或毒性方面的治疗优势。
在一个方面，本发明提供具有式I的结构的2’-C-桥接双环核苷或核苷酸，或寡核苷酸：
其中X是N或S。在一个实施方案中，X是N。在另一个实施方案中，X是S。
在多个实施方案中，W1和W2独立地为H，醇保护基团，磷酸酯，硫代磷酸酯，二或三磷酸酯，或亚磷酰胺。W3独立地为不存在，H，O，胺保护基团，亚磷酸胺，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，甲基，烷基，环烷基，氨甲酰，糖，脂肪酸，或本文所述的其它共轭分子，–C1-4(O)R，或–COOR，其中R为芳基，线性或环烷基或烯基，糖，脂肪酸，或其它分子缀合物例如药物缀合物。
在多个实施方案中，醇保护基团选自4’4-二甲氧基三苯甲基，乙酰基，甲硅烷基，或酸不稳定醚。在一个实施方案中，W1和W2各自是独立选自下组的醇保护基团：4’4-二甲氧基三苯甲基，乙酰基，甲硅烷基，或酸不稳定醚。在多个实施方案中，胺保护基团为苄氧羰基(carbobenzyloxy，Cbz)，对甲氧基苯甲基羰基(Moz或MeOZ)，叔丁基氧基羰基(BOC)，9-芴基甲氧基羰基(FMOC)，乙酰基(AC)，苯甲酰基(Bz)，苄基(Bn)，三氟乙酰基(tfa)。在一个实施方案中，W3为选自苄氧羰基，叔丁基氧基羰基，或三氟乙酰胺基(trifluoroacetamidyl)的胺保护基团。
在多个实施方案中，2’-C-桥接双环核苷为2’-脱氧-2’-C,4’-C桥接的双环核苷(2’-CBBN)。
在多个实施方案中，氧代-2’-C-桥接双环核苷为2’-脱氧-2’-C,4’-C桥接的双环核苷，其中2’C和4’C通过氧连接，产生三原子连接(-C-O-C-)(oxoCBBN)。
在多个实施方案中，氨基-2’-C-桥接双环核苷或氮杂-2’-桥接双环核苷是2’-脱氧-2’-C,4’-C-桥接双环核苷，其中2’C和4’C通过氮连接，产生三原子连接(-C-N-C-)(aminoCBBN)。
在多个实施方案中，硫代-2’-C-桥接双环核苷是2’-脱氧-2’-C,4’-C-桥接双环核苷，其中2’C和4’C通过硫连接，产生三原子连接(-C-S-C-)(thioCBBN)。
在多个实施方案中，氨基-2’-C-桥接双环核苷酸和硫代-2’-C-桥接双环核苷酸分别是氨基-2’-C-桥接双环核苷和硫代-2’-C-桥接双环核苷的磷酸酯。
在多个实施方案中，锁定核苷是2’-氧-4’-C桥接双环核苷(LNA)，其在核苷的核糖环的2’和4’位置之间具有2原子连接。核心糖形成2.5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷(2.5-dioxabicyclo[2.2.1]heptane)结构。
在多个实施方案中，ENA和oxoENA是2’-氧-4’-C桥接双环核苷，其在核苷的核糖环的2’和4’位置之间具有3原子连接。核心糖形成2.6-二氧杂双环[3.2.1]辛烷(2.6-dioxabicyclo[3.2.1]octane)结构。
在多个实施方案中，aminoENA和azaENA是2’-氮杂-4’-C桥接双环核苷，其在核苷的核糖环的2’和4’位置之间具有3原子连接。核心糖形成6-氧杂-2-氮杂双环[3.2.1]辛烷结构。
在多个实施方案中，B为核碱基。核碱基或碱基可以是嘌呤或嘧啶碱基，其可以经修饰。在一个实施方案中，核碱基是嘌呤碱基。在另一个实施方案中，核碱基是嘧啶碱基。在多个实施方案中，核碱基可以选自天然核苷碱基，例如腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶和胞嘧啶，或其衍生物和替代物。另外，本发明也考虑使用非天然发生的核碱基。在某些实施方案中，非天然发生的核碱基可以是其中核碱基的环原子中任意一个被另一个原子取代的碱基。例如，CH可以被N取代，反之亦然。这些修饰可以发生在多于一个位置。非天然发生碱基的另一个例子是其中天然发生碱基的2-和4-取代基反转的碱基。另外的嘌呤和/或嘧啶碱基修饰描述于WO 2012/061810，其通过提述完整并入本文。在一些实施方案中，碱基修饰是氨基羰基，例如羧氨基，氨基甲酰(carbamoyl)，或碳酰胺(carbamide)基。在多个实施方案中，修饰在一个或多个嘧啶碱基的C-5位置，和/或在一个或多个嘌呤碱基的C-8位置。示例性的核碱基包括但不限于，9-N-腺嘌呤，9-N-鸟嘌呤，胸苷，胞苷，尿苷，5-甲基胞嘧啶，肌苷，5-取代的尿苷，5-取代的胞嘧啶，2-氨基腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方案中，2’-C-桥接双环核苷酸可以定位为如WO2012/083005和美国专利公开号2013/0345288所述的锁定核酸，其通过提述完整并入本文。例如，2’-C-桥接双环核苷酸的数量和位置可以是使得寡核苷酸以高效力降低或抑制miR-15a，miR-15b，miR-208a，miR-208b，和/或miR-499的活性。在某些实施方案中，寡核苷酸不含具有多于四个，或多于三个，或多于两个连续的2’-C-桥接双环核苷酸的核苷酸段。在某些实施方案中，寡核苷酸不含有具有多于两个连续的非2’-C-桥接双环核苷酸的核苷酸段。例如，寡核苷酸可以具有仅一次发生的连续非2’-C-桥接双环核苷酸。在示例性的实施方案中，寡核苷酸具有恰好9个2’-C-桥接双环核苷酸和7个非2’-C-桥接双环核苷酸。例如，2’-C-桥接双环核苷酸的模式可以是使得至少位置1，6，10，13和15为2’-C-桥接双环核苷酸。在某些实施方案中至少位置1，5，10，和16为2’-C-桥接双环核苷酸。在某些实施方案中，位置1，5，6，8，10，11，13，15和16为2’-C-桥接双环核苷酸，而剩下的位置为非2’-C-桥接双环核苷酸。在其它实施方案中，位置1，3，4，5，6，8，10，13，15和16为2’-C-桥接双环核苷酸，,剩下的位置为非2’-C-桥接双环核苷酸。在其它实施方案中，位置1，4，5，7，9，10，12，14和16为2’-C-桥接双环核苷酸，剩下的位置为非2’-C-桥接双环核苷酸。非2’-C-桥接双环核苷酸可以是非锁定核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸为从约5至50个核苷酸长，从约8至30个核苷酸长，或从约10至25个核苷酸长，或从12至16个核苷酸长。在某些实施方案中，寡核苷酸为从约5至约10个核苷酸长，或从约5至约8个核苷酸长。在某些实施方案中，寡核苷酸为约8个核苷酸长，约9个核苷酸长，约10个核苷酸长，约11个核苷酸长，约12个核苷酸长，约13个核苷酸长，约14个核苷酸长，约15个核苷酸长，或约16个核苷酸长。在某些实施方案中，寡核苷酸长度为约16个核苷酸或更少，长度为约12个核苷酸或更少，长度为约10个核苷酸或更少，或长度为约8个核苷酸或更少。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少1个，至少3个，至少5个，或至少7个2’-C-桥接双环核苷酸。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸仅包括1个，2个，或3个2’-C-桥接双环核苷酸。在某些实施方案中至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约90％，或100％的核苷酸为2’-C-桥接双环核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸不是完全由2’-C-桥接双环核苷酸组成。例如，本段落中描述的实施方案可以是氨基2’-C-桥接双环核苷酸。
本发明的寡核苷酸可以是基于DNA或RNA的，和/或可以采用一个或多个核酸修饰，例如，诸如经修饰的寡核苷酸骨架或一个或多个经修饰的核苷单元。寡核苷酸或衍生物可以具有一个或多个单链和/或一个或多个双链区。寡核苷酸可以是反义寡核苷酸，短干扰RNA(siRNA)，双链RNA(dsRNA)，单链RNA(ssRNA)，微小RNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA)，或核酶。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个核苷酸，其具有如WO 2012/061810中所描述的嘌呤和/或嘧啶碱基修饰，其通过提述完整并入本文。在一些实施方案中，碱基修饰通常是氨基羰基，例如羧氨基，氨基甲酰，或碳酰胺。多个实施方案中的修饰在一个或多个嘧啶碱基的C-5位置，和/或一个或多个嘌呤碱基的C-8位置。
在一些实施方案中，寡核苷酸还包含至少一个具有2’修饰的核苷酸。如本文所使用的，术语“2’修饰”包括除了OH外的任意2’基团。在一些实施方案中，2’修饰可以独立地选自O-烷基(其可以被取代)，卤素，脱氧(H)，和2’至4’甲氧基桥接的核苷酸。例如，2’修饰可以各自独立选自O-甲基和氟代。在示例性的实施方案中，嘌呤核苷酸各自具有2’OMe而嘧啶核苷酸各自具有2’F。在某些实施方案中，从1至约5个2’位置，或从约1至约3个2’位置保持未修饰(即为2’羟基)。
根据本发明的2’修饰可以选自小的烃取代基。烃取代基包括烷基，烯基，炔基，和烷氧基烷基，其中烷基(包括烷氧基的烷基部分)，烯基和炔基可以是经取代或未取代的。烷基，烯基，和炔基可以是C1至C10烷基，烯基或炔基，例如C1，C2或C3。烃取代基可以包括一个或两个或三个非碳原子，其可以独立地选自N，O，和/或S。2’修饰可以进一步包括烷基，烯基，和炔基如O-烷基，O-烯基，和O-炔基。
根据本发明的示例性2’修饰包括2’-O-烷基(C1-3烷基，例如2’OMe或2’OEt)，2’-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)，2’-O-氨基丙基(2'-O-AP)，2’-O-二甲基氨乙基(2'-O-DMAOE)，2’-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)，2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2'-O-DMAEOE)，或2’-O-N-甲基乙酰胺(2'-O-NMA)取代基。
在某些实施方案中，寡核苷酸含有至少一个2’-卤素修饰(例如，代替2’羟基)，例如，2’-氟，2’-氯，2’-溴，和2’-碘。在一些实施方案中，2’-卤素修饰是氟。寡核苷酸可以含有从1个至约5个2’-卤素修饰(例如，氟)，或从1个至约3个2’-卤素修饰(例如，氟)。在一些实施方案中，寡核苷酸在所有非-2’-C-桥接双环核苷酸位置含有2’-氟基团。在某些实施方案中，2’-氟基团独立地为双-，三-或未甲基化的。
寡核苷酸可以具有一个或多个的2’-脱氧修饰(例如，H代替2’-羟基)，并且在一些实施方案中，含有从约一个至约十个2’-脱氧修饰。
本发明的寡核苷酸可以进一步包括至少一个锁定核酸(LNA)，例如，描述于美国专利号6,268,490，美国专利号6,316,198,美国专利号6,403,566，美国专利号6,770,748，美国专利号6,998,484，美国专利号6,670,461，和美国专利号7,034,133，其全部通过提述完整并入本文。在一个实施方案中，寡核苷酸含有一个或多个LNAs，其具有下面结构A所示的结构。可替换地或者另外，寡核苷酸含有一个或多个LNAs，其具有下面结构B所示的结构。
其它可以整合到本发明的寡核苷酸中的适合的锁定核酸包括描述于美国专利号6,403,566和美国专利号6,833,361中的那些，其两者都通过提述完整并入本文。
在某些实施方案中，寡核苷酸进一步包括至少一个末端修饰或“帽”。帽可以是5’和/或3’-帽结构。术语“帽”或“末端帽”包括在寡核苷酸任一末端的化学修饰(对于末端核糖核苷酸而言)，并包括在5’末端最后两个核苷酸和3’末端最后两个核苷酸之间连接处的修饰。本文所述的帽结构可以增加寡核苷酸对外切核酸酶的抗性，而不损害与RNA目标或细胞机器的相互作用。可以基于它们在体外或体内增加的效力来选择这些修饰。帽可以存在于5’-末端(5’-帽)或3’-末端(3’-帽)或可以存在于两端。在某些实施方案中，5’-和/或3’帽独立的选自硫代磷酸酯单磷酸盐，无碱基残基(部分)，硫代磷酸酯连接，4’-硫代核苷酸，碳环核苷酸，二硫代磷酸酯连接，反向核苷酸或反向无碱基部分(2’-3’或3’-3’)，二硫代磷酸酯单磷酸盐，以及甲基膦酸酯部分。硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接，当作为帽结构的部分时，通常定位于5’末端上的两个末端核苷酸和3’末端上的两个末端核苷酸之间。
在某些实施方案中，寡核苷酸具有至少一个末端硫代磷酸酯单磷酸盐。硫代磷酸酯单磷酸盐可以在寡核苷酸的5’和/或3’末端。硫代磷酸酯单磷酸盐通过以下结构定义，其中B为碱基，而R为上文所述的2’修饰：
5’硫代磷酸酯单磷酸盐
3’硫代磷酸酯单磷酸盐
在一些实施方案中可能存在硫代磷酸酯连接，例如在5’端和3’端的最后两个核苷酸之间(例如，作为帽结构的部分)，或者作为与磷酸二酯键交替。在这些或其它实施方案中，寡核苷酸可以在5’和3’端的任意一个或两个含有至少一个末端无碱基残基。无碱基部分不含有公认的嘌呤或嘧啶核苷碱基，例如腺苷，尿苷，胞苷，尿苷或胸苷。因此这些无碱基部分缺乏核苷酸碱基或在1’位置具有其它非核苷酸碱基化学基团。例如，无碱基核苷酸可以是反向无碱基核苷酸，例如，当反向无碱基亚磷酰胺通过5’亚酰胺(amidite)(而不是3’亚酰胺)偶联，导致5’-5’磷酸键。多核苷酸的5’和3’端的反向无碱基核苷酸的结构如下所示。
寡核苷酸可以含有一个或多个硫代磷酸酯连接。硫代磷酸酯连接已经用于使寡核苷酸对核酸酶切割更有抗性。例如，多核苷酸可以是部分硫代磷酸酯连接的，例如，硫代磷酸酯连接可以与磷酸二酯连接交替。然而，在某些实施方案中，寡核苷酸是完全硫代磷酸酯连接的。在其它实施方案中，寡核苷酸具有从一个到五个或一个到三个磷酸酯连接。在进一步的实施方案中，2’-C-桥接双环核苷酸是硫代磷酸酯连接的。
在其它实施方案中，寡核苷酸可以包括一个或多个经修饰的磷酸酯连接。示例性的经修饰的磷酸酯如以下的式II和III所描述：
如图所示，R1和R2独立地选自H，烷基，烯基，氧，芳基，苄基，卤素，-OH，-NH 2，烷氧基，醇保护基或胺保护基，并且对于式II，双环连接，如LNA，或2’-C-桥接双环核苷。X和Y独立地选自H，O，S，-CO2H，烷基，烯基，芳基，苄基羧酸酯，-N(烷基)2，-N(烯基)2，-N(芳基)2，-N(苄基)2，-NH2，-BH2，或硼酸酯。B可以独立地选自核碱基例如嘌呤或嘧啶碱基，其可以经修饰。如图所示，多核苷酸可以是部分二氨基磷酸酯连接的(如图2所示)。然而，在某些实施方案中，寡核苷酸是完全二氨基磷酸酯连接的。在其它实施方案中，寡核苷酸具有从一个至五个或一个至三个磷酸酯连接。在进一步的实施方案中，所有2’-C-桥接双环核苷酸通过修饰的磷酸酯连接而连接(如式II和III所示)。
在再进一步的实施方案中，寡核苷酸可以包括一个或多个吗啉代核苷酸。如以下式IV例示的，吗啉代核苷酸可以连接到2’-C-桥接双环核苷：
如式IV所示，R1独立地选自H，烷基，烯基，氧，芳基，苄基，卤素，-OH，-NH 2，烷氧基，醇保护基或胺保护基。X和Y独立地选自H，O，S，-CO2H，烷基，烯基，芳基，苄基羧酸酯，-N(烷基)2，-N(烯基)2，-N(芳基)2，-N(苄基)2，-NH2，-BH2，或硼酸酯。B可以独立地选自核碱基，如嘌呤或嘧啶碱基，其可以经修饰。
本文公开的寡核苷酸可以具有设计来抑制RNA分子(包括mRNA或miRNA)的核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸具有模拟或靶向天然miRNA的碱基序列，如下面表1中所列的成熟miRNA。在这些或其它实施方案中，寡核苷酸可以设计来靶向pre-mRNA或pri-mRNA形式。在一些实施方案中，寡核苷酸与人miRNA序列的核苷酸序列基本互补。在进一步的实施方案中，寡核苷酸与人miRNA序列的核苷酸序列基本相同。示例性的寡核苷酸与目标miRNA序列至少部分互补(例如，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85，至少约95％或100％互补)，例如下面表1中所列的成熟miRNA。例如，这些反义和有义序列可以整合到shRNA或其它含有茎和环部分的RNA结构中。这些序列特别可用于模拟或靶向miRNA功能以用于治疗或改善心脏肥大，心肌梗塞，心脏衰竭(例如，充血性心脏衰竭)，血管损伤，和/或病理性心脏纤维化等。示例性的miRNA治疗用途公开于下面表2中列出的美国和PCT专利参考文献中，其各自通过提述以其整体并入本文。miRNA的成熟和处理前形式公开于下面列出的专利参考文献中，而这些描述也特此通过提述并入。
表1
表2
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与miR-15a或b,miR-29,miR-92,miR-143,miR-145,miR-195,miR-206,miR-208a,miR-208b,miR-378,miR-451和/或miR-499的核苷酸序列基本互补的序列。在示例性的实施方案中，寡核苷酸可以包含与人miR-208a,miR-208b,miR-378,miR-451和/或miR-499序列基本互补的序列。在某些实施方案中，寡核苷酸可以包括与人miR-208a,miR-208b,miR-378,miR-451和/或miR-499序列基本相同的序列。如本文所使用的，“基本互补”或“基本相同”指代与目标多核苷酸序列至少约70％,约75％,约80％,约85％,约90％,约91％,约92％,约93％,约94％,约95％,约96％,约97％,约98％,或约99％互补或相同的序列。
本发明进一步提供合成2’-C-桥接双环核苷，2’-C-桥接双环核苷酸或对应的亚磷酰胺，或含有2’-C-桥接双环核苷酸的寡核苷酸的方法。方法包括使用例如核糖作为起始材料，转化为甲基4,4-双甲磺酰基氧基甲基-2-羟基甲基呋喃糖衍生物，接着是衍生物的糖基化。糖基化材料的2-羟基甲基接着转化为受保护的胺，其接着在核苷的α面与对应的4-甲磺酰基氧甲基环化以给出完全受保护的氮杂双环核苷，其易于通过标准的保护基化学转化为核苷亚磷酰胺。2’-C-桥接双环核苷的示例性合成方案示于本文中。用于合成的替换方案描述于2014年3月16日提交的，Kurt Vagle的题目为“双环核苷的合成”的美国临时专利申请，其通过提述完整并入本文。
通过固相合成的寡核苷酸(包括经修饰的多核苷酸)合成是公知的，并且由Caruthers等人综述于“New Chemical Methods for Synthesizing Polynucleotides,”Nucleic Acids Symp.Ser.,(7):215-23(1980)，其通过提述完整并入本文。寡核苷酸的合成随所利用的选择的核苷酸单体而变化。在示例性的实施方案中，用于合成的核苷酸单体包括但不限于，二甲氧基三苯甲基(DMTr)-保护的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺，DMTr-保护的胺2’-C-桥接双环核苷的内部亚磷酰胺衍生物，DMTr-和三氟乙酸-保护的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺，DMTr-保护的脂肪酸缀合的2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺，和DMTr-保护的糖缀合的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺(分别见图3A-3E)。在某些实施方案中，可能需要延长的偶联时间，用于利用二甲氧基三苯甲基(DMTr)-保护的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺，DMTr-和三氟乙酸-保护的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺，DMTr-保护的脂肪酸缀合的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺，和DMTr-保护的糖缀合的胺2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺的寡核苷酸合成。在某些实施方案中，对于涉及DMTr-保护的胺2’-C-桥接双环核苷的内部亚磷酰胺衍生物的寡核苷酸合成，可以通过使用非标准加帽试剂取代标准利用Ac2O/碱基的正常加帽试剂来修饰标准寡核苷酸合成循环。或者，可以通过使用对于合成循环稳定的胺反应性缀合物或保护基团(但是若想要的话，后来可以除去)在亚磷酰胺偶联循环之后，但在标准的加帽步骤之前处理新偶联的寡核苷酸来修饰合成。
可以将寡核苷酸整合到多种大分子装配体或组合物中。此类供投递用的复合物可以包含经配制用于投递至患者的多种脂质体、纳米颗粒和胶束。复合物可以包括一个或多个促融性(fusogenic)或亲脂性分子以起始细胞膜穿透。这些分子记载于例如美国专利No.7,404,969和美国专利No.7,202,227，其通过全文引用的方式并入本文中。或者，寡核苷酸可以进一步包含悬垂的亲脂基团以辅助细胞投递，例如WO 2010/129672中描述的基团，其通过提述并并入本文。
在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含有效量的本发明的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
组合物或制剂可以采用复数的治疗性寡核苷酸，包括至少一个本文所述的。例如，组合物或制剂可以采用至少约2个，约3个，约4个，或约5个本文所述的miRNA抑制物。
本发明的寡核苷酸可以配制为多种药物组合物。药物组合物将制备为适合所需应用的形式。通常来说，这将必需制备基本上没有热原以及可以对人或动物有害的其它杂质的组合物。示例性的递送/配制系统包括胶体分散系统，大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠、和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、以及脂质体。市售的适合用于将本发明的核酸递送到心脏和骨骼肌组织的脂肪乳剂包括II,III,Nutrilipid，以及其它相似的脂质乳剂。用作体内递送媒介物的优选胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。这种系统的制备和使用是本领域公知的。示例性的制剂也描述于美国专利号5,981,505；美国专利号6,217,900；美国专利号6,383,512；美国专利号5,783,565；美国专利号7,202,227；美国专利号6,379,965；美国专利号6,127,170；美国专利号5,837,533；美国专利号6,747,014；和WO2003/093449，其通过提述特此以其整体并入。
药物组合物和制剂可以采用适合的盐和缓冲液来使得递送媒介物稳定，并允许目标细胞吸收。本发明的水性组合物包含有效量的递送媒介物，其包含目前所要求保护的寡核苷酸(例如，脂质体或其它复合物)，溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。短语“药学上可接受”或“药理学上可接受”是指当施用到动物或人时不产生不利的、过敏的或其它不想要反应的分子实体及组合物。如本文中所使用，“药学上可接受的载体”可以包括用于配制药物，例如适合于向人施用的药物中可接受的一种或多种溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、涂层材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这类介质和药剂用于药学活性物质的用途是本领域中公知的。补充性活性成分也可以整合到所述组合物中。
根据本发明的药物组合物的施用或递送可以通过任何途径，只要通过该途径可达到目标组织。例如，可以通过皮内，皮下，肌肉内，腹膜内或静脉注射施用，或通过直接注射到目标组织中(例如，心脏组织)施用。本文公开的寡核苷酸的稳定性和/或效力允许方便的施用途径，包括皮下，皮内，以及肌肉内。包含miRNA抑制物的药物组合物也可以通过导管系统或将冠状循环分离的系统施用，用于将治疗试剂递送到心脏。用于将治疗试剂投递至心脏和冠状血管系统的各种导管系统是本领域中已知的。适合用于本发明中的基于导管的递送方法或冠状分离方法的一些非限制性例子公开于美国专利号6,416,510；美国专利号6,716,196；美国专利号6,953,466，WO 2005/082440，WO 2006/089340，美国专利公开号2007/0203445，美国专利公开号2006/0148742，和美国专利公开号2007/0060907，其通过提述完整并入本文。
组合物或制剂也可以胃肠外或腹膜内施用。举例而言，可以在适当地混合有表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)的水中制备呈游离碱或药理学可接受盐的缀合物的溶液。也可以在甘油、液态聚乙二醇和其混合物中以及在油中制备分散体。在普通的贮存和使用条件下，这些制剂通常含有防腐剂以防止微生物生长。
适合用于导管递送的药学形式包括，例如无菌水性溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。通常来说，这些制剂是无菌的并且在存在容易的注射能力的程度上流动。制剂在制造和贮存条件下应当是稳定的，并且应当针对微生物，例如细菌和真菌的污染作用提供防腐。适当的溶剂或分散介质可以含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物，和植物油。可以例如通过使用涂层材料，例如如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持需要的颗粒大小及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等，来防止微生物的作用。在许多情况下，会优选包括例如糖或氯化钠的等张剂。可以通过在组合物中使用吸收延迟剂，例如单硬脂酸铝和明胶，带来可注射组合物延长的吸收。
可以通过在想要时与任何其它成分(例如如上文列举)一起将合适量的缀合物掺入溶剂中制备无菌可注射溶液。一般地，通过将各种经灭菌的活性成份掺入含有基础分散介质及期望的其它成分(例如如上文列举)的无菌媒介物中制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分及来自其先前无菌过滤溶液的任何别的期望成分的粉末。
在配制后，溶液优选以与剂量配制剂相容的方式并且以治疗有效的此类量施用。可以以多种剂量形式(诸如可注射溶液、药物释放胶囊等)容易地施用配制剂。例如，对于在水性溶液中的胃肠外施用，溶液一般经适当地缓冲并且首先使流体稀释剂例如用足够的盐水或葡萄糖变成等张的。例如，可以使用这类水性溶液以静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优化地，采用本领域技术人员已知的无菌水性介质，尤其根据本公开内容。举例而言，可将单剂溶解于1ml等张NaCl溶液中，并且添加到1000ml皮下灌注术流体中或注射于提出的输注部位(参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版,第1035-1038和1570-1580页)。根据治疗受试者的状况，必然会发生一些剂量变化。在任何情况下，负责施用的人员将决定适合于个体受试者的剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足FDA生物制剂标准局(FDAOffice of Biologics standards)要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。
在另一个方面，本发明提供在细胞中降低或抑制RNA表达或活性的方法。在此类是实施方案中，方法包含使细胞与本文公开的寡核苷酸(或其药物组合物)接触，其中所述寡核苷酸与细胞表达的RNA转录物杂交(例如，至少部分互补)。在一些实施方案中，RNA是mRNA或miRNA。
在另一个方面，本发明提供在受试者中预防或治疗与/由RNA或其表达相关或介导的状况的方法。在一些实施方案中，RNA是mRNA或miRNA。根据本发明的预防或治疗方法涉及向所述受试者施用药物组合物，其包含有效量的寡核苷酸或其药学上可接受的组合物。
本发明提供向哺乳动物细胞递送本发明的寡核苷酸(例如，作为本文所述的组合物或制剂的部分)的方法，以及在哺乳动物患者中治疗，改善，或阻止状况进展的方法。寡核苷酸或药物组合物可以在体外或体内与目标细胞(例如，哺乳动物细胞)接触。细胞可以是心脏细胞。
该方法通常包含将寡核苷酸或包含寡核苷酸的组合物施用到哺乳动物患者或目标细胞群体。如已描述的寡核苷酸可以是miRNA抑制物(例如，具有经设计来抑制miRNA表达或活性的核苷酸序列)。例如，在miRNA抑制物是miR-208家族miRNA的抑制物的情况下，患者可以患有与miR-208家族表达，由miR-208家族表达诱导，或起因于miR-208家族表达的状况。这些状况包括例如心脏肥大，心肌梗塞，心脏衰竭(例如，充血性心脏衰竭)，血管损伤，再狭窄，或病理性心脏纤维化，癌症，或其它miRNA相关病症，包括列于表2中的专利公开中的那些。因此，本发明提供本发明的经修饰的寡核苷酸和组合物用于治疗这些状况以及用于制备用于此类治疗的药物的用途。
在某些实施方案中，所述患者(例如，人类患者)具有一种或多种风险因子包括，例如，长期未控制的高血压，未矫正的瓣膜病，慢性心绞痛，近期的心肌梗死，充血性心脏衰竭，心脏疾病的先天性素因和病理性肥大。可替换地或者另外，患者可以已经诊断为具有例如心脏肥大的遗传素因，或可以具有例如心脏肥大的家族史。
在这一方面，本发明可以提供改进的运动耐受，减少的住院治疗，更好的生活质量，降低的发病率，和/或患有心脏衰竭或心脏肥大的患者中降低的死亡率。
在某些实施方案中，降低或抑制心脏组织中或如患者血清中所确定的微小RNA的活性。
在多个实施方案中，药物组合物通过肠胃外施用或直接注射到心脏组织中施用。肠胃外施用可以是静脉内，皮下，或肌肉内。在一些实施方案中，组合物通过口服，经皮，持续释放，控制释放，延迟释放，栓剂，导管，或舌下施用来施用。在某些实施方案中，寡核苷酸以约50mg/kg或更少的剂量，约25mg/kg或更少的剂量，约10mg/kg或更少的剂量，或约5mg/kg或更少的剂量施用。在这些实施方案中，寡核苷酸或组合物可以通过肌肉内，皮下注射，或静脉内施用。
在一些实施方案中，方法进一步包含在治疗后清理或清除miRNA抑制物。例如，可以在治疗后施用具有与抑制物互补的核苷酸序列的寡核苷酸来减弱或终止抑制物的功能。
本文引用的所有参考文献(包括表1和2中的那些)通过提述特此并入用于所有目的。
实施例
实施例1： 2’-C-桥接双环核苷酸的产生
本实施例描述了用于胺2’-C-桥接双环核苷酸的产生的关键中间物的示例性合成(见图1)。
甲基-D-核糖(2)
将D-核糖(1)(90g，599mmol)，Amberlyst 15(H+)(90g，599mmol)，和MolecularTrap Pack(90g，599mmol)平分到三个500mL的肖特瓶(Schott Bottles)中(即每个肖特瓶中30g每种)。每个瓶中使用相等量的甲醇填充(体积：1350ml，即450ml/瓶)以产生无色溶液。将所有的瓶放置到定轨摇床上，在250rpm/25℃持续17小时。在15％MeOH/DCM作为展开溶剂中相比于与不受保护的核糖的共位点(co-spot)通过反应溶液的TLC监控反应进程。经由Hannessian氏染剂通过炭化显现糖类。
溶液通过玻璃烧结漏斗过滤。使用过量的MeOH(约500mL/瓶，其含有各30g的Amberlyst和Trap Pack)清洗催化剂和Molecular Trap Pack。通过添加15mL TEA(5ml/反应瓶)使甲醇溶液为碱性。该混合物浓缩至干燥。将残留物与二氯甲烷(3x 200mL)共蒸发以共沸除去残留的MeOH。残留物在高真空下过夜干燥，得到97.55g(99％)甲基-D-核糖(2)，其在无需进一步纯化下使用。
甲基5-O-(TBDPS)-α,β-D-核糖呋喃糖苷(Methyl5-O-(TBDPS)-α,β-D- ribofuranoside)(3)
在1L的圆底烧瓶中的是溶解于DMF(体积：400ml)以产生无色溶液的甲基-D-核糖(2，60.12g，366mmol)和DIEA(128ml，732mmol)。该烧瓶使用氩气冲洗，并在冰浴中冷却到0℃。将TBDPS-Cl(99ml，385mmol)在10分钟内逐滴添加，而该混合物允许过夜达到室温。
将反应混合物倒入饱和NaHCO3溶液(1L)中。使用EtOAc(3x 300mL)萃取水相。将有机相联合并使用水(1x 400mL)和卤水(1x 400mL)清洗。将有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以产生深棕色油，其通过分为4个相等部分并经由硅土层析纯化来纯化，所述硅土层析在75分钟内以100mL/min运行标准的0-100％EtOAc/Hex梯度，接着为7分钟保持在100％的EtOAc。将纯化级份合并以产生121.59g(82％)作为无色油的甲基5-O-(TBDPS)-α,β-D-核糖呋喃糖苷(3)。
甲基5-O-(TBDPS)-2,3-O-双(4-氯苄基)-α,β-D-核糖呋喃糖苷(Methyl5-O- (TBDPS)-2,3-O-bis(4-Chlorobenzyl)-α,β-D-ribofuranoside)(4)
在2L的圆底烧瓶中称量甲基5-O-(TBDPS)-α,β-D-核糖呋喃糖苷(3，55.0g，137mmol)。将该材料与甲苯(2x 100mL)在高真空在40℃共蒸发。该烧瓶装有回流冷凝器并且该起始材料在氩气下溶解于甲苯(体积：500ml)。在约5g部分中添加氢化钠(21.86g,547mmol)以产生灰色悬浮液。将混合物加热到60℃，30分钟，接着使用冰浴冷却到室温。在约15g中在剧烈搅拌下添加1-氯-4-(氯甲基)苯(66.0g,410mmol)。将混合物加热并在回流下搅拌过夜。
将反应混合物冷却到0℃并使用500mL EtOAc稀释。通过缓慢添加EtOH(50mL)使混合物骤冷(quench)，以使起泡最小化。将混合物用EtOAc进一步稀释到1.5L，并使用10％Na2CO3(2x 500mL)和饱和NaCl(1x 500mL)清洗。将有机物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶层析纯化粗制品。使用0-30％EtOAc/己烷梯度洗脱产物。将收集的纯级份合并以产生作为琥珀油的甲基5-O-(TBDPS)-2,3-O-双(4-氯苄基)-α,β-D-核糖呋喃糖苷(4,62.15g,70％)。
甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-α-D-核糖呋喃糖苷(Methyl5-O-(TBDPS)-3- O-(4-Chlorobenzyl)-α-D-ribofuranoside)(5)
在1L的圆底烧瓶中的是将溶解于600mL DCM以产生黄色溶液的甲基5-O-(TBDPS)-2,3-O-双(4-氯苄基)-α,β-D-核糖呋喃糖苷(4,65g,100mmol)。将该混合物在氩气下冷却至0℃。在10分钟内缓慢添加氯化锡(IV)(150ml,150mmol)，期间溶液变成清澈的深棕色溶液。将反应混合物在4℃在氩气下在搅动情况下贮存过夜。
使用DCM(250mL)稀释反应混合物，并在4L分液漏斗(sep funnel)中添加至500mLDI水。将混合物剧烈振摇并使其分离。保留所有有机物和乳液/沉淀物，并使用第二等分试样的500mL水清洗。通过添加MeOH和机械搅拌减少乳液。保留所有有机物和乳液/沉淀物并最后使用500mL卤水清洗。再次，通过添加MeOH和机械搅拌降低乳液。取出有机相并通过MgSO4悬浮液干燥。使用与MgSO4悬浮液组合的另外的DCM(2x 100mL)萃取剩下的乳液和水相。过滤有机相并浓缩为棕色油。通过硅胶柱层析使用0-30％EtOAc/己烷梯度纯化粗产品。将收集的纯级份组合以产生作为琥珀油的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-α-D-核糖呋喃糖苷(5,41.20g,78％)。
甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-氧-α-D-核糖呋喃糖苷(Methyl5-O- (TBDPS)-3-O-(4-Chlorobenzyl)-2-oxo-α-D-ribofuranoside)(6)
在1L的圆底烧瓶中的是溶解于DCM(体积:250ml)以产生橙色溶液的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-α-D-核糖呋喃糖苷(5,41.00g,78mmol)和TEMPO(1.215g,7.78mmol)。添加二乙酸碘苯(37.6g,117mmol)并将该混合物在室温下搅拌过夜。
使用DCM将反应混合物稀释到500mL并使用饱和硫代硫酸钠溶液(2x300mL)，和卤水(1x 300mL)清洗。将有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。该橙色残留物在高真空50℃下干燥3小时。作为琥珀油的粗制甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-氧-α-D-核糖呋喃糖苷(6,40.50,“99％”)用于后续反应。
甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-亚甲基-α-D-核糖呋喃糖苷 (Methyl5-O-(TBDPS)-3-O-(4-Chlorobenzyl)-2-deoxy-2-methylene-α-D-ribofuran oside)(7)
在2000mL圆底烧瓶中的是悬浮于乙醚(比率：20.00，体积：1500ml)以产生白色悬浮液的甲基三苯基溴化磷(6,26.6g,75mmol)。使用氩气冲洗烧瓶并在冰浴中冷却至0℃。将叔五氧化钠(sodium t-pentoxide)(7.39g,67mmol)溶解于苯(比率：1.000，体积：75ml)并立即添加至悬浮液。再次使用氩气冲洗该烧瓶并允许在2个小时内达到室温。将该悬浮液再搅拌4个小时。接着将该悬浮液在丙酮/干冰浴中冷却至-72℃。将甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-氧-α-D-核糖呋喃糖苷(19.56g,37.25mmol)溶解于另外的乙醚(比率：1.067，体积：40ml)。通过注射器添加碳水化合物溶液并且该反应混合物在4℃搅拌17个小时。
TLC揭示了该反应是完全的(15％EtOAc/Hex)。使用饱和NH4Cl(2x 500mL)和卤水(1x 250mL)清洗该反应混合物。使用乙醚(150mL)反萃取水相。将有机相合并，并通过卤水清洗(1x 250mL)和添加Na2SO4干燥。过滤并浓缩有机相。通过硅胶柱层析使用溶于己烷的0-20％EtOAc梯度完成纯化。合并纯级份并浓缩至干以产生作为无色油的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-亚甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(7,14.79g,28.3mmol,76％收率)。
甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-羟基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷 (Methyl5-O-(TBDPS)-3-O-(4-Chlorobenzyl)-2-deoxy-2-α-Hydroxymethyl-α-D-Ri bofuranoside)(8)
在氩气下，在室温将9-BBN(8.97g,73.5mmol)添加至溶解于THF(300ml)的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-亚甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(7,28.50g,54.5mmol)溶液。在室温下将反应混合物搅拌1.5小时后，TCL揭示了所有起始材料被消耗。
添加将过硼酸钠四水合物(33.9g,221mmol)和水(80mL)，并在室温下将混合物再搅拌2小时。分离有机层，将水相稀释至400mL，接着使用乙酸乙酯(3x 250mL)萃取。将有机层合并，并经MgSO4干燥。取出溶剂，通过硅胶层析纯化产物，其使用0-60％的乙酸乙酯/己烷梯度洗脱。合并纯化的级份并浓缩至干燥以产生作为无色油的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-羟甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8,26.39g,48.8mmol,90％收率)。
甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖 呋喃糖苷(Methyl3-O-(4-Chlorobenzyl)-2-deoxy-2-α-(4,4’- Dimethoxytrityloxymethyl)-α-D-Ribofur anoside)(10)
在1L圆底烧瓶中的是在氩气下溶解于吡啶(200ml)以产生无色溶液的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-羟甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8,26.30g,48.6mmol)。将DMTr-Cl(20.58g,60.8mmol)立刻添加至搅拌的溶液。将反应混合物搅拌过夜。通过在搅拌下添加50mL MeOH达20分钟，接着使用EtOAc将混合物稀释至750mL以使三苯甲基(trytilation)反应淬灭。使用饱和NaHCO3溶液(3x 350mL)和卤水(1x 150mL)清洗有机相。将该有机相经MgSO4干燥，过滤并浓缩至干燥。
将粗产物(9)溶解于THF(体积：70ml)。将溶于THF的1.0M TBAF溶液(72.9ml,72.9mmol)添加到混合物并在室温搅动1.5小时。TBAF的添加产生深色，烟熏色的溶液。该混合物浓缩到干燥并应用于使用溶于己烷的3％TEA预处理的330g ISCO硅胶柱。使用溶于己烷的0-60％EtOAc梯度在50分钟内以100mL/min洗脱产物。合并纯化部分并浓缩以产生作为无色油状物的甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10,27.17g,44.9mmol,92％收率)。
甲基5-氧-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D- 核糖呋喃糖苷(Methyl5-Oxo-3-O-(4-Chlorobenzyl)-2-deoxy-2-α-(4,4’- Dimethoxytrityloxymethyl)-α-D-Ribofuranoside)(11)
在1L圆底烧瓶中的是溶解于DMSO(166ml,2333mmol)以产生无色溶液的甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10,27.15g,44.9mmol)和DCC(27.8g,135mmol)。将吡啶(5.44ml,67.3mmol)和TFA(1.728ml,22.43mmol)组合于40mL DMSO中并将所得溶液添加至反应混合物。将烧瓶覆盖并在室温搅拌过夜。
添加水(25mL)，并让反应在室温搅拌3小时。使用500mL EtOAc稀释该反应物并过滤。使用另外的200mL EtOAc清洗沉淀。组合的有机物使用卤水(5x 400mL)清洗，使用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。该产物通过硅胶柱层析使用0-100％EtOAc/Hex梯度纯化。合并并浓缩纯的级份，以产生作为白色泡沫的甲基5-氧-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(11,25.22g,41.8mmol,93％收率)。
甲基4-C-羟甲基-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲 基)-α-D-核糖呋喃糖苷(Methyl4-C-Hydroxymethyl-3-O-(4-Chlorobenzyl)-2-deoxy-2- α-(4,4’-Dimethoxytrityloxy methyl)-α-D-Ribofuranoside)(12)
在2L的圆底烧瓶中的是溶解于二噁烷(1000ml)以产生无色溶液的甲基5-氧-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(11,25.20g,41.8mmol)。在搅拌下添加甲醛(249ml,3343mmol)。该反应混合物在冰浴中冷却至0℃。该烧瓶装有750mL的均压滴液漏斗(pressure equalizing dropping funnel)，在30分钟内添加2.0M氢氧化钠(606ml,1212mmol)以产生浑浊的白色溶液。在42小时里容许搅拌混合物，期间达到室温。该溶液变为清澈。通过添加磷酸钠(单碱，一水合物)(86g,627mmol)中和该溶液。该溶液浓缩至其体积的约三分之一，使用500mL水稀释和DCM(3x 300mL)萃取。将有机层合并并使用卤水清洗(1x 300mL)接着经Na2SO4干燥。取出溶剂，通过硅胶层析使用0-10％的MeOH/DCM梯度洗脱来纯化产物。合并纯化的级份，并浓缩到干燥以产生作为无色油的甲基4-C-羟甲基-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(12,22.50g,35.4mmol,85％收率)。
甲基5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧甲基)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(羟甲 基)-α-D-核糖呋喃糖苷(Methyl5-O-Mesyl-4-C-(Mesyloxymethyl)-3-O-(4- Chlorobenzyl)-2-deoxy-2-α-(Hydroxym ethyl)-α-D-Ribofuranoside)(14)
在1L圆底烧瓶中的是在Ar下溶解于吡啶(200ml)以产生无色溶液的甲基4-羟甲基-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(12,22.50g,35.4mmol)。该混合物在冰浴中冷却至0℃。将甲磺酰基-Cl(8.28ml,106mmol)在10分钟内逐滴添加到搅拌的溶液。该反应混合物在室温下搅拌45分钟。通过将该反应冷却至0℃，并在搅动下添加15mL水达20分钟来淬灭甲磺酰基化反应。使用EtOAc将该混合物稀释至750mL，并使用卤水清洗(3x 400mL)。有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干燥。
该粗产物(13)溶解于800mL AcOH。将水(200mL)添加至搅拌的溶液。该溶液在室温搅拌2.5小时接着使用500mL水稀释。将该混合物浓缩至约400mL并使用另外250mL水稀释。将该溶液在高真空下浓缩至干燥。将残留物应用于220g ISCO硅胶柱并使用0-100％EtOAc/己烷梯度稀释该产物。合并纯级份，并浓缩以产生作为无色油的甲基5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧甲基)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(羟甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(14,10.01g,20.47mmol,57.8％收率)。
((2S,3R,4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧)-5,5-双(((甲基磺酰基)氧)甲基) 四氢呋喃-3-基)乙酸甲酯(((2S,3R,4S)-2-acetoxy-4-((4-chlorobenzyl)oxy)-5,5-bis (((methylsulfonyl)oxy)met hyl)tetrahydrofuran-3-yl)methylacetate)(16)
将((3S,4R,5S)-3-((4-氯苄基)氧)-4-(羟甲基)-5-甲氧基四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(3.41g,6.97mmol)称量于带有搅拌棒的100ml圆底烧瓶中，并用隔膜密封。将该烧瓶冷却至0℃并加入吡啶(体积：25ml)和乙酸酐(1.316ml,13.95mmol)。将混合物在6小时内达到室温。将该混合物冷却至0℃并添加MeOH(1mL)并搅拌15分钟。将混合物浓缩至干燥并再溶解于EtOAc(100mL)。使用水性1％HCl(50mL)，饱和碳酸氢钠(50mL)和卤水(50mL)清洗有机相。经Na2SO4干燥有机相，过滤并浓缩。
在100mL圆底烧瓶中使用乙酸(9.98ml,174mmol)和乙酸酐(2.63ml,27.9mmol)再溶解所得的油。添加H2SO4(0.037ml,0.697mmol)，用隔膜密封该烧瓶，过夜搅拌该混合物。使用水(100mL)稀释混合物并使用EtOAc(3x 75mL)萃取。将有机相合并，并使用饱和碳酸氢钠(2x 100mL)和卤水(1x 100mL)小心清洗。经Na2SO4干燥有机相，过滤并浓缩以产生作为浅黄色油的3.15g粗制((2S,3R,4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧)-5,5-双(((甲基磺酰)氧)甲基)四氢呋喃-3-基)乙酸甲酯(3.15g,5.64mmol,81％收率)，其在不经过进一步纯化的情况下使用。
ESI-MS：617(M+乙酸盐)-
((3R,4S)-3-((4-氯苄基)氧)-2-(胸苷-基)-5,5-双(((甲基磺酰基)氧)甲基)四 氢呋喃-3-基)乙酸甲酯(((3R,4S)-4-((4-chlorobenzyl)oxy)-2-(thymidin-yl)-5,5-bis (((methylsulfonyl)oxy)m ethyl)tetrahydrofuran-3-yl)methylacetate)(17)
将N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(4.07ml,16.64mmol)添加到溶于无水乙腈(20ml)的((3R,4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧)-5,5-双(((甲基磺酰基)氧)甲基)四氢呋喃-3-基)乙酸甲酯(3.10g,5.55mmol)和胸腺嘧啶(0.874g,6.93mmol)的混合物。将该反应混合物回流1小时以得到澄清溶液。将溶液冷却至40℃并添加TMS-OTf(1.303ml,7.21mmol)。于60℃将该混合物加热4小时。溶液冷却至室温，使用CH2Cl2(100mL)稀释，并使用饱和NaHCO3(2x 100mL)和卤水(1x 100mL)清洗。有机层经(Na2SO4)干燥，减压浓缩，残留物通过硅胶柱层析在标准的Biotage Isolera梯度(0-10％v/v MeOH/CH2Cl2)上纯化以产生作为白色固体物质的((3R,4S)-4-((4-氯苄基)氧)-2-(胸苷-基)-5,5-双(((甲基磺酰基)氧)甲基)四氢呋喃-3-基)乙酸甲酯(2.84g,4.54mmol,82％收率)。
ESI-MS:624(M)-
((3S,4R)-3-((4-氯苄基)氧)-4-(羟甲基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2,2-二基)双 (亚甲基)二甲磺酸盐(((3S,4R)-3-((4-chlorobenzyl)oxy)-4-(hydroxymethyl)-5- (thymidin-yl)tetrahydrofu ran-2,2-diyl)bis(methylene)dimethanesulfonate)(19)
在装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中，将((3R,4S)-4-((4-氯苄基)氧)-2-(胸苷-基)-5,5-双(((甲基磺酰基)氧)甲基)四氢呋喃-3-基)乙酸甲酯(2.84g,4.54mmol)溶解于甲醇(体积：20ml)。加入甲醇钠(0.123g,2.272mmol)，将烧瓶封盖并在室温下搅拌过夜。TLC(100％EtOAc)显示该反应是完全的。将反应混合物在真空中蒸发至干燥，并直接应用于3gBiotage Samplet，将其安装在25g Biotage SNAP柱上。使用40-100％EtOAc/Hex梯度洗脱产物，以产生作为白色泡状物的((3S,4R)-3-((4-氯苄基)氧)-4-(羟甲基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(2.32g,3.98mmol,88％收率)。
ESI-MS:582(M)-
((3S,4R)-5-(胸苷-基)-3-((4-氯苄基)氧)-4-(羟甲基)四氢呋喃-2,2-二基)双 (亚甲基)二甲磺酸盐(((3S,4R)-5-(thymidin-yl)-3-((4-chlorobenzyl)oxy)-4- (hydroxymethyl)tetrahydrofu ran-2,2-diyl)bis(methylene)dimethanesulfonate) (20)
在室温下向((3S,4R)-3-((4-氯苄基)氧)-4-(羟甲基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(1.0g,1.715mmol)和吡啶(10ml)的混合物添加TMS-Cl(0.219ml,1.715mmol)。搅拌1小时后，将该反应混合物冷却至0℃，并通过注射剂逐滴添加苯甲酰氯(0.199ml,1.715mmol)。接着，移除冰浴并将反应混合物在室温搅拌48小时。通过加入水(2mL)淬灭反应；在室温搅拌15分钟后，使用EtOAc(50mL)稀释该混合物并使用5％HCl水溶液(2x 25mL)，饱和NaHCO3(1x 25mL)和卤水(1x 25mL)清洗。有机相经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。残留物应以最小DCM应用于3g Biotage Samplet，其接着安装到25g Biotage SNAP柱。使用40-100％EtOAc/Hex梯度洗脱期望的产物，以产生作为白色泡状物的((3S,4R)-5-(3-苯甲酰-5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3-((4-氯苄基)氧)-4-(羟甲基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(0.87g,1.266mmol,73.8％收率)。
胸苷的N-苯甲酰保护导致非对映体的混合物，其产生以3:2比例的两个C-5甲基单峰和两个C6质子单峰。对于α-端基异构体(anomer)：
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.89(s,1H,非对映异构体1),7.87(d,J＝1.3Hz,1H,非对映异构体2),7.67-7.60(m,1H),7.60-7.39(m,3H),7.39-7.17(m,5H),6.02(d,J＝8.6Hz,1H),4.67-4.46(m,3H),4.42-4.26(m,5H),3.87-3.73(m,2H),3.02(s,3H),2.98(s,2H),2.82(p,J＝6.5Hz,1H),2.03(s,3H,非对映异构体1),1.94(s,3H,非对映异构体2)。
((3S,4R,5R)-4-(((叔-丁氧基-(2,2,2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4- 氯苄基)氧)-5-(3-苯甲酰基-胸苷-基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐
(((3S,4R,5R)-4-(((tert-butoxy-(2,2,2-trifluoroethoxy)dicarbonyl) amino)methyl)-3-((4-chlorobenzyl)oxy)-5-(3-benzoyl--thymidin-yl) tetrahydrofuran-2,2-diyl)bis(met hylene)dimethanesulfonate)(21)
在装有搅拌棒的20mL闪烁瓶中是称量的((3S,4R)-5-(3-苯甲酰-胸苷-基)-3-((4-氯苄基)氧)-4-(羟甲基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(0.25g,0.364mmol)，(2,2,2-三氟代乙基)-叔-丁基-亚氨基二碳酸盐(0.088g,0.364mmol)，和三苯基磷(0.095g,0.364mmol)。在小瓶中装入THF(体积：4ml)和DLAD，逐滴加入溶于THF的1.0M溶液(0.364ml,0.364mmol)。搅拌过夜后，将反应混合物在真空中浓缩至干燥并应用于25gBiotage SNA柱。使用40-100％EtOAc/己烷梯度洗脱产物以产生作为白色泡状物的((3S,4R,5R)-4(((叔-丁氧基-(2,2,2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧)-5-(3-苯甲酰基-胸苷-基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(0.228g,0.25mmol,68.7％收率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.94(d,J＝7.6Hz,2H),7.63(t,J＝7.4Hz,1H),7.47(t,J＝7.8Hz,2H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),7.28(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(s,1H),5.99(d,J＝9.2Hz,1H),4.70(d,J＝11.0Hz,1H),4.60(d,J＝10.9Hz,1H),4.49(qd,J＝8.3,3.4Hz,2H),4.41-4.24(m,6H),3.94(d,J＝5.6Hz,2H),3.20-3.05(m,1H),2.98(s,2H),2.97(s,4H),1.92(s,3H),1.46(s,9H).ESI-MS:971(M+乙酸盐)-
((3S,4R,5R)-4-(((叔-丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧)-5-(胸苷- 基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(((3S,4R,5R)-4-(((tert- butoxycarbonyl)amino)methyl)-3-((4-chlorobenzyl)oxy)-5-(thymidin-yl) tetrahydrofuran-2,2-diyl)bis(methylene)dimethanesulfonate)(22)
在20ml螺旋盖闪烁瓶中是在磁性搅拌棒的情况下的称量的((3S,4R,5R)-4(((叔-丁氧基-(2,2,2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧)-5-(3-苯甲酰基-胸苷-基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(125mg,0.137mmol)。在小瓶中装入THF(体积：1.5ml)和溶于水的2.0M LiOH(1.507ml,3.01mmol)，封盖并在室温过夜搅拌。使用EtOAc(7mL)稀释该反应混合物并使用饱和碳酸氢钠(1x 5mL)和卤水(1x 5mL)清洗。该有机相经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩以产生作为灰白色泡状物的((3S,4R,5R)-4-(((叔-丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(80mg,0.117mmol,86％收率)，其纯度足以粗制用于后续反应。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.61(s,1H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(s,1H),6.04(d,J＝9.3Hz,1H),4.74-4.64(m,1H),4.59(d,J＝11.3Hz,1H),4.50(d,J＝11.3Hz,1H),4.40-4.23(m,6H),4.00-3.89(m,1H),3.44(dd,J＝13.6,6.7Hz,1H),3.17(ddd,J＝14.3,8.4,5.8Hz,1H),3.09(s,3H),3.00(s,3H),1.89(s,3H),1.32(s,9H).ESI-MS:681(M)-
((1R,5R,7R,8S)-叔-丁基8-((4-氯苄基)氧)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基) 氧)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷-3-羧酸盐((1R,5R,7R,8S)-tert-butyl8-((4- chlorobenzyl)oxy)-7-(thymidin-yl)-5-(((methylsulfonyl)oxy)methyl)-6-oxa-3- azabicyclo[3.2.1]octane-3-carboxylate)(23)
在10mL锥形反应瓶中是溶解于四氢呋喃(7mL)的((3S,4R,5R)-4-(((叔-丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2,2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸盐(60mg,0.076mmol)。将氢化钠，溶于油的60％悬浮液(12.21mg，0.305mmol)，立即添加到小瓶，该小瓶装有搅拌棒和聚四氟乙烯(teflon)衬里隔膜螺旋帽，并将混合物在55℃搅拌过夜。将反应冷却至室温并在搅拌下添加几滴MeOH淬灭该反应。使用EtOAc(10mL)稀释混合物并使用饱和碳酸氢钠水溶液(2x 10mL)和卤水(1x 10mL)清洗。有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以产生棕褐色泡沫状物，将其溶解于最小量的DCM并应用于与10g Biotage SNAP柱装配的1g Biotage Samplet。使用0-100％EtOAc/己烷梯度洗脱产物，以产生作为白色泡沫状物的((1R,5R,7R,8S)-叔-丁基8-((4-氯苄基)氧)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基)氧)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷-3-羧酸盐(35mg,0.060mmol,78％收率)。
环化产生在3:2混合物中的N-非对映体混合物，其不可通过TCL/柱层析析出。少量非对映体的存在产生了几个不同的信号，其表示为a(*)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.63(s,1H),8.59*(s),7.62(s,1H),7.58*(s),7.40-7.27(m,2H),7.23(d,J＝8.1Hz,3H),5.80*(s),5.79(s,1H),4.66-4.44(m,2H),4.44-4.27(m,2H),4.09-3.92(m,2H),3.79(d,J＝12.8Hz,1H),3.61*(d,J＝12.6Hz),3.36-3.10(m,2H),3.08(s,3H),2.81*(s),2.70(s,1H),1.94(s,3H),1.46(s,9H),1.44*(s).ESI-MS:585(M)-
1-((1R,5R,7R,8S)-8-((4-氯苄基)氧)-5-(羟甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1] 辛-7-基)-胸苷(1-((1R,5R,7R,8S)-8-((4-chlorobenzyl)oxy)-5-(hydroxymethyl)-6- oxa-3-azabicycl o[3.2.1]octan-7-yl)-thymidine)(24)
在10mL玻璃反应瓶中是溶解于DMF(2ml)的((1R,5R,7R,8S)-叔-丁基8-((4-氯苄基)氧)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基)氧)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷-3-羧酸盐(35mg,0.060mmol)和苯甲酸钠(17.21mg,0.119mmol)。该小瓶装有搅拌棒并使用聚四氟乙烯衬里的螺纹盖隔膜密封。将该混合物在油浴中加热至105℃过夜。所有组分都已实现溶解。将该小瓶从油浴移除并取出10uL通过TLC评估反应完全性。一旦冷却，立即开始形成白色晶体。TLC显示反应仅50％完全，因此添加另一部分的苯甲酸钠(17.21mg,0.119mmol)连同1mL DMF以容许搅拌。将该混合物加热至105℃，再持续48个小时，定期取出等分试样用于TLC分析。厚沉淀物一直没有完全实现溶解，甚至是加热到105℃达两天后续，然而反应在无可检测分解的情况下达到完全。
将反应混合物冷却至室温，使用EtOAc(10mL)稀释，并使用水(2x 10mL),饱和碳酸氢盐溶液(1x 10mL)和卤水(1x 10mL)清洗。将有机相在Na2SO4上干燥，过滤并在真空中浓缩。将残留物再溶解于MeOH(2ml)中并立即加入甲醇钠(6.45mg,0.119mmol)。将该混合物搅拌过夜。TLC显示反应完全并将混合物浓缩至干燥。所得的残留物再溶解于1mL 1:1DCM/TFA中，并在室温搅拌30分钟。将混合物浓缩至干燥并使用最小量的DCM应用于4g RediSep Rf硅胶柱。使用含有3％TEA的0-100％EtOAc/Hex梯度洗脱产物。合并产物级份并浓缩至干燥。所得的白色粉末再溶解于DCM(3mL)并使用饱和碳酸氢盐溶液(1x 5mL)清洗。使用70/30的氯仿/异丙醇(2x 5mL)反萃取水相。合并有机相，经MgSO4干燥，过滤并浓缩以产生作为白色粉末的1-((1R,5R,7R,8S)-8-((4-氯苄基)氧)-5-(羟甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛-7-基)-胸苷(17mg,0.042mmol,69.8％收率)。
1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ8.05(q,J＝1.2Hz,1H),7.36(s,4H),5.94(s,1H),4.52(dd,J＝38.6,11.9Hz,2H),4.14(d,J＝5.1Hz,1H),3.58(dd,J＝33.9,12.3Hz,2H),3.09(d,J＝12.7Hz,1H),2.89(d,J＝13.0Hz,1H),2.75(dd,J＝13.0,3.2Hz,1H),2.57-2.50(m,1H),2.34(d,J＝13.0Hz,1H),1.98-1.90(m,2H),1.81(d,J＝1.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3CN)δ165.01,151.22,138.07,136.98,133.72,130.05,129.23,109.19,87.42,85.04,73.06,71.38,61.04,45.85,43.60,41.58,12.71.
(1R,5R,7R,8S)-叔-丁基8-((4-氯苄基)氧)-7-(胸苷-基)-5-(羟甲基)-6-氧杂- 3-氮杂双环[3,2,1]辛烷-3-羧酸盐((1R,5R,7R,8S)-tert-butyl8-((4-chlorobenzyl) oxy)-7-(thymidin-yl)-5-(hydroxymethyl)-6-oxa-3-azabicyclo[3.2.1]octane-3- carboxylate)(25)
将(1R,5R,7R,8S)-叔-丁基8-((4-氯苄基)氧)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基)氧)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷-3-羧酸盐(1.0g,1.47mmol)和苯甲酸钠(0.63g,4.40mmol)称量到具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中。在该烧瓶中装入DMF(10mL)，用隔膜密封并加热到100℃达40小时。TLC(65％EtOAc/Hex)表明该反应完全。使用饱和碳酸氢钠(100mL)稀释该混合物并使用乙酸乙酯(3x 50mL)萃取。合并有机相并使用卤水清洗，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩以产生棕褐色固体，其溶解于二噁烷(20mL)和2M NaOH(3mL)的混合物中。将该混合物加热至50℃过夜。该反应混合物在真空中浓缩至固体并应用于50g Biotage SNAP硅胶柱，使用溶于己烷的50-100％EtOAc梯度洗脱7个柱体积，并保持在100％EtOAc达7个柱体积。合并含有产物的级份并在真空中浓缩以产出作为白色泡沫状物的(1R,5R,7R,8S)-叔-丁基8-(羟基)--7-(胸苷-基)-5-(羟甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷-3-羧酸盐(0.63g,1.24mmol,84.6％)。
ESI-MS:506(M)-
(1R,5R,7R,8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-(羟甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰基)-6-氧 杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷((1R,5R,7R,8S)-8-Hydroxy-7-(thymidin-yl)-5- (hydroxymethyl)-3-(2,2,2-trifluoroa cetyl)-6-oxa-3-azabicyclo[3.2.1]octane) (26)
将(1R,5R,7R,8S)-叔-丁基8-(羟基)-7-(胸苷-基)-5-(羟甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷-3-羧酸盐(0.6g,1.18mmol)溶解于乙醇(25mL)并转移到500mL的帕尔氢化器(Parr hydrogenation vessel)。立即添加Pearlman(0.35g)催化剂和一滴冰醋酸并将混合物在帕尔氢化器上氢气环境(40psi)下摇动4小时。TLC表明该反应完全并为点对点的(溶于DCM的5％甲醇)。将混合物小心过滤通过硅藻土床，其之前使用几个体积的甲醇清洗。使用乙酸乙酯(100mL)和乙醇(100mL)清洗该硅藻土床。过滤物在真空中浓缩至约5mL并转移到20mL的玻璃闪烁小瓶。使材料在真空中干燥以产生灰白色粉末，其在不进一步纯化的情况下使用。
该玻璃闪烁小瓶装有微搅拌棒并装入二氯甲烷(2mL)和三氟醋酸(2mL)。将小瓶密封并设置为搅拌30分钟。移除微搅拌棒并在真空中移出挥发物。所得的油与甲苯(2x 4mL)，甲醇(1x 4mL)和DCM(2x 4mL)共蒸发以在小瓶中产生灰白色粉末/残留物。使用微搅拌棒在闪烁小瓶中将该残留物再溶解于甲醇(5mL)。添加三氟乙酸乙酯(2.00mL,16.9mmol)和TEA(0.410mL,3.54mmol)，密封小瓶并将混合物设置为搅拌过夜。20小时后，混合物的TLC表明起始材料已经完全消耗而新的产物已经形成。在真空中移出挥发物。将残留物与EtOAc(2x5mL)和甲苯(2x 5mL)共蒸发以产生(1R,5R,7R,8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-(羟甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷(0.30g,79.8％)直接用于下一步三苯甲基化步骤。粗制材料的1H NMR分析表明形成了以约55:45比率的非对映体混合物(通过异头物信号的整合)。
(1R,5R,7R,8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-((4,4’-二甲氧基三苯甲基氧)甲基)-3- (2,2,2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷((1R,5R,7R,8S)-8-Hydroxy-7- (thymidin-yl)-5-((4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl)-3-(2,2,2-trifluoroacetyl)- 6-oxa-3-azabicyclo[3.2.1]octane)(27)
5'-O-DMTr-aCBBN(tfa)
在50mL圆底烧瓶中，将(1R,5R,7R,8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-(羟甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷(0.28g,0.74mmol)与吡啶(2x 10mL)共蒸发。烧瓶中装入无水吡啶(7mL)并立即向该溶液添加DMTr-Cl。密封烧瓶并将混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示所有起始材料被消耗(95％EtOAc/Hex或5％MeOH/DCM)。通过添加甲醇(0.5mL)并持续搅拌30分钟，接着通过添加饱和NaHCO3水溶液(30mL)淬灭反应。使用EtOAc(3x 20mL)萃取水相。合并有机相并使用卤水清洗(1x 20mL)，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩以产生棕褐色泡沫状物。固体溶解于最小量的DCM并应用于50g Biotage硅胶SNAP柱，其之前使用60ml溶于己烷的25％TEA溶液处理并使用200mL 30％的EtOAc/Hex平衡。使用10个柱体积30-100％溶于己烷的EtOAc梯度接着4个柱体积的100％EtOAc将产物从柱上洗脱。合并含有纯产物的级份并浓缩以产生作为白色泡沫状物的DMTr-(N-tfa)-aminoCBBN。1H和19F NMR两者指示两种不同的非对映体。1H NMR表格中的星号表示当非对映体质子以约55:45的比率溶解时的峰值。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.72*(d,J＝1.0Hz,1H),7.68*(d,J＝1.1Hz,1H),7.49–7.38(m,4H),7.35–7.20(m,14H),6.93–6.78(m,8H),5.73*(s,1H),5.68*(s,1H),4.55–4.36(m,3H),4.05*(s,2H),4.01*(s,2H),3.94–3.84(m,1H),3.79(q,J＝0.7Hz,13H),3.64(t,J＝12.0Hz,1H),3.57–3.38(m,4H),3.38–3.15(m,4H),2.70*(d,J＝3.6Hz,1H),2.65*(t,J＝4.0Hz,1H),1.47*(s,3H),1.41*(s,3H),1.28(bs,2H).19F NMR(376MHz,cdcl3)δ-68.61,-68.90.
ESI MS:680(M)-
(1R,5R,7R,8S)-7-(胸苷-基)-5-((4,4’-二甲氧基三苯甲基氧)甲基)-3-(2,2,2- 三氟乙酰基)-6,8-氧杂-3-氮杂双环[3,2,1]辛烷-8-O-(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰 胺((1R,5R,7R,8S)-7-(thymidin-yl)-5-((4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl)-3-(2,2, 2-trifluoroacetyl)-6,8-oxa-3-azabicyclo[3.2.1]octane-8-O-(2-cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphorami dite)(28)
5'-O-DMTr-aCBBN(tfa)亚酰胺(Amidite)
在装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中称量5'-O-DMTr-aCBBN(tfa)(0.32g,0.47mmol)。向瓶中装入二氯甲烷(7mL)并设置为搅拌。在注射器中称量2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.283g,0.94mmol)并立即添加到溶液，接着添加4,5-二氰基咪唑(55.44mg,0.47mmol)。立即将烧瓶用隔膜密封并搅拌过夜。在过程中，在20小时的TLC显示仅存在微量的起始材料，出现了两个三苯甲基阳性的新点，且使用5％甲醇/DCM w/UV显现后用Hanessian染剂处理时似乎与起始核苷类似地烧焦。通过添加饱和NaHCO3水溶液(50mL)淬灭反应。使用乙酸乙酯(4x 20mL)萃取水相。合并有机相并使用饱和NaHCO3溶液(2x 50mL)和卤水(1x 20mL)萃取。有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以产生无色油。粗产物溶解于最小量的DCM并应用于50g Biotage硅胶SNAP柱，其之前使用60ml溶于己烷的25％TEA溶液处理并使用150mL 30％的乙酸乙酯/己烷平衡。使用10个柱体积30-100％溶于己烷的EtOAc梯度接着4个柱体积的100％EtOAc将产物从柱上洗脱。合并含有纯产物的级份并浓缩以产生作为白色泡沫状物的DMTr-(N-tfa)-aminoCBBN亚酰胺。正如预期的，31P和1H NMR指示四种不同产物的存在，每种对应单独的立体异构体，其从环胺的tfa保护和亚磷酸化(phosphitylation)反应产生。31P NMR(162MHz,CD3CN)δ150.03,149.97,147.46.相对强度1:1:2.19F NMR(376MHz,CD3CN)δ-69.30,-69.31,-69.47,-69.47.
ESI MS:904.8(M+Na+)+
实施例2：2’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺和缀合物的产生
如图4A所示二甲氧基三苯甲基(DMTr)-保护的胺2-C’-桥接双环核苷亚磷酰胺 (30)的合成
化合物30从化合物24合成，通过在甲醛和氰基硼氢化钠(sodiumcyanoborohydride)(J.Org.Chem.,1972,37,pp 1673–1674,Borch条件)或类似还原剂例如ZnCl2/NaBH4的存在下将化合物24进行还原性胺化。还原性甲基化后，通过将产物溶解于乙醇并使用Pearlman催化剂在氢气环境(40psi)和微量乙酸中将混合物进行催化性氢化来使3’-OH暴露(unmask)。粗制的还原混合物可以直接在冷却的吡啶溶液中通过逐滴添加4’4-二甲氧基三苯甲基氯的吡啶溶液而三苯甲基化。过夜搅拌混合物以产生5’-二甲氧基三苯甲基-核苷，其通过使用硅胶柱层析纯化。接着对纯化的核苷进行亚磷酸化，其使用在二氯甲烷中的2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.5-2当量)和4,5-二氰基咪唑(1.1-2当量)作为偶联催化剂。将反应至少搅拌24小时和长达48小时直到使用饱和碳酸氢钠淬灭并经柱层析以产生亚磷酰胺30。化合物30适合在自动化固相寡核苷酸合成中使用，用于整合到合成的寡核苷酸中。
如图4B所示DMTr-保护的胺2’-C-桥接双环核苷的内部亚磷酰胺衍生物(32)的合 成
化合物32从化合物27经两个步骤合成，首先使用水性LiOH/THF溶液使化合物27经受三氟乙酰胺保护基团的碱水解。使用饱和碳酸氢钠稀释该水溶液并可以使用乙酸乙酯萃取。接着可以使粗制的核苷经亚磷酸化，使用经4-10个当量的无水TEA或DIEA预处理的2-氰乙基二氯亚磷酸酯(2-cyanoethyl phosphorodichloridite)。所得的亚磷酰胺通过硅胶柱层析纯化，其中该硅胶在使用适合的流动相洗脱前，使用几个柱体积的溶于己烷的3％TEA预处理。亚磷酰胺也必须与微量的TEA一起贮存以防止分解。化合物32适合用于自动化固相寡核苷酸合成，用于整合到合成的寡核苷酸中。在自动化固相寡核苷酸合成中的偶联和氧化步骤后，必须小心使用适合的加帽试剂。乙酸酐将产生最终去保护的寡核苷酸，其在双环氮上具有乙酰胺。在继续剩下的自动化固相寡核苷酸合成之前，其它活化的酯或酐可以用于直接在该双环氮中心处生成缀合物。
如图4C所示的DMTr-保护的脂肪酸缀合的胺2’-C-桥接双环核苷(33)的合成
化合物33直接从化合物31合成，通过利用吡啶溶液中TMS-CI对3’-OH的瞬态保护。反应4小时后，在冰浴中冷却该混合物，在搅拌下逐滴添加硬脂酰氯。将反应混合物达到室温过夜。通过添加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应混合物，使用乙酸乙酯萃取并将有机物干燥。粗制材料浓缩，再溶解于THF，接着使用溶于THF的TBAF溶液(1.25当量)处理。将反应混合物浓缩并直接经硅胶柱层析以产生化合物33。化合物33适合于亚磷酰胺的合成，如对化合物27向化合物28转化所描述的。
如图4D中所示的DMTr-保护的糖缀合的胺2’-C-桥接双环核苷的合成
化合物34直接从化合物31合成，通过利用HBTU作为偶联剂，5-[(2S,3S,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧甲基)-3-乙酰氨基四氢-2H-吡喃-2-基]戊酸(GalNAc-C5酸，通过描述于WO 2009073809的方法制备)以及至少1个当量溶于DMF溶液的N-甲基吗啉。当反应完成时(4-17小时)，使用饱和碳酸氢钠溶液稀释该混合物并使用乙酸乙酯萃取。将有机物干燥，浓缩粗制材料并将残留物直接经硅胶柱层析以产生化合物33。化合物33适合于亚磷酰胺的合成，如对化合物27向化合物28转化所描述的。
实施例3：具有2’-C-桥接双环核苷酸的寡核苷酸的合成
一般合成方法
一旦经修饰的核苷合成且游离的5’和3’羟基基团使用适合的反应基团掩蔽以成为核苷酸单体，可以制备含有糖和碱基修饰的短链寡核苷酸。例如，可以使用亚磷酰胺化学使用自动固相合成(见McBride et al.,Tetrahedron Letters 24:245-248(1983)及Sinhaet al.,Tetrahedron Letters 24:5843-5846(1983))。亚磷酰胺化学，连同相关方法例如氢膦酸酯(hydrogen phosphonate)化学就它们在寡核苷酸化学中的用途已被广泛地综述(见，例如Beaucage et al.,Tetrahedron 48:2223-2311(1992))。在固相寡核苷酸合成期间，一系列核苷酸单体以预定的顺序通过其亚磷酰胺衍生物顺序附接，所述顺序依赖于链延伸的方向，即生长的寡核苷酸链的5’-官能团或3’-官能团。
该寡核苷酸链锚定于不可溶部分，例如可控孔玻璃或聚苯乙烯树脂珠粒。附接每个单体的方法一般包括以下的步骤1至5。步骤1涉及反应官能性的保护。常见的反应官能性是末端核苷的5’-羟基。该官能性通常使用4,4’-二甲氧三苯甲基(DMT)部分保护，其可以通过酸处理移除。DMT部分的一个特征是其在酸去保护期间形成亮橙色DMT阳离子。该阳离子有效充当报告基团，其可以在波长480和500nm之间监控，用于判断之前偶联步骤完成度的目的。大多数商业化的自动合成仪具有监控释放的DMT阳离子的能力。该数据给予操作员该合成是否在任意给定步骤失败的即使提示。步骤2涉及通过添加亚磷酰胺衍生物和活化剂的偶联。该亚磷酰胺衍生物通常是核苷亚磷酰胺。然而，其也可以是用不同有机部分衍生化的亚磷酰胺。步骤3涉及未反应的末端官能团的加帽。该步骤引入惰性保护基团，其阻止进一步偶联到失效序列。步骤4涉及新形成的磷核苷酸骨架连接的氧化，从三价亚磷酸盐氧化成稳定的五价状态。该氧化步骤可以使用导致磷酸核苷酸的基于氧的氧化剂或者导致硫代磷酸核苷酸的硫化氧化剂进行。步骤5涉及清洗步骤后的方法重复。
以1μmol规模在MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统(Bioautomation,Plano,TX,USA)上合成与人miR-208a的核苷酸序列互补的截短的，16个核苷酸的序列。使用标准的脱三苯甲基化，活化剂和加帽溶液(其对于本领域技术人员是已知的)操作合成器。对每个脱氧核苷酸亚磷酰胺使用420秒的单一偶联，对于LNA亚磷酰胺使用共持续900秒的双重偶联，以及对新的核苷亚磷酰胺，例如DMTr-aCBBN(tfa)亚磷酰胺使用共持续1800秒的三重偶联来影响寡核苷酸链的延长。在进行每个偶联循环后，使用0.025M碘溶液或0.2M PADS氧化溶液氧化，以分别产生磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接。未修饰的反-208a DNA序列掺入九个2’-脱氧胸苷残基，其选择性地使用胸苷LNA(lT)，胸苷oxoCBBN(bT)，胞苷oxoCBBN(bC)或胸苷aminoCBBN(abT)核苷酸替换。胸苷LNA亚酰胺购于商业来源并与报道的光谱数据匹配(见，Singh,S.K.；Nielsen,P.；Koshkin,A.A.；Wengel,J.Chem.Commun.1998,455-6)。根据文献方法合成胸苷-2’-C,4’-C-桥接双环核苷(胸苷oxoCBBN，bT)和胞苷-2’-C,4’-C-桥接双环核苷(胞苷oxoCBBN，bC)并且所有光谱数据与报道值匹配(见，美国专利号6,403,566,Wang,G.,Girardet,J.,Gunic,E.Tetrahedron 55,1999,7707-7724)。核苷酸的平衡由具有对应于天然反-208a RNA序列的碱基的2’-脱氧核苷酸或LNA核苷酸构成。硫代磷酸酯核苷酸间连接表示为碱基后的“s”(例如，abTs或dGs)，而碱基后没有字母表示磷酸二酯核苷酸间连接(例如，abT或dG)。
化合物M-11915的制备：dC.dT.dT.dT.dT.dT.dG.dC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
亚磷酰胺试剂(28)用于单修饰的aminoCBBN寡核苷酸的合成中。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适合的偶联循环期间，亚磷酰胺试剂作为溶于乙腈的0.1M溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用有本领域知识的人已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐方法洗脱，进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到带有Waters Acuity SQ Detector的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用有本领域知识的人已知的标准方法进行产物的表征：计算值4845.2，发现值4844.0(M)-。
化合物M-11916的制备：dC.dT.dT.dT.dT.abT.dG.dC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
亚磷酰胺试剂(28)用于双重修饰的aminoCBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适合的偶联循环期间，亚磷酰胺试剂作为溶于乙腈的0.1M溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用有本领域知识的人已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐方法洗脱，进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到带有Waters Acuity SQ Detector的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用有本领域知识的人已知的标准方法进行产物的表征：计算值4886.2，发现值4885.2(M)-。
化合物M-11917的制备：dC.dT.dT.dT.abT.abT.dG.dC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT. dA
亚磷酰胺试剂(28)用于三重修饰的aminoCBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业化合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适合的偶联循环期间，亚磷酰胺试剂作为溶于乙腈的0.1M溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用有本领域知识的人已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐方法洗脱，进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到带有Waters Acuity SQ Detector的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OSTC182.5um柱，使用有本领域知识的人已知的标准方法进行产物的表征：计算值4927.3，发现值4926.1(M)-。
化合物M-11918的制备：dC.dT.dT.dT.abT.abT.dG.dC.dT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
亚磷酰胺试剂(28)用于双重修饰的aminoCBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业化合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适合的偶联循环期间，亚磷酰胺试剂作为溶于乙腈的0.1M溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用有本领域知识的人已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐方法洗脱，进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到带有Waters Acuity SQ Detector的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OSTC182.5um柱，使用有本领域知识的人已知的标准方法进行产物的表征：计算值4886.2，发现值4885.0(M)-。
化合物M-11919的制备：lCs.dTs.dTs.dTs.abTs.abTs.dGs.lCs.dTs.lCs.lGs.d Ts.lCs.dTs.lTs.lA
亚磷酰胺试剂(28)用于嵌合DNA/LNA/aminoCBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业化合成试剂进行合成，将溶于1:1嘧啶/CAN的0.2M PADS更换为氧化溶液。在如前所述的适合的偶联循环期间，亚磷酰胺试剂作为溶于乙腈的0.1M溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用有本领域知识的人已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐方法洗脱，进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到带有Waters Acuity SQ Detector的WatersAllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用有本领域知识的人已知的标准方法进行产物的表征：计算值5379.3，发现值5378.3(M)-。
化合物M-11920的制备：lCs.dTs.dTs.dTs.lTs.lTs.dGs.lCs.dTs.lCs.lGs.dTs. lCs.dTs.abTs.lA
亚磷酰胺试剂(28)用于嵌合DNA/LNA/aminoCBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业化合成试剂进行合成，将溶于1:1嘧啶/CAN的0.2M PADS更换为氧化溶液。在如前在“截短核苷酸的一般合成方法”中所述的适合的偶联循环期间，亚磷酰胺试剂作为溶于乙腈的0.1M溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用有本领域知识的人已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐方法洗脱，进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到带有WatersAcuity SQ Detector的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用本领域有知识的人已知的标准方法进行产物的表征：计算值5366.3，发现值5365.3(M)-。
化合物M-10930的制备：dC.dT.dT.dT.dT.dT.dG.dC.bT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
胸苷基-2’-C,4’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺(见，例如，美国专利号6,403,566，Wang,G.,Girardet,J.,Gunic,E.Tetrahedron 55,1999,7707-7724)用于单修饰的oxoCBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业化合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适合的偶联循环期间，所有亚磷酰胺试剂作为溶于乙腈的0.1M溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用有本领域知识的人已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐方法洗脱，进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到带有Waters Acuity SQ Detector的WatersAllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用有本领域知识的人已知的标准方法进行产物的表征：计算值4846.1，发现值4845.8(M)-。
化合物M-10924的制备：bC.bT.bT.bT.bT.bT.dG.bC.bT.bC.dG.bT.bC.bT.bT.dA
胸苷-2’-C,4’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺和N-Bz-腺苷-2’-C,4’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺(见，例如，美国专利号6,403,566，Wang,G.,Girardet,J.,Gunic,E.Tetrahedron55,1999,7707-7724)用于单修饰的oxoCBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业化合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适合的偶联循环期间，所有亚磷酰胺试剂作为溶于乙腈的0.1M溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的剪切。通过将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用有本领域知识的人已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐方法洗脱，进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到带有Waters Acuity SQ Detector的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OSTC182.5um柱，使用本领域有知识的人已知的标准方法进行产物的表征：计算值5330.6，发现值5350.2(M)-。
实施例4：具有2’-C-桥接双环核苷酸的寡核苷酸的功能性表征
解链温度(Tm)的确定
当设计合成寡核苷酸序列作为针对反义和微小RNA靶标的药物时，解链温度(Tm)是一个关键的参数。一般不存在特定的Tm阈值，高于或低于该Tm阈值决定活性。然而，人们认识到对于反义和微小RNA抑制物寡核苷酸药物，Tm必须显著升高。此外，合成的寡核苷酸药物的核苷酸骨架(例如，硫代磷酸酯)的化学修饰时常用于给予针对体内生物降解的稳定性。然而，大多数核苷酸磷酸酯骨架修饰时常导致与其靶物形成双链体的寡核苷酸药物的Tm的下降。因此，针对其靶序列的合成寡核苷酸药物的Tm相对于天然DNA或RNA，2’-OMeRNA，以及其它类似核苷酸单元的固有Tm的足够的增加对于合成寡核苷酸药物具有足够的特异性，靶标结合，以及最终靶标控制的细胞过程的下游调控是需要的。
确定了经修饰的16个核苷酸的磷酸二酯链的解链温度(Tm)，并与具有天然磷酸二酯DNA核苷酸的相同的16个核苷酸的序列的Tm比较。具体地，与具有相同核碱基的2’-脱氧核苷或oxoCBBN核苷相比，相对aminoCBBN解链温度(Tm)按照整合通过确定氨基修饰的16个核苷酸长度的磷酸二酯链的解链温度和利用2’-脱氧核苷或oxoCBBN磷酸二酯DNA核苷酸的相同16个核苷酸的序列的解链温度之间的差别测定。仅当它们被放置于序列的相同位置时，比较取代的Tm差别。通过文献参考文献获得amino-LNA和其oxo-LNA对应物的可比值(见Singh,S.K.,Kumar,R.,Wengel J.J.Org.Chem.,Vol.63,No.26,1998)。
例如，经修饰的反-208a寡核苷酸退火到互补序列，长二十二个核苷酸，由RNA核苷和磷酸酯骨架构成。互补序列与内源性成熟miRNA相同。热变性温度(Tm)测量为解链曲线(A260对Temp)的一阶导数图的最大值。该双链体以1μM在0.9％NaCl缓冲液中构成。温度以1℃/min从25℃变化到95℃，并且每30秒读一次260nm的OD。Tm值为至少两次测量的平均值。
使用Varian Cary 1E UV-Vis分光光度计测量16个核苷酸(与成熟的人miR-208a核苷酸序列互补)的多种修饰的双链体解链温度。测试的反-miRNA208a寡核苷酸序列包括完全的DNA磷酸二酯(化合物M-10931)，四种具有1个，2个或3个aminoCBBN胸苷残基取代dT残基的DNA磷酸二酯寡核苷酸(化合物M-11915,M-11916,M-11917,和M-11918)，混合的9LNA/7DNA硫代磷酸酯寡核苷酸(化合物M-10101)，以及2种混合的LNA/DNA/aminoCBBN硫代磷酸酯寡核苷酸，其中亲本化合物(化合物M-10101)的LNA胸苷使用1个或2个aminoCBBN残基取代(化合物M-11919和M-11920)。双链体以1μM在0.9％NaCl中构成。温度以1℃/min从25℃变化到95℃，并且每30秒读一次260nm的OD。
具有aminoCBBN修饰的磷酸二酯寡核苷酸相比其完全DNA对应物，一致地具有针对互补序列的更高解链温度，以及因此更高的亲和力(见表3)。相对于DNA，亲和力增强在5-9℃/修饰的等级上。这些亲和力的增加与LNA和aminoLNA的文献值一样好或更好。
表3
表4符号的说明
aminoLNA-T与其oxo-类似物，LNA-T的比较，显示aminoLNA-T针对其互补物没有LNA-T稳定。类似地，aminoENA-T相对于其oxo-类似物似乎具有非常少的双链体稳定效果。出人意料的是，aminoCBBN-T与其oxoCBBN-T类似物的比较显示aminoCBBN修饰比oxoCBBN-T显著地更稳定，达到2-4℃/修饰(见表5和图5)。不希望受到理论的束缚，推测LNA的2’-O(一种质子受体)当它在2’-位置被质子供体替换时，具有针对双链体水合和稳定性的更为稳定性效果，正如在aminoLNA的情况下。相反的，aminoCBBN比其oxoCBBN类似物似乎在双链体水合和稳定性上具有积极得多的效果，并提供在任意其它2’4’-碳-桥接双环核苷酸中都没有见到的Tm提高(见图5)。
表5
反-208a寡核苷酸的细胞培养活性
产生了稳定表达miR-208a的HeLa细胞系。具体地，将表达miR-208a的miRNA表达载体(Cell BioLabs,Inc.)转染到HeLa细胞中。接着使用嘌呤霉素选择筛选选自细胞，并分离通过qPCR测量的具有可检测miR-208a表达的克隆(Ct值＝约30)。
将细胞以10,000个细胞每孔分配到有黑色壁的96孔板中。分配后24小时后，使用含有在花虫(renilla)基因的3’UTR中的miR-208a结合位点和各种miR-208a抑制物(化合物M-11919，M-11920，和M-10101)的双重萤光素酶质粒转染细胞。化合物M-10591为非靶向对照。在37℃孵育细胞24小时，接着使用双重萤光素酶报告测试系统(Promega)通过发光测量萤火虫(作为转染标准化)和花虫水平两者。数据相对于仅使用miR-208a双重萤光素酶质粒(psi检验208a)处理的细胞标准化。该psi检验2细胞使用不包括miR-208a结合位点的双重萤光素酶质粒处理。
结果证明与化合物M-10101相比，化合物M-11920具有可比的活性，化合物M-10101是一种优化的miR208a抑制物，其仅包括LNA/DNA碱基(见图6)。因而，使用aminoCBBN残基多重取代LNA残基导致miR208抑制活性的完全保留。化合物M-11919与其它两种抑制物相比具有稍少的活性(见图6)。化合物M-11919的活性与Tm数据相关，表明化合物M-11919与M-11920化合物相比具有对miR-208a RNA的较少的亲和力。

Claims (55)

1.一种寡核苷酸，其包含至少一个2’-C-桥接双环核苷酸，其中所述2’-C-桥接双环核苷酸具有式I的结构：
其中
X为N；
W1和W2各自独立地选自H，醇保护基团，磷酸酯，硫代磷酸酯，二或三磷酸根，亚磷酰胺，或5’或3’侧的一个或多个核苷酸；
W3独立地选自不存在，H，胺保护基团，亚磷酰胺(phosphoramidite)，氨基磷酸酯(phosphoramidate ester)，二氨基磷酸酯(phosphordiamidate ester)，烷基，氨甲酰(carboxamide)，糖，脂肪酸，其它分子缀合物，–C1-4(O)R，或–COOR，其中R为芳基，线性或环状烷基或烯基，糖，脂肪酸，药物缀合物或其它分子缀合物；和
B为核碱基。
2.权利要求1的寡核苷酸，其中所述醇保护基团选自4,4’-二甲氧基三苯甲基，乙酰基，甲硅烷基，或酸不稳定醚。
3.权利要求1的寡核苷酸，其中所述胺保护基团选自苄氧羰基(carbobenzyloxy,Cbz)，对甲氧基苯甲基羰基(p-methoxybenzyl carbonyl)(Moz或MeOZ)，叔-丁基氧基羰基(butyloxycarbonyl BOC)，9-芴基甲氧基羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC)，乙酰基(Ac)，苯甲酰基(Bz)，苄基(Bn)，或三氟乙酰基(tfa)。
4.权利要求1的寡核苷酸，其中所述核碱基为嘌呤碱基。
5.权利要求1的寡核苷酸，其中所述核碱基为嘧啶碱基。
6.权利要求1的寡核苷酸，其具有5至9个2’-C-桥接双环核苷酸。
7.权利要求1的寡核苷酸，其中至少25％的核苷酸是2’-C-桥接双环核苷酸。
8.权利要求1的寡核苷酸，其中至少50％的核苷酸是2’-C-桥接双环核苷酸。
9.权利要求1的寡核苷酸，其中至少75％的核苷酸是2’-C-桥接双环核苷酸。
10.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为从5至50个核苷酸。
11.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为从10至25个核苷酸。
12.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度少于10个核苷酸。
13.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个选自2’脱氧，2’-O-甲基，2’-氟代，或2’至4’甲氧基桥接结构的核苷酸。
14.权利要求1的寡核苷酸，包含一个或多个硫代磷酸酯连接。
15.权利要求14的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸为完全硫代磷酸连接的。
16.权利要求14的寡核苷酸，其包含1至3个磷酸酯连接。
17.权利要求14的寡核苷酸，其中所述2’-C-桥接双环核苷酸是硫代磷酸酯连接的。
18.权利要求14的寡核苷酸，其包含一个或多个二氨基磷酸酯连接。
19.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是完全通过二氨基磷酸酯连接所连接的。
20.权利要求1的寡核苷酸，其包含1至3个二氨基磷酸酯连接。
21.权利要求18的寡核苷酸，其中所述2’-C-桥接双环核苷酸是二氨基磷酸酯连接的。
22.权利要求18的寡核苷酸，其中所述二氨基磷酸酯连接描述为
其中
R1和R2各自独立地选自-OH、烷氧基或醇保护基团；
R3选自H，烷基，烯基，氧，芳基，苄基，卤素，-OH，-NH2，烷氧基，醇保护基团或氨基保护基团；和
B为核碱基。
23.权利要求1的寡核苷酸，其包含至少一个嘌呤和/或嘧啶碱基修饰。
24.权利要求23的寡核苷酸，其中所述碱基修饰是甲酰胺基(carboxamido)。
25.权利要求23的寡核苷酸，其中所述碱基修饰是在嘌呤的C-8位置或嘧啶的C-5位置的甲酰胺基部分。
26.权利要求1的寡核苷酸，其包含一个或多个吗啉代核苷酸。
27.权利要求1的寡核苷酸，其由与人微小RNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。
28.权利要求27的寡核苷酸，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NOs:1-63中任一项的人微小RNA的核苷酸序列完全互补。
29.权利要求27的寡核苷酸，其中所述人微小RNA是miR-208a,miR-208b,miR-499,miR-15,miR-16,miR-195,miR-29,miR-126,miR-206,miR-143,miR-1,miR-133,miR-451,miR-378,miR-378*,miR-92,miR-34a,miR-145和miR-33中的任一项。
30.权利要求27的寡核苷酸，其中所述核苷酸序列与人miR-15a,miR-15b,miR-208a,miR-208b,miR-378,miR-451或miR-499序列互补。
31.权利要求27的寡核苷酸，其中所述核苷酸序列与人miR-208a,miR-208b,miR-378,miR-451或miR-499序列完全互补。
32.根据权利要求1的寡核苷酸，其中所述烷基是甲基或环烷基。
33.根据权利要求12的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度少于8个核苷酸。
34.一种具有式I的结构的2’-C-桥接双环核苷或核苷酸：
其中
X为N；
W1和W2各自独立地选自H，醇保护基团，磷酸酯，硫代磷酸酯，二或三磷酸酯，或亚磷酰胺；
W3独立地选自H，胺保护基团，亚磷酰胺，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，烷基，氨甲酰，糖，脂肪酸，其它分子缀合物，–C1-4(O)R，或–COOR，其中R为芳基，线性或环状烷基或烯基，糖，脂肪酸，药物缀合物或其它分子缀合物；和
B为核碱基。
35.根据权利要求34的2’-C-桥接双环核苷或核苷酸，其中所述烷基是甲基或环烷基。
36.一种药物组合物，其包含：有效量的权利要求1-33任一项的寡核苷酸，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或稀释剂。
37.权利要求36的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含胶体分散系统、大分子复合物、纳米胶囊、微球、水包油乳剂、胶束或脂质体。
38.权利要求37的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含珠。
39.权利要求37的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含混合胶束。
40.权利要求36的药物组合物，其中所述药物组合物为水性制剂。
41.一种在细胞中降低或抑制微小RNA活性的方法，其包含：使细胞接触权利要求1-33任一项的寡核苷酸，所述方法不是诊断或治疗疾病的方法，其中所述寡核苷酸与所述微小RNA互补。
42.权利要求41的方法，其中所述微小RNA是SEQ ID NOs:1-63中的任一项。
43.权利要求41的方法，其中所述微小RNA为miR-1,miR-100,miR-10b,miR-125b,miR-128,miR-133a,miR-133b,miR-139,miR-143,miR-145,miR-150,miR-15a,miR-15b,miR-16,miR-181b,miR-195,miR-197,miR-199a,miR-199b,miR-206,miR-208a,miR-208b,miR-20a,miR-21,miR-214,miR-22,miR-221,miR-222,miR-224,miR-23a,miR-26a,miR-26b,miR-28,miR-29a,miR-29b,miR-29c,miR-30a,miR-30b,miR-30c,miR-30d,miR-30e,miR-342-3p,miR-382,miR-422a,miR-378,miR-424,miR-483-3p,miR-484,miR-486-5p,miR-497,miR-499,miR-542-5p,miR-92a,miR-92b,miR-let-7a,miR-let-7b,miR-let-7c,miR-let-7d,miR-let-7e,miR-let-7f,miR-let-7g,miR-451,miR-15,miR-29,miR-126,miR-133,miR-92,miR-34a或miR-33。
44.权利要求41-43中任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述细胞是心脏细胞。
46.权利要求44的方法，其中所述细胞是离体的。
47.权利要求36-40任一项的药物组合物在制造用于在受试者中预防或治疗与以下的微小RNA相关，或由其介导的状况的药物中的用途：
1)miR-208a、miR-208b或miR-499，其中所述寡核苷酸是所述miR-208a、miR-208b或miR-499的拮抗剂，并且其中所述状况为病理性心脏肥大、心肌梗塞，或心脏衰竭；
2)miR-208a或miR-208b，其中所述寡核苷酸是所述miR-208a或miR-208b的拮抗剂，并且其中所述状况为代谢紊乱；
3)miR-15、miR-16或miR-195，其中所述寡核苷酸是所述miR-15、miR-16或miR-195的拮抗剂，并且其中所述状况为病理性心脏肥大、心肌梗塞，或心脏衰竭；
4)miR-29，其中所述寡核苷酸是所述miR-29的激动剂，并且其中所述状况为组织纤维化；
5)miR-126，其中所述寡核苷酸是所述miR-126的拮抗剂，并且其中所述状况为病理性血管形成；
6)miR-206，其中所述寡核苷酸是所述miR-206的激动剂，并且其中所述状况为肌肉损伤；
7)miR-206或miR-1，其中所述寡核苷酸是所述miR-206或miR-1的激动剂，并且其中所述状况为去神经神经病状态；
8)miR-143，其中所述寡核苷酸是所述miR-143的激动剂，并且其中所述状况为再狭窄或新内膜形成；
9)miR-1或miR-133，其中所述寡核苷酸是所述miR-1或miR-133的激动剂或拮抗剂，并且其中所述状况为肌肉损伤；
10)miR-451，其中所述寡核苷酸是所述miR-451的激动剂并且其中所述状况为贫血症；
11)miR-378或miR-378*，其中所述寡核苷酸是所述miR-378或miR-378*的拮抗剂并且其中所述状况为代谢紊乱；
12)miR-92，其中所述寡核苷酸是所述miR-92的拮抗剂，并且其中所述状况为血管生成和血管修复缺陷；
13)miR-92，其中所述寡核苷酸是所述miR-92的激动剂，其中所述状况为血管生成性肿瘤；
14)miR-34a，其中所述寡核苷酸是所述miR-34a的拮抗剂，其中所述状况为心肌梗塞；
15)miR-145，其中所述寡核苷酸是所述miR-145的拮抗剂，其中所述状况为肺动脉高压；或
16)miR-33，其中所述寡核苷酸是所述miR-33的拮抗剂，其中所述状况为他汀类(statin)诱导的肝毒性、胆汁淤积，或增加的HDL胆固醇。
48.权利要求47的用途，其中：
所述2)中的代谢紊乱为肥胖、高血脂症、糖尿病、代谢综合征、高胆固醇血症，或脂肪肝；
所述4)中的组织纤维化为心、肺、肝、或肾组织纤维化；
所述7)中的去神经神经病状态为ALS、脊髓损伤或重症肌无力；或者
所述11)中的代谢紊乱为肥胖、高血脂症、糖尿病、代谢综合征、高胆固醇血症，或脂肪肝。
49.权利要求47-48任一项的用途，其中所述药物组合物通过肠胃外施用或通过直接注射到心脏组织中施用。
50.权利要求49的用途，其中所述肠胃外施用是静脉内，皮下，腹膜内，或肌肉内。
51.权利要求47-48任一项的用途，其中所述药物组合物通过口服，经皮，受控释放，栓剂，导管，或舌下给药施用。
52.权利要求1-33中任一项的寡核苷酸用于制备组合物的用途，所述组合物用于在细胞中降低或抑制微小RNA活性，其中所述寡核苷酸与所述微小RNA互补。
53.权利要求52的用途，其中所述微小RNA是SEQ ID NOs:1-63中的任一项。
54.权利要求52的用途，其中所述微小RNA为miR-1,miR-100,miR-10b,miR-125b,miR-128,miR-133a,miR-133b,miR-139,miR-143,miR-145,miR-150,miR-15a,miR-15b,miR-16,miR-181b,miR-195,miR-197,miR-199a,miR-199b,miR-206,miR-208a,miR-208b,miR-20a,miR-21,miR-214,miR-22,miR-221,miR-222,miR-224,miR-23a,miR-26a,miR-26b,miR-28,miR-29a,miR-29b,miR-29c,miR-30a,miR-30b,miR-30c,miR-30d,miR-30e,miR-342-3p,miR-382,miR-422a,miR-378,miR-424,miR-483-3p,miR-484,miR-486-5p,miR-497,miR-499,miR-542-5p,miR-92a,miR-92b,miR-let-7a,miR-let-7b,miR-let-7c,miR-let-7d,miR-let-7e,miR-let-7f,miR-let-7g,miR-451,miR-15,miR-29,miR-126,miR-133,miR-92,miR-34a或miR-33。
55.权利要求47-48中任一项的用途，其中所述药物组合物通过持续释放或延迟释放施用。
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