CN106459135A - 双环核苷的合成 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于合成包含至少一个2'‑C‑桥接双环核苷酸的修饰的核苷、核苷酸和寡核苷酸的方法，还涉及在该方法中使用的中间体。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2014年3月16日提交的美国临时申请第61/953,889号的优先权的权益，其全部内容出于全部目的在此处通过提述以其全文并入。
发明领域
本发明涉及用于合成包含至少一个2′-C-桥接双环核苷酸的修饰的核苷、核苷酸和寡核苷酸的方法，还涉及在该方法中使用的中间体。
发明背景
包含至少一个2′-C-桥接双环核苷酸的修饰的寡核苷酸可提供效力、递送效率、靶标特异性、稳定性和/或毒性方面的优势。因此，需要用于有效合成用于掺入该寡核苷酸的2′-C-桥接双环核苷酸的方法。
发明概述
本发明涉及用于产生2′-C-桥接双环核苷或核苷酸(CBBN)或其亚磷酰胺和包含至少一个2′-C-桥接双环核苷酸的寡核苷酸方法，以及在该方法中使用的合成性中间体。在多个实施方案中，合成的寡核苷酸为在效力、递送效率、靶标特异性、稳定性和/或毒性方面提供优势的反义抑制剂。
在一个方面，本文提供用于产生2’C-桥接双环核苷或核苷酸(CBBN)的β-端基异构体的方法。所述方法包括糖基化核碱基(例如，全甲硅烷基化的(persilylated)核碱基)的步骤，其中所述糖基供体在2’位置包含经保护的烷基羟基。糖基化步骤随后是环化步骤，其中环化糖基的2’和4’位置。在实施方案中，所述方法可进一步包括纯化或回收2’C-桥接双环核苷或核苷酸(CBBN)的β-端基异构体的步骤。
在一个实施方案中，2’C-桥接双环核苷或核苷酸具有式I的结构：
其中X为N、S或O。在一个实施方案中，X为N，与W3形成氨基。在另一个实施方案中，X为S。在进一步的实施方案中，X为O。W1和W2独立地为H、醇保护基、包含图示的O的磷酸酯，包含图示的O的硫代磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或亚磷酰胺(phosphoramidite)。W3独立地为空、H、O、胺保护基、亚磷酰胺、包含O的氨基磷酸酯(phosphoramidate)(当X为O时)、包含O的二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)(当X为O时)、甲基、烷基、环烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸或其他本文所述的缀合分子、-C(O)R或-COOR，其中R为芳基、直链烷基、支链烷基、环状烷基、直链烯基、支链烯基、环状烯基、糖、脂肪酸或其他分子缀合物诸如药物缀合物。B为核碱基。在一些实施方案中，核碱基为嘧啶碱基。在其他实施方案中，核碱基为嘌呤碱基。在一个实施方案中，W3独立地选自空、H、O、胺保护基、亚磷酰胺、包含N的氨基磷酸酯(当X为N时)，包含N的二氨基磷酸酯(当X为N时)、甲基、烷基、环烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸、其他分子缀合物、-C1(O)R，或-COOR，其中R为芳基；直链、支链或环状烷基或烯基；糖、脂肪酸或其他分子缀合物诸如药物缀合物。
此外，在一些方面，当X为S时，W3可为＝O或(＝O)2。
X＝N、S或O
Y1、Y2＝-C(O)R、-COCF3、烷基、-COOR式II
在多个实施方案中，糖基化步骤涉及式II结构的糖基供体，其中C为N、S或O。在一个实施方案中，X为N。在另一个实施方案中，X为S。在进一步的实施方案中，X为O。W4、W5、W6独立地为醇保护基、烷基磺酸酯(包含图示的O)或芳基磺酸酯(包含图示的O)。Y1和Y2独立地为H、胺保护基、甲基、烷基、环烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸，或本文所述的其他缀合分子、-C1(O)R，或-COOR，其中R为芳基；直链烷基、支链烷基、环状烷基、直链烯基、支链烯基、环状烯基、糖、脂肪酸或其他分子缀合物诸如药物缀合物。
在多个实施方案中，糖基化步骤涉及在2’位置具有经保护的烷基羟基的糖基供体。在一个实施方案中，糖基供体在2’位置包含经乙酰基保护的甲基羟基，且环化步骤包括用胺、掩蔽的胺或经保护的胺取代羟基并环化2’和4’位置。在一个实施方案中，糖基供体在2’位置包含经乙酰基保护的甲基氨基取代基，且环化步骤包括直接环化2’和4’位置。在一个实施方案中，糖基供体在2’位置包含经乙酰基保护的甲基羟基，且环化步骤包括用巯基、掩蔽的巯基或经保护的巯基取代羟基并环化2’和4’位置。在另一个实施方案中，糖基供体在2’位置包含经乙酰基保护的甲基羟基，且环化步骤包括羟基的脱乙酰化并环化2’和4’位置以得到具有醚连接的2’C-4’C-桥接双环核苷。在一个实施方案中，糖基供体在3’位置包含醇保护基。在一个实施方案中，醇保护基为任选取代的苄基醚。在另一个实施方案中，醇保护基为热稳定的。在多个实施方案中，醇保护基可为乙酰基、甲硅烷基或不稳定性醚。在多个实施方案中，糖基供体为可被取代的戊糖。在一个实施方案中，糖基供体源自作为起始物质的核糖、阿拉伯糖或葡萄糖。
在另一方面，本文的方法以高效和高产量的产生2’C-桥接双环核苷或核苷酸。在一个实施方案中，糖基化步骤产生大于50％的β-端基异构体产量。在另一个实施方案中，糖基化步骤产生大于7∶3、大于8∶2或大于9∶1的β∶α端基异构体比率。
在一个方面，本文提供用于产生2’C-桥接双环核苷或核苷酸的β-端基异构体的方法，其包括步骤：a)糖基化核碱基，其中糖基供体在2’位置包含经保护的烷基羟基或烷基胺；和b)环化糖基的2’和4’位置以得到糖基化的双环[3.2.1]辛烷环系统。
在某些方面，糖基化包括其中碳水化合物(糖基供体)附接至另一分子(糖基受体)的羟基或其他官能团的反应。
本文的其他方面和实施方案从以下详述说明和实施例将是显而易见的。
附图简述
图1提供胺2′-C-桥接双环核苷示例性的合成路线。
图2A-2C提供具有不同的核碱基的2′-C-桥接双环核苷的示例性生成。
图2A说明胸腺嘧啶核碱基的掺入。
图2B说明完全保护的腺苷氧代CBBN的合成。掺入腺嘌呤核碱基后为包括羟基脱乙酰化的环化步骤，环化2’和4’位置以得到具有醚连接的2’C-4’C-桥接双环核苷，且最终苯甲酰化5’位置以得到完全保护的2’C-4’C-桥接双环核苷，其中来自式I的“X”为O。
图2C说明鸟嘌呤核碱基的掺入且其中来自式I的“X”为O。
图3A提供锁核苷(LNA)、其氨基LNA对应物、以及2′-O，4′-C-乙烯-桥接核苷(氧代ENA)及其氨基ENA对应物的亲和性增加(ΔTm，C/修饰)的比较图表。图3B提供胺2′-C-桥接双环核苷(氨基CBBN)及其氧代CBBN对应物的亲和性增加(ΔTm，C/修饰)的比较图表。如所示，胺2′-C-桥接双环核苷每个修饰赋予比其氧代CBBN对应物多得多的亲和性。此外，在寡核苷酸内的单一和多重的氨基CBBN修饰赋予等于或大于LNA核苷所具有的亲和性。
图4描述了多种miR-208a抑制剂对miR-208a表达的效力，如在双荧光素酶报告蛋白测定中所测量。测量了化合物M-10591、M-10101、M-11919和M-11920的活性。化合物M-10591为非靶向的对照。化合物M-10101，即混合的9 LNA/7 DNA硫代磷酸酯寡核苷酸，为优化的miR208a抑制剂。M10101化合物描述于美国专利第8,642,751号，其在本文以其整体通过提述并入。化合物M-10919和M-11920为混合的LNA/DNA/氨基CBBN硫代磷酸酯寡核苷酸，其中专利化合物(M-10101)的LNA胸腺嘧啶分别用1或2氨基CBBN残基替换。如所示，其中多个LNA残基用氨基CBBN残基替换的化合物M-11920保留优化的M-10101化合物的全部活性。
图5提供具有腺嘌呤碱基的2′-C-桥接双环核苷的示例性生成且其中来自式I的“X”为N。
图6提供具有鸟嘌呤碱基的2′-C-桥接双环核苷的示例性生成且其中来自式I的“X”为N。
图7提供具有胸腺嘧啶碱基的2′-C-桥接双环核苷的示例性生成且其中来自式I的“X”为N。
发明详述
本发明涉及用于合成包括2′-C-桥接双环核苷(CBBN)的经修饰的核苷的方法，并涉及在该方法中使用的中间体。在多个方面，合成方法通过使用便宜的容易获得的起始物质和试剂提供成本和便利性方面的优势。本文的方法还允许显著更高的产量。
在一个方面，本文提供用于产生2’C-桥接双环核苷或核苷酸(CBBN)的β-端基异构体的方法。所述方法包括糖基化核碱基(例如，全甲硅烷基化的核碱基)的步骤，其中糖基供体在2’位置包含经保护的烷基羟基。糖基化步骤随后为环化步骤，其中糖基的2’和4’位置环化导致环闭合。在一个实施方案中，所述方法可进一步包括纯化或回收β-端基异构体的步骤。
在一个实施方案中，本文涉及具有式I结构的CBBN的β-端基异构体的合成：
其中X为N、S或O。在一个实施方案中，X为N。在另一个实施方案中，X为S。在进一步的实施方案中，X为O。
在多个实施方案中，W1和W2独立地为H、醇保护基、包含图示的O的磷酸酯、包含图示的O的硫代磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或亚磷酰胺。在一个实施方案中，W3独立地为空、H、O、胺保护基、亚磷酰胺、包含O的氨基磷酸酯(当X为O时)、包含O的二氨基磷酸酯(当X为O时)、甲基、烷基、环烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸、或其他本文所述的缀合分子、-C1-4(O)R或-COOR，其中R为芳基；直链烷基、支链烷基、环状烷基、直链烯基、支链烯基、环状烯基、糖、脂肪酸或其他分子缀合物诸如药物缀合物。
在一个实施方案中，W3独立地选自空、H、O、胺保护基、亚磷酰胺、包含N的氨基磷酸酯(当X为N时)、包含N的二氨基磷酸酯(当X为N时)、甲基、烷基、环烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸、其他分子缀合物、-C1(O)R或-COOR，其中R为芳基；直链、支链或环状烷基或烯基；糖、脂肪酸或其他分子缀合物诸如药物缀合物。
此外，在一些方面，当X为S时，W3可为＝O或(＝O)2。
在多个实施方案中，醇保护基团选自4’4-二甲氧基三苯甲基、乙酰基、甲硅烷基或酸不稳定性醚。在一个实施方案中，W1和W2分别独立选自下组的醇保护基：4’4-二甲氧基三苯甲基、乙酰基、甲硅烷基或酸不稳定性醚。在多个实施方案中，胺保护基为苄氧羰基(carbobenzyloxy，Cbz)、对甲氧基苄基羰基(Moz或MeOZ)、叔丁基氧基羰基(BOC)，9-芴基甲基氧基羰基(FMOC)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、三氟乙酰基(tfa)。在一个实施方案中，W3为选自苄氧羰基、叔丁基氧基羰基或三氟乙酰胺基(trifluoroacetamidyl)的胺保护基团。在一个实施方案中，W3为不稳定的烷基取代基，产生叔胺。
在多个实施方案中，2’-C-桥接双环核苷为2’-脱氧-2’-C，4’-C桥接的双环核苷(2’-CBBN)。
在多个实施方案中，氧代-2’-C-桥接双环核苷为2’-脱氧-2’-C，4’-C桥接的双环核苷，其中2’C和4’C通过氧连接，产生三原子连接(-C-O-C-)(氧代CBBN)。
在多个实施方案中，氨基-2’-C-桥接双环核苷或氮杂-2’-桥接双环核苷为2’-脱氧-2’-C，4’-C-桥接双环核苷，其中2’C和4’C通过氮连接，产生三原子连接(-C-N-C-)(氨基CBBN)。
在多个实施方案中，硫代-2’-C-桥接双环核苷为2’-脱氧-2’-C，4’-C-桥接双环核苷，其中2’C和4’C通过硫连接，产生三原子连接(-C-S-C-)(硫代CBBN)。
在多个实施方案中，氨基-2’-C-桥接双环核苷酸和硫代-2’-C-桥接双环核苷酸分别为氨基-2’-C-桥接双环核苷和硫代-2’-C-桥接双环核苷的磷酸酯。
在多个实施方案中，锁核苷为2’-氧-4’-C桥接双环核苷(LNA)，其在核苷的核糖环的2’和4’位置之间具有2原子连接。核心糖形成2.5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷结构。
在多个实施方案中，ENA和氧代ENA为2’-氧-4’-C桥接双环核苷，其在核苷的核糖环的2’和4’位置间具有3原子连接。核心糖形成2.6-二氧杂双环[3.2.1]辛烷结构。
在多个实施方案中，氨基ENA和氮杂ENA为2’-氮杂-4’-C桥接双环核苷，其在核苷的核糖环的2’和4’位置间具有3原子连接。核心糖形成6-氧杂-2-氮杂双环[3.2.1]辛烷结构。
在多个实施方案中，B为核碱基。核碱基或碱基可为嘌呤或嘧啶碱基，其可经修饰。在一个实施方案中，核碱基为嘌呤碱基。在另一个实施方案中，核碱基为嘧啶碱基。在多个实施方案中，核碱基可选自天然核苷碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶，或其衍生物和替代物。另外，本发明也考虑使用非天然存在的核碱基。在某些实施方案中，非天然存在的核碱基可为其中核碱基的环原子中任意一个被另一个原子取代的碱基。例如，CH可被N取代，反之亦然。这些修饰可发生在多于一个位置。非天然存在的碱基的另一个例子为其中天然存在碱基的2-和4-取代基反转的碱基。另外的嘌呤和/或嘧啶碱基修饰描述于WO2012/061810，其通过提述完整并入本文。在一些实施方案中，碱基修饰为氨基羰基，诸如羧酰氨基、氨基甲酰基(carbamoyl)或脲(carbamide)基。在多个实施方案中，修饰在一个或多个嘧啶碱基的C-5位置，和/或在一个或多个嘌呤碱基的C-8位置。示例性的核碱基包括但不限于，9-N-腺嘌呤、9-N-鸟嘌呤、胸苷、胞苷、尿苷、5-甲基-胞嘧啶、肌苷、5-取代的尿苷、5-取代的胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶。
在多个实施方案中，糖基化步骤涉及在2’位置具有经保护的烷基羟基的糖基供体，其中烷基羟基可为C1-C4烷基羟基。在一个实施方案中，糖基供体在2’位置包含经乙酰基保护的甲基羟基。
在某些实施方案中，糖基供体在3’位置包含醇保护基。在一个实施方案中，醇保护基包含任选取代的苄基醚。在另一个实施方案中，醇保护基为热稳定的。示例性的醇保护基包括但不限于乙酰基、甲硅烷基或碱不稳定性醚。在一个实施方案中，醇保护基为4-卤代苄基。如图1(化合物17和18)所示，该方案提供高比率的β-端基异构体。
在多个实施方案中，糖基供体可为戊糖，其可被取代。在某些实施方案中，糖基供体源自便利的起始物质例如核糖、阿拉伯糖或葡萄糖。
2’和4’位置可随后环化。2’-羟基甲基可脱保护或直接环化以得到2’-C，4’-C-桥接双环核苷。可替换地，环化前，脱保护的2’-羟基甲基可转化为胺、掩蔽的胺或经保护的胺，随后在N-中心环化以得到氨基-2’-C，4’-C-桥接双环核苷。可替换地，环化前，脱保护的2’-羟基甲基可转化为巯基、掩蔽的巯基或经保护的巯基，随后在S-中心环化以得到硫代-2’-C，4’-C-桥接双环核苷。
在一个方面，本文的合成方法通过使用便宜、更易获得和更安全的化学试剂提供成本、便利和安全性方面的优势。在多个实施方案中，本文的方法以高效和高产量产生2’C-桥接双环核苷或核苷酸。在一个实施方案中，糖基化步骤产生大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的β-端基异构体。在一个实施方案中，糖基化步骤产生大于7∶3、大于8∶2或大于9∶1的β∶α端基异构体比率。
在一些实施方案中，2’C-桥接双环核苷或核苷酸转化为相应的亚磷酰胺，通过固相合成掺入寡核苷酸。在多个实施方案中，2’C-桥接双环核苷或核苷酸合成可涉及所示的一种或多种中间体，例如图1和2中所示，包括但不限于甲基-D-核糖、甲基5-O-(TBDPS)-α，β-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-2，3-O-双(4-氯苄基)-α，β-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-氧代-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-亚甲基-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-羟基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-氧代-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基4-C-羟基甲基-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(羟基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷、乙酸((2S，3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-二(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯、乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-二(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯、二甲磺酸((3S，4R)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)二(亚甲基)酯、二甲磺酸((3S，4R)-5-(胸苷-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)二(亚甲基)酯、二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基-(2，2，2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)-5-(3-苯甲酰基--胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)二(亚甲基)酯、二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)二(亚甲基)酯、(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯、1-((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-胸苷、(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯、(1R，5R，7R，8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷、(1R，5R，7R，8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-((4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷、(1R，5R，7R，8S)-7-(胸苷-基)-5-((4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6，8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-O-(2-氰基乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺、乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-二(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯、乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-异丁酰鸟苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯和苯甲酸{(1R，5R，7R，8S)-7-[(9R)-9a-苯甲酰基-9-腺嘌呤]-8-(4-氯苄基氧基)-3.6-二氧杂双环[3.2.1]辛-5-基}甲酯。这些中间体中所述的保护基可替换地可用其他本领域已知或本文所述的保护基取代，诸如4-单甲氧基三苯甲基氧基代替4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基保护基。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与miR-15a或b、miR-29、miR-92、miR-143、miR-145、miR-195、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-378、miR-451和/或miR-499的核苷酸序列基本上互补的序列。在示例性的实施方案中，寡核苷酸可包含与人miR-208a、miR-208b、miR-378、miR-451和/或miR-499的序列基本上互补的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含与人miR-208a、miR-208b、miR-378、miR-451和/或miR-499的序列基本上相同的序列。如本文使用，″基本上互补”或“基本上相同”是指与靶标多核苷酸序列至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补或相同的序列。
通过固相合成对寡核苷酸(包括修饰的多核苷酸)进行合成为本领域公知且由Caruthers等人，“New Chemical Methods for Synthesizing Poly Nucleic Acid，”Nucleic Acids Symp.Ser.，(7)：215-23(1980)综述，其在本文通过提述全部并入。寡核苷酸的合成取决于所选利用的核苷酸单体将有所变化。在示例性的实施方案中，用于合成的核苷酸单体包括但不限于二甲氧基三苯甲基(DMTr)-保护的胺2′-C-桥接双环核苷亚磷酰胺、DMTr-保护的胺2′-C-桥接双环核苷的内亚磷酰胺衍生物、DMTr-和三氟乙酸酯-保护的胺2′-C-桥接双环核苷亚磷酰胺、DMTr-保护的脂肪酸缀合的胺2′-C-桥接双环核苷亚磷酰胺，和DMTr-保护的糖缀合的胺2′-C-桥接双环核苷亚磷酰胺。在某些实施方案中，利用二甲氧基三苯甲基(DMTr)-保护的胺2′-C-桥接双环核苷亚磷酰胺、DMTr-和三氟乙酸酯-保护的胺2′-C-桥接双环核苷亚磷酰胺、DMTr-保护的脂肪酸缀合的胺2′-C-桥接双环核苷亚磷酰胺和DMTr-保护的糖缀合的胺2′-C-桥接双环核苷亚磷酰胺合成寡核苷酸可能需要延长的偶联时间。在某些实施方案中，对于涉及DMTr-保护的胺2′-C-桥接双环核苷的内亚磷酰胺衍生物的寡核苷酸的合成，标准的寡核苷酸合成循环可通过用非标准的封盖试剂替换利用Ac2O/碱的常规封盖试剂修饰。可替换地，在亚磷酰胺偶联循环后但在标准封盖步骤前，合成可立即通过用对于合成循环稳定的胺反应性缀合物或保护基(但如果合意，可在随后去除)处理新偶联的寡核苷酸修饰。
参考文献的并入
本文引用的全部参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请出于全部目的通过提述以其整体并入。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提述并非，也不应该被认作是对其构成有效现有技术的承认或任何形式的建议。
实施例
实施例1：氨基2’-C-4’C-桥接双环核苷的产生
本实施例描述了用于产生胺2’-C-桥接双环核苷的关键中间体的合成(参见图1)。
甲基-D-核糖(2)
将D-核糖(1)(90g，599mmol)、Amberlyst15(H+)(90g，599mmol)和Molecular TrapPack(90g，599mmol)平分到三个500mL的肖特瓶(Schott Bottle)中(即每个肖特瓶中各30g)。每个瓶中使用等量的甲醇填充(体积：1350ml，即450ml/瓶)以得到无色溶液。将所有的瓶放置到定轨摇床上，在250rpm/25℃持续17小时。在15％MeOH/DCM作为显色溶剂中，相比于与未经保护的核糖的共位点(co-spot)，通过反应溶液的TLC监测反应进程。经由Hannessian染色剂通过炭化显现糖类。
溶液通过玻璃垂熔漏斗过滤。使用过量的MeOH(约500mL/瓶，其含有各30g的Amberlyst和Trap Pack)清洗催化剂和Molecular Trap Pack。通过添加15mL TEA(5ml/反应瓶)使甲醇溶液为碱性。该混合物浓缩至干。将残留物与二氯甲烷(3x200mL)共蒸发以共沸除去残留的MeOH。残留物在高真空下过夜干燥，得到97.55g(99％)甲基-D-核糖(2)，其未经进一步纯化即使用。
甲基5-O-(TBDPS)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(3)
在1L的圆底烧瓶中，甲基-D-核糖(2，60.12g，366mmol)和DIEA(128ml，732mmol)溶解于DMF(体积：400ml)以得到无色溶液。该烧瓶使用氩气冲洗，并在冰浴中冷却到0℃。在10分钟内逐滴添加TBDPS-Cl(99ml，385mmol)，并允许该混合物过夜达到室温。
将反应混合物倒入饱和NaHCO3溶液(1L)中。使用EtOAc(3x300mL)萃取水相。合并有机相并使用水(1x400mL)和盐水(1x400mL)清洗。将有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到深棕色油，其通过分为4个等份并经由硅胶色谱纯化来纯化，所述硅胶色谱在75分钟内以100mL/min运行标准的0-100％EtOAc/Hex梯度，接着为7分钟保持在100％EtOAc。合并纯级分以得到121.59g(82％)作为无色油状物的甲基5-O-(TBDPS)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(3)。
甲基5-O-(TBDPS)-2，3-O-双(4-氯苄基)-α，β-D-核糖呋喃耱苷(4)
在2L的圆底烧瓶中称量甲基5-O-(TBDPS)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(3，55.0g，137mmol)。将该物质与甲苯(2x100mL)在高真空在40℃共蒸发。该烧瓶装有回流冷凝器并且该起始物质在氩气下溶解于甲苯(体积：500ml)。在约5g部分中添加氢化钠(21.86g，547mmol)以得到灰色悬浮液。将混合物加热到60℃且保持30分钟，随后使用冰浴冷却到室温。在剧烈搅拌下，在约15g部分中添加1-氯-4-(氯甲基)苯(66.0g，410mmol)。将混合物加热并在回流搅拌过夜。
将反应混合物冷却到0℃并使用500mL EtOAc稀释。通过缓慢添加EtOH(50mL)使混合物淬灭，以使起泡最小化。将混合物用EtOAc进一步稀释到1.5L，并使用10％Na2CO3(2x500mL)和饱和NaCl(1x500mL)清洗。将有机物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱纯化粗产物。使用0-30％EtOAc/己烷梯度洗脱产物。将收集的纯级分合并以得到作为黄褐色油状物的甲基5-O-(TBDPS)-2，3-O-双(4-氯苄基)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(4，62.15g，70％)。
甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-α-D-核糖呋喃耱苷(5)
在1L的圆底烧瓶中，将甲基5-O-(TBDPS)-2，3-O-双(4-氯苄基)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(4，65g，100mmol)溶解于600mL DCM以得到黄色溶液。将该混合物在氩气下冷却至0℃。在10分钟内缓慢添加氯化锡(IV)(150ml，150mmol)，期间溶液变成清澈的深棕色溶液。将反应混合物在4℃在氩气下伴随搅拌储存过夜。
使用DCM(250mL)稀释反应混合物，并在4L分液漏斗(sep funnel)中添加至500mLDI水中。将混合物剧烈振摇并使其分离。保留所有有机物和乳液/沉淀物，并使用第二等分试样的500mL水清洗。保留所有有机物和乳液/沉淀物，并使用500mL水中的10％Na2CO3清洗。通过添加MeOH和机械搅拌减少乳液。保留所有有机物和乳液/沉淀物并最后使用500mL盐水清洗。再次，通过添加MeOH和机械搅拌减少乳液。取出有机相并通过MgSO4悬浮液干燥。使用与MgSO4悬浮液组合的另外的DCM(2x100mL)萃取剩下的乳液和水相。过滤有机相并浓缩为棕色油。通过使用0-30％EtOAc/己烷梯度的硅胶柱色谱纯化粗产物。将收集的纯级分合并以的作为黄褐色油状物的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-α-D-核糖呋喃糖苷(5，41.20g，78％)。
甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-氧代-α-D-核糖呋喃糖苷(6)
在1L的圆底烧瓶中，将甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-α-D-核糖呋喃糖苷(5，41.00g，78mmol)和TEMPO(1.215g，7.78mmol)溶解于DCM(体积：250ml)以得到橙色溶液。添加二乙酸碘苯(37.6g，117mmol)并将该混合物在室温搅拌过夜。
使用DCM将反应混合物稀释到500mL并使用饱和硫代硫酸钠溶液(2x300mL)和盐水(1x300mL)清洗。将有机相经MgSO4干燥，过滤并浓缩。该橙色残留物在高真空下在50℃干燥3小时。作为黄褐色油状物的粗制甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-氧代-α-D-核糖呋喃糖苷(6，40.50，“99％”)用于后续反应。
甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-亚甲基-α-D-核耱呋喃糖苷(7)
在2000mL圆底烧瓶中将甲基三苯基溴化鏻(6，26.6g，75mmol)悬浮于乙醚(比率：20.00，体积：1500ml)以得到白色悬浮液。使用氩气冲洗烧瓶并在冰浴中冷却至0℃。将叔戊醇钠(7.39g，67mmol)溶解于苯(比率：1.000，体积：75ml)并立即添加至悬浮液。再次使用氩气冲洗该烧瓶并允许在2小时内达到室温。将该悬浮液再搅拌4小时。接着将该悬浮液在丙酮/干冰浴中冷却至-72℃。将甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-氧代-α-D-核糖呋喃糖苷(19.56g，37.25mmol)溶解于另外的乙醚(比率：1.067，体积：40ml)。通过注射器添加碳水化合物溶液并将该反应混合物在4℃搅拌17小时。
TLC显示该反应是完全的(15％EtOAc/Hex)。使用饱和NH4Cl(2x500mL)和盐水(1x250mL)清洗该反应混合物。使用乙醚(150mL)反萃取水相。将有机相合并，并通过盐水清洗(1x250mL)和添加Na2SO4干燥。过滤并浓缩有机相。通过使用0-20％EtOAc/己烷梯度的硅胶柱色谱完成纯化。合并纯级分并浓缩至干以的作为无色油状物的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-亚甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(7，14.79g，28.3mmol，76％收率)。
甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-羟基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷
(8)
在氩气下，在室温将9-BBN(8.97g，73.5mmol)添加至于THF(300ml)中的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-亚甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(7，28.50g，54.5mmol)溶液。在室温将反应混合物搅拌1.5小时后，TCL显示所有起始物质被消耗。
添加过硼酸钠四水合物(33.9g，221mmol)和水(80mL)，并在室温将混合物再搅拌2小时。分离有机层，将水相稀释至400mL，接着使用乙酸乙酯(3x250mL)萃取。将有机层合并，并经MgSO4干燥。去除溶剂，通过使用0-60％的乙酸乙酯/己烷梯度洗脱的硅胶色谱纯化产物。合并纯化的级分并浓缩至干以得到作为无色油状物的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-羟基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8，26.39g，48.8mmol，90％收率)。
甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核
糖呋喃糖苷(10)
在1L圆底烧瓶中，在氩气下，将甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-羟甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8，26.30g，48.6mmol)溶解于吡啶(200ml)以得到无色溶液。将DMTr-C1(20.58g，60.8mmol)立刻添加至搅拌的溶液。将反应混合物搅拌过夜。通过以下方式将三苯甲基化反应淬灭：伴随搅拌添加50mL MeOH达20分钟，随后使用EtOAc将混合物稀释至750mL。使用饱和NaHCO3溶液(3x350mL)和盐水(1x150mL)清洗有机相。将该有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干。
将粗产物(9a)溶解于THF(体积：70ml)。将1.0M TBAF/THF溶液(72.9ml，72.9mmol)添加到混合物并在室温搅拌1.5小时。TBAF的添加导致产生深色、烟熏色的溶液。将该混合物浓缩至干并应用于使用3％TEA/己烷预处理的330g ISCO硅胶柱。使用0-60％EtOAc/己烷梯度在50分钟内以100mL/min洗脱产物。合并纯级分并浓缩以得到作为无色油状物的甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10，27.17g，44.9mmol，92％收率)。
甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4单甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋
喃糖苷(10b)
在250圆底烧瓶中，在氩气下，将甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-羟基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8，1.82g，3.36mmol)溶解于吡啶(25ml)以得到无色溶液。将MMTr-Cl(1.30g，4.20mmol)立刻添加至搅拌的溶液。将反应混合物搅拌过夜。通过以下方式将三苯甲基化反应淬灭：伴随搅拌添加50mL MeOH达20分钟，接着使用EtOAc将混合物稀释至150mL。使用饱和NaHCO3溶液(3x75mL)和盐水(1x50mL)清洗有机相。将该有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干。
将粗产物(9b)溶解于THF(体积：10ml)。将1.0M TBAF/THF溶液(5.0ml，5.0mmol)添加到混合物并在室温搅拌1.5小时。TBAF的添加导致产生深色、烟熏色的溶液。将该混合物浓缩至干并应用于使用3％TEA/己烷预处理的100g ISCO硅胶柱。使用0-60％EtOAc/己烷梯度在30分钟内以50mL/min洗脱产物。合并纯级分并浓缩以得到作为无色油状物的甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4-单甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10b，1.74g，3.02mmol，90％产率)。
甲基5-氧代-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-
α-D-核糖呋喃糖苷(11)
在1L圆底烧瓶中，将甲基3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10a，27.15g，44.9mmol)和DCC(27.8g，135mmol)溶解于DMSO(166ml，2333mmol)以得到无色溶液。将吡啶(5.44ml，67.3mmol)和TFA(1.728ml，22.43mmol)组合于40mL DMSO中并将所得溶液添加至反应混合物。将烧瓶盖好并在室温搅拌过夜。
添加水(25mL)，并使反应在室温搅拌3小时。使用500mL EtOAc稀释该反应并过滤。使用另外的200mL EtOAc清洗沉淀。合并的有机物使用盐水(5x400mL)清洗，使用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。该产物通过使用0-100％EtOAc/Hex梯度的硅胶柱色谱纯化。合并且浓缩纯级分，以得到作为白色泡沫状物的甲基5-氧代-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(11a，25.22g，41.8mmol，93％收率)。
甲基4-C-羟基甲基-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基
甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(12)
在2L的圆底烧瓶中，将甲基5-氧-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(11a，25.20g，41.8mmol)溶解于二噁烷(1000ml)以得到无色溶液。伴随搅拌添加甲醛(249ml，3343mmol)。该反应混合物在冰浴中冷却至0℃。该烧瓶装有750mL的恒压滴液漏斗，在30分钟内添加2.0M氢氧化钠(606ml，1212mmol)以得到浑浊的白色溶液。在42小时里允许搅拌混合物，期间达到室温。该溶液变清澈。通过添加磷酸二氢钠一水合物(86g，627mmol)中和该溶液。该溶液浓缩至其体积的约三分之一，使用500mL水稀释并用DCM(3x300mL)萃取。将有机层合并且使用盐水清洗(1x300mL)，随后经Na2SO4干燥。除去溶剂，并将产物通过使用0-10％MeOH/DCM梯度洗脱的硅胶色谱纯化。合并纯化的级分并浓缩至干以得到作为无色油状物的甲基4-C-羟基甲基-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(12a，22.50g，35.4mmol，85％收率)。
甲基5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(羟基甲
基)-α-D-核糖呋喃糖苷(14)
在1L圆底烧瓶中，在Ar下，将甲基4-羟甲基-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(12a，2.50g，35.4mmol)溶解于吡啶(200ml)以得到无色溶液。该混合物在冰浴中冷却至0℃。将甲磺酰基-Cl(8.28ml，106mmol)在10分钟内逐滴添加到搅拌的溶液。该反应混合物在室温搅拌45分钟。通过以下方式将甲磺酰基化反应淬灭：将该反应冷却至0℃，并伴随搅拌添加15mL水达20分钟。使用EtOAc将该混合物稀释至750mL，并使用盐水清洗(3x400mL)。有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干。
该粗产物(13a)溶解于800mL AcOH。将水(200mL)添加至搅拌的溶液。该溶液在室温搅拌2.5小时，随后使用500mL水稀释。将该混合物浓缩至约400mL并使用另外250mL水稀释。将该溶液在高真空下浓缩至干。将残留物应用于220g ISCO硅胶柱并使用0-100％EtOAc/己烷梯度洗脱该产物。合并纯级分并浓缩以得到作为无色油状物的甲基5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰基氧基甲基)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(羟甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(14，10.01g，20.47mmol，57.8％收率)。
可替换地，将粗产物(13b)二甲磺酸((3S，4R，5S)-3-((4-氯苄基)氧基)-5-甲氧基-4-((4-单甲氧基三苯甲基氧基)甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(1.60g，2.10mmol)称量于带有搅拌棒的200ml圆底烧瓶中。向该烧瓶加入乙腈且设置为搅拌直至碳水化合物完全溶解。将水添加至搅拌的溶液，随后添加硝酸铈铵(0.115g，0.21mmol)。回收混合物并加热至60℃达1小时。将溶液冷却至室温并倒入盐水溶液(500mL)中。用乙酸乙酯(3x100mL)萃取水相。合并有机相并经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将所得的物质应用于50gBiotage SNAP硅胶柱并用0-100％EtOAc/己烷梯度洗脱。合并纯级分并浓缩以得到作为无色油状物的甲基5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-3-O-(4-氯苄基)-2-脱氧-2-α-(羟基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(14，0.94g，91.5％)。
乙酸((2S，3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧
基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(16)
将二甲磺酸((3S，4R，5S)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)-5-甲氧基四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(3.41g，6.97mmol)称量于带有搅拌棒的100ml圆底烧瓶中，并用隔膜密封。将该烧瓶冷却至0℃并加入吡啶(体积：25ml)和乙酸酐(1.316ml，13.95mmol)。使混合物在6小时内达到室温。将该混合物冷却至0℃并添加MeOH(1mL)且搅拌15分钟。将混合物浓缩至干并再溶解于EtOAc(100mL)。使用水性1％HCl(50mL)、饱和碳酸氢钠(50mL)和盐水(50mL)清洗有机相。将有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。
在100mL圆底烧瓶中使用乙酸(9.98ml，174mmol)和乙酸酐(2.63ml，27.9mmol)再溶解所得的油状物。添加H2SO4(0.037ml，0.697mmol)，用隔膜密封该烧瓶，过夜搅拌该混合物。使用水(100mL)稀释混合物并使用EtOAc(3x75mL)萃取。将有机相合并且使用饱和碳酸氢钠(2x100mL)和盐水(1x100mL)小心清洗。将有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到作为浅黄色油状物的3.15g粗制((2S，3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲基乙酸酯(3.15g，5.64mmol，81％收率)，其未经进一步纯化即使用。
ESI-MS：617(M+乙酸盐)-
((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(胸-苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲
基)四氢呋喃-3-基)甲基乙酸酯(17)
将N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(4.07ml，16.64mmol)添加到于无水乙腈(20ml)中的((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧)甲基)四氢呋喃-3-基)甲基乙酸酯(3.10g，5.55mmol)和胸腺嘧啶(0.874g，6.93mmol)的混合物。将该反应混合物回流1小时以得到澄清溶液。将溶液冷却至40℃并添加TMS-OTf (1.303ml，7.21mmol)。将该混合物在60℃加热4小时。将溶液冷却至室温，使用CH2Cl2(100mL)稀释，并使用饱和NaHCO3(2x100mL)和盐水(1x100mL)清洗。将有机层干燥(Na2SO4)，减压浓缩，残留物通过在标准的Biotage Isolera梯度(0-10％v/v MeOH/CH2Cl2)上的硅胶柱色谱纯化以得到作为白色固体物质的((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲基乙酸酯(2.84g，4.54mmol，82％收率)。
ESI-MS：624(M)-
二甲磺酸((3S，4R)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-
2，2-二基)双(亚甲基)酯(19)
在装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中，将((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲基乙酸酯(2.84g，4.54mmol)溶解于甲醇(体积：20ml)。添加甲醇钠(0.123g，2.272mmol)，将烧瓶盖好并在室温搅拌过夜。TLC(100％EtOAc)显示该反应是完全的。将反应混合物在真空中蒸发至干，并直接应用于安装在25g Biotage SNAP柱上的3g Biotage Sampler。使用40-100％EtOAc/Hex梯度洗脱产物，以得到作为白色泡沫状物的二甲磺酸((3S，4R)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(2.32g，3.98mmol，88％收率)。
ESI-MS：582(M)-
二甲磺酸((3S，4R)-5-(胸苷-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-
2，2-二基)双(亚甲基)酯(20)
在室温向二甲磺酸((3S，4R)-3-((4-氯苄基)氧)-4-(羟甲基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(1.0g，1.715mmol)和吡啶(10ml)的混合物添加TMS-Cl(0.219ml，1.715mmol)。搅拌1小时后，将该反应混合物冷却至0℃，并通过注射器逐滴添加苯甲酰氯(0.199ml，1.715mmol)。随后，移除冰浴并将反应混合物在室温搅拌48小时。通过添加水(2mL)淬灭反应；在室温搅拌15分钟后，使用EtOAc(50mL)稀释该混合物并使用5％HCl水溶液(2x25mL)、饱和NaHCO3(1x25mL)和盐水(1x25mL)清洗。有机相经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩至干。以最小DCM将残留物应用于3g Biotage Samplet，随后将其安装到25g Biotage SNAP柱。使用40-100％EtOAc/Hex梯度洗脱预期的产物，以得到作为白色泡沫状物的((3S，4R)-5-(3-苯甲酰-5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)二甲磺酸酯(0.87g，1.266mmol，73.8％收率)。
胸苷的N-苯甲酰保护导致非对映异构体的混合物，其产生3∶2比率的两个C-5甲基单峰和两个C-6质子单峰。对于α-端基异构体：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.89(s，1H，非对映异构体1)，7.87(d，J＝1.3Hz，1H，非对映异构体2)，7.67-7.60(m，1H)，7.60-7.39(m，3H)，7.39-7.17(m，5H)，6.02(d，J＝8.6Hz，1H)，4.67-4.46(m，3H)，4.42-4.26(m，5H)，3.87-3.73(m，2H)，3.02(s，3H)，2.98(s，2H)，2.82(p，J＝6.5Hz，1H)，2.03(s，3H，非对映异构体1)，1.94(s，3H，非对映异构体2)。
二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基-(2，2，2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲
基)-3-((4-氯苄基)氧基)-5-(3-苯甲酰基--胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯
(21)
在装有搅拌棒的20mL闪烁瓶中，称量二甲磺酸((3S，4R)-5-(3-苯甲酰基-胸苷-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(0.25g，0.364mmol)、亚氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(0.088g，0.364mmol)和三苯基膦(0.095g，0.364mmol)。在小瓶中装入THF(体积：4ml)，逐滴添加1.0M DLAD/THF溶液(0.364ml，0.364mmol)。搅拌过夜后，将反应混合物在真空中浓缩至干并应用于25gBiotage SNAP柱。使用40-100％EtOAc/己烷梯度洗脱产物以得到作为白色泡沫状物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-4(((叔丁氧基-(2，2，2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)-5-(3-苯甲酰基--胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(0.228g，0.25mmol，68.7％收率)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.94(d，J＝7.6Hz，2H)，7.63(t，J＝7.4Hz，1H)，7.47(t，J＝7.8Hz，2H)，7.34(d，J＝8.4Hz，2H)，7.28(d，J＝8.4Hz，2H)，7.15(s，1H)，5.99(d，J＝9.2Hz，1H)，4.70(d，J＝11.0Hz，1H)，4.60(d，J＝10.9Hz，1H)，4.49(qd，J＝8.3，3.4Hz，2H)，4.41-4.24(m，6H)，3.94(d，J＝5.6Hz，2H)，3.20-3.05(m，1H)，2.98(s，2H)，2.97(s，4H)，1.92(s，3H)，1.46(s，9H)。ESI-MS：971(M+乙酸盐)-
二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)-
5-(胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(22)
在具有磁性搅拌棒的20ml螺旋盖闪烁瓶中，称量二甲磺酸((3S，4R，5R)-4(((叔丁氧基-(2，2，2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)-5-(3-苯甲酰基-胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(125mg，0.137mmol)。在小瓶中装入THF(体积：1.5ml)和2.0M LiOH/水(1.507ml，3.01mmol)，盖好并在室温过夜搅拌。使用EtOAc(7mL)稀释该反应混合物并使用饱和碳酸氢钠(1x5mL)和盐水(1x5mL)清洗。该有机相经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩以得到作为灰白色泡沫状物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(80mg，0.117mmol，86％收率)，其纯度足以将粗品用于后续反应。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.61(s，1H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.27(d，J＝8.4Hz，2H)，7.13(s，1H)，6.04(d，J＝9.3Hz，1H)，4.74-4.64(m，1H)，4.59(d，J＝11.3Hz，1H)，4.50(d，J＝11.3Hz，1H)，4.40-4.23(m，6H)，4.00-3.89(m，1H)，3.44(dd，J＝13.6，6.7Hz，1H)，3.17(ddd，J＝14.3，8.4，5.8Hz，1H)，3.09(s，3H)，3.00(s，3H)，1.89(s，3H)，1.32(s，9H)。ESI-MS：681(M)-
(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氨苄基)氢基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基)氢基)甲
基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(23)
在10mL锥形反应瓶，将二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)-5-(胸苷-基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(60mg，0.076mmol)溶解于四氢呋喃(7mL)。将氢化钠(60％于油中的悬浮物)(12.21mg，0.305mmol)立即添加到小瓶，该小瓶装有搅拌棒和聚四氟乙烯(teflon)衬里隔膜螺旋帽，并将混合物在55℃搅拌过夜。将反应冷却至室温并伴随搅拌添加数滴MeOH淬灭该反应。使用EtOAc(10mL)稀释混合物并使用饱和碳酸氢钠水溶液(2x10mL)和盐水(1x10mL)清洗。有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到棕褐色泡沫状物，将其溶解于最小量的DCM并应用于与10g Biotage SNAP柱装配的1g Biotage Samplet。使用0-100％EtOAc/己烷梯度洗脱产物，以得到作为白色泡沫状物的((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(35mg，0.060mmol，78％收率)。
环化得到3∶2比率的N-非对映异构体的混合物，其不可通过TCL/柱色谱解析。少量非对映异构体的存在产生了数个不同的信号，其表示为a(*)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.63(s，1H)，8.59*(s)，7.62(s，1H)，7.58*(s)，7.40-7.27(m，2H)，7.23(d，J＝8.1Hz，3H)，5.80*(s)，5.79(s，1H)，4.66-4.44(m，2H)，4.44-4.27(m，2H)，4.09-3.92(m，2H)，3.79(d，J＝12.8Hz，1H)，3.61*(d，J＝12.6Hz)，3.36-3.10(m，2H)，3.08(s，3H)，2.81*(s)，2.70(s，1H)，1.94(s，3H)，1.46(s，9H)，1.44*(s)。ESI-MS：585(M)-
1-((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环
[3.2.1]辛烷-7-基)-胸苷(24)
在10mL玻璃反应瓶中，将((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(35mg，0.060mmol)和苯甲酸钠(17.21mg，0.119mmol)溶解于DMF(2ml)。该小瓶装有搅拌棒并使用聚四氟乙烯衬里的螺纹盖隔膜密封。将该混合物在油浴中加热至105℃过夜。所有组分都已实现溶解。将该小瓶从油浴移除并取出10uL通过TLC评估反应完全性。一旦冷却，立即开始形成白色晶体。TLC显示反应仅50％完全，因此添加另一部分的苯甲酸钠(17.21mg，0.119mmol)连同1mL DMF以容许搅拌。将该混合物加热至105℃，再持续48小时，定期取出等分试样用于TLC分析。稠厚沉淀物一直没有完全实现溶解，甚至在加热至105℃达两天后，然而反应在无可检测分解的情况下达到完全。
将反应混合物冷却至室温，使用EtOAc(10mL)稀释，并使用水(2x10mL)、饱和碳酸氢盐溶液(1x10mL)和盐水(1x10mL)清洗。将有机相经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残留物再溶解于MeOH(2ml)中并立即加入甲醇钠(6.45mg，0.119mmol)。将该混合物搅拌过夜。TLC显示反应完全并将混合物浓缩至干。所得残留物再溶解于1mL 1∶1DCM/TFA中，并在室温搅拌30分钟。将混合物浓缩至干并使用最小量的DCM应用于4g RediSep Rf硅胶柱。使用含有3％TEA的0-100％EtOAc/Hex梯度洗脱产物。合并产物级分并浓缩至干。所得白色粉末再溶解于DCM(3mL)并使用饱和碳酸氢盐溶液(1x5mL)清洗。使用70/30的氯仿/异丙醇(2x5mL)反萃取含水部分。合并有机相，经MgSO4干燥，过滤并浓缩以得到作为白色粉末的1-((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3，2，1]辛-7-基)-胸苷(17mg，0.042mmol，69.8％收率)。
1H NMR(400MHz，乙腈-d3)δ8.05(q，J＝1.2Hz，1H)，7.36(s，4H)，5.94(s，1H)，4.52(dd，J＝38.6，11.9Hz，2H)，4.14(d，J＝5.1Hz，1H)，3.58(dd，J＝33.9，12.3Hz，2H)，3.09(d，J＝12.7Hz，1H)，2.89(d，J＝13.0Hz，1H)，2.75(dd，J＝13.0，3.2Hz，1H)，2.57-2.50(m，1H)，2.34(d，J＝13.0Hz，1H)，1.98-1.90(m，2H)，1.81(d，J＝1.1Hz，3H)。13C NMR(101MHz，CD3CN)δ165.01，151.22，138.07，136.98，133.72，130.05，129.23，109.19，87.42，85.04，73.06，71.38，61.04，45.85，43.60，41.58，12.71。
(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮
杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(25)
将(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯苄基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(1.0g，1.47mmol)和苯甲酸钠(0.63g，4.40mmol)称量到具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中。在该烧瓶中装入DMF(10mL)，用隔膜密封并加热至100℃达40小时。TLC(65％EtOAc/Hex)表明该反应完全。使用饱和碳酸氢钠(100mL)稀释该混合物并使用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。合并有机相并使用盐水清洗，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩以得到棕褐色固体，其溶解于二噁烷(20mL)和2M NaOH(3mL)的混合物中。将该混合物加热至50℃过夜。该反应混合物在真空中浓缩至固体并应用于50g Biotage SNAP硅胶柱，且使用50-100％EtOAc/己烷梯度洗脱7个柱体积，并保持在100％EtOAc达7个柱体积。合并含有产物的级分并在真空中浓缩以得到作为白色泡沫状物的(1R，5R，7R，8S)-8-(羟基)-7-(胸苷-基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.63g，1.24mmol，84.6％)。
ESI-MS：506(M)-
(1R，5R，7R，8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-
氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷(26)
将(1R，5R，7R，8S)-8-(羟基)-7-(胸苷-基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.6g，1.18mmol)溶解于乙醇(25mL)并转移到500mL的帕尔氢化器(Parr hydrogenation vessel)。立即添加Pearlman催化剂(0.35g)和一滴冰醋酸，并将混合物在帕尔氢化器上在氢气气氛(40psi)下摇动4小时。TLC表明该反应完全并为点对点的(5％甲醇/DCM)。将混合物小心过滤通过硅藻土床，其之前使用数个体积的甲醇清洗。使用乙酸乙酯(100mL)和乙醇(100mL)清洗该硅藻土床。滤液在真空中浓缩至约5mL并转移到20mL的玻璃闪烁小瓶。使物质在真空中干燥以得到作为灰白色粉末的(1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-7-(5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(54)，其未经进一步纯化即使用。
该玻璃闪烁小瓶装有微搅拌棒并装入二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(2mL)。将小瓶密封并设置为搅拌30分钟。移除微搅拌棒并在真空中除去挥发物。所得油状物与甲苯(2x4mL)、甲醇(1x4mL)和DCM(2x4mL)共蒸发以在小瓶中得到灰白色粉末/残留物。使用微搅拌棒在闪烁小瓶中将该残留物再溶解于甲醇(5mL)。添加三氟乙酸乙酯(2.00mL，16.9mmol)和TEA(0.410mL，3.54mmol)，密封小瓶并将混合物设置为搅拌过夜。20小时后，混合物的TLC显示起始物质已经完全消耗而新的产物已经形成。在真空中除去挥发物。将残留物与EtOAc(2x5mL)和甲苯(2x5mL)共蒸发以得到(1R，5R，7R，8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3，2，1]辛烷(0.30g，79.8％)直接用于下一步三苯甲基化步骤。粗物质的1H NMR分析表明形成了以约55∶45比率的非对映异构体的混合物(通过端基异构体信号的积分)。
(1R，5R，7R，8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-((4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-
3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷(27)
5′-O-DMTr-aCBBN(tfa)
在50mL圆底烧瓶中，将(1R，5R，7R，8S)-8-羟基-7-(胸苷-基)-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3，2，1]辛烷(0.28g，0.74mmol)与吡啶(2x10mL)共蒸发。烧瓶中装入无水吡啶(7mL)并立即向该溶液添加DMTr-Cl。密封烧瓶并将混合物在室温搅拌过夜。TLC显示所有起始物质被消耗(95％EtOAc/Hex或5％MeOH/DCM)。通过以下方式淬灭反应：添加甲醇(0.5mL)并持续搅拌30分钟，随后添加饱和NaHCO3水溶液(30mL)。使用EtOAc(3x20mL)萃取水相。合并有机相并使用盐水(1x20mL)清洗，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩以得到棕褐色泡沫状物。固体溶解于最小量的DCM并应用于50g Biotage硅胶SNAP柱，其之前使用60ml 25％TEA/己烷溶液处理并使用200mL 30％EtOAc/Hex平衡。使用10个柱体积的30-100％EtOAc/己烷梯度随后4个柱体积的100％EtOAc将产物从柱上洗脱。合并含有纯产物的级分并浓缩以得到作为白色泡沫状物的DMTr-(N-tfa)-氨基CBBN。1H和19F NMR两者指示两种不同的非对映异构体。1H NMR列表中的星号表示其中非对映异构体质子以约55∶45的比率解析的峰。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.72*(d，J＝1.0Hz，1H)，7.68*(d，J＝1.1Hz，1H)，7.49-7.38(m，4H)，7.35-7.20(m，14H)，6.93-6.78(m，8H)，5.73*(s，1H)，5.68*(s，1H)，4.55-4.36(m，3H)，4.05*(s，2H)，4.01*(s，2H)，3.94-3.84(m，1H)，3.79(q，J＝0.7Hz，13H)，3.64(t，J＝12.0Hz，1H)，3.57-3.38(m，4H)，3.38-3.15(m，4H)，2.70*(d，J＝3.6Hz，1H)，2.65*(t，J＝4.0Hz，1H)，1.47*(s，3H)，1.41*(s，3H)，1.28(bs，2H)。19F NMR(376MHz，cdcl3)δ-68.61，-68.90。
ESI MS：680(M)-
(1R，5R，7R，8S)-7-(胸苷-基)-5-((4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-3-(2，2，
2-三氟乙酰基)-6，8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-O-(2-氰基乙基)-N，N-二异丙基亚
磷酰胺(28)
5′-O-DMTr-aCBBN(tfa)亚酰胺(amidite)
在装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中称量5′-O-DMTr-aCBBN(tfa)(0.32g，0.47mmol)。向瓶中装入二氯甲烷(7mL)并设置为搅拌。在注射器中称量2-氰乙基N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.283g，0.94mmol)并立即添加到溶液，随后添加4，5-二氰基咪唑(55.44mg，0.47mmol)。立即将烧瓶用隔膜密封并搅拌过夜。在过程中，在20小时的TLC显示仅存在微量的起始物质，出现了两个三苯甲基阳性的新点，且使用5％甲醇/DCMw/UV显现后用Hanessian染色剂处理时似乎与起始核苷类似地炭化。通过添加饱和NaHCO3水溶液(50mL)淬灭反应。使用乙酸乙酯(4x20mL)萃取水相。合并有机相并使用饱和NaHCO3溶液(2x50mL)和盐水(1x20mL)萃取。有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到无色油状物。粗产物溶解于最小量的DCM并应用于50g Biotage硅胶SNAP柱，其之前使用60ml 25％TEA/己烷溶液处理并使用150mL 30％乙酸乙酯/己烷平衡。使用10个柱体积的30-100％的EtOAc/己烷梯度随后使用4个柱体积的100％EtOAc将产物从柱上洗脱。合并含有纯产物的级分并浓缩以得到作为白色泡沫状物的DMTr-(N-tfa)-氨基CBBN亚酰胺。正如预期的，31P和1H NMR指示存在四种不同产物，每种对应单独的立体异构体，其从环胺的tfa保护和亚磷酸化(phosphitylation)反应产生。
31P NMR (162MHz，CD3CN)δ150.03，149.97，147.46。相对强度1∶1∶2。19F NMR(376MHz，CD3CN)δ-69.30，-69.31，-69.47，-69.47。
ESI MS：904.8(M+Na+)+
实施例2：2’-C-桥接双环核苷的产生
本实施例描述了用于产生具有不同核碱基的2’-C-桥接双环核苷的的关键中间体的合成(参见图2A-2C)。
乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)
甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(图2A)
将N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(4.07ml，16.64mmol)添加到于无水乙腈(20ml)中的乙酸((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(3.10g，5.55mmol)和胸腺嘧啶(0.874g，6.93mmol)的混合物。将该反应混合物回流1小时以得到澄清溶液。将溶液冷却至40℃并添加TMS-OTf(1.303ml，7.21mmol)。将该混合物在60℃加热4小时。溶液冷却至室温，使用CH2Cl2(100mL)稀释，并使用饱和NaHCO3(2x100mL)和盐水(1x100mL)清洗。将有机层干燥(Na2SO4)，减压浓缩，残留物通过硅胶柱色谱在标准的Biotage Isolera梯度(0-10％v/v MeOH/CH2Cl2)上纯化以得到作为白色固体物质的乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(2.84g，4.54mmol，82％收率)。
ESI-MS：624(M)-
粗物质的NMR显示具有0.10∶1.00相对积分的主要和次要的端基异构体信号
端基异构体峰的1H NMR(300MHz，氯仿-d)δ6.54(d，J＝8.1Hz，次要)，6.04(d，J＝9.2Hz，主要)
乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-双(((甲基
磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(29)
将N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(1.09g，1.31ml，5.37mmol)添加到于无水乙腈(15ml)中的乙酸((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(1.00g，1.79mmol)和N6-苯甲酰基腺嘌呤(0.640g，2.68mmol)的混合物。将该反应混合物回流1小时以得到澄清溶液。将溶液冷却至40℃并添加TMS-OTf(0.60g，0.49ml，2.68mmol)。回流该混合物4小时。溶液冷却至室温，使用CH2Cl2(100mL)稀释，并使用饱和NaHCO3(2x100mL)和盐水(1x100mL)清洗。将有机层干燥(Na2SO4)，减压浓缩，残留物通过硅胶柱色谱在标准的Biotage Isolera梯度(0-10％v/v MeOH/CH2Cl2)上纯化以得到作为白色固体物质的乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(0.95g，1.28mmol，72％收率)。不存在任何相当量的可分离的核苷副产物。
苯甲酸{[1R，5R，7R，8S)-7-[(9R)-9a-苯甲酰基-9-腺嘌呤]-8-化-氯苄基氧基)-
3.6-二氧杂双环[3.2.1]辛-5-基}甲酯(30)
将乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(0.70g，mmol)称量入具有微搅拌棒的20mL玻璃闪烁小瓶。在小瓶中装入THF(5mL)和LiOH水溶液(0.47mL，1.0M)。随后允许混合物在室温搅拌2小时。TLC表明脱乙酰化已经发生，同时使N-苯甲酰基完整。用水(7mL)稀释反应并用乙酸乙酯(3x5mL)萃取。合并有机相，用盐水(1x5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，真空过滤并浓缩以得到作为粗品使用的白色泡沫状物。
将固体转移至10mL装有搅拌棒的锥形反应小瓶并溶于水性THF(5mL)。立刻将氢化钠添加至小瓶。隔膜密封小瓶并设置在55℃搅拌4小时。TLC表明反应完成。通过小心添加碳酸氢钠溶液至冷却的反应混合物(3mL)淬灭反应。该混合物进一步用水稀释至10mL并用乙酸乙酯(3x5mL)萃取。合并有机相，用盐水(1x5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，在真空过滤并浓缩以得到作为粗品使用的灰白色/棕褐色泡沫状物。
粗制固体转移至装有搅拌棒的20mL闪烁小瓶。将苯甲酸钠添加至小瓶，其随后装入DMF(5mL)。将小瓶密封并伴随持续搅拌在油浴中加热至110℃。30分钟后，混合物变为稠厚浆料。允许混合物连续搅拌过夜。TLC表明反应完成。冷却时，混合物成为稠厚凝胶，其用饱和的碳酸氢钠溶液(30mL)和乙酸乙酯(10mL)分配。用乙酸乙酯(2x 10mL)萃取水相。合并有机相，用盐水(1x5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，在真空过滤并浓缩以得到灰白色/棕褐色泡沫状物，其进一步经由硅胶柱色谱(EtOAc/己烷梯度30％-100％)纯化以得到苯甲酸{(1R，5R，7R，8S)-7-[(9R)-9a-苯甲酰基-9-腺嘌呤]-8-(4-氯苄基氧基)-3.6-二氧杂双环[3.2.1]辛-5-基}甲酯(0.48g，0.77mmol，80.5％)。
乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-异丁酰基鸟苷-基)-5，5-双(((甲基
磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(31)
将N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(1.09g，1.31ml，5.37mmol)添加至于无水乙腈(15ml)中的乙酸((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(1.00g，1.79mmol)和N2-异丁酰基鸟苷(0.59g，2.68mmol)混合物。将该反应混合物回流1小时。将溶液冷却至40℃并添加TMS-OTf(0.60g，0.49ml，2.68mmol)。将该混合物回流4小时。将溶液冷却到室温，用CH2Cl2(100mL)稀释，并用饱和NaHCO3(2x100mL)和盐水(1x100mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，减压浓缩，且残留物通过硅胶柱色谱在标准的Biotage Isolera梯度(0-10％v/v MeOH/CH2Cl2)上纯化以得到作为白色固体物质的β-9-N-鸟苷端基异构体(0.67g，0.93mmol，52％收率)和β-7-N鸟苷端基异构体(0.17g，0.23mmol，13.2％)。
粗糖基化的NMR分析显示75∶17∶8比率的1个主要和2个次要的端基异构体峰；分别与β-N9、β-N7和α-N9端基异构体相关。1H NMR的端基异构体峰(300MHz，氯仿-d)δ6.30(d，J＝7.7Hz)次要8％，6.14(d，J＝9.1Hz)次要17％，5.98(d，J＝8.8Hz)主要75％。
1-[(9S)-9-{(1R，7R，8S)-8-(4-氯苄基氧基)-5-[(甲基磺酰氧基)甲基]-3.6-二
氧杂双环[3.2.1]辛-7-基}-6-氧代-1，9-二氢嘌呤-2-基氨基]-2-甲基-1-丙酮(34)(34)
将25mg含有82∶18比率的化合物31∶32的粗糖基化产物称量入具有搅拌棒的4mL玻璃小瓶。小瓶装有THF(1mL)并添加60％NaH分散体(4.5mg)。将小瓶密封并伴随搅拌在油浴中加热至55℃且持续4小时。经由TLC监测反应(Rxn)直至反应完成。通过添加数滴水至粗反应混合物淬灭混合物。将混合物转至具有水(约7mL)和乙酸乙酯(约7mL)的闪烁小瓶中。进一步用乙酸乙酯(2x 5mL)萃取水相。合并有机层，用盐水(1x 5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，在真空过滤并浓缩以得到作为棕褐色泡沫状物的粗环化混合物(12mg)。将混合物溶于CDCl3并进行1H NMR，由于主要和次要的端基异构体峰两者均以82∶18比率变为单峰，1H NMR确证主要杂质为N7-端基异构体。还残留ibu-甲基峰，确证环化反应与(ibu)G-糖基化分子兼容。
实施例3：带有2’-C-桥接双环核苷酸的寡核苷酸的合成
一般合成方法
一旦合成经修饰的核苷且使用适当反应基团掩蔽游离的5’和3’羟基以成为核苷酸单体，可制备携带糖和碱基修饰的短链寡核苷酸。例如，可使用亚磷酰胺化学使用自动固相合成(参见McBride等人，Tetrahedron Letters 24：245-248(1983)和Sinha等人，Tetrahedron Letters 24：5843-5846(1983))。亚磷酰胺化学，连同相关方法诸如氢膦酸酯(hydrogen phosphonate)化学就它们在寡核苷酸化学中的用途已被广泛地综述(参见，例如Beaucage等人，Tetrahedron 48：2223-2311(1992))。在固相寡核苷酸合成期间，一系列核苷酸单体以预定的顺序通过其亚磷酰胺衍生物顺序附接，所述顺序取决于链延伸的方向，即生长的寡核苷酸链的5’-官能团或3’-官能团。
该寡核苷酸链锚定于不可溶部分，诸如可控孔玻璃或聚苯乙烯树脂珠粒。附接每个单体的方法一般包括以下的步骤1至5。步骤1涉及反应官能基的保护。常见的反应官能基为末端核苷的5’-羟基。该官能基通常使用4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)部分保护，其可通过酸处理移除。DMT部分的一个特征是其在酸去保护期间形成亮橙色DMT阳离子。该阳离子有效充当报告基团，其可在波长480和500nm之间监测，用于判断之前偶联步骤完成度的目的。大多数市售自动合成仪具有监测释放的DMT阳离子的能力。该数据给予操作员合成是否在任意给定步骤失败的即时提示。步骤2涉及通过添加亚磷酰胺衍生物和活化剂的偶联。该亚磷酰胺衍生物通常为核苷亚磷酰胺。然而，其也可为用不同有机部分衍生化的亚磷酰胺。步骤3涉及未反应的末端官能团的加帽。该步骤引入惰性保护基团，其阻止进一步偶联到失效序列。步骤4涉及新形成的磷核苷酸骨架连接从三价亚磷酸酯至稳定的五价状态的氧化。该氧化步骤可使用导致磷酸核苷酸的基于氧的氧化剂或者导致硫代磷酸核苷酸的硫化氧化剂进行。步骤5涉及清洗步骤后的方法重复。
以1μmol规模在MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统(Bioautomation，Plano，TX，USA)上合成与人miR-208a的核苷酸序列互补的截短的、16个核苷酸的序列。使用标准的脱三苯甲基化、活化剂和加帽溶液(其对于本领域技术人员是已知的)操作合成仪。寡核苷酸链的延长如下进行：对每个脱氧核苷酸亚酰胺(amidite)使用420秒的单一偶联，对于LNA亚磷酰胺使用共持续900秒的双重偶联，以及对新颖的核苷亚酰胺，诸如DMTr-aCBBN(tfa)亚酰胺使用共持续1800秒的三重偶联。在进行每个偶联循环后，使用0.025M碘溶液或0.2MPADS氧化溶液氧化，以分别产生磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接。未修饰的反-208aDNA序列掺入九个2’-脱氧胸苷残基，其选择性地使用胸苷LNA(lT)、胸苷氧代CBBN(bT)、胞苷氧代CBBN(bC)或胸苷氨基CBBN(abT)核苷酸替换。胸苷LNA亚酰胺购于商业来源并与报道的光谱数据匹配(参见，Singh，S.K.；Nielsen，P.；Koshkin，A.A.；Wengel，J.Chem.Commun.1998，455-6)。根据文献操作合成胸苷-2’-C，4’-C-桥接双环核苷(胸苷氧代CBBN，bT)和胞苷-2’-C，4’-C-桥接双环核苷(胞苷氧代CBBN，bC)并且所有光谱数据与报道值匹配(参见，美国专利第6,403,566号，Wang，G.，Girardet，J.，Gunic，E.Tetrahedron55，1999，7707-7724)。核苷酸的平衡由具有对应于天然反-208aRNA序列的碱基的2’-脱氧核苷酸或LNA核苷酸构成。硫代磷酸酯核苷酸间连接表示为碱基后的“s”(例如，abTs或dGs)，而碱基后没有字母表示磷酸二酯核苷酸间连接(例如，abT或dG)。
制备化合物M-11915：dC.dT.dT.dT.dT.dT.dGdC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
亚磷酰胺试剂(28)用于单修饰的氨基CBBN寡核苷酸的合成中。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适当偶联循环期间，添加作为0.1M于乙腈中的溶液的亚磷酰胺试剂。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过以下方式进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液：将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用本领域的技术人员已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐操作洗脱。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装至具有Waters Acuity SQ检测器的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用本领域的技术人员已知的标准方法进行产物的表征：计算值4845.2，实测值4844.0(M)-。
制备化合物M-11916：dC.dT.dT.dT.dT.abT.dG.dC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
亚磷酰胺试剂(28)用于双重修饰的氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适当偶联循环期间，添加作为0.1M于乙腈中的溶液的亚磷酰胺试剂。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过以下方式进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液：将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用本领域的技术人员已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐操作洗脱。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到具有Waters Acuity SQ检测器的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用本领域的技术人员已知的标准方法进行产物的表征：计算值4886.2，实测值4885.2(M)-。
制备化合物M-11917：dC.dT.dT.dT.abT.abT.dG.dC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
亚磷酰胺试剂(28)用于三重修饰的氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适当偶联循环期间，添加作为0.1M于乙腈中的溶液的亚磷酰胺试剂。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过以下方式进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液：将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用本领域的技术人员已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐操作洗脱。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到具有Waters Acuity SQ检测器的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用本领域的技术人员已知的标准方法进行产物的表征：计算值4927.3，实测值4926.1(M)-。
制备化合物M-11918：dC.dT.dT.dT.abT.abT.dG.dC.dT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
亚磷酰胺试剂(28)用于双重修饰的氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适当偶联循环期间，添加作为0.1M于乙腈中的溶液的亚磷酰胺试剂。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过以下方式进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液：将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVacC18筒上并使用本领域的技术人员已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐操作洗脱。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到具有Waters Acuity SQ检测器的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C182.5um柱，使用本领域的技术人员已知的标准方法进行产物的表征：计算值4886.2，实测值4885.0(M)-。
制备化合物M-11919：lCs.dTs.dTs.dTs.abTs.abTs.dGs.lCs.dTs.lCs.lGs.dTs.l
Cs.dTs.lTs.lA
亚磷酰胺试剂(28)用于嵌合DNA/LNA/氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂进行合成，将0.2M于1∶1嘧啶/CAN中的PADS更换为氧化溶液。在如前所述的适当偶联循环期间，添加作为0.1M于乙腈中的溶液的亚磷酰胺试剂。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过以下方式进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液：将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVac C18筒上并使用本领域的技术人员已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐操作洗脱。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到具有Waters Acuity SQ检测器的WatersAllianceMD HPLC的XBridge OST C18 2.5um柱，使用本领域的技术人员已知的标准方法进行产物的表征：计算值5379.3，实测值5378.3(M)-。
制备化合物M-11920：lCs.dTs.dTs.dTs.lTs.lTs.dGs.lCs.dTs.lCs.lGs.dTs.lCs
.dTs.abTs.lA
亚磷酰胺试剂(28)用于嵌合DNA/LNA/氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂进行合成，将0.2M于1∶1嘧啶/CAN中的PADS更换为氧化溶液。在如前在“截短核苷酸的一般合成方法”中所述的适当偶联循环期间，添加作为0.1M于乙腈中的溶液的亚磷酰胺试剂。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过以下方式进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液：将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVacC18筒上并使用本领域的技术人员已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐操作洗脱。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到具有WatersAcuity SQ检测器的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C18 2.5um柱，使用本领域的技术人员已知的标准方法进行产物的表征：计算值5366.3，实测值5365.3(M)-。
制备化合物M-10930：dC.dT.dT.dT.dT.dT.dG.dC.bT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA
胸苷基-2’-C，4’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺(参见，例如，美国专利第6,403,566号，Wang，G.，Girardet，J.，Gunic，E.Tetrahedron 55，1999，7707-7724)用于单修饰的氧代CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适当偶联循环期间，添加作为0.1M于乙腈中的溶液的所有亚磷酰胺试剂。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过以下方式进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液：将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVacC18筒上并使用本领域的技术人员已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐操作洗脱。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到具有Waters Acuity SQ检测器的Waters AllianceMD HPLC的XBridge OST C18 2.5um柱，使用本领域的技术人员已知的标准方法进行产物的表征：计算值4846.1，实测值4845.8(M)-。
制备化合物M-10924：bC.bT.bT.bT.bT.bT.dG.bC.bT.bC.dG.bT.bC.bT.bT.dA
胸苷-2’-C，4’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺和N-Bz-腺苷-2’-C，4’-C-桥接双环核苷亚磷酰胺(参见，例如，美国专利第6,403,566号，Wang，G.，Girardet，J.，Gunic，E.Tetrahedron 55，1999，7707-7724)用于单修饰的氧代CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用Bioautomation MerMade-12自动化寡核苷酸合成系统合成。根据制造商的推荐在DMT-ON模式采用商业合成试剂和0.025M碘溶液进行合成。在如前所述的适当偶联循环期间，所有亚磷酰胺试剂作为0.1M于乙腈中的溶液添加。通过使用浓氢氧化铵水溶液在55℃加热CPG结合的寡核苷酸17小时，完成所述寡核苷酸从支持物的切割。通过以下方式进一步纯化所得的寡核苷酸水溶液：将粗制DMT-ON寡核苷酸溶液装载在WatersVacC18筒上并使用本领域的技术人员已知的标准DMT-ON寡核苷酸脱盐操作洗脱。通过HPLC-MS质谱分析法，利用装到具有Waters Acuity SQ检测器的Waters AllianceMD HPLC的XBridgeOST C18 2.5um柱，使用本领域的技术人员已知的标准方法进行产物的表征：计算值5330.6，实测值5350.2(M)-。
实施例4：携带2’-C-桥接双环核苷酸的寡核苷酸的功能性表征
解链温度(Tm)的确定
当设计合成性寡核苷酸序列作为针对反义和微小RNA靶标的药物时，解链温度(Tm)是一个关键的参数。一般不存在特定的Tm阈值，高于或低于该Tm阈值决定活性。然而，人们认识到对于反义和微小RNA抑制剂寡核苷酸药物，Tm必须显著升高。此外，合成性寡核苷酸药物的核苷酸骨架(例如，硫代磷酸酯)的化学修饰时常用于赋予针对体内生物降解的稳定性。然而，大多数核苷酸磷酸酯骨架修饰时常导致与其靶标形成双链体的寡核苷酸药物的Tm的下降。因此，针对其靶标序列的合成性寡核苷酸药物的Tm相对于天然DNA或RNA、2’-OMe RNA，以及其它类似核苷酸单元的固有Tm的足够的增加是合成性寡核苷酸药物具有足够的特异性、靶标结合(engagement)，以及最终由靶标控制的细胞过程的下游调控所需要的。
确定了经修饰的16个核苷酸的磷酸二酯链的解链温度(Tm)，并与具有天然磷酸二酯DNA核苷酸的相同的16个核苷酸的序列的Tm比较。具体地，与具有相同核碱基的2’-脱氧核苷或氧代CBBN核苷相比，相对氨基CBBN解链温度(Tm)按照掺入基础通过确定氨基修饰的16个核苷酸长度的磷酸二酯链的解链温度和利用2’-脱氧核苷或氧代CBBN磷酸二酯DNA核苷酸的相同16个核苷酸的序列的解链温度之间的差别确定。仅当它们被放置于序列的相同位置时，比较取代的Tm差别。通过参考文献获得氨基-LNA及其氧代-LNA对应物的可比值(参见Singh，S.K.，Kumar，R.，Wengel J.J.Org.Chem.，Vol.63，No.26，1998)。
例如，经修饰的反-208a寡核苷酸退火到互补序列，长二十二个核苷酸，由RNA核苷和磷酸酯骨架构成。互补序列与内源性成熟miRNA相同。热变性温度(Tm)测量为解链曲线(A260对Temp)的一阶导数图的最大值。该双链体以1μM在0.9％NaCl缓冲液中构成。温度以1℃/min从25℃变化到95℃，并且每30秒读一次260nm的OD。Tm值为至少两次测量的平均值。
使用Varian Cary 1E UV-Vis分光光度计测量16个核苷酸(与成熟的人miR-208a核苷酸序列互补)的多种修饰的双链体解链温度。测试的反-miRNA208a寡核苷酸序列包括完全的DNA磷酸二酯(化合物M-10931)，四种具有1个、2个或3个氨基CBBN胸苷残基替代dT残基的DNA磷酸二酯寡核苷酸(化合物M-11915、M-11916、M-11917和M-11918)，混合的9LNA/7DNA硫代磷酸酯寡核苷酸(化合物M-10101)，以及2种混合的LNA/DNA/氨基CBBN硫代磷酸酯寡核苷酸，其中母体化合物(化合物M-10101)的LNA胸苷使用1个或2个氨基CBBN残基替代(化合物M-11919和M-11920)。双链体以1μM在0.9％NaCl中构成。温度以1℃/min从25℃变化到95℃，并且每30秒读一次260nm的OD。
具有氨基CBBN修饰的磷酸二酯寡核苷酸相比其完全DNA对应物，一致地具有针对互补序列的更高解链温度，以及因此更高的亲和力(参见表1)。相对于DNA，亲和力增强在5-9℃/修饰的等级上。这些亲和力的增加与LNA和氨基LNA的文献值一样好或更好。
表2符号的描述
| 脱氧A | dA | 氧代CBBNA | bA |
| 脱氧G | dG | 氧代CBBN G | bG |
| 脱氧C | dC | 氧代CBBN C | bC |
| 脱氧T | dT | 氧代CBBN T | bT |
| lna A | lA | 氨基CBBNA | abA |
| lnaG | lG | 氨基CBBN G | abG |
| lna C | lC | 氨基CBBN C | abC |
| lna T | lT | 氨基CBBNT | abT |
| 脱氧A P＝S | dAs | ||
| 脱氧G P＝S | dGs | ||
| 脱氧C P＝S | dCs | ||
| 脱氧T P＝S | dTs | ||
| lnaA P＝S | lAs | ||
| lnaG P＝S | lGs | ||
| lna CP＝S | lCs | ||
| lna TP＝S | lTs |
氨基LNA-T与其氧代-类似物LNA-T的比较，显示氨基LNA-T针对其补体没有LNA-T稳定。类似地，氨基ENA-T相对于其氧代-类似物似乎具有非常少的双链体稳定化效果。出人意料的是，氨基CBBN-T与其氧代CBBN-T类似物的比较显示氨基CBBN修饰比氧代CBBN-T显著地更稳定，达到2-4℃/修饰(参见表3和图3B)。不希望受到理论的束缚，推测LNA的2’-O(一种质子受体)当它在2’-位置被质子供体替换时，具有针对双链体水合和稳定性的更为稳定化的效果，正如在氨基LNA的情况下。相反，氨基CBBN比其氧代CBBN类似物似乎在双链体水合和稳定性上具有更多阳性效果，并提供在任意其它2’4’-碳-桥接双环核苷酸中都没有见到的Tm提高(参见图3A和3B)。
反-208a寡核苷酸的细胞培养活性
产生了稳定表达miR-208a的HeLa细胞系。具体地，将表达miR-208a的miRNA表达载体(Cell BioLabs，Inc.)转染到HeLa细胞中。随后使用嘌呤霉素选择筛选选择细胞，并分离通过qPCR测量的具有可检测miR-208a表达的克隆(Ct值＝约30)。
将细胞以10,000个细胞/孔铺到黑色壁的96孔板中。铺板后24小时后，使用含有在海肾(renilla)基因的3’UTR中的miR-208a结合位点和各种miR-208a抑制剂(化合物M-11919、M-11920和M-10101)的双重萤光素酶质粒转染细胞。化合物M-10591为非靶向对照。在37℃孵育细胞24小时，接着通过使用双重萤光素酶报告蛋白测试系统(Promega)的发光测量萤火虫(作为转染标准化)和海肾水平两者。数据相对于仅使用miR-208a双重萤光素酶质粒(psi check 208a)处理的细胞标准化。该psi check 2细胞使用不包括miR-208a结合位点的双重萤光素酶质粒处理。
结果证明，化合物M-11920具有与化合物M-10101可比的活性，化合物M-10101是一种优化的miR208a抑制剂，其仅包括LNA/DNA碱基(参见图4)。因此，使用氨基CBBN残基多重替代LNA残基导致miR208抑制活性的完全保留。化合物M-11919与其它两种抑制剂相比具有稍低的活性(参见图4)。化合物M-11919的活性与Tm数据相关，表明化合物M-11919与M-11920化合物相比具有对miR-208a RNA的较低的亲和力。
实施例5：2’-C-桥接双环核苷的产生
本实施例进一步描述了具有不同核碱基的2’-C-桥接双环核苷的产生中的合成反应和关键中间体(参见图5-7)，其中式1的“X”为N。
实施例5A：2’-C-桥接双环核苷(腺苷)
乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-双(((甲基
磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(29)
将N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(27.6ml，113mmol)添加至于二氯乙烷(100m1)中的乙酸((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(20.0g，37.7mmol)和N6-苯甲酰基腺嘌呤(11.2g，47.1mmol)的混合物中。将反应混合物回流1小时。将该溶液冷却至60℃并添加TMS-OTf(13.6ml，75.3mmol)。将混合物回流4小时。将该溶液冷却至室温，用CH2Cl2(500mL)稀释，并用饱和NaHCO3(2x200mL)和盐水(1x 100mL)洗涤。干燥有机层(Na2SO4)，在减压下浓缩，且残留物分两批在经由乙酸乙酯洗脱的340g Biotage SNAP硅胶柱上纯化。合并纯级分并在1L圆底烧瓶中浓缩以得到作为白色固体物质的乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(18.90g，25.6mmol，68％收率)。不存在相当量的可分离的核苷副产物。
二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-(N-苯甲酰基苯甲酰氨基)-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-
氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(36)
包含纯化的乙酸((3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(18.90g，25.6mmol)的烧瓶装有THF(400mL)和1.0M LiOH水溶液(113mL，1.0M)。允许混合物在室温搅拌2小时。TLC表明脱乙酰化已经发生，同时使N-苯甲酰基完整。用水(200mL)稀释反应并用乙酸乙酯(3x 300mL)萃取。合并有机相，用盐水(1x 200mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤至1000mL圆底烧瓶并真空浓缩以得到作为白色泡沫状物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(17.60g，25.3mmol)，其未经进一步纯化即使用。烧瓶配有搅拌棒和隔膜密封。烧瓶装有吡啶(200mL)并在室温伴随搅拌冷却至约5℃。伴随搅拌逐滴添加三甲基氯硅烷(7.0mL，55mmol)。将混合物从冷却浴中移除并允许回到室温。30分钟后，在室温逐滴添加苯甲酰氯(4.4mL，38mmol)并允许混合物搅拌过夜。添加水至反应混合物(20mL)并搅拌混合物30分钟。用DCM(600mL)稀释混合物并用盐水(3x 150mL)洗涤。经Na2SO4干燥有机相，过滤并浓缩至干燥。将一半的残留物应用至340g SNAP柱并经由使用40-100％EtOAc/己烷梯度的Biotage洗脱。重复该步骤用于另一半粗物质。合并包含级分的产物并浓缩以得到作为白色泡沫状物的纯的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-(N-苯甲酰基苯甲酰氨基)-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(16.21g，80.1％)。
二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)
氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃2，2-二基)双(亚甲基)酯(37)
将二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-(N-苯甲酰基苯甲酰氨基)-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(16.2g，20.3mmol)、亚氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(6.16g，25.3mmol)和三苯基膦(6.64g，25.3mmol)称量入具有搅拌棒的200mL圆底烧瓶。伴随搅拌，烧瓶装有200mL THF。经5分钟，经由注射器逐滴添加DIAD(5.0mL，25.3mmol)并允许混合物搅拌45分钟。粗制混合物的TLC分析(60/40EtOAc/己烷)显示反应已完成，生成新的核苷阳性点(经由Hannessians染色)。浓缩混合物至干并应用至340g Biotage SNAP柱并用40-100％EtOAc/己烷梯度经9个柱体积洗脱。合并包含级分的产物以得到白色泡沫状物，将其立即再次溶于THF(500mL)并用2.0M LiOH(50.6mL，5当量)处理4小时。TLC分析显示产物为主要产物。无明显的完全去苯甲酰化物质的点。未经进一步纯化即使用产物二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(15.8g，98.2％)。
(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-
(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(38)
将二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(5.0g，6.3mmol)称量入具有搅拌棒的1000mL圆底烧瓶。烧瓶装有THF(430mL)并允许搅拌溶液。将氢化钠(60％于油中的分散体)(1.0g，25mmol)添加至溶液，烧瓶配有与干燥管通气的回流冷凝器并将反应加热至60℃达1.5小时。在冰浴中无盖冷却反应混合物，并通过经15分钟逐滴添加10mL水淬灭。真空浓缩混合物并在乙酸乙酯(300mL)中重悬。用盐水(2x 100mL)洗涤有机相，经MgSO4干燥，过滤并浓缩成棕褐色泡沫状物。该泡沫状物通过柱色谱进一步纯化：应用至340g Biotage SNAP柱并用35-100％乙酸乙酯/己烷梯度经6个柱体积洗脱。合并纯级分并浓缩以得到作为白色泡沫状物的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(2.31g，52.5％)。
(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲酰基氧基)甲基)-8-
((4-氯苄基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(39)
将(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(1.70g，2.43mmol)和苯甲酸钠(1.75g，12.2mmol)称量入具有搅拌棒的250mL圆底烧瓶。烧瓶装有DMF(150mL)并设置成在100℃搅拌48小时。将反应混合物在真空浓缩至1/3体积，用饱和碳酸氢钠溶液(500mL)稀释并用乙酸乙酯(3x 100mL)萃取。合并有机相并用盐水(1x 100mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到作为白色泡沫状物的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲酰基氧基)甲基)-8-((4-氯苄基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(1.75g，99.25％)，其未经进一步纯化即使用。
(1R，5R，7R，8S)-7-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(羟基甲
基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(40)
将(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲酰基氧基)甲基)-8-((4-氯苄基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(6.85g，9.45mmol)称量入具有搅拌棒的250mL圆底烧瓶。烧瓶装有甲醇(50mL)并设置为在50℃搅拌。将甲醇钠(0.51g，9.4mmol)添加至溶液，允许其搅拌2小时。冷却反应混合物，浓缩至干并在DCM(250mL)中重悬。用盐水(2x 100mL)洗涤有机相，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干燥以得到作为白色泡沫状物的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.25g，87.0％)。
(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-羟基-5-(羟基甲基)-6-氧
杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(42)
将(1R，5R，7R，8S)-7-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.25g，8.22mmol)溶于乙醇(20mL)并转移至具有搅拌棒的100mL硼硅酸盐瓶。立即添加Pearlman催化剂(3g)至溶液。将未封盖的瓶置于300mL Parr高压釜(bomb)内，密封并装有氢气(60psi)。将设备在油浴中加热至70℃达17小时。在冰浴中冷却设备并缓慢释放压力。从Parr高压釜取出反应混合物并通过硅藻土垫过滤。用温热的乙醇(200mL)洗涤硅藻土和催化剂。在500mL圆底烧瓶中真空浓缩乙醇滤液以得到黑色泡沫状物，将其与DCM(3x 20mL)共蒸发以得到混有少量催化剂的粗制的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-羟基-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(41)。立即将搅拌棒添加至装有吡啶(50mL)并隔膜密封的烧瓶。将混合物设置为搅拌同时在冰浴中冷却至0℃。逐滴添加TMS-Cl(2.6mL，21mmol)至搅拌的溶液。将反应混合物从冰浴中移除并允许经30分钟温热至室温。逐滴添加苯甲酰氯()至反应混合物。允许反应在室温搅拌3小时。通过以下方式淬灭反应混合物：添加水(10mL)伴随搅拌5分钟，随后添加浓缩的氢氧化铵(20mL)伴随在室温搅拌15分钟。在真空浓缩混合物至干。将油状物溶于乙酸乙酯(200mL)随后用饱和碳酸氢钠溶液(2x 100mL)和盐水(2x100mL)洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。将残留物溶于THF(10mL)。伴随搅拌添加1.0M于THF中的TBAF(8.5mL，8.5mmol)。在用乙酸乙酯(100mL)稀释前搅拌反应30分钟。用10％柠檬酸钠溶液(2x 50mL)和盐水(1x 50mL)洗涤有机相。有机相经柠檬酸钠干燥，过滤并浓缩至干。将残留物应用至100g Biotage SNAP柱并用0-10％甲醇/DCM梯度经9个柱体积洗脱。合并纯级分并浓缩以得到作为白色泡沫状物的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-羟基-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(2.00g，49.0％)。
N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-
3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺
将(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-羟基-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(2.00g，4.03mmol)称量入具有搅拌棒的200mL圆底烧瓶。添加二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(10mL)。无盖搅拌混合物30分钟，随后浓缩至干。残留物与甲醇(2x 10mL)共蒸发。残留物再次溶解于甲醇(20mL)和三氟乙酸乙酯(9.6mL，20当量)。将三乙胺(4.50mL，8当量)添加至溶液并在室温封盖搅拌混合物过夜。将混合物浓缩至干，溶解于二氯甲烷(100mL)并用饱和碳酸氢钠溶液(2x 50mL)和盐水(1x20mL)洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到作为白色泡沫状物的N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(1.80g，90.8％)，其未经进一步纯化即使用。
N-(9-((1R，5R，7R，8S)-5-((4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-8-羟基-3-(2，
2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺
[DMTr-aA(Bz)(tfa)](43)
将N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(1.80g，3.65mmol)称量入具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶。烧瓶装有吡啶(30mL)并设置成搅拌。立即将4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(1.49g，4.39mmol)添加至溶液。隔膜密封烧瓶并允许混合物搅拌17小时。将甲醇(2mL)添加至反应混合物，将其再搅拌30分钟。将饱和碳酸氢钠溶液(4mL)添加至反应混合物，其随后蒸发至干。残留物悬浮于DCM中，过滤并应用至TEA预处理的100g Biotage SNAP柱。用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度经6个柱体积洗脱产物。合并包含产物的级分以得到作为白色泡沫状物的N-(9-((1R，5R，7R，8S)-5-((4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-8-羟基-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(1.50g，51.6％)。
DMTr-aA(Bz)(tfa)亚酰胺(44)
将DMTr-aA(Bz)(tfa)(1.50g，1.89mmol)称量入具有搅拌棒并隔膜密封的100mL圆底烧瓶。烧瓶装有DCM(30mL)和2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(1.14g，3.78mmol)。立即添加4，5-二氰基咪唑(0.22g，1.9mmol)，并允许反应混合物搅拌过夜。用DCM(40mL)稀释反应混合物，用饱和碳酸氢钠溶液(2x 50mL)和盐水(1x 50mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物应用至TEA处理的100g Biotage SNAP柱并用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度经6个柱体积洗脱。合并包含产物的级分以得到作为白色泡沫状物的DMTr-aA(Bz)(tfa)亚酰胺(1.64g，87.3％)。
实施例5B：2’-C-桥接双环核苷(鸟苷)
乙酸((2R，3R，4S)-2-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-
双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(45)
将乙酸((2S，3R，4S)-4-((4-氯苄基)氧基)-2-甲氧基-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(15.00g，28.25mmol)称量入具有搅拌棒的500mL圆底烧瓶。烧瓶装有乙酸酐(10.68ml，113mmol)和乙酸(60mL)。在60℃搅拌混合物直至全部固体成为溶液。逐滴添加浓硫酸(75uL，0.05当量)并允许混合物在60℃再搅拌5分钟。从加热移除反应混合物并允许伴随搅拌过夜回至室温。用乙酸乙酯(300mL)稀释反应混合物，转移至分液漏斗并用盐水(3x 200mL)洗涤。用饱和碳酸氢盐洗涤(2x 200mL)和最终的盐水洗涤(100mL)小心中和有机相。经硫酸钠干燥有机相，过滤至500mL圆底烧瓶并浓缩以得到清澈、浅黄棕色油状物，其作为直接使用的粗品。
将2-氨基-6-氯嘌呤(6.23g，36.7mmol)和搅拌棒添加至获得的油状物中，且烧瓶配有与干燥管通风的回流冷凝器。烧瓶装有N，O-双三甲基甲硅烷基乙酰胺(19.34mL，79.1mmol)和乙腈。当混合物变为均匀溶液时，将混合物在油浴中回流搅拌45分钟。反应混合物短暂地从油浴移除并在逐滴添加三氟甲磺酸(三甲基甲硅烷基)酯(10.23mL，56.5mmol)前允许稍微冷却。添加完成后，将反应混合物返回回流1.5小时。过程中经由TLC(60％EtOAc/Hex，UV&Hannessian染色显现，Rf 0.5)的监测显示主要UV产物的出现并起始糖的完全消耗。
将反应混合物冷却至室温并用乙酸乙酯(500mL)稀释。用饱和碳酸氢钠(2x200mL)和盐水(1x 100mL)洗涤有机相。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。对半分开粗产物且每部分置于硅胶色谱(Biotage Isolera，340g SNAP柱)。合并全部纯级分以得到作为白色泡沫状物的N9，β糖苷，乙酸((2R，3R，4S)-2-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(9.80g，51％)。
二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-
4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(46)
将乙酸((2R，3R，4S)-2-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((4-氯苄基)氧基)-5，5-双(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)甲酯(9.80g，14.6mmol)称量入具有搅拌棒的500mL圆底烧瓶。烧瓶装有THF(100mL)和1.0M LiOH水溶液(44mL，3当量)。允许将混合物搅拌6小时。用乙酸乙酯(500mL)稀释混合物并用盐水(2x 100mL)洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到作为白色泡沫状物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(9.184g，99％)，其未经进一步纯化即使用。
二甲磺酸((3R，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((N-(叔丁氧基羰
基)-2，2，2-三氟乙基氨基甲酰基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚
甲基)酯亚氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(图6)
将二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯苄基)氧基)-4-(羟基甲基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(9.09g，14.51mmol)、三苯基膦(5.709g，21.8mmol)和亚氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(5.29g，21.8mmol)添加至具有搅拌棒的500mL圆底烧瓶。烧瓶装有THF，隔膜密封并设置成在20℃水浴中搅拌。经3分钟将二异丙基偶氮二酰亚胺(diisopropylazodiimide)(4.29mL，21.8mmol)逐滴添加至搅拌混合物。允许反应混合物搅拌1.5小时。将反应混合物浓缩至固体。立即将产物应用至340g Biotage SNAP柱并用20-100％乙酸乙酯/己烷梯度经9个柱体积洗脱。合并纯级分并浓缩以得到作为白色泡沫状物的产物(11.75g，95.1％)。
二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨
基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(图6)
将二甲磺酸((3R，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((N-(叔丁氧基羰基)-2，2，2-三氟乙基氨基甲酰基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯亚氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(11.7g，12.7mmol)称量入具有搅拌棒的500mL圆底烧瓶。烧瓶装有THF(100mL)和1.0M LiOH水溶液(42mL，3当量)。封盖混合物并在室温搅拌1.5小时。用乙酸乙酯(500mL)稀释反应并用盐水(2x 100mL)洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。所得的泡沫状物与ACN(2x 100mL)共蒸发并在高真空下使质量恒定以得到作为白色泡沫状物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(9.75g，97％)。
二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧
基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(47)
将二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(9.75g，13.4mmol)称量入具有搅拌棒的500mL圆底烧瓶。烧瓶装有ACN(150mL)和苄醇，隔膜密封，随后在盐-冰浴中伴随搅拌冷却。经20分钟添加400mg份的叔丁醇钾(2.38g，20.2mmol)。添加最后一份后，允许继续搅拌反应2小时同时维持盐-冰浴温度。
反应混合物的TLC(95：5 DCM：MeOH，UV/Hanessians染色显现)显示反应完成。用水(400mL)稀释反应混合物并用乙酸乙酯(3x 250mL)萃取。合并有机相并用盐水洗涤(1x100mL)，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。将所得的油状物应用至TEA预处理的BiotageSNAP柱(340g)并用20-100％EtOAc/己烷梯度经6个柱体积洗脱。合并纯级分，特别注意去除苄醇并浓缩以得到作为白色泡沫状物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(8.50g，79.3％)。
(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧
基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(48)
将二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(8.50g，10.7mmol)称量入具有搅拌棒的2L圆底烧瓶。烧瓶装有THF(850mL)和氢化钠(4.26g，107mmol)，配有具有干燥管通风口的回流冷凝器并设置在60℃搅拌4小时。将反应混合物冷却至0℃并通过逐滴添加10mL水淬灭。将反应混合物真空浓缩至干并在乙酸乙酯(300mL)中重新溶解。用水(2x 100mL)和盐水(1x100mL)洗涤有机相，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。将残留物应用至340g Biotage SNAP柱并用30-100％乙酸乙酯梯度经9个柱体积洗脱。分开合并包含产物的级分，即(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.70g，62.9％)和起始物质二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯苄基)氧基)四氢呋喃-2，2-二基)双(亚甲基)酯(2.32g，27.3％)，并浓缩至白色泡沫状物。
(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲酰基氧基)
甲基)-8-((4-氯苄基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(49)
将(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯苄基)氧基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.70g，6.70mmol)和苯甲酸钠(7.80g，54.1mmol)称量入具有搅拌棒的2L圆底烧瓶。烧瓶装有DMF(500mL)并隔膜密封。伴随剧烈搅拌将混合物加热至100℃过夜。在50℃真空下浓缩反应混合物至大约100mL。将混合物用饱和碳酸氢钠稀释至500mL。用乙酸乙酯(3x 200mL)萃取水相。合并有机相并用盐水(1x 100mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到作为白色泡沫状物的粗制的(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲酰基氧基)甲基)-8-((4-氯苄基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.56g，93.6％)，其未经进一步纯化即使用。
(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-8-羟基-5-(羟基
甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(50)
将(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(苄基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲酰基氧基)甲基)-8-((4-氯苄基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(2.40g，3.30mmol)称量入具有搅拌棒的250mL圆底烧瓶。烧瓶装有乙醇(15mL)。将甲醇钠(0.19g，3.30mmol)添加至混合物，隔膜密封烧瓶并温热至50℃达2小时。通过添加乙酸(0.19mL，3.30mmol)中和溶液。将混合物和搅拌棒转移至100mL硼硅酸盐瓶，将其置于300mL Parr高压釜。将Pearlman催化剂(1.50g)添加至混合物并密封设备，且装有氢气(60psi)。将高压釜设备在设置以500rpm搅拌的磁力搅拌台上加热至70℃达17小时。
将设备冷却至0℃并在拆卸高压釜设备前释放压力。通过硅藻土垫过滤溶液以去除大部分催化剂。用额外的200mL温热乙醇洗涤硅藻土。将过滤物浓缩至干并与二氯甲烷(3x 25mL)共蒸发以得到作为白色泡沫状物的(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-8-羟基-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(1.12g，83.1％)，其未经进一步纯化即使用。
N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-
3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(51)
将(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-8-羟基-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.45g，1.1mmol)称量入具有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶并隔膜密封。烧瓶装有吡啶(10mL)并在冰浴中冷却至0℃。将TMS-Cl(0.42mL，3.3mmol)逐滴添加至混合物并允许反应搅拌30分钟。逐滴添加丁酰氯(0.13mL，1.2mmol)至搅拌的混合物，允许混合物经3小时回至室温。启封反应混合物，用水(2mL)淬灭并允许搅拌30分钟。淬灭的反应用乙酸乙酯(100mL)稀释并用饱和碳酸氢钠溶液(2x 50mL)和盐水(1x 50mL)萃取。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到粗制泡沫状物，伴随搅拌将该泡沫状物立即用0.5M于THF中的TBAF(2.4mL，1.1当量)处理达30分钟。用二氯甲烷(40mL)稀释混合物并用10％水溶性柠檬酸钠(2x 20mL)洗涤。用盐水(1x 10mL)洗涤有机相，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至黄棕色粉末，伴随搅拌将所述粉末立即置于10mL的1∶1TFA∶DCM达45分钟。蒸发混合物至干并与乙醇(2x 10mL)共蒸发。将所得的固体再次溶于乙醇(10mL)和三氟乙酸乙酯(2.5mL，21.55mmol)。将三乙胺添加至搅拌的混合物(2.2mL，15.67mmol)，允许混合物在室温搅拌过夜。真空浓缩反应混合物并用二氯甲烷(30mL)和饱和碳酸氢钠溶液(20mL)分配。碳酸氢盐溶液进一步用DCM(2x 10mL)萃取。合并有机相，用盐水(1x 20mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到作为棕褐色泡沫的N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(0.38g，73％)，其未经进一步纯化即使用。
DMTr-aG(ibu)(tfa)(52)
将N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-6-氧代-6，9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(0.38g，0.80mmol)称量入具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶并隔膜密封。烧瓶装有吡啶(10mL)并立即添加4，4′-二-甲氧基三苯甲基氯(.326g，0.96mmol)。封盖烧瓶并允许在室温搅拌过夜。通过添加甲醇(0.5mL)淬灭反应。将饱和碳酸氢钠溶液(4mL)添加至反应混合物，随后将混合物蒸发至干。将残留物悬浮于DCM中，过滤并应用至TEA预处理的50g Biotage SNAP柱。用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度经6个柱体积洗脱产物。合并包含产物的级分以得到作为白色泡沫状物的DMTr-aG(ibu)(tfa)(0.41g，65.9％)。
DMTr-aG(ibu)(tfa)亚酰胺(53)
将DMTr-aG(ibu)(tfa)(0.40g，0.53mmol)称量入具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶并隔膜密封。烧瓶装有DCM(10mL)和2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.32g，1.06mmol)。立即添加4，5-二氰基咪唑(62.4mg，0.53mmol)，并允许反应混合物搅拌过夜。用DCM(40mL)稀释反应混合物，用饱和碳酸氢钠溶液(2x 50mL)和盐水(1x 50mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物应用至TEA处理的100g Biotage SNAP柱并用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度经9个柱体积洗脱。合并包含产物的级分以得到作为白色泡沫状物的DMTr-aG(ibu)(tfa)亚酰胺(0.39g，76％)。
实施例5C：2’-C-桥接双环核苷(胞嘧啶)
(1R，5R，7R，8S)-7-(4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-5-(羟基甲基)-8-
((三甲基甲硅烷基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(55)
将(1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-7-(5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯，54，(0.80g，2.1mmol)称量入具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶并隔膜密封。烧瓶装有ACN(10mL)和TEA(1.16mL，8.35mmol)，随后冷却至0℃。经5分钟伴随搅拌逐滴添加TMS-Cl(0.583mL，4.60mmol)。返回室温的同时允许混合物搅拌达30分钟。
在另一具有搅拌棒的250mL圆底烧瓶中添加1，2，4-1H-三唑(1.441g，20.9mmol)并隔膜密封。用氩气冲洗烧瓶并在冰浴中冷却至0℃。烧瓶装有ACN(20mL)和TEA(2.90mL，20.9mmol)，随后设置为搅拌。经5分钟伴随剧烈搅拌逐滴添加PO1l3。将甲硅烷基化的核苷溶液吸收于注射器中并经数分钟逐滴添加至冷却的POCl3/三唑溶液。从冰浴移除反应并允许经2小时回到室温。用乙酸乙酯(200mL)稀释反应混合物并用饱和碳酸氢钠(2x 100mL)和盐水(1x 50mL)小心洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤并在具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中浓缩至黄色泡沫状物。烧瓶密封并装有ACN(15mL)和饱和氨溶液(15mL)。启封前在室温搅拌混合物17小时。浓缩混合物至干，再次溶解于DCM(50mL)并用饱和碳酸氢钠(2x 10mL)和盐水(1x 10mL)洗涤有机相。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干以得到作为黄褐色泡沫状物的粗制(1R，5R，7R，8S)-7-(4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-5-(羟基甲基)-8-((三甲基甲硅烷基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.63g，66.4％)。
(1R，5R，7R，8S)-7-(4-苯甲酰氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-8-羟基-5-
(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(56)
将(1R，5R，7R，8S)-7-(4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-5-(羟基甲基)-8-((三甲基甲硅烷基)氧基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.60g，1.3mmol)称量入具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶并隔膜密封。烧瓶装有吡啶(25mL)并将混合物设置为搅拌同时在冰浴中冷却至0℃。逐滴添加TMS-Cl(0.25mL，2.0mmol)至搅拌的溶液。将反应混合物从冰浴移除并允许经30分钟温热至室温。将苯甲酰氯(0.17mL，1.4mmol)逐滴添加至反应混合物。在室温允许搅拌反应3小时。通过添加水(6mL)伴随搅拌5分钟淬灭反应混合物，随后添加浓氢氧化铵(10mL)，同时在室温再搅拌15分钟。真空浓缩混合物至干。将油状物溶于乙酸乙酯(200mL)，随后用饱和碳酸氢钠溶液(2x 100mL)和盐水(2x 100mL)洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干燥。将残留物溶于THF(5mL)。伴随搅拌添加1.0M于THF中的TBAF(2.5mL，2.5mmol)。在用DCM(50mL)稀释前搅拌反应30分钟。用10％柠檬酸钠溶液(2x 10mL)和盐水(1x 10mL)洗涤有机相。有机相经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。将残留物应用至25g Biotage SNAP柱并用0-10％甲醇/DCM梯度经9个柱体积洗脱。合并纯级分并浓缩以得到作为白色泡沫状物的(1R，5R，7R，8S)-7-(4-苯甲酰氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-8-羟基-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.49g，76.3％)。
N-(1-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-
3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基)苯甲酰胺(图7)
将(1R，5R，7R，8S)-7-(4-苯甲酰氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-8-羟基-5-(羟基甲基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.49g，1.0mmol)称量入具有搅拌棒的50mL圆底烧瓶。伴随搅拌，烧瓶装有DCM(5mL)和三氟乙酸。30分钟后，真空浓缩溶液至干。残留物与乙醇(2x 10mL)共蒸发。将所得的物质再次溶于乙醇(10mL)、三氟乙酸乙酯(2.4mL，20mmol)和三甲胺(1.4mL，10mmol)。在室温搅拌混合物过夜。蒸发混合物至干并直接应用至25g Biotage SNAP柱并用0-10％甲醇/DCM梯度经9个柱体积洗脱。合并纯级分并浓缩以得到作为白色泡沫作为的N-(1-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)苯甲酰胺(0.35g，72％)。
N-(1-((1R，5R，7R，8S)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-8-羟基-3-
(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氢
吡啶-4-基)苯甲酰胺(57)
将来自之前步骤的N-(1-((1R，5R，7R，8S)-8-羟基-5-(羟基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)苯甲酰胺(0.35g，0.73mmol)称量入具有搅拌棒的50mL圆底烧瓶并隔膜密封。烧瓶装有吡啶(10mL)并立即添加4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.295g，0.87mmol)。封盖烧瓶并允许在室温搅拌过夜。反应通过添加甲醇(0.5mL)淬灭。将饱和碳酸氢钠溶液(4mL)添加至反应混合物，随后将该混合物蒸发至干。将残留物悬浮于DCM中，过滤并应用至TEA预处理的50g BiotageSNAP柱。用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度经6个柱体积洗脱产物。合并包含产物的级分以得到作为白色泡沫状物的N-(1-((1R，5R，7R，8S)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-8-羟基-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)苯甲酰胺[DMTr-aC(Bz)(tfa)](0.35g，61.5％)。
DMTr-aC(Bz)(tfa)亚酰胺(58)
将DMTr-aC(Bz)(tfa)(0.35g，0.45mmol)称量入具有搅拌棒的100mL圆底烧瓶并隔膜密封。烧瓶装有DCM(7mL)和2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.27g，0.89mmol)。立即添加4，5-二氰基咪唑(53mg，0.45mmol)，并允许反应混合物搅拌过夜。用DCM(40mL)稀释反应混合物，用饱和碳酸氢钠溶液(2x 20mL)和盐水(1x 10mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物应用至TEA处理的25g Biotage SNAP柱并30-100％乙酸乙酯/己烷梯度经9个柱体积洗脱。合并包含产物的级分以得到作为白色泡沫状物的DMTr-aC(Bz)(tfa)亚酰胺(0.38g，86％)。
Claims (25)
1.一种用于产生2’C-桥接双环核苷或核苷酸的β-端基异构体的方法，其包括步骤：
a)糖基化核碱基，其中糖基供体在2’位置包含经保护的烷基羟基或烷基胺；和
b)环化糖基的2’和4’位置。
2.权利要求1的方法，其进一步包括纯化或回收所述2’C-桥接双环核苷或核苷酸的β-端基异构体的步骤。
3.权利要求1的方法，其中所述2’C-桥接双环核苷或核苷酸具有式I的结构，或其亚磷酰胺：
其中
X选自N、S或O；
W1和W2分别独立地选自H、醇保护基、包含图示的O的磷酸酯、包含图示的O的硫代磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或亚磷酰胺；
W3独立地选自空、H、O、胺保护基、亚磷酰胺、当X为N时为包含N的氨基磷酸酯、当X为N时为包含N的二氨基磷酸酯、甲基、烷基、环烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸、其他分子缀合物、–C1(O)R或–COOR，其中R为芳基；直链、支链或环状烷基或烯基；糖、脂肪酸或其他分子缀合物诸如药物缀合物；且
B为核碱基。
4.权利要求3的方法，其中X为N。
5.权利要求3的方法，其中X为S。
6.权利要求3的方法，其中X为O。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述核碱基为嘌呤。
8.权利要求7的方法，其中所述核碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤或其衍生物。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述核碱基为嘧啶。
10.权利要求9的方法，其中所述核碱基为胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶，或其衍生物。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述核碱基为全甲硅烷基化的。
12.权利要求3-11中任一项的方法，其中所述醇保护基选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、酯、甲硅烷基或酸不稳定性醚。
13.权利要求3-11中任一项的方法，其中所述胺保护基选自苄氧羰基(Cbz)、对甲氧基苄基羰基(Moz或MeOZ)、叔丁氧基羰基(BOC)、9-芴基甲基氧基羰基(FMOC)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)或三氟乙酰基(tfa)。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述糖基供体在2’位置包含乙酰基保护的甲基羟基，且所述环化步骤包括用胺、掩蔽的胺或经保护的胺取代羟基并环化2’和4’位置。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述糖基供体在2’位置包含经保护的或掩蔽的甲胺，且所述环化步骤包括直接环化2’经保护的或掩蔽的甲胺和4’位置。
16.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述糖基供体在2’位置包含经保护的或掩蔽的甲基羟基，且所述环化步骤包括用巯基、掩蔽的巯基或经保护的巯基取代羟基并环化2’和4’位置。
17.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述糖基供体在2’位置包含经乙酰基保护的甲基羟基，且所述环化步骤包括羟基的脱乙酰化和环化2’和4’位置。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述糖基供体在3’位置包含醇保护基。
19.权利要求18的方法，其中所述醇保护基为醚。
20.权利要求18的方法，其中所述醇保护基为热和酸稳定的。
21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述醇保护基选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、乙酰基、甲硅烷基、苄基、经取代的苄基或不稳定性醚。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述糖基供体为可被取代的戊糖。
23.权利要求22的方法，其中所述糖基供体源自核糖、阿拉伯糖或葡萄糖。
24.权利要求1-23中任一项的方法，所述糖基化步骤产生大于50％的β-端基异构体产量。
25.权利要求24的方法，其中所述糖基化步骤产生大于7:3、大于8:2或大于9:1的β:α端基异构体比率。
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