CN110621700B - 用于GalNAc寡核苷酸缀合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包含用于制备有治疗价值的GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物的方法。该方法包含使寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐与GalNAc聚簇化合物或其盐偶联且随后纯化。

Description

用于GalNAc寡核苷酸缀合物的方法
本发明涉及用于制备GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物的新方法。
近来的考量集中于寡核苷酸与非核苷酸部分缀合，所述非核苷酸部分还可以添加另外的官能团到寡核苷酸上，例如，其能够使治疗性寡核苷酸靶向至体内特定器官和组织。为了靶向至肝细胞，已经发现能够结合去唾液酸糖蛋白受体的三价GalNAc缀合部分能够广泛降低剂量，同时递送有效的治疗作用。这类GalNAc聚簇反义缀合物例如描述在PCT公开号WO 2012/083046或美国专利申请公开号US 2011/0207799中。
尽管这些出版物公开了用于制备GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物的方法，但是发现，这些方法无法满足工业规模合成的标准。
因此，本发明的目的在于提供用于制备GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物的改进方法，其满足工业化规模方法的要求。
用于制备GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物的方法包含下列步骤：
a)生产结合至固相支持物的寡核苷酸或其脂族胺盐；
b)从支持物上裂解寡核苷酸并且在氨存在下除去保护基，由此得到未保护的寡核苷酸的铵盐；
c)将寡核苷酸铵盐进行盐交换改变成寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐，由此除去任意游离氨或残留脂族胺；
d)使寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐与GalNAc聚簇化合物或其盐偶联，且最终
e)纯化GalNAc-聚簇寡核苷酸缀合物。
举出下列定义以便示例和定义用于描述本文的本发明的各种术语的含义和范围。
无论在何种情况下手性碳存在于化学结构中，都预期与该手性碳相关的所有立体异构体均由该结构涵盖，为纯的立体异构体及其混合物。
术语“烷基”是指1至12个碳原子的单价直链或支链饱和烃基，在具体的实施方案中，烷基具有1至7个碳原子，并且在更具体的实施方案中为1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
术语“C1-12烷基”是指1至12个碳原子的单价直链或支链饱和烃基，并且在更具体的实施方案中为1至7个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，以及戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基及其异构体。
术语“脂族胺”表示单-、二-或三-C1-4-烷基胺，其中C1-4-烷基如上述所定义或为脂环族胺。单-、二-或三-C1-4-烷基胺的具体实例为乙胺、二乙胺或三乙胺。脂环族胺的具体实例为5元脂环族胺，例如吡咯烷，或6元脂环族胺，例如哌啶或吗啉。
术语“氨基保护基团”是旨在保护氨基的基团，且包括苯甲酰基、苄氧基羰基、苄氧羰基(CBZ或Z)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、叔丁氧基羰基(BOC)和三氟乙酰基。这些基团的其它实例可以在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第2版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，1991，第7章；E.Haslam，“Protective Groups in Organic Chemistry”，J.G.W.McOmie，Ed.，Plenum Press，New York，NY，1973，第5章，和T.W.Greene，“Protective Groups inOrganic Synthesis”，John Wiley和Sons，New York，NY，1981中找到。
术语“羟基保护基团”和术语“酯保护基团”是指旨在保护羟基的基团，包括形成酯和醚的基团，特别是四氢吡喃基、酰基、氨基甲酰基、苄基和甲硅烷基醚(例如TBS、TBDPS)基团。这些基团的其它实例在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in OrganicSynthesis”，2nd ed.，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，1991，第2-3章；E.Haslam，“Protective Groups in Organic Chemistry”，J.G.W.McOmie，Ed.，Plenum Press，NewYork，NY，1973，第5章，和T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，JohnWiley和Sons，New York，NY，1981中找到。优选酰基，特别是C1-12-烷基羰基，更具体地为C1-6-烷基羰基，其任选地被C1-6-烷基或苯基取代。更优选的羟基保护基可以选自乙酰基、新戊酰基或苯甲酰基，由此乙酰基为最优选的羟基保护基。
术语“碱”涵盖碱金属锂、钠和钾，特别是钠和钾，优选钠。
术语“碱土”涵盖碱土金属钙和镁，但特别是钙。
术语修饰的5’氨基与术语5’氨基-修饰的寡核苷酸结合使用，且确定反应性氨基共价结合至连接基，作为氨基接头，其连接在寡核苷酸的5’末端基团上。连接基优选为2-12个碳原子的脂族烷基或包含1-10个乙二醇单元的乙二醇连接基。
因此，优选的5’氨基-修饰剂选自任选氨基被保护的氨基C2-12-烷基连接基或包含1-10个乙二醇单元的氨基乙二醇连接基。
5’氨基修饰的寡核苷酸的适合的氨基保护基为三氟乙酰基(TFA)或单甲氧基三苯甲基(MMT)。
通常，氨基接头通过商购的氨基接头亚磷酰胺被引入，例如，通过TFA-或MMT-C6-连接基亚磷酰胺，例如其来自Sigma Aldrich；或通过5’氨基修饰剂TEG(三甘醇)CE亚磷酰胺，其来自Glen Research。
如本文所用，将术语寡核苷酸定义为本领域技术人员通常所理解为的包含两个或多个共价连接的核苷酸的分子。为了用作治疗上有价值的寡核苷酸，将寡核苷酸典型地合成为7-30个核苷酸长度。
寡核苷酸由任选修饰的DNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成。
LNA核苷单体为修饰的核苷，其包含核苷酸的核糖环的C2’与C4'之间的连接基(称作双基或桥)。这些核苷在文献中也称作桥接核酸或双环核酸(BNA)。
如本文所用，任选修饰的是指与等效的DNA、RNA或LNA核苷相比通过引入糖部分或核碱基部分的一种或多种修饰被修饰的核苷。在一个优选的实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分，并且可以例如包含一个或多个2’取代的核苷和/或一个或多个LNA核苷。术语修饰的核苷在本文中还可以与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。
DNA、RNA或LNA核苷通常通过磷酸二酯(P＝O)和/或硫代磷酸(P＝S)核苷间键连接，该键使两个核苷彼此共价偶联。
因此，在一些寡核苷酸中，全部核苷间键可以由磷酸二酯(P＝O)组成，在另外的寡核苷酸中，全部核苷间键可以由硫代磷酸(P＝S)组成；或仍然在另外的寡核苷酸中，核苷间键的序列可变，且包含磷酸二酯(P＝O)和硫代磷酸(P＝S)核苷间键。
核碱基部分可以用每个相应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可以任选地包括具有等效功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，用大写字母A、T、G描述核碱基部分，且用MeC(5-甲基胞嘧啶)描述LNA核苷，且用小写字母a、t、g、c和Mec描述DNA核苷。修饰的核碱基包括、但不限于携带保护基的核碱基，例如叔丁基苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或二甲基甲脒基(参见Wikipedia，Phosphoramidit-Synthese，https：//de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Syntheseof March 24，2016)。
优选地，寡核苷酸由任选修饰的DNA或LNA核苷单体或其组合组成，且为10-25个核苷酸长度。
步骤a)：
步骤a)要求用固相支持物生产寡核苷酸或其脂族胺盐。
寡核苷酸合成的原理为本领域众所周知的并且充分描述在文献中，且为公众所知，如Wikipedia(参见，例如Oligonucleotide synthesis；Wikipedia，the freeencyclopedia；https：//en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis，of March15，2016)。
目前较大规模的寡核苷酸合成采用计算机控制的合成仪自动地进行。
通常，寡核苷酸合成为固相合成，其中组装的寡核苷酸通过其3′-末端羟基共价结合至固体支持物材料，并且在整个链组装期间保持与之结合。适合的支持物为商购的大孔聚苯乙烯支持物，如来自GE Healthcare的Primer支持物5G或来自Kinovate的HL支持物。
寡核苷酸合成主要为逐步添加核苷酸残基至生长链的5′-末端，直至组装期望的序列。
通常，每次添加称作合成循环且主要由化学反应组成
a1)使固体支持物上的被保护的羟基解锁；
a2)使作为活化的亚磷酰胺的第一核苷与游离羟基在固体支持物上偶联；
a3)氧化或硫化相应的P-连接的核苷，形成相应的磷酸三酯(P＝O)或相应的硫代磷酸(P＝S)；
a4)任选地，将固体支持物上的未反应的羟基封端；
a5)使连接至所述固体支持物的第一核苷的5’羟基解锁；
a6)使作为活化的亚磷酰胺的第二核苷偶联成相应的P-连接的二聚体；
a7)氧化或硫化相应的P-连接的二核苷，形成相应的磷酸三酯(P＝O)或相应的硫代磷酸(P＝S)；
a8)任选地，将任意未反应的5’羟基封端；
a9)重复上述步骤a5-a8，直至组装期望的序列。
所应用的亚磷酰胺单体如下所示且代表本发明的优选实施方案。
在本发明的一个优选的实施方案中，生产脂族胺盐形式的寡核苷酸。
在脱保护步骤后用相应的脂族胺得到脂族胺盐(除去2-氰基乙基P-保护基)。
适合的脂族胺为如上述所定义的单-、二-或三-C1-4-烷基胺或环状脂族胺。
优选地，使用单-、二-或三-C1-4-烷基胺，更优选二-C1-4-烷基胺且特别是二乙胺。
因此，在本发明的一个更优选的实施方案中，生产二乙胺盐形式的寡核苷酸。
步骤b)：
步骤b)要求从支持物上裂解寡核苷酸并且除去保护基。
从支持物上裂解寡核苷酸并且除去保护基(核碱基保护基和氨基修饰剂保护基)便利地采用氨水进行，由此得到寡核苷酸的铵盐。通常，应用浓氨水和40℃-80℃的升高反应温度。
然后可以通过经过滤从反应混合物中分离，用水和/或脂族醇的洗涤步骤且随后通过蒸发除去溶剂得到粗的寡核苷酸铵盐。
步骤c)：
步骤c)要求将寡核苷酸的铵盐进行盐交换改变成寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐，由此除去任意游离氨或残留脂族胺。
根据本发明的一个实施方案，形成碱金属盐。然后使用碱金属氢氧化物便利地进行盐交换。
适合的碱金属氢氧化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，但优选氢氧化钠。
通常，在室温或适度升温下在水性环境中进行盐交换，由此优选采用相应的氢氧化物的水溶液。
根据本发明的另一个实施方案，形成碱土金属盐。然后采用碱土金属氢氧化物水溶液便利地进行盐交换。
适合的碱土金属氢氧化物为氢氧化钙或氢氧化镁，但优选氢氧化钙。
通常，在室温或适度升温下在水性环境中进行盐交换，因此，优选使用相应的氢氧化物的水溶液。
在一个优选的实施方案中，形成碱金属盐，更优选寡核苷酸钠盐。
得到的寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐的水溶液的后处理极为重要的方面在于有效地除去任何游离氨或残留脂族胺。
因此，根据一种方法，可以通过蒸发水分离碱金属盐或碱土金属盐的水溶液。借助于适合的有机溶剂例如2-甲基-2-丁醇共沸除去剩余的水且随后蒸发可以得到粗的寡核苷酸的碱金属盐。再用脂族醇如甲醇或乙醇消化、过滤和用相应的脂族醇洗涤能够得到寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐，其基本上不含氨和残留脂族胺，由此可以便利地应用于偶联步骤。
根据另一种方法，可以通过连续部分蒸发(通过恒定体积和添加水)分离碱金属盐或碱土金属盐的水溶液，直至蒸气相的pH达到pH 7，由此表示已经除去任何剩余的氨和或脂族胺。得到的溶液递送寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐，其基本上不含氨和残留的脂族胺，且由此可以便利地应用于溶液中的偶联步骤。
根据另一种方法，可以通过对碱金属盐或碱土金属溶液例如氢氧化钠、氯化钠、磷酸钠(pH 6-8)及其混合物的正切流动过滤或交叉流过滤分离碱金属盐或碱土金属盐的水溶液。得到的溶液递送寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐，其基本上不含氨和残留的脂族胺，且由此可以便利地应用于溶液中的偶联步骤。或者，用脂族醇如甲醇或乙醇进一步消化、过滤和用相应的脂族醇洗涤能够得到寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐，其基本上不含氨和残留的脂族胺，且可以便利地应用于偶联步骤。
优选如上所述的“连续部分蒸发”方法和“正切流动过滤或交叉流过滤”方法。
根据另一种方法，可通过阴离子交换色谱、然后脱盐和通过正切流动过滤或交叉流过滤浓缩来纯化粗的寡核苷酸铵盐。得到的溶液递送寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐，其基本上不含氨和残留的脂族胺，且由此可以便利地应用于溶液中的偶联步骤。或者，冻干该溶液能够得到寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐，其基本上不含氨和残留的脂族胺，且可以便利地应用于偶联步骤。
纯化技术“正切流动过滤或交叉流过滤”和“阴离子交换色谱”如下步骤e)中详细描述。
根据本发明的另一个实施方案，形成四烷基铵盐。在这种情况下，便利地采用氢氧化四烷基胺或卤化四烷基铵，优选使用氢氧化或卤化四C1-12-烷基铵，例如氢氧化四丁基铵或溴化四丁基铵，在适合的有机溶剂中便利地进行盐交换，所述适合的有机溶剂选自甲醇、二甲亚砜、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或其混合物。优选地，使用甲醇或二甲亚砜或其混合物。在混合物的情况中，可以通过蒸发得到除去甲醇和二甲亚砜的混合物，得到无质子溶液的四烷基铵盐。如果随后进行偶联，则该实施方案适合在无水条件下进行。
步骤d)：
步骤d)要求寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐与GalNAc聚簇化合物或其盐偶联。
GalNAc聚簇化合物、其相应的盐、对映体和/或立体异构体具有下式
其中R2为氢或羟基保护基，且n为0-10的整数。
适合的羟基保护基为酰基，特别是C1-12-烷基羰基，更具体地为C1-6-烷基羰基，其任选地被C1-6-烷基或苯基取代。更优选乙酰基、新戊酰基或苯甲酰基，其中乙酰基为最优选的羟基保护基。
n优选为0-5的整数，更优选1-3，但最优选为2。
在一个优选的实施方案中，式I的GalNAc聚簇化合物为式Ia的碱金属或碱土金属盐，
其中M+/++为碱金属或碱土金属阳离子，但优选钠。
可以如下制备GalNAc聚簇化合物：
最初，可以根据如下方案1制备GalNAc聚簇化合物的苄基酯前体。随后通过使用氢在氢化催化剂例如披钯活性炭存在下催化氢化氢解苄基酯，得到式I的乙酰基-保护的GalNAc聚簇酸衍生物。
方案1：
可以根据如下方案2制备式I的GalNAc聚簇盐。
方案2：
寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐与式I的GalNAc聚簇化合物的偶联反应包括在第一步中用偶联剂活化GalNAc聚簇化合物，并且在第二步中使活化的GalNAc聚簇化合物与寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐在胺碱和有机溶剂存在下偶联。
偶联剂选自DCC(N，N′-二环己基碳二亚胺)或EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N`-乙基碳二亚胺-盐酸盐)或TBTU(N，N，N′，N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)，且添加剂选自HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其常用的组合，例如TBTU/HOBt或HBTU/HOAt。
在一个优选的实施方案中，偶联基选自EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N`-乙基碳二亚胺-盐酸盐)，且HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)作为添加剂。
在以碱金属盐或碱土金属盐形式使用GalNAc聚簇的情况下，活化必须在酸性环境中进行。适合的酸为无机酸，例如正膦酸，或有机酸，例如甲磺酸，以及适合的极性无质子溶剂，例如在N，N'-二甲基甲酰胺中。可以在10℃-40℃选择反应温度。
对于偶联，胺碱通常为叔胺，如三乙胺或N-乙基二异丙基胺，吡啶衍生物，例如2，4，6-可力丁或DABCO(1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷)，但优选N-乙基二异丙基胺。该反应在极性无质子溶剂中进行，如乙腈、二甲亚砜或四氢呋喃或其混合物，反应温度在20℃-70℃。
或者，将正-丙基膦酸酸酐三聚体(T3P)或(3-(二乙氧基-磷酰基氧基)-1，2，3-苯并[d]三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)与叔胺碱例如三乙胺或N-乙基二异丙基胺选作偶联剂，但优选使用N-乙基二异丙基胺。
过滤反应混合物得到包含GaINAc-聚簇寡核苷酸缀合物的滤液，其可以用于随后的纯化步骤。
步骤e)：
步骤e)要求纯化GalNAc-聚簇寡核苷酸缀合物。
得自上述步骤的GalNAc-聚簇寡核苷酸缀合物的纯化主要包含步骤色谱、浓缩和分离。色谱和浓缩步骤可以重复应用。
适合的纯化方法包含如下步骤次序：
I.色谱
II.浓缩
III.分离
或
I.色谱
II.浓缩
III.色谱
IV.浓缩
V.分离
或
I.色谱
II.浓缩
III.分离
IV.色谱
V.浓缩
VI.分离
优选包含顺序I.-V.的纯化程序。
甚至更优选包含如下步骤顺序的纯化程序：
I.阴离子交换色谱或反相色谱
II.正切流动过滤
III.冻干或喷雾干燥
或
I.阴离子交换色谱或反相色谱
II.正切流动过滤
III.阴离子交换色谱或反相色谱
IV.正切流动过滤
V.冻干或喷雾干燥。
上述纯化方法为常规的且为本发明领域普通技术人员众所周知。
术语色谱包含方法阴离子交换色谱或反相色谱及其组合。
阴离子交换色谱法基于样品溶液的带电荷的离子与常规的商购阴离子交换树脂、优选具有三甲基铵-官能化的那些的相互作用。例如，这些相材料可以得自GE Healthcare、Tosoh Bioscience、Bio-Rad或Merck。已经使用购自Tosoh Bioscience的阴离子交换树脂TSKgel Super Q-5PW(QAE)得到了特别良好的结果。
可以使用传统的商购相材料进行反相色谱，例如改性的硅胶吸附剂作为固定相和适合的有机溶剂，例如乙腈，且如果适用，则可以使用缓冲剂。适合的改性硅胶型相材料可以选自KromasilTMC18、KromasilTMC8、YMC Triart C18和YMC Triart C8。已经使用来自YMC的Triart Prep C8-S得到了特别良好的结果。
术语浓缩包含方法正切流动过滤或蒸发及其组合。
在正切流动过滤或交叉流过滤中，使进料在相对于渗透侧正压下通过滤膜(以正切方式)。小于通过膜的膜孔径的材料的比例作为渗透物或滤液通过膜；另外的每种物质作为渗余物保留在膜的进料侧。正切流动过滤的原理也用于纳米过滤、超滤、透析过滤和微孔过滤方法。适合的膜商购自例如Merck Millipore，商品名为PelliconTM。适合的膜具有≤3kDA的分子量截留值(MWCO)。优选分别具有1kDA或3kDA的MWCO的Merck MilliporePellicon2和3膜。
术语分离包含方法冻干、沉淀、喷雾干燥和蒸发。所有这些术语均为本领域技术人员众所周知。
在一个非限制性实施方案中，寡核苷酸选自：
AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′(化合物1)
AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3`(化合物2)
AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊-t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`(化合物5)
AM-C6-5`-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`(化合物6)
其中AM-C6是指C6氨基接头；＊表示硫代磷酸桥；A、G、T和MeC(5-甲基胞嘧啶)为LNA核苷单体，且a、t、c、g为DNA核苷单体。
在一个非限制性实施方案中，GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物可以选自：
GN2-AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′(化合物3)
GN2-AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3`(化合物4)
GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊-t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`(化合物7)
GN2-AM-C6-5`-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`(化合物8)
其中AM-C6是指C6氨基接头；＊表示硫代磷酸桥；A、G、T和MeC(5-甲基胞嘧啶)为LNA核苷单体，且a、t、c、g为DNA核苷单体，且GN2为GalNAc聚簇部分，其可以以下式的立体异构体GN2a或GN2b或其混合物的形式出现，其中R表示AM-C6-寡核苷酸尾。
本文公开的化合物具有核碱基序列，其选自SEQ ID NO 1、2、3和4。SEQ ID NO 1：aatgctacaaaaccccca(实施例1A、2A、3A、4A)，SEQ ID NO 2：cagcgtaaagagagg(实施例1B、2B、3B、4B1、4B2、1C、2C、3C、1D、2D、3D、4C、4D、1E、2E、1F、2F)，SEQ ID NO 3：cacctatttaacatcagac(实施例1G、1I、1J、2G、2I、2J、3E、3G、4E1、4E2、4E3、4E4、5)，
SEQ ID NO 4：cactaattgtagtagtactc(实施例1H、2H、3F、4F1、4F2)。
实施例
缩写：
AcOH 乙酸
DMAP 4-(二甲基氨基)-吡啶
DMF N，N’-二甲基甲酰胺
EtOH 乙醇
MeOH 甲醇
rt 室温
THF 四氢呋喃
TBME 叔丁基甲基醚
ACN 乙腈
GalNAc聚簇化合物前体的制备
结构单元A：
实施例A1
(2S)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸苄基酯
将234.0g(500.0mmol)(2S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸悬浮于500ml二氯甲烷，加入62.0ml(600mmol，1.2当量)苄醇和3.05g DMAP(25.0mmol，0.05当量)。将该溶液在40分钟的时间内冷却到0-5℃，滴加108.0g(525.0mmol，1.05当量)N，N’-二环己基碳二亚胺在500ml二氯甲烷中的溶液。将白色混悬液在0-5℃搅拌1小时，然后在室温下搅拌15小时。将混悬液经G3玻璃滤器过滤，白色滤饼用总量250ml的二氯甲烷分批洗涤。以650-10毫巴/1h蒸发滤液，得到黄色油，其溶于2.0L乙酸乙酯，用2.0L0.5M盐酸、2.0L 1M NaHCO3和1.0L盐水洗涤，有机层以40℃/150-10毫巴/5h蒸发至干，得到291.1g粗的(2S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸苄基酯，为白色固体，收率104％，96.4％纯度(HPLC面积％；含有约5％苄醇)。该物质不经进一步纯化而用于下一步骤。MS：m/z＝459.22735(M-boc+H)+。
实施例A2
(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯甲磺酸盐
将291.1g(500.0mmol)(2S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸苄基酯(HPLC纯度；95.8％；含有约5％苄醇)在室温下溶于1.4L THF。在10分钟内，加入1.04L二乙胺(10.0mol，20当量)，将该浅黄色溶液在室温搅拌2小时，接着在40℃/200-10毫巴蒸发，加入200ml乙腈，并在40℃/100-10毫巴/1h再次蒸发以充分除去二乙胺。最后，获得268.1g的黄色油，将其溶于2.5L乙腈，在室温下搅拌10分钟。经玻璃滤器滤出不溶性颗粒，用500ml乙腈洗涤。滤液在20℃-25℃在10分钟内用34.0ml甲磺酸滴加处理。形成的白色混悬液在室温搅拌17小时，用G3玻璃滤器过滤。滤饼用500ml乙腈分批洗涤。将白色晶体以40℃/15毫巴/4h干燥，得到195.8g(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯甲磺酸盐，为白色晶体，91％收率(两步骤)和99.3％纯度(HPLC面积％)。MS：m/z＝337.2149(M+H)+。
实施例A3
(2S)-2-[[(2S)-2，6-双(叔丁氧基羰基氨基)己酰基]氨基]-6-(叔丁氧羰基氨基)己酸苄基酯
将190.0g(439.0mmol)(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯甲磺酸盐在室温下悬浮于1.9L THF。加入335ml(1.98mol，4.5当量)N-乙基二异丙基胺，因此温度轻微降低至15℃。接着，加入213g(615mmol，1.4当量)(S)-2，6-二((叔丁氧基羰基)氨基)己酸，该白色混悬液在室温下搅拌20分钟。在20分钟内在20-25℃滴加390ml正丙基膦酸酐(T3P，为环状三聚体，50％在乙酸乙酯中的溶液，659mmol，1.5当量)(在冷水浴中冷却)。将所得浅黄色浑浊溶液在室温下搅拌1.5小时，转移至分液漏斗，用1.9LTBME稀释，用1.9L水、1.9L 0.5M盐酸、1.9L 0.5M NaOH、1.9L水和1.9L盐水萃取。所分离的浑浊有机层经玻璃纤维滤器过滤，将滤器用100ml TBME洗涤，并将合并的滤液以40℃/100毫巴/1h蒸发，再次加入1.0L TBME(以便共沸除去水)，以40℃/250-10毫巴/1h蒸发，得到粗物质296.4g，为白色固体残余物。
将粗固体用500ml乙腈处理，并将浑浊的溶液加热到60-65℃，持续10分钟。将混合物冷却到20-25℃，搅拌10分钟，经玻璃纤维滤器过滤，用50ml乙腈洗涤。将该浅黄色溶液以40℃/100-10毫巴/4h蒸发，得到295g(2S)-2-[[(2S)-2，6-二(叔丁氧基羰基氨基)己酰基]氨基]-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯，为浅白色固体，收率101％(HPLC纯度：100％，非对映异构体纯度(SS)98.6％)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。MS：m/z＝565.3741(M-boc+H)+。
实施例A4
(2S)-6-氨基-2-[[(2S)-2，6-二氨基己酰基]氨基]己酸苄基酯三-甲磺酸盐
将124.0g(187mmol)(2S)-2-[[(2S)-2，6-二(叔丁氧基羰基氨基)己酰基]氨基]-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯悬浮于1.25L乙腈。在20-25℃在10分钟内加入61.0ml(935.0mmol，5.0当量)甲磺酸(气体放出)。将所得橙色混悬液在40分钟内加热到55-60℃，并在55-60℃再搅拌1小时。将该橙红色乳液冷却到室温(通过1H-NMR控制debocation)，并且不经进一步纯化而用于实施例8的A+B的组装步骤。MS：m/z＝365.2558(M+H)+。
结构单元B：
实施例R1a
2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯
在20-25℃将30.0g(200.0mmol)2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙醇溶于50ml DMF中，接着加入46.0ml 25％甲醇钠(200.0mmol，1.0当量)的甲醇溶液。将所形成的溶液以40℃/50毫巴/0.5h蒸发(除去40ml溶剂)，再加入50ml DMF，以40℃/20毫巴/0.5h蒸发(除去15ml溶剂)。在20-25℃向该轻度果冻状混悬液中加入13.9g溴乙酸(100mmol，0.5当量)在50ml DMF中的溶液，并将混合物搅拌6小时。加入11.9ml苄基溴(100mmol，0.5当量)，并将混合物在20-25℃再搅拌16小时。接着将反应混合物用200ml盐水处理，用200ml TBME萃取。分离的TBME层用200ml盐水萃取，接着将分离的TBME层用无水硫酸钠干燥，过滤，以40℃/300-10毫巴/1h蒸发，得到粗的23.9g 2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯。
在色谱纯化(600g硅胶60(0.063-0.2mm)，流动相：乙酸乙酯)后，分离到总计7.85g无色油状的2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，13％收率，99.0％纯度(HPLC面积％)。MS：m/z＝299.1517(M+H)+。
实施例B1b
2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯
将11.2g叔丁醇钾(100.0mmol，0.5当量)悬浮在70ml 2-甲基-2-丁醇中(轻度放热35℃)，接着在5分钟的时间内滴加30.0g(200.0mmol)2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙醇。滴液漏斗用10ml 2-甲基-2-丁醇(温度升至45℃)清洗，将溶液加热到60-65℃，加入11.6g(100mmol，0.5当量)氯乙酸钠，并在60-65℃搅拌16小时，接着加入11.9ml苄基溴(100mmol，0.5当量)，并将混合物在60-65℃再搅拌16小时。将反应混合物冷却到室温，然后用50ml水处理，用80ml TBME和40ml TBME萃取。将合并的TBME层用50ml半饱和的盐水洗涤，有机层以40℃/300-10毫巴/1h蒸发，得到粗的27.0g 2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯。
在色谱分离(270g硅胶60(0.063-0.2mm)，流动相：从乙酸乙酯/正庚烷1/1开始，当纯产物可见时，流动相改为100％乙酸乙酯)后，分离到总计11.4g 2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，为接近无色的油，19％收率(38％来自氯乙酸钠)和99.0％纯度(HPLC面积％)。
实施例B2
2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯
将268.0g 2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸苄基酯(900mol)溶于2.4L二氯甲烷。加入385.0g(2S，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2，4，5-三基三乙酸酯(990mmol，1.1当量)和12.0ml三氟甲磺酸(135mmol，0.15当量)。将混悬液用Dean-Stark分离器加热回流(50ml，以除去AcOH)。1小时后，将4.50ml三氟甲磺酸(50.7mmol，0.05当量)和50ml二氯甲烷加入该橙色混悬液，将溶剂(50ml)通过Dean-Stark分离器除去。每半小时重复此操作，总共6次(3h)。在总共4.5小时后，将红色溶液冷却到10-15℃，并在20-25℃在30分钟内加入到1.8L 1M碳酸氢钠(1.8mol，2.0当量)溶液中(CO2放出，pH 7-8)。分离黄色有机层，以40℃/600-10毫巴/3h蒸发，得到585.4g粗的2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，为黄色油(HPLC纯度：87％)。将粗产物溶于700ml丙酮，加载到预装填的硅胶柱上(3.0kg硅胶60；0.063-0.2mm)。使用正庚烷/丙酮作为流动相(梯度从5∶1到1∶2)进行色谱分离。合并的收集液以40℃/600-10毫巴蒸发，并以20-25℃/0.3毫巴/3h干燥，得到465.0g 2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，为黄色油，83％收率，100％纯度(HPLC面积％)。MS：m/z＝628.2627(M+H)+。
实施例B3
2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸
在氩气下，将456.0g 2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基乙氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯(727mmol)溶于1.4L THF。加入4.56g Pd/C 10％，并将氩气替换为氢气(1巴)。该黑色混悬液在20-25℃氢化2小时。将氢气替换为氩气，过滤黑色混悬液，滤饼用总计400ml THF分批洗涤。该无色滤液(HPLC纯度：71％，27％甲苯)不经任何纯化而用于实施例8的A+B组装步骤实施例C1。MS：m/z＝538.2191(M+H)+。
结构单元A和B的组装
实施例C1
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯
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将实施例4的(2S)-6-氨基-2-[[(2S)-2，6-二氨基己酰基]氨基]己酸苄基酯三氟甲磺酸盐(180.0mmol)的红橙色溶液(～1.4L)用3.60L乙腈稀释。在20-25℃下，在5分钟内加入365.0ml N-乙基二异丙基胺(2.16mol，12.0当量)。向所形成的粘性浆液中在20-25℃下在10分钟内加入来自实施例B3的2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸(720mmol，4.0当量)溶液(～2.25L)，温度由此轻微升至40℃。在45-50℃将425ml正丙基膦酸酐(T3P，三聚体，50％在乙酸乙酯中的溶液，720mmol，4.0当量)在10分钟内加入。反应溶液在45-50℃搅拌1小时。将该浅黄色溶液冷却到20-25℃，并以40℃/10毫巴/6h蒸发，得到1.06kg粗的(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯(HPLC纯度：24.1％)。将粗产物分三批沉淀以除去甲磺酸N-乙基二异丙基胺和残余的T3P。将353g粗产物溶于7.0L 2-丙醇，在1小时内冷却到-25℃，在-25℃搅拌1小时，通过预冷的(-25℃)G3玻璃滤器过滤(不清洗)，沉淀产物的一部分从反应器中沉积在玻璃壁上。将所有沉淀物从滤器和玻璃壁中用总计1.0L THF分批溶解。将合并的溶液以40℃/20毫巴/6h蒸发，得到390.0g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯(HPLC纯度：71.9％)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。MS：m/z＝1923.8438(M+H)+。
实施例C2
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-双[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠
将(2S)-6-氨基-2-[[(2S)-2，6-二氨基己酰基]氨基]己酸苄基酯三氟甲磺酸盐(12.2mmol)的红橙色溶液(～95ml)用240ml乙腈稀释。在20-25℃，将30.0ml N-乙基二异丙基胺(2.16mol，14.5当量)在5分钟内加入。在20-25℃下向所形成的粘性浆液中在10分钟内加入2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸(48.8mmol，4.0当量)溶液(～150ml)，温度由此轻微升至40℃。在45-50℃将28.8ml正丙基膦酸酐(T3P，三聚体，50％在乙酸乙酯中的溶液，48.8mmol，4.0当量)在10分钟内加入。反应溶液在45-50℃搅拌1小时。将该浅黄色溶液冷却到20-25℃，并以40℃/10毫巴/6h蒸发，得到粗的73.6g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯(HPLC纯度：32％面积)。
将68.0g(11.0mmol)的粗产物溶于340ml甲醇，向该浅黄色溶液中加入20.0ml(220mmol，20当量)10.8M NaOH，温度升至32℃，将反应混合物在室温下搅拌2.5小时，由此形成混悬液(pH 12.0)。将混悬液过滤，并将滤饼用100.0ml甲醇洗涤，滤液以40℃/250-10毫巴/2h蒸发，得到41.5g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠，其随后经制备型反相色谱纯化，条件参见实验C3。
实施例C3
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠；
将378.0g(197.0mmol，粗的)(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯溶于1.9L甲醇。在10分钟内，在20-25℃加入200.0mL 10.8M氢氧化钠溶液(2.16mol，11.0当量)。温度由此升至31℃。将该浅黄色溶液在20-25℃搅拌2小时(pH13.4)，接着加入80.0mL 5M氯化铵溶液(pH 10.7)。然后将该浅黄色溶液以20-25℃/100-20毫巴/5h蒸发，以20-0.5毫巴/1h干燥，得到543g粗的(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠(HPLC纯度：40.1％)，其随后经制备型反相色谱纯化。
柱：Triart C18-120 26x15cm；10um；
流动相：A：2mM NaHCO3/B：乙腈；
梯度：
分钟 A B 流速(ml/Min)
0 94 6 700
2 94 6 700
20 88 12 700
20.1 10 90 750
26 10 90 750
26.1 94 6 700
36 94 6 700
热稳定：室温
检测：220nm
溶液：将543g溶于4500ml 2mM NaHCO3，过滤(GF5)(＝5000ml(109mg/ml)
样品溶液/注射：每次运行200ml样品＝21.8g(25次运行)
浓度：用110L水稀释合并的级分(46L)，将该溶液分3部分泵送至RP C18柱，用水/MeOH 98/2洗涤，然后用MeOH洗脱，用旋转蒸发器浓缩，得到1.18kg甲醇溶液。在40℃/20mbar/1h，然后在20-25℃/0.35mbar/14h将制备型HPLC纯化步骤的1.18kg甲醇溶液的四分之一(即295g)蒸发至干，得到43.5g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-双[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠，为无定形白色粉末，99.88％HPLC纯度。将剩余的上述溶液的四分之三(885g)用于下一步。MS：m/z＝1452.684(M-H)-。
GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物的制备
实施例1A
CF3CO-AM-C6＊-5`A(bz)＊A(bz)＊T＊g(ibu)＊c(bz)＊t＊a(bz)＊c(bz)＊a(bz)＊a(bz)＊a(bz)＊a(bz)＊c(bz)＊MeC(bz)＊MeC(bz)＊A(bz)-3′-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为1.60mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer Support 5GUnyLinker350(GE Healthcare，Freiburg，Germany)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用2.0eq DNA/LNA-亚磷酰胺和3.0eqTFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化(Phosphorothiolation)试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，Merck Millipore，EMP Biotech；参见以下详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2A。
标准试剂溶液
实施例1B
CF3CO-AM-C6-5`c(bz)a(bz)G(dmf)＊MeC(bz)＊G(dmf)＊t＊a(bz)＊a(bz)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊G(dmf)＊G(dmf)3′-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为1.90mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer SupportUnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用1.5eq DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，Merck Millipore，EMP Biotech；参见以下详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2B。/>
标准试剂溶液
实施例1C
CF3CO-AM-C6-5`c(bz)a(bz)G(ibu)＊MeC(bz)＊G(ibu)＊t＊a(bz)＊a(bz)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊G(ibu)＊G(ibu)3′-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为1.90mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer SupportUnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用1.5eq DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，Merck Millipore，EMP Biotech；参见下列详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2C。
标准试剂溶液
实施例1D
CF3CO-AM-C6-5`c(bz)a(bz)G(dmf)＊MeC(bz)＊G(dmf)＊t＊a(bz)＊a(bz)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊G(dmf)＊G(dmf)-3′-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为1.60mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer Support 5GUnyLinker 350(GE Healthcare，Freiburg，Germany)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用2.0eq DNA/LNA-亚磷酰胺和3.0eqTFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，MerckMillipore，EMP Biotech；参见以下详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2D。
标准试剂溶液
/>
实施例1E
CF3CO-AM-C6-5`c(bz)a(bz)G(dmf)＊MeC(bz)＊G(dmf)＊t＊a(bz)＊a(bz)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊G(dmf)＊G(dmf)-3′-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为0.20mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer SupportUnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用1.5eq DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(PADS)、双-(苯基乙酰基)-二硫化物(ABCR，AB180887)以在无水乙腈/3-甲基吡啶1/1中的0.2M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，MerckMillipore，EMP Biotech；参见以下详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2E。
标准试剂溶液
实施例1F
CF3CO-AM-C6-5`c(bz)a(bz)G(dmf)＊MeC(bz)＊G(dmf)＊t＊a(bz)＊a(bz)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊g(ibu)＊a(bz)＊G(dmf)＊G(dmf)-3′-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为0.20mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer SupportUnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用1.5eq DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，Merck Millipore，EMP Biotech；参见行为详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2F。
标准试剂溶液
实施例1G
CF3CO-AM-C6-5`-c(bz)a(bz)MeC(bz)＊MeC(bz)＊t＊a(bz)＊t＊t＊t＊a(bz)＊a(bz)＊c(bz)＊a(bz)＊-t＊c(bz)＊A(bz)＊G(dmf)＊A(bz)＊MeC(bz)-3`-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为1.90mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer SupportUnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用1.5eq DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，Merek Millipore，EMP Biotech；参见以下详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2G。
标准试剂溶液
实施例1H
CF3CO-AM-C6-5`-c(bz)a(bz)MeC(bz)＊T＊A(bz)＊a(bz)＊t＊t＊g(ibu)＊t＊a(bz)＊g(ibu)＊t＊-a(bz)＊g(ibu)＊t＊a(bz)＊MeC(bz)＊T＊MeC(bz)-3`-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为1.90mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer SupportUnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用1.5eq DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，Merck Millipore，EMP Biotech；参见以下详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2H。
标准试剂溶液
实施例1I
CF3CO-AM-C6-5`-c(bz)a(bz)MeC(bz)＊MeC(bz)＊t＊a(bz)＊t＊t＊t＊a(bz)＊a(bz)＊c(bz)＊a(bz)＊-t＊c(bz)＊A(bz)＊G(dmf)＊A(bz)＊MeC(bz)3`-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为0.2mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE HeaIthcare，Freiburg，Germany and Primer SupportUnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用1.5eq DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，Activator 42，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，Merck Millipore，EMP Biotech；参见以下详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2I。
标准试剂溶液
/>
实施例1J
CF3CO-AM-C6-5`-c(bz)a(bz)MeC(bz)＊MeC(bz)＊t＊a(bz)＊t＊t＊t＊a(bz)＊a(bz)＊c(bz)＊a(bz)＊-t＊c(bz)＊A(bz)＊G(dmf)＊A(bz)＊MeC(bz)-3`-UnyLinker作为其二乙胺盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
通过使用固定相的标准亚磷酰胺化学生产标题化合物，规模为1.90mmol，其中采用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany and Primer SupportUnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA)。采用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA即2`-OCH2-4`桥接核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联采用1.5eq DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)以在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。全部另外的标准试剂溶液(DCA-debloc，DCI，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash为商购的(Sigma-Aldrich，Merck Millipore，EMP Biotech；参见以下详细描述)。2-氰基乙基-基团的脱保护通过称作DEA-wash的方法得到，得到粗的被保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙胺盐。因此，将得到的标题化合物不经进一步操作用于实验例2J。
标准试剂溶液
实施例2A
AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′作为其钠盐的制备
用180ml浓氢氧化铵水溶液30-32％处理来自实施例1A的粗的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为其二乙胺盐。将该混悬液在60℃在压力稳定密闭烧瓶中搅拌10小时。用玻璃纤维滤器过滤该混悬液，用60ml水洗涤。在40℃/300-10mbar/2h蒸发黄色滤液，得到～10.5g粗寡核苷酸，为铵盐。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，WatersMS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 5455.6。将总计13个以类似方式制备的1.6mmol批量与上述合并(总的新批量大小：22.4mmol)，在一个圆底烧瓶中溶于750ml水。用加入的52.0ml 10.8M NaOH(561.6mmol)(pH 10)处理黄色溶液，在40℃/100-10mbar/2h蒸发该溶液，用100ml水处理残余物，真空40℃/100-10mbar浓缩，将该操作重复总计4次(第四次蒸馏物具有7.0的pH)。用100ml 2-甲基-2-丁醇处理油状残余物，在40℃/50-10mbar/2h蒸发(共沸除去水)，得到160g，为黄色固体。将粗产物混悬于800ml乙醇，温热至40-45℃ 15min，将黄色混悬液在20-25℃搅拌1h。过滤该混悬液(除去苯甲酰胺、异丁酰胺、三氟乙酰胺和其他副产物)，用160ml乙醇分部分洗涤滤饼。在40-45℃/10mbar/3h干燥产物，得到130.5g AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′，为其钠盐，为高密度黄色粉末，其具有的LC-纯度为75.6％面积(LC-SystemAgilentTechnologies 1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 5455.6。该产物不经进一步纯化用于实验例3A)。
实施例2B
AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的制备
用180ml浓氢氧化铵水溶液30-32％处理来自实施例1B的粗的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为其二乙胺盐。将该混悬液在60℃在压力稳定密闭烧瓶中搅拌10小时。用玻璃纤维滤器过滤该混悬液，用60ml水洗涤。在40℃/300-10mbar/2h蒸发黄色滤液，得到～10.5g粗寡核苷酸，为铵盐。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，WatersMS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 5197.6。将总计25个以类似方式制备的1.9mmol批量与上述合并(总的新批量大小：47.5mmol)，在一个圆底烧瓶中溶于1200ml水。用68.0ml 10.8M NaOH(734.4mmol，15.5eq，pH 10)处理橙色溶液，在40℃/200-50mbar浓缩该溶液，得到～600g粗溶液，用200ml水处理，在40℃/50mbar真空蒸馏出相同体积，将该操作重复总计10次(蒸馏出总计2000ml水，第十次蒸馏物具有7.0的pH，除去全部氨)。将得到的855g橙色水溶液(包含最大47.5mmol产物AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′，为其钠盐)不经进一步纯化用于实验例3B。使用相同方法后处理2x 20个以类似方式制备的1.9mmo批量(2x 38.0mmol)，总计123.5mmol。
实施例2C
AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的制备
按照与实施例2B类似的方式，以实验例1C为原料生产标题化合物。将得到的148g黄色水溶液(包含最大1.9mmol产物AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′，为其钠盐)不经进一步纯化用于实验例3C。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITYH-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50 mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 5197.6。
实施例2D
AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的制备
用180ml浓氢氧化铵水溶液30-32％处理来自实施例1C的粗的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为其二乙胺盐。将该混悬液在60℃在压力稳定密闭烧瓶中搅拌10小时。用玻璃纤维滤器过滤该混悬液，用60ml水/乙醇3/1洗涤。在40℃/300-10mbar/2h蒸发黄色滤液，得到～10.5g粗寡核苷酸，为铵盐。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITYH-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 5197.6。在一个圆底烧瓶中将残余物10.2g(1.6mmol)溶于250ml水。用2.22ml 10.8M NaOH(24mmol，15eq，pH 10)处理黄色溶液，在40℃/200-50mbar蒸发该溶液，得到黄色油状物，用10ml水处理2次，真空40℃/50-10mbar蒸馏出相同体积(2次蒸馏物pH 7.0，除去全部氨)。用30ml 2-甲基-2-丁醇处理油状残余物，在40℃/10mbar蒸发，得到粗9.82g，为黄色固体(包含全部裂解的保护基)AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′，为其钠盐，其不经进一步纯化用于实验例3D。
实施例2E
AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的制备
用25.0ml浓氢氧化铵水溶液30-32％处理来自实施例1E的粗的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为其二乙胺盐。将该混悬液在60℃在压力稳定密闭烧瓶中搅拌10小时。用玻璃纤维滤器过滤该混悬液，用20ml水洗涤。在40℃/300-10mbar/2h蒸发黄色滤液，得到～1.3g粗寡核苷酸，为铵盐。将残余物溶于10ml，用0.28ml(3.0mmol，15eq)氢氧化钠32％水溶液处理。在40℃/100-15mbar/1h蒸发黄色溶液，得到0.96g，为黄色固体(包含全部裂解的保护基)AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′，为其钠盐。将该黄色固体混悬于4.8ml乙醇，在40℃搅拌1小时，冷却至20-25℃，在该温度下搅拌1小时。过滤该混悬液，用1.0ml乙醇洗涤滤饼，在40℃/15mbar/1h干燥，得到0.75g黄白色固体(包含全部裂解的保护基)AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′，为其钠盐。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 5197.6。
实施例2F
AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的制备
用25.0ml浓氢氧化铵水溶液30-32％处理来自实施例1F的粗的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为其二乙胺盐。将该混悬液在60℃在压力稳定密闭烧瓶中搅拌10小时。用玻璃纤维滤器过滤该混悬液，用20ml水洗涤。用0.28ml(3.0mmol，15eq)氢氧化钠32％水溶液处理黄色滤液。在40℃/100-15mbar/1h蒸发黄色溶液，得到0.65g，为黄色固体(包含全部裂解的保护基)AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′，为其钠盐。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50 mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 5197.6。
实施例2G
AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`作为其钠盐的制备
按照与实施例2B类似的方式，以实验例1G为原料生产标题化合物。将得到的1720g橙色水溶液(包含最大15.2mmol产物，AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，为其钠盐)不经进一步纯化用于实验例3E。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITYH-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50 mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6357.7。
实施例2H
AM-C6-5`-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`作为其钠盐的制备
按照与实施例2B类似的方式，以实施例1H为原料生产标题化合物。将得到的1920g橙色水溶液(包含最大15.2mmol产物AM-C6-5`-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`，为其钠盐)不经进一步纯化用于实验例3F。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6748.8。
实施例2I
AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`作为其钠盐的制备
通过超滤/渗滤来自实施例1I的溶于水(150mL)的1.00g作为其二乙胺盐的粗CF3CO-AM-C6-5`-c(bz)a(bz)MeC(bz)＊T＊A(bz)＊a(bz)＊t＊t＊g(ibu)＊t＊a(bz)＊g(ibu)＊t＊-a(bz)＊g(ibu)＊t＊a(bz)＊MeC(bz)＊T＊MeC(bz)-3`生产标题化合物，用配备两个Sartocon SliceHydrosart 2KD 0.1m2膜的-Cross-Flow，使用0.1MNaOH(1.0L)、然后使用0.1MNaHCO3(1.0L)和1M NaCl(1.0L)渗滤得到的溶液。使用H2O(2.0L)进行最终的脱盐步骤。减压浓缩得到的溶液，与EtOH(5mL)一起在室温下研磨1小时，过滤，真空干燥(24℃/10mbar/12h)，得到标题化合物，为其钠盐(白色固体，410mg，40％收率)。将该物质不经进一步纯化用于实施例3G。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50 mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物。UPLC-MS：m/z 6357.7。
实施例2J
AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`作为其铵盐的制备
以实验例1J为原料生产标题化合物。用20ml浓氢氧化铵水溶液30-32％处理来自实施例1J的粗的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为其二乙胺盐。将该混悬液在45℃中压力稳定密闭烧瓶中搅拌10小时。用玻璃纤维滤器过滤该混悬液，用10ml水洗涤。在40℃/300-10mbar/2h蒸发黄色滤液，得到0.45g粗的寡核苷酸，为铵盐。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6357.7。
实施例3A
GN2-AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′作为其钠盐的制备
GalNAc活化：
将30.5g(20.6mmol)GalNAc-聚簇-钠盐在20-25℃溶于300ml DMF，在2min过程中加入1.22ml(18.1mm0l)正膦酸85％在300ml DMF的溶液。5min后，在20-25℃，将2.61g(22.7mmol)N-羟基琥珀酰亚胺加入到轻度浑浊的无色溶液中，然后加入4.75g(24.8mmol)EDC·HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺-盐酸盐)。将无色轻度浑浊溶液在20-25℃搅拌3h，用于偶联步骤。
GalNAc偶联：
将得到的60.0g(10.3mmol)AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′作为其钠盐(来自实施例2A)在900ml甲醇、30ml水和20.7ml(119mmol)N-乙基二异丙基胺中的溶液温热至40-45℃，在1min内加入到上述制备的活化溶液中。将形成的黄色混悬液在40-45℃搅拌0.5h。向该黄色混悬液中加入100ml水，用玻璃纤维滤器过滤该混悬液，得到作为其钠盐的GN2-AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′的澄清黄色溶液，其中LC-纯度为68.2％面积(LC-SystemAgilent Technologies 1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A1.7μm 2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6891.3，然后在实验例4A中纯化和分离。
实施例3R
GN2-AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的制备
GalNAc活化：
将112.1g(75.9mmol)GalNAc-聚簇-钠盐在20-25℃溶于640ml DMF，在2min过程中加入4.48ml(66.4mmol，1.4eq)正膦酸85％在640ml DMF的溶液。5min后，在20-25℃，将13.1g(114mmol，2.4eq)N-羟基琥珀酰亚胺加入到轻度浑浊的无色溶液中，然后加入21.8g(24.8mmol，2.4eq)EDC·HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺-盐酸盐)。将无色轻度浑浊溶液在20-25℃搅拌4h，用于偶联步骤。
GalNac偶联：
用3400ml水稀释来自实验例2B的855g(47.5mmol)AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的溶液，加入95.3ml(546mm0l)N-乙基二异丙基胺和2100ml DMSO，将该溶液温热至40-45℃，在1min内加入到上述制备的活化溶液中。将该黄色溶液在40-45℃搅拌0.5h，得到GN2-AM-C6-5`-caG＊C＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐，HPLC，粗溶液中46.9％面积(LC-System Agilent Technologies1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6633.3，然后在实验例4B1中与2x 20个来自实验例2B的以类似方式制备的1.9mmol批量(2x 38.0mmol)一起纯化和分离。
实施例3C：
GN2-AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的制备
按照与实施例3B类似的方式，以实验例2C为原料生产标题化合物。
用旋转蒸发器在40℃/50mbar浓缩得到的～275g黄色溶液，其包含最大1.5mmol产物，GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，为其钠盐230g，直至该溶液重量为～115g。将浓缩的黄色溶液冷却至20-25℃，在20-25℃在30min过程中滴加至230ml 1-丙醇中。将形成的白色混悬液在20-25℃搅拌16小时，用G3滤器过滤。用总计50ml1-丙醇洗涤黄白色滤饼，在40℃/10mbar干燥1小时，得到9.66g粗的GN2-AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′，为其钠盐，其中HPLC纯度为50.3％面积(LC-System AgiIent Technologies 1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50 mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITYH-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6633.3。
实施例3D
GN2-AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的制备
按照与实施例3B类似的方式，以实验例2D为原料生产标题化合物。
GalNAc活化：
在20-25℃将2.54g(1.72mmol)GalNAc-聚簇-钠盐溶于24.0ml DMF，在2min过程中加入0.100ml(1.50mmol，1.175eq)正膦酸水溶液85％在24.0ml DMF中的溶液。5min后，在20-25℃，将0.22g(1.90mmol，2.2eq)N-羟基琥珀酰亚胺加入到轻度浑浊的无色溶液中，然后添加0.40g(2.06mmol，2.4eq)EDC·HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺-盐酸盐)。将无色轻度浑浊溶液在20-25℃搅拌3h，用于偶联步骤。
GalNAc偶联：
将来自实验例2D的4.75g(0.859mmol)作为其钠盐的固体AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3溶于70ml水，用1.70ml(9.9mmol)N-乙基二异丙基胺和38ml DMSO处理，将该溶液温热至40-45℃，在1min内加入到上述制备的活化溶液中。将黄色溶液在40-45℃搅拌0.5h，得到170g GN2-AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的溶液。用旋转蒸发器在40℃/50mbar浓缩该黄色溶液，直至溶液重量为80g。将浓缩的黄色溶液冷却至20-25℃，在20-25℃在30min过程中滴加至160ml 1-丙醇中。将形成的白色混悬液在20-25℃搅拌2小时，用G3滤器过滤。用总计30ml1-丙醇洗涤滤饼，在40℃/20mbar干燥1小时，得到6.05g粗的GN2-AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′，为其钠盐，其中HPLC纯度为57.2％面积(LC-System AgilentTechnologies 1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6633.3，然后在实验例4C和实验例4D中纯化和分离。
实施例3E
GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`作为其钠盐的制备
按照与实施例3B类似的方式，以实验例2G为原料生产标题化合物。将得到的～3500g黄色溶液(包含15.2mmol产物，GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，为其钠盐)不经进一步纯化用于实验例4E1。
实施例3F
GN2-AM-C6-5`-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`作为其钠盐的制备
按照与实施例3B类似的方式，以实验例2H为原料生产标题化合物。将得到的～3500g黄色溶液(包含最大15.2mmol产物，GN2-AM-C6-5`-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`，为其钠盐)不经进一步纯化用于实验例4F1。
实施例3G
GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`作为其钠盐的制备
按照与实施例3B类似的方式，以实验例2I为原料生产标题化合物。用旋转蒸发器在40℃/50mbar浓缩黄色溶液，直至溶液重量为4.9g。将浓缩的黄色溶液冷却至20-25℃，在20-25℃在5min过程中滴加至10ml1-丙醇中。将形成的白色混悬液在20-25℃搅拌12小时，用G3滤器过滤。用总计5ml 1-丙醇洗涤滤饼，在40℃/20mbar干燥1小时，得到530mg粗的GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，为其钠盐，其中HPLC纯度为57.2％面积(LC-System Agilent Technologies 1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。使用UPLC-MS(WatersUPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEHC18 130A 1.7μm 2.1x50 mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 7793.4。
实施例4A
GN2-AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′作为其钠盐的纯化和分离
通过离子交换色谱法(IEX)，用填充30μm Tosoh TSK Gel Super Q-5PW的9L柱纯化来自实施例3A的溶液，2次色谱运行。每次运行上1.5L粗溶液，用50mM NaHCO3 pH9.0EtOH 80/20(流动相A)-50mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20+1.2M NaCl(流动相B)线性梯度洗脱。
梯度：
流速：0.8L/min
检测：290nm
温度：20-25℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分(9L)并通过超滤(UF)浓缩。
UF在来自Millipore的2x 0.57(1.14m2Pellicon2 3kD膜)上进行。将9L的溶液浓缩至约3L，并在Amicon SP 20UF装置中用20L水渗滤至渗透液的最终电导率为35μS/cm。
在Lyostar II冻干机上的lyoguard托盘中，在一个冻干循环中将溶液冻干，得到43g干燥的白色粉末。在21-22℃和38-42％相对湿度下调节4天后，分离总计46.4g GN2-AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′，为白色无定形粉末形式，其含水量为12.7％，纯度为90.2％：LC-System Agilent Technologies1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。
借助接头结构域的2D-1H/13C-NMR光谱，检测到GN2a与GN2b的差向异构体比(请参见第17页)为～64％-～36％。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6891.3。
实施例4B1
GN2-AM-C6-5`-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3′作为其钠盐的纯化
通过IEX色谱法，使用填充Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 30μm的9L柱纯化来自实施例3B的溶液，其中进行47次色谱运行。每次运行上样0.4L粗溶液，并且用50mM NaHCO3 pH9.0EtOH 80/20(流动相A)-50mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20+1.2M NaCl(流动相B)线性梯度洗脱。
梯度：
流速：0.8L/min
检测：290nm
温度：20-25℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分(220L)，并通过超滤(UF)浓缩。
UF在来自Millipore的2x 0.57(1.14m2Pellicon2 3kD膜上进行。将220L该溶液浓缩至约3L，并在Amicon SP 20UF装置中用20L水渗滤至渗透液的最终电导率＜50μS/cm。
如实施例4B2所述，可以将所得浓缩物直接冻干(3-步骤工艺)或通过反相色谱法(RP)进一步纯化。
将来自上述的溶液在一个冻干循环中在Lyostar II冻干机上的两个lyoguard托盘中冻干一次，得到174g干燥的白色粉末。
在21℃和50％相对湿度下调节2天后，分离总计203.9g GN2-AM-C6＊-5`-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′，为其钠盐，为白色无定形粉末，其含水量为16.2％，纯度为89.0％面积(LC-System Agilent Technologies 1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。借助于接头结构域的2D-1H/13C-NMR光谱，检测到GN2a与GN2b的差向异构体比(请参见第17页)为～43.9％-～56.1％。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITYH-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50 mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6633.3。
实施例4B2
采用反相色谱法(RP)进一步纯化来自实施例4B1的1.6g冻干粉末。
将该材料溶解在16ml 0.2M乙酸钠中，并在YMC Triart制备型C8-S(10μm250x30mm柱)上进行两次色谱分离。每次运行中均应用8ml溶液，并用线性梯度0.2M乙酸钠(流动相A)-乙腈(流动相B)洗脱。
梯度：
流速：30mL/min
检测：290nm
温度：20-25℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分，浓缩并通过超滤(UF)在Amicon Ultra-15离心过滤器3kD上进行渗滤。将得到的浓缩物冻干，得到0.9g白色无定形粉末，通过实施例4B1中所述的分析方法测定其纯度为93.9％a/a。
实施例4C
色谱纯化的顺序可以互换。从反相色谱法(RP)开始纯化，然后再进行离子交换色谱(IEX)纯化产生与先进行IEX、再进行RP色谱分析相同的收率和纯度。
第1次色谱-RP：将来自实验例3D的1g样品溶于10ml 0.2M乙酸钠中，并使用反相(RP)色谱法在YMC Triart制备型C18-S，10μm 250x4.6mm柱上进行50次运行的色谱纯化。每次运行中均上样0.2ml溶液，并用线性梯度0.2M乙酸钠(流动相A)-乙腈(流动相B)洗脱。
梯度：
流速：0.7mL/min
检测：310nm
温度：45℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分(250ml)，浓缩(150ml)，并在配备0.1m2Millipore Pellicon II膜(3kDa)的GE交叉流装置上通过超滤(UF)用1.5L水渗滤。将所得浓缩物冻干，得到0.375g白色无定形粉末，其纯度通过实施例4B1中所述的分析方法测定为91.3％a/a。
第2次色谱-IEX：通过阴离子交换色谱法进一步纯化0.355g该物质。将该物质溶于10ml 50mM碳酸氢钠pH9.0/EtOH 80/20中，并在填充Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 30μm(10x220mm)的柱上进行11次运行的纯化，线性梯度为50mM NaHCO3 pH 9.0EtOH 80/20(流动相A)-50mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20+1.2M NaCl(流动相B)。
梯度：
/>
流速：1.3mL/min
检测：300nm
温度：30℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分(150ml)，并在配备0.1m2Millipore PelliconII膜(3kDa)的GE交叉流装置上通过超滤(UF)用1.5L水渗滤。将得到的浓缩物冻干，得到0.246g白色无定形粉末，通过实施例4B1中所述的分析方法测定其纯度为92.8％a/a。
实施例4D
第1次色谱-IEX：将1g来自实验例3D的物质溶于10ml 0.2M乙酸钠中，并在填充Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 30μm(10x220mm)的柱上进行34次运行的纯化，线性梯度为50mM NaHCO3 pH 9.0EtOH 80/20(流动相A)-50mM NaHCO3pH 9.0/EtOH 80/20+1.2M NaCl(流动相B)。
梯度：
流速：1.3mL/min
检测：300nm
温度：30℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分(250ml)，浓缩(150ml)，并在配备0.1m2Millipore Pellicon II膜(3kDa)的GE交叉流装置上通过超滤(UF)用1.5L水渗滤。将得到的浓缩物冻干，得到0.292g白色无定形粉末，用实施例4B1中所述的分析方法测定其纯度为87.7％a/a。
第2次色谱-RP：将0.272g的该物质溶于3ml 0.2M乙酸钠中，并使用反相(RP)色谱法在YMC Triart制备型C18-S 10μm 250x4.6mm柱上进行18次运行的色谱纯化。每次运行中均上样0.18ml溶液，并用线性梯度0.2M乙酸钠(流动相A)-乙腈(流动相B)洗脱。
梯度：
流速：0.7mL/min
检测：310nm
温度：45℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分(150ml)，并在配备0.1m2 MilliporePelliconII膜(3kDa)的GE交叉流装置上通过超滤(UF)用1.5L水渗滤。将得到的浓缩物冻干，得到0.19g白色无定形粉末，通过实施例4B1中所述的分析方法测定其纯度为93.7％。
实施例4E1
将来自实施例3E的溶液在9L柱上通过IEX色谱进行纯化，该柱填充Tosoh TSK GelSuper Q-5PW 30μm，共进行了8次色谱运行。每次运行中均上样0.3-0.38L的粗溶液，并用线性梯度50mM NaHCO3pH 9.0EtOH80/20(流动相A)-50mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20+1.2MNaCl(流动相B)洗脱。
梯度：
/>
流速：0.8L/min
检测：294nm
温度：20-25℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分(48L)，并通过超滤(UF)浓缩。
UF在购自Sartorius的2x 0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜上进行。将48L的溶液浓缩至1.4L，并在GE交叉流超滤装置上用水进行渗滤至渗透液的最终电导率＜50μS/cm。
在Lyostar II冻干机上的lyoguard托盘中，在一个冻干循环中将溶液冻干，得到51g干燥的白色粉末。在21℃和50％相对湿度下调节2天后，分离总计60.5g GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`作为其钠盐的形式，为白色无定形粉末，含水量为15.7％，纯度为85.4％面积(LC-System Agilent Technologies1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。借助于接头结构域的2D-1H/13C-NMR光谱，检测到GN2a与GN2b的差向异构体比(请参见第17页)为～50.8％-～49.2％。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 7793.4。
实施例4E2
使用RP色谱法进一步纯化来自实施例4E1的0.5g冻干粉末。
将该材料溶解在3.3ml的0.2M乙酸钠中，并在YMC Triart制备型C8-S(10μm250x4.6mm柱上进行33次色谱运行分离。每次运行中均应用0.1ml该溶液，并用线性梯度0.2M乙酸钠(流动相A)-乙腈(流动相B)洗脱。
梯度：
流速：0.7mL/min
检测：290nm
温度：45℃
根据洗脱特性收集级分。将级分合并(100ml)，用水(400ml)稀释，浓缩(150ml)，并在配备来自Sartorius的2x 0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜的GE交叉流装置上通过超滤(UF)用1.5L水渗滤。将得到的浓缩物冻干，得到0.29g白色无定形粉末，通过实施例4E1中所述的分析方法测定其纯度为91.9％a/a。
实施例4E3
制备5.0g GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，其纯度为85.4％a/a，并按照类似于实施例4E1的方式纯化。然后将该物质通过RP色谱法、UF进一步纯化，并通过类似于实施例4E2的方式冻干进行分离，得到2.5gGN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，纯度为89.8％a/a。将该物质溶解在50ml水中后，然后将该无色溶液在Procept喷雾干燥器(120℃)上喷雾干燥，得到1.8gGN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，用实施例4E1中所述的分析方法测定的纯度为89.5％a/a。没有发现通过LC/MS、NMR和EA(元素分析)技术的分析障碍，即在喷雾干燥过程中，材料发生了(部分)分解。作为其结果，可以通过喷雾干燥或冻干在IEX和/或RP色谱和随后的UF之后进行材料分离。
实施例4E4
将按照类似于实施例3E的方式制备的粗GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`的溶液(7.2ml)-其纯度为55.4％a/a-用14.4ml 0.2M乙酸钠稀释，并在YMC Triart C8 prep 120，10μm 250x4.6mm柱上以36次色谱运行进行纯化。由此每次运行上样0.6ml的溶液级分，并用线性梯度0.2M乙酸钠(流动相A)-乙腈(流动相B)洗脱。
梯度：
流速：0.7mL/min
检测：300nm
温度：45℃
合并目标级分(50ml)，并在GE交叉流超滤装置上，在来自Sartorius的0.1m2Sartocon Slice Hydrosart膜上通过超滤浓缩，并用水渗滤至渗透液的最终电导率＜50S/cm。将溶液冻干，得到120mg GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，用实施例4E1中描述的分析方法测定的其纯度为87.6％a/a。
实施例4F1
将来自实施例3F的溶液通过IEX色谱法在9L柱上进行纯化，该柱填充Tosoh TSKGel Super Q-5PW 30μm，分8次色谱运行。每次运行中均上样0.35L的粗溶液，并用线性梯度50mM NaHCO3 pH 9.0EtOH 80/20(流动相A)-50mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20+1.2M NaCl(流动相B)洗脱。
梯度：
流速：0.8L/min
检测：294nm
温度：20-25℃
根据洗脱特性收集级分。合并级分(29L)，并通过超滤(UF)浓缩。
UF在购自Sartorius的2x 0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜上进行。将29L的溶液浓缩至3.2L，并在GE交叉流UF装置上用水进行渗滤至渗透液的最终电导率＜50μS/cm。
在一个冻干循环中，将溶液在Lyostar II冻干机上的两个lyoguard托盘中冻干，得到43g干白色粉末。
在21℃和50％相对湿度下调节2天后，分离总计50.2gGN2-AM-C6-5`-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`，为其钠盐，为白色无定形粉末，含水量为16.4％，纯度为85.0％面积(LC-System Agilent Technologies1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。借助接头结构域的2D-1H/13C-NMR光谱，检测到GN2b的GN2a与GN2b的差向异构体比(参见第17页)为～49.3％-～50.7％。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQB，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 8184.4。
实施例4F2
使用RP色谱法进一步纯化0.5g来自实施例4F1的冻干粉末。
将该材料溶解在3.3.ml的0.2M乙酸钠中，并在YMC Triart制备型C8-S，10μm250x4.6mm柱上进行33次色谱运行分离。每次运行中均应用0.1ml该溶液，并用线性梯度0.2M乙酸钠(流动相A)-乙腈(流动相B)洗脱。
梯度：
流速：0.7mL/min
检测：290nm
温度：45℃
根据洗脱特性收集级分。将级分合并(100ml)，用水(400ml)稀释，浓缩(150ml)，并在配备来自Sartorius的2x 0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜的GE交叉流装置上通过超滤(UF)渗滤(1.5L水)。将得到的浓缩物冻干，得到0.29g白色无定形粉末，其通过实施例4F1中所述的分析方法测定的纯度为91.9％a/a。
实施例5
GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3′作为其钠盐的合成
步骤1：CF3CO-AM-C6-5`c(bz)a(bz)MeC(bz)＊MeC(bz)＊G(dmf)＊t＊a(bz)＊t＊t＊t＊a(bz)＊a(bz)＊c(bz)＊a(bz)＊t＊c(bz)＊A(bz)＊G(dmf)＊A(bz)-3′-UnyLinker作为其二乙铵盐的制备
命名：A，G，T，MeC(5-甲基胞嘧啶)＝LNA；a，t，c，g＝DNA；＊＝硫代磷酸作为非对映异构体混合物；AM-C6＝氨基接头C6；GN2＝GalNAc-聚簇；CF3CO＝TFA＝三氟乙酰基；bz＝苯甲酰基；ibu＝异丁酰基；dmf＝二甲基甲脒
使用AEKTA Oligopilot 100(GE Healthcare，Freiburg，Germany)和PrimerSupport UnyLinker(KinovateHL UnyLinkerTM400，USA)，在固相上以1.90mmol的规模通过标准亚磷酰胺化学生产标题化合物。使用相应的亚磷酰胺和TFA-保护的-氨基接头-亚磷酰胺(Link Technologies，Scotland，UK)生成包含LNA、即2`-OCH2-4`桥接的核苷酸单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)和DNA核苷单体(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，Germany)的寡核苷酸。通常，每次偶联使用1.5eq的DNA/LNA-亚磷酰胺和2.0eq TFA-氨基接头-亚磷酰胺。磷酸硫醇化试剂(Xanthanhydride)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ABCR，AB251827)作为在无水乙腈/吡啶1/1中的0.1M溶液使用。所有其他标准试剂溶液(DCA-debloc，BTT，Cap A，B1，B2，Oxidizer，DEA wash均可商购(Sigma-Aldrich，Merck Millipore，EMP Biotech；请参见下文)。2-氰基乙基的脱保护通过用在无水乙腈中的二乙胺(DEA-wash)洗涤，得到粗的保护的聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸，为二乙铵盐的形式。由此获得的标题化合物在实验2中无需进一步操作即可使用。
标准试剂溶液
步骤2：AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3′作为其钠盐的制备
用180ml浓氢氧化铵水溶液30-32％处理作为其来自实验1的二乙铵盐的粗聚合物-支持物键合的Unylinker-LNA-寡核苷酸。将该混悬液在压力稳定的密闭烧瓶中于60℃搅拌10小时。将该混悬液通过玻璃纤维滤器过滤，并用60ml水洗涤。在40℃/300-10mbar/2h蒸发黄色滤液，得到～14.5g粗寡核苷酸，为铵盐。使用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm2.1x50 mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物身份。UPLC-MS：m/z 6362.1。将总计51个类似制备的1.9mmol批量和2个3.8mmol批量与上述批量合并(总的新批量大小：106.7mmol)，并溶解在一个圆底烧瓶中的4.0L水中。用189ml10.8M NaOH(2.04mol，19.1eq)处理橙色溶液。滤出沉淀的固体，用200ml 水洗涤，并将滤液在40℃/200-60mbar下浓缩，得到～1.5kg粗溶液，将其用2L水处理，并在40℃的真空中蒸馏出相同体积。在40℃/50mbar下，将该操作重复两次，直至蒸馏物的pH达到7-7.5，这表明不存在氨。将混悬液用水稀释，得到10kg混悬液，将其再次过滤，将固体用200ml水洗涤，得到9.67kg棕色溶液(含有理论上7.4％的粗产物(w/w))，其不经进一步纯化将其分几个批次使用。
步骤3：1、RO7191863-001、GN2-AM-C6-5`caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3′作为其钠盐的制备
GalNAc活化：
在20-25℃将82.6g(55.9mmol)GalNAc-聚簇-钠盐溶解在600ml DMF中，在2min过程中加入3.3ml(48.9mmol，1.13eq)磷酸水溶液85％在600ml DMF中的溶液。5min后，在20-25℃下，将9.66g(83.9mmol，1.94eq)N-羟基琥珀酰亚胺添加到无色溶液中，然后添加16.1g(84mmol，1.94eq)EDC·HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺-盐酸盐)1。将无色的略混浊的溶液在20-25℃下搅拌4h，用于偶联步骤。
GalNAc偶联：
向来自实验例2的理论上含有292g(43.3mmol)作为其钠盐的AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3′的3.95kg溶液中，加入70.3ml(402mmol)N-乙基二异丙基胺和1.98L DMSO，将该溶液温热至40-45℃，并在1min内添加到来自上述的活化的GalNAc溶液中。将黄色溶液在40-45℃下搅拌0.5h，得到GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3′作为其钠盐的粗溶液，HPLC显示粗溶液为56.5％面积(LC-System Agilent Technologies 1290Infinity，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，260nm，梯度A：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺，B：水/CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/三乙胺)。
将该溶液储存在4℃直到纯化。储存时，发生残留的苯甲酰胺沉淀，将其滤出，然后纯化。以相同规模重复一次该操作，以半规模重复一次，并将三次单独的反应混合物合并以进行纯化。
步骤4：GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3′作为其钠盐的纯化和分离
使用反相色谱法纯化从GalNAc偶联反应中获得的溶液。在15cm ID DAC柱中装入2.5kg YMC Triart制备型C8-S至柱压为80巴。进料溶液通过下列步骤制备：用0.2M乙酸钠溶液以50/50v/v稀释粗偶联反应体系，然后通过梯度洗脱(进样：400ml进料溶液。梯度：A：0.2M乙酸钠，B：乙腈)以77次运行完全分离。
梯度：
在洗脱目标峰后终止梯度。
流速：700mL/min
检测：300nm
温度：45℃
色谱图指示梯度以及级分切段。收集在c4和c5之间的主要目标级分，同时收集在其他切段之间的次要级分。
将全部级分采集入库。
弃去在c2和c3之间收集的集合物1，同时将其他集合物浓缩并通过用2x Pellicon3Kassetten 0.57m2超滤脱盐。
浓缩：入口压力：3.0巴；出口压力：0.5巴；渗透流速：200ml/min。
脱盐：入口压力：3.0巴；出口压力：0.5巴；渗透流速：50ml/min。
将70L的主要目标库浓缩至3L，渗滤至电导率＜100uS/cm，并在两个冻干液lyoguards中冻干，得到188g冻干粉末(88.70％a/a)。然而，在最终浓缩时，材料开始通过膜。
合并侧级分池，如前所述浓缩和渗滤，并分别冻干，得到120g冻干粉末(88.62％a/a)。
为了获得均匀的材料，将两个批次合并，溶解在3L的水中，并再次冻干，得到305g冻干的粉末(88.80％a/a)。
由于该材料非常易吸湿，因此在气候室中在21℃和50％相对湿度下冻干后，可以对lyoguard进行调节，直至恒重(在48h后达到)。
调节后，分离总计355g GN2-AM-C6-5`-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3′，为其钠盐，纯度为90.35％，含水量为16％，总收率30.7％。使用HPLC测定产物纯度(LC-System Agilent Technologies 1290Infinity Series LC129；柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，；柱温：80℃；采样器温度：15℃；流速0.4mL/min；检测210nm/260nm；流动相A：200mM六氟-2-丙醇+5mM己胺+4mM三乙胺+40μL H3PO4；流动相B：90％MeOH/10％乙腈。
梯度：
/>
采用UPLC-MS(Waters UPLC ACQUITY H-级，Waters MS SQ检测器H-级SQD，柱：Waters ACQUITY/UPLC寡核苷酸BEH C18 130A 1.7μm 2.1x50mm，梯度A：95％水/2.5％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三甲胺，B：17.5％水/80％CH3OH/0.2M六氟-2-丙醇/16.3mmol三乙胺)测定产物的身份。UPLC-MS：m/z 7793.4。

Claims (16)

1.用于制备GaINAc聚簇寡核苷酸缀合物的方法，其包含下列步骤：
a)生产结合至固相支持物的寡核苷酸或其脂族胺盐；
b)从支持物上裂解寡核苷酸并且在氨存在下除去保护基，由此得到未保护的寡核苷酸的铵盐；
c)将寡核苷酸铵盐进行盐交换改变成寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐，由此除去任意游离氨或残留脂族胺；
其中形成寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐的水溶液，且
其中从水溶液中分离寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐
a1)通过蒸发水且随后借助于适合的有机溶剂共沸除去剩余的水来进行，或
b1)使用恒定体积并且添加水，通过连续部分蒸发，至蒸气相的pH达到pH 7来进行，或
c1)通过对碱金属盐或碱土金属盐的水溶液的正切流动过滤来进行，或
d1)通过阴离子交换色谱法、随后脱盐和通过正切流动过滤浓缩来进行，
d)使寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐与下式GalNAc聚簇化合物或其相应的盐、对映体和/立体异构体偶联，
其中R2为氢或羟基保护基，且n为0-10的整数，
且最终
e)纯化GalNAc-聚簇寡核苷酸缀合物，其包含如下步骤次序：
I.色谱
II.浓缩
III.分离
或
I.色谱
II.浓缩
III.色谱
IV.浓缩
V.分离
或
I色谱
II.浓缩
III.分离
IV.色谱
V.浓缩
VI.分离
且
其中寡核苷酸为5’氨基-修饰的寡核苷酸，且
其中5’氨基-修饰剂选自任选氨基被保护的氨基C2-12-烷基连接基或包含1-10个乙二醇单元的氨基乙二醇连接基。
2.权利要求1的方法，其中寡核苷酸由任选修饰的DNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成，并且为7-30个核苷酸长度。
3.权利要求1或2的方法，其中寡核苷酸由DNA或LNA核苷单体或其组合组成，并且为10-25个核苷酸长度。
4.权利要求1的方法，其中在步骤a)中，脂族胺盐为单-、二-或三-C1-4-烷基胺或脂环族胺盐。
5.权利要求4的方法，其中形成二乙胺。
6.权利要求1的方法，其中在步骤b)中，使用氨水。
7.权利要求1的方法，其中式I的GalNAc聚簇化合物为式Ia的碱金属或碱土金属盐
其中M+/++为碱金属或碱土金属阳离子。
8.权利要求1的方法，其中步骤d)中寡核苷酸与GalNAc聚簇化合物或其盐的偶联包括在第一步中用偶联剂活化GalNAc聚簇化合物，并且在第二步中使活化的GalNAc聚簇化合物与寡核苷酸在胺碱和有机溶剂存在下偶联。
9.权利要求8的方法，其中偶联剂为选自如下的偶联剂：DCC(N，N′-二环己基碳二亚胺)或EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N、-乙基碳二亚胺-盐酸盐)或TBTU(N，N，N′，N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐)、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)；且添加剂选自HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)及其组合。
10.权利要求8或9的方法，其中胺碱为叔胺，有机溶剂为极性无质子溶剂，且反应温度在20℃-70℃的范围。
11.权利要求10的方法，其中偶联剂为正丙基膦酸酸酐(T3P)或3-(二乙氧基磷酰基氧基)-1，2，3-苯并[d]三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)与叔胺。
12.权利要求1的方法，其中步骤e)中的GalNAc-聚簇寡核苷酸缀合物的纯化包含步骤色谱、浓缩和分离。
13.权利要求1的方法，其中纯化包含如下步骤次序：
I.色谱
II.浓缩
III.分离
或
I.色谱
II.浓缩
III.色谱
IV.浓缩
V.分离。
14.权利要求1的方法，其中纯化包含如下步骤次序：
I.阴离子交换色谱或反相色谱
II.正切流动过滤
III.冻干或喷雾干燥
或
I.阴离子交换色谱或反相色谱
II.正切流动过滤
III.阴离子交换色谱或反相色谱
IV.正切流动过滤
V.冻干或喷雾干燥。
15.权利要求1的方法，其中寡核苷酸选自：
AM-C6＊-5｀-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′，化合物1
AM-C6-5｀-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3`，化合物2
AM-C6-5｀-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊-t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，化合物5
AM-C6-5｀-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`，化合物6
其中AM-C6是指C6氨基接头；＊表示硫代磷酸桥；A、G、T和MeC(5-甲基胞嘧啶)为LNA核苷单体，且a、t、c、g为DNA核苷单体。
16.权利要求1的方法，其中GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物选自：
GN2-AM-C6＊-5｀-A＊A＊T＊g＊c＊t＊a＊c＊a＊a＊a＊a＊c＊MeC＊MeC＊A-3′，化合物3
GN2-AM-C6-5｀-caG＊MeC＊G＊t＊a＊a＊a＊g＊a＊g＊a＊G＊G-3`，化合物4
GN2-AM-C6-5｀-caMeC＊MeC＊t＊a＊t＊t＊t＊a＊a＊c＊a＊-t＊c＊A＊G＊A＊MeC-3`，化合物7
GN2-AM-C6-5｀-caMeC＊T＊A＊a＊t＊t＊g＊t＊a＊g＊t＊-a＊g＊t＊a＊MeC＊T＊MeC-3`，化合物8
其中AM-C6是指C6氨基接头；＊表示硫代磷酸桥；A、G、T和MeC(5-甲基胞嘧啶)为LNA核苷单体，且a、t、c、g为DNA核苷单体，且GN2为GalNAc聚簇。
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