ES2963907T3 - Procedimiento posterior para conjugados de oligonucleótidos con GalNAc - Google Patents

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Abstract

La invención comprende un proceso para la preparación de conjugados de oligonucleótidos agrupados de GalNAc terapéuticamente valiosos. El proceso comprende el acoplamiento de una sal de metal alcalino, sal de metal alcalinotérreo o una sal de tetraalquilamonio de un oligonucleótido con un compuesto agrupado de GalNAc o con una sal del mismo y una purificación posterior. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento posterior para conjugados de oligonucleótidos con GalNAc
La invención se refiere a un nuevo procedimiento para la preparación de conjugados de oligonucleótidos con agrupaciones de GalNAc.
Recientemente se ha prestado una atención considerable a la conjugación de oligonucleótidos con restos no nucleotídicos que añaden funcionalidad adicional al oligonucleótido, por ejemplo, permitiendo dirigir oligonucleótidos terapéuticos a órganos y tejidos específicosin vivo.Para dirigirse a los hepatocitos hepáticos, se ha descubierto que los restos de conjugación con GalNAc trivalente que se pueden unir a receptores de asialoglucoproteína permiten dosis muy reducidas y al mismo tiempo proporcionan una acción terapéutica eficaz. Dichos conjugados antisentido con agrupaciones de GalNAc se describen, por ejemplo, en la publicación PCT WO 2012/083046, los documentos WO 2014/118267, WO 2014/076195, WO 2015/173208, WO 2017/055423, WO 2017/021385, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. US 2011/0207799 o en Prakashet al.J. of Med.Chem. 59, 6, 2016, p.2718-2733.
Si bien estas publicaciones divulgan procedimientos para la preparación de conjugados de oligonucleótidos con agrupaciones de GalNAc, se descubrió que estos procedimientos no cumplen el estándar para una síntesis a escala técnica.
Por lo tanto, el objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento mejorado para la preparación de conjugados de oligonucleótidos con agrupaciones de GalNAc que cumplan los requisitos de un procedimiento a escala industrial.
El procedimiento para la preparación de un conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc comprende las etapas de:
a) producir un oligonucleótido o una sal de amina alifática del mismo unido a un soporte en fase sólida;
b) escindir el oligonucleótido del soporte y retirar los grupos protectores en presencia de amoníaco, proporcionando de este modo la sal de amonio del oligonucleótido desprotegido;
c) realizar un cambio de intercambio de sales de la sal de amonio del oligonucleótido a una sal de metal alcalino o sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido, retirando de este modo cualquier amoníaco libre o amina alifática residual,
en el que se forma una solución acuosa de la sal de metal alcalino o de metal alcalinotérreo del oligonucleótido y
en el que el aislamiento de la sal de metal alcalino o de la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido de la solución acuosa tiene lugar
a1) por evaporación del agua y posterior retirada azeotrópica del agua restante con la ayuda de un disolvente orgánico adecuado o
b1) por evaporación parcial continua (por volumen constante y adición de agua) hasta que el pH de la fase de vapor alcance un pH 7 o
c1) por filtración de flujo tangencial contra soluciones acuosas de sales de metales alcalinos o de sales de metales alcalinotérreos o bien
d1) por cromatografía de intercambio aniónico seguida de desalinización y concentración por medio filtración de flujo tangencial;
d) acoplar la sal de metal alcalino o la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido con el compuesto de agrupación de GalNAc o con una sal del mismo de fórmula
en la que R2 es hidrógeno o un grupo protector de hidroxi y n es un número entero de 0 a 10, sales, enantiómeros y/ estereoisómeros correspondientes del mismo,
y finalmente
e) purificar el conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc que comprende la secuencia de las etapas
I. cromatografía
II. concentración
III. aislamiento
o
I. cromatografía
II. concentración
III. cromatografía
IV. concentración
V. aislamiento
o
I. cromatografía
II. concentración
III. aislamiento
IV. cromatografía
V. concentración
VI. aislamiento
y
en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido modificado con amino en el extremo 5' y
en el que el modificador amino en el extremo 5' se selecciona de un conector aminoalquilo C<2-12>con el grupo amino opcionalmente protegido o un conector aminoetilenglicol que contiene de 1 a 10 unidades de etilenglicol.
Las siguientes definiciones se exponen para ilustrar y definir el significado y alcance de los diversos términos usados para describir la invención en el presente documento.
Siempre que un carbono quiral está presente en una estructura química, se entiende que la estructura engloba todos los estereoisómeros asociados con ese carbono quiral como estereoisómeros puros así como mezclas de los mismos.
El término "alquilo" indica un grupo hidrocarburo saturado lineal o ramificado monovalente de 1 a 12 átomos de carbono. En modos de realización particulares, el alquilo tiene de 1 a 7 átomos de carbono, y en modos de realización más particulares de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo o tere-butilo.
El término "alquilo C<1>-<12>" indica un grupo hidrocarburo saturado lineal o ramificado monovalente de 1 a 12 átomos de carbono y, en modos de realización más particulares, de 1 a 7 átomos de carbono. Los ejemplos de alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo o tere-butilo y pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo y dodecilo y sus isómeros.
El término "amina alifática" indica una mono-, di- o trialquil C1-4-amina, en la que el alquilo C<1-4>se define como anteriormente o una amina alifática cíclica. Ejemplos particulares de mono-, di- o trialquil C1-4-amina son etilamina, dietilamina o trietilamina. Ejemplos particulares de aminas alifáticas cíclicas son las aminas alifáticas cíclicas de cinco miembros tales como pirrolidina o las aminas alifáticas cíclicas de seis miembros tales como piperidina o morfolina.
El término "grupo protector de amino" indica grupos destinados a proteger un grupo amino e incluye benzoílo, benciloxicarbonilo, carbobenciloxi (CBZ o Z), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, terc-butoxicarbonilo (BOC) y trifluoroacetilo. Otros ejemplos de estos grupos se encuentran en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2.a ed., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, 1991, capítulo 7; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry”, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, Nueva York, NY, 1973, capítulo 5 y T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 1981.
El término "grupo protector de hidroxi" y el término "grupo protector de éster" indican grupos destinados a proteger un grupo hidroxi e incluyen grupos formadores de ésteres y éteres, en particular grupos tetrahidropiranilo, acilo, carbamoílo, bencilo y sililéteres (por ejemplo, TBS, TBDPS). Otros ejemplos de estos grupos se encuentran en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2.a ed., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, 1991, capítulo 2-3; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry”, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, Nueva York, NY, 1973, capítulo 5 y T.W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1981. Son preferentes los grupos acilo, en particular un grupo alquil C<1>-<12>-carbonilo, más en particular un grupo alquil C<1>-<6>-carbonilo que está sustituido opcionalmente con alquilo C<1-6>o fenilo. Los grupos protectores de hidroxi más preferentes se pueden seleccionar de acetilo, pivaloílo o benzoílo, con lo que el acetilo es el grupo protector de hidroxi más preferente.
El término "álcali" o "alcalino" engloba los metales alcalinos litio, sodio y potasio, en particular sodio y potasio con preferencia por el sodio.
El término "alcalinotérreo" engloba los metales alcalinotérreos calcio y magnesio, pero en particular calcio.
El término "modificado con amino en el extremo 5'" se usa en conexión con el término "oligonucleótido modificado con amino en el extremo 5'" y determina un grupo amino reactivo unido covalentemente a un conector que, como conector amino, se une al grupo del extremo 5' de un oligonucleótido.
En consecuencia, el modificador amino en el extremo 5' se selecciona de un conector aminoalquilo C<2-12>con el grupo amino opcionalmente protegido o un conector aminoetilenglicol que contiene de 1 a 10 unidades de etilenglicol.
Los grupos protectores de amino adecuados para el oligonucleótido modificado con amino en el extremo 5' son trifluoroacetilo (TFA) o monometoxitritilo (MMT).
Por lo general, el conector amino se introduce por medio de una fosforamidita con conector amino disponible comercialmente, tal como, por ejemplo, por medio de TFA- o MMT-conector C6 fosforamiditas, por ejemplo de Sigma Aldrich, o por medio del modificador amino en el extremo 5' TEG (trietilenglicol) CE fosforoamidita de Glen Research.
El término oligonucleótido, como se usa en el presente documento, tiene una longitud de 7 a 30 nucleótidos y consiste en monómeros de nucleósidos de ADN, ARN o LNA opcionalmente modificados o combinaciones de los mismos.
Los monómeros de nucleósidos de LNA son nucleósidos modificados que comprenden un grupo conector (denominado birradical o puente) entre C2' y C4' del anillo glucídico de ribosa de un nucleótido. Estos nucleósidos también se denominan ácido nucleico con puente o ácido nucleico bicíclico (BNA) en la literatura.
Opcionalmente modificado, como se usa en el presente documento, se refiere a nucleósidos modificados en comparación con el nucleósido de ADN, ARN o LNA equivalente por la introducción de una o más modificaciones del resto de glúcido o del resto de base nitrogenada. En un modo de realización preferente, el nucleósido modificado comprende un resto de glúcido modificado y puede comprender, por ejemplo, uno o más nucleósidos sustituidos en 2' y/o uno o más nucleósidos de LNA. El término nucleósido modificado también se puede usar en el presente documento de manera intercambiable con el término "análogo nucleosídico" o "unidades" modificadas o "monómeros" modificados.
Por lo general, los nucleósidos de ADN, ARN o LNA se enlazan por un enlace internucleosídico fosfodiéster (P=O) y/o fosforotioato (P=S) que acopla covalentemente dos nucleósidos.
En consecuencia, en algunos oligonucleótidos, todos los enlaces internucleosídicos pueden consistir en un fosfodiéster (P=O), en otros oligonucleótidos, todos los enlaces internucleosídicos pueden consistir en un fosforotioato (P=S) o, todavía en otros oligonucleótidos, la secuencia de los enlaces internucleosídicos varía y comprende tanto enlaces internucleosídicos fosfodiéster (P=O) como fosforotioato (P=S).
Los restos de bases nitrogenadas se pueden indicar por el código de letras para cada base nitrogenada correspondiente, por ejemplo, A, T, G, C o U, en el que cada letra puede incluir opcionalmente bases nitrogenadas modificadas de función equivalente. Por ejemplo, en los oligonucleótidos ejemplificados, los restos de bases nitrogenadas se describen con letras mayúsculas A, T, G y MeC (5-metil citosina) para el nucleósido de LNA y con letras minúsculas a, t, g, c y Mec para los nucleósidos de ADN. Las bases nitrogenadas modificadas incluyen, pero no se limitan a, bases nitrogenadas que portan grupos protectores tales como ferc-butilfenoxiacetilo, fenoxiacetilo, benzoílo, acetilo, isobutirilo o dimetilformamidino (véase Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese del 24 de marzo de 2016).
Preferentemente, el oligonucleótido consiste en monómeros de nucleósidos de ADN o LNA opcionalmente modificados o combinaciones de los mismos y tiene una longitud de 10 a 25 nucleótidos.
Etapa a):
La etapa a) requiere la producción de un oligonucleótido o una sal de amina alifática del mismo sobre un soporte en fase sólida.
Los principios de la síntesis de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y están bien descritos en la literatura y son públicos como, por ejemplo, en Wikipedia (véase, por ejemplo, Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonudeotide_synthesis del 15 de marzo de 2016). Hoy en día, la síntesis de oligonudeótidos a gran escala se lleva a cabo automáticamente usando sintetizadores controlados por ordenador.
Por lo general, la síntesis de oligonucleótidos es una síntesis en fase sólida, en la que el oligonucleótido que se ensambla se enlaza covalentemente, por medio de su grupo hidroxi del extremo 3', a un material de soporte sólido y permanece fijado a él durante todo el transcurso del ensamblaje de la cadena. Los soportes adecuados son los soportes de poliestireno macroporoso disponibles comercialmente como el soporte Primer 5G de GE Healthcare o el soporte NittoPhase®HL de Kinovate.
En principio, la síntesis de oligonucleótidos es una adición escalonada de residuos nucleotídicos al extremo 5' de la cadena en crecimiento hasta que se ensambla la secuencia deseada.
Por lo general, cada adición se denomina ciclo sintético y, en principio, consiste en las reacciones químicas ai) desbloquear el grupo hidroxilo protegido en el soporte sólido,
a<2>) acoplar el primer nucleósido como fosforamidita activada con el grupo hidroxilo libre en el soporte sólido, a3) oxidar o sulfurar el nucleósido respectivo con enlaces P-glucosídicos para formar el respectivo fosfotriéster (P=O) o el respectivo fosforotioato (P=S);
a4) opcionalmente, bloquear cualquier grupo hidroxilo sin reaccionar en el soporte sólido;
as) desbloquear el grupo hidroxilo en 5' del primer nucleósido fijado al soporte sólido;
a6) acoplar el segundo nucleósido como fosforamidita activada para formar el respectivo dímero con enlaces P-glucosídicos;
a7) oxidar o sulfurar el dinucleósido respectivo con enlaces P-glucosídicos para formar el respectivo fosfotriéster (P=O) o el respectivo fosforotioato (P=S);
a8) opcionalmente, bloquear cualquier grupo hidroxilo en 5' sin reaccionar;
ag) repetir las etapas a5 a a8 previas hasta ensamblar la secuencia deseada.
Los monómeros de fosforamidita aplicados se muestran a continuación y representan un modo de realización preferente de la presente invención.
En un modo de realización preferente de la presente invención, el oligonucleótido se produce en forma de una sal de amina alifática.
La sal de amina alifática se obtiene después de la etapa de desprotección (retirada del grupo protector de P de 2-cianoetilo) con la respectiva amina alifática.
Las aminas alifáticas adecuadas son las mono-, di- o trialquil C1-4-aminas o aminas alifáticas cíclicas como se define anteriormente.
Preferentemente se usan las mono-, di- o trialquil C1-4-aminas, más preferentemente las dialquil C1-4-aminas y, en particular, dietilamina.
En consecuencia, en un modo de realización más preferente de la presente invención, el oligonucleótido se produce en forma de una sal de dietilamina.
Etapa b):
La etapa b) requiere escindir el oligonucleótido del soporte y retirar los grupos protectores.
La escisión del oligonucleótido del soporte y la retirada de los grupos protectores (grupos protectores de bases nitrogenadas y grupos protectores de modificadores amino) se realiza convenientemente con amoníaco acuoso, proporcionándose de este modo la sal de amonio del oligonucleótido. Por lo general, se aplica una solución concentrada de amoníaco acuoso y temperaturas de reacción elevadas de entre 40 °C y 80 °C.
La sal de amonio bruta del oligonucleótido se puede obtener a continuación por medio de separación de la mezcla de reacción por filtración, una etapa de lavado con agua y/o un alcohol alifático y posterior retirada del disolvente por evaporación.
Etapa c):
La etapa c) requiere realizar un cambio de intercambio de sales de la sal de amonio del oligonucleótido a una sal de metal alcalino o sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido, retirando de este modo cualquier amoníaco libre o amina alifática residual,
De acuerdo con un modo de realización de la presente invención, se forma la sal de metal alcalino. El intercambio de sales se realiza a continuación convenientemente con un hidróxido de metal alcalino.
Los hidróxidos alcalinos adecuados son hidróxido de litio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, pero preferentemente hidróxido de sodio.
Por lo general, el intercambio de sales sucede a temperatura ambiente o a una temperatura ligeramente elevada en un entorno acuoso; por lo tanto, se aplica una solución acuosa del hidróxido respectivo.
De acuerdo con otro modo de realización de la presente invención, se forma la sal de metal alcalinotérreo. El intercambio de sales se realiza a continuación convenientemente con un hidróxido acuoso de metal alcalinotérreo.
Los hidróxidos de metales alcalinotérreos adecuados son hidróxido de calcio o hidróxido de magnesio, pero preferentemente hidróxido de calcio.
Por lo general, el intercambio de sales sucede a temperatura ambiente o a una temperatura ligeramente elevada en un entorno acuoso; por lo tanto, se aplica preferentemente una solución acuosa del hidróxido respectivo.
En un modo de realización preferente, se forma la sal de metal alcalino, más preferentemente la sal sódica del oligonucleótido.
El tratamiento de la solución acuosa de la sal de metal alcalino o de la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido resultante es muy importante en el sentido de que se retira eficazmente cualquier amoníaco libre o amina alifática residual.
Por lo tanto, de acuerdo con un procedimiento, la solución acuosa de la sal de metal alcalino o de la sal de metal alcalinotérreo se puede aislar por evaporación del agua. La retirada azeotrópica del agua restante con la ayuda de un disolvente orgánico adecuado tal como 2-metil-2-butanol y la evaporación posterior pueden proporcionar una sal de metal alcalino bruta del oligonucleótido. La digestión adicional con un alcohol alifático como metanol o etanol, filtración y lavado con el alcohol alifático respectivo permite obtener una sal de metal alcalino o una sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido que está sustancialmente libre de amoníaco y amina alifática residual y que, por lo tanto, se puede aplicar fácilmente durante la etapa de acoplamiento.
De acuerdo con otro procedimiento, la solución acuosa de la sal de metal alcalino o de la sal de metal alcalinotérreo se puede aislar por evaporación parcial continua (por volumen constante y adición de agua) hasta que el pH de la fase de vapor alcance un pH 7, indicando de este modo que se ha retirado cualquier amoníaco y/o amina alifática restante. La solución resultante proporciona la sal de metal alcalino o la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido sustancialmente libre de amoníaco y amina alifática residual y que, por lo tanto, se puede aplicar fácilmente durante la etapa de acoplamiento en solución.
De acuerdo con otro procedimiento, la solución acuosa de la sal de metal alcalino o de la sal de metal alcalinotérreo se puede aislar por filtración de flujo tangencial o filtración de flujo cruzado contra soluciones acuosas de sal de metal alcalino o de sal de metal alcalinotérreo, tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio (pH 6-8) y mezclas de los mismos. La solución resultante proporciona la sal de metal alcalino o la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido sustancialmente libre de amoníaco y amina alifática residual y que, por lo tanto, se puede aplicar fácilmente durante la etapa de acoplamiento en solución. De forma alternativa, la digestión adicional con un alcohol alifático como metanol o etanol, filtración y lavado con el alcohol alifático respectivo permite obtener una sal de metal alcalino o una sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido que está sustancialmente libre de amoníaco y amina alifática residual y que, por lo tanto, se puede aplicar fácilmente durante la etapa de acoplamiento.
Son preferentes el procedimiento de “evaporación parcial continua” y el procedimiento de “filtración de flujo tangencial o filtración de flujo cruzado” como se describe anteriormente.
De acuerdo con todavía otro procedimiento, la sal de amonio bruta del oligonucleótido se puede purificar por cromatografía de intercambio aniónico seguida de desalinización y concentración por medio de filtración de flujo tangencial o filtración de flujo cruzado. La solución resultante proporciona la sal de metal alcalino o la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido sustancialmente libre de amoníaco y amina alifática residual y que, por lo tanto, se puede aplicar fácilmente durante la etapa de acoplamiento en solución. De forma alternativa, la liofilización de esta solución permite obtener una sal de metal alcalino o una sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido que está sustancialmente libre de amoníaco y amina alifática residual y que, por lo tanto, se puede aplicar fácilmente durante la etapa de acoplamiento.
Las técnicas de purificación de “filtración de flujo tangencial o filtración de flujo cruzado” y “cromatografía de intercambio aniónico” se describen en detalle en la etapa e) a continuación.
Etapa d):
La etapa d) requiere el acoplamiento de la sal de metal alcalino o la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido
en la que R2 es hidrógeno o un grupo protector de hidroxi y n es un número entero de 0 a 10, sales, enantiómeros y/o estereoisómeros correspondientes del mismo.
Los grupos protectores de hidroxi adecuados son acilo, en particular el grupo alquil C<1>-<12>-carbonilo, más en particular el grupo alquil C<1>-<6>-carbonilo que está sustituido opcionalmente con alquilo C<1-6>o fenilo. Más preferente es acetilo, pivaloílo o benzoílo, con lo que el acetilo es el grupo protector de hidroxi más preferente.
n es preferentemente un número entero de 0 a 5, más preferentemente de 1 a 3, pero lo más preferente es 2. En un modo de realización preferente, el compuesto de agrupación de GalNAc de fórmula I es una sal de metal alcalino o de metal alcalinotérreo de fórmula Ia,
en la que M+/++ es el catión de un metal alcalino o de un metal alcalinotérreo, pero preferentemente es sodio.
Los compuestos de agrupación de GalNAc se pueden preparar como sigue:
Inicialmente, se puede preparar un precursor de éster bencílico del compuesto de agrupación de GalNAc de acuerdo con el esquema 1 a continuación. La hidrogenólisis posterior del éster bencílico por medio de una hidrogenación catalítica con hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación tal como, por ejemplo, con paladio sobre carbón vegetal proporciona un derivado ácido de agrupación de GalNAc protegido con acetilo de fórmula I.
Esquema 1:
Se puede preparar una sal de agrupación de GalNAc de fórmula I de acuerdo con el esquema 2 a continuación.
La reacción de acoplamiento de la sal de metal alcalino o de metal alcalinotérreo del oligonucleótido con el compuesto de agrupación de GalNAc de fórmula I engloba en una primer etapa la activación del compuesto de agrupación de GalNAc con el agente de acoplamiento y, en una segunda etapa, el acoplamiento del compuesto de agrupación de GalNAc activado con la sal de metal alcalino o la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido en presencia de una base de amina y un disolvente orgánico.
El agente de acoplamiento se selecciona de DCC (W,W'-diciclohexilcarbodiimida) o EDC (clorhidrato de W-(3-dimetilaminopropil)-W-etilcarbodiimida) o TBTU (tetrafluoroborato de N,W,W,W-tetramet¡l-0-(benzotr¡azoM-¡l)uron¡o, HBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio) y un aditivo seleccionado de HOBt (1-hidroxibenzotriazol), HOSu (W-hidroxisuccinimida) o HOAt (1-hidroxi-7-azabenzotriazol) y combinaciones frecuentes de los mismos tales como TBTU/HOBt o HBTU/HOAt.
En un modo de realización preferente, el agente de acoplamiento se selecciona de EDC (clorhidrato de W-(3-dimetilaminopropil)-W-etilcarbodiimida) y HOSu (W-hidroxisuccinimida) como aditivo.
La activación se tiene que realizar en un entorno ácido. Los ácidos adecuados son ácidos minerales tales como ácido ortofosfórico o ácidos orgánicos tales como ácido metanosulfónico y un disolvente aprótico polar adecuado tal como WW-dimetilformamida. La temperatura de reacción se puede seleccionar entre 10 °C y 40 °C.
Para el acoplamiento, la base de amina es normalmente una amina terciaria, como trietilamina o W-etildiisopropilamina, derivados de piridina tales como 2,4,6-colidina o DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano), pero preferentementeW-etildiisopropilamina. La reacción tiene lugar en un disolvente aprótico polar como acetonitrilo, dimetilsulfóxido o tetrahidrofurano o mezclas de los mismos a temperaturas de reacción en el intervalo de 20 °C a 70 °C.
De forma alternativa, se selecciona el trímero de anhídrido de ácido n-propilfosfónico (T3P) o (3-(dietoxi-fosforiloxi)-1,2,3-benzo[d]triacina-4(3H)-ona (DEPBT) como agente de acoplamiento conjuntamente con una base de amina terciaria como trietilamina o W-etildiisopropilamina, pero preferentemente conW-etildiisopropilamina.
La filtración de la mezcla de reacción proporciona un conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc que contiene un filtrado que se puede usar en la etapa de purificación posterior.
Etapa e):
La etapa e) requiere purificar el conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc que comprende la secuencia de las etapas
I. cromatografía
II. concentración
III. aislamiento
o
I. cromatografía
II. concentración
III. cromatografía
IV. concentración
V. aislamiento
o
I. cromatografía
II. concentración
III. aislamiento
IV. cromatografía
V. concentración
VI. aislamiento
Es preferente el procedimiento de purificación que comprende la secuencia I. a V.
Aún más preferentes son los procedimientos de purificación que comprenden la secuencia de las etapas I. cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de fase inversa
II. filtración de flujo tangencial
III. liofilización o secado por pulverización
o
I. cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de fase inversa
II. filtración de flujo tangencial
III. cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de fase inversa
IV. filtración de flujo tangencial
V. liofilización o secado por pulverización.
Los procedimientos de purificación mencionados anteriormente son frecuentes y bien conocidos por los expertos en la técnica de la presente invención.
El término cromatografía comprende los procedimientos de cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de fase inversa y combinaciones de los mismos.
La cromatografía de intercambio aniónico se basa en la interacción competitiva de iones cargados de la solución de muestra con el medio tampón empleado. Se puede llevar a cabo con resinas de intercambio aniónico convencionales disponibles comercialmente, preferentemente, aquellas con grupo funcional de trimetilamonio. Estos materiales de fase se pueden obtener, por ejemplo, de GE Healthcare, Tosoh Bioscience, Bio-Rad o Merck. Se han logrado buenos resultados, en particular, con la resina de intercambio aniónico TSKgel Super Q-5PW (QAE), disponible de Tosoh Bioscience.
La cromatografía de fase inversa se puede llevar a cabo con materiales de fase tradicionales disponibles comercialmente, tales como sorbentes de gel de sílice modificado como fase estacionaria y disolventes orgánicos adecuados tales como acetonitrilo y, según sea aplicable, un tampón. Los materiales de fase de tipo gel de sílice modificado adecuados se pueden seleccionar de Kromasil™ C18, Kromasil™ C8, YMC Triart C18 y YMC Triart C8. Se han logrado buenos resultados, en particular, con Triart Prep C8-S de YMC.
El término concentración comprende los procedimientos de filtración de flujo tangencial o evaporación y combinaciones de los mismos.
En la filtración de flujo tangencial o filtración de flujo cruzado, la alimentación pasa a través de la membrana filtrante (tangencialmente) a presión positiva con respecto al lado del permeado. Una proporción del material que es más pequeña que el tamaño de poro de la membrana pasa a través de la membrana como permeado o filtrado; todo lo demás se retiene en el lado de alimentación de la membrana como retenido. Los principios de la filtración de flujo tangencial también se usan en procedimientos de nanofiltración, ultrafiltración, diafiltración y microfiltración. Hay membranas adecuadas disponibles comercialmente, por ejemplo, de Merck Millipore bajo el nombre comercial Pellicon™. Las membranas adecuadas tienen un peso molecular de corte (MWCO) de <3 kDA. Son preferentes las membranas Pellicon 2 y 3 de Merck Millipore con un MWCO de 1 kDA o 3 kDA, respectivamente.
El término aislamiento comprende los procedimientos de liofilización, precipitación, secado por pulverización y evaporación. Todos estos términos son bien conocidos para los expertos en la técnica.
En un modo de realización no limitante, el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en:
AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' (compuesto 1)
AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (compuesto 2)
AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' (compuesto 5)
AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' (compuesto 6)
en el que AM-C6 significa un conector amino C6; * representa puentes de fosforotioato; A, G, T y MeC (5-metilcitosina) son monómeros de nucleósidos de LNA y a, t, c, g son monómeros de nucleósidos de ADN. En un modo de realización no limitante, el conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc se puede seleccionar del grupo que consiste en:
GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' (compuesto 3)
GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (compuesto 4)
GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' (compuesto 7)
GN2-AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' (compuesto 8)
en el que AM-C6 significa un conector amino C6; * representa puentes de fosfortioato; A, G, T y MeC (5-metilcitosina) son monómeros de nucleósidos de LNA y a, t, c, g son monómeros de nucleósidos de ADN y GN2 es el resto de agrupación de GalNAc que se puede producir en forma de los estereoisómeros GN2a o GN2b, o mezclas de los mismos de la fórmula a continuación, en la que R significa la cola del AM-C6-oligonucleótido.
Los compuestos divulgados en el presente documento tienen una secuencia de bases nitrogenadas seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1, 2, 3 y 4.
SEQ ID NO 1: aatgctacaaaaccccca (ejemplos 1A, 2A, 3A, 4A)
SEQ ID NO 2: cagcgtaaagagagg (ejemplos 1B, 2B, 3B, 4B1,4B2, 1C, 2C, 3C, 1D, 2D, 3D, 4C, 4D, 1E, 2E, 1F, 2F) SEQ ID NO 3: cacctatttaacatcagac (ejemplos 1G, 11, 1J, 2G, 2I, 2J, 3E, 3G, 4E1, 4E2, 4E3, 4E4, 5)
SEQ ID NO 4: «ictaattgtagtagtactc<( e j e m p | o s 1 H ,>2H, 3F, 4F1,4F2).
Ejemplos
Abreviaturas:
AcOH ácido acético
DMAP 4-(dimetilamino)-piridina
DMF N,N-dimetilformamida
EtOH etanol
MeOH metanol
t.a. temperatura ambiente
THF tetrahidrofurano
TBME éter ferc-butil-metílico
ACN acetonitriloPreparación del precursor del compuesto de agrupación de GalNAc
Componente básico A:
Ejemplo A1
(2S)-6-(ferc-butox¡carbon¡lam¡no)-2-(9H-fluoren-9-¡lmetox¡carbon¡lam¡no)hexanoato de bencilo
Se suspend¡eron 234,0 g (500,0 mmol) de ác¡do (2S)-6-(terc-butox¡carbon¡lam¡no)-2-(9H-fluoren-9-¡lmetox¡carbon¡lam¡no)hexano¡co en 500 ml de d¡clorometano, se añad¡eron 62,0 ml (600 mmol, 1,2 eq.) de alcohol bencíl¡co y 3,05 g de DMAP (25,0 mmol, 0,05 eq.). Se enfr¡ó la soluc¡ón a 0-5 °C en el transcurso de 40 m¡n, se añad¡ó gota a gota una soluc¡ón de 108,0 g (525,0 mmol, 1,05 eq.) de N,W-d¡c¡clohex¡lcarbod¡¡m¡da en 500 ml de d¡clorometano. Se agitó la suspens¡ón blanca durante 1 h a 0-5 °C y, a cont¡nuac¡ón, durante 15 h a temperatura amb¡ente. Se f¡ltró la suspens¡ón sobre un f¡ltro de v¡dr¡o G3, se lavó la torta de f¡ltrado blanca por porc¡ones con un total de 250 ml de d¡clorometano. Se evaporó el f¡ltrado a 650-10 mbar/1 h para obtener un ace¡te amar¡llo, que se d¡solv¡ó en 2,0 l de acetato de et¡lo, se extrajo con 2,0 l de ác¡do clorhídr¡co 0,5 M, 2,0 l de NaHCO3 1 M y 1,0 l de salmuera, se evaporó la capa orgán¡ca a sequedad a 40 °C/150-10 mbar/5 h para obtener 291,1 g de (2S)-6-(ferc-butox¡carbon¡lam¡no)-2-(9H-fluoren-9-¡lmetox¡carbon¡lam¡no)hexanoato de benc¡lo en bruto como un sólido blanco con un 104 % de rend¡m¡ento y un 96,4 % de pureza (% del área por HPLC; cont¡ene aprox. 5 % de alcohol bencíl¡co). Se usó el mater¡al en la s¡gu¡ente etapa s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal. EM: m/z = 459,22735 (M-Boc+H)+.
Ejemplo A2
Sal de ác¡do metanosulfón¡co de (2S)-2-am¡no-6-(ferc-butox¡carbon¡lam¡no)hexanoato de benc¡lo
Se d¡solv¡eron 291,1 g (500,0 mmol) de (2S)-6-(ferc-butox¡carbon¡lam¡no)-2-(9H-fluoren-9-¡lmetox¡carbon¡lam¡no)hexanoato de benc¡lo (pureza por HPLC; 95,8 %; cont¡ene aprox. 5 % de alcohol bencíl¡co) en 1,4 l de THF a temperatura amb¡ente. Dentro de 10 m¡n, se añad¡eron 1,04 l de d¡et¡lam¡na (10,0 mol, 20 eq.), se agitó la soluc¡ón de color amar¡llo claro durante 2 h a temperatura amb¡ente y, a cont¡nuac¡ón, se evaporó a 40 °C/200-10 mbar, se añad¡eron 200 ml de aceton¡tr¡lo y se evaporó nuevamente para retirar eficazmente la d¡et¡lam¡na a 40 °C/100-10 mbar/1 h. F¡nalmente, se obtuv¡eron 268,1 g de un ace¡te amar¡llo, que se d¡solv¡ó en 2,5 l de aceton¡tr¡lo, ag¡tando durante 10 m¡n a temperatura amb¡ente. Se f¡ltraron las partículas ¡nsolubles sobre un filtro de f¡bra de v¡dr¡o y se lavaron con 500 ml de acetonitrilo. Se trató el filtrado gota a gota en el transcurso de 10 min con 34,0 ml de ácido metanosulfónico a 20 °C-25 °C. Se agitó la suspensión blanca formada durante 17 h a temperatura ambiente y se filtró sobre un filtro de vidrio G3. Se lavó la torta de filtrado por porciones con 500 ml de acetonitrilo. Se secaron los cristales blancos a 40 °C/15 mbar/4 h para obtener 195,8 g de sal de ácido metanosulfónico de (2S)-2-amino-6-(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoato de bencilo como cristales blancos con un 91 % de rendimiento (2 etapas) y un 99,3 % de pureza (% del área por HPLC). EM: m/z = 337,2149 (M+H)+.
Ejemplo A3
(2S)-2-[[(2S)-2,6-bis(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoil]amino]-6-(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoato de bencilo
Se suspendieron 190,0 g (439,0 mmol) de sal de ácido metanosulfónico de (2S)-2-amino-6-(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoato de bencilo en 1,9 l de THF a temperatura ambiente. Se añadieron 335 ml (1,98 mol, 4,5 eq.) de /V-etildiisopropilamina, con lo que disminuyó ligeramente la temperatura hasta 15 °C. A continuación, se añadieron 213 g (615 mmol, 1,4 eq.) de ácido (S)-2,6-bis((ferc-butoxicarbonil)amino)hexanoico y se agitó la suspensión blanca a temperatura ambiente durante 20 min. Se añadieron gota a gota 390 ml de anhídrido del ácido n-propilfosfónico (T3P como trímero cíclico al 50 % en acetato de etilo, 659 mmol, 1,5 eq.) en el transcurso de 20 min a 20-25 °C (enfriado en un baño de agua fría). Se agitó la solución turbia de color amarillo claro resultante a temperatura ambiente durante 1,5 h, se transfirió a un embudo de separación, se diluyó con 1,9 l de TBME y se extrajo con 1,9 l de agua, 1,9 l de ácido clorhídrico 0,5 M, 1,9 l de NaOH 0,5 M, 1,9 l de agua y 1,9 l de salmuera. Se filtró la capa orgánica separada, todavía turbia, sobre un filtro de fibra de vidrio, se lavó el filtro con 100 ml de TBME y se evaporaron los filtrados combinados a 40 °C/100 mbar/1 h, se añadió de nuevo 1,0 l de TBME (para retirar el agua de forma azeotrópica) y se evaporó a 40 °C/250-10 mbar/1 h para obtener 296,4 g en bruto como un residuo sólido blanco.
Se trató el sólido en bruto con 500 ml de acetonitrilo y se calentó la solución turbia a 60-65 °C durante 10 min. Se enfrió la mezcla a 20-25 °C, se agitó durante 10 min, se filtró sobre un filtro de fibra de vidrio y se lavó con 50 ml de acetonitrilo. Se evaporó la solución de color amarillo claro a 40 °C/100-10 mbar/4 h para obtener 295 g de (2S)-2-[[(2S)-2,6-bis(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoil]amino]-6-(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoato de bencilo como un sólido blanquecino con un 101 % de rendimiento (pureza por HPLC: 100 %, pureza del diastereómero (SS): 98,6 %) que se usó sin purificación adicional en la siguiente etapa. EM: m/z = 565,3741 (M-Boc+H)+.
Ejemplo A4
Sal de ácido trimetanosulfónico de (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoil]amino]hexanoato de bencilo
Se suspendieron 124,0 g (187 mmol) de (2S)-2-[[(2S)-2,6-bis(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoil]amino]-6-(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoato de bencilo en 1,25 l de acetonitrilo. Se añadieron 61,0 ml (935,0 mmol, 5,0 eq.) de ácido metanosulfónico a 20-25 °C en el transcurso de 10 min (evolución de gas). Se calentó la suspensión naranja resultante en 40 min a 55-60 °C y se agitó durante 1 h adicional a 55-60 °C. Se enfrió la emulsión de color anaranjado rojizo a temperatura ambiente (se controló la eliminación de Boc por 1H-RMN) y se usó sin purificación adicional en la etapa de ensamblaje A+B, ejemplo 8. EM: m/z = 365,2558 (M+H)+.
Componente básico B:
Ejemplo B1a
2-[2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi]acetato de bencilo
Se disolvieron 30,0 g (200,0 mmol) de 2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etanol en 50 ml de DMF a 20-25 °C y, a continuación, se añadieron 46,0 ml de metóxido de sodio al 25 % (200,0 mmol, 1,0 eq.) en metanol. Se evaporó la solución formada a 40 °C/50 mbar/0,5 h (retirada de 40 ml de disolvente), se añadieron nuevamente 50 ml de DMF y se evaporó a 40 °C/20 mbar/0,5 h (retirada de 15 ml de disolvente). A la suspensión ligeramente gelatinosa se le añadió una solución de 13,9 g de ácido bromoacético (100 mmol, 0,5 eq.) en 50 ml de DMF a 20-25 °C y se agitó la mezcla durante 6 h. Se añadieron 11,9 ml de bromuro de bencilo (100 mmol, 0,5 eq.) y se agitó la mezcla durante otras 16 h a 20-25 °C. A continuación, se trató la mezcla de reacción con 200 ml de salmuera y se extrajo con 200 ml de TBME. Se extrajo la capa de TBME separada con 200 ml de salmuera, a continuación se secó la capa de TBME separada con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó a 40 °C/300-10 mbar/1 h para obtener 23,9 g de 2-[2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi]acetato de bencilo bruto.
Después de la cromatografía (600 g de sílice 60 [0,063-0,2 mm], fase móvil: acetato de etilo), se aislaron un total de 7,85 g de 2-[2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi]acetato de bencilo como un aceite incoloro con un 13 % de rendimiento y un 99,0 % de pureza (% del área por HPLC). EM: m/z = 299,1517 (M+H)+.
Ejemplo B1b
2-[2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi]acetato de bencilo
Se suspendieron 11,2 g de ferc-butilato de potasio (100,0 mmol, 0,5 eq.) en 70 ml de 2-metil-2-butanol (ligeramente exotérmica a 35 °C) y, a continuación, se añadieron 30,0 g (200,0 mmol) de 2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etanol gota a gota en el transcurso de 5 min. Se enjuagó el embudo de decantación con 10 ml de 2-metil-2-butanol (incremento de temperatura a 45 °C), se calentó la solución a 60-65 °C, se añadieron 11,6 g (100 mmol, 0,5 eq.) de cloroacetato de sodio y se agitó durante 16 h a 60-65 °C; a continuación, se añadieron 11,9 ml de bromuro de bencilo (100 mmol, 0,5 eq.) y se agitó la mezcla durante otras 16 h a 60-65 °C. Se enfrió la mezcla de reacción a t.a. y, a continuación, se trató con 50 ml de agua y se extrajo con 80 ml de TBME y 40 ml de TBME. Se lavó la capa combinada de TBME con 50 ml de salmuera semisaturada, se evaporó la capa orgánica a 40 °C/300-10 mbar/1 h para obtener 27,0 g de 2-[2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi]acetato de bencilo bruto.
Después de la cromatografía (270 g de sílice 60 [0,063-0,2 mm], fase móvil: comenzar con acetato de etilo/n-heptano 1/1, cuando el producto puro fue visible, se cambió la fase móvil a acetato de etilo al 100 %), se aisló un total de 11,4 g de 2-[2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi]acetato de bencilo en forma de aceite casi incoloro con un 19 % de rendimiento (38 % a partir del cloroacetato de sodio) y un 99,0 % de pureza (% del área por HPLC).
Ejemplo B2
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]etoxi]ace tato de bencilo
Se disolvieron 268,0 g de 2-(2-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)etoxi)acetato de bencilo (900 mol) en 2,4 l de diclorometano. Se añadieron 385,0 g de triacetato de (2S,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-6-(acetoximetil)tetrahidro-2H-piran-2,4,5-triilo (990 mmol, 1,1 eq.) y 12,0 ml de ácido trifluorometanosulfónico (135 mmol, 0,15 eq.). Se calentó la suspensión a reflujo con un separador Dean-Stark (50 ml, para retirar el AcOH). Después de 1 h, se añadieron 4,50 ml de ácido trifluorometanosulfónico (50,7 mmol, 0,05 eq.) y 50 ml de diclorometano a la suspensión naranja y se descargó el disolvente (50 ml) del separador Dean-Stark. Cada media hora se repitió este procedimiento, hasta un total de 6 veces (3 h). Después de un total de 4,5 h, se enfrió la solución roja a 10-15 °C y se añadió dentro de 30 min a 20-25 °C a una solución de 1,8 l de hidrogenocarbonato de sodio 1 M (1,8 mol, 2,0 eq.) (evolución de CO<2>, pH 7-8). Se separó la capa orgánica amarilla y se evaporó a 40 °C/600-10 mbar/3 h para obtener 585,4 g de 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]etoxi]ace tato de bencilo bruto como un aceite amarillo (pureza por HPLC: 87 %). Se disolvió el producto bruto en 700 ml de acetona y se cargó en una columna de sílice precargada (3,0 kg de sílice 60; 0,063-0,2 mm). Se realizó la cromatografía usando n-heptano/acetona como fase móvil (gradiente de 5:1 a 1:2). Se evaporaron las fracciones recogidas combinadas a 40 °C/600-10 mbar y se secaron a 20-25 °C/0,3 mbar/3 h para obtener 465,0 g de 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrah¡dro-p¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]etox¡]ac etato de benc¡lo como un ace¡te amar¡llo con un 83 % de rend¡m¡ento y un 100 % de pureza (% del área por HPLC). EM: m/z = 628,2627 (M+H)+.
Ejemplo B3
Ác¡do
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrah¡drop¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]etox¡]acé t¡co
Bajo atmósfera de argón, se d¡solv¡eron 456,0 g de 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrah¡dro-p¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]etox¡]ac etato de benc¡lo (727 mmol) en 1,4 l de THF. Se añad¡eron 4,56 g de Pd/C al 10 % y se reemplazó la atmósfera de argón por h¡drógeno (1 bar). Se h¡drogenó la suspens¡ón negra a 20-25 °C durante 2 h. Se reemplazó la atmósfera de h¡drógeno por argón, se f¡ltró la suspens¡ón negra y se lavó la torta de f¡ltrado por porc¡ones con un total de 400 ml de THF. Se usó el f¡ltrado ¡ncoloro (pureza por HPLC: 71 % y 27 % de tolueno) s¡n n¡nguna pur¡f¡cac¡ón en la etapa de ensamblaje A+B, ejemplo C1.<e M :>m/z = 538,2191 (M+H)+.
Ensamblaje de los componentes básicos A y B
Ejemplo C1
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrah¡drop¡ ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡] etox¡]acet¡l]am¡no]-2-[[(2S)-2,6-b¡s[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrah¡ drop¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡no]hexano¡l]am¡no]hexanoato de benc¡lo
Se diluyó la solución de color rojo anaranjado (~1,4 l) de trimetanosulfonato de (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoil]amino]hexanoato de bencilo (180,0 mmol) del ejemplo 4 con 3,60 l de acetonitrilo. A 20-25 °C, se añadieron 365,0 ml de N-etildiisopropilamina (2,16 mol, 12,0 eq.) dentro de 5 min. A la suspensión pegajosa formada se le añadió una solución (~2,25 l) de ácido 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]etoxi]eto xi]acético (720 mmol, 4,0 eq.) del ejemplo B3 a 20-25 °C dentro de 10 min, con lo que la temperatura se incrementó ligeramente hasta 40 °C. A 45-50 °C, se añadió una solución de 425 ml de anhídrido del ácido n-propilfosfónico (T3P, trímero al 50 % en acetato de etilo, 720 mmol, 4,0 eq.) dentro de 10 min. Se agitó la solución de reacción durante 1 h a 45-50 °C. Se enfrió la solución de color amarillo claro a 20-25 °C y se evaporó a 40 °C/10 mbar/6 h para obtener 1,06 kg de (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietoxi]etoxi] etoxi]acetil]amino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahi dropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]amino]hexanoato de bencilo bruto (pureza por HPLC: 24,1 %). Se precipitó el producto bruto en tres porciones para retirar el ácido metanosulfónico, la N-etildiisopropilamina y el T3P residual. Se disolvieron 353 g del producto bruto en 7,0 l de 2-propanol, se enfrió en 1 h a -25 °C, se agitó durante 1 h a -25 °C, se filtró sobre un filtro de vidrio G3 enfriado previamente (-25 °C; sin enjuague), con una parte del producto precipitado depositado sobre la pared de vidrio del reactor. Se disolvieron todos los precipitados por porciones del filtro y de la pared de vidrio con un total de 1,0 l de THF. Se evaporaron las soluciones combinadas a 40 °C/20 mbar/6 h para obtener 390,0 g de (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietoxi]etoxi] etox¡]acet¡l]amino]-2-[[(2S)-2,6-b¡s[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrah¡ dropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]amino]hexanoato de bencilo (pureza por HPLC: 71,9 %), que se usó sin purificación adicional en la siguiente etapa. EM: m/z = 1923,8438 (M+H)+.
Ejemplo C2
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]et ox¡]acet¡l]am¡no]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡h¡drox¡-6-(h¡drox¡met¡l)tetrah¡dro piran-2-iljoxietoxi]etoxi]etoxi]acetil]aminojhexanoil]amino]hexanoato de sodio
Se diluyó la solución de color rojo anaranjado (~95 ml) de trimetanosulfonato de (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoil]amino]hexanoato de bencilo (12,2 mmol) con 240 ml de acetonitrilo. A 20-25 °C, se añadieron 30,0 ml de N-etildiisopropilamina (2,16 mol, 14,5 eq.) dentro de 5 min. A la suspensión pegajosa formada se le añadió una solución (~150 ml) de ácido 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]etoxi]eto xi]acético (48,8 mmol, 4,0 eq.) a 20-25 °C dentro de 10 min, con lo que se incrementó ligeramente la temperatura hasta 40 °C. A 45-50 °C, se añadió una solución de 28,8 ml de anhídrido del ácido n-propilfosfónico (T3P, trímero al 50 % en acetato de etilo, 48,8 mmol, 4,0 eq.) dentro de 10 min. Se agitó la solución de reacción durante 1 h a 45-50 °C. Se enfrió la solución de color amarillo claro a 20-25 °C y se evaporó a 40 °C/10 mbar/6 h para obtener 73,6 g de (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetoximet¡l)tetrah¡drop¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡] etox¡]acet¡l]am¡no]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrah¡ dropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]amino]hexanoato de benc¡lo bruto (pureza por HPLC: 32 % del área).
Se disolvieron 68,0 g (11,0 mmol) del producto bruto en 340 ml de metanol, se añadieron 20,0 ml (220 mmol, 20 eq.) de NaOH 10,8 M a la solución de color amarillo claro, se incrementó la temperatura hasta 32 °C, se agitó la mezcla de reacción durante 2,5 h a t.a., con lo que se formó una suspensión (pH 12,0). Se filtró la suspensión y se lavó la torta de filtrado con 100,0 ml de metanol, se evaporó el filtrado a 40 °C/250-10 mbar/2 h para obtener 41,5 g de
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡h¡drox¡-6-(hidrox¡met¡l)tetrah¡drop¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]et ox¡]acet¡l]am¡no]-2-[[(2S)-2,6-b¡s[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡h¡drox¡-6-(h¡drox¡met¡l)tetrah¡dro p¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡no]hexano¡l]am¡no]hexanoato de sodio que, a continuación, se purificó por cromatografía preparativa de fase inversa, véanse las condiciones en el experimento C3.
Ejemplo C3
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-Acetam¡do-4,5-d¡h¡drox¡-6-(hidrox¡met¡l)tetrah¡drop¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]e tox¡]acet¡l]am¡no]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡h¡drox¡-6-(h¡drox¡met¡l)tetrah¡dr op¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]etox¡]acet¡l]amino]hexano¡l]am¡no]hexanoato de sodio
Se disolvieron 378,0 g (197,0 mmol, en bruto) de (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrahidrop¡ ran-2-il]oxietox¡]etox¡] etox¡]acet¡l]am¡no]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡acetox¡-6-(acetox¡met¡l)tetrah¡ drop¡ran-2-il]ox¡etox¡]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡no]hexano¡l]am¡no]hexanoato de bencilo en 1,9 l de metanol. Dentro de 10 minutos, se añadieron 200,0 ml de solución de hidróxido de sodio 10,8 M (2,16 mol, 11,0 eq.) a 20-25 °C. De este modo, se incrementó la temperatura hasta 31 °C. Se agitó la solución de color amarillo claro durante 2 h a 20-25 °C (pH 13,4) y, a continuación, se añadieron 80,0 ml de solución de cloruro de amonio 5 M (pH 10,7). A continuación, se evaporó la solución de color amarillo claro a 20-25 °C/100-20 mbar/5 h y se secó a 20-0,5 mbar/1 h para obtener 543 g de (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡h¡drox¡-6-(hidrox¡met¡l)tetrah¡drop¡ran-2-¡l]ox¡etox¡]etox¡]et ox¡]acet¡l]am¡no]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡h¡drox¡-6-(h¡drox¡met¡l)tetrah¡dro p¡ran-2-¡ljox¡etox¡]etox¡]etox¡]acet¡l]am¡nojhexano¡l]am¡no]hexanoato de sodio bruto (pureza por HPLC: 40,1 %) que, a continuación, se purificó por cromatografía preparativa de fase inversa.
Columna: Triart C18-12026 x 15 cm; 10 |jm;
Fase móvil: A: NaHCO32 mM / B: acetonitrilo;
Gradiente:
Termostatización: temperatura ambiente
Detección: 220 nm
Solución: 543 g disueltos en 4500 ml de NaHCO32 mM y filtrados (GF5) (= 5000 ml [109 mg/ml])
Solución de muestra/Inyección: muestra de 200 ml por serie = 21,8 g (25 series)
Concentración: Se diluyeron las fracciones combinadas (46 l) con 110 l de agua, se bombeó esta solución en 3 porciones a una columna RP C18 y se lavó con agua/MeOH 98/2 y, a continuación, se eluyó con MeOH y se concentró en un evaporador rotatorio para obtener 1,18 kg de solución metanólica. Se evaporó un cuarto de los 1,18 kg de solución metanólica de la etapa de purificación por HPLC preparativa, es decir, 295 g, a 40 °C/20 mbar/1 h y, a continuación, a 20-25 °<c>/0,35 mbar/14 h a sequedad para obtener 43,5 g de (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-dihidroxi-6-(hidroximetil)tetrahidropiran-2-il]oxietoxi]etoxi]et ox¡]acet¡l]am¡no]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetam¡do-4,5-d¡h¡drox¡-6-(h¡drox¡met¡l)tetrah¡dro piran-2-iljoxietoxi]etoxi]etoxi]acetil]aminojhexanoil]amino]hexanoato de sodio como un polvo blanco amorfo, 99,88 % de pureza por HPLC. Los tres cuartos restantes de la solución anterior (885 g) se usaron en la siguiente etapa. EM: m/z = 1452,684 (M-H)-.
Preparación del conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc
Ejemplo 1A
Preparación de CF<3>CO-AM-C<6>*-5'A(bz)*A(bz)*T*g(¡bu)*c(bz)*t*a(bz)*c(bz)*a(bz)*a(bz)*a(bz)*a(bz)*c(bz)*Mec(bz)*Mec(bz)*A(bz)-3'- | j nyL¡nker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN; * = fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 1,60 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support 5G Jnylinker 350 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2'-OCH<2>-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 2,0 eq. de ADN/LNA-fosforamiditas y 3,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABC<r>, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, BTT, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Jnylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2A.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3%en tolueno (v/v)
Activador BTT 5-benciltiotetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1B
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'c<bz>a<bz>G<dmf>*MeC<bz>*G<dmf>*t*a<bz>*a<bz>*a<bz>*g<ibu>*a<bz>*g<ibu>*a<bz>*G<dmf>*G<dmf)-3-UnyUnker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN; * = fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 1,90 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2'-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas de ADN/LNA y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, BTT, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2B.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3 % en tolueno (v/v)
Activador BTT 5-benciltiotetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1C
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'c(bz>a(bz>G(ibu>*MeC(bz>*G(ibu>*t*a(bz>*a(bz>*a(bz>*g(ibu>*a(bz>*g(ibu>*a(bz>*G(ibu>*G(ibu>-3-UnyUnker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN; * = fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 1,90 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2'-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas de ADN/LNA y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, BTT, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2C.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3%en tolueno (v/v)
Activador BTT 5-benciltiotetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1D
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'c<bz>a<bz>G<dmf>*MeC<bz>*G<dmf>*t*a<bz>*a<bz>*a<bz>*g(ibu>*a<bz>*g<ibu>*a<bz>*G<dmf>*G<dmf)-3-UnyUnker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN; * = fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 1,60 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support 5G Unylinker 350 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2'-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 2,0 eq. de fosforamiditas y 3,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, BTT, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2D.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3 % en tolueno (v/v)
Activador BTT 5-benciltiotetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1E
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)G(dmf)*MeC(bz)*G(dmf)*t*a(bz)*a(bz)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*G(dmf)*G(dmf)-3-UnyUnker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN; * = fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 0,20 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.).
Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2'-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (PADS), bis-(fenilacetil)-disulfuro (ABCR, AB 180887) como una solución 0,2 M en acetonitrilo anhidro/3-picolina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, BTT, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2E.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3%en tolueno (v/v)
Activador BTT 5-benciltiotetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1F
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'c(bz>a(bz>G(dmf)*MeC(bz>*G(dmf>*t*a(bz>*a(bz>*a(bz>*g(ibu>*a(bz>*g(ibu>*a(bz>*G(dmf)*G(dm,)-3'-UnyUnker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN; * = fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 0,20 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2'-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas de ADN/LNA y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, DCI, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2F.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3 % en tolueno (v/v)
Activador DCI 4,5-dicianoimidazol 0,25 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1G
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'-c(bz)a(bz)MeC(bz)*MeC(bz)*t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*a(bz)*c(bz)*a(bz)*-t*c(bz)*A(bz)*G(dmf)*A(bz)*MeC(bz)-3 -U nyUnker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN; * = fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 1,90 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas de ADN/LNA y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, BTT, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como lavado con DEA, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2G.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3 % en tolueno (v/v)
Activador BTT 5-nenciltiotetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1H
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'-c(bz)a(bz)MeC(bz)*T*A(bz)*a(bz)*t*t*g(ibu)*t*a(bz)*g(ibu)*t*-a(bz)*g(ibu)*t*a(bz)*MeC(bz)*T*MeC(bz)-3'-UnyLinker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN;* =fosforotioato como mezcla dediastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 1,90 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2'-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas de ADN/LNA y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, BTT, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2H.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3%en tolueno (v/v)
Activador BTT 5-benciltiotetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1I
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'-c(bz)a(bz)MeC(bz)*MeC(bz)t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*a(bz)*c(bz)*a(bz)*-t*c(bz)*A(bz)*G(dmf)*A(bz)*MeC(bz)*-3'-U nyLinker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN;* =fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 0,2 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas de ADN/LNA y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, Activator 42, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2I. Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3 % en tolueno (v/v)
Activator 42 5-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-tetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-Metilimidazol al 20%en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0.05M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 1J
Preparación de CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)*MeC(bz)*t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*a(bz)*a(bz)*c(bz)*a(bz)*-t*c(bz)*A(bz)*G(dmf)*A(bz)*MeC(bz)-3'-Unyüriker como su sal de dietilamina
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN;* =fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 1,90 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas de ADN/LNA y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, DCI, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por procedimientos conocidos como DEA-wash, para obtener un oligonucleótido de LAN unido al soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamina. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento del ejemplo 2J.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3 % en tolueno (v/v)
Activador DCI Dicianoimidazol 0,7 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante 0,05 M Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Ejemplo 2A
Preparación de AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' como su sal de sodio.
Se trató el oligonucleótido de LNA unido al soporte de polímero a través de Unylinker bruto como su sal de dietilamina del ejemplo 1A con 180 ml de una solución conc. de hidróxido de amonio ac. al 30-32 %. Se agitó la suspensión a 60 °C durante 10 horas en un matraz cerrado a presión estable. Se filtró la suspensión sobre un filtro de fibra de vidrio y se lavó con 60 ml de agua. Se evaporó el filtrado amarillo a 40 °C/300-10 mbar/2 h para obtener ~10,5 g de oligonucleótido bruto como sal de amonio. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 5455,6. Se combinaron un total de 13 lotes de 1,6 mmol preparados de forma análoga con el anterior (tamaño total del nuevo lote: 22,4 mmol) y se disolvieron en 750 ml de agua en un matraz de fondo redondo. Se trató la solución amarilla con 52,0 ml de NaOH 10.8 M (561,6 mmol) (pH 10) y se evaporó la solución a 40 °C/100-10 mbar/2 h, se trató el residuo con 100 ml de agua y se concentró a vacío a 40 °C/100-10 mbar, se repitió este procedimiento un total de cuatro veces (el cuarto destilado tiene un pH de 7,0). Se trató el residuo oleoso con 100 ml de 2-metil-2-butanol y se evaporó a 40 °C/50-10 mbar/2 h (retirada azeotrópica de agua) para obtener 160 g como un sólido amarillo. Se suspendió el producto bruto en 800 ml de etanol y se calentó a 40-45 °C durante 15 min, se agitó la suspensión amarilla durante 1 h a 20-25 °C. Se filtró la suspensión (retirada de benzamida, isobutirilamida, trifluoroacetamida y otros subproductos) y se lavó la torta de filtrado en porciones con 160 ml de etanol. Se secó el producto a 40-45 °C/10 mbar/3 h para obtener 130,5 g de AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' como su sal de sodio como un polvo amarillo de alta densidad con una pureza por LC de un 75,6 % de área (sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUIt Y/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina). Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 5455,6. Se usó el producto sin purificación adicional en el experimento del ejemplo 3A.
Ejemplo 2B
Preparación de AM-C6-5'-caG*MeC*G*t**a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio.
Se trató el oligonucleótido de LNA unido al soporte de polímero a través de Unylinker bruto como su sal de dietilamina del ejemplo 1B con 180 ml de una solución conc. de hidróxido de amonio ac. al 30-32 %. Se agitó la suspensión a 60 °C durante 10 horas en un matraz cerrado a presión estable. Se filtró la suspensión sobre un filtro de fibra de vidrio y se lavó con 60 ml de agua. Se evaporó el filtrado amarillo a 40 °C/300-10 mbar/2 h para obtener ~10,5 g de oligonucleótido bruto como sal de amonio. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 5197,6. Se combinaron un total de 25 lotes de 1,9 mmol preparados de forma análoga con el anterior (tamaño total del nuevo lote: 47,5 mmol) y se disolvieron en 1200 ml de agua en un matraz de fondo redondo. Se trató la solución naranja con 68,0 ml de NaOH 10.8 M (734,4 mmol, 15,5 eq., pH 10) y se concentró la solución a 40 °C/200-50 mbar para obtener ~600 g de solución bruta que se trató con 200 ml de agua y se eliminó el mismo volumen por destilación a vacío a 40 °C/50 mbar, se repitió este procedimiento un total de diez veces (se destilaron un total de 2000 ml de agua, el décimo destilado tiene un pH de 7,0, se retiró todo el amoníaco). Se usó la solución acuosa de color naranja obtenida de 855 g, que contiene como máximo 47,5 mmol de producto AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio, sin purificación adicional en el experimento del ejemplo 3B. Se procesaron con el mismo procedimiento 2 x 20 lotes de 1,9 mmol preparados de manera análoga (2 x 38,0 mmol), total 123,5 mmol.
Ejemplo 2C
Preparación de AM-C6*-5'-caG*MeC*G*t**a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio.
Se produjo el compuesto del título de forma análoga al ejemplo 2B comenzando a partir del material del ejemplo 1C. Se usó la solución acuosa de color amarillo obtenida de 148 g, que contiene como máximo 1,9 mmol de producto AM-C6-5'-caG*MeC*G*t**a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio, sin purificación adicional en el experimento del ejemplo 3C. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS<s>Q Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A I , 7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 5197,6.
Ejemplo 2D
Preparación de AM-C6*-5'-caG*MeC*G*t**a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio.
Se trató el oligonucleótido de LNA unido al soporte de polímero a través de Unylinker bruto como su sal de dietilamina del ejemplo 1C con 180 ml de una solución conc. de hidróxido de amonio ac. al 30-32 %. Se agitó la suspensión a 60 °C durante 10 horas en un matraz cerrado a presión estable. Se filtró la suspensión sobre un filtro de fibra de vidrio y se lavó con 60 ml de agua/etanol 3/1. Se evaporó el filtrado amarillo a 40 °C/300-10 mbar/2 h para obtener ~10,5 g de oligonucleótido bruto como sal de amonio. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95%de agua/2,5%de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 5197,6. Se disolvieron 10,2 g (1,6 mmol) del residuo en 250 ml de agua en un matraz de fondo redondo. Se trató la solución amarilla con 2,22 ml de NaOH 10,8 M (24 mmol, 15 eq., pH 10) y se evaporó la solución a 40 °C/200-50 mbar para obtener un aceite amarillo que se trató dos veces con 10 ml de agua y se eliminó el mismo volumen por destilación a vacío a 40 °C/50-10 mbar (2.° destilado a pH 7,0, se retiró todo el amoníaco). Se trató el residuo oleoso con 30 ml de 2-metil-2-butanol y se evaporó a 40 °C/10 mbar para obtener 9,82 g en bruto como un sólido amarillo de AM-C6*-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (contiene todos los grupos protectores escindidos) como su sal de sodio, que se usó sin purificación adicional en el experimento del ejemplo 3<d>.
Ejemplo 2E
Preparación de AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio.
Se trató el oligonucleótido de LNA unido al soporte de polímero a través de Unylinker bruto como su sal de dietilamina del ejemplo 1E con 25,0 ml de una solución conc. de hidróxido de amonio ac. al 30-32 %. Se agitó la suspensión a 60 °C durante 10 horas en un matraz cerrado a presión estable. Se filtró la suspensión sobre un filtro de fibra de vidrio y se lavó con 20 ml de agua. Se evaporó el filtrado amarillo a 40 °C/300-10 mbar/2 h para obtener ~1,3 g de oligonucleótido bruto como sal de amonio. Se disolvió el residuo en 10 ml y se trató con 0,28 ml (3,0 mmol, 15 eq.) de hidróxido de sodio al 32 % en agua. Se evaporó la solución amarilla a 40 °C/100-15 mbar/1 h para obtener 0,96 g de un sólido amarillo de AM-C6*-5'-caG*MeC*G*t**a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (contiene todos los grupos protectores escindidos) como su sal de sodio. Se suspendió el sólido amarillo en 4,8 ml de etanol, se agitó durante 1 hora a 40 °C, se enfrió a 20-25 °C y se agitó durante 1 hora a esta temperatura. Se filtró la suspensión y se lavó la torta de filtrado con 1,0 ml de etanol y se secó a 40 °C/15 mbar/1 h para obtener 0,75 g de un sólido blanquecino de AM-C6*-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (contiene todos los grupos protectores escindidos) como su sal de sodio. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 5197,6.
Ejemplo 2F
Preparación de AM-C6*-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio.
Se trató el oligonucleótido de LNA unido al soporte de polímero a través de Unylinker bruto como su sal de dietilamina del ejemplo 1F con 25,0 ml de una solución conc. de hidróxido de amonio ac. al 30-32 %. Se agitó la suspensión a 60 °C durante 10 horas en un matraz cerrado a presión estable. Se filtró la suspensión sobre un filtro de fibra de vidrio y se lavó con 20 ml de agua. Se trataron los filtrados amarillos con 0,28 ml (3,0 mmol, 15 eq) de hidróxido de sodio al 32 % en agua. Se evaporó la solución amarilla a 40 °C/100-15 mbar/1 h para obtener 0,65 g de un sólido amarillo de AM-C6*-5'-caG*MeC*G*t**a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (contiene todos los grupos protectores escindidos) como su sal de sodio. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 5197,6.
Ejemplo 2G
Preparación de AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio.
Se produjo el compuesto del título de forma análoga al ejemplo 2B comenzando a partir del material del ejemplo 1G. Se usó la solución acuosa de color naranja obtenida de 1720 g, que contiene como máximo 15,2 mmol de producto AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio, sin purificación adicional en el experimento del ejemplo 3E. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 6357,7.
Ejemplo 2H
Preparación de AM-C6-5'-caMeC*MeC*T*A*a*t*t*g*t*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' como su sal de sodio
Se produjo el compuesto del título de forma análoga al ejemplo 2B comenzando a partir del material del ejemplo 1H. Se usó la solución acuosa de color naranja obtenida de 1920 g, que contiene como máximo 15,2 mmol de producto AM-C6-5'-caMeC*MeC*T*A*a*t*t*g*t*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' como su sal de sodio, sin purificación adicional en el experimento del ejemplo 3F. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS s Q Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 6748,8.
Ejemplo 2I
Preparación de AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio.
Se produjo el compuesto del título por medio de ultrafiltración/diafiltración de 1,00 g de CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)MeC(bz)*T*A(bz)*a(bz)*t*t*g(ibu)*t*a(bz)*g(ibu)*t*-a(bz)*g(ibu)*t*a(bz)*Mec(bz)*T*MeC(bz)-3' brnto como su sal de dietilamina del ejemplo 1I, se disolvió en agua (150 ml) y se diafiltró la solución resultante en un Ákta-Cross-Flow equipado con dos membranas Sartocon Slice Hydrosart 2KD de 0,1 m2 usando NaOH 0,1 M (1,0 l) seguido de NaHcO3 0,1 M (1,0 l) y NaCl 1 M (1,0 l). Se realizó una etapa final de desalinización con H<2>O (2,0 l). Se concentró la solución resultante bajo presión reducida, se trituró con EtOH (5 ml) a temperatura ambiente durante 1 hora, se filtró y se secó a vacío (24 °C/10 mbar/12 h) para obtener el compuesto del título como su sal de sodio (sólido blanco, 410 mg, 40 % de rendimiento). Se usó el material sin purificación adicional en el ejemplo 3G.
Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A:
95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 6357,7.
Ejemplo 2J
Preparación de AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de amonio.
Se produjo el compuesto del título comenzando a partir del material del ejemplo 1J. Se trató el oligonucleótido de LNA unido al soporte de polímero a través de Unylinker bruto como su sal de dietilamina del ejemplo 1J con 20 ml de una solución ac. conc. de hidróxido de amonio al 30-32 %. Se agitó la suspensión a 45 °C durante 10 horas en un matraz cerrado a presión estable. Se filtró la suspensión sobre un filtro de fibra de vidrio y se lavó con 10 ml de agua. Se evaporó el filtrado amarillo a 40 °C/300-10 mbar/2 h para obtener 0,45 g de oligonucleótido bruto como sal de amonio. Se determinó la identidad del producto con UPlC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters A<c>QUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 6357,7.
Ejemplo 3A
Preparación de GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' como su sal de sodio
Activación de GalNAc:
Se disolvieron 30,5 g (20,6 mmol) de sal de sodio de la agrupación de GalNAc en 300 ml de DMF, a 20-25 °C, se añadió una solución de 1,22 ml (18,1 mmol) de ácido ortofosfórico ac. al 85 % en 300 ml de DMF en el transcurso de dos min. Después de 5 min. a 20-25 °C, se añadieron 2,61 g (22,7 mmol) de N-hidroxisuccinimida a la solución incolora ligeramente turbia, seguido de la adición de 4,75 g (24,8 mmol) de EDC HCl (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida). Se agitó la solución incolora ligeramente turbia durante 3 h a 20-25 °C y se usó en la etapa de acoplamiento.
Acoplamiento de GalNAc:
Se calentó una solución preformada de 60,0 g (10,3 mmol) de AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC* A-3' como su sal de sodio (del ejemplo 2A) en 900 ml de metanol, 30 ml de agua y 20,7 ml (119 mmol) de N-etildiisopropilamina a 40-45 °C y se añadió en 1 min a la solución de activación preparada anterior. Se agitó la suspensión amarilla formada durante 0,5 h a 40-45 °C. A la suspensión amarilla se le añadieron 100 ml de agua y se filtró la suspensión sobre un filtro de fibra de vidrio para proporcionar una solución amarilla transparente de GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' como su sal de sodio con una pureza por LC de un 68,2 % del área (sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/Up LC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina). Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z 6891,3 que, a continuación, se purificó y aisló en el experimento del ejemplo 4A.
Ejemplo 3B
Preparación de GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio
Activación de GalNAc:
Se disolvieron 112,1 g (75,9 mmol) de sal de sodio de la agrupación de GalNAc en 640 ml de DMF, a 20-25 °C, se añadió una solución de 4,48 ml (66,4 mmol, 1,4 eq.) de ácido ortofosfórico ac. al 85 % en 640 ml de DMF en el transcurso de dos min. Después de 5 min a 20-25 °C, se añadieron 13,1 g (114 mmol, 2,4 eq.) de N-hidroxisuccinimida a la solución incolora ligeramente turbia, seguido de la adición de 21,8 g (24,8 mmol, 2,4 eq.) de EDCHCl (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida). Se agitó la solución incolora ligeramente turbia durante 4 h a 20-25 °C y se usó en la etapa de acoplamiento.
Acoplamiento de GalNAc:
Se diluyó la solución del experimento del ejemplo 2B, 855 g (47,5 mmol) de AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio con 3400 ml de agua, se añadieron 95,3 ml (546 mmol) de N-etildiisopropilamina y 2100 ml de DMSO, se calentó la solución a 40-45 °C y se añadió en 1 min a la solución de activación preparada anterior. Se agitó la solución amarilla durante 0,5 h a 40-45 °C para obtener GN2-AM-C6-5'-caG*C*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio. HPLC, 46,9 % del área en solución bruta (sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina). Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z 6633,3 que, a continuación, se purificó conjuntamente con 2 x 20 lotes de 1,9 mmol preparados de forma análoga (2 x 38,0 mmol) del experimento 2B y se aisló en el experimento del ejemplo 4B1.
Ejemplo 3C:
Preparación de GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio.
Se produjo el compuesto del título de forma análoga al ejemplo 3B comenzando a partir del material del ejemplo 2C.
La solución amarilla obtenida de ~275 g, que contiene como máximo 1,5 mmol de producto GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio. Se concentraron 230 g de la solución amarilla con un evaporador rotatorio a 40 °C/50 mbar hasta un peso de la solución de ~115 g. Se enfrió la solución amarilla concentrada a 20-25 °C y se añadió gota a gota en el transcurso de 30 min a 230 ml de 1-propanol a 20-25 °C. Se agitó la suspensión blanca formada durante 16 horas a 20-25 °C y se filtró sobre un filtro G3. Se lavó la torta de filtrado blanquecina con un total de 50 ml de 1-propanol y se secó a 40 °C/10 mbar durante una hora para obtener 9,66 g de GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' bruto como su sal de sodio, con una pureza por HPLC de un 50,3 % del área. (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina). Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 6633,3.
Ejemplo 3D
Preparación de GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio.
Se produjo el compuesto del título de forma análoga al ejemplo 3B comenzando a partir del material del ejemplo 2D.
Activación de GalNAc:
Se disolvieron 2,54 g (1,72 mmol) de sal de sodio de la agrupación de GalNAc en 24,0 ml de DMF, a 20-25 °C, se añadió una solución de 0,100 ml (1,50 mmol, 1,175 eq.) de ácido ortofosfórico ac. al 85 % en 24,0 ml de DMF en el transcurso de dos min. Después de 5 min a 20-25 °C, se añadieron 0,22 g (1,90 mmol, 2,2 eq.) de W-hidroxisuccinimida a la solución incolora ligeramente turbia, seguido de la adición de 0,40 g (2,06 mmol, 2,4 eq.) de EDC HCl (clorhidrato de W-(3-dimetilaminopropil)-W-etilcarbodiimida). Se agitó la solución incolora ligeramente turbia durante 3 h a 20-25 °C y se usó en la etapa de acoplamiento.
Acoplamiento de GalNAc:
Se disolvieron 4,75 g (0,859 mmol) de AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio del sólido del experimento del ejemplo 2D en 70 ml de agua, se trató con 1,70 ml (9,9 mmol) de W-etildiisopropilamina y 38 ml de DMSO, se calentó la solución a 40-45 °C y se añadió en 1 min a la solución de activación preparada anterior. Se agitó la solución amarilla durante 0,5 h a 40-45 °C para obtener 170 g de solución de GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio. Se concentró la solución amarilla con un evaporador rotatorio a 40 °C/50 mbar hasta un peso de la solución de 80 g. Se enfrió la solución amarilla concentrada a 20-25 °C y se añadió gota a gota en el transcurso de 30 min a 160 ml de 1-propanol a 20-25 °C. Se agitó la suspensión blanca formada durante 2 horas a 20-25 °C y se filtró sobre un filtro<g>3. Se lavó la torta de filtrado con un total de 30 ml de 1-propanol y se secó a 40 °C/20 mbar durante una hora para obtener 6,05 g de GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' bruto como su sal de sodio con una pureza por HPLC de un 57,2 % del área. (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina). Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z 6633,3 que, a continuación, se purificó y aisló en los experimentos del ejemplo 4C y el ejemplo 4D.
Ejemplo 3E
Preparación de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio
Se produjo el compuesto del título de forma análoga al ejemplo 3B comenzando a partir del material del ejemplo 2G. Se usó la solución de color amarillo obtenida de ~3500 g, que contenía 15,2 mmol de producto GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio, sin purificación adicional en el experimento del ejemplo 4E1.
Ejemplo 3F
Preparación de GN2-AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' como su sal de sodio Quiral
Se produjo el compuesto del título de forma análoga al ejemplo 3B comenzando a partir del material del ejemplo 2H. Se usó la solución de color amarillo obtenida de ~3500 g, que contiene como máximo 15,2 mmol de producto, AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' como su sal de sodio, sin purificación adicional en el experimento del ejemplo 4F1.
Ejemplo 3G
Preparación de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio
Se produjo el compuesto del título de forma análoga al ejemplo 3B comenzando a partir del material del ejemplo 2I. Se concentró la solución amarilla con un evaporador rotatorio a 40 °C/50 mbar hasta un peso de la solución de 4,9 g. Se enfrió la solución amarilla concentrada a 20-25 °C y se añadió gota a gota en el transcurso de 5 min a 10 ml de 1-propanol a 20-25 °C. Se agitó la suspensión blanca formada durante 12 horas a 20-25 °C y se filtró sobre un filtro G3. Se lavó la torta de filtrado blanquecina con un total de 5 ml de 1-propanol y se secó a 40 °C/20 mbar durante una hora para obtener 530 mg de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' bruto como su sal de sodio con una pureza por HPLC de un 57,2 % del área. (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACq UiTY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-<2>-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-<2>-propanol 0,2 M/trietilamina). Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-<2>-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-<2>-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 7793,4.
Ejemplo 4A
Purificación y aislamiento de GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' como su sal de sodio
Se purificó la solución del ejemplo 3A por cromatografía de intercambio iónico (IEX) en una columna de 9 l empaquetada con Tosoh TSK Gel Super Q-5PW, 30 jm en 2 series cromatográficas. Se aplicaron 1,5 l de la solución bruta en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de NaHCO3 50 mM pH 9,0/EtOH 80/20 (fase móvil A) a NaHCO350 mM pH 9,0/EtOH 80/20 NaCl 1,2 M (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 0,8 l/min
Detección: 290 nm
Temperatura: 20-25 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (9 l) y se concentraron por ultrafiltración (UF).
Se realizó la UF en membrana Pellicon 2 de 3 kD, 2 x 0,57 (1,14 m2) de Millipore. Se concentró la solución de 9 l hasta aprox. 3 l y se diafiltró en una unidad de UF Amicon SP20 con 20 l de agua hasta una conductividad final del permeado de 35 jS/cm.
Se liofilizó la solución en un ciclo de liofilización en un liofilizador Lyostar II en una bandeja lyoguard, dando como resultado 43 g de polvo blanco seco. Después del acondicionamiento a 21-22 °C y una humedad rel. de 38-42 % durante 4 días, se aislaron un total de 46,4 g de GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' como su sal de sodio como un polvo amorfo blanco con un contenido de agua de 12,7 % y un 90,2 % de pureza, sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C<18>130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-<2>-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-<2>-propanol 0,2 M/trietilamina).
Con la ayuda de espectroscopia de 2D-1H/13C-RMN del dominio del conector, se detectó una proporción de epímeros entre GN2a y GN2b (véase la página 17) de ~64 % a ~36 %. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95%de agua/2,5%de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 6891,3.
Ejemplo 4B1
Purificación de GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' como su sal de sodio
Se purificó la solución del ejemplo 3B por cromatografía IEX en una columna de 9 l empaquetada con Tosoh TSK Gel Super Q-5PW, 30 jm en 47 series cromatográficas. Se aplicaron 0,4 l de la solución bruta en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de NaHCO3 50 mM pH 9,0/EtOH 80/20 (fase móvil A) a NaHCO3 50 mM pH 9,0/EtOH 80/20 NaCl 1,2 M (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 0,8 l/min
Detección: 290 nm
Temperatura: 20-25 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (220 l) y se concentraron por ultrafiltración (UF).
Se realizó la UF en membrana Pellicon 2 de 3 kD, 2 x 0,57 (1,14 m2) de Millipore. Se concentró la solución de 220 l hasta aprox. 3 l y se diafiltró en una unidad de UF Amicon SP20 con 20 l de agua hasta una conductividad final del permeado de <50 jS/cm.
El concentrado resultante se puede liofilizar directamente (procedimiento en 3 etapas) o bien purificar adicionalmente por cromatografía de fase inversa (RP) como se describe en el ejemplo 4B2.
Se liofilizó la solución anterior en un ciclo de liofilización en un liofilizador Lyostar II en dos bandejas lyoguard, dando como resultado 174 g de polvo blanco seco.
Después del acondicionamiento a 21 °C y una humedad rel. del 50 % durante 2 días, se aislaron un total de 203,9 g de GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' como su sal de sodio como un polvo amorfo blanco con un contenido de agua de 16,2 % y una pureza de 89,0 % del área (Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina). Con la ayuda de espectroscopia de 2D-1H/13C-RMN del dominio del conector, se detectó una proporción de epímeros entre GN2a y GN2b (véase la página 17) de ~43,9 % a ~56,1 %. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 6633,3.
Ejemplo 4B2
Se purificaron adicionalmente 1,6 g del polvo liofilizado del ejemplo 4B1 usando cromatografía de fase inversa (RP).
Se disolvió el material en 16 ml de acetato de sodio 0,2 M y se separó en dos series cromatográficas en una columna YMC Triart prep C8-S, 10 |jm, 250 x 30 mm. Se aplicaron 8 ml de la solución en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de acetato de sodio 0,2 M (fase móvil A) a acetonitrilo (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 30 ml/min
Detección: 290 nm
Temperatura: 20-25 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones, se concentraron y se diafiltraron por ultrafiltración (UF) en un filtro centrífugo Amicon Ultra-15, 3 kD. Se liofilizó el concentrado resultante dando como resultado 0,9 g de polvo amorfo blanco con una pureza de un 93,9 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4B1.
Ejemplo 4C
El orden de las purificaciones cromatográficas es intercambiable. Una purificación que comienza con cromatografía de fase inversa (RP) seguida de cromatografía de intercambio iónico (IEX) da como resultado los mismos rendimientos y purezas que si se realiza primero la cromatografía IEX y, después, la cromatografía RP.
1.a cromatografía - RP: Se disolvió 1 g del experimento del ejemplo 3D en 10 ml de acetato de sodio 0,2 M y se purificó usando cromatografía de fase inversa (RP) en 50 series cromatográficas en una columna YMC Triart prep C18-S, 10 jm , 250 x 4,6 mm. Se aplicaron 0,2 ml de la solución en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de acetato de sodio 0,2 M (fase móvil A) a acetonitrilo (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 0,7 ml/min
Detección: 310 nm
Temperatura: 45 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (250 ml), se concentraron (150 ml) y se diafiltraron con 1,5 l de agua por ultrafiltración (UF) en una unidad de flujo cruzado de GE equipada con una membrana Millipore Pellicon II de 0,1 m2 (3 kDa). Se liofilizó el concentrado resultante dando como resultado 0,375 g de polvo amorfo blanco con una pureza de un 91,3 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4B1.
2.a cromatografía - IEX: Se purificaron adicionalmente 0,355 g de este material por cromatografía de intercambio aniónico. Se disolvió el material en 10 ml de bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9,0/EtOH 80/20 y se purificó en 11 series en una columna empaquetada con Tosoh TSK Gel Super Q-5PW, 30 |jm (10 x 220 mm) con un gradiente lineal de NaHCOa 50 mM, pH 9,0/EtOH 80/20 (fase móvil A) a NaHCOa 50 mM pH 9,0/EtOH 80/20 NaCl 1,2 M (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 1,3 ml/min
Detección: 300 nm
Temperatura: 30 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (150 ml) y se diafiltraron con 1,5 l de agua por ultrafiltración (UF) en una unidad de flujo cruzado de GE equipada con una membrana Millipore Pellicon II de 0,1 m2 (3 kDa). Se liofilizó el concentrado resultante dando como resultado 0,246 g de polvo amorfo blanco con una pureza de un 92,8 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4B1.
Ejemplo 4D
1.a cromatografía - IEX: Se disolvió 1 g del experimento del ejemplo 3D en 10 ml de acetato de sodio 0,2 M y se purificó en 34 series en una columna empaquetada con Tosoh TSK Gel Super Q-5PW, 30 jm (10 x 220 mm) con un gradiente lineal de NaHCOa 50 mM, pH 9,0/EtOH 80/20 (fase móvil A) a NaHCOa 50 mM, pH 9,0/EtOH 80/20 NaCl 1,2 M (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 1,3 ml/min
Detección: 300 nm
Temperatura: 30 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (250 ml), se concentraron (150 ml) y se diafiltraron con 1,5 l de agua por ultrafiltración (UF) en una unidad de flujo cruzado de GE equipada con una membrana Millipore Pellicon II de 0,1 m2 (3 kDa). Se liofilizó el concentrado resultante dando como resultado 0,292 g de polvo amorfo blanco con una pureza de un 87,7 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4B1.
2.a cromatografía - RP: Se disolvieron 0,272 g de este material en 3 ml de acetato de sodio 0,2 M y se purificó usando cromatografía de fase inversa (RP) en 18 series cromatográficas en una columna YMC Triart prep C18-S, 10 |jm, 250 x 4,6 mm. Se aplicaron 0,18 ml de la solución en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de acetato de sodio 0,2 M (fase móvil A) a acetonitrilo (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 0,7 ml/min
Detección: 310 nm
Temperatura: 45 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (150 ml) y se diafiltraron con 1,5 l de agua por ultrafiltración (UF) en una unidad de flujo cruzado de GE equipada con una membrana Millipore Pellicon II de 0,1 m2 (3 kDa). Se liofilizó el concentrado resultante dando como resultado 0,19 g de polvo amorfo blanco con una pureza de un 93,7 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4B1.
Ejemplo 4E1
Se purificó la solución del ejemplo 3E por cromatografía IEX en una columna de 9 l empaquetada con Tosoh TSK Gel Super Q-5PW, 30 jm en 8 series cromatográficas. Se aplicaron 0,3-0,38 l de la solución bruta en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de NaHCO3 50 mM pH 9,0/EtOH 80/20 (fase móvil A) a NaHCO3 50 mM pH 9,0/EtOH 80/20 NaCl 1,2 M (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Tiempo%en vo l.
Caudal: 0,8 l/min
Detección: 294 nm
Temperatura: 20-25 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (48 l) y se concentraron por ultrafiltración (UF).
Se realizó la UF en una membrana Sartocon Slice Hydrosart de 2 x 0,1 m2 de Sartorius. Se concentró la solución de 48 l hasta 1,4 l y se diafiltró en una unidad de UF de flujo cruzado de GE con agua hasta una conductividad final del permeado de <50 |jS/cm.
Se liofilizó la solución en un ciclo de liofilización en un liofilizador Lyostar II en una bandeja lyoguard, dando como resultado 51 g de polvo blanco seco. Después del acondicionamiento a 21 °C y una humedad rel. del 50 % durante 2 días, se aislaron un total de 60,5 g de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio como un polvo amorfo blanco con un contenido de agua de 15,7 % y una pureza de 85,4 % del área (Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina). Con la ayuda de espectroscopia de 2D-1H/13C-RMN del dominio del conector, se detectó una proporción de epímeros entre GN2a y GN2b (véase la página 17) de ~50,8 % a ~49,2 %. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters U<p>LC<a>C<q>UITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 7793,4.
Ejemplo 4E2
Se purificaron adicionalmente 0,5 g del polvo liofilizado del ejemplo 4E1 usando cromatografía RP.
Se disolvió el material en 3,3 ml de acetato de sodio 0,2 M y se separó en 33 series cromatográficas en una columna YMC Triart prep C8-S, 10 jm , 250 x 4,6 mm. Se aplicaron 0,1 ml de la solución en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de acetato de sodio 0,2 M (fase móvil A) a acetonitrilo (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 0,7 ml/min
Detección: 290 nm
Temperatura: 45 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (100 ml), se diluyeron con agua (400 ml), se concentraron (150 ml) y se diafiltraron con 1,5 l de agua por ultrafiltración (UF) en una unidad de flujo cruzado de GE equipada con una membrana Sartocon Slice Hydrosart de 2 x 0,1 m2 de Sartorius. Se liofilizó el concentrado resultante dando como resultado 0,29 g de polvo amorfo blanco con una pureza de un 91,9 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4E1.
Ejemplo 4E3
Se prepararon y purificaron 5,0 g de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' con una pureza de un 85,4 % a/a de forma análoga al ejemplo 4E1. A continuación, se purificó el material adicionalmente por cromatografía RP, UF y se aisló por medio de liofilización de forma análoga al ejemplo 4E2 para proporcionar 2,5 g de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' con una pureza de un 89,8 % a/a. Después de que el material se disolviera en 50 ml de agua, se secó por pulverización la solución incolora en un secador por pulverización Procept (120 °C) para proporcionar 1,8 g de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' con una pureza de un 89,5 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4E1. No se encontraron indicios analíticos por técnicas de CL/EM, RMN y EA (análisis elemental) de que, durante el secado por pulverización, el material sufriera descomposición (parcial). Como consecuencia de esto, el aislamiento del material después de la cromatografía IEX y/o RP y la posterior UF se puede realizar por medio de secado por pulverización o de liofilización.
Ejemplo 4E4
Se diluyó una solución (7,2 ml) de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' bruto con una pureza de un 55,4 % a/a, que se preparó de forma análoga al ejemplo 3E, con 14,4 ml de acetato de sodio 0,2 M y se purificó en 36 series cromatográficas en una columna YMC Triart C8 prep 120, 10 |jm, 250 x 4,6 mm. De este modo, se aplicaron fracciones de 0,6 ml de la solución por serie y se eluyeron con un gradiente lineal de acetato de sodio 0,2 M (fase móvil A) a acetonitrilo (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 0,7 ml/min
Detección: 300 nm
Temperatura: 45 °C
Se combinaron las fracciones objetivo (50 ml) y se concentraron por ultrafiltración en una membrana Sartocon Slice Hydrosart de 0,1 m2 de Sartorius en una unidad UF de flujo cruzado de GE y se diafiltraron con agua hasta una conductividad final del permeado de <50 jS/cm. Se liofilizó la solución para proporcionar 120 mg de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' con una pureza de un 87,6 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4E1.
Ejemplo 4F1
Se purificó la solución del ejemplo 3F por medio de cromatografía IEX en una columna de 9 l empaquetada con Tosoh TSK Gel Super Q-5PW, 30 |jm en 8 series cromatográficas. Se aplicaron 0,35 l de la solución bruta en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de NaHCO350 mM pH 9,0/EtOH 80/20 (fase móvil A) a NaHCO350 mM pH 9,0/EtOH 80/20 NaCl 1,2 M (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
T ie m p o%en vo l.
Caudal: 0,8 l/min
Detección: 294 nm
Temperatura: 20-25 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (29 l) y se concentraron por ultrafiltración (UF).
Se realizó la UF en una membrana Sartocon Slice Hydrosart de 2 x 0,1 m2 de Sartorius. Se concentró la solución de 29 l hasta 3,2 l y se diafiltró con agua en una unidad de UF de flujo cruzado de GE con agua hasta una conductividad final del permeado de <50 |jS/cm.
Se liofilizó la solución en un ciclo de liofilización en un liofilizador Lyostar II en dos bandejas lyoguard, dando como resultado 43 g de polvo blanco seco.
Después del acondicionamiento a 21 °C y una humedad rel. del 50 % durante 2 días, se aislaron un total de 50,2 g de GN2-AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' como su sal de sodio como un polvo amorfo blanco con un contenido de agua de 16,4 % y una pureza de 85,0 % del área (Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina). Con la ayuda de espectroscopia de 2D-1H/13C-RMN del dominio del conector, se detectó una proporción de epímeros entre GN2a y GN2b (véase la página 17) de ~49,3 % a ~50,7 % de GN2b. Se determinó la identidad del producto con UPLC-e M (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 8184,4.
Ejemplo 4F2
Se purificaron adicionalmente 0,5 g del polvo liofilizado del ejemplo 4F1 usando cromatografía RP.
Se disolvió el material en 3,3 ml de acetato de sodio 0,2 M y se separó en 33 series cromatográficas en una columna YMC Triart prep C8-S, 10 jm , 250 x 4,6 mm. Se aplicaron 0,1 ml de la solución en cada serie y se eluyeron con un gradiente lineal de acetato de sodio 0,2 M (fase móvil A) a acetonitrilo (fase móvil B).
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Caudal: 0,7 ml/min
Detección: 290 nm
Temperatura: 45 °C
Se recogieron fracciones de acuerdo con el perfil de elución. Se combinaron las fracciones (100 ml), se diluyeron con agua (400 ml), se concentraron (150 ml) y se diafiltraron (1,5 l de agua) por ultrafiltración (UF) en una unidad de flujo cruzado de GE equipada con una membrana Sartocon Slice Hydrosart de 2 x 0,1 m2 de Sartorius. Se liofilizó el concentrado resultante dando como resultado 0,29 g de polvo amorfo blanco con una pureza de un 91,9 % a/a determinada con el procedimiento analítico descrito en el ejemplo 4F1.
Ejemplo 5
Síntesis de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*m*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio
Etapa 1: Preparación de CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)MeC(bz)*MeC(bz)*G(dmf)*t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*a(bz)*c(bz)*a(bz)*t*c(bz)*A(bz)*G(dmf)*A(bz)-3-UnyUnker como su sal de dietilamonio
Nomenclatura: A, G, T, MeC (5-metilcitosina) = LNA; a, t, c, g = ADN; * = fosforotioato como mezcla de diastereómeros; AM-C6 = conector amino C6; GN2 = agrupación de GalNAc; CF3CO = TFA = trifluoroacetilo; bz = benzoílo; ibu = isobutirilo; dmf = dimetilformamidina
El compuesto del título se produjo por química estándar de fosforamidita en fase sólida a una escala de 1,90 mmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y Primer Support Unylinker (Kinovate Nittophase® HL UnyLinker™400, EE. UU.). Se generaron oligonucleótidos que contenían LNA, es decir, monómeros de nucleótidos con puente 2'-OCH2-4' (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) y monómeros de nucleósidos de ADN (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemania) empleando las fosforamiditas y fosforamiditas con conector amino protegido con TFA correspondientes (Link Technologies, Escocia, Reino Unido). En general, se emplearon 1,5 eq. de fosforamiditas de ADN/LNA y 2,0 eq. de fosforamidita con conector amino protegido con TFA por acoplamiento. Se usó reactivo de fosforotiolación (hidruro de xantano), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ABCR, AB251827) como una solución 0,1 M en acetonitrilo anhidro/piridina 1/1. Todas las demás soluciones de reactivo estándar (DCA de desbloqueo, BTT, caperuza A, B1, B2, oxidante, lavado con DEA) estaban disponibles comercialmente (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; véanse detalles a continuación). Se logró la desprotección del grupo 2-cianoetilo por lavado con dietilamina en acetonitrilo anhidro (DEA-wash) para obtener un oligonucleótido de LNA unido a soporte de polímero a través de Unylinker protegido bruto como sal de dietilamonio. El compuesto del título obtenido de este modo se usó sin operaciones adicionales en el experimento 2.
Soluciones de reactivos estándar
DCA de desbloqueo Ácido dicloroacético al 3 %en tolueno (v/v)
Activador BTT 5-benciltiotetrazol 0,3 M en acetonitrilo
Caperuza A 1-metilimidazol al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B1 Anhídrido de ácido acético al 40 % en acetonitrilo (v/v)
Caperuza B2 Piridina o 2,6-lutidina al 60 % en acetonitrilo (v/v)
Oxidante Agua/piridina/yodo 10/90/1,27 (v/v/p) 0,05 M
Tiolación 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona 0,1 M en piridina/MeCN 1:1 (v/v)
Lavado con DEA Dietilamina al 20 % en acetonitrilo (v/v)
Etapa 2: Preparación de AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio
Se trató el oligonucleótido de LNA unido al soporte de polímero a través de Unylinker bruto como su sal de dietilamonio del experimento 1 con 180 ml de una solución conc. de hidróxido de amonio ac. al 30-32 %. Se agitó la suspensión a 60 °C durante 10 horas en un matraz cerrado a presión estable. Se filtró la suspensión sobre un filtro de fibra de vidrio y se lavó con 60 ml de agua. Se evaporó el filtrado amarillo a 40 °C/300-10 mbar/2 h para obtener ~14,5 g de oligonucleótido bruto como sal de amonio. Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 6362,1. Se combinaron un total de 51 lotes de 1,9 mmol y dos lotes de 3,8 mm preparados de forma análoga con el anterior (tamaño total del nuevo lote: 106,7 mmol) y se disolvieron en 4,0 l de agua en un matraz de fondo redondo. Se trató la solución naranja con 189 ml de NaOH 10,8 M (2,04 mol, 19,1 eq.). Se filtraron los sólidos precipitados, se lavaron con 200 ml de agua y se concentró el filtrado a 40 °C/200-60 mbar para obtener ~1,5 kg de solución bruta que se trató con 2 l de agua y se eliminó el mismo volumen por destilación a vacío a 40 °C/50 mbar, se repitió este procedimiento dos veces hasta que el destilado alcanzó un pH de 7-7,5 que indicaba la ausencia de amoníaco. Se diluyó la suspensión con agua para dar 10 kg de una suspensión que se filtró de nuevo, se lavaron los sólidos con 200 ml de agua para dar 9,67 kg de una solución marrón (que contenía un 7,4 % teórico de producto bruto (p/p)) que se usó en varios lotes sin purificación adicional.
Etapa 3: Preparación de 1, RO7191863-001, GN2-AM-C6-5'caMeC*MeC*t*a*m*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio
Activación de GalNAc:
Se disolvieron 82,6 g (55,9 mmol) de sal de sodio de la agrupación de GalNAc en 600 ml de DMF a 20-25 °C, se añadió una solución de 3,3 ml (48,9 mmol, 1,13 eq.) de ácido fosfórico ac. al 85 % en 600 ml de DMF en el transcurso de dos min. Después de 5 min a 20-25 °C, se añadieron 9,66 g (83,9 mmol, 1,94 eq.) de W-hidroxisuccinimida a la solución incolora, seguido de la adición de 16,1 g (84 mmol, 1,94 eq.) de EDC HCl (clorhidrato de W-(3-dimetilaminopropil)-W-etilcarbodiimida)1. Se agitó la solución incolora ligeramente turbia durante 4 h a 20-25 °C y se usó en la etapa de acoplamiento.
Acoplamiento de GalNAc:
A 3,95 kg de la solución del experimento del ejemplo 2 que contenía teóricamente 292 g (43,3 mmol) de AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio se le añadió 70,3 ml (402 mmol) de W-etildiisopropilamina y 1,98 l de DMSO, se calentó la solución a 40-45 °C y se añadió en 1 min a la solución de GalNAc activada anterior. Se agitó la solución amarilla durante 0,5 h a 40-45 °C para obtener una solución bruta de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio. La HPLC mostró un 56,5 % del área en solución bruta (sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, 260 nm, gradiente A: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina, B: agua/CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/trietilamina).
Se almacenó esta solución a 4 °C hasta su purificación. Tras el almacenamiento, se produjo la precipitación de benzamida residual que se separó por filtración antes de la purificación. Se repitió este procedimiento una vez a la misma escala y una vez a media escala y se combinaron las tres mezclas de reacción individuales para la purificación.
Etapa 4: Purificación y aislamiento de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio
Se purificó la solución obtenida de la reacción de acoplamiento de GalNAc usando cromatografía de fase inversa. Se empaquetó una columna DAC de 15 cm de DI con 2,5 kg de YMC Triart prep C8-S a una presión de columna de 80 bar. Se preparó la solución de alimentación diluyendo la reacción de acoplamiento bruta con una solución de acetato de sodio 0,2 M 50/50 v/v y se separó completamente en 77 series por elución en gradiente (inyección: solución de alimentación de 400 ml. Gradiente: A: acetato de sodio 0,2 M, B: acetonitrilo)
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Tiempo%en vo l.
Se detuvo el gradiente después de la elución del pico objetivo.
Caudal: 700 ml/min Detección: 300 nm
Temperatura: 45 °C
El cromatograma indica el gradiente así como los cortes de fracción. La fracción objetivo principal se recogió entre c4 y c5, mientras que las fracciones laterales se recogieron entre los otros cortes.
Todas las fracciones se recogieron en mezclas.
Se desechó la mezcla 1 recogida entre c2 y c3, mientras que las otras mezclas se concentraron y desalinizaron por ultrafiltración en 2 x Pellicon 3 Kassetten de 0,57 m2
Concentración: presión de entrada: 3,0 bar; presión de salida: 0,5 bar; flujo de permeado: 200 ml/min Desalinización: presión de entrada: 3,0 bar; presión de salida: 0,5 bar; flujo de permeado: 50 ml/min
Se concentró la mezcla objetivo principal de 70 l hasta 3 l, se diafiltró hasta una conductividad de <100 uS/cm y se liofilizó en dos Lyoguards, lo que dio como resultado 188 g de polvo liofilizado (88,70 % a/a). Sin embargo, a la concentración final, el material comenzó a atravesar la membrana.
Se combinaron las mezclas de fracciones laterales, se concentraron y se diafiltraron como antes y se liofilizaron por separado, dando como resultado 120 g de polvo liofilizado (88,62 % a/a).
Para obtener material homogéneo, se combinaron ambos lotes, se disolvieron en 3 l de agua y se liofilizaron de nuevo, dando como resultado 305 g de polvo liofilizado (88,80 % a/a).
Como el material es muy higroscópico, se acondicionaron las lyoguards después de la liofilización en una cámara climática a 21 °C y 50 % de humedad rel. hasta que el peso fue constante, lo que se logró después de 48 h. Después del acondicionamiento, se aislaron un total de 355 g de GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' como su sal de sodio con un 90,35 % de pureza y un contenido de agua de un 16 % con un rendimiento global de un 30,7 %. La pureza del producto se determinó con HPLC (sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity Series LC129; columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18 130A 1,7 |jm 2,1 x 50 mm; temp. de columna: 80 °C; temperatura del tomamuestras: 15 °C; caudal 0,4 ml/min; detección 210 nm/260 nm; fase móvil A: hexafluoro-2-propanol 200 mM hexilamina 5 mM trietilamina 4 mM 40 j l de H<3>PO<4>; fase móvil B: 90 % MeOH/10 % acetonitrilo.
Gradiente:
Tiempo % en vol.
Se determinó la identidad del producto con UPLC-EM (Waters UPLC ACQUITY clase H, Waters MS SQ Detector clase H SQD, columna: Waters ACQUITY/UPLC oligonucleótidos BEH C18130A 1,7 jm 2,1 x 50 mm, gradiente A: 95 % de agua/2,5 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5 % de agua/80 % de CH3OH/hexafluoro-2-propanol 0,2 M/16,3 mmol de trimetilamina). UPLC-EM: m/z = 7793,4.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la preparación de un conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc que comprende las etapas de a) producir un oligonucleótido o una sal de amina alifática del mismo unido a un soporte en fase sólida; b) escindir el oligonucleótido del soporte y retirar los grupos protectores en presencia de amoníaco, proporcionando de este modo la sal de amonio del oligonucleótido desprotegido; c) realizar un cambio de intercambio de sales de la sal de amonio del oligonucleótido a una sal de metal alcalino o sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido, retirando de este modo cualquier amoníaco libre o amina alifática residual, en el que se forma una solución acuosa de la sal de metal alcalino o de metal alcalinotérreo del oligonucleótido y en el que el aislamiento de la sal de metal alcalino o de la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido de la solución acuosa tiene lugar a1) por evaporación del agua y posterior retirada azeotrópica del agua restante con la ayuda de un disolvente orgánico adecuado o b1) por evaporación parcial continua (por volumen constante y adición de agua) hasta que el pH de la fase de vapor alcance un pH 7 o c1) por filtración de flujo tangencial contra soluciones acuosas de sal de metal alcalino o de sal de metal alcalinotérreo o bien d1) por cromatografía de intercambio aniónico seguida de desalinización y concentración por medio de filtración de flujo tangencial; d) acoplar la sal de metal alcalino o la sal de metal alcalinotérreo del oligonucleótido con el compuesto de agrupación de GalNAc o con una sal del mismo de fórmula
    en la que R2 es hidrógeno o un grupo protector de hidroxi y n es un número entero de 0 a 10, sales, enantiómeros y/ estereoisómeros correspondientes del mismo, y finalmente e) purificar el conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc que comprende la secuencia de las etapas I. cromatografía II. concentración III. aislamiento o I. cromatografía II. concentración III. cromatografía IV. concentración V. aislamiento o 1. cromatografía II. concentración III. aislamiento IV. cromatografía V. concentración VI. aislamiento y en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido modificado con amino en el extremo 5' y en el que el modificador amino en el extremo 5' se selecciona de un conector aminoalquilo C<2-12>con el grupo amino opcionalmente protegido o un conector aminoetilenglicol que contiene de 1 a 10 unidades de etilenglicol.
  2. 2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido consiste en monómeros de nucleósidos de ADN, ARN o LNA opcionalmente modificados o combinaciones de los mismos y tiene una longitud de 7 a 30 nucleótidos.
  3. 3. Procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el oligonucleótido consiste en monómeros de nucleósidos de ADN o LNA o combinaciones de los mismos y tiene una longitud de 10 a 25 nucleótidos.
  4. 4. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa a) la sal de amina alifática es una mono-, di- o trialquil C1-4-amina o sal de amina alifática cíclica.
  5. 5. Procedimiento de la reivindicación 4, en el que se forma la sal de dietilamina.
  6. 6. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la etapa b) se usa amoníaco acuoso.
  7. 7. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto de agrupación de GalNAc de fórmula I es una sal de metal alcalino o de metal alcalinotérreo de fórmula Ia.
    en la que M+/++ es el catión de un metal alcalino o de un metal alcalinotérreo.
  8. 8. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el acoplamiento del oligonucleótido con el compuesto de agrupación de GalNAc o con una sal del mismo en la etapa d) engloba, en una primera etapa, la activación del compuesto de agrupación de GalNAc con un agente de acoplamiento y, en una segunda etapa, el acoplamiento del compuesto de agrupación de GalNAc activado con el oligonucleótido en presencia de una base de amina y un disolvente orgánico.
  9. 9. Procedimiento de la reivindicación 8, en el que el agente de acoplamiento es un agente de acoplamiento seleccionado de DCC (N,W-diciclohexilcarbodiimida) o EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida) o TBTU (tetrafluoroborato de N,W,W,W-tetramet¡l-0-(benzotr¡azoM-¡l)uron¡o, HBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio) y un aditivo seleccionado de HOBt (1-hidroxibenzotriazol), HOSu (W-hidroxisuccinimida) o HOAt (1-hidroxi-7-azabenzotriazol) y combinaciones de los mismos.
  10. 10. Procedimiento de la reivindicación 8 o 9, en el que la base de amina es una amina terciaria, el disolvente orgánico es un disolvente aprótico polar y las temperaturas de reacción están en el intervalo de 20 °C a 70 °C.
  11. 11. Procedimiento de la reivindicación 10, en el que el agente de acoplamiento es anhídrido del ácido n-propilfosfónico (T3P) o (3-(dietoxi-fosforiloxi)-1,2,3-benzo[d]triazina-4(3H)-ona (DEPBT) conjuntamente con una amina terciaria.
  12. 12. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la purificación del conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc en la etapa e) comprende las etapas de cromatografía, concentración y aislamiento.
  13. 13. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la purificación comprende la secuencia de las etapas I. cromatografía II. concentración III. aislamiento o I. cromatografía II. concentración III. cromatografía IV. concentración V. aislamiento
  14. 14. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la purificación comprende la secuencia de las etapas I. cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de fase inversa II. filtración de flujo tangencial III. liofilización o secado por pulverización o I. cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de fase inversa II. filtración de flujo tangencial III. cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de fase inversa IV. filtración de flujo tangencial V. liofilización o secado por pulverización
  15. 15. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el oligonucleótido se selecciona de AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' (compuesto 1) AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (compuesto 2) AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' (compuesto 5) AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' (compuesto 6) en el que AM-C6 significa un conector amino C6; * representa puentes de fosforotioato; A, G, T y MeC (5-metilcitosina) son monómeros de nucleósidos de LNA y a, t, c, g son monómeros de nucleósidos de ADN.
  16. 16. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el conjugado de oligonucleótido con agrupación de GalNAc se selecciona de GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' (compuesto 3) GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (compuesto 4) GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' (compuesto 7) GN2-AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' (compuesto 8) en el que AM-C6 significa un conector amino C6; * representa puentes de fosforotioato; A, G, T y MeC (5-metilcitosina) son monómeros de nucleósidos de LNA y a, t, c, g son monómeros de nucleósidos de ADN y GN2 es la agrupación de GalNAc.
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