CN107709342B - 制备乙酰半乳糖胺酸衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括制备式I的GalNAc衍生物及其盐、相应的对映异构体和/或光学异构体的新方法，其中n是0‑10的整数。式I的GalNAc酸衍生物可用于制备有治疗价值的GalNAc寡核苷酸缀合物。

Description

制备乙酰半乳糖胺酸衍生物的方法
本发明涉及制备式I的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物及其盐、相应的对映异构体和/或光学异构体的新方法，
Figure BDA0001532402020000011
其中n是0-10的整数。
式I的GalNAc衍生物通常是包含GalNAc部分和某些寡核苷酸的缀合物的靶向部分。GalNAc部分由于其对位于肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体的亲和力而能够将寡核苷酸缀合物功能性递送至肝细胞。该GalNAc簇反义缀合物具有作为药代动力学调节剂的潜在能力，如在PCT公开物WO 2012/083046或美国专利申请公开物US 2011/0207799中描述。虽然这些出版物也公开了制备GalNAc衍生物的方法，但发现这些方法不符合技术上规模合成的标准。
因此，本发明的目的是提供一种制备式I的GalNAc衍生物的改良方法，其符合工业化规模生产过程的需要。
本发明的另一个目的是式I的GalNAc酸衍生物用于制备有治疗价值的GalNAc寡核苷酸缀合物的用途以及制备该缀合物的方法。
所述目的可以通过本发明的方法来实现，其包括：
a)将式II的三胺盐
Figure BDA0001532402020000021
其中R1是酯保护基团，且X是酸的阴离子，
在肽偶联试剂、胺碱和有机溶剂的存在下与式III的四氢吡喃酸偶联，
Figure BDA0001532402020000022
其中n如上所述并且R2是羟基保护基团，
以形成式IV的GalNAc酯，
Figure BDA0001532402020000031
其中n、R1和R2如上所述；
b)酯保护基团R1和羟基保护基团R2在无机碱的存在下去除，以形成式V的GalNAc酸盐；
Figure BDA0001532402020000041
其中n如上文所述，且M是金属阳离子；
和
c)任选地将式V的GalNAc酸盐转化为式I的GalNAc酸衍生物。
阐述以下定义以说明和定义本文用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
当手性碳存在于化学结构中时，意味着与该手性碳相关的所有立体异构体都包含在纯的立体异构体及其混合物中。
术语“C1-7烷基”是指1至7个碳原子的单价直链或支链饱和烃基，并且在更具体的实施方案中为1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
术语苯基-C1-7-烷基是指与如上文所定义的C1-7烷基连接的苯基基团。具体实例是苄基基团。
该苯基基团可以任选地被卤素例如氯、溴或碘或者被如上文所定义的C1-7烷基基团取代。
术语“氨基保护基团”是旨在保护氨基的基团，且包括苄基、苄氧基羰基、苄氧羰基(CBZ或Z)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、叔丁氧基羰基(BOC)和三氟乙酰基。这些基团的其它实例可以在T.W.Greene和P.G.M.Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,第2版,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,1991,第7章；E.Haslam,“Protective Groups in Organic Chemistry”,J.G.W.McOmie,Ed.,Plenum Press,New York,NY,1973,第5章，以及T.W.Greene,“Protective Groups inOrganic Synthesis”,John Wiley和Sons,New York,NY,1981中找到。优选的氨基保护基团是FMOC和BOC。
术语“羟基保护基团”和术语“酯保护基团”是指旨在保护羟基的基团，包括形成酯和醚的基团，特别是四氢吡喃基、苯甲酰基、乙酰基、氨基甲酰基、苄基和甲硅烷基醚(例如TBS、TBDPS)基团。这些基团的其它实例在T.W.Greene和P.G.M.Wuts,“Protective Groupsin Organic Synthesis”,第2版,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,1991,第2-3章；E.Haslam,“Protective Groups in Organic Chemistry”,J.G.W.McOmie,Ed.,PlenumPress,New York,NY,1973,第5章，和T.W.Greene,“Protective Groups in OrganicSynthesis”,John Wiley和Sons,New York,NY,1981中找到。
在优选的实施方案中，该GalNAc衍生物具有式Ia，其中n如上文所述。
Figure BDA0001532402020000061
同样，与式Ia一致，中间体II、III、IV、X、XI、XII、XIII、XIV、XX、XXI和XXII在其手性中心处具有相同的立体化学。
式II的三胺盐(结构单元A)的合成
该方法包括：
a1)将式X的羧酸转化为式XI的酯，
Figure BDA0001532402020000062
其中R3’和R4是不同的，且各自独立地是氨基保护基团，
Figure BDA0001532402020000071
其中R1是酯保护基团，且R3’和R4如上文所述；
b1)去除氨基保护基团R4，并随后形成式XII的胺盐，
Figure BDA0001532402020000072
其中R1和R3’如上文所述，且X-是酸阴离子；
c1)将式XII的胺盐与式XIII的己酸衍生物偶联，
Figure BDA0001532402020000073
其中R3“和R3“‘是氨基保护基团，
以形成式XIV的被保护的三胺，
Figure BDA0001532402020000074
其中R3’、R3’‘、R3“‘和R1如上文所述；
d1)用酸将被保护的式XIV的三胺转化为式II的三胺盐。
步骤a1)包括将式X的羧酸用醇R1OH在活化试剂、胺催化剂和有机溶剂的存在下转化为各自的式XI的酯。
由于所述酯保护基团应当是在碱性条件下可去除的，合适的醇R1OH是其中R1是C1-7烷基或苯基-C1-7烷基的那些，其中所述苯基任选被卤素或C1-7烷基取代。特别合适的是C1-4脂肪族醇如甲醇或乙醇或苄醇。优选的醇是苄醇。
重要的是，氨基保护基团R3’、R3”和R3”’的去除条件与R4不同。适合地，R3’、R3”和R3”’选择在酸性条件下可去除的氨基保护基团例如优选Boc基团。
对于R4氨基保护基团，优选在碱性条件下或通过氢解可去除的基团，如FMOC(碱性条件)或Z(氢解)。FMOC是R4优选的氨基保护基团。
适合的活化试剂可以选自本领域内技术人员已知的常规碳二亚胺类，例如N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，但优选使用DCC。
胺催化剂、优选4-(二甲基氨基)吡啶的存在对于酯化反应是有利的。
酯化反应通常在20℃至50℃的温度下，在非质子有机溶剂例如卤代烃如二氯甲烷中进行。
步骤b1)在第一步骤中涉及在有机溶剂存在下用脂肪族胺除去氨基保护基R4，优选Fmoc。
脂肪族胺适宜的为脂肪族仲胺如二甲胺、二乙胺、吗啉或哌嗪。优选使用二乙胺。
反应通常在合适的有机溶剂中，例如在极性非质子溶剂如四氢呋喃中，在20℃和50℃之间的反应温度下进行。
过量的胺可以适当地通过用合适的溶剂例如乙腈经共沸蒸馏除去。
在步骤b1)的第二个步骤中用适合的酸将游离胺转化为式XII的胺盐。
合适的酸是无机酸如盐酸或磷酸或磺酸。优选地可以使用磺酸如甲磺酸或对甲苯磺酸，且更优选甲磺酸。
因此X代表所用酸的阴离子。
因为游离胺通常不被分离，所以反应可以在步骤b1)使用的乙腈中通常在室温下进行。
形成的式XII的胺盐通常可以通过过滤分离。
式XII的铵盐
Figure BDA0001532402020000091
其中R1和R3’是胺保护基团，且X-是酸的阴离子，其不是本领域已知的化合物，因此其构成是本发明的另一项实施方案。
在式XII的胺盐的其它优选的实施方案中，R1是苄基，R3’是Boc，且X是甲磺酸的阴离子。
步骤c1)包括将式XII的胺盐(其中R1、R3’和X如上文所述，但优选R1是苄基，R3’是Boc，且X是甲磺酸的阴离子)与式XIII的己酸衍生物(其中R3”和R3”’如上文所述，但优选是Boc)以及偶联试剂在胺碱和有机溶剂的存在下偶联，并形成式XIV的被保护的三胺。
该偶联反应可以按照本领域技术人员已知的常规方法进行，使用碳二亚胺偶联试剂，如DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺)或EDC.HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N`-乙基碳二亚胺盐酸化物和添加物如HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)、TBTU(N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟硼酸盐)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其常规组合，如TBTU/HOBt或HBTU/HOAt。
在优选的实施方案中，选择正丙基膦酸酐(T3P)作为偶联试剂与叔胺碱如三乙胺或N-乙基二异丙胺，但优选与N-乙基二异丙胺一起反应。
式XIII的己酸衍生物，特别是Boc保护的衍生物是可商购的化合物。
偶联反应通常在极性非质子溶剂如乙腈或四氢呋喃或其混合物中，在0℃至50℃的反应温度下进行。
粗的式XIV的被保护的三胺的分离可以通过除去溶剂来进行。随后例如用乙腈结晶得到高纯度的产物，其可以容易地用于下一步骤d1)。
在优选的实施方案中，在式XIV的被保护的三胺中R1是苄基，且R3’、R3”和R3”’是Boc。
步骤d1)包括式XIV的被保护的三胺用酸在有机溶剂存在下转化为式II的三胺盐，其中R1、R3’、R3”和R3”’如上文所述，优选R1是苄基且R3’、R3”和R3”’是Boc。
合适的酸是无机酸如盐酸或磷酸、三氟乙酸或磺酸。可优选使用磺酸如甲磺酸或对甲苯磺酸，且更加优选甲磺酸。
优选使用过量的4当量至10当量的各自的酸。
该反应通常在合适的极性非质子溶剂中，在20℃至80℃的反应温度下进行。
在本发明的一项优选的实施方案中，所述转化在防止所得的式II的三胺盐结晶的极性非质子溶剂中进行。特别优选的溶剂是乙腈，其使所得的式II的三胺盐以乳液形式存在，该乳液可以容易地用于后续步骤a)中与式II的四氢吡喃酸的偶联反应。
合成式III的四氢吡喃酸(结构单元B):
用于制备式III的四氢吡喃酸的方法包括：
a2)将式XX的二醇
Figure BDA0001532402020000101
其中n是0-10之间的整数，
转化为式XXI的醇酯
Figure BDA0001532402020000102
其中n如上文所述，且R5是酯保护基团；
b2)式XXI的醇酯与式XXII的四氢吡喃衍生物偶联，
Figure BDA0001532402020000111
其中R2和R6各自独立地是羟基保护基团，
以形成式XXIII的四氢吡喃酯，
Figure BDA0001532402020000112
其中R2和R5如上文所述；
c2)去除酯基团R5，以形成式III的四氢吡喃酸。
步骤a2)需要将式XX的二醇转化为式XXI的醇酯。
式XX的二醇的特征在于n个重复的–(CH2-)-O-单元。整数n通常选自0-10之间，但优选0-5之间，更加优选0-2之间。优选的二醇是市场可获得的2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙醇(n＝1)。
在步骤a2)的第一个步骤中，将式XX的二醇用碱金属醇化物去质子化。
合适的碱金属醇化物是叔醇钠或叔醇钾，例如叔丁醇钠或叔丁醇钾或戊醇钠或戊醇钾。
对于去质子化，可以存在极性质子或极性非质子溶剂如N,N-二甲基甲酰胺或叔醇如叔丁醇或2-甲基-2-丁醇，反应可以在50℃至120℃进行。
在步骤a2)的第二个步骤中，乙酸部分是用卤代乙酸或其适合的盐引入。
合适的卤代乙酸是溴代或氯代乙酸或其碱金属盐。在一个优选的实施方案中，使用卤代乙酸的盐，更优选使用氯乙酸钠。
该反应可以在极性质子或极性非质子溶剂中进行，通常在与前一步骤相同的溶剂中进行。
反应温度取决于溶剂，但通常在50℃和120℃之间选择。
在步骤a2)的第三个步骤中，中间体酯盐不经分离而转化成式XXI的醇酯。
醇酯的形成意味着引入酯保护基团R5。
尽管本领域知道保护酯的许多可能性，但发现苄基是最合适的。其引入可以用苄基卤化物或苄基磺酰基酯进行，但是优选用苄基溴化物进行。
酯化可以在极性非质子溶剂中进行，通常在与前一步骤相同的溶剂中，在20℃至120℃的反应温度下进行。
从反应混合物中分离醇酯可以通过用合适的溶剂例如甲基叔丁基醚萃取并除去溶剂来进行。步骤b2)需要式XXI的醇酯与式XXII的四氢吡喃衍生物在酸和有机溶剂存在下反应，形成式XXIII的四氢吡喃酯。
尽管本领域知道许多羟基保护基团，但R2和R6优选是乙酰基。
式XXII的四氢吡喃衍生物，特别是乙酰基衍生物是市售的化合物。
合适的酸是卤代磺酸，如优选的三氟甲磺酸。
反应通常在极性非质子溶剂如二氯甲烷存在下，在0℃至40℃的反应温度下进行。
在一项优选的实施方案中，生成的乙酸在反应过程中被连续蒸馏掉。
在中和反应混合物之后，可以通过除去溶剂来分离式XXIII的四氢吡喃酯。粗产物可以通过硅胶色谱用正庚烷/丙酮或优选叔丁基甲基醚/丙酮作为流动相来纯化。
在一项优选的实施方案中，式XXIII的四氢吡喃酯中R2是乙酰基，且R6是苄基。
步骤c2)是指酯基R6的去除。
酯基的去除原则上是本领域技术人员已知的，并在文献中有详细描述。
作为优选的实施方案，步骤c2)包括在氢化催化剂存在下用氢进行催化氢化以除去苄基，并形成式III的四氢吡喃酸。
用于去除苄基基团的常规氢化催化剂是钯/碳(Pd/C)。
反应通常在极性非质子溶剂如四氢呋喃的存在下，在10℃至30℃的反应温度和1巴至5巴的氢气压力下进行。
式III的四氢吡喃酸在过滤掉催化剂后可直接用于本发明方法的步骤a)中的后续偶联的溶液中。
在优选的式III的四氢吡喃酸中，R2是乙酰基。
在另一项实施方案中，式XXI的醇酯可以用包括以下步骤的方法制备：
a3)将式XXV的2-氨基乙酸酯用亚硝酸盐重氮化，
Figure BDA0001532402020000131
其中R5如上文所述，且X是卤素原子，
以形成式XXVI的2-重氮基化合物，
Figure BDA0001532402020000132
其中R5如上文所述；和
b3)将式XXVI的2-重氮基化合物用式XX的二醇转化为式XXI的所需醇酯。
步骤a3)需要式XXV的2-氨基乙酸酯的氨基重氮化并形成式XXVI的2-重氮基化合物。
式XXV的氨基乙酸酯是适合作为盐酸盐(X＝Cl)使用的可商购的化合物。
通常用碱性亚硝酸盐，优选用亚硝酸钠在水和非极性非质子溶剂的溶剂混合物存在下，在-10℃至10℃，优选0℃至5℃的反应温度下进行重氮化。
合适的非极性非质子溶剂可以选自甲基叔丁基醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、环戊基甲基醚、二氯甲烷和甲苯。优选甲苯以与水的1:1v/v混合物使用。
将获得的式XXVI的2-重氮基化合物保持溶解在有机相中，以用于在步骤b3)中的后续转化。
步骤b3)需要用式XX的二醇转化式XXVI的2-重氮基化合物。
如上所述，式XX的二醇的特征在于n个重复的–(CH2-)-O-单元。整数n通常选自0-10，但优选0-5，更优选0-2。优选的二醇是市售的2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙醇(n＝1)。
该反应可以在路易斯酸和非极性非质子溶剂存在下，在-10℃至10℃，优选0℃至5℃下进行。
非极性非质子溶剂通常与步骤a3)中使用的相同。
常规的路易斯酸可以选自三卤化硼，如三氟化硼及其市售的加合物如三氟化硼乙醚合物，或乙酸铑(II)或三氟甲磺酸铜(II)。优选采用乙醚合物形式的三氟化硼。
式XXI的醇酯可以通过常规的后处理程序从反应混合物中分离，包括分离有机层、蒸发除去溶剂和任选地通过色谱进一步纯化粗产物。
随后，式XXI的醇酯可以容易地用于下一步骤b2)。
结构单元A和B的组装
步骤a)需要在肽偶联剂、胺碱和有机溶剂存在下将式II的三胺盐与式III的四氢吡喃酸偶联，以形成式IV的GalNAc酯。
如上所述，式II的三胺盐和式III的四氢吡喃酸可优选在不从来自其合成的反应混合物中分离的情况下使用。
如上所述，在优选的式III的四氢吡喃酸中，R2是乙酰基，在优选的式II的三胺盐中，R1是苄基且X是甲磺酸的阴离子。
所述偶联可以按照本领域技术人员已知的典型方法进行，使用碳二亚胺偶联剂如DCC和添加物如HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)、TBTU(N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐)、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑以及其通常组合，如TBTU/HOBt或HBTU/HOAt。
在优选的实施方案中，选择正丙基膦酸酐(T3P)作为偶联剂，以及叔胺碱如三乙胺或N-乙基二异丙基胺，但优选N-乙基二异丙基胺。
所述偶联反应通常在极性非质子溶剂如乙腈或四氢呋喃或其混合物中，在20℃-70℃的反应温度下进行。
所形成的甲磺酸和过量的胺碱以及偶联剂可以在偶联反应完成后通过将粗产物在合适的有机溶剂如2-丙醇中沉淀而除去。
在备选和优选的实施方案中，步骤a)和b)可以合并，以一个步骤进行，不分离式IV的GalNAc酯。因此，来自步骤a)的反应混合物可以用如下面的步骤b)所述的无机碱直接处理。
在优选的式IV的GalNAc酯中，R1是苄基且R2是乙酰基。
步骤b)需要在无机碱存在下除去酯保护基团R1和羟基保护基团R2，形成式V的GalNAc酸盐。
通常，式IV的GalNAc酯溶于极性有机溶剂，特别是醇，例如甲醇。
M代表金属阳离子，通常是碱金属或碱土金属阳离子，如锂、钠、钾、铷、钙或镁，但优选钠、钾或钙，更优选钠。
因此，合适的无机碱是碱金属或碱土金属氢氧化物，选自钠、钾或钙的氢氧化物，通常以水溶液形式应用。优选地，以11当量到25当量过量使用氢氧化钠水溶液。
该反应在0℃-40℃的温度下进行。
粗产物可以通过蒸发溶剂分离。产物的进一步纯化可以通过制备型反相色谱进行，使用极性固定相和极性流动相。
发现优选的极性流动相是碳酸氢钠水溶液和乙腈的混合物，其以改变的梯度使用。
将来自色谱的所选择的流分进行浓缩提供了式V的纯的GalNAc酸。
在优选的式V的GalNAc酸盐中，R1是苄基，R2是乙酰基且M是钠。
在式V的GalNAc盐经历任选的步骤c)的情况下，不需要浓缩，所述步骤c)包括将式V的GalNAc酸盐转化为式I的GalNAc酸衍生物。
进行所述转化可以通过用合适的阳离子交换剂进行离子交换，或者用合适的酸进行中和，例如磷酸或磺酸如甲磺酸。
在分离所需的式I的GalNAc酸衍生物的情况下，所述转化可以优选在甲醇溶液中进行。除去溶剂得到高纯度和收率的所需产物。
或者，如果式I的GalNAc酸衍生物直接与寡核苷酸进行缀合，则所述转化适合在极性非质子溶剂如N,N'-二甲基甲酰胺中进行。
或者，如上所述，式I的GalNAc酸衍生物可以在合适的无机碱存在下转化回式V的GalNAc盐。该备选方法原则上可以改变金属阳离子。
在式I的GalNAc酸衍生物的上下文中，术语“盐”相应地是指具有选自锂、钠、钾、铷、钙或镁，但优选钠、钾或钙，更优选钠的阳离子的碱金属盐或碱土金属盐。
与寡核苷酸的缀合
式I的GalNAc酸衍生物或式V的GalNAc酸盐可以按照最初描述的用于制备有治疗价值的GalNAc寡核苷酸缀合物。
如本文所用，术语寡核苷酸定义为如本领域技术人员通常理解的包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。为了用作有治疗价值的寡核苷酸，寡核苷酸通常合成为长度为7-30个核苷酸。
寡核苷酸可以由DNA、RNA、修饰的RNA或LNA核苷单体或其组合组成。LNA核苷单体是修饰的核苷，其包含位于核苷酸的核糖环的C2'和C4'之间的接头基团(称为双基或桥)。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。
寡核苷酸还可以在寡核苷酸的5'端包含氨基接头，例如C-6-氨基接头。
GalNAc多核苷酸缀合物的制备包括以下步骤：
a3)根据本发明的如上所述，制备式I的GalNAc酸衍生物或式V的GalNAc酸盐，和
b3)将式I的GalNAc酸衍生物或式V的GalNAc酸盐在肽偶联条件下与多核苷酸缀合。
优选使用式V的GalNAc酸盐缀合。
肽偶联条件是本领域技术人员已知的经典方法，使用碳二亚胺偶联剂如DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺)或EDC.HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N`-乙基碳二亚胺盐酸盐和添加物如HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)、TBTU(N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑以及它们的通常组合，例如TBTU/HOBt或HBTU/HOAt。
例如，可引用美国专利申请公开号2011/0207799来参考GalNAc衍生物与寡核苷酸的缀合。
实施例
缩写：
AcOH 乙酸
DMAP 4-(二甲基氨基)-吡啶
DMF N,N’-二甲基甲酰胺
EtOH 乙醇
MeOH 甲醇
rt 室温
THF 四氢呋喃
TBME 叔丁基甲基醚
结构单元A:
实施例1
(2S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸苄基酯
Figure BDA0001532402020000181
将234.0g(500.0mmol)(2S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸悬浮于500ml二氯甲烷，加入62.0ml(600mmol,1.2当量)苄胺和3.05g DMAP(25.0mmol,0.05当量)。将该溶液在40分钟的时间内冷却到0-5℃，滴加108.0g(525.0mmol,1.05当量)N,N’-二环己基碳二亚胺在500ml二氯甲烷中的溶液。将白色混悬液在0-5℃搅拌1小时，然后在室温下搅拌15小时。将混悬液经G3玻璃滤器过滤，白色滤饼用总量250ml的二氯甲烷分批洗涤。以650-10毫巴/1h蒸发滤液，得到黄色油，其溶于2.0L乙酸乙酯，用2.0L0.5M盐酸、2.0L 1M NaHCO3和1.0L盐水洗涤，有机层以40℃/150-10毫巴/5h蒸发至干，得到291.1g粗的(2S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸苄基酯，为白色固体，产率104％，96.4％纯度(HPLC面积％；含有约5％苄醇)。该物质不经进一步纯化而用于下一步骤。MS：m/z＝459.22735(M-boc+H)+。
实施例2
(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯甲磺酸盐
Figure BDA0001532402020000191
将291.1g(500.0mmol)(2S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸苄基酯(HPLC纯度；95.8％；含有约5％苄醇)在室温下溶于1.4L THF。在10分钟内，加入1.04L二乙胺(10.0mol,20当量)，将该浅黄色溶液在室温搅拌2小时，接着在40℃/200-10毫巴蒸发，加入200ml乙腈，并在40℃/100-10毫巴/1h再次蒸发以充分除去二乙胺。最后，获得268.1g的黄色油，将其溶于2.5L乙腈，在室温下搅拌10分钟。经玻璃滤器滤出不溶性颗粒，用500ml乙腈洗涤。滤液在20℃-25℃在10分钟内用34.0ml甲磺酸滴加处理。形成的白色混悬液在室温搅拌17小时，用G3玻璃滤器过滤。滤饼用500ml乙腈分批洗涤。将白色晶体以40℃/15毫巴/4h干燥，得到195.8g(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯甲磺酸盐，为白色晶体，91％产率(两步骤)和99.3％纯度(HPLC面积％)。MS:m/z＝337.2149(M+H)+。
实施例3
(2S)-2-[[(2S)-2,6-二(叔丁氧基羰基氨基)己酰基]氨基]-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯
Figure BDA0001532402020000201
将190.0g(439.0mmol)(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯甲磺酸盐在室温下悬浮于1.9L THF。加入335ml(1.98mol,4.5当量)N-乙基二异丙基胺，因此温度轻微降低至15℃。接着，加入213g(615mmol,1.4当量)(S)-2,6-二((叔丁氧基羰基)氨基)己酸，该白色混悬液在室温下搅拌20分钟。在20分钟内在20-25℃滴加390ml正丙基膦酸酐(T3P，为环状三聚体，50％在乙酸乙酯中的溶液，659mmol，1.5当量)(在冷水浴中冷却)。将所得浅黄色浑浊溶液在室温下搅拌1.5小时，转移至分液漏斗，用1.9L TBME稀释，用1.9L水、1.9L 0.5M盐酸、1.9L 0.5M NaOH、1.9L水和1.9L盐水萃取。所分离的浑浊有机层经玻璃纤维滤器过滤，将滤器用100ml TBME洗涤，并将合并的滤液以40℃/100毫巴/1h蒸发，再次加入1.0L TBME(以便共沸除去水)，以40℃/250-10毫巴/1h蒸发，得到粗物质296.4g，为白色固体残余物。
将粗固体用500ml乙腈处理，并将浑浊的溶液加热到60-65℃，持续10分钟。将混合物冷却到20-25℃，搅拌10分钟，经玻璃纤维滤器过滤，用50ml乙腈洗涤。将该浅黄色溶液以40℃/100-10毫巴/4h蒸发，得到295g(2S)-2-[[(2S)-2,6-二(叔丁氧基羰基氨基)己酰基]氨基]-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯，为浅白色固体，产率101％(HPLC纯度：100％，非对映异构体纯度(SS)98.6％)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。MS:m/z＝565.3741(M-boc+H)+。
实施例4
(2S)-6-氨基-2-[[(2S)-2,6-二氨基己酰基]氨基]己酸苄基酯三甲磺酸盐
Figure BDA0001532402020000211
将124.0g(187mmol)(2S)-2-[[(2S)-2,6-二(叔丁氧基羰基氨基)己酰基]氨基]-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸苄基酯悬浮于1.25L乙腈。在20-25℃在10分钟内加入61.0ml(935.0mmol,5.0当量)甲磺酸(气体放出)。将所得橙色混悬液在40分钟内加热到55-60℃，并在55-60℃再搅拌1小时。将该橙红色乳液冷却到室温(通过1H-NMR控制debocation)，并且不经进一步纯化而用于实施例8的A+B的组装步骤。MS:m/z＝365.2558(M+H)+。
结构单元B：
实施例5a
2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯
Figure BDA0001532402020000212
在20-25℃将30.0g(200.0mmol)2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙醇溶于50ml DMF中，接着加入46.0ml 25％甲醇钠(200.0mmol,1.0当量)的甲醇溶液。将所形成的溶液以40℃/50毫巴/0.5h蒸发(除去40ml溶剂)，再加入50ml DMF，以40℃/20毫巴/0.5h蒸发(除去15ml溶剂)。在20-25℃向该轻度果冻状混悬液中加入13.9g溴乙酸(100mmol,0.5当量)在50ml DMF中的溶液，并将混合物搅拌6小时。加入11.9ml苄基溴(100mmol,0.5当量)，并将混合物在20-25℃再搅拌16小时。接着将反应混合物用200ml盐水处理，用200ml TBME萃取。分离的TBME层用200ml盐水萃取，接着将分离的TBME层用无水硫酸钠干燥，过滤，以40℃/300-10毫巴/1h蒸发，得到粗的23.9g 2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯。
在色谱纯化(600g硅胶60(0.063-0.2mm)，流动相：乙酸乙酯)后，分离到总计7.85g无色油状的2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，13％产率，99.0％纯度(HPLC面积％)。MS:m/z＝299.1517(M+H)+。
实施例5b
2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯
Figure BDA0001532402020000221
将11.2g叔丁醇钾(100.0mmol,0.5当量)悬浮在70ml 2-甲基-2-丁醇中(轻度放热35℃)，接着在5分钟的时间内滴加30.0g(200.0mmol)2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙醇。滴液漏斗用10ml 2-甲基-2-丁醇(温度升至45℃)清洗，将溶液加热到60-65℃，加入11.6g(100mmol,0.5当量)氯乙酸钠，并在60-65℃搅拌16小时，接着加入11.9ml苄基溴(100mmol,0.5当量)，并将混合物在60-65℃再搅拌16小时。将反应混合物冷却到室温，然后用50ml水处理，用80ml TBME和40ml TBME萃取。将合并的TBME层用50ml半饱和的盐水洗涤，有机层以40℃/300-10毫巴/1h蒸发，得到粗的27.0g 2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯。
在色谱分离(270g硅胶60(0.063-0.2mm)，流动相：从乙酸乙酯/正庚烷1/1开始，当纯产物可见时，流动相改为100％乙酸乙酯)后，分离到总计11.4g 2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，为接近无色的油，19％产率(38％来自氯乙酸钠)和99.0％纯度(HPLC面积％)。
实施例5c
2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯
Figure BDA0001532402020000231
将40.3g(200.0mmol)2-氨基乙酸苄基酯盐酸盐溶于冷却到0-5℃的340ml水和340ml甲苯中，在60分钟时间内，在0-5℃在剧烈搅拌下滴加16.5g(240mmol,1.2当量)亚硝酸钠在50ml水中的溶液。将反应混合物在0-5℃搅拌3小时。分离黄色甲苯层，用340ml 1MNaHCO3和340ml盐水洗涤，分离的甲苯层用60g硫酸钠处理，在20-25℃搅拌1小时。过滤黄色混悬液，用50ml甲苯洗涤。澄清的黄色甲苯溶液含有最多200.0mmol 2-重氮基乙酸苄基酯(约8.5％在甲苯中的溶液)。将该溶液在60分钟时间内滴加到冷却至0-5℃并充分搅拌的60.0g(400mmol)三乙二醇和465μl(3.67mmol,0.02当量)三氟化硼乙醚合物在170ml甲苯的混合物中，有氮气放出。该黄色反应混合物在20-25℃搅拌90分钟，此时形成无色溶液。将溶液用250ml盐水萃取，分离的有机层用60g硫酸钠干燥，过滤，用100ml甲苯洗涤，以40℃/40-10毫巴/1h蒸发，得到粗的49.9g 2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯。用Teledyne Isco CombiFlash(330g硅胶60(0.035-0.070mm Teledyne Isco Cat.No.69-2203-330)进行色谱分离，流动相：梯度为在45min内15％丙酮85％正庚烷到30％和70％，流分体积：20ml。合并的流分得到33.88g 2-[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，为无色油状，总产率57％和99.0％纯度(HPLC面积％)。
实施例6
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯
Figure BDA0001532402020000241
将268.0g 2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸苄基酯(900mol)溶于2.4L二氯甲烷。加入385.0g(2S,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基三乙酸酯(990mmol,1.1当量)和12.0ml三氟甲磺酸(135mmol,0.15当量)。将混悬液用Dean-Stark分离器加热回流(50ml，以除去AcOH)。1小时后，将4.50ml三氟甲磺酸(50.7mmol,0.05当量)和50ml二氯甲烷加入该有机混悬液，将溶剂(50ml)通过Dean-Stark分离器除去。每半小时重复此操作，总共6次(3h)。在总共4.5小时后，将红色溶液冷却到10-15℃，并在20-25℃在30分钟内加入到1.8L 1M碳酸氢钠(1.8mol,2.0当量)溶液中(CO2放出,pH 7-8)。分离黄色有机层，以40℃/600-10毫巴/3h蒸发，得到585.4g粗的2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，为黄色油(HPLC纯度：87％)。将粗产物溶于700ml丙酮，加载到预装填的硅胶柱上(3.0kg硅胶60；0.063-0.2mm)。使用正庚烷/丙酮作为流动相(梯度从5:1到1:2)进行色谱分离。合并的收集液以40℃/600-10毫巴蒸发，并以20-25℃/0.3毫巴/3h干燥，得到465.0g 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯，为黄色油，83％产率，100％纯度(HPLC面积％)。MS:m/z＝628.2627(M+H)+。
实施例7
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸
Figure BDA0001532402020000251
在氩气下，将456.0g 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸苄基酯(727mmol)溶于1.4L THF。加入4.56g Pd/C 10％，并将氩气替换为氢气(1巴)。该黑色混悬液在20-25℃氢化2小时。将氢气替换为氩气，过滤黑色混悬液，滤饼用总计400ml THF分批洗涤。该无色滤液(HPLC纯度：71％，27％甲苯)不经任何纯化而用于实施例8的A+B组装步骤。MS:m/z＝538.2191(M+H)+。
结构单元A和B的组装
实施例8a
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯
Figure BDA0001532402020000261
将实施例4的(2S)-6-氨基-2-[[(2S)-2,6-二氨基己酰基]氨基]己酸苄基酯三氟甲磺酸盐(180.0mmol)的红橙色溶液(～1.4L)用3.60L乙腈稀释。在20-25℃下，在5分钟内加入365.0ml N-乙基二异丙基胺(2.16mol,12.0当量)。向所形成的粘性浆液中在20-25℃下在10分钟内加入来自实施例7的2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸(720mmol,4.0当量)溶液(～2.25L)，温度由此轻微升至40℃。在45-50℃将425ml正丙基膦酸酐(T3P,三聚体，50％在乙酸乙酯中的溶液,720mmol,4.0当量)在10分钟内加入。反应溶液在45-50℃搅拌1小时。将该浅黄色溶液冷却到20-25℃，并以40℃/10毫巴/6h蒸发，得到1.06kg粗的(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯(HPLC纯度：24.1％)。将粗产物分三批沉淀以除去甲磺酸N-乙基二异丙基胺和残余的T3P。将353g粗产物溶于7.0L 2-丙醇，在1小时内冷却到-25℃，在-25℃搅拌1小时，通过预冷的(-25℃)G3玻璃滤器过滤(不清洗)，沉淀产物的一部分从反应器中沉积在玻璃壁上。将所有沉淀物从滤器和玻璃壁中用总计1.0L THF分批溶解。将合并的溶液以40℃/20毫巴/6h蒸发，得到390.0g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯(HPLC纯度：71.9％),其不经进一步纯化而用于下一步骤。MS:m/z＝1923.8438(M+H)+
实施例8b
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠
Figure BDA0001532402020000271
将(2S)-6-氨基-2-[[(2S)-2,6-二氨基己酰基]氨基]己酸苄基酯三氟甲磺酸盐(12.2mmol)的红橙色溶液(～95ml)用240ml乙腈稀释。在20-25℃，将30.0ml N-乙基二异丙基胺(2.16mol,14.5当量)在5分钟内加入。在20-25℃下向所形成的粘性浆液中在10分钟内加入2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸(48.8mmol,4.0当量)溶液(～150ml)，温度由此轻微升至40℃。在45-50℃将28.8ml正丙基膦酸酐(T3P，三聚体，50％在乙酸乙酯中的溶液，48.8mmol,4.0当量)在10分钟内加入。反应溶液在45-50℃搅拌1小时。将该浅黄色溶液冷却到20-25℃，并以40℃/10毫巴/6h蒸发，得到粗的73.6g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯(HPLC纯度：32％面积)。
将68.0g(11.0mmol)的粗产物溶于340ml甲醇，向该浅黄色溶液中加入20.0ml(220mmol,20当量)10.8M NaOH，温度升至32℃，将反应混合物在室温下搅拌2.5小时，由此形成混悬液(pH 12.0)。将混悬液过滤，并将滤饼用100.0ml甲醇洗涤，滤液以40℃/250-10毫巴/2h蒸发，得到41.5g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠，其随后经制备型反相色谱纯化，条件如实验9所示。
实施例9
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠
Figure BDA0001532402020000291
将378.0g(197.0mmol,粗的)(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸苄基酯溶于1.9L甲醇。在10分钟内，在20-25℃加入200.0mL 10.8M氢氧化钠溶液(2.16mol,11.0当量)。温度由此升至31℃。将该浅黄色溶液在20-25℃搅拌2小时(pH13.4)，接着加入80.0mL 5M氯化铵溶液(pH 10.7)。然后将该浅黄色溶液以20-25℃/100-20毫巴/5h蒸发，以20-0.5毫巴/1h干燥，得到543g粗的(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠(HPLC纯度：40.1％)，其随后经制备型反相色谱纯化。
柱：Triart C18-120 26x15cm；10um；
流动相：A:2mM NaHCO3/B:乙腈；
梯度：
分钟 A B 流速(ml/Min)
0 94 6 700
2 94 6 700
20 88 12 700
20.1 10 90 750
26 10 90 750
26.1 94 6 700
36 94 6 700
恒温控制：室温
检测：220nm
溶液：543g溶解于4500ml 2mM NaHCO3中并过滤(GF5)(＝5000ml(109mg/ml)
样品溶液/进样：每次运行200ml样品＝21.8g(25次运行)
浓缩：将合并的流分(46L)用110L水稀释，将溶液分三批泵入RP C18柱，并用水/MeOH 98/2洗涤，接着用MeOH洗脱，在旋转蒸发仪上浓缩，得到1.18kg在甲醇中的溶液。将制备型HPLC纯化步骤的该1.18kg甲醇溶液的四分之一(即295g)以40℃/20毫巴/1h蒸发，接着以20-25℃/0.35毫巴/14h干燥，得到43.5g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钠，为无定形白色粉末，99.88％HPLC纯度。以上溶液剩余的四分之三(885g)用于下一步骤。MS：m/z＝1452.684(M-H)-。
实施例10
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2，6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R，3R，4R，5R，6R)-3-乙酰氨基-4，5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸
Figure BDA0001532402020000311
将实施例9的甲醇溶液(885g)在20-25℃用47.9g Dowex(50x8阳离子交换剂；H3O+浓度2.57mmol/g)处理搅拌1小时(pH 3.1)，过滤，并用200mL甲醇洗涤。滤液以20-25℃/15-50毫巴蒸发，以20-25℃/0.01毫巴/2h干燥，得到128.0g(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸，为无定形白色粉末，99.77％HPLC纯度。MS：m/z＝1452.684(M-H)-。
实施例11
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸钙
Figure BDA0001532402020000312
将0.10g(0.068mmol)(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸溶于3.0ml甲醇和0.30ml水中，加入2.60mg(0.034mmol,0.5当量)氢氧化钙，将混合物在室温下搅拌1小时。将轻微浑浊的溶液以40℃/200-10毫巴/1h蒸发，得到0.11g白色固体。99.60％HPLC纯度。MS：m/z＝1452.684(M-H)-。
与寡核苷酸缀合
实施例11(按照美国专利申请公开号2011/0207799的实施例15进行)
将(20mg,0.014mmol)(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-2-[[(2S)-2,6-二[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]己酸(GalNAc酸)与吡啶和二氯甲烷共蒸发。将残余物溶于无水的DMF(0.9ml)中，在氩气下搅拌的条件下加入N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)在DMF中的溶液(1.6mg,0.014mmol)。在0℃缓慢加入N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)在DMF中的溶液(3.2mg,0.016mmol)。使反应加温至室温，并搅拌过夜。所形成的GalNAc N-羟基琥珀酰亚胺酯不经进一步纯化而用于与RNA缀合。
所用RNA是氨基-修饰的RNA，具有以下序列：5′-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3′(SEQ ID 1)，其中u和c分别是相应碱基的2′-O-甲基核苷酸且s表示硫代磷酸酯。
该RNA(2.54μmol)具有在5′-末端的C-6氨基接头，将其冷冻干燥并溶于250μL硼酸钠缓冲液(0.1mol/L硼酸钠,pH 8.5,0.1mol/L KCl)和1.1mL DMSO中。在加入8μL N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)后，在连续搅拌下将GalNAc N-羟基琥珀酰亚胺酯(理论值0.014mmol)在DMF中的溶液缓慢加入RNA溶液中。将反应混合物在35℃搅拌过夜。反应使用RP-HPLC(源RPC3ml，缓冲液：A：100mM三乙基铵乙酸盐(TEAA,2.0M,pH 7.0)的水溶液，B：100mM TEAA在95％乙腈中的溶液，梯度：在20个柱体积内，5％B到22％B)监测。在-20℃使用乙酸钠的乙醇溶液(3M)沉淀RNA后，将RNA缀合物使用以上条件纯化。收集纯流分，使用乙酸钠/EtOH沉淀所需的缀合物，得到纯的RNA缀合物。该缀合物以59％产率(1.50μmol)分离。缀合物的纯度通过阴离子交换HPLC分析(纯度：85.5％)，通过ESI-MS鉴定([M+H]1+ 计算值：8374.4；[M+H]1+ 实测值：8376.0。

Claims (30)

1.制备式I的GalNAc酸衍生物及其盐、相应的对映异构体和/或光学异构体的方法
Figure FDA0003039650930000011
其中n是0-10的整数，
所述方法包括：
a)将式II的三胺盐
Figure FDA0003039650930000012
其中R1是酯保护基团，且X是酸的阴离子，
在肽偶联试剂、胺碱和有机溶剂的存在下与式III的四氢吡喃酸偶联，
Figure FDA0003039650930000021
其中R2是羟基保护基团并且n如上所述，
以形成式IV的GalNAc酯，
Figure FDA0003039650930000022
其中R1和R2和n如上所述；
b)酯保护基团R1和羟基保护基团R2在无机碱的存在下去除，以形成式V的GalNAc酸盐；
Figure FDA0003039650930000031
其中n如上文所述，且M是金属阳离子；
和
c)将式V的GalNAc酸盐转化为式I的GalNAc酸衍生物。
2.根据权利要求1的方法，其中n是0-5的整数，酯保护基团R1是C1-7-烷基或苯基-C1-7-烷基，其中所述苯基任选地被卤素或C1-7-烷基取代，所述羟基保护基团R2是乙酰基，且X选自磺酸的阴离子。
3.根据权利要求1的方法，其中所述肽偶联试剂是正丙基膦酸酐，且所述胺碱是叔胺。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中在步骤a)中所述偶联在有机溶剂中在20℃-70℃的反应温度下进行，所述有机溶剂是极性非质子溶剂。
5.根据权利要求1-3任一项的方法，其中在步骤b)中用于除去所述酯保护基团R1的无机碱是碱性氢氧化物。
6.根据权利要求1-3任一项的方法，其中将所述步骤a)和步骤b)合并，以一个步骤进行，不需要分离式V的GalNAc酸盐。
7.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述将式V的GalNAc酸盐转化为式I的GalNAc酸衍生物是通过阳离子交换或用酸处理来进行。
8.根据权利要求1-3任一项的方法，其中式I的GalNAc酸衍生物是式Ia的对映异构体，及其盐、相应的对映异构体和/或光学异构体
Figure FDA0003039650930000041
其中n如上文所定义。
9.根据权利要求1的方法，其中所述用于制备式II的三胺盐的方法包括以下步骤：
a1)将式X的羧酸转化为式XI的酯，
Figure FDA0003039650930000051
其中R3’和R4是不同的，且各自独立地是氨基保护基团，
Figure FDA0003039650930000052
其中R1是酯保护基团，且R3’和R4如上文所述；
b1)去除氨基保护基团R4，并随后形成式XII的胺盐，
Figure FDA0003039650930000053
其中R1和R3’如上文所述，且X-是酸阴离子；
c1)将式XII的胺盐与式XIII的己酸衍生物偶联，
Figure FDA0003039650930000054
其中R3“和R3“‘是氨基保护基团，
以形成式XIV的被保护的三胺，
Figure FDA0003039650930000061
其中R3’、R3”、R3“‘和R1如上文所述；
d1)用酸将式XIV的被保护的三胺转化为式II的三胺盐。
10.根据权利要求9的方法，其中R3’、R3”和R3“‘是相同的且可在酸性条件下除去的保护基团，R4是可在碱性条件下除去或通过氢解除去的保护基团。
11.根据权利要求10的方法，其中R3’、R3”和R3“‘是Boc，且R4是FMOC。
12.根据权利要求9-11任一项的方法，其中步骤a1)的转化是在活化试剂、胺催化剂和非质子有机溶剂存在下，在20℃-50℃的反应温度下用苄醇进行的。
13.根据权利要求9-11任一项的方法，其中所述氨基保护基团R4是FMOC，并且其在步骤b1)中的除去是在极性非质子溶剂中在20℃-50℃的反应温度下用脂肪族仲胺进行。
14.根据权利要求9-11任一项的方法，其中在步骤b1)中随后形成式XII的铵盐是用磺酸进行。
15.根据权利要求9-11任一项的方法，其中在步骤c1)中的偶联是使用正丙基膦酸酐作为偶联剂，在叔胺和极性非质子溶剂存在下在20℃-50℃的反应温度下进行。
16.根据权利要求9-11任一项的方法，其中在步骤d1)中，式II的三胺盐是用磺酸在极性非质子溶剂中在20℃-80℃的反应温度下形成。
17.根据权利要求16的方法，其中极性非质子溶剂选自防止式II的三胺盐结晶的溶剂。
18.根据权利要求1的方法，其中用于制备式III的四氢吡喃酸的方法包括：
a2)将式XX的二醇
Figure FDA0003039650930000071
其中n如上文所述，
转化为式XXI的醇酯
Figure FDA0003039650930000072
其中n如上文所述，且R5是酯保护基团；
b2)式XXI的醇酯与式XXII的四氢吡喃衍生物偶联，
Figure FDA0003039650930000073
其中R2和R6各自独立地是羟基保护基团，
以形成式XXIII的四氢吡喃酯，
Figure FDA0003039650930000081
其中n、R2和R5如上文所述；
c2)去除酯基团，以形成式III的四氢吡喃酸。
19.根据权利要求18的方法，其中所述羟基保护基团R2是乙酰基，所述酯保护基团R5是苄基，且所述羟基保护基团R6是乙酰基。
20.根据权利要求18或19的方法，其中在步骤a2)的第一步中，式XX的二醇使用碱金属醇化物在极性质子溶剂或极性非质子溶剂存在下在50℃-120℃的反应温度下脱质子。
21.根据权利要求18或19的方法，其中在步骤a2)的第二步中，使用卤代乙酸或其盐在极性质子溶剂或极性非质子溶剂存在下在50℃-120℃的反应温度下引入乙酸部分。
22.根据权利要求18或19的方法，其中在步骤a2)的第三步中，使用苄基卤化物或苄基磺酰基酯在极性非质子溶剂中在20℃-120℃的反应温度下形成其中R5是苄基的式XXI的醇酯。
23.根据权利要求18或19的方法，其中在步骤b2)中，将式XXI的醇酯与式XXII的四氢吡喃衍生物在卤代磺酸的存在下、在极性非质子溶剂存在下在0℃-140℃的反应温度下进行偶联。
24.根据权利要求18或19的方法，其中在步骤c2)中，在氢化催化剂的存在下通过使用氢气的催化氢化去除苄基酯基团。
25.根据权利要求18的方法，其中式XXI的醇酯的形成包括以下步骤：
a3)将式XXV的2-氨基乙酸酯用亚硝酸盐重氮化，
Figure FDA0003039650930000091
其中R5如上文所述，且X是卤素原子，
以形成式XXVI的2-重氮基化合物，
Figure FDA0003039650930000092
其中R5如上文所述；和
b3)将式XXVI的2-重氮基化合物用式XX的二醇转化。
26.根据权利要求25的方法，其中在步骤a3)中的所述重氮化使用碱金属亚硝酸盐在水和非极性非质子溶剂的溶剂混合物存在下，在-10℃至10℃的反应温度下进行。
27.根据权利要求25或26的方法，其中在步骤b3)中用式XX的二醇转化2-重氮基化合物是在路易斯酸和非极性非质子溶剂存在下在-10℃至10℃的反应温度下进行。
28.权利要求1-27的方法在制备GalNAc寡核苷酸缀合物的方法中的用途。
29.制备GalNAc寡核苷酸缀合物的方法，包括以下步骤：
a3)根据权利要求1-27所述，制备式I的GalNAc酸衍生物或式V的GalNAc酸盐，和
b3)将式I的GalNAc酸衍生物或式V的GalNAc酸盐在肽偶联条件下与寡核苷酸缀合。
30.根据权利要求29的方法，其中使用式V的GalNAc酸盐。
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