JP2018523643A - GalNAc酸誘導体の調製法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)式II
[式中、R1はエステル保護基であり、かつXは酸のアニオンである]
のトリアミン塩を、式III
[式中、nは前述のとおりであり、かつR2はヒドロキシ保護基である]
のテトラヒドロピラン酸と、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下でカップリングさせて、式IV
[式中、n、R1およびR2は前述のとおりである]
のGalNAcエステルを生成する段階;
b)エステル保護基R1およびヒドロキシ保護基R2を、鉱塩基(mineral base)存在下で除去して、式V
[式中、nは前述のとおりであり、かつMは金属カチオンである]
のGalNAc酸塩を生成する段階;
および
c)任意で、式VのGalNAc酸塩を式IのGalNAc酸誘導体に変換する段階。
方法は以下の段階を含む。
a1)式X
[式中、R3'およびR4は異なり、互いに独立にアミノ保護基である]
のカルボン酸を、式XI
[式中、R1はエステル保護基であり、かつR3'およびR4は前述のとおりである]
のエステルに変換する段階;
b1)アミノ保護基R4を除去し、続いて式XII
[式中、R1およびR3'は前述のとおりであり、かつX-は酸アニオンである]
のアミン塩を生成する段階;
c1)式XIIのアミン塩を、式XIII
[式中、R3''およびR3'''はアミノ保護基である]
のヘキサン酸誘導体とカップリングさせて、式XIV
[式中、R3'、R3''、R3'''およびR1は前述のとおりである]
の保護トリアミンを生成する段階;
d1)式XIVの保護トリアミンを酸により式IIのトリアミン塩に変換する段階。
式IIIのテトラヒドロピラン酸を生成する方法は以下の段階を含む。
a2)式XX
[式中、nは0〜10の間の整数である]
のジオールを、式XXI
[式中、nは前述のとおりであり、かつR5はエステル保護基である]
のアルコールエステルに変換する段階;
b2)式XXIのアルコールエステルを式XXII
[式中、R2およびR6は互いに独立にヒドロキシ保護基である]
のテトラヒドロピラン誘導体とカップリングさせて、式XXIII
[式中、R2およびR5は前述のとおりである]
のテトラヒドロピランエステルを生成する段階;
c2)エステル基R5を除去して、式IIIのテトラヒドロピラン酸を生成する段階。
a3)式XXV
[式中、R5は前述のとおりであり、かつXはハロゲン原子である]
の2-アミノ酢酸エステルを亜硝酸塩でジアゾ化して、式XXVI
[式中、R5は前述のとおりである]
の2-ジアゾ化合物を生成する段階;および
b3)式XXVIの2-ジアゾ化合物を式XXのジオールにより、式XXIの所望のアルコールエステルに変換する段階。
段階a)は、式IIのトリアミン塩を式IIIのテトラヒドロピラン酸と、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下でカップリングさせて、式IVのGalNAcエステルを生成することを必要とする。
治療的に有用なGalNAcオリゴヌクレオチド結合体の調製のために、最初に記載したとおり、式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を用いることができる。
a3)本発明の式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を前述のとおりに調製する段階、および
b3)式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を、ペプチドカップリング条件下でポリヌクレオチドと結合させる段階。
AcOH 酢酸
DMAP 4-(ジメチルアミノ)-ピリジン
DMF N,N'-ジメチルホルムアミド
EtOH エタノール
MeOH メタノール
rt 室温
THF テトラヒドロフラン
TBME tert-ブチルメチルエーテル
実施例1
(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル
234.0g(500.0mmol)の(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸を500mlのジクロロメタンに懸濁し、62.0ml(600mmol、1.2当量)のベンジルアルコールおよび3.05gのDMAP(25.0mmol、0.05当量)を加えた。溶液を40分間のうちに0〜5℃に冷却し、500mlのジクロロメタン中の108.0g(525.0mmol、1.05当量)のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液を滴加した。白色懸濁液を0〜5℃で1時間と、次いで室温で15時間撹拌した。懸濁液をG3ガラスフィルターでろ過し、白色ろ過ケークを合計250mlのジクロロメタンで少しずつ洗浄した。ろ液を650〜10mbar/1時間で蒸発させて、黄色油状物を得、これを2.0Lの酢酸エチルに溶解し、2.0Lの0.5M塩酸、2.0Lの1M NaHCO3および1.0Lの食塩水で抽出し、有機層を40℃/150〜10mbar/5時間で蒸発乾固させて、291.1gの粗製(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルを白色固体として、収率104%および純度96.4%(HPLC面積%;約5%のベンジルアルコールを含む)で得た。この材料をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: m/z = 459.22735 (M-boc+H)+。
(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩
291.1g(500.0mmol)の(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル(HPLC純度;95.8%;約5%のベンジルアルコールを含む)を1.4LのTHFに室温で溶解した。10分以内に、1.04Lのジエチルアミン(10.0mol、20当量)を加え、淡黄色溶液を室温で2時間撹拌し、次いで40℃/200〜10mbarで蒸発させ、200mlのアセトニトリルを加え、ジエチルアミンを効率的に除去するために40℃/100〜10mbar/1時間で再度蒸発させた。最後に、268.1gの黄色油状物を得、これを2.5Lのアセトニトリルに溶解し、室温で10分間撹拌した。不溶性粒子をガラスファイバーフィルターでろ過し、500mlのアセトニトリルで洗浄した。ろ液を10分間のうちに20℃〜25℃で34.0mlのメタンスルホン酸を滴加して処理した。生成した白色懸濁液を室温で17時間撹拌し、G3ガラスフィルターでろ過した。ろ過ケークを500mlのアセトニトリルで少しずつ洗浄した。白色結晶を40℃/15mbar/4時間で乾燥し、195.8gの(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩を白色結晶として、収率91%(2段階)および純度99.3%(HPLC面積%)で得た。MS: m/z = 337.2149 (M+H)+。
(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル
190.0g(439.0mmol)の(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩を1.9LのTHFに室温で懸濁した。335ml(1.98mol、4.5当量)のN-エチルジイソプロピルアミンを加え、それにより温度は15℃までわずかに低下した。次に、213g(615mmol、1.4当量)の(S)-2,6-ビス((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサン酸を加え、白色懸濁液を室温で20分間撹拌した。390mlのn-プロピルホスホン酸無水物(環式三量体としてのT3P、酢酸エチル中50%、659mmol、1.5当量)を20分のうちに20〜25℃(冷水浴中で冷却)で滴加した。得られた淡黄色混濁溶液を室温で1.5時間撹拌し、分液漏斗に移し、1.9L TBMEで希釈し、1.9Lの水、1.9Lの0.5M塩酸、1.9Lの0.5M NaOH、1.9Lの水および1.9Lの食塩水で抽出した。分離した、まだ混濁した有機層をガラスファイバーフィルターでろ過し、フィルターを100mlのTBMEで洗浄し、合わせたろ液を40℃/100mbar/1時間で蒸発させ、1.0LのTBME(水を共沸除去するため)を再度加え、40℃/250〜10mbar/1時間で蒸発させて、粗生成物296.4gを白色固体残渣で得た。
(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル三メタンスルホン酸塩
124.0g(187mmol)の(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルを1.25Lのアセトニトリルに懸濁した。61.0ml(935.0mmol、5.0当量)のメタンスルホン酸を20〜25℃で、10分のうちに加えた(ガス放出)。得られた橙色懸濁液を40分以内に55〜60℃まで加熱し、55〜60℃でさらに1時間撹拌した。橙赤色乳濁液を室温まで冷却し(脱boc化を1H-NMRにより制御した)、それ以上精製せずにA+B組み立て段階、実施例8で用いた。MS: m/z = 365.2558 (M+H)+。
実施例5a
2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
30.0g(200.0mmol)の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノールを50mlのDMFに20〜25℃で溶解し、次いで、46.0mlのメタノール中25%ナトリウムメトキシド(200.0mmol、1.0当量)を加えた。生成した溶液を40℃/50mbar/0.5時間で蒸発させ(40mlの溶媒の除去)、50mlのDMFを再度加え、40℃/20mbar/0.5時間で蒸発させた(15mlの溶媒の除去)、わずかにゼリー様の懸濁液に、50ml DMF中の13.9gのブロモ酢酸(100mmol、0.5当量)の溶液を20〜25℃で加え、混合物を6時間撹拌した。11.9mlの臭化ベンジル(100mmol、0.5当量)を加え、混合物を20〜25℃でさらに16時間撹拌した。次いで、反応混合物を200mlの食塩水で処理し、200mlのTBMEで抽出した。分離したTBME層を200mlの食塩水で抽出し、次いで、分離したTBME層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、40℃/300〜10mbar/1時間で蒸発させて、23.9gの粗製2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを得た。
2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
11.2gのtert-酪酸カリウム(100.0mmol、0.5当量)を70mlの2-メチル-2-ブタノールに懸濁し(軽度の発熱35℃)、次いで30.0g(200.0mmol)の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノールを5分のうちに滴加し、滴下漏斗を10mlの2-メチル-2-ブタノールで洗浄し(温度は45℃に上昇)、溶液を60〜65℃まで加熱し、11.6g(100mmol、0.5当量)のクロロ酢酸ナトリウムを加え、60〜65℃で16時間撹拌し、次いで11.9mlの臭化ベンジル(100mmol、0.5当量)を加え、混合物を60〜65℃でさらに16時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、次いで50mlの水で処理し、80mlのTBMEおよび40mlのTBMEで抽出した。合わせたTBME層を50mlの半飽和食塩水で洗浄し、有機層を40℃/300〜10mbar/1時間で蒸発させて、27.0gの粗製2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを得た。
2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
40.3g(200.0mmol)の2-アミノ酢酸ベンジル塩酸塩を、0〜5℃に冷却した340mlの水および340mlのトルエンに、60分のうちに溶解し、50mlの水中の16.5g(240mmol、1.2当量)の亜硝酸ナトリウムの溶液を0〜5℃で、激しく撹拌しながら滴加した。反応混合物を0〜5℃で3時間撹拌した。黄色のトルエン層を分離し、340mlの1M NaHCO3および340mlの食塩水で洗浄し、分離したトルエン層を60gの硫酸ナトリウムで処理し、20〜25℃で1時間撹拌した。黄色懸濁液をろ過し、50mlのトルエンで洗浄した。澄明黄色トルエン溶液は最大200.0mmolの2-ジアゾ酢酸ベンジル(トルエン中約8.5%)を含む。この溶液を60分のうちに、0〜5℃に冷却し、よく撹拌した、170mlのトルエン中、60.0g(400mmol)のトリエチレングリコールおよび465μl(3.67mmol、0.02当量)の三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートの混合物に、窒素ガス発生下で滴加した。黄色反応混合物を20〜25℃で90分間撹拌し、ここで無色溶液が生成した。溶液を250mlの食塩水で抽出し、分離した有機層を60gの硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、100mlのトルエンで洗浄し、40℃/40〜10mbar/1時間で蒸発させて、49.9gの粗製2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを得た。クロマトグラフィをTeledyne Isco CombiFlash(330gのシリカ60(0.035〜0.070mm Teledyne Isco Cat.No. 69-2203-330)、移動相:15%アセトン85%n-ヘプタンから45分で30%および70%への勾配、分画サイズ20mlで実施した。合わせた分画から33.88gの2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを無色油状物として、全収率57%および純度99.0%(HPLC面積%)で得た。
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
268.0gの2-(2-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)酢酸ベンジル(900mol)を2.4Lのジクロロメタンに溶解した。385.0gの(2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2,4,5-トリイル三酢酸塩(990mmol、1.1当量)および12.0mlのトリフルオロメタンスルホン酸(135mmol、0.15当量)を加えた。懸濁液をディーンスターク分離器(50ml、AcOHを除去するため)を用いて加熱還流した。1時間後、4.50mlのトリフルオロメタンスルホン酸(50.7mmol、0.05当量)および50mlのジクロロメタンを橙色懸濁液に加え、ディーンスターク分離器からの溶媒(50ml)を排出した。半時間ごとにこの手順を合計6回(3時間)繰り返した。合計4.5時間後、赤色溶液を10〜15℃まで冷却し、30分以内に20〜25℃で1.8Lの1M炭酸水素ナトリウム(1.8mol、2.0当量)の溶液に加えた(CO2放出、pH7〜8)。黄色有機層を分離し、40℃/600〜10mbar/3時間で蒸発させて、585.4gの粗製2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを黄色油状物として得た(HPLC純度:87%)。粗生成物を700mlのアセトンに溶解し、あらかじめ充填されたシリカカラム(3.0kgのシリカ60;0.063〜0.2mm)にチャージした。クロマトグラフィを、n-ヘプタン/アセトンを移動相として用いて(5:1〜1:2の勾配)実施した。合わせた回収分画を40℃/600〜10mbarで蒸発させ、20〜25℃/0.3mbar/3時間で乾燥して、465.0gの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-ピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを黄色油状物として、収率83%および純度100%(HPLC面積%)で得た。MS: m/z = 628.2627 (M+H)+。
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸
アルゴン雰囲気下、456.0gの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-ピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル(727mmol)を1.4LのTHFに溶解した。4.56gのPd/C 10%を加え、アルゴン雰囲気を水素(1bar)で置き換えた。黒色懸濁液を20〜25℃で2時間水素化した。水素雰囲気をアルゴンで置き換え、黒色懸濁液をろ過し、ろ過ケークを合計400mlのTHFで少しずつ洗浄した。無色ろ液(HPLC純度:71%および27%トルエン)をいかなる精製もせずにA+B組み立て段階、実施例8で用いた。MS: m/z = 538.2191 (M+H)+。
実施例8a
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル
実施例4からの(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル三メタンスルホン酸塩(180.0mmol)の赤橙色溶液(約1.4L)を3.60Lのアセトニトリルで希釈した。20〜25℃で、365.0mlのN-エチルジイソプロピルアミン(2.16mol、12.0当量)を5分以内に加えた。生成した粘稠スラリーに、実施例7からの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸(720mmol、4.0当量)の溶液(約2.25L)を20〜25℃で10分以内に加え、それにより温度が40℃までわずかに上昇した。45〜50℃で、425mlのn-プロピルホスホン酸無水物(T3P、三量体、酢酸エチル中50%、720mmol、4.0当量)の溶液を10分以内に加えた。反応溶液を45〜50℃で1時間撹拌した。淡黄色溶液を20〜25℃まで冷却し、40℃/10mbar/6時間で蒸発させて、1.06kgの粗製(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル(HPLC純度:24.1%)を得た。粗生成物を3回に分けて沈澱させ、メタンスルホン酸N-エチルジイソプロピルアミンおよび残存T3Pを除去した。353gの粗生成物を7.0Lの2-プロパノールに溶解し、1時間で-25℃まで冷却し、-25℃で1時間撹拌し、あらかじめ冷却した(-25℃)G3-ガラスフィルターでろ過し(洗浄なし)、沈澱生成物からの一部が反応器からガラス壁上に沈着した。すべての沈澱をフィルターおよびガラス壁から合計1.0LのTHFで少しずつ溶解した。合わせた溶液を40℃/20mbar/6時間で蒸発させて、390.0gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル(HPLC純度:71.9%)を得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: m/z = 1923.8438 (M+H)+
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウム
(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル三メタンスルホン酸塩(12.2mmol)の赤橙色溶液(約95ml)を240mlのアセトニトリルで希釈した。20〜25℃で、30.0mlのN-エチルジイソプロピルアミン(2.16mol、14.5当量)を5分以内に加えた。生成した粘稠スラリーに、2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸(48.8mmol、4.0当量)の溶液(約150ml)を20〜25℃で10分以内に加え、それにより温度が40℃までわずかに上昇した。45〜50℃で、28.8mlのn-プロピルホスホン酸無水物(T3P、三量体、酢酸エチル中50%、48.8mmol、4.0当量)の溶液を10分以内に加えた。反応溶液を45〜50℃で1時間撹拌した。淡黄色溶液を20〜25℃まで冷却し、40℃/10mbar/6時間で蒸発させて、73.6gの粗製(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル(HPLC純度:32面積%)。
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウム
378.0g(197.0mmol、粗製)の(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジルを1.9Lのメタノールに溶解した。10分以内に、200.0mLの10.8M水酸化ナトリウム溶液(2.16mol、11.0当量)を20〜25℃で加えた。それにより温度が31℃まで上昇した。淡黄色溶液を20〜25℃で2時間撹拌し(pH13.4)、次いで80.0mLの5M塩化アンモニウム溶液を加えた(pH10.7)。次いで、淡黄色溶液を20〜25℃/100〜20mbar/5時間で蒸発させ、20〜0.5mbar/1時間で乾燥して、543gの粗製(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウム(HPLC純度:40.1%)を得、次いでこれを分取逆相クロマトグラフィで精製した。
カラム:Triart C18-120 26×15cm;10um
移動相:A:2mM NaHCO3/B:アセトニトリル
勾配:
温度安定化:室温
検出:220nm
溶液:543gを4500mlの2mM NaHCO3に溶解し、ろ過した(GF5)(=5000ml(109mg/ml)
試料溶液/注入:1回ごとに試料200ml=21.8g(25回)
濃縮:合わせた分画(46L)を110Lの水で希釈し、この溶液を3分割してRP C18カラムにポンプで送り、水/MeOH 98/2で洗浄し、次いでMeOHで溶出し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、1.18kgのメタノール溶液を得た。分取HPLC精製段階の1.18kgのメタノール溶液の4分の1、すなわち295gを40℃/20mbar/1時間で蒸発させ、次いで20〜25℃/0.35mbar/14時間で乾固させて、43.5gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウムを非結晶白色粉末、99.88%HPLC純度で得た。前述の溶液の残りの4分の3(885g)を次の段階で用いた。MS: m/z = 1452.684 (M-H)-。
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸
実施例9からのメタノール溶液(885g)を、20〜25℃で47.9gのDowex(50×8カチオン交換体;H3O+濃度2.57mmol/g)により1時間撹拌して処理し(pH3.1)、ろ過し、200mLのメタノールで洗浄した。ろ液を20〜25℃/15〜50mbarで蒸発させ、20〜25℃/0.01mbar/2時間で乾燥して、128.0gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸を白色非結晶粉末、99.77%HPLC純度で得た。MS: m/z = 1452.684 (M-H)-。
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸カルシウム
0.10g(0.068mmol)の(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸を3.0mlのメタノールおよび0.30mlの水に溶解し、2.60mg(0.034mmol、0.5当量)の水酸化カルシウムを加え、混合物を室温で1時間撹拌した。淡い混濁溶液を40℃/200〜10mbar/1時間で蒸発させて、0.11gを白色固体で得た。99.60%HPLC純度。MS: m/z = 1452.684 (M-H)-。
実施例11(US特許出願公報第2011/0207799号の実施例15に従って)
(20mg、0.014mmol)の(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸(GalNAc酸)をピリジンおよびジクロロメタンと共に同時蒸発させた。残渣を無水DMF(0.9ml)に溶解し、DMF中のN-ヒドロキシスクシンイミド(HOSu)の溶液(1.6mg、0.014mmol)を、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら加えた。0℃で、DMF中のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)の溶液(3.2mg、0.016mmol)をゆっくり加えた。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌した。生成したGalNAc N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを、それ以上精製せずに、RNAへの結合のために用いた。
Claims (32)
- 式中、nは0〜10の間の整数である、式I
のGalNAc酸誘導体、ならびにその塩、その対応する鏡像異性体および/または光学異性体の調製のための方法であって、
a)式中、R1はエステル保護基であり、かつXは酸のアニオンである、式II
のトリアミン塩を、
式中、R2はヒドロキシ保護基であり、かつnは前述のとおりである、式III
のテトラヒドロピラン酸と、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下でカップリングさせて、
式中、R1およびR2およびnは前述のとおりである、式IV
のGalNAcエステルを生成する段階;
b)エステル保護基R1およびヒドロキシ保護基R2を、鉱塩基(mineral base)存在下で除去して、
式中、nは前述のとおりであり、かつMは金属カチオンである、式V
のGalNAc酸塩を生成する段階;
ならびに
c)任意で、式VのGalNAc酸塩を式IのGalNAc酸誘導体に変換する段階
を含む、前記方法。 - nが0〜5の間の整数であり、エステル保護基R1がC1-7-アルキルまたはフェニル-C1-7-アルキルであり、ここでフェニル基はハロゲンまたはC1-7-アルキルで置換されていてもよく、ヒドロキシ保護基R2がアセチルであり、かつXがスルホン酸のアニオンから選択される、請求項1記載の方法。
- ペプチドカップリング剤がn-プロピルホスホン酸無水物であり、かつアミン塩基が三級アミンである、請求項1または2のいずれか一項記載の方法。
- 段階a)のカップリングを極性非プロトン性溶媒である有機溶媒中、20℃〜70℃の反応温度で行う、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 段階b)におけるエステル保護基R1の除去のための鉱塩基がアルカリ水酸化物である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 段階a)およびb)を組み合わせて、式VのGalNAcエステルを単離せずに、1段階で実施する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 式VのGalNAc酸塩の式IのGalNAc酸誘導体への任意の変換を、カチオン交換により、または酸での処理により実施する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 式IIのトリアミンを生成する方法が、
a1)式中、R3'およびR4は異なり、互いに独立にアミノ保護基である、式X
のカルボン酸を、
式中、R1はエステル保護基であり、かつR3'およびR4は前述のとおりである、式XI
のエステルに変換する段階;
b1)アミノ保護基R4を除去し、続いて
式中、R1およびR3'は前述のとおりであり、かつX-は酸アニオンである、式XII
のアミン塩を生成する段階;
c1)式XIIのアミン塩を、
式中、R3''およびR3'''はアミノ保護基である、式XIII
のヘキサン酸誘導体とカップリングさせて、
式中、R3'、R3'、R3'''およびR1は前述のとおりである、式XIV
の保護トリアミンを生成する段階;
d1)式XIVの保護トリアミンを酸により式IIのトリアミン塩に変換する段階
を含む、請求項1記載の方法。 - R3'、R3'およびR3'''が同じで、酸性条件下で切断可能な保護基であり、かつR4が塩基性条件下または水素化分解により切断可能な保護基である、請求項9記載の方法。
- R3'、R3'およびR3'''がBocであり、かつR4がFMOCである、請求項10記載の方法。
- 段階a1)の変換をベンジルアルコールにより、活性化剤、アミン触媒および非プロトン性有機溶媒の存在下、20℃〜50℃の反応温度で行う、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
- アミノ保護基R4がFMOCであり、段階b1)におけるその除去を二級脂肪族アミンにより、極性非プロトン性溶媒中、20℃〜50℃の反応温度で実施する、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
- 段階b1)における続いての式XIIのアミン塩の生成をスルホン酸により行う、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
- 段階c1)のカップリングを、n-プロピルホスホン酸無水物をカップリング剤として、三級アミンおよび極性非プロトン性溶媒の存在下、20℃〜50℃の反応温度で実施する、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
- 段階d1)において、式IIのトリアミン塩をスルホン酸により、極性非プロトン性溶媒中、20℃〜80℃の反応温度で生成する、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
- 式IIのトリアミン塩の結晶化を防止する極性非プロトン性溶媒を選択する、請求項16記載の方法。
- ヒドロキシ保護基R2がアセチルであり、エステル保護基R5がベンジルであり、かつヒドロキシ保護基R6がアセチルである、請求項18記載の方法。
- 段階a2)の第一の段階において、式XXのジオールをアルカリ金属アルコラートにより、極性プロトン性または極性非プロトン性の溶媒の存在下、50℃〜120℃の反応温度で脱プロトン化する、請求項18または19記載の方法。
- 段階a2)の第二の段階において、ハロゲン酢酸またはその塩により、極性プロトン性または極性非プロトン性の溶媒の存在下、50℃〜120℃の反応温度で、酢酸部分を導入する、請求項18または19記載の方法。
- 段階a2)の第三の段階において、ハロゲン化ベンジルまたはベンジルスルホニルエステルにより、極性非プロトン性溶媒中、20℃〜120℃の反応温度で、R5がベンジルである式XXIのアルコールエステルを生成する、請求項18または19記載の方法。
- 段階b2)において、式XXIのアルコールエステルを式XXIIのテトラヒドロピラン誘導体と、ハロゲン化スルホン酸存在下、極性非プロトン性溶媒存在下で、0℃〜140℃の反応温度でカップリングさせる、請求項18または19記載の方法。
- 段階c2)において、ベンジルエステル基を、水素化触媒存在下、水素での接触水素化により除去する、請求項18または19記載の方法。
- 段階a3)のジアゾ化を、亜硝酸アルカリにより、水および非極性非プロトン性溶媒の溶媒混合物存在下、-10℃〜10℃の反応温度で実施する、請求項25記載の方法。
- 段階b3)における2-ジアゾ化合物の式XXのジオールによる変換を、ルイス酸および非極性非プロトン性溶媒の存在下、-10℃〜10℃の反応温度で実施する、請求項25または26記載の方法。
- R1がベンジルであり、R3'がBocであり、かつXがメタンスルホン酸のアニオンである、請求項28記載のアミン塩。
- GalNAcオリゴヌクレオチド結合体の調製法における、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法の使用。
- GalNAcオリゴヌクレオチド結合体の調製法であって、
a3)請求項1〜27のいずれか一項に従って、式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を調製する段階、および
b3)式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を、ペプチドカップリング条件下でオリゴヌクレオチドと結合する段階
を含む、前記方法。 - 式VのGalNAc酸塩を用いる、請求項31記載の方法。
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