JP7383618B2 - 放射標識オリゴヌクレオチドおよびその調製のための方法 - Google Patents
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Description
の放射標識オリゴヌクレオチドによって達成することができ、式中、
nは0または1であり;
X1およびX2は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;
Qは、式2aまたは2b
の残基を表し、ここでR1*およびR2*は、放射標識C1~6アルキル基であり;かつ
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する部分である。
[本発明1001]
式Iの放射標識オリゴヌクレオチド:
式中、
nは0または1であり;
X 1 およびX 2 は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C 2~12 アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC 2~12 アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;
Qは、式2aまたは2b
の残基を表し、ここでR 1* およびR 2* は、放射標識C 1~6 アルキル基であり;かつ
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する部分である。
[本発明1002]
Qが式2bを有し、かつコンジュゲーションがオリゴヌクレオチドの3’または5’末端に存在する、本発明1001の放射標識オリゴヌクレオチド。
[本発明1003]
Qが式2aを有し、かつコンジュゲーションがオリゴヌクレオチドの3’または5’末端に存在する、本発明1001または1002の放射標識オリゴヌクレオチド。
[本発明1004]
R 1* およびR 2* が、放射標識C 1~4 アルキル基、好ましくは放射標識メチルまたはエチル基である、本発明1001~1003のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチド。
[本発明1005]
放射標識が、 3 Hまたは 14 C標識、好ましくは 3 H標識である、本発明1001~1004のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチド。
[本発明1006]
任意で修飾されたDNA、RNA、もしくはLNAヌクレオシド単量体またはそれらの組み合わせからなる7~30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、本発明1001~1005のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチド。
[本発明1007]
式Ibである、本発明1001~1008のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチド:
式中、R 2* 、X 2 、およびリンカー1は前記の通りである。
[本発明1008]
式Icである、本発明1001~1008のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチド:
式中、R 2* 、X 1 およびX 2 、リンカー1およびリンカー2は前記の通りである。
[本発明1009]
受容体標的指向部分が、非ヌクレオチド部分、好ましくはアシアル糖タンパク質受容体標的指向部分、より好ましくは式VII
のGalNAc部分、その対応する塩、鏡像異性体、および/または立体異性体であり、式中、R 3 は水素またはヒドロキシ保護基であり、かつnは0~10、好ましくは0~5、より好ましくは1~3の整数であるが、最も好ましくは2である、本発明1001~1008のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチド。
[本発明1010]
式Idである、本発明1001~1010のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチド:
式中、R 1* 、X 2 、およびリンカー1は前記の通りである。
[本発明1011]
37 GBq/mmol(1 Ci/mmol)~3.7 TBq/mmol(100 Ci/mmol)、好ましくは111 GBq/mmol(3 Ci/mmol)~1.85 TBq/mmol(50 Ci/mmol)、より好ましくは185 GBq/mmol(5 Ci/mmol)~740 GBq/mmol(20 Ci/mmol)の比放射能を有する、本発明1001~1010のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチド。
[本発明1012]
Qが式2aの残基を表す式Iの放射標識オリゴヌクレオチドの調製のための方法であって、以下の工程を含む、方法:
式III
(式中、
nは0または1であり;
X 1 およびX 2 は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C 2~12 アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC 2~12 アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する非ヌクレオチド部分、特にアシアル糖タンパク質受容体標的指向部分、好ましくはGalNAc部分である)
のアミンを、式IV
(式中、R 1* は前記の通りである)
の放射標識スクシンイミド化合物とコンジュゲートさせる工程。
[本発明1013]
Qが式2bの残基を表す式Iの放射標識オリゴヌクレオチドの調製のための方法であって、以下の工程を含む、方法:
式V
(式中、
nは0または1であり;
X 1 およびX 2 は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C 2~12 アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC 2~12 アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する非ヌクレオチド部分、特にアシアル糖タンパク質受容体標的指向部分、好ましくはGalNAc部分である)
のチオールを、式VI
(式中、R 2* は前記の通りである)
の放射標識マレイミド化合物とコンジュゲートさせる工程。
[本発明1014]
組織または体液中でのオリゴヌクレオチドの生体内分布および薬物動態の決定のための、本発明1001~1011のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチドの使用。
[本発明1015]
以下の工程を含む、組織または体液中でのオリゴヌクレオチドの生体内分布および薬物動態の決定のための方法:
a)有効量の本発明1001~1011のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチドを、試験する組織または体液へと投与する工程、ならびに
b)組織または体液中の本発明1001~1011のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチドの生体内分布および薬物動態を測定する工程、ならびに任意で、
c)試験する組織または体液中の本発明1001~1011のいずれかの放射標識オリゴヌクレオチドをオートラジオグラフィーにより画像化する工程。
[本発明1016]
式Xのオリゴヌクレオチド:
式中、
nは0または1であり;
X 1 およびX 2 は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C 2~12 アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC 2~12 アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;
Qは、式2a’または2b’
の残基を表し、ここでR 1 およびR 2 は、C 1~6 アルキル基であり;かつ
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する部分である。
[本発明1017]
Qが式2b’を有し、かつコンジュゲーションがオリゴヌクレオチドの3’または5’末端に存在する、本発明1016のオリゴヌクレオチド。
[本発明1018]
Qが式2a’を有し、かつコンジュゲーションがオリゴヌクレオチドの3’または5’末端に存在する、本発明1016または1017のオリゴヌクレオチド。
[本発明1019]
R 1 およびR 2 が、C 1~4 アルキル基、好ましくはメチルまたはエチル基である、本発明1016~1018のいずれかのオリゴヌクレオチド。
[本発明1020]
任意で修飾されたDNA、RNA、もしくはLNAヌクレオシド単量体またはそれらの組み合わせからなる7~30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、本発明1016~1019のいずれかのオリゴヌクレオチド。
[本発明1021]
式Xbである、本発明1016~1020のいずれかのオリゴヌクレオチド:
式中、R 2 、X 2 、およびリンカー1は前記の通りである。
[本発明1022]
式Xcである、本発明1016~1021のいずれかのオリゴヌクレオチド:
式中、R 2 、X 1 およびX 2 、リンカー1およびリンカー2は前記の通りである。
[本発明1023]
受容体標的指向部分が、非ヌクレオチド部分、好ましくはアシアル糖タンパク質受容体標的指向部分、より好ましくは式VII
のGalNAc部分、その対応する塩、鏡像異性体、および/または立体異性体であり、式中、R 3 は水素またはヒドロキシ保護基であり、かつnは0~10、好ましくは0~5、より好ましくは1~3の整数であるが、最も好ましくは2である、本発明1016~1022のいずれかのオリゴヌクレオチド。
[本発明1024]
式Xdである、本発明1016~1023のいずれかのオリゴヌクレオチド:
式中、R 1 、X 2 、およびリンカー1は前記の通りである。
a1)固体支持体上の保護されたヒドロキシル基のブロック解除、
a2)活性化ホスホロアミダイトとしての第1のヌクレオシドと固体支持体上の遊離ヒドロキシル基の連結、
a3)各々のP連結ヌクレオシドの酸化または硫化による各々のホスホトリエステル(P=O)または各々のホスホロチオエート(P=S)の形成、
a4)任意で、固体支持体上の未反応ヒドロキシル基のキャップ、
a5)固体支持体に付加された第1のヌクレオシドの5’ヒドロキシル基のブロック解除、
a6)活性化ホスホロアミダイトとしての第2のヌクレオシドの連結による各々のP連結二量体の形成、
a7)各々のP連結ジヌクレオシドの酸化または硫化による各々のホスホトリエステル(P=O)または各々のホスホロチオエート(P=S)の形成、
a8)任意で、未反応5’ヒドロキシル基のキャップ、
a9)所望の配列がアセンブルされるまでの前工程a5~a8の反復
の化学反応からなる。
、その対応する塩、鏡像異性体、および/または立体異性体を有し、式中、R3は水素またはヒドロキシ保護基であり、かつnは0~10、好ましくは0~5、より好ましくは1~3の整数であるが、最も好ましくは2である。
を有し、式中、
R2*は、放射標識C1~6アルキルであり、
X2は、SまたはOであり、
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数である。
を有し、式中、
R2*は、放射標識C1~6アルキルであり、
X1およびX2は、互いに独立して、SまたはOであり、
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり、
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり、かつ
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する部分である。
を有し、式中、
R1*は、放射標識C1~6アルキルであり、
X2は、SまたはOであり、
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数である。
により例示され得、ここでAm-C6はC6(ヘキシレン)アミノリンカーを意味し;Am-GBBはグリセロールベース架橋(m=1)アミノリンカーを意味し;Propは3H標識プロピオニルであり;*はホスホロチオエート架橋を表し;A、C、G、TはLNAヌクレオシド単量体であり、a、t、c、gはDNAヌクレオシド単量体である。
により例示され得、ここでC6SHはC6(ヘキシレン)チオールリンカーを意味し;NEMは3H標識N-エチルマレイミドであり;NMMは3H標識N-メチルマレイミドであり;*はホスホロチオエート架橋を表し;A、C、G、TはLNAヌクレオシド単量体であり、a、t、c、gはDNAヌクレオシド単量体である。
式III
(式中、
X1およびX2は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;かつ
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する部分である)
のアミンを、式IV
(式中、R1*は前記の通りである)
の放射標識スクシンイミド化合物とコンジュゲートさせる工程。
式V
(式中、
X1およびX2は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;かつ
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する部分である)
のチオールを、式VI
(式中、R2*は前記の通りである)
の放射標識マレイミド化合物とコンジュゲートさせる工程。
a)有効量の請求項1~11のいずれか一項記載の放射標識オリゴヌクレオチドを、試験する組織または体液へと投与する工程、ならびに
b)組織または体液中の請求項1~11のいずれか一項記載の放射標識オリゴヌクレオチドの生体内分布および薬物動態を測定する工程、ならびに任意で、
c)試験する組織または体液中の請求項1~11のいずれか一項記載の放射標識オリゴヌクレオチドをオートラジオグラフィーにより画像化する工程。
のオリゴヌクレオチドを含み、式中、
nは0または1であり;
X1およびX2は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;
Qは、式2a’または2b’
の残基を表し、ここでR1およびR2は、C1~6アルキル基であり;かつ
受容体標的指向部分は、該オリゴヌクレオチドにさらなる機能を追加する部分である。
のオリゴヌクレオチド;
R2、X1およびX2、リンカー1およびリンカー2が上記の通りである式Xc
のオリゴヌクレオチド;
R1、X2およびリンカー1が上記の通りである式Xd
のオリゴヌクレオチド、ならびに
非ヌクレオチド部分である受容体標的指向部分、好ましくはアシアル糖タンパク質受容体標的指向部分、より好ましくは、R3が水素またはヒドロキシ保護基であり、かつnが0~10、好ましくは0~5、より好ましくは1~3の整数であるが、最も好ましくは2である式VII
のGalNAc部分、その対応する塩、鏡像異性体、および/または立体異性体
にも同様に適用される。
AcOH 酢酸
Bq ベクレル
Ci キュリー
Da ダルトン
DI 脱イオン化
DIPEA N,N-ジイソプロピルエチルアミン(ヒューニッヒ塩基)
DMAP 4-(ジメチルアミノ)-ピリジン
DMF N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
EtOH エタノール
GBB グリセロールベースの架橋
h 時間
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
i イソ
LC-MS/MS タンデム質量分析と組み合わされた液体クロマトグラフィー
LNA ロックド核酸
LSC 液体シンチレーション計測
MeOH メタノール
min 分
mM, nM ミリモル、ナノモル
mL ミリリットル
μL マイクロリットル
MS 質量分析
MW 分子量
MWCO 分子量カットオフ
n 正常
NEM N-エチルマレイミド
ng ナノグラム
nm ナノメートル
NMM N-メチルマレイミド
NSP プロピオン酸N-スクシンイミジル
p パラ
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PD 薬力学
Prop プロピオン酸塩
QC 品質管理(サンプル)
QWBA 定量全身オートラジオグラフィー
rpm 1分あたりの回転数
rt 室温
SRM 選択反応モニタリング
t 第三級
TEA トリエチルアミン
UPLC 超高速液体クロマトグラフィー
v 体積
出発物質として使用したすべてのオリゴヌクレオチドは、Roche Pharma research and early developmentが合成した。トリチウム標識されたN-[3H]エチルマレイミド(比放射能:2 TBq/mmol = 55 Ci/mmol)は、Pharmaron(Cardiff, Wales, UK)からペンタン溶液として入手した。トリチウム標識されたプロピオン酸N-[3H]スクシンイミジル(比放射能:3.8 TBq/mmol = 103 Ci/mmol)は、RC Tritec(Teufen, CH)からトルエン溶液として入手した。トリチウム化合物の液体シンチレーション計測は、HIDEX 300 SLおよびULTIMATE GOLDカクテル(PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)を用いて行った。オリゴ1~3の反応モニタリングおよび純度は、HPLC Agilent 1210によって、260 nM波長、Waters XBridge RP18、4.6×150 mm、3.5μmカラム、60℃([A]=水/メタノール/ヘキサフルオロi-プロパノール/TEA:950/25/21/2.3 mL;[B]=水/メタノール/ヘキサフルオロi-プロパノール/TEA:175/800/21/2.3 mL)、流速1.0 mL/分で、以下の勾配:12分間で10%[B]~60%[B]、を用いて決定した。オリゴ4~6は、UPLC Agilent 1290によって、260 nm波長、ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18、2.1×50 mm、1.7μmカラム、80℃で、同じ溶出液および以下の勾配、6分間で10%[B]~40%、を用いて決定した。オリゴ7は、以下の勾配:6分間で10%[B]~30%、を除いてオリゴ4~6と同じ条件で分析した。質量分析は、Single Quadruple (SQ)を装備したWaters Acquity UPLC H-class Systemによって行い、ESI Mass Detector Radiochemical純度を、内部固体シンチレータを有するβ放射線HPLC検出装置RAMONA Quattro(Raytest, Straubenhardt, Germany)を用いて測定した。オリゴ1~3についての分取HPLCは、XBridge C18カラム、5μm、10 mm×250 mmと共にGilson PLC 2050によりおよび移動相[A]として水(950 mL)/メタノール(25 mL)/TEA(2.3 mL)/ヘキサフルオロi-プロパノール(21 mL)および15分間で10%[B]~60%[B]の勾配の移動相[B]として水(175 mL)/メタノール(800 mL)/TEA(2.3 mL)/ヘキサフルオロi-プロパノール(21 mL)を用いて行った。濃度は、Eppendorf BioSpectrometer(登録商標)basicによって260 nm波長および対応する算出された分子減衰係数で決定した。
a)本実施例で使用したオリゴヌクレオチド
MW:4520.7 g/mol;(オリゴ1)
MW:5506.5 g/mol;(オリゴ2)
MW:4553.6 g/mol;(オリゴ3)
DMF中の5’または3’末端にアミンリンカーを含む1当量のオリゴヌクレオチド(体積係数:125 mL/g)および40当量のヒューニッヒ塩基に対して、1.2当量のプロピオン酸N-スクシンイミジル(NSP)を添加し、無色の懸濁物を得た。この混合物を室温で一晩撹拌し、透明かつ無色の溶液にした。溶媒を高真空下で除去し、残留物をPBSに溶解させた。粗混合物を分取HPLCによって精製した。所望の画分をAmicon(登録商標)Pro精製システム(MWCO:3,000 Da)に移し、4000 rpmで遠心分離した。DI水を添加し、HPLC溶出液から水への交換を完遂するためにこのプロセスを4回以上繰り返した。得られた水溶液を凍結乾燥し、47%~74%の範囲の収量および96~99%の純度で無色粉末としてオリゴヌクレオチドを単離した。
a)本実施例で使用したオリゴヌクレオチド
MW:7709.5 g/mol;(オリゴ4)
MW:4537.6 g/mol;(オリゴ5)
MW:5491.5 g/mol;(オリゴ6)
MW:6742.3 g/mol;(オリゴ7)
5’または3’末端スルフヒドリルリンカーを有する1当量のオリゴヌクレオチドを、PBSに溶解した(体積係数:250 mL/g)。DMSOに溶解させた1.5当量のN-アルキル化マレイミド(メチルまたはエチル)(体積係数:1500 mL/g)をこの水溶液に添加し、室温で1時間撹拌した。UPLC分析は、オリゴヌクレオチドへのマレイミドの完全な付加を示した。緩衝液を水に交換するため、反応混合物をAmicon(登録商標)Pro精製システム(MWCO:3,000 Da)に移し、4000 rpmで遠心分離した。DI水を添加し、この交換を完遂するためにこのプロセスを4回以上繰り返した。得られた水溶液を凍結乾燥し、69%~81%の範囲の収量および96~99%の純度で無色粉末としてオリゴヌクレオチドを単離した。
実施例3.a. (コンジュゲート体2に基づく[3H]化合物1)
3.811 GBq/mmol(103 Ci/mmol)の比放射能を有し、2 mLトルエンに溶解させた370 MBq(10 mCi)のプロピオン酸N-[3H]スクシンイミジル(17.3μg、0.079μmol)を、22.8μgの対応する非放射性プロピオン酸N-スクシンイミジルで希釈し、1.554 TBq/mmol(42 Ci/mmol)の比放射能を有する40.1μg(0.234μmol)の総量とした。溶媒を蒸発によって除去し、残留固形物を100μl DMFに溶解した。250μL DMFおよび1.3μL(0.97μmol)DIPEAに溶解させた0.98 mg(0.167μmol)のオリゴ2を、この[3H]NSP溶液に滴下し、室温で一晩撹拌した。UPLCは、所望の生成物への40%変換を示した。反応溶液をAmicon(登録商標)Pro精製システム(MWCO:3,000 Da)に入れ、4000 rpmで遠心分離して、溶媒を分取HPLCサンプル調製のために水/メタノール/ヘキサフルオロi-プロパノール/TEA:950/25/21/2.3に交換した。分取HPLC後、対応する画分をPBSで希釈し、Amicon(登録商標)Pro精製システム(MWCO:3,000 Da)に移し、4000 rpmで遠心分離した。PBSを添加し、99%の化学純度を達成するようこのプロセスを4回以上繰り返した。体積:0.55 mL、濃度:0.32 mg/mL、量:0.19 mg(収量:19.5%)、活性51.8 MBq(1.4 mCi)、比放射能:1.554 TBq/mmol(42 Ci/mmol)に相当する262.7 MBq/mg(7.1 mCi/mg)。
4 mLペンタン中の370 MBq(10 mCi)のN-[3H]エチルマレイミド(20.5μg、0.159μmol)を、シリカゲル充填済カラム上で濃縮し、2×0.5 mL DMSOで溶出させた。1 mL PBS中のオリゴ4(1.02 mg、0.132μmol)の溶液を添加し、室温で1時間撹拌した。UPLC分析は、20%の所望の生成物を示した。非放射性NEM(166μg、1.32μmol)を添加し、室温で1時間撹拌した。HPLCは、所望の生成物への完全な付加を示した。この反応溶液を、5 mL Float-A-Lyzer(登録商標)チューブ(MWCO:500~1000 Da)に移し、室温でPBS pH 7.1に対して透析した。緩衝液を4回、45分後に交換し、冷蔵庫で一晩保管した。UPLCは、93%の放射化学純度を示した。体積:2.9 mL、濃度:0.33 mg/mL、量:0.95 mg(収量:92%)、活性33.7 MBq(0.91 mCi)、比放射能:0.3 TBq/mmol(7.9 Ci/mmol)に相当する35.5 MBq/mg(953μCi/mg)。
12 mLペンタン中の1.1 GBq(30 mCi)のN-[3H]エチルマレイミド(61.5μg、0.477μmol)を、シリカゲル充填済カラム上で濃縮し、2×0.5 mL DMSOで溶出させた。1 mL PBS中のオリゴ6(2.20 mg、0.401μmol)の溶液を添加し、室温で1時間撹拌した。UPLC分析は、40%の所望の生成物を示した。非放射性NEM(502μg、4.01μmol)を添加し、室温で1時間撹拌した。HPLCは、所望の生産物への完全な付加を示した。この反応溶液を、5 mL Float-A-Lyzer(登録商標)チューブ(MWCO:500~1000 Da)に移し、室温でPBS pH 7.1に対して透析した。緩衝液を4回、45分後に交換し、冷蔵庫で一晩保管した。UPLCは、高極性放射性不純物を示した。この溶液をAmicon(登録商標)Pro精製システム(MWCO:3,000 Da)に入れ、4000 rpmで遠心分離した。PBSを添加し、99%の化学純度を達成するようこのプロセスを4回以上繰り返した。体積:1.0 mL、濃度:1.58. mg/mL、量:1.58 mg(収量:70%)、活性163 MBq(4.4 mCi)、比放射能:614 MBq/mmol(16.6 Ci/mmol)に相当する104 MBq/mg(2.8 mCi/mg)。
4 mLペンタン中の370 MBq(10 mCi)のN-[3H]エチルマレイミド(20.5μg、0.159μmol)を、シリカゲル充填済カラム上で濃縮し、2×0.5 mL DMSOで溶出させ、0.5 mL PBS中のオリゴ7(1.13 mg、0.168μmol)の溶液に滴下し、室温で1.5時間撹拌した。UPLCは、45%の所望の生成物および55%の出発物質を示した。非放射性NEM(210μg、1.68μmol)を添加し、室温で1時間撹拌した。HPLCは、所望の生成物への完全な付加を示した。この反応溶液をAmicon(登録商標)Pro精製システム(MWCO:3,000 Da)に移し、4000 rpmで遠心分離した。PBSを添加し、99%の化学純度を達成するようこのプロセスを4回以上繰り返した。体積:1.0 mL、濃度:1.80 mg/mL、量:1.07 mg(収量:93%)、活性71 MBq(1.91 mCi)、比放射能:481 MBq/mmol(13.0 Ci/mmol)に相当する67 MBq/mg(1.8 mCi/mg)。
ストック溶液の調製、較正標準、および品質確認
約100 ng/mLから最大約250000 ng/mLの作業水溶液を作製するため、ストック溶液(PCR等級水中約1 mg/mL、ストック溶液の正確な濃度は、260 nmでの減衰係数に基づく分光光度計Nanodrop(Thermo Scientific)を用いて定量される)からの連続希釈を行った。
内部標準の添加後、較正標準および品質管理サンプル(血漿を用いて新たに調製、50μL)を、タンパク質の変性のために、150μLの4Mグアニジンチオシアン酸塩で処理した。十分に混合(1600 rpmで20分間)した後、200μLの水/ヘキサフルオロイソプロパノール/ジイソプロピルエチルアミン溶液(100:4:0.2、v/v/v)を添加し、混合(1500 rpmで15分間)した。ついで、溶出および蒸発乾燥(+40℃で30~45分間)し、サンプルを200μLの移動相(水/メタノール/ヘキサフルオロイソプロパノール/ジイソプロピルエチルアミン(95/5/1/0.2、v/v/v/v))で再構成した後、固相抽出カートリッジ(Waters、OASIS HLB 5 mg、30μm)により清浄工程を行った。ボルテックスで混合(1500 rpmで10分間)後、アリコート(20μL)をLC-MS/MSシステム(50μLループ)に注入した。
Waters Acquity C18カラム(50×2.1 mm)を装着したShimadzu 30ADXRポンプを60℃で使用した。分析物および内部標準を、水/メタノール/ヘキサフルオロイソプロパノール/ジイソプロピルエチルアミン(95/5/1/0.2、v/v/v/v)から水/メタノール/ヘキサフルオロイソプロパノール/ジイソプロピルエチルアミン(10/90/1/0.2、v/v/v/v)への勾配溶液を用いて0.4 mL/分の流速で4.0分以内にマトリクス界面から分離した。
Packard Tri-carb 3100TRをLSC分析に使用した。
図1において、GalNAc LNA試験化合物A(点線)およびGalNAcなしのLNA試験化合物A(実線)の肝臓中濃度をLC-MS/MSによって分析した。GalNAc標識LNAは、予想された通り、肝臓血漿への高い初期取り込みおよび正常な経時的減少を示した。同様に、裸の、すなわちGalNAcを含まないLNAは、より低いレベルの取り込みを示した。
Claims (9)
- 下記式Iaまたは式Ibの放射標識オリゴヌクレオチド:
式中、
X 1およびX2は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;
の残基を表し、ここでR 2*は、3H-または14C-で標識されたC1~6アルキルであり;かつ
受容体標的指向部分は、式VII
、その対応する塩、鏡像異性体、および/または立体異性体を有するGalNAc部分であり、式中、R3は水素またはアシル基であり、かつnは0~10の整数であり、かつ
は、オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端のどちらかで上記式Iaまたは式Ibの
なる部分と結合している。 - R 2*が、3H-または14C-で標識されたC1~4アルキルである、請求項1~3のいずれか一項記載の放射標識オリゴヌクレオチド。
- R 2*が、3H-または14C-で標識されたメチルまたはエチルである、請求項1~3のいずれか一項記載の放射標識オリゴヌクレオチド。
- 放射標識が、3H標識である、請求項1~3のいずれか一項記載の放射標識オリゴヌクレオチド。
- 任意で修飾されたDNA、RNA、もしくはLNAヌクレオシド単量体またはそれらの組み合わせからなる7~30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、請求項1~6のいずれか一項記載の放射標識オリゴヌクレオチド。
- 37 GBq/mmol(1 Ci/mmol)~3.7 TBq/mmol(100 Ci/mmol)の比放射能を有する、請求項1~7のいずれか一項記載の放射標識オリゴヌクレオチド。
- 請求項1記載の式Iaまたは式Ibの放射標識オリゴヌクレオチドの調製のための方法であって、以下の工程を含む、方法:
下記式Vaまたは式Vb:
(式中、
X 1およびX2は、互いに独立して、SまたはOであり;
リンカー1は、C2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、または下記式
のグリセロールベースの架橋であり、ここでmは1~6の整数であり;
リンカー2は、任意でアミノ基保護されたアミノC2~12アルキレン架橋、1~10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり;
受容体標的指向部分は、式VII
、その対応する塩、鏡像異性体、および/または立体異性体を有するGalNAc部分であり、式中、R3は水素またはアシル基であり、かつnは0~10の整数であり、かつ
は、オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端のどちらかで上記式Vaまたは式Vbの
なる部分と結合している)
のチオールを、式VI
(式中、R2*は請求項1で定義された通りである)
の放射標識マレイミド化合物とコンジュゲートさせる工程。
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