KR20200116088A - 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 및 이의 제조 방법 - Google Patents

방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 및 이의 제조 방법 Download PDF

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KR20200116088A
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마르틴 로베르트 에델만
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 [식 중, n, X1, X2, 링커 1, 링커 2, Q 및 수용체 표적화 모이어티는 발명의 설명에서 정의된 바와 같음]를 포함한다. 화학식 (I)의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 조직 또는 체액에서 올리고뉴클레오티드의 생체 분포 및 약동학의 측정에 사용될 수 있다.

Description

방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 및 이의 제조 방법
본 발명은 화학식 I의 신규한 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00001
[식 중,
n, X1 및 X2, 링커 1 및 2, Q 및 수용체 표적화 모이어티는 이후에 논의됨], 이의 제조 방법 및 조직 또는 체액에서 올리고뉴클레오티드의 생체 분포 및 약동학의 측정을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
안티센스 치료 접근법이 효과적이기 위해서는, 올리고뉴클레오티드가 환자에게 도입되어야 하고 치료되어야 할 특정 조직에 도달해야 한다. 치료 약물의 생체 분포 및 약동학은 약물 치료의 예비 단계로서 측정되어야 한다. 결과적으로, 체액 또는 조직에서 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 있는 필요가 있다. Agrawal et al., Clin. Pharmacokinetics 28, 7 (1995)은, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 약동학의 특정 측면을 검토한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 약리학적 화합물의 생체 내 약동학적 연구에 사용되는 다른 잘 확립된 접근법은 검출을 가능하게 하기 위해 화합물을 방사성 표지하는 것을 수반한다. 동물 모델에서, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 동물에게 투여되었으며, 체액 및 조직 내에서의 분포는 올리고뉴클레오티드의 추출 및 자가 방사선 촬영에 의해 평가되었다 (Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7595-7599 (1991) 참조).
35S-표지는 확립되고 널리 보급된 기술이다. 생물학적 연구의 경우, 35S-표지된 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트는 H-포스포네이트 화학을 사용하여 제조되었다 (Gareg et al., Chem. Scr. 25, 280-282 (1985) 참조).
14C 및 3H로 합성 올리고뉴클레오티드의 방사성 동위원소 표지는 현재 잘 확립된 고체상 자동 합성을 사용하여 달성된다. 이러한 접근 방식에서, 14C 또는 3H 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 조립은 US 5,847,104의 도 1에 도시된 바와 같이 2-단계 방법을 필요로 한다. 그러나, 이 방법에는 몇 가지 단점이 있다. 방사성 동위원소는 바로 제1 단계에서 도입되기 때문에 (a) 2 단계 후 방사성 화학 물질 수율이 제한되고; (b) 이 작업은 종종 희석 문제를 겪고, 즉 자연 풍부 동위 원소는 일반적으로 관리 가능한 합성 규모를 유지하기 위해 담체로서 혼합되어, 최종 올리고의 특이적 활성이 낮아지고 (c) 포스포르아미다이트 3 (도 1)은 최종 방사성 전구 물질로서 엄격한 보관 및 운송 요건을 초래하는 분해되기 쉬운 반응성 화학종이다.
종래 기술의 방법의 결함을 고려하여, 높은 특이적 활성을 갖는 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드를 수득하기 위한 다른 접근법이 바람직하다.
따라서 본 발명의 목적은 올리고뉴클레오티드의 방사성 표지에 대한 새로운 접근법을 제공하는 것이다.
목적은 화학식 I의 새로 개발된 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드로 달성될 수 있음이 밝혀졌다:
Figure pct00002
[식 중,
n 은 0 또는 1 이고;
X1 및 X2 는 서로 독립적으로 S 또는 O 이고;
링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
Figure pct00003
(식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고;
Q는 하기 화학식 2a 또는 2b의 잔기를 나타내고
Figure pct00004
(식 중, R1* 및 R2* 는 방사성 표지된 C1-6-알킬기임) 및
수용체 표적화 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 추가의 관능성을 부가하는 모이어티임].
도면은 하기 의미를 갖는다:
도 1에서 GalNAc 연구 화합물 A (점선) 및 GalNAc이 없는 연구 화합물 A(연속선)의 간 농도는 LC-MS/MS와 비교되었다.
도 2에서, 실시예 3b (점선) 및 실시예 3c (연속선)의 삼중 수소 표지된 화합물의 간 농도는 LSC와 비교되었다.
하기 정의는 본원에서 본 발명을 기재하기 위해 사용되는 다양한 용어의 의미 및 범위를 설명 및 정의하기 위해 제시되어 있다.
용어 "C1-6-알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자의, 보다 특정한 구체예에서는 1 내지 4개의 탄소 원자의 1가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 나타낸다. C1-6-알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸 또는 t-부틸, 바람직하게는 메틸 또는 에틸, 보다 바람직하게는 에틸을 포함한다.
용어 "C2-12-알킬"은 마찬가지로 2 내지 12개 탄소 원자, 보다 특정한 구체예에서 4 내지 8개 탄소 원자 및 보다 더 특정한 구체예의 6개 탄소 원자의 일가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 나타낸다. 특정한 예는 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 또는 옥틸 및 이의 이성질체이지만, 바람직하게는 n-헥실이다.
용어 "C2-12-알킬렌 브릿지"는 2 내지 12개의 탄소 원자, 보다 특정한 구체예에서 4 내지 8개 탄소 원자 및 보다 더 특정한 구체예의 6개 탄소 원자의 2가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 나타낸다. 특정한 예는 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌 또는 옥틸렌 및 이의 이성질체이지만, 바람직하게는 n-헥실렌이다.
용어 "아미노 C2-12-알킬렌 브릿지"는 2 내지 12개 탄소 원자, 보다 특정한 구체예에서 4 내지 8개 탄소 원자 및 보다 더 특정한 구체예의 6개 탄소 원자의 분지형 포화 탄화수소기에 부착된 2가 기를 나타낸다. 특정한 예는 아미노 부틸렌, 아미노 펜틸렌, 아미노 헥실렌, 아미노 헵틸렌 또는 아미노 옥틸렌 및 이의 이성질체이지만, 바람직하게는 아미노 n-헥실렌(-NH-(CH2)6-)이다.
용어 "에틸렌 글리콜 단위"는 브릿징 단위로서 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위, 바람직하게는 2 내지 6 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유할 수 있는 화학식 -(CH2)2-O-의 단위를 의미한다.
용어 "글리세롤 단위 글리세롤 기반 브릿지"는 하기 화학식을 특징으로 하고,
Figure pct00005
식 중, m은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1의 정수이다.
용어 "아미노-보호기"는 아미노 기를 보호하는 것으로 의도되는 기를 나타내고, 벤조일, 벤질옥시카르보닐, 카르보벤질옥시 (CBZ 또는 Z), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (FMOC), p-메톡시벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, t-부톡시카르보닐 (BOC), 및 트리플루오로아세틸을 포함한다. 이들 기의 추가의 예는 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapter 7; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5, 및 T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981에 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 올리고뉴클레오티드는 2 개 이상의 공유결합적으로 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 분자로서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 치료적으로 가치있는 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위해서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 7 내지 30 개 뉴클레오티드 길이로 합성된다.
올리고뉴클레오티드는 임의로 변형된 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
LNA 뉴클레오시드 단량체는 뉴클레오티드의 리보스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이에 링커 기 (바이라디클 (biradicle) 또는 브릿지로서 지칭됨)를 포함하는 변형된 뉴클레오시드이다. 이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 브릿지된 핵산 또는 바이시클릭 핵산 (BNA)으로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이 임의로 변형된 것은 당 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 하나 이상의 변형의 도입에 의해 동등한 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함하고, 예를 들어 하나 이상의 2' 치환된 뉴클레오시드 및/또는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 본원에서, 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "유닛" 또는 변형된 "단량체"와 호환되어 사용될 수 있다.
DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드는 원칙적으로 2개의 뉴클레오시드를 공유적으로 커플링하는 포스포디에스테르 (P=O) 및/또는 포스포로티오에이트 (P=S) 뉴클레오시드 간 연결에 의해 연결된다.
따라서, 일부 올리고뉴클레오티드에서 모든 뉴클레오시드 간 연결은 포스포디에스테르 (P=O)로 이루어질 수 있고, 다른 올리고뉴클레오티드에서 모든 뉴클레오시드 간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S)로 이루어질 수 있거나 또는 여전히 다른 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오시드 간 연결의 서열은 다양하고 포스포디에스테르 (P=O) 및 포스포로티오에이트 (P=S) 뉴클레오시드 둘 다를 포함할 수 있다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대하여 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U 로 나타내어질 수 있고, 여기서 각각의 문자는 임의로는 동등한 기능의 개질된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 LNA 뉴클레오시드에 대하여는 대문자 A, T, G 및 MeC (5-메틸 시토신)로, DNA 뉴클레오시드에 대하여는 소문자 a, t, g, c 및 Mec 로 기재된다. 변형된 핵염기는 보호기를 갖는 핵염기, 예컨대 t-부틸페녹시아세틸, 페녹시아세틸, 벤조일, 아세틸, i-부티릴 또는 디메틸포름아미디노를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese of March 24, 2016 참조).
바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 임의로 변형된 DNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어지고 길이는 10 내지 25개의 뉴클레오티드이다.
올리고뉴클레오티드 합성의 원리는 당업계에 잘 알려져 있으며, Wikipedia 와 같은 문헌 및 대중에게 잘 설명되어 있다 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 합성; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis, of March 15, 2016 참조).
오늘날 대규모 올리고뉴클레오티드 합성은 컴퓨터 제어 합성기를 사용하여 자동으로 수행된다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드 합성은 고체상 합성이며, 여기서 조립되는 올리고뉴클레오티드는 이의 3'-말단 하이드록시기를 통해 고체 지지체 물질에 공유 결합되고 사슬 조립의 전체 과정에 걸쳐 부착되어 남아있다. 적합한 지지체는 상업적으로 판매되는 GE Healthcare의 Primer 지지체 5G 또는 Kinovate의 NittoPhase® HL 지지체와 같은 상업적으로 판매되는 거대다공성 폴리스티렌 지지체이다.
올리고뉴클레오티드 합성은 원칙적으로 원하는 서열이 조립될 때까지 성장 사슬의 5'-말단에 뉴클레오티드 잔기를 단계적으로 첨가하는 것이다.
일반적으로, 각각의 첨가는 합성 사이클이라고 지칭되며, 원칙적으로 화학 반응으로 이루어진다:
a1) 고체 지지체 상의 보호된 하이드록실기를 탈-블로킹,
a2) 활성화된 포스포라미다이트로서 제1 뉴클레오시드를 고체 지지체 상의 유리 하이드록실기와 커플링,
a3) 각각의 포스포트리에스테르 (P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트 (P=S)를 형성하기 위해 각각의 P-연결된 뉴클레오시드를 산화 또는 황화;
a4) 임의로, 고체 지지체 상의 임의의 미반응된 하이드록실기를 캡핑;
a5) 고체 지지체에 부착된 제1 뉴클레오시드의 5' 하이드록실기를 탈-블로킹;
a6) 활성화된 포스포라미다이트로서 각각의 P-연결된 이량체를 형성하기 위해 제2 뉴클레오시드를 커플링;
a7) 각각의 포스포트리에스테르 (P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트 (P=S)를 형성하기 위해 각각의 P-연결된 디뉴클레오시드를 산화 또는 황화;
a8) 임의로, 임의의 미반응된 5' 하이드록실기를 캡핑;
a9) 원하는 서열이 조립될 때까지 이전 단계 a5 내지 a8 를 반복함.
본 발명의 맥락에서 용어 "방사성 표지된"은 치환기 R1* 및 R2* 에 사용되고, 방사성 표지된 C1-6-알킬기, 바람직하게는 방사성 표지 된 C1-4-알킬기, 보다 바람직하게는 메틸 또는 에틸기이다. 따라서 이들 기에 적합한 방사성 표지는 상응하는 방사성 동위원소 14C 또는 3H, 바람직하게는 3H에 의한 자연 원자의 대체를 의미한다.
용어 "수용체 표적화 모이어티"는 올리고뉴클레오티드에 추가의 관능성을 부가하는 모이어티이다.
이러한 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 대한 관능성을 향상시킬 수 있는 임의의 단백질 수용체 표적화 모이어티로부터 선택될 수 있다. 이들은 신체 조직 또는 체액으로의 올리고뉴클레오티드의 전달을 향상시킬 수 있는 앱타머 또는 비-뉴클레오티드 단백질 수용체 표적화 모이어티와 같은 특정 분자를 표적화하는 항체 또는 관능성 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 수용체 표적화 모이어티는 아시알당단백질 수용체 표적화 모이어티, 보다 바람직하게는 GalNAc 모이어티이다.
GalNAc 모이어티는 화학식 VII:
Figure pct00006
[식 중, R3 은 수소 또는 하이드록시 보호기이고, n은 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 5, 보다 바람직하게는 1 내지 3의 정수이지만, 가장 바람직한 것은 2임], 이의 상응하는 염, 거울상 이성질체 및/또는 입체 이성질체를 갖는다.
적합한 하이드록시 보호기는 아실, 특히 C1-12-알킬카르보닐기, 보다 특히 C1-6-알킬 또는 페닐에 의해 임의로 치환되는 C1-6-알킬카르보닐기이다. 보다 바람직한 것은 아세틸, 피발로일 또는 벤조일이며, 아세틸이 가장 바람직한 하이드록시 보호기이다.
바람직한 구체예에서, GalNAc 모이어티는 화학식 VII을 갖는다: [식 중, R3 은 수소이고 n은 2임].
GalNAc 모이어티는 펩티드 결합 -CO-NH-를 통해 링커 2와 연결된다.
GalNAc 클러스터 화합물은 PCT 공개 WO2017021385에 따라 제조될 수 있다.　
바람직한 구체예에서, 화학식 IQ의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 화학식 2b를 가지며 컨쥬게이션은 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 있다.
다른 바람직한 구체예에서 청구항 제1항 또는 제2항의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 [식 중, Q는 화학식 2a를 가지며 컨쥬게이션이 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 있음]가 있다.
특히 바람직한 화학식 I의 희귀 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 [식 중, Q가 화학식 2b를 가지고 컨쥬게이션이 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 있음]가 있다.
다른 구체예에서, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 화학식 Ib를 갖는다:
Figure pct00007
[식 중,
R2*는 방사성 표지된 C1-6-알킬이고;
X2 는 S 또는 O 이며;
링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지임:
Figure pct00008
(식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)].
바람직한 구체예에서, 화학식 Ib의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 컨쥬게이션을 갖는다.
화학식 Ib의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서 R2*는 메틸 또는 에틸이고, 보다 바람직하게는 에틸이다.
화학식 Ib의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서, X2는 S 이다.
화학식 Ib의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서, 링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 바람직하게는 C6 -알킬렌 브릿지이다.
보다 더 바람직한 것은 화학식 Ib의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드이며, 식 중, R2*는 메틸 또는 에틸, 바람직하게는 에틸이고; X2 는 S이고 링커 1은 C6 -알킬렌 브릿지이다.
다른 구체예에서, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 화학식 Ic를 갖는다:
Figure pct00009
[식 중,
R2* 는 방사성 표지된 C1-6-알킬이고;
X1 및 X2 는 서로 독립적으로 S 또는 O 이고;
링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
Figure pct00010
(식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고; 및
수용체 표적화 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 추가의 관능성을 부가하는 모이어티임].
수용체 표적화 모이어티는 상기에서와 같지만, 바람직하게는 아시알당단백질 수용체 표적화 모이어티, 보다 바람직하게는 GalNAc 모이어티이다.
화학식 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 바람직한 구체예에서, R2*는 메틸 또는 에틸이고, 보다 바람직하게는 에틸이다.
화학식 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서, X1 은 O 이고 X2 는 S 이다.
화학식 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서, 링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 바람직하게는 C6 -알킬렌 브릿지이다.
화학식 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서, 링커 2은 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 바람직하게는 아미노 C6 -알킬렌 브릿지이다.
화학식 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서, 수용체 표적화 모이어티는 화학식 V의 GalNAc 모이어티이다.
보다 더 바람직한 것은 화학식 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드이며, 식 중, R2* 는 메틸 또는 에틸, 바람직하게는 에틸이고; X1 는 O이고 X2 는 S 이고; 링커 1은 C6 -알킬렌 브릿지이며; 링커 2는 아미노 C6 -알킬렌 브릿지이고 수용체 표적화 모이어티는 R3 수소를 갖는 화학식 V의 GalNAc 모이어티이며 n = 2 이다.
다른 구체예에서, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 화학식 Id를 갖는다:
Figure pct00011
[식 중,
R1*는 방사성 표지된 C1-6-알킬이고;
X2 는 S 또는 O 이며;
링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지임:
Figure pct00012
(식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)].
화학식 Id의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 바람직한 구체예에서, R1* 은 메틸 또는 에틸이고, 보다 바람직하게는 에틸이다.
화학식 Id의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서, X2 는 S 이다.
화학식 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 다른 바람직한 구체예에서, 링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 바람직하게는 C6-알킬렌 브릿지이다.
보다 더 바람직한 것은 화학식 Id의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드이며, 식 중, R1*는 메틸 또는 에틸, 바람직하게는 에틸이고; X2 는 S이고 링커 1은 C6-알킬렌 브릿지이다.
화학식 Id의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 하기 화합물로 예시될 수 있다.
Prop-5'-Am-C6*G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-Am-GBB-Prop
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-Am-GBB-Prop
여기서 Am-C6은 C6 (헥실렌) 아미노 링커를 의미하고; Am-GBB는 글리세롤 기반 브릿지 (m = 1) 아미노 링커를 의미하며, Prop은 3H 표지된 프로피오닐이고; * 은 포스포르티오에이트 브릿지를 나타내고; A, C, G, T는 LNA 뉴클레오시드 단량체이고, a, t, c, g는 DNA 뉴클레오시드 단량체이다.
가장 바람직한 구체예는 화학식 Ib 및 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드이다.
화학식 Ib 및 Ic의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 하기 화합물로 예시될 수 있다.
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-NEM
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-C6SH-NEM
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-C6SH-NMM
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-NEM
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-NMM
5'-NEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C
여기서 C6SH은 C6 (헥실렌) 티올 링커를 의미하고; NEM은 3H 표지된 N-에틸말레이미드이고; NMM은 3H 표지된 N-메틸 말레이미드이고; * 은 포스포르티오에이트 브릿지를 나타내고; A, C, G, T는 LNA 뉴클레오시드 단량체이고, a, t, c, g는 DNA 뉴클레오시드 단량체이다.
본 발명의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드는 37 GBq/mmol (1 Ci/mmol) 내지 3.7 TBq/mmol (100 Ci/mmol), 바람직하게는 111 GBq/mmol (3 Ci/mmol) 내지 1.85 Tbq/mmol (50 Ci/mmol), 보다 바람직하게는 185 GBq/mmol (5 Ci/mmol) 내지 740 GBq/mmol (20 Ci/mmol)의 특이적 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 화학식 I 의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 포함한다.
Q가 화학식 2a의 잔기를 나타내는 화학식 I의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 경우, 방법은 하기 화학식 III의 아민과:
Figure pct00013
[식 중,
X1 및 X2 는 각각 독립적으로 S 또는 O 이고;
링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
Figure pct00014
(식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고; 및
수용체 표적화 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 추가의 관능성을 부가하는 모이어티임]
화학식 IV의 방사성 표지된 숙신이미딜 화합물의 컨쥬게이팅을 포함한다:
Figure pct00015
[식 중, R1* 은 상기에서와 같음].
방사성 표지된 숙신이미딜 유도체는 상업적으로 판매된다. R1* 에틸 (N-숙신이미딜 프로피오네이트; NSP)인 화학식 IV의 3H 표지된 숙신이미딜 화합물은 예를 들어 Pharmaron, Cardiff, UK 로부터 수득될 수 있다.
컨쥬게이션 반응은 0 ℃ 내지 50 ℃의 반응 온도에서 유기 염기 및 유기 용매의 존재하에 또는 수성 완충 시스템에서 수행될 수 있다.
적합한 유기 염기는 3차 아민, 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기)이다.
적합한 수성 완충제는, 예컨대 pH 6 내지 9의 인산염 완충 식염수이다.
적합한 용매는 극성 비 양성자성 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 또는 디메틸술폭시드이다.
생성된 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 반응 혼합물은 용매로부터 유리될 수 있고 미정제는 추가 정제를 위해 적합한 수성 완충 용액에 용해될 수 있다.
정제는 본질적으로 당업자에게 잘 알려진 단계 크로마토그래피, 농축 및 단리 적용 기술을 포함한다.
크로마토그래피는 전형적으로 수성 및 유기 용매를 이동상으로 사용하는 C-18 역상 컬럼을 갖는 분취용 HPLC이다.
크로마토그래피로부터 수득된 분획의 농도는 접선 유동 여과, 특히 적합한 막 위의 정용 여과를 통해 발생할 수 있다.
최종적으로, 용리액으로부터 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 단리는 전형적으로 동결 건조에 의해 발생할 수 있다.
Q가 화학식 2b의 잔기를 나타내는 화학식 I의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 경우, 방법은 화학식 V의 티올과:
Figure pct00016
[식 중,
X1 및 X2 는 각각 독립적으로 S 또는 O 이고;
링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
Figure pct00017
(식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고; 및
수용체 표적화 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 추가의 관능성을 부가하는 모이어티임]
화학식 VI 의 방사성 표지된 말레이미드 화합물의 컨쥬게이팅을 포함한다:
Figure pct00018
[식 중, R2* 은 상기에서와 같음].
방사성 표지된 말레이미드 유도체는 상업적으로 판매된다. R2* 메틸 (공급자 1) 또는 에틸 (공급자 2)인 3H 표지된 말레이미드는 예를 들어 RC Tritec, Teufen, CH (공급자 1), Pharmaron, Cardiff, UK (공급자 2)로부터 수득될 수 있다.
컨쥬게이션 반응은 0℃ 내지 50℃ 의 반응 온도에서 유기 용매의 존재 하에서 수행될 수 있다.
적합한 용매는 극성 비 양성자성 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드, 디메딜술폭시드 또는 수성 완충 시스템이다.
생성된 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 반응 혼합물은 용매로부터 유리된 형태일 수 있고 미정제는 추가 정제를 위해 적합한 수성 완충 용액에 용해될 수 있다.
정제는 본질적으로 당업자에게 잘 알려진 단계 농축 및 단리 적용 기술을 포함한다.
농축은 접선 유동 여과, 특히 적합한 막 위의 수용액의 정용 여과를 통해 발생할 수 있다.
본 발명은 조직 또는 체액에서 올리고뉴클레오티드의 생체 분포 및 약동학을 측정하기 위한 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 용도를 추가로 포함한다. 또한, 삼중 수소 표지된 올리고뉴클레오티드는 정량적 전신자가 방사선 검사 (QWBA), 표적 결합, 및 운반체 유출 및 흡수 연구를 포함하는 생명과학에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 조직 또는 체액에서 올리고뉴클레오티드의 생체분포 및 약동학의 측정 방법을 포함한다:
a) 검사할 조직 또는 체액에 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계 및
b) 조직 또는 체액 내에서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 생체분포 및 약동학을 측정하는 단계 및 임의로
c) 자가 방사선 검사에 의해 검사될 조직 또는 체액에서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드를 영상화하는 단계.
본 발명은 화학식 X의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다:
Figure pct00019
[식 중,
n 은 0 또는 1 이고;
X1 및 X2 는 각각 독립적으로 S 또는 O 이고;
링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
Figure pct00020
(식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고;
Q는 화학식 2a' 또는 2b'의 잔기를 나타내고
Figure pct00021
(식 중, R1 및 R2 는 C1-6-알킬기임) 및
수용체 표적화 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 추가의 관능성을 부가하는 모이어티임].
화학식 I의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드에 대해 기재된 바람직한 구체예는 마찬가지로 화학식 X의 올리고뉴클레오티드에 적용한다.
따라서, R1 및 R2 는 C1-4-알킬기, 바람직하게는 메틸 또는 에틸기, 보다 바람직하게는 에틸기를 나타낸다.
화학식 Ib, Ic 및 Id의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드에 대해 기재된 바람직한 구체예는 마찬가지로 하기에 대하여 적용된다:
화학식 Xb의 올리고뉴클레오티드
Figure pct00022
(식 중, R2, X2 및 링커 1은 상기에서와 같음)
화학식 Xc의 올리고뉴클레오티드
Figure pct00023
(식 중, R2, X1 및 X2, 링커 1 및 링커 2는 상기에서와 같음)
화학식 Xd의 올리고뉴클레오티드
Figure pct00024
(식 중, R1, X2 및 링커 1은 상기에서와 같음) 및
비-뉴클레오티드 모이어티, 바람직하게는 아시알당단백질 수용체 표적화 모이어티, 보다 바람직하게는 화학식 VII의 GalNAc 모이어티:
Figure pct00025
(식 중, R3 은 수소 또는 하이드록시 보호기이고, n은 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 5, 보다 바람직하게는 1 내지 3의 정수이지만, 가장 바람직한 것은 2임), 이의 상응하는 염, 거울상 이성질체 및/또는 이의 입체 이성질체인 수용체 표적화 모이어티.
본원에 개시된 화합물은 하기 핵염기 서열을 갖는다.
SEQ ID NO 1: gcattggtattca (올리고 1,3,5)
SEQ ID NO 2: gagttacttgccaact (올리고 2,6)
SEQ ID NO 3: cagagttacttgccaact (올리고 4)
SEQ ID NO 4: ttacacttaattatacttcc (올리고 7)
실시예:
약어:
AcOH 아세트산
Bq 베크렐
Ci curries
Da 돌턴
DI 탈이온화된
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기)
DMAP 4-(디메틸아미노)-피리딘
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸술폭시드
EtOH 에탄올
GBB 글리세롤 기반 브릿지
h 시간
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
i 이소
LC-MS/MS 액체 크로마토그래프-탠덤 질량 분석법
LNA 잠금 핵산
LSC 액체 섬광 계수
MeOH 메탄올
min 분(들)
mM, nM 밀리몰, 나노몰
mL 밀리리터
μL 마이크로로리터
MS 질량 분광법
MW 분자량
MWCO 분자 중량 컷-오프
n 노르말
NEM n-에틸 말레이미드
Ng 나노그램
nm 나노미터
NMM N-메틸 말레이미드
NSP N-숙신이미딜 프로피오네이트
p 파라
PBS 포스페이트-완충 식염수
PCR 중합효소 연쇄 반응
PD 약동학
Prop 프로피오네이트
QC 품질 관리 (샘플)
QWBA 정량 전신 자동 방사선 촬영
rpm 분당 회전수
rt 실온
SRM 선택된 반응 모니터링
t 3차
TEA 트리에틸아민
UPLC 초고성능 액체 크로마토그래피
v 부피
일반적 방법:
출발 물질로서 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 Roche Pharma 연구 및 초기 개발로부터 합성되었다. 삼중 수소 표지된 N-[3H]에틸 말레이미드 (특이적 활성: 2 TBq/mmol = 55 Ci/mmol)를 펜탄 중의 용액으로서 Pharmaron (Cardiff, Wales, UK)으로부터 수득하였다. 삼중 수소 표지된 N-[3H]숙신이미딜 프로피오네이트 (특정 활성: 3.8 TBq/mmol = 103 Ci/mmol)를 톨루엔 용액으로서 RC Tritec (Teufen, CH)로부터 수득하였다. 삼중 수소 화합물에 대한 액체 섬광 계수는 HIDEX 300 SL 및 ULTIMATE GOLD cocktail (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 달성되었다. 올리고 1-3에 대한 반응 모니터링 및 순도는 60℃에서 260 nM 파장의 HPLC Agilent 1210, Waters XBridge RP18, 4.6 x 150 mm, 3.5 μm 컬럼에 의해 유량 1.0 mL/분에서 하기 구배로 측정되었다: 12분 내에 10% [B] 내지 60% [B] ([A] = 물/메탄올/헥사플루오로 i-프로판올/TEA : 950/25/21/2.3 mL; [B] = 물/메탄올/헥사플루오로 i-프로판올/TEA : 175/800/21/2.3mL). 올리고 4-6는 260 nm 파장에서 UPLC Agilent 1290, ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18, 2.1 x 50 mm, 80℃에서 1.7 μm 컬럼으로 동일한 용리액과 하기 구배로 측정되었다: 6분 내에 10% [B] 내지 40%. 올리고 7은 올리고 4-6과 같은 조건으로 6 분 내에 10% [B] 내지 30%의 구배를 수용하는 것으로 분석되었다. 질량 분광법은 Single Quadruple (SQ)이 장착된 Waters Acquity UPLC H-class System에 의해 수행되었으며, ESI Mass Detector Radiochemical 순도는 β-방사성 HPLC 검출기 RAMONA Quattro (Raytest, Straubenhardt, Germany)를 사용하여 측정하였다. 올리고 1-3에 대한 분취용 HPLC는 Gilson PLC 2050에 의해 XBridge C18 컬럼, 5 μm, 10 mm × 250 mm 및 물 (950 mL)/메탄올 (25 mL)/TEA (2.3 mL)/헥사플루오로 i-프로판올 (21 mL)을 이동상 [A]로서 사용하고, 물 (175ml)/메탄올 (800mL)/TEA (2.3mL)/헥사플루오로 i-프로판올 (21 mL)을 이동상 [B]로서 사용하여 15 분 내 10% [B] 내지 60% [B]의 구배로서 수행되었다. 농도는 260 nm 파장에서 Eppendorf BioSprectrometer® 염기성 및 상응하는 계산된 몰 흡광 계수에 의해 측정되었다.
실시예 1 (아민 링커상의 비-방사성 컨쥬게이션)
a) 실시예에서 사용되는 올리고뉴클레오티드
5'-Am-C6*G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A; MW:4520.7 g/mol; (올리고 1)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-Am-GBB; MW: 5506.5 g/mol; (올리고 2)
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-Am-GBB; MW: 4553.6 g/mol; (올리고 3)
b) 일반적 반응식:
Figure pct00026
c) 일반적 과정:
DMF에서 5' 또는 3' 말단에 아민 링커를 함유하는 1 당량의 올리고뉴클레오티드 (부피 계수: 125 mL/g) 및 40 당량의 휘니그 염기에 1.2 당량의 N-숙신이미딜 프로피오네이트 (NSP)를 첨가하여 무색 현탁액을 수득하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하여 투명하고 무색의 용액이 되었다. 용매를 고진공 하에서 제거하고, 잔류물을 PBS에 용해시켰다. 미정제 혼합물을 분취용 HPLC로 정제하였다. 원하는 분획을 Amicon® Pro 정제 시스템 (MWCO: 3.000 Da)으로 옮기고 4000 rpm에서 원심분리하였다. 탈이온수를 첨가하고 방법을 4회 더 반복하여 HPLC 용리액으로부터 물로의 교환을 완료하였다. 생성된 수용액을 동결건조시켜 올리고뉴클레오티드를 무색 분말로서 96% 내지 99% 순도 및 47% 내지 74%의 범위 내 수율로 분리하였다.
일반적인 절차 (1.c.)에 따라 올리고뉴클레오티드 올리고 1-3이 컨쥬게이션되었다.
실시예 1.d (컨쥬게이트 1)
Prop-5'-Am-C6*G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A; 수율: 47%, 순도: 99%, MS (m/z): 4577.0 [M-(H)]-
실시예 1.e (컨쥬게이트 2)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-Am-GBB-Prop; 수율: 74%, 순도: 95%, MS (m/z): 5561.6 [M-(H)]-
실시예 1.f (컨쥬게이트 3)
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-Am-GBB-Prop; 수율: 60%, 순도: 96%, MS (m/z): 4662.3 [M-(H)]-
실시예 2 (티올 링커상의 비-방사성 콘쥬게이션)
a) 실시예에서 사용되는 올리고뉴클레오티드
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH; MW: 7709.5 g/mol; (올리고 4)
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-C6SH; MW: 4537.6 g/mol; (올리고 5)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH; MW: 5491.5 g/mol; (올리고 6)
5'-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C; MW: 6742.3 g/mol; (올리고 7)
b) 일반적 반응식:
Figure pct00027
c) 일반적 과정:
5' 또는 3' 말단 술프하이드릴 링커를 갖는 1 당량의 올리고뉴클레오티드를 PBS (부피 인자: 250 mL/g)에 용해시켰다. DMSO (부피 인자: 1500 mL/g)에 용해된 1.5의 당량의 N-알킬화 말레이미드 (메틸 또는 에틸)를 수용액에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. UPLC 분석은 올리고 뉴클레오티드에 말레이미드의 완전한 첨가를 나타내었다. 완충액을 물로 교환하기 위해, 반응 혼합물을 Amicon® Pro 정제 시스템 (MWCO: 3.000 Da)으로 옮기고 4000 rpm에서 원심분리 하였다. 탈이온수를 첨가하고 방법을 4 회 더 반복하여 교환을 완료하였다. 생성된 수용액을 동결건조시켜 올리고뉴클레오티드를 무색 분말로서 96% 내지 99% 순도 및 69% 내지 81%의 범위 내 수율로 분리하였다.
일반적인 절차 (2.c.)에 따라 올리고뉴클레오티드 올리고 4-7)이 컨쥬게이션되었다.
실시예 2.d (컨쥬게이트 4)
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-NEM; 수율: 73%, 순도: 99%, MS (m/z): 7833.4 [M-(H)]-
실시예 2.e (컨쥬게이트 5)
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-C6SH-NEM; 수율: 73%, 순도: 99%, MS (m/z): 4662.3 [M-(H)]-
실시예 2.f (컨쥬게이트 6)
G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A*-C6SH-NMM; 수율: 81%, 순도: 99%, MS (m/z): 4648.2 [M-(H)]-
실시예 2.g (컨쥬게이트 7)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-NEM; 수율: 73%, 순도: 96%, MS (m/z): 5616.2 [M-(H)]-. 1H NMR (600 MHz, D2O) δ ppm 4.11 (br s, 2 H), 4.05 - 4.17 (m, 1 H), 3.75 (br s, 2 H), 3.43 - 3.52 (m, 1 H), 2.80 - 2.91 (m, 1 H), 2.74 - 2.91 (m, 2 H), 1.71 - 1.83 (m, 2　H), 1.61 - 1.77 (m, 2 H), 1.44 - 1.59 (m, 2 H), 1.43 - 1.56 (m, 2 H), 1.34 (br s, 3 H)
NMR 데이터는 링커 및 NEM 컨쥬게이트된 표지로 제한된다.
실시예 2.h (컨쥬게이트 8)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-NMM; 수율: 69%, 순도: 97%, MS (m/z): 5602.2 [M-(H)]-
실시예 2.i (컨쥬게이트 9)
5'-NEM-SH- C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C; 수율: 97%, 순도: 99%, MS (m/z): 6868.7 [M-(H)]-
실시예 3 (방사성 컨쥬게이션 올리고뉴클레오티드)
실시예 3.a (컨쥬게이트 2에 기초한 [ 3 H]-화합물 1)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-Am-GBB-[ 3 H]-Prop
3.811 GBq/mmol (103 Ci/mmol)의 특이적 활성을 가지고 2 mL 톨루엔에 용해된 370 MBq (10 mCi)의 N-[3H]숙신이미딜 프로피오네이트 (17.3 μg, 0.079 μmol)는 22.8 μg의 상응하는 비방사성 N-숙신이미딜 프로피오네이트로 희석되어 1.554 TBq/mmol (42 Ci/mmol)의 특이적 활성을 갖는 총량 40.1 μg (0.234 μmol)을 달성시켰다. 용매를 증발로 제거하고 고체 잔류물을 100 μl DMF에 용해시켰다. 250 μL DMF 및 1.3 μL (0.97 μmol) DIPEA에 용해된 0.98 mg (0.167 μmol)의 Olio 2를 [3H] NSP 용액에 적가하고 실온에서 밤새 교반하였다. UPLC는 원하는 생성물로 40%의 전환을 나타내었다. 반응 용액을 Amicon® Pro 정제 시스템 (MWCO: 3.000 Da)에 채우고 4000 rpm에서 원심분리하여 용매를 물/메탄올/헥사플루오로 i-프로판올/TEA : 950/25/21/2.3 으로 분취용 HPLC 샘플 제조를 위해 변경하였다. 분취-HPLC 이후, 상응하는 분획을 PBS로 희석하고 Amicon® Pro 정제 시스템 (MWCO: 3.000 Da)으로 옮기고 4000 rpm에서 원심분리하였다. PBS를 첨가하고 방법을 4회 더 반복하여 99%의 화학적 순도를 달성하였다. 부피: 0.55 mL, 농도: 0.32 mg / mL, 양: 0.19 mg (수율: 19.5 %), 활성: 51.8 MBq (1.4 mCi), 특이적 활성: 262.7 MBq/mg (7.1 mCi/mg), 이는 1.554 TBq/mmol (42 Ci/mmol)과 동일함.
실시예 3.b (컨쥬게이트 4에 기초한 [ 3 H]-화합물 2)
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-[ 3 H]-NEM
4 mL 펜탄 중 370 MBq (10mCi)의 N-[3H]에틸 말레이미드 (20.5 μg, 0.159 μmol)를 실리카겔 사전 충전 컬럼상에서 농축시키고 2x 0.5mL DMSO로 용리시켰다. 1mL PBS 중의 올리고 4 (1.02 mg, 0.132 μmol)의 용액을 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. UPLC 분석은 20%의 원하는 생성물을 나타내었다. 비-방사성 NEM (166 ㎍, 1.32 μmol)을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. HPLC는 원하는 생성물에 완전한 첨가를 나타내었다. 반응 용액을 5 mL Float-A-Lyzer® 튜브 (MWCO: 500 - 1000 Da)로 옮기고 실온에서 PBS pH 7.1에 대해 투석하였다. 완충액을 45분 후에 4회 교체하고 냉장고에 밤새 저장하였다. UPLC 는 93%의 방사성 화학 순도를 나타내었다. 부피: 2.9 mL, 농도: 0.33 mg / mL, 양: 0.95 mg (수율: 92%), 활성: 33.7 MBq (0.91 mCi), 특이적 활성: 35.5 MBq/mg (953 μCi/mg), 이는 0.3 TBq/mmol (7.9 Ci/mmol)과 동일함.
실시예 3.c (컨쥬게이트 7에 기초한 [ 3 H]-화합물 3)
G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-[ 3 H]-NEM
12 mL 펜탄 중 1.1 GBq (30 mCi)의 N-[3H]에틸 말레이미드 (61.5 μg, 0.477 μmol)를 실리카겔 사전 충전 컬럼상에서 농축시키고 2x 0.5mL DMSO로 용리시켰다. 1mL PBS 중의 올리고 6 (2.20 mg, 0.401μmol)의 용액을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. UPLC 분석은 40%의 원하는 생성물을 나타내었다. 비-방사성 NEM (502 μg, 4.01 μmol)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 원하는 생성물에 완전한 첨가를 나타내었다. 반응 용액을 5 mL Float-A-Lyzer® 튜브 (MWCO: 500 - 1000 Da)로 옮기고 실온에서 PBS pH 7.1에 대해 투석하였다. 완충액을 45분 후에 4회 교체하고 냉장고에 밤새 저장하였다. UPLC는 높은 극성 방사성 불순물을 나타내었다. 용액을 Amicon® Pro 정제 시스템 (MWCO: 3.000 Da)에 채우고 4000 rpm에서 원심분리 하였다. PBS를 첨가하고 방법을 4회 더 반복하여 99%의 화학적 순도를 달성하였다. 부피: 1.0 mL, 농도: 1.58 mg / mL, 양: 1.58 mg (수율: 70%), 활성: 163 MBq (4.4 mCi), 특이적 활성: 104 MBq/mg (2.8 mCi/mg), 이는 614 MBq/mmol (16.6 Ci/mmol)과 동일함.
실시예 3.d (컨쥬게이트 9에 기초한 [ 3 H]-화합물 4)
5'-[ 3 H]-NEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*t*t*a*a*t*t*a*t*a*c*t*T*C*C
4 mL 펜탄 중 370 MBq (10mCi)의 N-[3H]에틸 말레이미드 (20.5 μg, 0.159 μmol)를 실리카겔 사전 충전 컬럼상에서 농축시키고 2x 0.5mL DMSO로 용리시키며, 0.5mL PBS 중 올리고 7의 용액 (1.13 mg, 0.168 μmol) 내에 적가하고, 실온에서 1.5시간 동안 교반되도록 하였다. UPLC는 45%의 원하는 생성물 및 55%의 출발 물질을 나타내었다. 비-방사성 NEM (210 μg, 1.68 μmol)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 원하는 생성물에 완전한 첨가를 나타내었다. 반응 용액을 Amicon® Pro 정제 시스템 (MWCO: 3.000 Da)으로 옮기고 4000 rpm에서 원심분리 하였다. PBS를 첨가하고 방법을 4회 더 반복하여 99%의 화학적 순도를 달성하였다. 부피: 1.0 mL, 농도: 1.80 mg/mL, 양: 1.07 mg (수율: 93%), 활성: 71 MBq (1.91 mCi), 특이적 활성: 67 MBq/mg (1.8 mCi/mg), 이는 481 MBq/mmol (13.0 Ci/mmol)과 동일함.
비표지 및 삼중 수소 표지된 LNA의 조직 노출 연구 - 타당성 연구
연구는 하기 화합물로 수행되었다:
5'-GN2-C6-ca G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-3' (GalNAc LNA 연구 화합물 A)
5'- G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-3' (LNA 연구 화합물 A)
5'-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-[3H]-NEM (=실시예 3.b)
5'-G*A*G*t*t*a*c*t*t*g*c*c*a*A*C*T*-C6SH-[3H]-NEM (=실시예 3.c)
1 mg/kg에서 실시예 3.b (컨쥬게이트 4에 기초한 [3H]-화합물 2) 및 실시예 3.c (컨쥬게이트 7에 기초한 [3H]-화합물 3)을 이용한 단일 용량 PK 실험을 수행하였다. LNA는 투여 후 간 24, 72 및 336 시간에서 분석되었다. 연구는 방사성 컨쥬게이션을 갖는 올리고뉴클레오티드의 가능성을 확인할 것이다.
생체 내 연구를 위한 실험적인 부분:
스톡 용액 준비, 교정 표준 및 품질 검사
연속 희석은 스톡 용액 (PCR 등급의 물에서 약 1 mg/mL, 스톡 용액의 정확한 농도는 260 nm에서의 흡광 계수에 기초한 분광 광도 소자 Nanodrop (Thermo Scientific)으로 정량화될 것임)으로부터 물 중에서 작업 용액을 약 100 ng/mL 내지 최대 약 250000 ng/mL 까지 생성하기 위해 수행되었다.
이 작업 용액은 하기 이 절차에 따라 플라즈마를 스파이킹하는데 사용되었다: 1 μL 작업 용액을 49 μL 플라즈마에 추가하여 보정 샘플을 생성하고, 품질 제어 샘플은 플라즈마의 4 농도 수준임.
추출 방법
교정 표준 물질 및 품질 관리 샘플 (혈장에서 새로 제조된, 50 μL)을, 내부 표준 물질을 첨가한 후 150 μL의 4 M의 구아니딘 티오시아네이트로 단백질 변성을 위해 처리하였다. 격렬하게 혼합 (1600rpm에서 20분)한 후, 200 μL의 물/헥사플루오로이소프로판올/디이소프로필에틸아민 용액 (100:4:0.2, v/v/v)을 첨가한 후, 이어서 혼합하였다 (1500rpm에서 15분). 이후에 세척 단계는 고체상 추출 카트리지 (Waters, OASIS HLB 5 mg, 30 μm)를 사용하여 용리 및 증발 건조 (+40 ℃에서 30-45 분) 후 수행되었고 샘플은 200 μL의 이동상 (물/메탄올/헥사플루오로이소프로판올/디이소프로필에틸아민 (95/5/1/0.2, v/v/v/v))에서 재구성되었다. 볼텍스 혼합 (1500 rpm에서 10분) 후, 분취량 (20 μL)을 LC-MS/MS 시스템 (50 μL 루프)에 주입하였다.
LC-MS / MS 방법의 설명
60 ℃에서 Waters Acquity C18 컬럼 (50 x 2.1mm)이 장착된 Shimadzu 30ADXR 펌프를 사용했다. 분석물 및 내부 표준 물질은 물/메탄올/헥사플루오로이소프로판올/디이소프로필에틸아민 (95/5/1/0.2, v/v/v/v)에서 물/메탄올/헥사플루오로이소프로판올/디이소프로필에틸아민 (10/90/1/0.2, v/v/v/v)으로의 구배 용리를 사용하여 매트릭스 간섭으로부터 0.4 mL/분의 유속으로 4.0 분 이내에 분리되었다.
질량 분광 분석은 음이온 모드에서 SRM을 사용하여 AB-Sciex Triple Quad 6500+질량 분석기에서 수행되었다.
액체 섬광 계수
Packard Tri-carb 3100TR을 LSC 분석에 사용하였다.
도면의 상세한 설명:
도 1에서 GalNAc LNA 연구 화합물 A (점선) 및 GalNAc이 없는 연구 화합물 A (연속선)의 간 농도는 LC-MS/MS에 의해 분석되었다. GalNAc 표지된 LNA는 예측한대로 간 혈장에서 높은 초기 흡수 및 시간에 따른 정상적인 감소를 나타낸다. 마찬가지로 네이키드, 즉 GalNAc이 아닌 LNA를 함유하는, 낮은 수준의 흡수를 나타낸다.
도 2에서, 실시예 3.b (점선) 및 실시예 3.c (연속선)의 삼중 수소 표지된 화합물의 간 농도는 LSC에 의해 분석되었다. 이 도면은, 말레이미드 컨쥬게이션에도 불구하고 방사성 표지된 GalNAc 화합물이 치료 GalNAc LNA와 동등한 간 흡수를 가지고 있음을 나타낸다 (도 1).
PD 효과는 비표지 및 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드와 비교할 만하다. LSC에 의한 방사능의 간에서 LNA 농도 측정은 LC-MS/MS에 의해 측정된 치료 LNA와 유사하다.
도 2는 본 발명의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 화합물의 높은 특이성을 인상적으로 도시한다.
SEQUENCE LISTING <110> F.Hoffmann-La Roche Ltd <120> Radiolabeled oligonucleotides and process for their preparation <130> Case 34626-WO <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Sequence <400> 1 gcattggtat tca 13 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Sequence <400> 2 gagttacttg ccaact 16 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Sequence <400> 3 cagagttact tgccaact 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Sequence <400> 4 ttacacttaa ttatacttcc 20

Claims (24)

  1. 화학식 I 의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00028

    [식 중,
    n 은 0 또는 1 이고;
    X1 및 X2 는 서로 독립적으로 S 또는 O 이고;
    링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
    Figure pct00029

    (식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
    링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고;
    Q는 화학식 2a 또는 2b의 잔기를 나타내고
    Figure pct00030

    (식 중, R1* 및 R2* 는 방사성 표지된 C1-6-알킬기임) 및
    수용체 표적화 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 추가의 관능성을 부가하는 모이어티임].
  2. 제1항에 있어서, Q가 화학식 2b를 가지고 컨쥬게이션이 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 있는, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Q가 화학식 2a를 가지고 컨쥬게이션이 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 있는, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1* 및 R2*가 방사성 표지된 C1-4-알킬기, 바람직하게는 방사성 표지된 메틸 또는 에틸기인, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지가 3H- 또는 14C-표지, 바람직하게는 3H-표지인, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 임의로 변형된 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어진 7 내지 30 개 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Ib인, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00031

    [식 중, R2*, X2 및 링커 1은 상기에서와 같음].
  8. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Ic인, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00032

    [식 중, R2*, X1 및 X2, 링커 1 및 링커 2는 상기에서와 같음].
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 표적화 모이어티는 비-뉴클레오티드 모이어티, 바람직하게는 아시알당단백질 수용체 표적화 모이어티, 보다 바람직하게는 화학식 VII의 GalNAc 모이어티, 이의 상응하는 염, 거울상 이성질체 및/또는 입체 이성질체인, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00033

    [식 중, R3 은 수소 또는 하이드록시 보호기이고, n은 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 5, 보다 바람직하게는 1 내지 3의 정수이지만, 가장 바람직한 것은 2임].
  10. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Id인, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00034

    [식 중, R1*, X2 및 링커 1은 상기에서와 같음].
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 37 GBq/mmol (1 Ci/mmol) 내지 3.7 TBq/mmol (100 Ci/mmol), 바람직하게는 111 GBq/mmol (3 Ci/mmol) 내지 1.85 Tbq/mmol (50 Ci/mmol), 보다 바람직하게는 185 GBq/mmol (5 Ci/mmol) 내지 740 GBq/mmol (20 Ci/mmol)의 특이적 활성을 갖는, 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드.
  12. Q가 화학식 2a의 잔기를 나타내는 화학식 I의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법으로서, 하기 화학식 III의 아민과:
    Figure pct00035

    [식 중,
    n 은 0 또는 1 이고;
    X1 및 X2 는 서로 독립적으로 S 또는 O 이고;
    링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
    Figure pct00036

    (식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
    링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고;
    수용체 표적화 모이어티는 비-뉴클레오티드 모이어티 (이는 올리고뉴클레오티드에 추가 관능성을 부가함), 특히 아시알당단백질 수용체 표적화 모이어티, 바람직하게는 GalNAc 모이어티임]
    화학식 IV 의 방사성 표지된 숙신이미드 화합물의 컨쥬게이팅을 포함하는 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법:
    Figure pct00037

    [식 중, R1* 은 상기에서와 같음].
  13. Q가 화학식 2b의 잔기를 나타내는 화학식 I의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법으로서, 하기 화학식 V의 티올과:
    Figure pct00038

    [식 중,
    n 은 0 또는 1 이고;
    X1 및 X2 는 서로 독립적으로 S 또는 O 이고;
    링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
    Figure pct00039

    (식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
    링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고;
    수용체 표적화 모이어티는 비-뉴클레오티드 모이어티 (이는 올리고뉴클레오티드에 추가 관능성을 부가함), 특히 아시알당단백질 수용체 표적화 모이어티, 바람직하게는 GalNAc 모이어티임]
    화학식 VI의 방사성 표지된 말레인이미드 화합물의 컨쥬게이팅을 포함하는 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법:
    Figure pct00040

    [식 중, R2* 은 상기에서와 같음].
  14. 조직 또는 체액에서 올리고뉴클레오티드의 생체 분포 및 약동학을 측정하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 용도.
  15. 하기 단계를 포함하는, 조직 또는 체액에서 올리고뉴클레오티드의 생체 분포 및 약동학의 측정 방법;
    a) 검사될 조직 또는 체액에 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계 및
    b) 조직 또는 체액 내에서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드의 생체 분포 및 약동학을 측정하는 단계 및 임의로
    c) 자가 방사선 검사에 의해 검사될 조직 또는 체액에서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드를 영상화하는 단계.
  16. 화학식 X의 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00041

    [식 중,
    n 은 0 또는 1 이고;
    X1 및 X2 는 서로 독립적으로 S 또는 O 이고;
    링커 1은 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 브릿지 또는 하기 화학식의 글리세롤 기반 브릿지이고,
    Figure pct00042

    (식 중, m 은 1 내지 6 의 정수임)
    링커 2는 임의로 아미노기 보호된 아미노 C2-12-알킬렌 브릿지, 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 브릿지이고;
    Q는 화학식 2a' 또는 2b'의 잔기를 나타내고
    Figure pct00043

    (식 중, R1 및 R2 는 C1-6-알킬기임) 및
    수용체 표적화 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 추가의 관능성을 부가하는 모이어티임].
  17. 제16항에 있어서, Q가 화학식 2b'를 가지고 컨쥬게이션이 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 있는, 올리고뉴클레오티드.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, Q가 화학식 2a'를 가지고 컨쥬게이션이 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 있는, 올리고뉴클레오티드.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2 가 C1-4-알킬기, 바람직하게는 메틸 또는 에틸기인, 올리고뉴클레오티드.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 임의로 변형된 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어진 7 내지 30 개 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Xb인, 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00044

    [식 중, R2, X2 및 링커 1은 상기에서와 같음].
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Xc인, 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00045

    [식 중, R2, X1 및 X2, 링커 1 및 링커 2는 상기에서와 같음].
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 표적화 모이어티가 비-뉴클레오티드 모이어티, 바람직하게는 아시알당단백질 수용체 표적화 모이어티, 보다 바람직하게는 화학식 VII의 GalNAc 모이어티, 이의 상응하는 염, 거울상 이성질체 및/또는 입체 이성질체인, 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00046

    [식 중, R3 은 수소 또는 하이드록시 보호기이고, n은 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 5, 보다 바람직하게는 1 내지 3의 정수이지만, 가장 바람직한 것은 2임].
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Xd인, 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00047

    [식 중, R1, X2 및 링커 1 은 상기에서와 같음].
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