JP2003501487A - リガンドコンジュゲート化オリゴマー化合物 - Google Patents

リガンドコンジュゲート化オリゴマー化合物

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Abstract

(57)【要約】 リガンドが２’−、３’−、５’−、核酸塩基及びヌクレオチド間結合部位を含めた、オリゴマー化合物上の１つ以上の部位にコンジュゲートしているリガンドコンジュゲート化オリゴマー化合物を開示する。リガンドは任意の連結基を介して付着することができる。１種類以上の細胞、血清及び血管タンパク質に結合して、得られるリガンドコンジュゲート化オリゴマー化合物に強化された薬物動態的性質を与えるリガンドが、コンジュゲーションのために選択される。血清中のオリゴヌクレオチドの濃度を高める方法及びオリゴヌクレオチドに対する血清の容量を高める方法も提供される。さらに、血管系の一部に対するオリゴヌクレオチドの結合を増強する方法も開示される。さらに、細胞中へのオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、タンパク質分子に結合し、強化された薬物動態的性質を有するリガ
ンドコンジュゲート化(ligand-conjugated)オリゴマー化合物に関する。本発明
はさらに、血清中のオリゴマー化合物濃度を高める方法及び細胞中へのオリゴマ
ー化合物の細胞取り込みを促進する方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） タンパク質合成は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の仲介により核酸によ
って操作される。アンチセンス方法論は、これらの細胞内核酸の例えばタンパク
質合成のような、正常な必須機能が破壊されるような、ｍＲＮＡ又はＤＮＡへの
比較的短いオリゴヌクレオチドの相補的ハイブリダイゼーションである。ハイブ
リダイゼーションは、ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドのＷａｔ
ｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対による配列特異性水素結合である。このような塩基対
は相互に相補的であるといわれる。
【０００３】 Ｃｏｈｅｎ（オリゴヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス阻害剤，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８９，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ．）によって
考察された、核酸機能を破壊する天然生成イベントは、２種類であると思われる
。第１のハイブリダイゼーション制止は、オリゴヌクレオチド阻害剤がターゲッ
ト核酸に結合するため、単純な立体障害によって、核酸への必須タンパク質、最
も頻繁にはリボソームの結合を妨害する停止イベントである。メチルホスホネー
トオリゴヌクレオチド（Ｍｉｌｌｅｒ等，（１９８７），Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，２：１１７−１２８）と、α−アノマーオリゴヌ
クレオチドとは、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を破壊すると考
えられる、２種類の最も広範囲に研究されたアンチセンス剤である。
【０００４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが核酸機能を破壊する、もう１つの手段はタ
ーゲットｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションと、続いての細胞内ＲＮアーゼＨ
によるターゲット化ＲＮＡの酵素切断による手段である。２’−デオキシリボフ
ラノシルオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体はターゲット化ＲＮ
Ａとハイブリダイズして、この二本鎖はＲＮアーゼＨ酵素を活性化して、ＲＮＡ
鎖を切断することによって、ＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドは、この種類のアンチセンス停止イベントによって作用す
るアンチセンス剤の最も顕著な例である。
【０００５】 診断、研究用途及び可能な治療目的のためのアンチセンス剤としてのオリゴヌ
クレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体の用途には、かなりの研究が行なわれ
ている。ｉｎ ｖｉｖｏでごく部分的にのみ克服されているにすぎない主要なハ
ードルの１つは、オリゴヌクレオチドの迅速な分解と排泄によってひどく妨げら
れる、効果的な細胞取り込みである。細胞取り込みの一般的に受容されるプロセ
スは、温度と血清及び血管外流体中のオリゴヌクレオチド濃度とに依存する受容
体仲介エンドサイトーシスによるものである。
【０００６】 核酸とオリゴヌクレオチドとのトランスメンブランデリバリーの改良を目的と
した努力は、タンパク質キャリヤー、抗体キャリヤー、リポソームデリバリー系
(liposomal delivery systems)、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合
、ウイルスベクター及びリン酸カルシウム仲介トランスフォーメーションを利用
している。しかし、これらの手法の多くは、トランスメンブラン輸送が可能であ
る細胞の種類と、このような輸送を達成するために必要な条件とによって制限さ
れる。オリゴヌクレオチドのトランスメンブランデリバリーのために特に魅力的
である代替え手段は、輸送を促進する分子へのコンジュゲーションによるオリゴ
ヌクレオチドの物理化学的性質の修飾である。他の代替え手段は、血清中のオリ
ゴヌクレオチドの安定性を高め、それによってオリゴヌクレオチドの濃度と分配
とを増強することである。
【０００７】 ５’−ホスフェート位置(5'-phosphate position)において４−［（Ｎ−２−
クロロエチル−Ｎ−メチル）アミノ］ベンジルアミン反応性官能基によって修飾
されたオリゴヌクレオチドがアルブミン及び免疫グロブリンＭとＧと反応するこ
とは、既に報告されている（Ｙｕ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４，３
３４：９６−９８）。アルブミンへの結合は約２０μＭで弱く、免疫グロブリン
結合は約４〜６μＭでより強かった。この研究はさらに、ステロイドにコンジュ
ゲートしたオリゴヌクレオチドが血液細胞へのアフィニティを高め、それによっ
てそれらの分配を変化させ、血清中のそれらの寿命を高めることを報告した。オ
リゴヌクレオチドの膜及び細胞輸送を高める１つの方法は、ペンダント親油基の
取り付けである。Ｒａｍｉｒｅｚ等（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８２
，１０４：５４８３）は、リン脂質基５’−Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−メリストイ
ル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリル）をダイマーＴｐＴ中に３’位置及び５’
位置において独立的に導入している。その後、Ｓｈｅａ等（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）は、オリゴヌクレオチドの５’−末端
の５’−ホスフェートに結合した１，２−ジ−Ｏ−ヘキシルデシル−ｒａｃ−グ
リセロール基を有するオリゴヌクレオチドを開示している。Ｓｈｅａ等著者のう
ちの幾人かは、特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１００２中においてもこれら及び
他の化合物を開示している。他のグリコシルリン脂質は、Ｇｕｅｒｒａ等，Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２８：３５８１によって開示
されている。
【０００８】 換言すると、オリゴヌクレオチドの第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチド（３
’末端から）との間のヌクレオチド間結合にコレステリル基が取り付けられた。
この研究は、米国特許４，９５８，０１３に開示され、さらにＬｅｔｓｉｎｇｅ
ｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５
５３に開示されている。オリゴヌクレオチドのデリバリー及び研究への他のアプ
ローチは、多様な他の分子及びリポーター基のコンジュゲーションを必要として
いた。Ｙａｍａｎａ等（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９０，１
：３１９）、Ｌｅｍａｉｒｅ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，１９８６，８４：６４８）及びＬｅｏｎｅｔｔｉ等（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９０，１：１４９）によって報告されているように、オ
リゴヌクレオチドの糖フラグメントの２’位置に芳香族挿入剤アントラキノンが
取り付けられた。
【０００９】 リシンとポリリシンもオリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドの電荷サイ
ズ特徴を改良するためにコンジュゲートされている。ポリ（Ｌ−リシン）はオリ
ゴヌクレオチドに３’−末端リボースの過ヨウ素酸塩酸化と、その後に還元及び
Ｎ−モルホリン環を介してのカップリングとによって結合されている。オリゴヌ
クレオチド−ポリ（Ｌ−リシン）コンジュゲートはヨーロッパ特許出願８７１０
９３４８．０．に開示されている。この場合に、オリゴヌクレオチドの５’末端
又は３’末端ヌクレオチドの５’又は３’ホスフェートにリシン残基が結合され
た。オリゴヌクレオチドにペプチドを結合させるために、オリゴヌクレオチドの
３’末端におけるジスルフィド結合も利用されている。ＣｏｒｅｙとＳｃｈｕｌ
ｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８：１４０１；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ等
，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８８，１１０：１６１４；及びＣｏｒｅ
ｙ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８９，１１１：８５２４参照。
【００１０】 オリゴヌクレオチドの３’−末端にビオチンを取り付けるための結合試薬(lin
king reagent)も開示されている。Ｎｅｌｓｏｎ等，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１９８９，１７：７１８７参照。この試薬、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ−ＤＭ−３
−アミノ−１，２−プロパンジオールは現在、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から名称３’−Ａｍｉｎｅ ｏｎで
商業的に入手可能である。これは３’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ試薬なる
名称でＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔｅｒｌｉｎ
ｇ，ＶＡ）からも商業的に入手可能である。Ｊｕｄｙ等（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９１，３２：８７９）によって報告されているように
、この試薬はペプチドをオリゴヌクレオチドに結合させるためにも用いられた。
オリゴヌクレオチドの５’末端に結合させるための同様な商業的試薬（実際には
、種々な長さのポリメチレンコネクターを有する一連のこのようなリンカー）は
、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６である。これらの試薬はＧｌｅｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から
入手可能である。これらの化合物又は同様な化合物はＫｒｉｅｇ等（Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９１，１
：６１）によって、オリゴヌクレオチドの５’−末端にフルオレセインを結合さ
せるために用いられた。重要な他の化合物もオリゴヌクレオチドの３’−末端に
結合されている。Ａｓｓｅｌｉｎｅ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，１９８４，８１：３２９７）は、ポリメチレン結合によるポリ（Ｔｐ
）オリゴヌクレオチドの３’−末端ホスフェート基へのアクリジンの結合を述べ
ている。Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ等（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，１９８７，２８：５１９９）は、固相サポート上のペプチド構築と、次の、
オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基による、該ペ
プチドへのオリゴヌクレオチドの結合を報告している。Ｃｈｏｌｌｅｔ（Ｎｕｃ
ｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９０，９：９５７）はＡ
ｍｉｎｏｌｉｎｋ ２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をオリゴヌクレオチドの５’末端ホスフェートに取り付けた
。次に、二官能性連結基ＳＭＰＢ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）を用いて、インターロイキンタンパク質をオリゴヌク
レオチドに結合させている。
【００１１】 オリゴヌクレオチドへの脂質、リポーター、ペプチド及び他の分子のコンジュ
ゲーションは末端３’−及び５’−位置に限定されない。オリゴヌクレオチドの
ヌクレオチド構築ブロック上の２’−位置の任意の１つ以上において取り付けが
行なわれる、非常に広範囲のコンジュゲートも文献に報告されている。オリゴヌ
クレオチドのヌクレオチド間結合上に又はヌクレオチド単位のいずれかの核酸塩
基の原子の１つ上に取り付けが生ずる、他のコンジュゲートも報告されている。
例えば、ＤｒｅｙｅｒとＤｅｒｖａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，１９８５，８２：９６８）によって報告されたように、ＥＤＴＡ鉄複
合体がピリミジンヌクレオシドの５位置に結合されている。Ｈａｒａｌａｍｂｉ
ｄｉｓ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５：４
８５７）による報告と同じ方法でフルオレセインが、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ／
０２１９８の記載と同じ方法でビオチンがオリゴヌクレオチドに結合されている
。フルオレセイン、ビオチン及びピレンも、Ｔｅｌｓｅｒ等（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，１９８９，１１１：６９６６）による報告と同じ方法で結合され
ている。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔｅｒｌｉ
ｎｇ，ＶＡ）からの商業的試薬、Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ−ｄＴを用いて
、ピリミジンヌクレオチドを有する同様な連結基をオリゴヌクレオチド中に導入
することができる。
【００１２】 Ｍａｎｏｈａｒａｎ等（ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３）はさらに、例えば
ステロイド、リポーター分子、リポーター酵素、ビタミン、非芳香族親油性分子
、キレーター、ポルフィリン、挿入剤(intercalators)、ペプチド及びタンパク
質のような多様な分子とオリゴヌクレオチドとの、例えば６−アミノアルコキシ
基及び６−アミノアルキルアミノ基のような、種々の連結基を仲介したコンジュ
ゲーションも報告している。オリゴヌクレオチドの３’−、５’−、２’−位置
、ヌクレオチド間結合及び核酸塩基位置におけるコンジュゲーションが報告され
ている。このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実
験によって実証されるように、細胞中へのそれらの取り込みとデリバリーとを促
進する改良された物理化学的性質を有することが予想される。しかし、核酸及び
オリゴヌクレオチドの細胞内及び核内デリバリーはまだチャレンジである。非常
にしばしば、今までに報告されたオリゴヌクレオチドコンジュゲートの透過が限
定されることが発見されている。このことは今まで典型的に問題であった、この
理由は、このようなコンジュゲートはオリゴヌクレオチドの受動的吸収を改良す
るように一般に設計されており、この場合にはコンジュゲートのサイズ、物理化
学的性質及び細胞外濃度が重要な限定役割りを果たすからである。このことは、
核酸及びオリゴヌクレオチドの限定された細胞外安定性に関連して、特異的組織
及びターゲット細胞中に高レベルの核酸及びオリゴヌクレオチドをデリバーする
新規なコンジュゲートの開発を必要とする。
【００１３】 アルブミンは哺乳動物系における最も豊富なタンパク質であり、血液中の薬物
物質の輸送及び沈殿(deposition)に重要な役割りを果たす。ヒトアルブミン上に
２つの主要な特異的結合部位、部位Ｉと部位ＩＩが存在することが一般に認めら
れている。結晶質ヒトアルブミンのＸ線研究（ＨｅとＣａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９９２，３５８：２０９−２１５）は、部位Ｉと部位ＩＩとがそれぞれ、
サブドメインＩＩＡとＩＩＩＡとにおける専用キャビティ内に位置決めされるこ
とを実証している。
【００１４】 オリゴヌクレオチドとタンパク質との相互作用は、吸収、分配及び薬物動態に
重要な役割りを果たす。血流中では、主要なオリゴヌクレオチド結合タンパク質
は免疫グロブリンＭとＧ、血清アルブミン及びオロソムコイドα−１−酸糖タン
パク質（ＡＡＧ）である。血漿タンパク質結合の役割りは、オリゴヌクレオチド
のディスポジション(disposition)及び効力における重要な要因である。オリゴ
ヌクレオチドのタンパク質結合を小分子コンジュゲートによってモジュレートす
ることができるならば、より大きく効果的なオリゴヌクレオチド薬物が得られる
であろう。
【００１５】 アルブミンは、単一トリプトファン（Ｔｒｐ−２１４）、低い（２％）グリシ
ン含量、高いシスチン含量及び多数の荷電アミノ酸（約１００負電荷と１００正
電荷）を含有する一本鎖の５８５アミノ酸を含む分子量６６，５００の水溶性タ
ンパク質であり、約ｐＨ５．０の等電点を有する。したがって、７．４の血漿ｐ
Ｈでは、これは−１５の正味負電荷を有する。それにも拘わらず、これはアニオ
ンとカチオンの両方を引きつける。これは血液血漿中を３．５〜５ｇ／１００ｍ
ｌの濃度で循環し、さらに血管外流体中により低い濃度で存在する。全ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）のうちの約６０％は血管外スペース中に存在する（Ｐｅｔ
ｅｒｓ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．，１９８５，３７：１６１）。Ｈ
ＳＡは、血漿中の最も豊富なタンパク質として、血液ｐＨ及びコロイド浸透圧の
維持に重要な役割りを果たし、血漿のチオール含量の大部分を占める（Ｃｙｓ−
３４）。アルブミンへの薬物の結合は通常、迅速に可逆性である。結合（会合）
定数は典型的に１０4〜１０6Ｍ-1の範囲内である。ＨＳＡは各々が２サブドメイ
ンを有する３反復ドメイン（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）の系列として形成される。リ
ガンドはＨＳＡに、一般に２結合部位の一方又は両方に結合する。部位Ｉはリガ
ンド ワルファリン、フェニルブタゾンと会合する。この部位はサブドメインＩ
ＩＡに局在する。部位ＩＩはサブドメインＩＩＩＡに存在し、ジアゼパム及びイ
ブプロフェンに結合する。他のイブプロフェン類似体、全て非ステロイド系抗炎
症薬である、スプロフェン、プラノプロフェン、カルプロフェン、フェンブフェ
ン及びケトプロフェンは部位ＩＩに結合する。フルフェナム酸とダンシルサルコ
シンとは部位ＩＩに結合し、ダンシルアミドは部位Ｉに結合する。例えばキナル
バルビトンのようなバルビツレートは、部位ＩＩと相互作用し、抗糖尿病薬トル
ブタミドは部位Ｉ、部位ＩＩ及び未同定部位に結合する。（Ｒ）−フォリン酸は
両方の部位に結合する。ＨＳＡに結合する他の化合物はチアジアジド、ジアゼピ
ン及び抗菌剤（例えば、ナリジクス酸）を包含する。
【００１６】 リポタンパク質は親油性薬物の血漿結合に寄与することができ、リポタンパク
質の脂質コア中に溶解することができる。オリゴヌクレオチドにコンジュゲート
したコレステロールは、血清タンパク質に結合することが知られている。Ａｇｒ
ａｗａｌ等（“ラットにおけるオリゴヌクレオチドホスホロチオエートのタンパ
ク質結合及び組織ディスポジションに対するアスピリンの影響”，Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９８，５：３０３−３１３）は
、２ｍｇ／ｍｌの濃度でのアスピリンの同時投与の効果を述べており、血清アル
ブミンへのＰ＝Ｓオリゴヌクレオチド結合が減少する（Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチ
ドの結合タンパク質％によって測定）ことを実証している。この結果は、体内に
おけるアスピリン又は同様な小分子薬物の存在がｉｎ ｖｉｖｏでのＰ＝Ｓオリ
ゴヌクレオチドのタンパク質結合を効果的に変化させうることを示す。
【００１７】 ボラス注射後のラットにおけるＰ＝Ｓオリゴヌクレオチド（ＧＥＭ−９１，２
５−マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）の薬物動態研究を決定した。
薬物投与の１時間前に、胃管栄養によってアスピリンを投与する。ラットにおけ
るアスピリン投与後にＰ＝Ｓオリゴヌクレオチドを投与すると、下記血漿薬物動
態パラメーター（ｔ1/2α、ｔ1/2β、ＡＵＣ等）は低下した。組織ディスポジシ
ョンは、組織の大部分、例えば腎臓、肝臓、脾臓、骨髄、皮膚、甲状腺、副腎、
心臓、肺及び膵臓は低い濃度を有し、胃腸組織と胃腸内容物は高い濃度を有した
点で、顕著にそれぞれ異なった。ある一定の組織、例えば肝臓と骨髄では、アス
ピリン投与後に投与されたＰ＝Ｓオリゴヌクレオチドの濃度は、Ｐ＝Ｓオリゴヌ
クレオチドのみの投与後に観察された濃度の約半分であった。動物における排出
速度はＰ＝Ｓオリゴヌクレオチドのみを投与されたラットに比べて影響されるこ
とが見られた。Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチドのみを投与されたラットに比べて、ア
スピリン後にＰ＝Ｓオリゴヌクレオチドを投与されたラットからの糞便中では排
泄オリゴヌクレオチドの高い濃度が観察された。しかし、血清アルブミン結合を
モジュレートするためにオリゴヌクレオチドに小分子薬物を取り付けた効果はま
だ研究されていない。
【００１８】 それ故、上述したオリゴヌクレオチドコンジュゲートの欠点に対処する、改良
された分配と細胞取り込みを有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートとそれら
の製造方法との明白な必要性が存在する。本発明はこの非常に重要な目的に関す
る。
【００１９】 （発明の概要） 本発明は、タンパク質と相互作用することができるリガンドコンジュゲート化
オリゴマー化合物を提供する。特に、本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴ
マー化合物はタンパク質に結合する。さらに特に、本発明は、薬物部分にコンジ
ュゲートするオリゴマー化合物を提供する。
【００２０】 本発明のオリゴマー化合物は血清、血管及び細胞タンパク質に結合する。血清
タンパク質がアルブミン、免疫グロブリン、リポタンパク質、α−２−マクログ
ロブリン及びα−１−糖タンパク質を包含することが好ましい。
【００２１】 本発明はまた、オリゴマー化合物が複数個のヌクレオシドを含むオリゴヌクレ
オチドである、リガンドコンジュゲート化オリゴマー化合物を提供する。さらに
、ヌクレオシドがホスホジエステル結合によって連結されているオリゴヌクレオ
チドが提供される。さらに、ヌクレオシドがホスホロチオエート結合によって連
結されているオリゴヌクレオチドも提供される。本発明のオリゴヌクレオチドの
ヌクレオシドの少なくとも１つが２’−置換基を有することが好ましい。
【００２２】 本発明はまた、血清中のオリゴヌクレオチドの濃度を高める方法であって、 （ａ）血清タンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択する工程
と； （ｂ）前記薬物部分を前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コン
ジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する工程と； （ｃ）前記コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを前記血清に加える工程と を含む前記方法を提供する。
【００２３】 本発明はさらに、 オリゴヌクレオチドに対する血清の容量を高める方法であ
って、 （ａ）血清タンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択する工程
と； （ｂ）前記薬物部分を前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コン
ジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する工程と； （ｃ）前記コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを前記血清に加える工程と を含む前記方法を提供する。
【００２４】 本発明の１実施態様では、血清タンパク質は薬物部分に対する結合部位を有す
るタンパク質である。他の実施態様では、血清タンパク質はオリゴヌクレオチド
に対する結合部位を有するタンパク質である。さらに他の実施態様では、血清タ
ンパク質はオリゴヌクレオチドに対する結合部位と、薬物部分に対する結合部位
とが全く異なるように、血清タンパク質はオリゴヌクレオチドに対する結合部位
と、薬物部分に対する結合部位とを有するタンパク質である。
【００２５】 本発明はさらに、血管系の一部に対するオリゴヌクレオチドの結合を増強する
方法であって、 （ａ）一部は循環血清中に存在し、一部は血管系の非循環部分中に存在するタ
ンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択する工程と； （ｂ）前記薬物部分を前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コン
ジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する工程と； （ｃ）前記コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを前記血管系に加える工程と
を含む前記方法を提供する。
【００２６】 本発明はまた、 細胞中へのオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進する方
法であって、 （ａ）細胞膜上に存在し、少なくとも部分的に前記膜の外側に達するタンパク
質を選択する工程と； （ｂ）前記タンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択する工程
と； （ｃ）前記薬物部分を前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コン
ジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する工程と； （ｄ）前記細胞を前記コンジュゲート化オリゴヌクレオチドに暴露させる工程
と を含む前記方法も提供する。
【００２７】 好ましくは、細胞膜上に存在するタンパク質は細胞表面インテグリンである。 本発明の１実施態様では、血清タンパク質はアルブミン、免疫グロブリン、α
−２−マクログロブリン、α−１−糖タンパク質又はリポタンパク質である。好
ましくは、血清タンパク質はアルブミンである。
【００２８】 本発明のさらに他の実施態様では、薬物部分はアスピリン、ワルファリン、フ
ェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフ
ェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシ
ン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチ
アジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、
セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤又は抗生物質である。好ま
しくは、薬物部分はアスピリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフ
ェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、
パルミチル又はカルプロフェンである。より好ましくは、薬物部分はイブプロフ
ェンである。
【００２９】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 本発明はオリゴヌクレオチドの薬物動態的性質の改良方法を提供する。本発明
はさらに、改良された薬物動態的性質を有するリガンドコンジュゲート化オリゴ
マー化合物と、それらの製造方法を提供する。このようなオリゴマー化合物は、
１種類以上の血清タンパク質、血管タンパク質又は細胞タンパク質に可逆的に結
合する共有結合リガンドを有して製造される。この可逆的な結合は、このように
コンジュゲートしたオリゴマー化合物の尿排泄を減少させ、血清半減期を高め、
分配を非常に高めると期待される。血漿タンパク質への特定薬物の結合が薬物の
ディスポジションと効力を強化することが今までに判明している（Ｈｅｒｖｅ等
，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，１９９４，２６：４４）。
【００３０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療効果は、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが特異的な細胞核酸と相互作用して、その機能を効果的に無効にするときに
、認識される。好ましいターゲットは、疾患状態の原因であるタンパク質をコー
ドするｍＲＮＡである。投与後にターゲット核酸に到達するために、アンチセン
ス剤は、例えば血清中での迅速な分解、血清中での短い半減期及び尿中への排泄
を付随する腎臓による迅速な濾過のような、固有の要因を克服することができる
べきである。 これらの固有の要因を克服するオリゴヌクレオチドは、漸増した血清半減期、分
配、細胞取り込み、そのため改良された効力を有する。これらの強化された薬物
動態パラメーターは、血漿タンパク質に結合する選択された薬物分子に関して判
明している（ＯｌｓｏｎとＣｈｒｉｓｔ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ
Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３１：３２７）。今ま
でに特に研究されている２種類のタンパク質はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と
α−１−酸性糖タンパク質である。ＨＳＡは多様な内因性及び外因性リガンドと
、典型的に１０4〜１０6Ｍ-1の範囲内の会合定数で結合する。α−１−酸性糖タ
ンパク質とリガンドの会合定数は、ＨＳＡの会合定数と同様である。
【００３１】 少なくとも治療目的のためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、分配と
細胞取り込みとを可能にするような血清中での安定度を有するべきである。血清
中に治療レベルのアンチセンス剤を長時間維持することは、分配と細胞取り込み
とに顕著な効果を有し、特異的な細胞受容体をターゲットとするコンジュゲート
基とは異なって、血清安定度の増強は全ての細胞に影響を及ぼす。コンジュゲー
トによる膜透過性及びオリゴヌクレオチドの細胞デリバリーの増強を含めた、オ
リゴヌクレオチドの細胞取り込みの増強には非常に多くの努力が集中している。
【００３２】 多くの薬物が血漿タンパク質に可逆的に結合する。包括的であることは意味し
ない、代表的なリストはアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプ
ロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−
プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨ
ード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチア
ジド、ジアゼピン（例えば、フルジアゼパム及びジアゼパム）、インドメタシン
、バルビツレート（例えば、キナルバルビトン）、セファロスポリン、サルファ
剤、抗糖尿病薬（例えば、トルブタミド）、抗菌剤（例えば、キノロン類；ナリ
ジクス酸及びシノキサシン）又は幾つかの抗生物質を包含する。血清アルブミン
は、薬物結合のための全ての血漿タンパク質の中で最も重要なタンパク質である
が、他のタンパク質（例えば、マクログロブリンＧ2、免疫グロブリン、リポタ
ンパク質、α−１−酸性糖タンパク質、トロンビン）への結合も重要である。
【００３３】 血清タンパク質、血管タンパク質又は細胞タンパク質に結合するリガンドは、
任意の連結部分を介して、本発明のオリゴヌクレオチド上の１つ以上の部位に付
着することができる。これらの部位は、非限定的に、２’−位置、３’−位置、
５’−位置、ヌクレオチド間結合、及び任意のヌクレオチド残基の核酸塩基原子
の１つ以上を包含する。このような構造へのリガンドの付着は、本発明の幾つか
の好ましい実施態様によると、連結基を用いて、又はこのような連結基を用いず
に行なわれうる。
【００３４】 本発明の幾つかの好ましい実施態様では、１つ以上のタンパク質結合リガンド
が連結基を介してオリゴヌクレオチドに付着して、リガンドコンジュゲート化オ
リゴヌクレオチドを形成する。本発明の好ましい連結基は、非限定的に、６−ア
ミノアルコキシリンカー、６−アミノアルキルアミノリンカー、システアミン、
ヘテロ二官能性リンカー、ホモ二官能性リンカー及びユニバーサルリンカー（３
−ジメトキシトリチルオキシ−２−アミノプロパノールに由来）を包含する。本
発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドの合成のために特に好まし
い連結基は、６−アミノヘキシルオキシ基である。多様なヘテロ二官能性及びホ
モ二官能性連結部分がＰｉｅｒｃｅ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入
手可能である。このようなヘテロ二官能性及びホモ二官能性連結部分は、６−ア
ミノアルコキシ及び６−アミノアルキルアミノ部分と共に、リガンドをヌクレオ
シドに連結させるために有用な長いリンカーを形成するために特に有用である。
商業的に入手可能である、他の有用な連結基は５’−アミノ−モディファイヤー
Ｃ６と３’−アミノ−モディファイヤー試薬であり、両方ともＧｌｅｎ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から入手可能
である。５’−アミノ−モディファイヤーＣ６はＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からもＡｍｉｎ
ｏｌｉｎｋ−２として入手可能であり、３’−アミノ−モディファイヤーはＣｌ
ｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）からも入手可能である。さらに、ヌクレオシドに予め付着した連結基を有す
るヌクレオチド類似体は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎから商品名“Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ−ｄＴ”で商業的に入手可能であ
る。このヌクレオシド連結基試薬、ピリミジン環の５位置に［Ｎ（７−トリフル
オロアセチルアミノ−ヘプチル）３−アクリルアミド］置換基を有するウリジン
誘導体はＪａｂｌｏｎｓｋｉ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
，１９８６，１４：６１１５）の方法によって合成される。本発明はヌクレオシ
ド類似体として、Ｎ６プリンアミノ基上にリンカーを含むように官能化されたア
デニンヌクレオシド、環外Ｎ２プリンアミノ基にリンカーを含むように官能化さ
れたグアニンヌクレオシド、及びＮ４ピリミジンアミノ基又は５ピリミジン位置
のいずれかにリンカーを含むように官能化されたシトシンヌクレオシドをも包含
する。このようなヌクレオシド類似体は、オリゴマー化の前又は後のいずれかに
、リンカーに結合したリガンドによってオリゴヌクレオチド中に組み入れられる
。
【００３５】 本発明の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーション
のためにリガンド分子が１種類以上のタンパク質に対するそれらのアフィニティ
に基づいて選択される。これらのタンパク質は血清、血管又は細胞タンパク質で
ありうる。血清タンパク質は、循環血液中の血漿とははっきり識別される、凝固
後にフィブリンクロット及び血液細胞を除去した後に得られる、血液の流体部分
中に存在するタンパク質である。血管タンパク質は、血管に関する又は血管を含
有する血管系の部分中に存在するタンパク質である。細胞タンパク質は、細胞外
に伸びて、エンドサイトーシスのプロセスを助成するタンパク質の少なくとも一
部を有する膜タンパク質である。
【００３６】 タンパク質に対してアフィニティを有する多くのリガンドは文献に充分に記録
されていて、本発明に利用可能である。好ましいリガンド群は、薬物部分を包含
する小分子である。本発明によると、薬物部分は、非限定的に、ワルファリン；
置換クマリン、イソクマリン誘導体、７−アニリノクマリン−４−酢酸を包含す
るクマリン；イブプロフェン、イブプロフェンのエナンチオマー（γ−イブプロ
フェンとｓ，−イブプロフェン）、イブプロフェン類似体、ケトプロフェン、カ
ルプロフェン、エトドラク、スプロフェン、インドプロフェン、フェンブフェン
を包含するプロフェン類；アリールプロピオン酸、アリールアルカン酸、２−ア
リール−２−フルオロプロピオン酸、グリベンクラミド、アセトヘキサミド、ア
リールアルカン酸、トルブタミド、グリクラジド、メトホルミン、クルクミン、
ジギトキシン、ジゴキシン、ジアゼパム、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド
、ジアゼピン、ベンゾジアゼピン、ナプロキセン、フェニルブタゾン、オキシフ
ェンブタゾン、ダンシルアミド、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード
安息香酸、パルミチン酸、アスピリン、サリチレート、置換サリチレート、ペニ
シリン、フルルビプロフェン、ピルプロフィン、オキサプロジン、フルフェナム
酸、デオキシコール酸、グリシルリジン(glycyrrhizin)、アザチオプリン、ブチ
ブフェン、イブフェナク、５−フルオロ−１−チプタファン、５−フルオロ−サ
リチル酸、アシドアザプロパナゾン(acidazapropanazone)、メフェナム酸、イン
ドメタシン、フルフェナム酸、ビリルビン、イブプロフェン、リシン複合体、ジ
フェニル、ヒダントイン、バルプロ酸、トルメチン、バルビツレート類（例えば
、キナルバルビトン）、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬（例えば、
トルブタミド）、抗菌剤（例えば、キノロン、ナリジクス酸及びシノキサシン）
及び幾つかの抗生物質を包含する。
【００３７】 本発明の１実施態様では、薬物部分はカルボン酸基を有する。本発明の他の実
施態様では、薬物部分はプロピオン酸誘導体である。 他の好ましい実施態様では、薬物部分は式：
【００３８】
【化４】
【００３９】 ［式中、Ｒ1とＲ2の一方はＣ1−Ｃ12アルキルであり、Ｒ1とＲ2の他方はアリー
ルである；又はＲ1とＲ2の両方がＣ1−Ｃ12アルキルである；又はＲ1とＲ2の両
方がアリールである］で示されるアリールプロピオン酸である。
【００４０】 好ましい実施態様では、アリール基は置換された又は非置換のベンジル、フェ
ニル、キシリル、ナフチル、トルイル、ピレニル、アントラシル、フェナントリ
ル、アズリル、フェネチル、シンナミル、ベンズヒドリル及びメシチルであり、
前記置換基はヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アルコール、ベンジル、フ
ェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン若しくはアルキル、置換
されたアルキル、アリール、アルケニル若しくはアルキニル基である。
【００４１】 本発明の好ましい１実施態様では、リガンドコンジュゲート化オリゴマー化合
物によってターゲットにされるタンパク質は血清タンパク質である。コンジュゲ
ート化オリゴマー化合物によってターゲットにされる血清タンパク質が免疫グロ
ブリン（抗体）であることが好ましい。好ましい免疫グロブリンは免疫グロブリ
ンＧと免疫グロブリンＭである。免疫グロブリンは脊椎動物の血液血清及び組織
中に出現することが知られている。
【００４２】 本発明の他の実施態様では、コンジュゲート化オリゴマー化合物によってター
ゲットにされる血清タンパク質はリポタンパク質である。リポタンパク質は一般
に２０，０００を超える分子量を有し、脂質を保持し、特異的細胞表面受容体に
よって認識される血液タンパク質である。血清中のリポタンパク質との会合はま
ず第一に例えば半減期及び分配のような薬物動態パラメーターを増強する。第二
に考えられることは、リポタンパク質が受容体仲介エンドサイトーシスによって
細胞取り込みを促進することができることである。
【００４３】 さらに他の実施態様では、リガンドコンジュゲート化オリゴマー化合物によっ
てターゲットにされる血清タンパク質はα−２−マクログロブリンである。さら
に他の実施態様では、リガンドコンジュゲート化オリゴマー化合物によってター
ゲットにされる血清タンパク質はα−１−糖タンパク質である。
【００４４】 本明細書中で用いられる“保護される”という用語は、示された部分が、そこ
に付加された保護基を有するということを意味する。本発明の若干の好ましい態
様において、化合物は、一つまたはそれ以上の保護基を含有する。本発明の方法
では、広範囲の保護基を用いることができる。概して、保護基は、特定の反応条
件に不活性な化学官能基を与え、そして分子の残り部分をほとんど損傷すること
なく、分子中のこのような官能基に付加することができるし且つそこから除去す
ることができる。
【００４５】 代表的なヒドロキシル保護基は、例えば、Beaucage et al（Tetrahedron, 199
2,48:2223-2311）によって開示されている。更に別のヒドロキシル保護基、更に
は、他の代表的な保護基は、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic
Synthesis, Chapter 2,2d ed., John Wiley & Sons, New York, 1991 および Ol
igonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F.Ed., IRL P
ress, N.Y., 1991 に開示されており、これらはそれぞれ、本明細書中にそのま
ま援用される。
【００４６】 ヒドロキシル保護基の例には、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメ
チル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ
）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニト
ロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ
’−ジニトロベンゾヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリ
メチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフ
ェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルマート、アセテート、クロ
ロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバロエート
、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、９−フルオレニルメチルカーボネ
ート、メシラートおよびトシラートが含まれるが、これらに制限されるわけでは
ない。
【００４７】 酸処理に安定なアミノ保護基は、塩基処理を用いて選択的に除去され、そして
反応性アミノ基を置換に選択的に利用可能にするのに用いられる。このような基
の例は、Ｆｍｏｃ（E.Atherton and R.C.Sheppard in The Peptides, S.Udenfri
end, J.Meienhofer, Eds., Academic Press, Orlando, 1987,volume 9, p.1）、
およびＮｓｃ基によって例示されるいろいろな置換スルホニルエチルカルバメー
ト（Samukov et al., Tetrahedron Lett, 1994,35:7821; Verhart and Tesser,
Rec.Trav.Chim.Pays-Bas, 1987,107:621）である。
【００４８】 追加のアミノ保護基には、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏ
ｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）
、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）
、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびベンジルオキシ
カルボニル（Ｃｂｚ）のようなカルバメート保護基；ホルミル、アセチル、トリ
ハロアセチル、ベンゾイルおよびニトロフェニルアセチルのようなアミド保護基
；２−ニトロベンゼンスルホニルのようなスルホンアミド保護基；およびフタル
イミドおよびジチアスクシノイルのようなイミンおよび環状イミドの保護基が含
まれるが、これらに制限されるわけではない。これらアミノ保護基の同等物も、
本発明の化合物および方法によって包含される。
【００４９】 本発明の好ましい態様において、少なくとも一つのヌクレオシドが、ヌクレオ
シドの２’位に連結されたリガンド分子を有する２’−官能基付加ヌクレオシド
である多数の連結ヌクレオシド；ヌクレオシドの複素環式塩基に連結されたリガ
ンド分子を有する複素環式塩基に官能基付加されたヌクレオシド、ヌクレオシド
の５’位に連結されたリガンド分子を有する５’末端ヌクレオシド、ヌクレオシ
ドの３’位に連結されたリガンド分子を有する３’末端ヌクレオシド、または隣
接したヌクレオシドに鎖間ヌクレオシドを連結する鎖間結合に連結されたリガン
ド分子を有する鎖間ヌクレオシドを含めたオリゴヌクレオチドを提供する。
【００５０】 本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、結合性分子のオリ
ゴヌクレオチドへの結合から誘導されるような、ペンダント反応性官能基を有す
るオリゴヌクレオチドの使用によって合成することができる。この反応性オリゴ
ヌクレオチドは、商業的に入手可能なリガンド、いろいろな保護基を有して合成
されるリガンド、または結合した結合性部分を有するリガンドと直接的に反応し
うる。本発明の方法は、若干の好ましい態様において、リガンドと適当にコンジ
ュゲートしていて且つ固体支持体材料に更に付着しうるヌクレオシドモノマーの
使用によって、リガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドの合成を容易にす
る。固体支持体材料に付着していてよいこのようなリガンド−ヌクレオシドコン
ジュゲートは、本発明の方法の若干の好ましい態様にしたがって、ヌクレオシド
またはオリゴヌクレオチドの２’位、３’位または５’位に位置する結合性部分
と、ある選択された血清結合性リガンドの反応によって製造される。
【００５１】 本発明は、血清中のオリゴヌクレオチドの濃度を増加させる方法を提供する。
このような方法によれば、血清タンパク質に結合することが知られている薬物部
分を選択し、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせることによって、コンジ
ュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する。次に、このコンジュゲート化オリゴ
ヌクレオチドを血清に加える。
【００５２】 本発明は、更に、オリゴヌクレオチドに関する血清の能力を増加させる方法を
提供する。このような方法によれば、血清タンパク質に結合することが知られて
いる薬物部分を選択し、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせることによっ
て、コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する。次に、このコンジュゲー
ト化オリゴヌクレオチドを血清に加える。
【００５３】 本発明は、更に、血管系の一部分へのオリゴヌクレオチドの結合を増加させる
方法を提供する。このような方法により、血管タンパク質に結合することが知ら
れている薬物部分を選択する。選択される血管タンパク質は、一部分は、循環性
血清中に、そして一部分は、血管系の非循環性部分に存在するタンパク質である
。この薬物部分をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コンジュゲート
化オリゴヌクレオチドを形成した後、これを血管系に加える。
【００５４】 本発明は、更に、細胞におけるオリゴヌクレオチドの細胞内取込みを促進する
方法を提供する。このような方法により、細胞性タンパク質を選択する。この細
胞性タンパク質は、細胞膜上に存在し且つ一部分は細胞外に広がるタンパク質で
あるので、この細胞性タンパク質の一部分は細胞膜の外側に広がる。次に、細胞
性タンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択し、オリゴヌクレオ
チドにコンジュゲートさせて、コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する
。次に、このコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの細
胞内取込みが促進されるべき細胞と接触させる。
【００５５】 本発明は、更に、オリゴヌクレオチドの細胞内取込みを増加させる方法であっ
て、本発明のオリゴヌクレオチドであってリガンドにコンジュゲートされている
オリゴヌクレオチドと生物を接触させることを含む方法を提供する。
【００５６】 本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴマー化合物は、１種類またはそれ以
上の不活性担体化合物を更に含む組成物中に含まれうる。 アンチセンス治療法は、単細胞の原核生物または真核生物から多細胞真核生物
までのいろいろな生物の多血症において実施することができる。ＤＮＡ−ＲＮＡ
転写またはＲＮＡ−タンパク質翻訳を遺伝、代謝または細胞の制御の基本的部分
として利用する生物はいずれも、アンチセンス治療法および／または予防法に感
受性である。細菌、酵母、原生動物、藻類、全植物、および温血動物を含めた全
高等動物の型のような外観上異なった生物は、アンチセンス治療法によって処置
することができる。更に、多細胞真核生物の細胞それぞれも、ＤＮＡ−ＲＮＡ転
写およびＲＮＡ−タンパク質翻訳の両方をその細胞活性の不可欠な部分として含
むので、アンチセンス治療法および／または診断法は、このような細胞集団に実
施することもできる。更に、真核性細胞の細胞小器官の多く、例えば、ミトコン
ドリアおよび葉緑体も、転写および翻訳の機構を含む。単細胞、細胞集団または
細胞小器官はそれ自体、アンチセンス治療法または診断法を用いて処置されるこ
とができる生物の定義の範囲内に含まれうる。本明細書中で用いられる治療法と
は、疾患状態の根治、生物、例えば、細菌、原生動物または他の感染の致死、ま
たは迷走性のまたは有害な細胞成長または発現の制御も含むことを意味する。
【００５７】 本発明の好ましい態様では、血清タンパク質への親和性を有するリガンドを、
アンチセンス診断薬または治療薬中の少なくとも一つのヌクレオシドに結合させ
て、そのアンチセンス治療薬または診断薬の薬物動態学的性状を増強する。この
ような改善される薬物動態学的性状には、血清タンパク質への増加したアンチセ
ンス化合物結合、アンチセンス化合物の増加した血漿濃度、増加した組織分布、
血清タンパク質へのアンチセンス化合物の増加した結合能力、および増加した半
減期が含まれるが、これらに制限されるわけではない。このようなアンチセンス
診断薬または治療薬は、好ましくは、目的のＲＮＡまたはＤＮＡの領域に“アン
チセンス”である配列の複数の連結ヌクレオシドから形成される核酸またはオリ
ゴヌクレオチドである。それらヌクレオシドは、リン含有または非リン含有共有
ヌクレオシド間結合によって連結される。オリゴヌクレオチドの一つまたはそれ
以上のヌクレオシドは、結合基を用いてまたは用いることなくヌクレオシドに結
合したリガンド分子を含むようにコンジュゲートされる。識別の目的のために、
このようなコンジュゲート化ヌクレオシドは、リガンド含有ヌクレオシドまたは
リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートとして特性決定することができる。少な
くとも一つのコンジュゲート化ヌクレオシドを配列内に有する連結ヌクレオシド
は、コンジュゲートされていない同様の配列の類似した連結ヌクレオシドまたは
オリゴヌクレオチドと比較した場合、増大したアンチセンス活性を示すであろう
。
【００５８】 本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドには、リガンドが、リ
ンカー基の仲介を用いることなく、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに直接的に
結合しているオリゴヌクレオチドおよび連結ヌクレオシドのコンジュゲートも含
まれる。リガンドのこの結合は、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレ
オシドの２’−、３’−、５’−、核酸塩基またはヌクレオシド間結合の位置の
一つかまたはそれ以上で行われうる。リガンドは、好ましくは、結合基によって
、リガンドのカルボキシル基、アミノ基またはオキソ基のところで結合していて
よい。典型的な結合基は、エステル基、アミド基またはカルバメート基でありう
る。
【００５９】 本発明の文脈中、“オリゴマー”および“オリゴマー化合物”という用語は、
特定の配列中で互いに結合した複数の天然に存在するまたは天然に存在しないヌ
クレオシドを意味するのみならず、オリゴヌクレオチド類似体、ペプチド核酸、
およびコンホメーションの固定に糖が関与している固定核酸（locked nucleic a
cids）のような当該技術分野において現在知られているオリゴマー化合物の全種
類を更に含める。オリゴマー化合物を領域に分けるヌクレオシド間結合が２種類
以上存在する場合、オリゴマー化合物を、例えば、キメラのオリゴマー化合物な
どに向ける具体的なターゲットに望まれる作用を改善する多数の異なったモチー
フが現在知られている。オリゴマー化合物は、典型的には、天然に存在するまた
は合成の野生型オリゴヌクレオチドと構造的に区別しうるが、なお機能的に交換
可能である。したがって、オリゴマー化合物には、例えば、標的（ターゲット）
にハイブリッド形成することによって、所望のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の構造およ
び／または機能を模擬するように有効に機能するこのような構造全てが含まれる
。“オリゴヌクレオチド”という用語は、当該技術分野において充分に定義され
た意味を有するが、“オリゴマー化合物”または“オリゴマー”という用語は、
当該技術分野において知られている全ての修飾様式を有するオリゴマーを含めて
、より広範囲の意味である。ギャップ付きまたはキメラの化合物は、例えば、１
９９７年４月２２日発行の米国特許第５，６２３，０６５号に開示され、その内
容は本明細書中に援用される。
【００６０】 本発明の文脈中、“オリゴマー化合物”という用語には、リンおよび非リン結
合および混合主鎖オリゴマーを有する連結ヌクレオシドが含まれる。本発明にし
たがうリン含有および非リン含有結合の代表的なリストには、次が含まれる。
【００６１】 リン含有結合 ホスホロジチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｓ）−Ｏ−）； ホスホロチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｏ−）； ホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｊ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（ＯＪ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｓ−）； チオノアルキルホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｊ）−Ｏ−）； チオノアルキルホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＪ）−Ｓ−）； ボラノホスフェート（−Ｒ5−Ｐ（Ｏ）（Ｏ）−Ｊ−）； 非リン含有結合 チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）； チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｓ−）； シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｊ）2−Ｏ−）； カルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−および−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）； スルファメート（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｎ−および−Ｎ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−
Ｎ−）； モルホリノスルファミド（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｎ（モルホリノ）−）； スルホンアミド（−Ｏ−ＳＯ2−ＮＨ−）； スルフィド（−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−）； スルホネート（−Ｏ−ＳＯ2−ＣＨ2−）； Ｎ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−）； チオホルムアセタール（−Ｓ−ＣＨ2−Ｏ−）； ホルムアセタール（−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−）； チオケタール（−Ｓ−Ｃ（Ｊ）2−Ｏ−）；および ケタール（−Ｏ−Ｃ（Ｊ）2−Ｏ−）； アミン（−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−）； ヒドロキシルアミン（−ＣＨ2−Ｎ（Ｊ）−Ｏ−）； ヒドロキシルイミン（−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−）；および ヒドラジニル（−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）−Ｎ（Ｈ）−）。 式中、“Ｊ”は、一般的には水素またはアルキル基、または一つの種類から別の
種類の結合へと変化するより複雑な基である置換基を示す。
【００６２】 天然に存在する結合の−Ｏ−Ｐ−Ｏ−原子の修飾または置換を含む上記の結合
基に加えて、本発明の範囲内に含まれるのは、５’−メチレン基の修飾、更には
、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−原子の一つまたはそれ以上を含む結合基である。この種類の結
合は、先行技術で充分に証明されており、次を含むが、これに制限されるわけで
はない。
【００６３】 アミド（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ））および−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ＝Ｃ
Ｈ−；および アルキルリン（−Ｃ（Ｊ）2−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＪ）−Ｃ（Ｊ）2−Ｃ（Ｊ）2−
）。 式中、Ｊは上記の通りである。
【００６４】 上記の代わりのヌクレオシド間結合の合成に関する合成スキームは、ＷＯ９１
／０８２１３号；ＷＯ９０／１５０６５号；ＷＯ９１／１５５００号；ＷＯ９２
／２０８２２号；ＷＯ９２／２０８２３号；ＷＯ９１／１５５００号；ＷＯ８９
／１２０６０号；ＥＰ２１６８６０号；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号；ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９０／０３１３８号；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６８５５号；ＰＣＴ／ＵＳ
９２／０３３８５号；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３６８０号；米国特許出願第０７／
９９０，８４８号；同０７，８９２，９０２号；同０７／８０６，７１０号；同
０７／７６３，１３０号；同０７／６９０，７８６号；米国特許第５，４６６，
６７７号；同５，０３４，５０６号；同５，１２４，０４７号；同５，２７８，
３０２号；同５，３２１，１３１号；同５，５１９，１２６号；同４，４６９，
８６３号；同５，４５５，２３３号；同５，２１４，１３４号；同５，４７０，
９６７号；同５，４３４，２５７号；Stirchak,E.P.,et al., Nucleic Acid Res
., 1989,17,6129-6141；Hewitt,J.M.,et al., 1992,11,1661-1666；Sood,A.,et
al., J.Am.Chem.Soc., 1990,112,9000-9001；Vaseur,J.J. et al., J.Amer.Chem
.Soc., 1992,114,4006-4007；Musichi,B.,et al., J.Org.Chem., 1990,55,4231-
4233；Reynolds,R.C.,et al., J.Org.Chem., 1992,57,2983-2985；Mertes,M.P.,
et al., J.Med.Chem., 1969,12,154-157；Mungall,W.S.,et al., J.Org.Chem.,
1977,42,703-706；Stirchak,E.P.,et al., J.Org.Chem., 1987,52,4202-4206；
Coull,J.M.,et al., Tet.Lett., 1987,28,745；および Wang,H.,et al., Tet.Le
tt., 1991,32,7385-7388 に開示されている。
【００６５】 他の修飾は、ヌクレオチドの糖、塩基またはリン酸基に行われうる。代表的な
修飾は、１９９１年７月２５日公開の国際公開第ＷＯ９１／１０６７１号、１９
９２年２月２０日公開のＷＯ９２／０２２５８号、１９９２年３月５日公開のＷ
Ｏ９２／０３５６８号、およびいずれも本出願の譲受人に付与された米国特許第
５，１３８，０４５号、同５，２１８，１０５号、同５，２２３，６１８号、同
５，３５９，０４４号、同５，３７８，８２５号、同５，３８６，０２３号、同
５，４５７，１９１号、同５，４５９，２５５号、同５，４８９，６７７号、同
５，５０６，３５１号、同５，５４１，３０７号、同５，５４３，５０７号、同
５，５７１，９０２号、同５，５７８，７１８号、同５，５８７，３６１号、同
５，５８７，４６９号に開示されている。上に挙げられた公報のそれぞれの開示
は、本明細書中に援用される。
【００６６】 本発明にしたがうオリゴマー化合物を製造するのに用いられる別の修飾には、
２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレンＬＮＡヌクレオシドモノマーを含有する新規なコ
ンホメーションによって制限されるオリゴヌクレオチド類似体であるＬＮＡ（固
定核酸）が含まれる。ＬＮＡおよびＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ
との極めて高い二重らせん熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０Ｃ）、３’−エキソヌ
クレオリティック（exonucleolytic）分解に対する安定性、および充分な溶解性
を示す（例えば、次を参照されたい）。
【００６７】 ＬＮＡ（Locked nucleic acids, synthesis and high-affinity nucleic acid
recognition, Singh et al., Dep.Chem., Univ.Copenhagen, Copenhagen, Den.
Chem.Commun., (Cambridge), (1998),(4),455-456。ＬＮＡ（固定核酸）と称さ
れる新規クラスの核酸類似体が考えられる。ワトソン・クリック塩基対法則にし
たがって、ＬＮＡは、顕著に増加した熱安定性および概して改善された選択性を
有する相補的ＤＮＡおよびＲＮＡと二重らせんを形成する。
【００６８】 アデニン、シトシン、グアニン、５−メチルシトシン、チミンおよびウラシル
のビシクロヌクレオシドモノマーの合成、オリゴマー化および核酸認識特性が記
載されている（Koshkin et al., Department of Chemistry, University of Cop
enhagen, Copenhagen, Den.Tetrahedron (1998),54(14),3607-3630 を参照され
たい）。ＬＮＡモノマーを合成し、そしてそれらの核酸認識可能性を、６種類の
異なった核酸塩基、すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチルシト
シン、チミンおよびウラシルについて評価した。誤対合した配列の研究は、ＬＮ
Ａが、概して、対応する非修飾対照鎖と比較して改善された選択性を伴って、ワ
トソン・クリック塩基対法則に従うことを示している。
【００６９】 固定核酸を含有する強力な且つ無毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記
載されている（Wahlestedt et al., Center for Genomics Research, Karolinsk
a Institutet, Stockholm,Swed., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (2000),97(10),5
633-5638）。その著者らは、アンチセンス薬にいくつか望ましい性状を与える固
定核酸（ＬＮＡ）を示している。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、血清および細胞
抽出物中で容易に分解されなかった。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、検定システ
ムにおいて、生きているラット脳のＧタンパク質共役型受容体および大腸菌（Es
cherichia coli）リポーター遺伝子と同様に異なる強力なアンチセンス活性を示
した。
【００７０】 固定核酸（ＬＮＡ）のコンホメーションは、Petersen et al., Department of
Chemistry, University of Southern Denmark, Odense University, Odense, D
en, J.Mol.Recognit., (2000),13(1),44-53 によって示されている。その著者ら
は、２Ｄ ＮＭＲ分光法を用いて、ｓｓＬＮＡおよび二重らせん双方のＬＮＡヌ
クレオチドの固定されたコンホメーションが、Ｎ型コンホメーションの高級集団
を導入するような方法でリン酸主鎖（バックボーン）を組織化するということを
示している。これらコンホメーション変化は、核酸塩基の改善されたスタッキン
グと関連している。
【００７１】 ＬＮＡ性状は、Wengel et al., Center For Synthetic Bioorganic Chemistry
, Department of Chemistry, University of Copenhagen, Copenhagen, Den.Nuc
leosides Nucleotides (1999),18(6&7),1365-1370 によって記載されている。
【００７２】 ＬＮＡは、高熱親和性を有する相補的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡと二重らせ
んを形成する。ＣＤスペクトルは、充分に修飾されたＬＮＡを含む二重らせん（
特に、ＬＮＡ：ＲＮＡ）が、Ａ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重らせんに構造的に似ている
ことを示している。ＬＮＡ：ＤＮＡ二重らせんのＮＭＲ検査は、ＬＮＡモノマー
の３’末端コンホメーションを確証する。二本鎖ＤＮＡの認識は、ＬＮＡによる
鎖侵入を示唆して示される。ヒト胸部癌生細胞中へのリポフェクチンに媒介され
るＬＮＡの有効な供給（デリバリー）が行われている。
【００７３】 ある特許出願では、核酸ポリメラーゼの基質としての固定ヌクレオシド類似体
含有オリゴデオキシリボヌクレオチド二重らせんの製造が記載されている。Weng
el, Jesper; Nielsen, Poul. (Exiqon A/S. Den.)。ＰＣＴ国際出願（1999），
英語版特許269頁。出願：ＷＯ９８−ＤＫ３９３ １９９８０９１４。優先権：
ＤＫ９７−１０５４ １９９７０９１２；ＤＫ９７−１４９２ １９９７１２１
９；ＤＫ９８−６１ １９９８０１１６；ＤＫ９８−２８６ １９９８０３０３
；ＤＫ９８−５８５ １９９８０４２９；ＵＳ９８−８８３０９ １９９８０６
０５。ＣＡＮ１３０：２５２６０９ＡＮ１９９９：２１６９２６ 二環式および三環式のヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、更には、この
ような要素Ｉ（Ｂは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アシルオキシ
、核酸塩基、ＤＮＡインターカレーターより選択され；Ｐは、次のモノマーへの
ヌクレオシド間結合、または５’末端基のラジカル位置を示し、このようなヌク
レオシド間結合または５’末端基は、置換基Ｒ５を含んでいてよく；Ｘは、Ｏ、
Ｓ、置換Ｎ、置換Ｃより選択され；Ｒ１、Ｒ１*、Ｒ２、Ｒ２*、Ｒ３、Ｒ３*、
Ｒ４*、Ｒ５、Ｒ５*は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ
、アルコキシ、アルケニルオキシ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキ
ルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキ
シ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、カルバミド、アルカノイルオキシ、
スルホノ、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、アルキ
ルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーターより独立して選択される一つまた
は複数のビラジカルである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドを製造した
。したがって、（１Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｒ）−５−（２−シアノエトキシ（ジイ
ソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）−６−（４，４’−ジメトキシトリチルオ
キシメチル）−８−（チミン−１−イル）−２，７−ジオキサビシクロ［３．３
．０］ノナンを製造し、オリゴデオキシリボヌクレオチド中に包含させた。ヌク
レオチド類似体であるＬＮＡ（Locked Nucleoside Analogs）は、相補的ＲＮＡ
およびＤＮＡオリゴマーに対する親和性および特異性に関するオリゴヌクレオチ
ドへの有効な改善を提供することができる。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの新
規種類も、ＬＮＡそれ自体も、広範囲の診断用途、更には、治療用途において有
用である。これらの中から、アンチセンス適用、ＰＣＲ適用、鎖置換オリゴマー
、核酸ポリメラーゼの基質として、ヌクレオチド基剤薬物として等を挙げること
ができる。
【００７４】 ＬＮＡは、極めて安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二重らせんを形成することが示されて
いる（Koshkin et al., Center for Synthetic Bioorganic Chemistry Departme
nt of Chemistry, University of Copenhagen, Copenhagen, Den.J.Am.Chem.Soc
. (1998),120(50),13252-13253）。
【００７５】 ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは、最も熱安定な核酸型二重らせんシ
ステムであることが示され、ＬＮＡのＲＮＡ模擬特性は、二重らせんレベルで確
かめられた。誘導される３個のＬＮＡモノマー（ＴまたはＡ）の導入は、ＤＮＡ
補体に対して融解温度を有意に増加させる（Ｔｍ＝＋１５／＋１１）。ＬＮＡに
媒介されるハイブリダイゼーションの普遍性は、極めて安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二
重らせんの形成によって強調されている。ＬＮＡのＲＮＡ模擬は、それらモノマ
ーのＮ型コンホメーション制限に関しておよびＬＮＡ：ＲＮＡ二重らせんの二次
構造に関して反映された。
【００７６】 Handle 法を用いた、新規なコンホメーションによって制限される高親和性オ
リゴヌクレオチドである２’−アミノ−ＬＮＡの合成は示されている（Singh et
al., Center for Synthetic Bioorganic Chemistry Department of Chemistry,
University of Copenhagen, Copenhagen, Den.J.Org.Chem. (1998),63(26),100
35-10039 を参照されたい）。
【００７７】 モノマーヌクレオシドＩ（Ｒ＝Ｍｅ，ＣＯＣＦ3）を含有する２’−アミノ−
および２’−メチルアミノ−固定核酸（２’−アミノ−ＬＮＡ）を製造したが、
相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ鎖を含むそれら二重らせんの熱安定性は、以前に報告
されている。
【００７８】 同様に、ＬＮＡの最初の類似体であるホスホロチオエート−ＬＮＡおよび２’
−チオ−ＬＮＡが製造されている（Kumar et al., Center for Synthetic Bioor
ganic Chemistry, Department of Chemistry, University of Copenhagen, Cope
nhagen, Den.Bioorg.Med.Chem.Lett. (1998),8(16),2219-2222 を参照されたい
）。
【００７９】 化学修飾されたＬＮＡ類似体の合成も報告されている。３個のＬＮＡチミンモ
ノマー（Ｉ，Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝Ｓ，Ｒ＝Ｍｅ）を含有する９マーのホスホロチオエー
ト−ＬＮＡおよび１個、３個または５個の２’−チオ−ＬＮＡモノマー（Ｉ，Ｘ
＝Ｓ，Ｙ＝Ｏ，Ｒ＝Ｈ）を含有する９マーＬＮＡは、親ＬＮＡの場合に匹敵する
熱親和性を有する相補的ＤＮＡおよびＲＮＡを両方とも認識することができた。
【００８０】 新規なビシクロ［２．２．１］リボヌクレオシドである２’−アミノ−および
２’−チオ−ＬＮＡモノマーヌクレオシドの合成は、Singh et al., Center for
Synthetic Bioorganic Chemistry Department of Chemistry Chemical Laborat
ory II, University of Copenhagen, Copenhagen, Den.J.Org.Chem. (1998),63(
18),6078-6079 に記載されている。
【００８１】 本発明は、モジュレーションが望まれるタンパク質をコードしているＤＮＡま
たはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の機能のアンチセンスモジュレーション
において用いるための、そして最終的には、このようなタンパク質の量を調節す
るためのオリゴヌクレオチドを用いる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとその
ｍＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの正常な役割を妨げ、そ
して細胞中でのその機能のモジュレーションを引き起こす。妨げられるｍＲＮＡ
の機能には、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからの実際のタンパ
ク質翻訳、一つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、
ｍＲＮＡの代謝回転または分解、およびおそらくは無関係であるとしても、ＲＮ
Ａが関与するかもしれない触媒活性のような生体機能全てが含まれる。ｍＲＮＡ
機能についてのこのような全妨害作用は、タンパク質の発現のモジュレーション
であり、ここにおいて、“モジュレーション”とは、タンパク質の発現の増加（
刺激）かまたは減少（阻害）を意味する。本発明の文脈中、阻害は、遺伝子発現
のモジュレーションの好ましい形である。
【００８２】 本発明の文脈中、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸またはデオ
キシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語には、天然に存
在する核酸塩基、糖および糖間（主鎖）共有結合から構成されるオリゴヌクレオ
チド、更には、天然に存在しない部分を有する同様に機能する修飾オリゴヌクレ
オチドが含まれる。このような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、
増大した細胞取込み、増大した標的への結合、およびヌクレアーゼの存在下の増
加した安定性のような望ましい性状ゆえに、しばしば、未変性型より好適である
。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約５個〜約５０個のヌクレオシ
ドを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、約８個〜約３０個のヌクレオシド
を含むのがより好適であり、１５個〜２５個のヌクレオシドが特に好適である。
【００８３】 オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドとして一般的に知ら
れている反復単位のポリマーである。未修飾（天然に存在する）ヌクレオチドは
、三つの成分、すなわち、（２）５炭素環式糖、（１）これにその窒素原子の一
つによって連結された含窒素塩基、および（３）糖の炭素５にエステル化された
リン酸を有する。オリゴヌクレオチド鎖中に包含される場合、最初のヌクレオチ
ドのリン酸も、次の隣接したヌクレオチドの糖の炭素３にエステル化される。未
修飾オリゴヌクレオチドの“主鎖”は、（２）および（３）、すなわち、最初の
ヌクレオチドの糖のＣ５（５’）位と次の隣接したヌクレオチドのＣ３（３’）
位との間のホスホジエステル結合によって互いに連結された糖から成る。“ヌク
レオシド”は、リン酸部分の不存在下における（１）核酸塩基および（２）糖の
組合せである（Kornberg, DNA Replication, W.H.Freeman & Co., San Francisc
o, 1980,pages 4-7）。オリゴヌクレオチドの主鎖は、一連の塩基を特定の順序
で配置するが；この塩基列の表示は、５’〜３’の順で好都合に書かれ、ヌクレ
オチド配列として知られている。
【００８４】 オリゴヌクレオチドは、特定の核酸との特異的ハイブリダイゼーションを行う
のに充分な同一性および数のヌクレオシドまたはヌクレオチド配列を含んでいて
よい。遺伝子のセンス鎖の一部分に特異的にハイブリッド形成するこのようなオ
リゴヌクレオチドは、一般的には、“アンチセンス”として記載される。本発明
の文脈中、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレ
オチド間のワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティー
ン型水素結合であってよい水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミン
は、水素結合の形成によって対になる相補的核酸塩基である。本明細書中で用い
られる“相補的”とは、二つのヌクレオチド間の正確な対合の能力を意味する。
例えば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ
分子の同様の位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、そのオリゴ
ヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置で互いに相補的であると考
えられる。そのオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、それぞれの分
子中の充分に多数の対応する位置が、互いに水素結合しうるヌクレオチドによっ
て占められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリ
ッド形成可能”および“相補的”は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ
標的との間に安定且つ特異的な結合が生じるような充分な程度の相補性または正
確な対合を示すのに用いられる用語である。当該技術分野において、オリゴヌク
レオチドは、特異的にハイブリッド形成可能であるその標的ＤＮＡ配列に１００
％相補的である必要はないということは理解される。オリゴヌクレオチドは、標
的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの結合が、標的ＤＮＡまたは
ＲＮＡの正常な機能を妨げて、機能の低下または損失を引き起こす場合、特異的
にハイブリッド形成可能であるので、特異的結合が望まれる条件下において、す
なわち、in vivo 検定または治療的処置の場合の生理学的条件下において、また
は in vitro 検定の場合、その検定が行われる条件下において、非標的配列への
オリゴヌクレオチドの非特異的結合を避ける充分な程度の相補性が存在する。
【００８５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的には、研究用試薬、診断補助薬お
よび治療薬として用いられる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺
伝子発現を鋭敏な特異性で阻害することができ、しばしば、当業者によって、特
定の遺伝子の機能を解明するのに、例えば、生体経路のいろいろなメンバーの機
能を区別するのに用いられる。この特異的阻害作用は、したがって、当業者によ
って研究用途に利用されてきている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ある
種の疾患状態において存在するＤＮＡまたはｍＲＮＡへのそれらの特異的結合ま
たはハイブリダイゼーションに基づいて、およびハイブリダイゼーションに基づ
く検定および若干のポリメラーゼ連鎖反応を利用する増幅検定が与える高度の感
受性のために、診断補助薬としても用いられている。オリゴヌクレオチドの特異
性および感受性は、当業者によって治療的用途にも利用される。例えば、次の米
国特許は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する待期的、治療的およびそ
の他の方法を示している。米国特許第５，１３５，９１７号は、ヒトインターロ
イキン−１受容体発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
米国特許第５，０９８，８９０号は、ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子に相補的なアンチセン
スオリゴヌクレオチドおよび若干の癌状態のためのアンチセンスオリゴヌクレオ
チド療法に関する。米国特許第５，０８７，６１７号は、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドを用いて癌患者を治療する方法を提供する。米国特許第５，１６６，
１９５号は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のオリゴヌクレオチド阻害剤を提
供する。米国特許第５，００４，８１０号は、単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５
ｍＲＮＡにハイブリッド形成し且つ複製を阻害することができるオリゴマーを提
供する。米国特許第５，１９４，４２８号は、インフルエンザウイルスに対して
抗ウイルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許
第４，８０６，４６３号は、ＨＴＬＶ−III複製を阻害するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドおよびそれらを用いる方法を提供する。米国特許第５，２８６，７
１７号は、癌遺伝子の一部分に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを
提供する。米国特許第５，２７６，０１９号および米国特許第５，２６４，４２
３号は、細胞中の異種核酸の複製を妨げるのに用いられるホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチド類似体に関する。米国特許第４，６８９，３２０号は、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的な抗ウイルス薬としてのアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドに関する。米国特許第５，０９８，８９０号は、ヒトｃ−ｍｙｂ遺
伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に相補的なオリゴヌクレオチドを提供
する。米国特許第５，２４２，９０６号は、潜伏性エプスタイン・バールウイル
ス（ＥＢＶ）感染の治療において有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供
する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、本明細書中で提供される。
【００８６】 本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチド中で用いるための考え
られる若干の好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体的な例には、修飾主鎖また
は非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細
書中で定義される、修飾主鎖またはヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオ
チドには、その主鎖中にリン原子を保持するものおよび主鎖中にリン原子を有し
ていないものが含まれる。本明細書の目的に関しておよび当該技術分野において
時々言及されるように、それらの糖間主鎖中にリン原子を有していない修飾オリ
ゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドであると考えられる。
【００８７】 具体的なオリゴヌクレオチド化学修飾は、下に記載される。ある与えられた化
合物中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際上、次の修飾の二つ以
上が、一つのアンチセンス化合物中に、またはその一つの残基中にでも、例えば
、オリゴヌクレオチド中の一つのヌクレオシドの所で包含されていてよい。
【００８８】 好ましい修飾ヌクレオシド間結合または主鎖には、例えば、ホスホロチオエー
ト、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、
アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラ
ルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネー
ト、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート
を含めたホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホス
ホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および普通の３’−５’結合を
有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、およびヌクレオシ
ド単位の隣接した対が、３’−５’対５’−３’または２’−５’対５’−２’
で連結されている逆方向の極性を有するものが含まれる。各種塩、混合塩および
遊離酸の形も含まれる。
【００８９】 上のリン原子含有結合の製造を示す代表的な米国特許には、米国特許第３，６
８７，８０８号；同４，４６９，８６３号；同４，４７６，３０１号；同５，０
２３，２４３号；同５，１７７，１９６号；同５，１８８，８９７号；同５，２
６４，４２３号；同５，２７６，０１９号；同５，２７８，３０２号；同５，２
８６，７１７号；同５，３２１，１３１号；同５，３９９，６７６号；同５，４
０５，９３９号；同５，４５３，４９６号；同５，４５５，２３３号；同５，４
６６，６７７号；同５，４７６，９２５号；同５，５１９，１２６号；同５，５
３６，８２１号；同５，５４１，３０６号；同５，５５０，１１１号；同５，５
６３，２５３号；同５，５７１，７９９号；同５，５８７，３６１号；同５，６
２５，０５０号；および同５，６９７，２４８号が含まれるが、これらに制限さ
れるわけではなく、これらのいくつかは、本出願と共同所有され、それぞれ、本
明細書中に援用される。
【００９０】 リン原子を中に含まない好ましい修飾ヌクレオシド間結合または主鎖は、短鎖
アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたは
シクロアルキル糖間結合、または一つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複
素環式糖間結合によって形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合
を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン主
鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオ
ホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；
アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラ
ジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合さ
れたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ2成分部分を有するその他が含まれる。
【００９１】 上のオリゴヌクレオシドの製造を示す代表的な米国特許には、米国特許第５，
０３４，５０６号；同５，１６６，３１５号；同５，１８５，４４４号；同５，
２１４，１３４号；同５，２１６，１４１号；同５，２３５，０３３号；同５，
２６４，５６２号；同５，２６４，５６４号；同５，４０５，９３８号；同５，
４３４，２５７号；同５，４６６，６７７号；同５，４７０，９６７号；同５，
４８９，６７７号；同５，５４１，３０７号；同５，５６１，２２５号；同５，
５９６，０８６号；同５，６０２，２４０号；同５，６１０，２８９号；同５，
６０２，２４０号；同５，６０８，０４６号；同５，６１０，２８９号；同５，
６１８，７０４号；同５，６２３，０７０号；同５，６６３，３１２号；同５，
６３３，３６０号；同５，６７７，４３７号；および同５，６７７，４３９号が
含まれるが、これらに制限されるわけではなく、これらのいくつかは、本出願と
共同所有され、それぞれ、本明細書中に援用される。
【００９２】 他の好ましいオリゴヌクレオチド模擬体の場合、ヌクレオシド単位の糖および
ヌクレオシド間結合は両方とも、すなわち、主鎖は、新規な基で置き換えられる
。核酸塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために
維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている一
つのこのようなオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド模擬体は、ペプチ
ド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖
主鎖は、アミド含有主鎖、特に、アミノエチルグリシン主鎖で置き換えられる。
核酸塩基は保持され且つ主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接
的に結合している。ＰＮＡ化合物の製造を示す代表的な米国特許には、米国特許
第５，５３９，０８２号；同５，７１４，３３１号；および同５，７１９，２６
２号が含まれるが、これらに制限されるわけではなく、それぞれ、本明細書中に
援用される。ＰＮＡ化合物の更に別の教示は、Nielsen et al., Science, 1991,
254,1497 に見出されうる。
【００９３】 本発明の若干の好ましい態様は、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレ
オチド、およびヘテロ原子主鎖、特に、上に言及された米国特許第５，４８９，
６７７号の−ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2−
［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる］、−ＣＨ2−Ｏ
−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−および
−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2−［未変性ホスホジエステル主鎖は、−Ｏ−
Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−として示される］、および上に言及された米国特許第５，６０
２，２４０号のアミド主鎖を含むオリゴヌクレオシドを用いてよい。更に好適で
あるのは、上に言及された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構
造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００９４】 本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチド中で用いられるオリゴ
ヌクレオチドは、核酸塩基（当該技術分野において、しばしば、簡単に“塩基”
と称される）の修飾または置換を付加的にまたは代わりに含むことができる。本
明細書中で用いられる“未修飾の”または“未変性の”核酸塩基には、プリン塩
基アデニン（ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、
シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチ
ルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒ
ポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよ
び他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアル
キル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−
ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−ア
ゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−
チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−
ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５
−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン
、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−
アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、および３−デア
ザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然の核酸塩基が
含まれる。更に別の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示され
たもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 8
58-859, Kroschwitz,J.I.,ed. John Wiley & Sons, 1990 に開示されたもの、En
glisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991,30,613 に
よって開示されたもの、および Sanghvi,Y.S., Chapter 15, Antisense Researc
h and Applications, pages 289-302, Crooke,S.T. and Lebleu,B.,ed., CRC Pr
ess, 1993 によって開示されたものが含まれる。これら核酸塩基のいくつかは、
本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるのに特に有用である。こ
れらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、および２−アミノプロピ
ルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めたＮ
−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、
核酸二重らせん安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（
同上，276-278頁）、なお一層具体的には、２’−メトキシエチル糖修飾と組み
合わされた場合、現在のところ好ましい塩基置換である。
【００９５】 上記の修飾核酸塩基のいくつか、更には、他の修飾塩基の製造を示す代表的な
米国特許には、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、更には、米国特許第４
，８４５，２０５号；同５，１３０，３０２号；同５，１３４，０６６号；同５
，１７５，２７３号；同５，３６７，０６６号；同５，４３２，２７２号；同５
，４５７，１８７号；同５，４５９，２５５号；同５，４８４，９０８号；同５
，５０２，１７７号；同５，５２５，７１１号；同５，５５２，５４０号；同５
，５８７，４６９号；同５，５９４，１２１号；同５，５９６，０９１号；同５
，６１４，６１７号；および同５，６８１，９４１号が含まれるが、これらに制
限されるわけではなく、これらのいくつかは、共同所有され、それぞれ、本明細
書中に援用され、そして１９９６年１２月１０日出願の共同所有される米国特許
出願第０８／７６２，４８８号も、本明細書中に援用される。
【００９６】 本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチド中で用いられるオリゴ
ヌクレオチドは、一つまたはそれ以上の置換糖部分を付加的にまたは代わりに含
むことができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、次の内の一つを２’位に含む
。ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル
、またはＯ−、Ｓ−またはＮ−アルキニルであって、そのアルキル、アルケニル
およびアルキニルが、置換または非置換のＣ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ2〜Ｃ10ア
ルケニルおよびアルキニルであってよいもの。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ2
）nＯ］mＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2、Ｏ（ＣＨ2）nＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2）nＯＮＨ2およびＯ（ＣＨ2）nＯＮ［（ＣＨ2）nＣＨ3）］2であっ
て、但し、ｎおよびｍが１〜約１０であるものである。他の好ましいオリゴヌク
レオチドは、次の内の一つを２’位に含む。Ｃ1〜Ｃ10低級アルキル、置換低級
アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、Ｓ
Ｈ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＳＯＣＨ3、ＳＯ2
ＣＨ3、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロア
ルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切
断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的
性状を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性状を改善する基、お
よび同様の性状を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキ
シ［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる２
’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3］（Martin et al., Helv.Chim.Acta, 1995,78,486
）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。更に好ましい修飾には、本
明細書中にその内容が援用される１９９８年１月３０日出願の共同所有される米
国特許出願第０９／０１６，５２０号に記載のような２’−ジメチルアミノオキ
シエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ2）2ＯＮ（
ＣＨ3）2基が含まれる。
【００９７】 他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ3）、２’−アミノ
プロポキシ（２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ3）および２’−フルオロ（２’−Ｆ
）が含まれる。同様の修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末
端ヌクレオチド上または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位およ
び５’末端ヌクレオチドの５’位でも行われてよい。
【００９８】 本明細書中で用いられる“糖置換基”または“２’−置換基”には、酸素原子
を含むまたは含まないリボフラノシル残基の２’位に結合した基が含まれる。本
発明に従う糖置換基には、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−
アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアル
キル、Ｏ−アルキルイミダゾール、および式（Ｏ−アルキル）m（式中、ｍは１
〜約１０である）を有するポリエーテルが含まれるが、これらに制限されるわけ
ではない。これらポリエーテルの中で好ましいのは、直鎖状および環状のポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）、およびクラウンエーテルおよび本明細書中にそれ
ぞれそのまま援用される Ouchi et al.（Drug Design and Discovery 1992,9:93
）；Ravasio et al.（J.Org.Chem. 1991,56:4329）；および Delgardo et al.（
Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992,9:249）によっ
て開示されるものなどの（ＰＥＧ）含有基である。更に別の糖修飾は、Cook（An
ti-Cancer Drug Design, 1991,6:585-607）によって開示されている。フルオロ
、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキ
ルアミノアルキルおよびアルキルアミノ置換は、本明細書中にそのまま援用され
る１９９５年３月６日出願の“Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucle
otide(s) with 2' and 5' Substitutions,”と称される米国特許出願第０８／３
９８，９０１号に記載されている。
【００９９】 本発明に従う更に別の糖置換基には、２’−ＳＲ基および２’−ＮＲ2基が含
まれるが、ここにおいて、Ｒはそれぞれ独立して、水素、保護基、または置換ま
たは非置換のアルキル、アルケニルまたはアルキニルである。２’−ＳＲヌクレ
オシドは、本明細書中にそのまま援用される１９９７年９月２３日発行の米国特
許第５，６７０，６３３号に開示されている。２’−ＳＲモノマーシントンの包
含は、Hamm et al.（J.Org.Chem., 1997,62:3415-3420）によって開示されてい
る。２’−ＮＲヌクレオシドは、Goettingen,M., J.Org.Chem., 1996,61,6273-6
281；および Polushin et al., Tetrahedron Lett., 1996,37,3227-3230 によっ
て開示されている。本発明に従う更に別の代表的な２’置換基には、式XIまたは
XII
【０１００】
【化５】
【０１０１】 ［式中、Ｅは、Ｃ1〜Ｃ10アルキル、Ｎ（Ｑ3）（Ｑ4）またはＮ＝Ｃ（Ｑ3）（Ｑ 4 ）であり； Ｑ3およびＱ4は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ10アルキル、ジアルキルア
ミノアルキル、窒素保護基、束縛されたまたは非束縛のコンジュゲート基、固体
支持体へのリンカーであり；または Ｑ3およびＱ4は、一緒になって、窒素保護基、またはＮおよびＯより選択され
る少なくとも一つの追加のヘテロ原子を含んでいてよい環構造を形成し； ｑ1は、１〜１０の整数であり； ｑ2は、１〜１０の整数であり； ｑ3は、０または１であり； ｑ4は、０、１または２であり； Ｚ1、Ｚ2およびＺ3は、それぞれ独立して、Ｃ4〜Ｃ7シクロアルキル、Ｃ5〜Ｃ 14 アリールまたはＣ3〜Ｃ15ヘテロサイクリルであり、ここにおいて、このヘテ
ロサイクリル基中のヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄より選択され； Ｚ4は、ＯＭ1、ＳＭ1またはＮ（Ｍ1）2であり； Ｍ1は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ1〜Ｃ8ハロアルキル、
Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｍ2、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ2またはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）
Ｍ2であり； Ｍ2は、ＨまたはＣ1〜Ｃ8アルキルであり；そして Ｚ5は、Ｃ1〜Ｃ10アルキル、Ｃ1〜Ｃ10ハロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル、
Ｃ2〜Ｃ10アルキニル、Ｃ6〜Ｃ14アリール、Ｎ（Ｑ3）（Ｑ4）、ＯＱ3、ハロ、
ＳＱ3またはＣＮである］ を有する一つを有するものが含まれる。
【０１０２】 式XIを有する代表的な２’−Ｏ−糖置換基は、本明細書中にそのまま援用され
る１９９８年８月７日出願の“Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides,”と称
される米国特許出願第０９／１３０，９７３号に開示されている。
【０１０３】 式XIIを有する代表的な環状２’−Ｏ−糖置換基は、本明細書中にそのまま援
用される１９９８年７月２７日出願の“RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleo
tides that are Conformationally Preorganized,”と称される米国特許出願第
０９／１２３，１０８号に開示されている。
【０１０４】 リボシル環上にＯ−置換を有する糖も、本発明に従う。環Ｏへの代表的な置換
には、Ｓ、ＣＨ2、ＣＨＦおよびＣＦ2が含まれるが、これらに制限されるわけで
はない。例えば、本明細書中にそのまま援用される Secrist et al., Abstract
21, Program & Abstracts, Tenth International Roundtable, Nucleosides, Nu
cleotides and their Biological Applications, Park City, Utah, Sept. 16-2
0,1992 を参照されたい。
【０１０５】 オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分の
ような糖模擬体も有することができる。このような修飾糖構造の製造を示す代表
的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号；同５，１１８，８００号
；同５，３１９，０８０号；同５，３５９，０４４号；同５，３９３，８７８号
；同５，４４６，１３７号；同５，４６６，７８６号；同５，５１４，７８５号
；同５，５１９，１３４号；同５，５６７，８１１号；同５，５７６，４２７号
；同５，５９１，７２２号；同５，５９７，９０９号；同５，６１０，３００号
；同５，６２７，０５３１号；同５，６３９，８７３号；同５，６４６，２６５
号；同５，６５８，８７３号；同５，６７０，６３３号；および同５，７００，
９２０号が含まれるが、これらに制限されるわけではなく、これらのいくつかは
共同所有され、それぞれ、本明細書中に援用され、そして１９９５年６月５日出
願の共同所有される米国特許出願第０８／４６８，０３７号も本明細書中に援用
される。
【０１０６】 更に別の修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオ
チド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位で行われてもよい。例
えば、本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドの一つの更に別の
修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞内取込みを促進す
る一つまたはそれ以上の追加の非リガンド部分またはコンジュゲートをオリゴヌ
クレオチドに化学結合させることが含まれる。このような部分には、コレステロ
ール部分（Letsinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989,86,6553）、コー
ル酸（Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.Lett., 1994,4,1053）、チオエーテ
ル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann.N.Y.Ac
ad.Sci., 1992,660,306; Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.Let., 1993,3,27
65）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl.Acids Res., 1992,20,53
3）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Saison-
Behmoaras et al., EMBO J., 1991,10,111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990
,259,327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993,75,49）、リン脂質、例えば、
ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−
ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Manoharan et
al., Tetrahedron Lett., 1995,36,3651; Shea et al., Nucl.Acids Res., 199
0,18,3777）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al.,
Nucleosides & Nucleotides, 1995,14,969）、またはアダマンタン酢酸（Manoh
aran et al., Tetrahedron Lett., 1995,36,3651）、パルミチル部分（Mishra e
t al., Biochim.Biophys.Acta, 1995,1264,229）、またはオクタデシルアミンま
たはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J.P
harmacol.Exp.Ther., 1996,277,923）などの脂質部分が含まれるが、これらに制
限されるわけではない。
【０１０７】 このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの製造を示す代表的な米国特許
には、米国特許第４，８２８，９７９号；同４，９４８，８８２号；同５，２１
８，１０５号；同５，５２５，４６５号；同５，５４１，３１３号；同５，５４
５，７３０号；同５，５５２，５３８号；同５，５７８，７１７号；同５，５８
０，７３１号；同５，５８０，７３１号；同５，５９１，５８４号；同５，１０
９，１２４号；同５，１１８，８０２号；同５，１３８，０４５号；同５，４１
４，０７７号；同５，４８６，６０３号；同５，５１２，４３９号；同５，５７
８，７１８号；同５，６０８，０４６号；同４，５８７，０４４号；同４，６０
５，７３５号；同４，６６７，０２５号；同４，７６２，７７９号；同４，７８
９，７３７号；同４，８２４，９４１号；同４，８３５，２６３号；同４，８７
６，３３５号；同４，９０４，５８２号；同４，９５８，０１３号；同５，０８
２，８３０号；同５，１１２，９６３号；同５，２１４，１３６号；同５，０８
２，８３０号；同５，１１２，９６３号；同５，２１４，１３６号；同５，２４
５，０２２号；同５，２５４，４６９号；同５，２５８，５０６号；同５，２６
２，５３６号；同５，２７２，２５０号；同５，２９２，８７３号；同５，３１
７，０９８号；同５，３７１，２４１号；同５，３９１，７２３号；同５，４１
６，２０３号；同５，４５１，４６３号；同５，５１０，４７５号；同５，５１
２，６６７号；同５，５１４，７８５号；同５，５６５，５５２号；同５，５６
７，８１０号；同５，５７４，１４２号；同５，５８５，４８１号；同５，５８
７，３７１号；同５，５９５，７２６号；同５，５９７，６９６号；同５，５９
９，９２３号；同５，５９９，９２８号；および同５，６８８，９４１号が含ま
れるが、これらに制限されるわけではなく、これらのいくつかは共同所有され、
それぞれ、本明細書中に援用される。
【０１０８】 本発明は、更に、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を用いた組成物を含
む。本発明の文脈中、“キメラの”アンチセンス化合物または“キメラ”は、ア
ンチセンス化合物、特に、それぞれが少なくとも一つのモノマー単位、すなわち
、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドから成る二つまたはそれ以上
の化学的に異なった領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらオリゴヌ
クレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解への増加した耐性、増加した細胞
内取込みおよび／または標的核酸への増加した結合親和性をオリゴヌクレオチド
に与えるようにオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも一つの領域を含
有する。オリゴヌクレオチドの更に別の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：
ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として役立ちうる。例え
ば、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重らせんのＲＮＡ鎖を切断する細胞性エ
ンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の
切断を引き起こし、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を
大きく増加させる。その結果として、キメラオリゴヌクレオチドを用いる場合、
同様の標的領域にハイブリッド形成するホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドと比較してより短いオリゴヌクレオチドを用いると、しばしば、同様の
結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、そして
必要ならば、当該技術分野において知られている関連の核酸ハイブリダイゼーシ
ョン技術によって常套的に検出することができる。ＲＮアーゼＨに媒介される標
的切断は、核酸を切断するリボザイムの使用とは異なり、リボザイムは、本発明
によって包含されない。
【０１０９】 例として、このような“キメラ”は、“ギャップマー（gapmers）”、すなわ
ち、オリゴヌクレオチドの中心部分（“ギャップ”）が、例えば、ＲＮアーゼＨ
の基質として役立ち、そして５’および３’部分（“ウィング”）は、標的ＲＮ
Ａ分子へのより大きい親和性またはそれと二重らせんを形成した場合の安定性を
有するように修飾されているが、ヌクレアーゼ活性を支持することができない（
例えば、２’−フルオロ−または２’−メトキシエトキシ置換）オリゴヌクレオ
チドであってよい。他のキメラには、“ヘミマー（hemimers）”、すなわち、オ
リゴヌクレオチドの５’位は、例えば、ＲＮアーゼＨの基質として役立つが、３
’位は、標的ＲＮＡ分子へのより大きい親和性またはそれと二重らせんを形成し
た場合の安定性を有するように修飾されているが、ヌクレアーゼ活性を支持する
ことができない（例えば、２’−フルオロ−または２’−メトキシエトキシ置換
）、またはその逆の場合も同じオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１１０】 より大きいオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重らせん安定性を与えるオリゴヌク
レオチドへの多数の化学修飾は、Freier et al.（Nucl.Acids Res., 1997,25,44
29）によって記載されている。このような修飾は、キメラオリゴヌクレオチドの
ＲＮアーゼＨ不応性部分に好適であり、概して、標的ＲＮＡへのアンチセンス化
合物の親和性を増加させるのに用いることができる。
【０１１１】 本発明のキメラのアンチセンス化合物は、上記のような二つまたはそれ以上の
オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／ま
たはオリゴヌクレオチド模擬体の複合体構造として形成されてよい。このような
化合物は、当該技術分野において、ハイブリッドまたはギャップマーとも称され
ている。このようなハイブリッド構造の製造を示す代表的な米国特許には、米国
特許第５，０１３，８３０号；同５，１４９，７９７号；同５，２２０，００７
号；同５，２５６，７７５号；同５，３６６，８７８号；同５，４０３，７１１
号；同５，４９１，１３３号；同５，５６５，３５０号；同５，６２３，０６５
号；同５，６５２，３５５号；同５，６５２，３５６号；および同５，７００，
９２２号が含まれるが、これらに制限されるわけではなく、これらのいくつかは
共同所有され、それぞれ、本明細書中に援用され、そして１９９５年６月６日出
願の米国特許出願第０８／４６５，８８０号も、本明細書中に援用される。
【０１１２】 本発明は、更に、オリゴヌクレオチド内の特定の位置に関して、実質的にキラ
ルによって純粋であるオリゴヌクレオチドを用いた組成物を含む。実質的にキラ
ルによって純粋なオリゴヌクレオチドの例には、少なくとも７５％ＳｐまたはＲ
ｐであるホスホロチオエート結合を有するもの（Cook et al., 米国特許第５，
５８７，３６１号）、および実質的にキラルによって純粋な（ＳｐまたはＲｐ）
アルキルホスホネート、ホスホロアミデートまたはホスホトリエステル結合を有
するもの（Cook, 米国特許第５，２１２，２９５号および同５，５２１，３０２
号）が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１１３】 本発明は、更に、リボザイムを用いたリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレ
オチドを包含する。極めて特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を触媒する合成
ＲＮＡ分子およびそれらの誘導体は、リボザイムとして知られる。（概して、１
９９６年８月６日発行の Haseloff et al. による米国特許第５，５４３，５０
８号および１９９６年８月１３日発行の Goodchild et al. による米国特許第５
，５４５，７２９号を参照されたい。）切断反応は、ＲＮＡ分子自体によって触
媒される。天然に存在するＲＮＡ分子の場合、自己触媒切断部位は、ＲＮＡ二次
構造の高度に保存される領域内に位置する（Buzayan et al., Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A., 1986,83,8859; Forster et al., Cell, 1987,50,9）。天然に存在す
る自己触媒ＲＮＡ分子は、特定の細胞性または病原性ＲＮＡ分子に高度の特異性
でターゲットされることができるリボザイムを生じるように修飾されている。し
たがって、リボザイムは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の一般的な目
的（すなわち、特定の遺伝子の発現のモジュレーション）に役立ち、そしてオリ
ゴヌクレオチドのように、かなりの一本鎖部分を有する核酸である。すなわち、
リボザイムは、オリゴヌクレオチドとの実質的な化学的および機能的同一性を有
するので、本発明の目的に関して同等物であると考えられる。
【０１１４】 本発明のコンジュゲートに用いられるオリゴヌクレオチドは、便宜上および常
套的に、周知の固相合成技術によって製造することができる。このような合成の
ための装置は、例えば、Applied Biosystems（Foster City, ＣＡ）を含めたい
くつかの業者によって販売されている。当該技術分野において知られているこの
ような合成のための他の手段はいずれも、付加的にまたは代わりに用いることが
できる。同様の技法を用いて、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のよ
うな他のオリゴヌクレオチドを製造することも知られている。
【０１１５】 具体的な修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、次の米国特許または
係属特許出願において見出されうるが、これらはそれぞれ、本出願と共通に譲渡
される。ポリアミンコンジュゲート化オリゴヌクレオチドに引用される米国特許
第５，１３８，０４５号および同５，２１８，１０５号；キラルリン結合を有す
るオリゴヌクレオチドの製造用のモノマーに引用される米国特許第５，２１２，
２９５号；修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドに引用される米国特許第５，３
７８，８２５号および同５，５４１，３０７号；主鎖修飾オリゴヌクレオチドお
よび還元的カップリングによるそれらの製造に引用される米国特許第５，３８６
，０２３号；３−デアザプリン環系を基剤とする修飾核酸塩基およびそれらの合
成法に引用される米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ−２置換プリンを基剤と
する修飾核酸塩基に引用される米国特許第５，４５９，２５５号；キラルリン結
合を有するオリゴヌクレオチドを製造する方法に引用される米国特許第５，５２
１，３０２号；ペプチド核酸に引用される米国特許第５，５３９，０８２号；β
−ラクタム主鎖を有するオリゴヌクレオチドに引用される米国特許第５，５５４
，７４６号；オリゴヌクレオチドの合成のための方法および材料に引用される米
国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基であって、ヌクレオシドのいろ
いろな位置のいずれかに結合した他の部分へのリンカーとして用いることができ
るアルキルチオ基を有するヌクレオシドに引用される米国特許第５，５７８，７
１８号；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに
引用される米国特許第５，５８７，３６１号および同５，５９９，７９７号；２
，６−ジアミノプリン化合物を含めた２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび関連
化合物の製造方法に引用される米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プ
リンを有するオリゴヌクレオチドに引用される米国特許第５，５８７，４６９号
；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに引用される米国特許第５，５
８７，４７０号；コンジュゲート化４’−デスメチルヌクレオシド類似体に両方
とも引用される１９９３年６月２９日発行の米国特許第５，２２３，１６８号お
よび同５，６０８，０４６号；主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体に引用される
米国特許第５，６０２，２４０号および同５，６１０，２８９号；および２’−
フルオロオリゴヌクレオチドを合成する方法に特に引用される１９９５年２月３
日出願の米国特許出願第０８／３８３，６６６号および米国特許第５，４５９，
２５５号。
【０１１６】 本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドおよびリガンド分子含
有配列特異的連結ヌクレオシドの場合、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オシドは、標準的なヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または結合部分を
既に有するヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、またはリガ
ンド分子を既に有するリガンド−ヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲー
ト前駆体を用いて適当なＤＮＡ合成機で組み立てることができる。
【０１１７】 結合部分を既に有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体を用いた場合、配列
特異的連結ヌクレオシドの合成は、典型的には完了し、次に、リガンド分子を結
合部分と反応させて、リガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する
。ステロイド、ビタミン、脂質および受容体分子のようないろいろな分子を有す
るオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成へのこのアプローチは、以前に記載
されている（Manoharan et al., ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３号を参照され
たい）。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレ
オシドは、自動合成機によって、商業的に入手可能であり且つオリゴヌクレオチ
ド合成において常套的に用いられる標準的なホスホロアミダイトおよび非標準的
ホスホロアミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートから誘導
されるホスホロアミダイトを用いて合成される。
【０１１８】 本明細書中にいずれも援用される出願第ＵＳ９１／００２４３号、出願第４６
３，３５８号および出願第５６６，９７７号において、オリゴヌクレオチドのヌ
クレオシド中の２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル
基、２’−Ｏ−アリル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基または２’−デオキシ−
２’−フルオロ基は、オリゴヌクレオチドへの増大したハイブリダイゼーション
特性を与えるということが報告されている。更に、ホスホロチオエート主鎖を含
有するオリゴヌクレオチドは、増大したヌクレアーゼ安定性を有することが報告
されている。したがって、本発明の機能付加された連結ヌクレオシドは、ホスホ
ロチオエート主鎖かまたは、その上の２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２
’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−Ｏ−アリルまたは２’−
デオキシ−２’−フルオロ基、またはその両方を更に含むように増大することが
できる。
【０１１９】 若干の好ましい態様において、５’末端にアミノ基を有する本発明の機能付加
されたヌクレオシド配列を、ＤＮＡ合成機を用いて製造後、ある選択されたリガ
ンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は、当業者に周知
である。代表的な活性エステルには、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テト
ラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペン
タクロロフェノールエステルが含まれる。アミノ基および活性エステルの反応は
、選択されたリガンドが結合基によって５’位に結合しているオリゴヌクレオチ
ドを生じる。５’末端にあるアミノ基は、上記の５’−アミノ修飾因子（モディ
ファイヤー）（Amino-Modifier）Ｃ６試薬を用いて好都合に製造することができ
る。好ましい態様において、リガンド分子は、そのリガンドが５’−ヒドロキシ
基に直接的にまたはリンカーによって間接的に結合しているリガンド−ヌクレオ
シドホスホロアミダイトの使用により、オリゴヌクレオチドに５’位でコンジュ
ゲートさせることができる。このようなリガンド−ヌクレオシドホスホロアミダ
イトは、典型的には、自動合成手順の最後に用いられて、５’末端にリガンドを
有するリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１２０】 更に好ましい態様において、ある選択されたリガンドが３’末端アミノ基に結
合している本発明の機能付加されたヌクレオシド配列は、３’−アミノ修飾され
た制御細孔ガラス（Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, ＣＡによって販
売されている）を用いて製造することができるが、引き続きのリガンドの結合は
、リガンド活性エステルとの反応によって行われる。
【０１２１】 本発明のもう一つ好ましい態様において、リガンドは、万能リンカーのような
適当な多機能性リンカーの使用によってオリゴヌクレオチドの３’末端に結合す
ることができる。この場合、最初に、万能リンカーを用いてリガンドを誘導体化
した後、このコンジュゲートを固体支持体に負荷させる。この固体支持体上での
引き続きの核酸またはオリゴヌクレオチドの合成は、切断および脱保護について
、リガンド分子を３’末端に有するリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチ
ドを与える。
【０１２２】 なお更に好ましい態様において、リガンド分子が、オリゴヌクレオチドのヌク
レオシド単位のいずれかの核酸塩基の原子のいずれか一つに直接的にかまたは結
合基によって結合している本発明のヌクレオシドおよびリガンドコンジュゲート
化オリゴヌクレオチドの機能付加された配列を製造することができる。したがっ
て、一つまたはそれ以上のリガンド分子は、核酸塩基の３’末端、５’末端また
は両者間のいずれかの位置に結合していてよい。このような結合は、例えば、文
献に記載のおよび上述の化学によって行うことができる。核酸塩基へのリガンド
分子の結合の好ましい様式は、ヌクレオシド前駆体上に存在する適当なリンカー
の仲介による。次に、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートを３’位でホスフ
ィチル化して、オリゴヌクレオチドの自動合成のための伝統的なヌクレオシドホ
スホロアミダイトと一緒にビルディングブロックとして引き続き用いることがで
きるリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートホスホロアミダイトを与える。次に
、このようなリガンドヌクレオチドコンジュゲートホスホロアミダイトの挿入の
数および位置は、本発明の合成されたリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオ
チド中に存在するリガンド分子の数および位置を指示するであろう。
【０１２３】 本発明は、更に、リガンド分子がヌクレオチド間結合の原子の一つに結合して
いるリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを提供する。核酸およびオリ
ゴヌクレオチド中の一つの典型的なヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結
合である。多数の修飾されたヌクレオチド間結合は、当業者に知られており、上
記のようなホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスホロジチオエー
トが含まれるが、これらに制限されるわけではない。リガンド分子は、このよう
なヌクレオチド間結合の原子の一つに、結合基の仲介を用いてまたは用いること
なくコンジュゲートすることができる。リガンド分子の結合は、本発明の方法に
よってホスホロアミダイトのようなヌクレオシドビルディングブロックの製造中
に行うことができるかまたは、オリゴヌクレオチド合成中のヌクレオチド間結合
の形成中に行うことができる。
【０１２４】 本発明の更に好ましい態様において、リガンド分子は、一つのオリゴヌクレオ
チド上の多数の部位で結合している。例えば、一つまたはそれ以上のリガンドが
、連結ヌクレオシド配列の両末端に結合しているリガンドコンジュゲート化オリ
ゴヌクレオチドを製造することができる。好ましくは、このような構造は、３’
，５’−ジアミノ配列をリガンド活性エステルと反応させることによって製造さ
れる。必要なオリゴヌクレオシド配列は、例えば、上記の３’−アミノ修飾因子
および５’−アミノ修飾因子Ｃ６（またはアミノリンク（Aminolink）−２）試
薬を利用して、または５’−アミノ修飾因子Ｃ２（またはアミノリンク−２）試
薬と組み合わせた上記の３’−アミノ修飾制御多孔質ガラス試薬を利用すること
によって合成することができる。或いは、このような多重コンジュゲート化オリ
ゴヌクレオチドは、本発明の方法により、自動合成中のある与えられたオリゴヌ
クレオチド配列中において、必要に応じておよび必要なところで適当なリガンド
−ヌクレオシドコンジュゲートホスホロアミダイトを用いて容易に合成すること
ができる。
【０１２５】 本発明のなお更に好ましい態様において、一つまたはそれ以上の選択されたヌ
クレオシドの２’位にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチド配列は、例え
ば、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ε−フタルイミジルアミノペンチ
ル）−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルシアノエトキ
シホスホロアミダイトのような適当に機能付加されたヌクレオチドを用いて製造
される。上に言及された特許出願第ＵＳ９１／００２４３号、同５６６，９７７
号および同４６３，３５８号を参照されたい。好ましくは、それらヌクレオチド
またはヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド成分の一つまたはそ
れ以上において、活性エステルまたはそのチオイソシアネートとの反応によって
リガンドに結合している。
【０１２６】 なお更に好ましい態様において、一つまたはそれ以上のヌクレオシドの複素環
式塩基がリガンド分子に連結されていることがありうる本発明の機能付加された
ヌクレオシド配列を製造することができる。例えば、Jablonski et al., 上記に
よって記載のような（Glen Research からも商業的に入手可能な）５’−Ｏ−ジ
メトキシトリチル−５−［Ｎ（７−トリフルオロアセチルアミノヘプチル）−３
−アクリルアミド］−２’−デオキシウリジン３’−Ｏ−（メチルＮ，Ｎ−ジイ
ソプロピル）ホスホロアミドを用いると、複素環式塩基上に結合基を包含するよ
うに機能付加された所望のヌクレオシドは、ＤＮＡ合成機を用いて連結ヌクレオ
シド配列中に包含される。
【０１２７】 本発明の更に機能付加された連結ヌクレオシドにおいて、リガンド分子のコン
ジュゲート（または連結）は、ヌクレオシド上の上記のアミノ結合基へのリガン
ドのコンジュゲーションによって行われる。これは、いくつかの方法で行うこと
ができる。例えば、本発明のリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートは、ＥＤＣ
／スルホ−ＮＨＳ（すなわち、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピルカ
ルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）を用いてリガンドのカル
ボン酸官能基をヌクレオシド上の結合基のアミノ官能基とコンジュゲートさせる
ヌクレオシドへのリガンド分子のコンジュゲートによって製造することができる
。
【０１２８】 本発明のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）または４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（
ＳＭＣＣ）のようなヘテロ二官能性リンカーによってリガンド分子上の求核位置
、好ましくは、チオールをヌクレオシド配列上の結合基のアミノ官能基へ連結す
る、ヌクレオシド配列へのリガンド分子のコンジュゲートによって製造すること
ができる。この機構により、オリゴヌクレオシド−マレイミドコンジュゲートは
、連結ヌクレオシド上のリンカーのアミノ基とＭＢＳまたはＳＭＣＣマレイミド
リンカーとの反応によって形成される。次に、そのコンジュゲートを、リガンド
分子、好ましくは、チオール官能性を有するものと反応させる。
【０１２９】 或いは、リガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、スベリン酸ジスク
シンイミジル（ＤＳＳ）のようなホモ二官能性リンカーによってリガンド上のア
ミノ官能基をオリゴヌクレオチド配列上のリンカーのアミノ基へ連結する、オリ
ゴヌクレオチドまたはヌクレオシドへのリガンド分子のコンジュゲートによって
製造することができる。この機構により、オリゴヌクレオシド−スクシンイミジ
ルコンジュゲートは、ヌクレオシド配列上のリンカーのアミノ基とスベリン酸ジ
スクシンイミジルリンカーとの反応によって形成される。スベリン酸ジスクシン
イミジルリンカーは、ヌクレオシド上のアミンリンカーとカップリングして、リ
ンカーのサイズを延長する。次に、延長されたリンカーを、リガンド分子のアミ
ノ基と反応させる。
【０１３０】 オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞内取込みを増大させるため
に、多数の非リガンド分子がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしているが、
このようなコンジュゲーションを行う手順は、科学文献で入手可能である。この
ような非リガンド部分には、コレステロール（Letsinger et al., Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 1989,86,6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.
Lett., 1994,4,1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオー
ル（Manoharan et al., Ann.N.Y.Acad.Sci., 1992,660,306; Manoharan et al.,
Bioorg.Med.Chem.Let., 1993,3,2765）、チオコレステロール（Oberhauser et
al., Nucl.Acids Res., 1992,20,533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール
残基またはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991,10,111;
Kabanov et al., FEBS Lett., 1990,259,327; Svinarchuk et al., Biochimie,
1993,75,49）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールま
たは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸ト
リエチルアンモニウム（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995,36,3651;
Shea et al., Nucl.Acids Res., 1990,18,3777）、ポリアミンまたはポリエチ
レングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995,14,9
69）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995,
36,3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim.Biophys.Acta, 1995,126
4,229）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニルオキシコ
レステロール部分（Crooke et al., J.Pharmacol.Exp.Ther., 1996,277,923）な
どの脂質部分が含まれている。このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの
製造を示す代表的な米国特許は、上に挙げられている。典型的なコンジュゲート
プロトコールは、配列の一つまたはそれ以上の位置にアミノリンカーを有するオ
リゴヌクレオチドの合成を行う。次に、そのアミノ基を、適当なカップリング試
薬または活性化試薬を用いて、コンジュゲートされる分子と反応させる。コンジ
ュゲート反応は、固体支持体になお結合しているオリゴヌクレオチドを用いてか
または液相中のオリゴヌクレオチドの切断後に行うことができる。ＨＰＬＣによ
るオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製は、典型的には、純粋なコンジュゲ
ートを与える。
【０１３１】 或いは、コンジュゲートされる分子を、分子中に存在するアルコール基によっ
てまたはホスフィチル化されうるアルコール基を有するリンカーの結合によって
、ホスホロアミダイトのようなビルディングブロックに変換することができる。
【０１３２】 これらアプローチはそれぞれ、リガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチド
の合成に用いることができる。アミノ連結オリゴヌクレオチドは、カップリング
試薬の使用によって、またはＮＨＳまたはペントフルオロフェノラートエステル
としてのリガンドの活性化後に、リガンドと直接的にカップリングさせることが
できる。リガンドホスホロアミダイトは、カルボキシル基の一つへのアミノヘキ
サノールリンカーの結合後、末端アルコール官能基のホスフィチル化によって合
成することができる。システアミンのような他のリンカーも、合成されたオリゴ
ヌクレオチド上に存在するクロロアセチルリンカーへのコンジュゲートに利用す
ることができる。
【０１３３】 本発明の方法の一つの好ましい態様において、リガンドコンジュゲート化オリ
ゴヌクレオチドの製造は、リガンド分子を構築するための適当な前駆体分子の選
択とともに開始する。典型的には、その前駆体は、一般的に用いられるヌクレオ
シドの適当に保護された誘導体である。例えば、本発明のリガンドコンジュゲー
ト化オリゴヌクレオチドの合成のための合成前駆体には、分子の核酸塩基部分で
更に保護されていてよい２’−６−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレ
オシド、２’−６−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、５
’−６−アミノアルコキシ−２’−デオキシヌクレオシド、５’−６−アミノア
ルコキシ−２’−保護ヌクレオシド、３’−６−アミノアルコキシ−５’−ＯＤ
ＭＴ−ヌクレオシドおよび３’−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌク
レオシドが含まれるが、これらに制限されるわけではない。このような前駆体の
使用は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド成分の一つまたはそれ以上の２’位
、３’位または５’位のような多数の可能な部位の一つに結合がある場合に、リ
ガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを与えると考えられる。このような
アミノ連結した保護されたヌクレオシド前駆体の合成方法は、当業者に知られて
いるし且つ文献で入手可能である。
【０１３４】 本発明の一つの態様において、コンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、固相
化学を用い、コンジュゲートヌクレオシドを用いて出発して製造される。オリゴ
ヌクレオシドは、２’位、３’位または５’位の一つに付着したまたは連結して
いてよい血清タンパク質結合リガンド、２’位、３’位または５’位の一つにあ
る保護されたヒドロキシル基、および２’位、３’位または５’位の他の一つに
位置するフリーのヒドロキシル基を有するものが選択される。フリーのヒドロキ
シル基を、二官能性結合部分を用いて処理し、得られたヌクレオシドを固体支持
体と反応させる。２’−Ｏ−位置にあるスクシニルリンカーによって固体支持体
に結合した代表的なコンジュゲートヌクレオシド（実施例２０による）を下に示
す。
【０１３５】
【化６】
【０１３６】 リガンドはイブプロフェンであり、リンカーは、好適な６−アミノヘキシルオ
キシ結合基である。Ｂｘは複素環式塩基部分であり、Ｐｇはヒドロキシル保護基
である。得られた固体支持体に結合したコンジュゲートヌクレオシドを、弱酸を
用いて処理してヒドロキシル保護基を除去し、そして追加のヌクレオシドまたは
ヌクレオチドを用いて処理して二量体（以下、ダイマーともいう）を形成させる
。本発明の一つの側面において、所望のオリゴヌクレオチドを形成する追加のヌ
クレオシドのカップリングは、ホスホロアミダイトモノマーを用いて、既知の方
法および手順にしたがって行われる。
【０１３７】 本明細書中で用いられる“アルキル”という用語には、直鎖、分岐状鎖および
脂環式の炭化水素基が含まれるが、これらに制限されるわけではない。本発明の
アルキル基は、置換されていてよい。代表的なアルキル置換基は、本明細書中に
そのまま援用される米国特許第５，２１２，２９５号の段落１２、４１〜５０行
に開示されている。
【０１３８】 本明細書中で用いられる“アラルキル”という用語は、アリール基を有するア
ルキル基、例えば、ベンジル基を意味する。“アルカリル”という用語は、アル
キル基を有するアリール基、例えば、メチルフェニル基を意味する。“アリール
”基は、置換および非置換の芳香族ヒドロカルビル基が含まれるがこれらに制限
されるわけではない芳香族環状化合物である。アラルキル基（一般的には、Ｃ7
〜Ｃ20）には、ベンジル基およびキシリル基のようなアリールおよびアルキル両
官能基を有する基が含まれるが、これらに制限されるわけではない。好ましいア
リール基およびアラルキル基には、フェニル、ベンジル、キシリル、ナフチル、
トルイル、ピレニル、アントラシル、フェナントリル、アズリル、フェネチル、
シンナミル、ベンゾヒドリルおよびメシチルが含まれるが、これらに制限される
わけではない。置換に典型的な置換基には、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ア
ルコール基、ベンジル基、フェニル基、ニトロ基、チオール基、チオアルコキシ
基、ハロゲン基、またはアルキル基、アリール基、アルケニル基またはアルキニ
ル基が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１３９】 本明細書中で用いられる“アルカノイル”という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）−ア
ルキルを有する基としてのその慣例の意味を有する。好ましいアルカノイル基は
、アセトイル基である。
【０１４０】 概して、“ヘテロ”という用語は、炭素以外の原子、好ましくは、これに限る
わけではないが、Ｎ、ＯまたはＳ、ＳＯおよびＳＯ2を意味する。したがって、
“複素環”という用語は、少なくとも１個の非炭素原子を有する環状構造を意味
する。“シクロ”または“サイクリル”には、単環式、二環式または三環式であ
ってよく且つオキソ、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、
アルケニル、アルキニル、アミノ、アミド、アジド、アリール、ヘテロアリール
、カルボン酸、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒ
ドラジノ、ＯＤＭＴ、アルキルスルホニル、ニトロ、スルフィド、スルホン、ス
ルホンアミド、チオールおよびチオアルコキシのような置換基で置換されていて
よい環状基が含まれる。
【０１４１】 本発明の更に別の目的、利点および新規な特徴は、制限するためのものではな
い次の実施例の検討によって当業者に明らかになるであろう。
【０１４２】 実施例１ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノフェンブフェニル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウ
リジン（１） ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中に溶解した３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル）−５
−メチルウリジン（１．０ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等（Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６４７）に記載された
方法によって調製）の溶液に、フェンブフェン（Ｓｉｇｍａ，４２４ｍｇ，１．
６６ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｆ
ｌｕｋａ，３４２ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）を加え、約２時間振とうした。混合
物を濾過し、ジシクロヘキシル尿素を除去して、濾液をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）
と飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５０ｍｌ）とに分配した。有機層を無水硫酸ナ
トリウム上で乾燥させ、蒸発させた。得られた泡状物をシリカゲルカラム・クロ
マトグラフィーによって、溶離剤として５０：５０のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを用
いて精製して、１．７５ｇ（９２％）の標題化合物を無色固体として得た。
【０１４３】
【数１】
【０１４４】 実施例２ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノフェンブフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（２） 化合物１（１．００ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．１６８ｇ
，１．６８ｍｍｏｌ）と、ジメチルアミノピリジン（０．０６８ｇ，０．５６ｍ
ｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．１６ｍｌ，１．１２ｍｍｏｌ）とを１，２
−ジクロロエタン（３ｍｌ）中に室温において溶解した。ねじ込みキャップトッ
プ付き試験管中の反応混合物を５５℃の加熱ブロック中に２時間入れてから、室
温に一晩冷却させた。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（８５／１５；ｖ／ｖ）を用いるＴ
ＬＣは出発物質の完全な転化を示した。１，２−ジクロロエタン（３０ｍｌ）を
加えて、混合物を冷１０％クエン酸（１７ｍｌ，水溶液）の１回量で３回洗浄し
、続いて水（１７ｍｌ）の１回量で３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で
乾燥させ、蒸発させて、１．１４ｇ（１００％）の標題化合物を泡状物として得
た。
【０１４５】
【数２】
【０１４６】 実施例３ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノフェンブフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（３） 化合物２（１．０４ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）と４−メチルモルホリン（０．２
３ｍｌ，２．１０ｍｍｏｌ）を室温においてＤＭＦ（１９ｍｌ）中に溶解した。
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラ−メチル
−ウロニウムテトラフルオロボレート（０．３４ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）と酸洗
浄済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（４．５６ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一
晩振とうした。得られた樹脂を次にＣＨ2Ｃｌ2によって３回、エーテルによって
３回洗浄した。最初の負荷は４１μｍｏｌ／ｇであることが判明した。この樹脂
を次にＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣａｐ
Ａ（２０ｍｌ）及びＣａｐ Ｂ（２０ｍｌ）溶液と一緒にして、さらに１時間振
とうして、ＣＨ2Ｃｌ2及びエーテルによって３回ずつ洗浄した。キャップされた
樹脂３を一晩真空下において乾燥させたところ、負荷が４６μｍｏｌ／ｇである
ことが判明した。
【０１４７】 実施例４ ３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル−ケトプロフェニル）−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５
’−メチルウリジン（４） ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中の３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル）−５−メチル
ウリジン（１．０ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）の溶液に、ケトプロフェン（Ｓｉｇｍ
ａ，４２２ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（Ｆｌｕｋａ，３４２ｍｇ，１．
６６ｍｍｏｌ）の溶液を加えて、２時間振とうした。混合物を濾過し、濾液をＣ
Ｈ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）と飽和炭酸水素ナトリウムの溶液（５０ｍｌ）とに分配し
た。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残留泡状
物をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって、溶離剤として５０：５０
の酢酸エチル：ヘキサンを用いて精製して、１．８２ｇ（８８％）の標題化合物
を得た。
【０１４８】
【数３】
【０１４９】 実施例５ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノケトプロフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（５） 化合物４（１．００ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．１６８ｇ
，１．６８ｍｍｏｌ）と、ジメチルアミノピリジン（０．０６８ｇ，０．５６ｍ
ｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．１６ｍｌ，１．１２ｍｍｏｌ）とを１，２
−ジクロロエタン（３ｍｌ）中に室温において溶解した。この反応混合物（ねじ
込みキャップトップ付き試験管中）を５５℃の加熱ブロック中に２時間入れてか
ら、室温に一晩冷却させた。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（８５／１５；ｖ／ｖ）を用
いるＴＬＣは出発物質の存在しないことを示した。混合物を１，２−ジクロロエ
タン（３０ｍｌ）によって希釈して、冷１０％クエン酸（水溶液，１７ｍｌ）に
よって３回洗浄し、続いて水（１７ｍｌ）によって３回洗浄した。有機相を硫酸
ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて、１．１４ｇ（１００％）の標題化合物を
泡状物として得た。
【０１５０】
【数４】
【０１５１】 実施例６ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノケトプロフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（６） 化合物５（１．０４ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）と４−メチルモルホリン（０．２
３ｍｌ，２．１０ｍｍｏｌ）を室温においてＤＭＦ（１９ｍｌ）中に溶解した。
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−
ウロニウムテトラフルオロボレート（０．３４ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）と酸洗浄
済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（４．５６ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩
振とうした。得られた樹脂を次にＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３回）とエーテル（ｘ３回）に
よって洗浄した。最初の負荷は３２μｍｏｌ／ｇであることが判明した。この樹
脂を次にＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣａｐ
Ａ（２０ｍｌ）及びＣａｐ Ｂ（２０ｍｌ）溶液と一緒にして、さらに１時間
振とうした。この樹脂をＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３回）とエーテル（ｘ３回）によって再
び洗浄した。キャップされた樹脂（６）を一晩真空下において乾燥させた。負荷
が４４μｍｏｌ／ｇであることが判明した。
【０１５２】 実施例７ ３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル−スプロフェニル）−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−
メチルウリジン（７） ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中の３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル）−５−メチル
ウリジン（１．０ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）の溶液に、スプロフェン（Ｓｉｇｍａ
，４３２ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた後に、ＤＣＣ（Ｆｌｕｋａ，
３４２ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を２時間振とうした
後に、ジシクロヘキシル尿素を濾別した。得られた有機溶液をＣＨ2Ｃｌ2（５０
ｍｌ）と飽和ＮａＨＣＯ3溶液（５０ｍｌ）とに分配した。有機層を分離し、無
水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。得られた生成物をシリカゲル・カ
ラムクロマトグラフィーによって、溶離剤として５０：５０の酢酸エチル：ヘキ
サンを用いて精製して、１．７５ｇ（８８％）の標題化合物を無色固体として得
た。
【０１５３】
【数５】
【０１５４】 実施例８ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノスプロフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−Ｏ
−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（８） 化合物７（１．００ｇ，１．１１ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．１６７ｇ
，１．６６ｍｍｏｌ）と、ジメチルアミノピリジン（０．０６８ｇ，０．５６ｍ
ｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．１５ｍｌ，１．１１ｍｍｏｌ）とを１，２
−ジクロロエタン（３ｍｌ）中に室温において溶解した。この反応混合物（ねじ
込みキャップトップ付き試験管中）を５５℃の加熱ブロック中に２時間入れてか
ら、室温に一晩冷却した。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（８５：１５；ｖ／ｖ）を用い
るＴＬＣは、出発物質の全てが転化されていることを示した。混合物を１，２−
ジクロロエタン（３０ｍｌ）によって希釈して、冷１０％酸（水溶液，１７ｍｌ
）によって３回、水（１７ｍｌ）によって３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウ
ム上で乾燥させ、蒸発させて、１．１３ｇ（１００％）の標題化合物を泡状物と
して得た。
【０１５５】
【数６】
【０１５６】 実施例９ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノスプロフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−Ｏ
−ＤＭＴ−５−メチルウリジン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（９） 化合物８（１．０３ｇ，１．０３ｍｍｏｌ）と４−メチルモルホリン（０．２
３ｍｌ，２．０６ｍｍｏｌ）を室温においてＤＭＦ（１９ｍｌ）中に溶解した。
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−
ウロニウムテトラフルオロボレート（０．３３ｇ，１．０３ｍｍｏｌ）と酸洗浄
済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（４．４７ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩
振とうした。得られた樹脂を次にＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３回）とエーテル（ｘ３回）に
よって洗浄した。最初の負荷は３６μｍｏｌ／ｇであることが判明した。この樹
脂を次にＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣａｐ
Ａ（２０ｍｌ）及びＣａｐ Ｂ（２０ｍｌ）溶液と一緒にして、１時間振とう
した。この樹脂をＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３回）とエーテル（ｘ３回）によって洗浄した
。キャップされた樹脂９を一晩真空下において乾燥させたところ、負荷が４７μ
ｍｏｌ／ｇであることが判明した。
【０１５７】 実施例１０ ３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル−カルプロフェニル）−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５
−メチルウリジン（１０） ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中の３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル）−５−メチル
ウリジン（１．０ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）の溶液に、カルプロフェン（Ｓｉｇｍ
ａ，４５３ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）を加えた後に、ＤＣＣ（Ｆｌｕｋａ，３４
２ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を２時間振とうした後に
、ジシクロヘキシル尿素を濾別した。得られた有機溶液をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ
）と飽和ＮａＨＣＯ3溶液（５０ｍｌ）とに分配した。有機層を無水硫酸ナトリ
ウム上で乾燥させ、蒸発させた。得られた生成物をシリカゲル・カラムクロマト
グラフィーによって、溶離剤として５０：５０の酢酸エチル：ヘキサンを用いて
精製して、１．６５ｇ（８４％）の標題化合物を無色固体として得た。
【０１５８】 実施例１１ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノカルプロフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（１１） 化合物１０（１．００ｇ，１．０９ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．１６４
ｇ，１．６４ｍｍｏｌ）と、ジメチルアミノピリジン（０．０６６ｇ，０．５４
ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．１５ｍｌ，１．０９ｍｍｏｌ）とを１，
２−ジクロロエタン（３ｍｌ）中に室温において溶解した。この反応混合物（ね
じ込みキャップトップ付き試験管中）を５５℃の加熱ブロック中に２時間入れて
から、室温に冷却した。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（８５／１５；ｖ／ｖ）を用いる
ＴＬＣは、出発物質が転化されていることを示した。混合物を１，２−ジクロロ
エタン（３０ｍｌ）によって希釈して、冷１０％クエン酸（水溶液，１７ｍｌ）
によって３回、水（１７ｍｌ）によって３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム
上で乾燥させ、蒸発させて、１．０７ｇ（９７％）の標題化合物を泡状物として
得た。
【０１５９】
【数７】
【０１６０】 実施例１２ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノカルプロフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１２） 化合物１１（０．９７０ｇ，０．９６ｍｍｏｌ）と４−メチルモルホリン（０
．２１ｍｌ，１．９２ｍｍｏｌ）を室温においてＤＭＦ（１９ｍｌ）中に溶解し
た。２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチ
ル−ウロニウムテトラフルオロボレート（０．３１ｇ，０．９６ｍｍｏｌ）と酸
洗浄済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（４．１４ｇ，０．４８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を
一晩振とうした。得られた樹脂を次にＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３回）とエーテル（ｘ３回
）によって洗浄した。最初の負荷は３９μｍｏｌ／ｇであることが判明した。こ
の樹脂を次にＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣ
ａｐ Ａ（２０ｍｌ）及びＣａｐ Ｂ（２０ｍｌ）溶液と一緒にして、１時間振
とうした。この樹脂を再びＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３回）とエーテル（ｘ３回）によって
洗浄した。キャップされた樹脂１２を真空下において乾燥させた。負荷は４１μ
ｍｏｌ／ｇであることが判明した。
【０１６１】 実施例１３ ３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル−パルミチル）−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ
−スクシニルウリジン（１３） 室温におけるＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中の３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル）
−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン（１．５ｇ，２．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイ
ソプロピルアミン（０．８１ｍｌ，４．６６ｍｍｏｌ）を加え、続いてパルミチ
ン酸ペンタフルオロフェニルエステル（化合物，以下参照，１．０４ｇ，２．８
ｍｍｏｌ）を加えて、一晩撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲル・カラ
ムクロマトグラフィーによって、溶離剤としてＥｔＯＡｃ：ＣＨ3ＯＨ（９０：
１０；ｖ／ｖ）を用いて、２’−Ｏ−スクシニル基の結合していない標題化合物
１．３９ｇ（７２％）を得た。
【０１６２】 上記コンジュゲート（１．１２ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．１７ｇ，１
．７ｍｍｏｌ）と、ジメチルアミノピリジン（０．０６８ｇ，０．５６ｍｍｏｌ
）と、トリエチルアミン（０．１６ｍｌ，１．１２ｍｍｏｌ）とをねじ込みキャ
ップトップ付き試験管中の室温の１，２−ジクロロエタン（３ｍｌ）中に溶解し
た。この反応混合物を５５℃の加熱ブロック中に２時間入れてから、室温に冷却
した。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（８５：１５；ｖ／ｖ）を用いるＴＬＣは、出発物
質の存在しないことを示した。混合物を１，２−ジクロロエタン（３０ｍｌ）に
よって希釈して、冷１０％クエン酸水溶液（２５ｍｌ）によって３回、水（２５
ｍｌ）によって３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させ
て、１．２ｇ（定量的収量）の標題化合物を泡状物として得た。
【０１６３】 実施例１４ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−パルミチルアミノヘキシル−２’−Ｏ−スクシニ
ルウリジン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１４） 化合物１３（１．３５ｇ，１．３５ｍｍｏｌ）と４−ジメチル−アミノピリジ
ン（０．１６ｇ，１．３５ｍｍｏｌ）とを第１フラスコ中の室温のＣＨ3ＣＮ（
１２．２ｍｌ）中に溶解した。第２フラスコにおいて、２，２’−ジチオビス−
５−ニトロピリジン（０．４２ｇ，１．３５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８．
５３ｍｌ）とジクロロメタン（３．６４ｍｌ）中に溶解し、得られた溶液を第１
フラスコに加えた。第３フラスコにおいて、トリフェニルホスフィン（０．３５
ｇ，１．３５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ3ＣＮ（１２．２ｍｌ）中に溶解し、得られ
た溶液を第１フラスコに加えた。酸洗浄済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１０．９ｇ，１
１５ｍｏｌ／ｇの負荷を有する）を加え、混合物を約３時間振とうした。得られ
た樹脂をＣＨ3ＣＮ（ｘ３）によって洗浄し、続いてＣＨ2Ｃｌ2とエーテルとに
よって洗浄して、過剰な試薬を除去した。洗浄済み樹脂に、テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）中の無水酢酸（２５ｍｌ）とＴＨＦ中の１−メチルイミダゾール（２
５ｍｌ）（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣａ
ｐ ＡとＣａｐ Ｂ試薬）を加え、混合物を２時間振とうした。樹脂を再びＣＨ 2 Ｃｌ2（ｘ３）とエーテル（ｘ３）とによって洗浄した。洗浄済み樹脂を真空オ
ーブン中でＰ2Ｏ5下、室温において一晩乾燥させた。乾燥した樹脂の収量は１０
．８ｇであり、負荷は４４ｍｏｌ／ｇであると判明した。
【０１６４】 最終樹脂の一部（３．８ｍｇ）をＣＨ2Ｃｌ2中のトリクロロ酢酸（２５ｍｌ，
３％）による処理によって切断した。分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａ
ｒｄ ８４５２Ａ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ分光光度計）上での５０３ｎｍにお
ける放出トリチルカチオンの吸収を測定することによって、負荷を判定した。最
終の誘導体化樹脂の収量は全体で１０．８ｇであった。
【０１６５】 実施例１５ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノパルミチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジン（１５） 室温においてＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中に溶解した３’−Ｏ−ヘキシルアミノ
−５’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジン（１．５０ｇ，２．３３ｍｍｏｌ）（ＲＩ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ，ＣＡから購入）に、ジイソプロピルアミン（０．８１ｍｌ，４．
６６ｍｍｏｌ）とパルミチン酸ペンタフルオロフェニル−エステル（１．１８ｇ
，２．８０ｍｍｏｌ）とを加えて、一晩撹拌した。混合物を蒸発させ、得られた
粗生成物をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって、溶離剤としてＥｔ
ＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９０／１０；ｖ／ｖ）を用いて精製して、１．２０ｇ（５９
％）の標題化合物を得た。
【０１６６】
【数８】
【０１６７】 実施例１６ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノパルミチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ４−ベンゾイルシ
チジン（１６） 室温においてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍｌ）中に溶解した化合物
１５（１．２０ｇ，１．３６ｍｍｏｌ）に、無水安息香酸（０．３７ｇ，１．６
３ｍｍｏｌ）を加えて、一晩撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて
、混合物を酢酸エチル（ｘ３）によって抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上
で乾燥させ、蒸発させた。次に、粗生成物をシリカゲル・カラムクロマトグラフ
ィーによって、溶離剤としてＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９５／５；ｖ／ｖ）を用い
て精製して、０．９０ｇ（６７％）の標題化合物を得た。
【０１６８】
【数９】
【０１６９】 実施例１７ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノパルミチル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−Ｏ−Ｄ
ＭＴ−Ｎ４−ベンゾイルシチジン（１７） 化合物１６（０．８８ｇ，０．８９ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．１３４
ｇ，１．３４ｍｍｏｌ）と、ジメチルアミノピリジン（０．０５４ｇ，０．４４
ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．１２ｍｌ，０．８９ｍｍｏｌ）とを室温
における１，２−ジクロロエタン（４ｍｌ）中に溶解した。この反応混合物（ね
じ込みキャップトップ付き試験管中）を５５℃の加熱ブロック中に１時間入れて
、室温に一晩冷却した。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９０／１０；ｖ／ｖ）を用いる
ＴＬＣは、出発物質が転化していることを示した。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍ
ｌ）によって希釈して、混合物を冷１０％クエン酸（２０ｍｌ，水溶液，ｘ３）
によって洗浄し、続いて水（２０ｍｌ，ｘ３）によって洗浄した。有機相を硫酸
マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させて、０．９７ｇ（１００％）の標題化合物
を泡状物として得た。
【０１７０】
【数１０】
【０１７１】 実施例１８ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノパルミチル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−Ｏ−Ｄ
ＭＴ−Ｎ４−ベンゾイル−シチジン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１８） 化合物１７（０．９５ｇ，０．８７ｍｍｏｌ）と４−ジメチル−アミノピリジ
ン（０．１１ｇ，０．８７ｍｍｏｌ）とを第１フラスコ中の室温のＣＨ3ＣＮ（
７．０ｍｌ）とＣＨ2Ｃｌ2（４ｍｌ）中に溶解した。第２フラスコにおいて、２
，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（０．２８ｇ，０．８７ｍｍｏｌ）
をＣＨ3ＣＮ（６．０ｍｌ）とＣＨ2Ｃｌ2（２．５ｍｌ）中に溶解して、第１フ
ラスコに加えた。第３フラスコにおいて、トリフェニルホスフィン（０．２３ｇ
，０．８７ｍｍｏｌ）をＣＨ3ＣＮ（７．０ｍｌ）中に溶解してから、第１フラ
スコと一緒にした。得られた混合物に、酸洗浄済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（３．７８
ｇ，０．４４ｍｍｏｌ）を加えて、約２時間振とうした。得られた樹脂をＣＨ2
Ｃｌ2（ｘ３）とエーテル（ｘ３）によって洗浄した。次に、これをＰｅｒｓｅ
ｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣａｐ Ａ（２５ｍｌ）と
Ｃａｐ Ｂ（２５ｍｌ）溶液と一緒にして、１時間振とうした。樹脂を再びＣＨ 2 Ｃｌ2（ｘ３）とエーテル（ｘ３）とによって洗浄して、真空下に乾燥するまで
入れた。最終負荷は５８μｍｏｌ／ｇであると判明した。
【０１７２】 実施例１９ ３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル−パルミチル）−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン
（１９） 室温におけるＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中の３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル）
−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン（１．５ｇ，２．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイ
ソプロピルアミン（０．８１ｍｌ，４．６６ｍｍｏｌ）を加え、続いてイブプロ
フェンペンタフルオロフェニルエステル（化合物２１，下記参照，１．０４ｇ，
２．８ｍｍｏｌ）を加えて、一晩撹拌した。混合物を濃縮して、残渣をシリカゲ
ル・カラムクロマトグラフィーによって、溶離剤としてＥｔＯＡｃ：ＣＨ3ＯＨ
（９０：１０；ｖ／ｖ）を用いて精製して、１．３９ｇ（７２％）の、スクシニ
ル基を有さない標題化合物を得た。
【０１７３】 上記コンジュゲート（１．１２ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．１７ｇ，１
．７ｍｍｏｌ）と、ジメチルアミノピリジン（０．０６８ｇ，０．５６ｍｍｏｌ
）と、トリエチルアミン（０．１６ｍｌ，１．１２ｍｍｏｌ）とをねじ込みキャ
ップトップ付き試験管中で室温の１，２−ジクロロエタン（３ｍｌ）中に溶解し
た。この反応混合物を５５℃の加熱ブロック中に２時間入れてから、室温に冷却
した。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（８５：１５；ｖ／ｖ）を用いるＴＬＣは出発物質
の存在しないことを示した。混合物を１，２−ジクロロエタン（３０ｍｌ）によ
って希釈し、冷１０％クエン酸（２５ｍｌ）によって３回、水（２５ｍｌ）によ
って３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて、１．２
ｇ（定量的収量）の標題化合物を泡状物として得た。
【０１７４】 実施例２０ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−イブプロフェニルアミノヘキシル−２’−Ｏ−ス
クシニルウリジン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０） 化合物１９（１．０２ｇ，１．０８ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン
（０．１３ｇ，１．０８ｍｍｏｌ）とをフラスコ中の室温のＣＨ3ＣＮ（９．７
３ｍｌ）中に溶解した。この溶液に、アセトニトリル（６．８０ｍｌ）とＣＨ2
Ｃｌ2（２．９０ｍｌ）中に溶解した２，２’−ジチオビス（５−ニトロ−ピリ
ジン）（０．３４ｇ，１．０８ｍｍｏｌ）の溶液を加えて、続いてＣＨ3ＣＮ（
９．７３ｍｌ）中に溶解したトリフェニルホスフィン（０．２８ｇ，１．０８ｍ
ｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物に、酸洗浄済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（８．６
９ｇ，１１５ｍｏｌ／ｇの負荷付き）を加えて、約２．５時間振とうした。得ら
れた樹脂をＣＨ3ＣＮ（ｘ３）、ＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３）及びエーテル（ｘ３）によ
って除去して、過剰な試薬を除去した。洗浄済み樹脂をＴＨＦ中の無水酢酸（２
５ｍｌ）とＴＨＦ中の１−メチルイミダゾール（２５ｍｌ）（Ｐｅｒｓｅｐｔｉ
ｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣａｐ ＡとＣａｐ Ｂ試薬）と
一緒にして、２時間振とうした。樹脂を再び、ＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３）とエーテル（
ｘ３）とによって洗浄した。最後に、これをＰ2Ｏ5下、室温において真空オーブ
ン中で一晩乾燥させた。最終負荷は５３ｍｏｌ／ｇであると判明した。
【０１７５】 最終樹脂の一部（３．０ｇ）をＣＨ2Ｃｌ2中のトリクロロ酢酸（２５ｍｌ，３
％）による処理によって切断した。分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒ
ｄ ８４５２Ａ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ分光光度計）上での５０３ｎｍにおけ
る放出トリチルカチオンの吸収を測定することによって、負荷を判定した。最終
の誘導体化樹脂の収量は全体で８．９０ｇであった。
【０１７６】 実施例２１ イブプロフェニルペンタフルオロフェニルエステル（２１） 室温におけるテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）中に溶解したイブプロフェン（
２．００ｇ，９．７０ｍｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ）の溶液に、４−ジメチルアミノピ
リジン（０．２４ｇ，１．９４ｍｍｏｌ）と１，３−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（２．００ｇ，９．７０ｍｍｏｌ）とを加えて、２０分間撹拌した。この
混合物に、ペンタフルオロフェノール（１．７８ｇ，９．７０ｍｍｏｌ）を加え
て、一晩撹拌した。次に、この混合物を濾過して、ＤＣＵを除去して、ＣＨ2Ｃ
ｌ2を加えた。混合物を水（ｘ２）によって洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥
させ、蒸発させて、油状物を得た。この油状物をシリカゲル・カラムクロマトグ
ラフィーによって、溶離剤として酢酸エチル：ヘキサン（５／９５，ｖ／ｖ）を
用いて精製して、２．７０ｇ（７５％）の標題化合物を得た。
【０１７７】
【数１１】
【０１７８】 実施例２２ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノイブプロフェニル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジン（２
２） 室温においてＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中に溶解した３’−Ｏ−ヘキシルアミノ
−５’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジン（１．５０ｇ，２．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ
イソプロピルアミン（０．８１ｍｌ，４．６６ｍｍｏｌ）と化合物２１（１．０
４ｇ，２．８０ｍｍｏｌ）とを加えて、一晩撹拌した。この混合物を濃縮して、
残渣をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって、溶離剤としてＥｔＯＡ
ｃ：ＭｅＯＨ（９０／１０；ｖ／ｖ）を用いて精製して、１．４６ｇ（７５％）
の標題化合物を得た。
【０１７９】
【数１２】
【０１８０】 実施例２３ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノイブプロフェニル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ４−ベンゾ
イルシチジン（２３） 室温におけるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍｌ）中に溶解した化合物
２２（１．４５ｇ，１．７４ｍｍｏｌ）の溶液に、無水安息香酸（０．０．５７
ｇ，２．５３ｍｍｏｌ）を加えて、一晩撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶
液を加えて、混合物を酢酸エチル（ｘ３）によって抽出した。有機相を硫酸マグ
ネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。次に、粗生成物をシリカゲル・カラ
ムクロマトグラフィーによって、溶離剤としてＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９０／１
０；ｖ／ｖ）を用いて精製して、０．９７ｇ（６０％）の標題化合物を得た。
【０１８１】
【数１３】
【０１８２】 実施例２４ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノイブプロフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ４−ベンゾイルシチジン（２４） 化合物２３（０．９５ｇ，１．０１ｍｍｏｌ）と、無水コハク酸（０．１５２
ｇ，１．５２ｍｍｏｌ）と、ジメチルアミノピリジン（０．０６２ｇ，０．５０
ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．１４ｍｌ，１．０１ｍｍｏｌ）とを室温
において１，２−ジクロロエタン（４．５ｍｌ）中に溶解した。この反応混合物
（ねじ込みキャップトップ付き試験管中）を５５℃の加熱ブロック中に１時間入
れてから、室温に冷却させた。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９０／１０；ｖ／ｖ）を
用いるＴＬＣは出発物質が転化したことを示した。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（４５ｍ
ｌ）によって希釈し、冷１０％クエン酸（水溶液、２０ｍｌ）によって３回、水
（２０ｍｌ）によって３回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、
蒸発させて、１．０５ｇ（１００％）の標題化合物を泡状物として得た。
【０１８３】
【数１４】
【０１８４】 実施例２５ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノイブプロフェニル−２’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ４−ベンゾイルシチジン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２５） 室温においてＣＨ3ＣＮ（８．０ｍｌ）中に溶解した化合物２４（１．０３ｇ
，０．９９ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（０．１２ｇ，０．９９ｍ
ｍｏｌ）との溶液に、ＣＨ3ＣＮ（７．０ｍｌ）とＣＨ2Ｃｌ2（３．０ｍｌ）中
に溶解した２，２’−ジチオビス（５−ニトロ−ピリジン）（０．３１ｇ，０．
９９ｍｍｏｌ）の溶液を加えて、続いてＣＨ3ＣＮ（８．０ｍｌ）中に溶解した
トリフェニルホスフィン（０．２６ｇ，０．９９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。得
られた混合物に、酸洗浄済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（４．３１ｇ，０．５０ｍｍｏｌ
）を加えて、混合物を約２時間振とうした。得られた樹脂をＣＨ2Ｃｌ2（ｘ３）
とエーテル（ｘ３）とによって洗浄した。次に、これをＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣａｐ Ａ（２６ｍｌ）及びＣａｐ Ｂ
（２６ｍｌ）溶液と一緒にして、１時間振とうした。樹脂を再び、ＣＨ2Ｃｌ2（
ｘ３）とエーテル（ｘ３）とによって洗浄して、真空下で一晩乾燥させた。最終
負荷は５０μｍｏｌ／ｇであると判明した。
【０１８５】 実施例２６ 化合物１４及び２０を組み入れたオリゴヌクレオチドの合成 配列番号：１（ＩＳＩＳ ２２６５５−１とＩＳＩＳ ２２６５６−１）及び
配列番号：２（ＩＳＩＳ ２７７００−１とＩＳＩＳ ２７７０１−１）をＭｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０１核酸合成系上で合成した。
【０１８６】
【表１】
【０１８７】 1下線付きヌクレオシドは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）を含有し、全て
のＣは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジンである。 標準２’−デオキシアミダイト（ＣＨ3ＣＮ中０．１Ｍ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）を配列番号：１（ＩＳＩＳ ２２６５５
−１とＩＳＩＳ ２２６５６−１）を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号：
２（ＩＳＩＳ ２７７００−１とＩＳＩＳ ２７７０１−１）を有するオリゴヌ
クレオチドとの合成に用いた。ホスホロアミダイト類、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’
−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ6−ベンゾイルアデノシン−３−Ｏ−アミダ
イト（ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキ
シエチル）−Ｎ4−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−アミダイト（
ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌｏｔ ＃Ｅ８０５−Ｐ−１７）、５’−Ｏ−ＤＭＴ
ｒ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ2−イソブチルグアノシン−３’−
Ｏ−アミダイト（ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌｏｔ ＃ＥＭＧ−Ｐ−１８Ｕ）及
び５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−２’−Ｏ−（２−メトキシルエチル）−５−メチルウリ
ジン−３’−Ｏ−アミダイト（ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌｏｔ ＃Ｅ１０５０
−Ｐ−１０）を合成に用いた。２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホロアミ
ダイトをＣＨ3ＣＮ（１００ｍｇアミダイト／１ ｍｌ ＣＨ3ＣＮ）中に溶解し
た。配列番号：１（ＩＳＩＳ ２２６５５−１）と配列番号：２（ＩＳＩＳ ２
７７００−１）の合成にはＬＣＡＡ−ＣＰＧ固体サポートとして、化合物１４を
用いた。配列番号：１（ＩＳＩＳ ２２６５６−１）と配列番号：２（ＩＳＩＳ
２７７０１−１）の合成にはＬＣＡＡ−ＣＰＧ固体サポートとして、化合物２
０を用いた。
【０１８８】 各オリゴヌクレオチドを約１ｘ２ｍｏｌの合成規模で合成した、これは各合成
のために約５０ｍｇの誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧを必要とした。ＤＭＴ保護基を
有する５’−ヒドロキシル基の脱保護をホスホロアミダイト・カップリングにつ
きトリクロロ酢酸（１．２ｍｌ，ＣＨ2Ｃｌ2中３％）を用いて行ない、続けてＣ
Ｈ3ＣＮ洗浄を行なった。次に、脱トリチル化ＬＣＡＡ−ＣＰＧに、アミダイト
（０．３ｍｌ）とＣＨ3ＣＮ中の１−Ｈ−テトラゾール（０．６ｍｌ，０．４９
Ｍ）とをデリバーした。カップリング時間(coupling time)は標準２’−デオキ
シホスホロアミダイトでは約５分間であり、新規なホスホロアミダイトでは約１
４分間であった。アミダイトをカップリング当り２回デリバーした。過剰なアミ
ダイトをＣＨ3ＣＮによって洗い流した。ＣＨ3ＣＮ中の（２Ｒ，８ａＳ）−（＋
）−（１０−カンファースルホニル）オキサジリジン（０．５ｍｌ，３６Ｍ）を
４分間にわたってデリバーして、ホスホジエステル結合を酸化し、さらにＣＨ3
ＣＮ洗浄を行なった。未反応官能基をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中無水酢酸
とＴＨＦ中１−メチルイミダゾールとの５０：５０混合物（０．２ｍｌ／カップ
リング）によってキャップして、無水ＣＨ3ＣＮ洗浄を行なった。合成サイクル
（脱トリチル化、アミダイト・カップリング、酸化及びキャッピングを包含する
）を、所望の長さに達するまで続けた。各合成期間中にトリチルモニターによっ
てトリチル収量を追跡した。最終ＤＭＴ基は完全な状態で残された。
【０１８９】 合成後に、オリゴヌクレオチドを脱保護し、５５℃において約１６時間、濃縮
水酸化アンモニウム水溶液を用いて固体サポートから切断した。次に、オリゴヌ
クレオチドを固体サポートから濾別し、Ｓａｖａｎｔ ＡＳ１６０ Ａｕｔｏｍ
ａｔｉｃ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃにおいてアンモニアを蒸発させた。
【０１９０】 オリゴヌクレオチドの粗収量をＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ８４５２Ａ
Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ分光光度計で２６０ｎｍにおいて測定した。次に、粗サ
ンプルを完全性(integrity)に関して、質量分光測定（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃ
ｋａｒｄ エレクトロスプレー質量分析計）と、毛管ゲル電気泳動（Ｂｅｃｋｍ
ａｎｎ Ｐ／ＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ５０００）と、高速液体クロマトグラフィ
ー（Ｗａｔｅｒｓ ９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ ＨＰＬＣ
Ｓｙｓｔｅｍ）とによって分析した。トリチル−オン オリゴヌクレオチド(tri
tyl-on oligonucleotides)をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）によって、逆相プロトコ
ール（ＨＰＬＣ条件：９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ；Ｗａｔｅ
ｒｓ Ｃ4 Ｄｅｌｔａ Ｐａｋカラム（７．８ｘ３００ｍｍ，１５，３００Å
）；溶媒Ａ＝５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ＝７．０；溶媒Ｂ＝
１００％ＣＨ3ＣＮ；２．５ｍｌ／分流量；勾配：最初の５分間は５％Ｂ、次の
５５分間にわたって６０％までＢが直線的に増加）を用いて、精製した。適当な
ＨＰＬＣフラクションを回収し、完全に蒸発させ、室温における水中８０％酢酸
中で約１時間脱トリチル化してから、さらに１回蒸発させた。遊離トリチルと過
剰な塩とを除去するために、脱トリチル化オリゴをアンモニア水溶液中に溶解し
て、溶媒として水を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂に通過させた。サ
ンプルをＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｓｕｐｅｒ Ｆｒａｃフラクションコレ
クターによって回収した。精製済みオリゴヌクレオチドを純度に関して、ＣＧＥ
，ＭＳ及びＨＰＬＣ（流量：１．５ｍｌ／分、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａ
ｋ Ｃ4カラム，３．９ｘ３００ｍｍ，１５，３００Å）によって分析した。最
終収量を２６０ｎｍにおいて分光光度計によって判定した。
【０１９１】
【表２】
【０１９２】 2＝ＨＰＬＣ条件：９９１デテクターＨＰＬＣ系付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ
；Ｗａｔｅｒｓ Ｃ4 Ｄｅｌｔａ Ｐａｋカラム（３．９ｘ３００ｍｍ，１５
，３００Å）；溶媒Ａ＝５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ＝７．０
；溶媒Ｂ＝１００％ＣＨ3ＣＮ；１．５ｍｌ／分流量；勾配：最初の５分間は５
％Ｂ、次の５５分間にわたって６０％までＢが直線的に増加。Ｕ*は特定の配列
中の化合物を意味する、例えば、化合物１４と２０の両方を配列番号：１と配列
番号：２の各々中に用いた。
【０１９３】 実施例２７ 化合物３、６、９及び１２を組み入れたオリゴヌクレオチドの合成 配列番号：３を有する４種類のオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ２５１５２−
１、ＩＳＩＳ ２５１５３−１、ＩＳＩＳ ２５１５４−１及びＩＳＩＳ ２５
１５５−１）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０１核酸合成系で
合成した。これらのオリゴヌクレオチドを製造するために、下記修飾アミダイト
を用いた：２’−Ｏ−メトキシエチル−チミジン（ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ロ
ット＃Ｅ１０５０−Ｐ−１０）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジ
ン（ロット＃Ｓ１９４１／ＲＳ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−アデノシン（Ｒ
Ｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ロット＃ＥＭＡ−Ｐ−１４）、及び２’−Ｏ−メトキシ
−エチルグアノシン（ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ロット＃ＥＭＧ−Ｐ−１８Ｕ）
。ＩＳＩＳ ２５１５２−１の合成のためには化合物３を、ＩＳＩＳ ２５１５
３−１の合成のためには化合物６を、ＩＳＩＳ ２５１５４−１の合成のために
は化合物９を、ＩＳＩＳ ２５１５５−１の合成のためには化合物１２を、ＬＣ
ＡＡ−ＣＰＧ固体サポートとして用いた。
【０１９４】 アミダイトの必要量を、ＣＨ3ＣＮ中に溶解して（１００ｍｇ／ｍｌになるよ
うに、修飾ヌクレオシドを調製した）、乾燥バイアルに入れ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ ＥｘｐｅｄｉｒｅTM核酸合成系上の適当なポートに接続した。固体サポート
樹脂（６０ｍｇ）を２ｘ１μｍｏｌｅ規模合成用の各カラムに用いた。酸化工程
のために（＋）−（２Ｒ，８ａＳ）−１０（カンホリルスルホニル）オキサジリ
ジン（ＣＳＯ）を用いる標準ホスホロアミダイトプロトコールを用いて、合成を
行なった。トリチル報告は正常なカップリング結果を示した。
【０１９５】 合成後に、オリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム（水溶液）によって５
５℃において約１６時間脱保護して、Ｓａｖａｎｔ ＡＳ１６０ Ａｕｔｏｍａ
ｔｉｃ ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて濃縮し（アンモニアを除去するために）、濾
過して、ＣＰＧ−樹脂を除去した。粗サンプルをＭＳ、ＨＰＬＣ及びＣＥによっ
て分析し、続いて９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ ＨＰＬＣ系（
Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４分取規模カラム）上で下記溶媒：Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡ−Ａ
ｃ，ｐＨ７．０とＢ：ＣＨ3ＣＮを用いて精製した。精製済みオリゴヌクレオチ
ドを８０％酢酸によって室温において約３０分間脱トリチル化し、続いて真空下
で濃縮し、乾燥させた。オリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム中に溶解し
、溶媒として水を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を含有するカラムとＰｈａ
ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ ＳｕｐｅｒＦｒａｃフラクションコレクターとに通して
処理した。得られた精製済みオリゴヌクレオチドを蒸発させ、ＭＳ、ＣＥ及びＨ
ＰＬＣによって分析した。
【０１９６】
【表３】
【０１９７】 Ｔ★を除いて、全てのヌクレオチドは２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）で
あり；バックボーンは完全にホスホジエステルであり；複素環は非修飾である。
以下の表Ｖの場合と同様に、全てのＣは５−Ｍｅである。
【０１９８】
【表４】
【０１９９】 実施例２８ 化合物１６（パルミチル）と２１（イブプロフェニル）を組み入れたオリゴヌク
レオチドの合成 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０１核酸合成系上で配列番号：
４を有する２種類のオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３２３６１−１とＩＳＩＳ
３２３６２−１）を合成した。ＩＳＩＳ ３２３６１−１とさらにパルミチル
ＴＣダイマーとの合成のためのＡ−ＣＰＧ固体サポートとして化合物１６を用い
た。ＩＳＩＳ ３２３６２−１とイブプロフェニルＴＣダイマーとの合成のため
のＬＣＡＡ−ＣＰＧ固体サポートとして化合物２１を用いた。上記配列には、次
の修飾アミダイトを用いた：５’−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メ
チルウリジン β−シアノエチルホスホロアミダイト（ＰｒＯｌｉｇｏ，ロット
Ｎｏ．Ｓ３０４４）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−Ｍｅ−Ｃ Ｂｚ
アミダイト（ＢＳＲ−１０２６−８９）、２’−Ｏ−ＭＯＥ Ａ ホスホロアミ
ダイト（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ロットＮｏ．３１１１１９）及
び２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−（ｉＢｕ）Ｇアミダイト（ＢＳＲ−１０
２６−８４）。
【０２００】 アミダイトの必要量を、ＣＨ3ＣＮ中に溶解して（１００ｍｇ／ｍｌになるよ
うに、修飾ヌクレオシドを調製した）、乾燥バイアルに入れ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ ＥｘｐｅｄｉｔｅTM核酸合成系上の適当なポートに接続した。固体サポート
樹脂（６０ｍｇ）を２ｘ１μｍｏｌｅ規模合成用の各カラムに用いた。酸化工程
のためにＣＳＯを用いる標準ホスホロアミダイトプロトコールを用いて、合成を
行なった。トリチル報告は正常なカップリング結果を示した。合成後に、オリゴ
ヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム（水溶液）によって５５℃において約１６
時間脱保護した。これらをＳａｖａｎｔ ＡＳ１６０ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓ
ｐｅｅｄＶａｃを用いて蒸発させ（アンモニアを除去するために）、濾過して、
ＣＰＧ−樹脂を除去した。
【０２０１】 粗サンプルを実施例２７に上述したように分析し、精製し、脱保護した。乾燥
したオリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム中に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５を含有するカラムに溶離剤として水を用いて通して処理した。ダイマ
ーをＤｏｗｅｘと、次にＮＭＲ研究のためにＣｈｅｌｅｘカラムとを用いてさら
にそれぞれ精製した。得られた精製済みオリゴヌクレオチドを蒸発させ、ＭＳ、
ＣＥ（ＭＤＱ）及びＨＰＬＣによって分析した。
【０２０２】
【表５】
【０２０３】 Ｃ★を除いて、全てのヌクレオチドは２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）で
あり；バックボーンは完全にホスホジエステルであり；全てのＣが５−メチルシ
チジンである以外には、複素環は非修飾である。
【０２０４】
【表６】
【０２０５】 実施例２９ 化合物１８（パルミチル）と２０（イブプロフェニル）とを組み入れたオリゴヌ
クレオチドの合成 上記実施例に例示した方法に従って、表ＶＩＩに例示したように、化合物１８
と２０をオリゴヌクレオチド配列番号：４中に組み入れた。化合物４−１８はＩ
ＳＩＳ ３２３６１−１であり、化合物４−２０はＩＳＩＳ ３２３６２−１で
ある。
【０２０６】
【表７】
【０２０７】 4全てのヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル基を含有する（３’−末端
Ｃを除く）。全てのＣは５−メチル−Ｃである。Ｃ★＝３’−Ｏ−パルミチル−
アミノヘキシル−シチジン。Ｃ★★＝３’−Ｏ−イブプロフェニル−アミノヘキ
シル−シチジン。
【０２０８】 実施例３０ 化合物（２６）を組み入れたオリゴヌクレオチドの合成 化合物２６を３’−末端ヌクレオシドとして配列番号：４（ＩＳＩＳ ２９７
８２−１）中に組み入れた。合成はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８
９０１核酸合成装置上で行なった。オリゴヌクレオチド中への化合物２６の組み
入れは、オリゴヌクレオチドの３’−末端における２’−アミノプロピル基を介
したコンジュゲーションを可能にする。
【０２０９】
【表８】
【０２１０】 5全てのヌクレオシドは、Ｃ★を除いて、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）
を含有する。全てのＣは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジ
ンである。
【０２１１】 ヌクレオシドは商業的な供給源から購入した：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−
（２−メトキシエチル）−Ｎ6−ベンゾイルアデノシン−３−Ｏ−アミダイト（
ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ロット＃ＥＭＡ−Ｐ−０９）；５’−Ｏ−ＤＭＴ−２
’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ4−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３
’−Ｏ−アミダイト（ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ロット＃Ｅ８０５−Ｐ−１７）
；５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ2−イソブチルグ
アノシン−３’−Ｏ−アミダイト（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２７
−００２２−４２）；及び５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル
）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−アミダイト（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）。２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホロアミダイトを
ＣＨ3ＣＮ中に溶解した（１００ｍｇアミダイト／１ ｍｌ ＣＨ3ＣＮ）。化合
物２６をＬＣＡＡ−ＣＰＧ固体サポートとして、オリゴヌクレオチドの３’末端
においてその組み入れが行なわれた合成に用いた。
【０２１２】 オリゴヌクレオチドを約２ｘ２０μｍｏｌ合成規模で合成した、これはそれぞ
れ約３３３ｍｇの誘導体化ＬＣＡＡ−ＣＰＧを必要とした。固体サポート上のＤ
ＭＴ保護基をカップリング当りＣＨ2Ｃｌ2中のトリクロロ酢酸(tRI chemicalhlo
roacetic acid)（１０．６ｍｌ，３％）によって除去し、続いてＣＨ3ＣＮ洗浄
を行なった。次に、脱トリチル化ＬＣＡＡ−ＣＰＧに、アミダイト（１．２０ｍ
ｌ）と、ＣＨ3ＣＮ中の１−Ｈ−テトラゾール（１．８０ｍｌ、０．４９Ｍ）と
をデリバーした（新規なアミダイトのために約２４分間の総カップリング時間）
。アミダイト試薬をカップリング当り４回デリバーした。過剰なアミダイトをＣ
Ｈ3ＣＮによって洗い流した。無水ＣＨ3ＣＮ中の（２Ｒ，８ａＳ）−（＋）−（
１０−カンファースルホニル）オキサジリジン（２．４０ｍｌ，３６．４Ｍ）を
４分間にわたってデリバーして、ホスホジエステル結合を酸化し、続いてもう一
度ＣＨ3ＣＮ洗浄を行なった。反応しなかった官能基をテトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）中無水酢酸とＴＨＦ中１−メチルイミダゾールとの５０：５０混合物（１
．４０ｍｌ／カップリング）によってキャップし、続いて無水ＣＨ3ＣＮ洗浄を
行なった。合成期間中、トリチルモニターによって、トリチル収量を追跡した。
最終ＤＭＴ基は完全な状態で残された。
【０２１３】 合成後に、オリゴヌクレオチドを脱保護して、固体サポートから濃水酸化アン
モニウム（水溶液）とメチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，１
０％，水中４０重量％溶液）とによって５５℃において約１６時間かけて除去し
た。これらを次に固体サポートから濾別し、Ｓａｖａｎｔ ＡＳ１６０ Ａｕｔ
ｏｍａｔｉｃ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃにおいてアンモニアを蒸発させた。
【０２１４】 オリゴヌクレオチド粗収量をＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａ
Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ分光光度計で２６０ｎｍにおいて測定した。次に、粗サ
ンプルを完全性に関して、質量分光測定（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ エ
レクトロスプレー質量分析計）と、毛管ゲル電気泳動（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｐ／
ＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ５０００）と、高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅ
ｒｓ ９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ
）とによって分析した。トリチル−オン オリゴヌクレオチドをＷａｔｅｒｓ
ＨＰＬＣ系において、上述したような逆相によって精製した。（ＨＰＬＣ条件：
Ｗａｔｅｒｓ Ｃ4 Ｄｅｌｔａ Ｐａｋカラム（２５ｘ１００ｍｍ，１５，３
００Å）；溶媒Ａ＝５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ＝７．０；溶
媒Ｂ＝１００％ＣＨ3ＣＮ；５．０ｍｌ／分流量；勾配：最初の５分間は５％Ｂ
、次の５５分間にわたって６０％までＢが直線的に増加）。適当なＨＰＬＣフラ
クションを回収し、完全に蒸発させ、室温における水中８０％酢酸中で約１時間
脱トリチル化してから、さらに１回蒸発させた。遊離トリチルと過剰な塩とを除
去するために、脱トリチル化オリゴをアンモニア水溶液中に溶解して、溶媒とし
て水を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂に通過させた。サンプルをＰｈ
ａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｓｕｐｅｒ Ｆｒａｃフラクションコレクターによっ
て回収した。精製済みオリゴヌクレオチドを次に純度に関して、ＣＧＥ，ＭＳ及
びＨＰＬＣ（流量：１．５ｍｌ／分、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ4
カラム，３．９ｘ３００ｍｍ，１５，３００Å）によって分析した。最終収量を
２６０ｎｍにおいて分光光度計によって判定した。
【０２１５】
【表９】
【０２１６】 実施例３１ アミノプロピルリンカーを含有するオリゴヌクレオチドへのリガンドコンジュゲ
ーション 配列番号：４を有し、さらに３’−ヌクレオシドとして付着した化合物２６を
有するオリゴヌクレオチド（４−２６）を官能基の合成後コンジュゲーションの
ための基質として用いた。４種類の異なる官能基（ＰＥＧ2000、ＰＥＧ5000、ビ
オチン及びピレン）をコンジュゲートさせ、それぞれのオリゴヌクレオチドを精
製した。基はオリゴヌクレオチドの３’末端に２−Ｏ−アミノヘキシル連結基を
介して付着させる。
【０２１７】
【表１０】
【０２１８】 Ｃ★を除いて、全てのヌクレオチドは２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾される。全てのＣ
は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジンである。 （Ａ）ＰＥＧ2000，ＩＳＩＳ ３０１３０−１の方法 密封キャップした１３ｘ１００ｍｍパイレックス（登録商標）試験管中に含有
されたＩＳＩＳ ２９７８２−１（１００ＯＤｓ）をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中で一
晩乾燥させた。乾燥後に、２００ｍｇのＰＥＧ2000と炭酸水素ナトリウム（４０
０μｌ、０．２Ｍ）とをこのオリゴヌクレオチドに加え、一晩振とうした。この
反応混合物を水（３ｍｌ）中に溶解し、ＨＰＬＣによって精製した（ＨＰＬＣ条
件：Ｗａｔｅｒｓ Ｃ4 Ｄｅｌｔａ Ｐａｋカラム（７．８ｘ３００ｍｍ，１
５，３００Å）；溶媒Ａ＝５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ＝７．
０；溶媒Ｂ＝１００％ＣＨ3ＣＮ；流量２．５ｍｌ／分；勾配：最初の５分間は
５％Ｂ、次の５５分間にわたって６０％までＢが直線的に増加）。問題のフラク
ションを回収し、完全に蒸発させた。塩と遊離ＰＥＧ2000とを除去するために、
オリゴヌクレオチドをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂に通過させ、さらにＨＰ
ＬＣによって精製した（条件：溶媒Ａ＝５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム
，ｐＨ＝７．０；溶媒Ｂ＝１００％ＣＨ3ＣＮ；溶媒Ｃ＝Ｈ2Ｏ；流量２．５ｍｌ
／分；勾配：最初の１０分間は１００％Ａ、次の５分間にわたってＣが１００％
まで直線的に増加し、次の６０分間は一定に留まり、その後、２０分間Ｂが１０
０％まで直線的に増加する）。ＩＳＩＳ ３０１３０−１を純度に関して、Ｍａ
ｓｓ Ｓｐｅｃ、ＨＰＬＣ及びＣＧＥによって分析した。最終収量を２６０ｎｍ
において分光光度計によって判定した。
【０２１９】 （Ｂ）ＰＥＧ5000，ＩＳＩＳ ３０１３１−１の方法 密封キャップした１３ｘ１００ｍｍパイレックス（登録商標）試験管中に含有
されたＩＳＩＳ ２９７８２−１（１００ＯＤｓ）をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中で一
晩乾燥させた。乾燥後に、１５０ｍｇのＰＥＧ5000と炭酸水素ナトリウム（３５
０μｌ、０．２Ｍ）とを加え、一晩振とうした。この反応混合物を水（３ｍｌ）
中に溶解し、上述したように、ＨＰＬＣによって精製した。最終オリゴヌクレオ
チドを純度に関して、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ、ＨＰＬＣ及びＣＧＥによって分析し
た。最終収量を２６０ｎｍにおいて分光光度計によって判定した。
【０２２０】 （Ｃ）ビオチン、ＩＳＩＳ ３０１３２−１の方法 密封キャップした１３ｘ１００ｍｍパイレックス（登録商標）試験管中に含有
されたＩＳＩＳ ２９７８２−１（１００ＯＤｓ）をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中で一
晩乾燥させた。乾燥後に、２０ｍｇの（＋）−ビオチン Ｎ−スクシンイミジル
エステル（Ｆｌｕｋａ １４４０５）と炭酸水素ナトリウム（２００μｌ、０．
２Ｍ）とをオリゴヌクレオチドに加え、一晩振とうした。この混合物を一晩振と
うした。この反応混合物を水（３ｍｌ）中に溶解し、上述したように、ＨＰＬＣ
によって精製した。最終オリゴヌクレオチドを純度に関して、Ｍａｓｓ Ｓｐｅ
ｃ、ＨＰＬＣ及びＣＧＥによって分析した。最終収量を２６０ｎｍにおいて分光
光度計によって判定した。
【０２２１】 （Ｄ）ピレン、ＩＳＩＳ ３０１３３−１の方法 密封キャップした１３ｘ１００ｍｍパイレックス（登録商標）試験管中に含有
されたＩＳＩＳ ２９７８２−１（１００ＯＤｓ）をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中で一
晩乾燥させた。乾燥後に、２０ｍｇのスクシンイミジルエステル−１−ピレンブ
チレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ロット＃２７２１−３）と炭酸
水素ナトリウム（２００μｌ、０．２Ｍ）とをオリゴヌクレオチドに加えた。こ
の反応混合物を水（３ｍｌ）中に溶解し、上述したように、ＨＰＬＣによって精
製した。最終オリゴヌクレオチドを純度に関して、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ、ＨＰＬ
Ｃ及びＣＧＥによって分析した。最終収量を２６０ｎｍにおいて分光光度計によ
って判定した。
【０２２２】
【表１１】
【０２２３】 実施例３２ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノベンジルペニシリニル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチ
ルウリジン（２２） ベンジルペニシリンカリウム塩（０．５６ｇ，１．５２ｍｍｏｌ，Ｆｌｕｋａ
）をＤＭＦ（６ｍｌ）中にアルゴン雰囲気下、室温において懸濁させた。４−メ
チルモルホリン（０．３３ｍｌ，３．０４ｍｍｏｌ）とＴＢＴＵ（０．４９ｇ，
１．５２ｍｍｏｌ）とを加えると、懸濁液は透明な橙色溶液になった。３’−Ｏ
−ヘキシルアミノ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（１．０ｇ，１．５
２ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を一晩撹拌した。混合物を高真空下で蒸発させて
、標題化合物を得た。
【０２２４】 実施例３３ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノフェノキシメチルペニシリニル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−
５−メチルウリジン（２３） フェノキシメチルペニシリン酸（１．０６ｇ，３．０３ｍｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ
）をＤＭＦ（１０ｍｌ）中にアルゴン雰囲気下、室温において溶解した。４−メ
チルモルホリン（０．６７ｍｌ，６．０６ｍｍｏｌ）とＴＢＴＵ（０．９７ｇ，
３．０３ｍｍｏｌ）とを加え、続いて３’−Ｏ−ヘキシルアミノ−５’−Ｏ−Ｄ
ＭＴ−５−メチルウリジン（２．０ｇ，３．０３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を
一晩撹拌してから、蒸発させた。物質をシリカゲル・カラムクロマトグラフィー
によって、溶離剤として酢酸エチル：トリエチルアミン（１００／１，ｖ／ｖ）
を用いて精製して、０．４９６ｇの標題化合物を得た。
【０２２５】 実施例３４ スクシンイミジルフェノキシメチルペニシリン（２４） フェノキシメチルペニシリン酸（１．００ｇ，２．８５ｍｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ
）をＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）中にアルゴン雰囲気下、室温において懸濁させた。
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０７０ｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を加
えて、透明な溶液になるまで溶解させた。１，３−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（０．５９ｇ，２．８５ｍｍｏｌ）を加えて、約３０分間撹拌し、続いてＮ
−ヒドロキシスクシンイミド（０．３３ｇ，２．８５ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁
液を約３時間撹拌してから、濾過してＤＣＵを除去した。フィルターケーキをＣ
Ｈ2Ｃｌ2によって洗浄し、一緒にした有機相を水によって２回洗浄した（ＤＭＡ
Ｐを除去するため）。有機相を次に硫酸ナトリウム上で乾燥させ、褐色泡状物に
なるまで蒸発させて、１．２６ｇ（９８％）の標題化合物を得た。Ｃ20Ｈ21Ｎ3
Ｏ7Ｓとしての算出ＭＳ（ＥＳ+）４４７．１．実測ＭＨ+４４９．１（マイナー
ピーク）及びＭＨ2+２２４．９（メジャーピーク）．
【０２２６】 実施例３５ フェノキシメチルペニシリニルコンジュゲート化オリゴヌクレオチド配列番号：
５の製造 ５’−ヘキサノールアミン−ホスホジエステル−ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＣＣ Ｃ
ＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴ，配列番号：５（ＩＳＩＳ ３０８２）を自動化Ｄ
ＮＡ合成装置を用いて、標準方法と手法に従って製造した。合成の最後の工程に
おいて、５’−アミノ−モディファイヤー Ｃ６ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて、オリゴマーの５’−
末端に付着したアミノヘキシルホスホジエステルを導入した。全てのヌクレオチ
ド間結合は、ＣＳＯ酸化プロトコールによって導入されたＰ＝Ｏ（ホスホジエス
テル）結合であった。最終オリゴヌクレオチドを脱保護し、ＨＰＬＣ精製して、
５’−アミノヘキシルホスホジエステル連結オリゴヌクレオチドを得た。
【０２２７】 アミノヘキシル連結オリゴヌクレオチドを乾燥させて、白色粉末を得て、これ
を炭酸水素ナトリウム（２００μｌ，０．１Ｍ，水溶液）中に室温において溶解
した。ＤＭＦ（２００μｌ）中の化合物２４（２５ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）を
渦流させながら加えて、混合物を室温に一晩維持した。溶媒として水を用いて、
混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して処理した。回収したフラク
ションをシリンジ・ディスクフィルター（ｓｙｒｉｎｇｅ ｄｉｓｋ ｆｉｌｔ
ｅｒ）に通して濾過して、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣによってＣ−４カラムを用いて、
先行実施例に例示したように精製した。回収したフラクションを濃縮し、乾燥さ
せて、標題オリゴヌクレオチドを得た。
【０２２８】 実施例３６ フェノキシメチルペニシリニルコンジュゲート化完全２’−Ｏ−ＭＯＥオリゴヌ
クレオチド配列番号：３の製造 ５’−ヘキサノールアミン−ホスホジエステル−ＴＣ5MＴ ＧＡＧ ＴＡＧ
Ｃ5MＡＧ ＡＧＧ ＡＧＣ5MＣ5MＴ，配列番号：３（ＩＳＩＳ １１１５８）を
、標準方法及び手法に従って、自動化ＤＮＡ合成装置を用いて製造した。合成の
最後の工程において、５’−アミノ−モディファイヤー Ｃ６ホスホロアミダイ
ト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて、オリゴ
マーの５’−末端に付着したアミノヘキシルホスホジエステルを導入した。全て
のヌクレオチド間結合は、ＣＳＯ酸化プロトコールによって導入されたＰ＝Ｏ（
ホスホジエステル）結合であった。最終オリゴヌクレオチドを脱保護し、ＨＰＬ
Ｃ精製して、５’−アミノヘキシルホスホジエステル連結オリゴヌクレオチドを
得た。
【０２２９】 アミノヘキシル連結オリゴヌクレオチド（５０ＯＤ’ｓ）を炭酸水素ナトリウ
ム（２００μｌ，０．１Ｍ，水溶液）中に室温において溶解した。ＤＭＦ（１０
０μｌ）中の化合物２４（２５ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）を加え、得られた懸濁
液を渦流させて、室温に一晩静置させた。溶媒として水を用いて、混合物をＳｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して処理した。回収したフラクションをシリ
ンジ・ディスクフィルターに通して濾過して、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣに通してＣ−
４カラムを用いて、上記に例示したように精製した。これらの回収したフラクシ
ョンを蒸発させて、標題オリゴヌクレオチドを得た。
【０２３０】 実施例３７ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノアスピリニル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジ
ン２５の製造 アセチルサリチル酸（アスピリン）（０．５５ｇ，３．０３ｍｍｏｌ）をＤＭ
Ｆ（１０ｍｌ）中にアルゴン雰囲気下、室温において溶解した。４−メチルモル
ホリン（０．６７ｍｌ，６．０６ｍｍｏｌ）とＴＢＴＵ（０．９７ｇ，３．０３
ｍｍｏｌ）とを加え、続いて３’−Ｏ−ヘキシルアミノ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５
−メチルウリジン（２．００ｇ，３．０３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩撹
拌して、濃縮した。粗物質をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって溶
離剤として酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミン（７５／２５／１，ｖ／ｖ
／ｖ）を用いて精製して、１．３６ｇ（５５％）の標題化合物を透明な油状物と
して得た。Ｃ46Ｈ51Ｎ3Ｏ11としての算出ＭＳ（ＥＳ+）８２１．４；実測ＭＨ+
＋Ｎａ ８４４．４
【０２３１】 実施例３８ ３’−Ｏ−ヘキシルアミノアスピリニル−２’−Ｏ−スクシニル−５’−Ｏ−Ｄ
ＭＴ−５−メチルウリジン２６の製造 化合物２５（１．３１ｇ，１．５９ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（４
ｍｌ）中にアルゴン雰囲気下、室温において溶解した。トリエチルアミン（０．
２２ｍｌ，１．５９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０９７ｇ，０．８０ｍｍｏｌ）
及び無水コハク酸（０．２３９ｇ，２．３８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５０℃
の加熱ブロック中に一晩入れて、精製後に標題化合物を得た。
【０２３２】 実施例４０ スクシンイミジルアスピリン２７ アセチルサリチル酸（１．００ｇ，５．５５ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（０．１３
６ｇ，１．１１ｍｍｏｌ）とをＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）中にアルゴン雰囲気下、
室温において溶解した。ＤＣＣ（１．１４５ｇ，５．５５ｍｍｏｌ）を加えて、
混合物を約５分間撹拌し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．６３９ｇ，５．
５５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４時間撹拌し、濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2を加え、
混合物を水によって２回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮
し、乾燥させて、１．５８ｇ（１００％）の標題化合物を得た。
【０２３３】 実施例４１ アスピリニルコンジュゲート化オリゴヌクレオチド配列番号：３の製造 実施例３６によって製造した５’−ヘキサノールアミン−ホスホジエステル−
ＴＣ5MＴ ＧＡＧ ＴＡＧ Ｃ5MＡＧ ＡＧＧ ＡＧＣ5MＣ5MＴ，配列番号：３
（ＩＳＩＳ １１１５８）（１００ＯＤ’ｓ）（白色粉末に乾燥）を炭酸水素ナ
トリウム（０．１Ｍ，２００μｌ，水溶液）中に室温において溶解した。ＤＭＦ
（４００μｌ）中の化合物３８（２５ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）を加え、得られ
た懸濁液を渦流させてから、室温において一晩振とうした。得られた物質をＳｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通して溶媒として水を用いて処理した。回収し
たフラクションをシリンジ・ディスクフィルターに通して濾過して、ｐｒｅｐ−
ＨＰＬＣ Ｃ−４カラムに通して、上記に例示したように精製して、濃縮及び乾
燥後に標題オリゴヌクレオチドを得た。
【０２３４】 実施例４２ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するオリゴヌクレオチドの結合アフィニティ 結合曲線： ＩＳＩＳ−２７７００の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと標準方法
を用いて32Ｐによって末端標識した。組み入れられなかった標識をＧ２５カラム
を用いて除去して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。一定濃
度の標識オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）を、上昇する濃度のヒト血清アルブミ
ン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ，本質的に脂肪酸含まず，本質的にグロブリン含まず
，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｌｕｉｓ，ＭＯ
）と共にインキュベートし、ＰＢＳプラス０．１ｍＭ ＥＤＴＡと０．００５％
Ｔｗｅｅｎ８０中で２５°において１時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン時間を長くした実験は、完全な平衡が１時間未満に達成されることを実証し
た。
【０２３５】 アルブミン−オリゴヌクレオチド混合物を膜（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ ３
００００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に置き、〜２０％量がフィルターを通過する
まで３〜６分間３０００ｒｐｍ（７２５ｘｇ）において非常に穏やかに回転させ
た。初期ミックス（濾過前）のアリコートと濾液とをシンチレーション・カウン
ター中でカウントした。バックグラウンドに関して適当に修正した後に、遊離オ
リゴヌクレオチドと結合オリゴヌクレオチドとの濃度を算出した。
【０２３６】 アルブミンに比べて低濃度のオリゴヌクレオチドはアルブミン上の最も堅固な
(tightest)結合部位のみへの結合の検出を可能にする。したがって、結合オリゴ
ヌクレオチドの分率を総アルブミン濃度に対してプロットして、データは２状態
モデルに適合した：
【０２３７】
【数１５】
【０２３８】 式中、Ｏは未結合オリゴヌクレオチドであり、Ａは未結合アルブミンであり、
（ＯＡ）はオリゴヌクレオチド−アルブミン複合体であり、ＫAは平衡会合定数
である。
【０２３９】 容量曲線： 一定濃度のアルブミン（５０μＭ）を用い、標識オリゴヌクレオチドの濃度は
変化したことを除いて、結合曲線に用いた方法と同様な方法を用いて、容量曲線
を測定した。タンパク質 １モル当りに結合したオリゴヌクレオチドの平均モル
数、ｎL、を遊離オリゴヌクレオチド濃度に対してプロットした、これはそれぞ
れ、タンパク質当りのｎi結合部位と会合定数Ｋiを有する２種類の結合部位を有
するモデルに適合した。
【０２４０】 結果： 試験したオリゴヌクレオチドを表ＸＩＩに列挙する。非修飾デオキシジエステ
ルオリゴヌクレオチド（８６５１）とその３’イブプロフェンコンジュゲート（
２２６５５）、及び均一な２’−Ｏ−メトキシ−エチル修飾ホスホジエステルオ
リゴヌクレオチド（１１１５８）とその３’イブプロフェンコンジュゲート（２
７７００）とを比較した。図１と表ＸＩＩＩに見られるように、非コンジュゲー
ト化対照の結合は非常に弱かった（ＫD＞２００μＭ）。イブプロフェンコンジ
ュゲートの付加はアフィニティを実質的に高めた。ホスホジエステルコンジュゲ
ートの結合は、全ての修飾オリゴヌクレオチドの最も堅固な結合に含まれるホス
ホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチドの結合に匹敵するものであった（デー
タ示さず）。イブプロフェンコンジュゲートに対するＨＳＡの容量も測定した。
このコンジュゲートに関しては、０．７５：１（オリゴヌクレオチド：アルブミ
ン）の結合比率が得られた。これは、実測された最大容量が０．２：１であった
非コンジュゲート化オリゴヌクレオチドとは対照的である。
【０２４１】 結論： ホスホジエステルオリゴヌクレオチド（２’−デオキシと２’−Ｏ−メトキシ
エチルの両方）は弱いアフィニティ（ＫD＞２００μＭ）でＨＳＡに結合した。
これとは対照的に、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはより大きなアフィ
ニティ（ＫD３−３０μＭ）を有した。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの
３’末端へのイブプロフェンコンジュゲートの付加はアフィニティをホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドに典型的な範囲内に高めた。イブプロフェンコンジ
ュゲートに対するＨＳＡの容量が非コンジュゲート化オリゴヌクレオチドに対す
る容量よりも非常に大きいことが認められた。
【０２４２】
【表１２】
【０２４３】
【表１３】
【０２４４】 ★平衡定数は明細書中に述べるように図１のデータから得たものである。
【０２４５】 実施例４３ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノパルミチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−アデノシン２８ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−アデノシン（３．００ｇ，４
．４９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６０ｍｌ，無水）中に室温において溶解し
た。ジイソプロピルアミン（１．５６ｍｌ，８．９８ｍｍｏｌ）とパルミチン酸
ペンタフルオロフェニル−エステル（２．２８ｇ，５．３９ｍｍｏｌ）とを加え
て、混合物を一晩撹拌し、蒸発させた。粗物質をシリカカラム（２５０ｍｌ）上
で溶離剤としてＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を用いて精製して、〜４．０
７ｇ（〜１００％）の標題化合物を得た。
【０２４６】 実施例４４ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノパルミチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ6−ベンゾイルア
デノシン２９ 化合物２８（４．００ｇ，４．４１ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５０ｍｌ）中
にアルゴン雰囲気下、室温において溶解した。この溶液を氷温度に冷却し、クロ
ロトリメチルシラン（１．４０ｍｌ，１１．０２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を
氷温度において〜３０分間撹拌し、この時点で塩化ベンゾイル（１．５４ｍｌ，
１３．２３ｍｍｏｌ）を加えた。次に、これを室温に温度上昇させ、一晩撹拌し
た。混合物を氷温度に再び冷却し、冷水（１０ｍｌ）を加えた。これを１５分間
撹拌し、次に冷濃水酸化アンモニウム（１０ｍｌ）を加えた。この混合物を室温
に温度上昇させ、３０分間撹拌し、この後にこれを蒸発させた。水（２５ｍｌ）
を加え、混合物を酢酸エチル（ｘ３）によって抽出した。有機相を無水硫酸ナト
リウム上で乾燥させ、蒸発させた。３００ｍｌのシリカカラムを溶媒として酢酸
エチル−ヘキサン（５０：５０）を用いて稼動させて、１．８３ｇ（４１％）の
標題化合物を得た。
【０２４７】 実施例４５ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノパルミチル−３’−Ｏ−スクシネート−５’−Ｏ−Ｄ
ＭＴ−Ｎ6−ベンゾイルアデノシン３０ 化合物２９（１．１９ｇ，１．１８ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（０．２２ｇ，
１．７７ｍｍｏｌ），ジメチルアミノピリジン（０．０９ｇ，０．５９ｍｍｏｌ
）及びトリエチルアミン（０．２１ｍｌ，１．１８ｍｍｏｌ）を７ｍｌの１，２
−ジクロロエタン中に室温において溶解した。この反応混合物（ねじ込みキャッ
プトップ付き試験管中）を５５℃の加熱ブロックに１時間入れてから、室温に一
晩冷却させた。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ−ヘキサン，９０：１０）は、出発物質の存
在しないことを示した。ジクロロメタン（７０ｍｌ）を加え、混合物を冷１０％
クエン酸水溶液３０ｍｌずつで３回洗浄し、続いて水３０ｍｌずつで３回洗浄し
た。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて、１．２６ｇ（９７
％）の標題化合物を泡状物として得た。
【０２４８】 実施例４６ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノパルミチル−３’−Ｏ−スクシネート−５’−Ｏ−Ｄ
ＭＴ−Ｎ6−ベンゾイルアデノシン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ３１ 化合物３０（１．２４ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン
（０．１４ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）とを室温においてアセトニトリル（７．０ｍ
ｌ，無水）中に溶解した。別のフラスコにおいて、２，２’−ジチオビス−５−
ニトロピリジン（０．３５ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（４．
０ｍｌ）と無水ジクロロメタン（４．０ｍｌ）中に溶解した。次に、この溶液を
第１フラスコに加えた。第３フラスコにおいて、トリフェニルホスフィン（０．
２９ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６．０ｍｌ）中に溶解してから
、第１フラスコと一緒にした。最後に、酸洗浄済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（４．８６
ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を〜２時間振とうした。得られた樹脂を
ジクロロメタンとエーテルとによって３回洗浄した。次に、これをＣａｐ Ａ（
２１ｍｌ）とＣａｐ Ｂ（２１ｍｌ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ ＧｍｂＨからの溶液）と一緒にして、さらに１時間振とうした。次に、樹
脂を再びジクロロメタンとエーテルとによって３回洗浄して、真空下に一晩置い
て、乾燥させた。最終負荷は４８μｍｏｌ／ｇであると判明した。
【０２４９】 実施例４７ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノイブプロフェニル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−アデノシン３
２ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−アデノシン（３．００ｇ，４
．４９ｍｍｏｌ，ＲＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を無水ジクロロメ
タン（４０ｍｌ）中に室温において溶解した。ジイソプロピルアミン（１．５６
ｍｌ，８．９８ｍｍｏｌ）とイブプロフェン−ペンタフルオロフェニルエステル
（２．０１ｇ，５．３９ｍｍｏｌ，実施例２１）とを加えて、混合物を一晩撹拌
して、蒸発させた。粗物質を蒸発させ、２５０ｍｌのシリカカラム上で溶媒とし
てＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を用いて精製して、２．８９ｇ（７５％）
の標題化合物を得た。
【０２５０】 実施例４８ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノイブプロフェニル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ6−ベンゾ
イルアデノシン３３ 化合物３２（２．８７ｇ，３．３５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５０ｍｌ）中
にＡｒ（ｇ）下、室温において溶解した。この溶液を氷温度に冷却し、クロロト
リメチルシラン（１．０６ｍｌ，８．３８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を氷温度
において〜３０分間撹拌してから、塩化ベンゾイル（１．１７ｍｌ，１０．０５
ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温に温度上昇させ、一晩撹拌した。混合物
を氷温度に再び冷却し、冷水（１０ｍｌ）を加えて、１５分間撹拌した。次に冷
濃水酸化アンモニウム（１０ｍｌ）を加えた。この混合物を室温に温度上昇させ
、３０分間撹拌し、蒸発させた。水（２５ｍｌ）を加え、混合物を酢酸エチル（
ｘ３）によって抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。
得られた物質を溶離剤としての酢酸エチル−ヘキサン（９０：１０）によって２
００ｍｌのシリカカラムを用いて精製して、２．５０ｇ（７８％）の標題化合物
を得た。
【０２５１】 実施例４９ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノイブプロフェニル−３’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ6−ベンゾイルアデノシン３４ 化合物３３（２．００ｇ，２．０８ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（０．３１２ｇ
，３．１２ｍｍｏｌ），ジメチルアミノピリジン（０．１２７ｇ，１．０４ｍｍ
ｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２９ｍｌ，２．０８ｍｍｏｌ）を１，２−ジ
クロロエタン（９ｍｌ）中に室温において溶解した。この反応混合物（ねじ込み
キャップトップ付き試験管中）を５５℃の加熱ブロックに１時間入れてから、室
温に一晩冷却させた。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ，９０：１０）は、出発物
質の存在しないことを示した。ジクロロメタン（９０ｍｌ）を加え、混合物を冷
１０％クエン酸水溶液４０ｍｌずつで３回洗浄し、続いて水４０ｍｌずつで３回
洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、泡状物になるまで蒸発さ
せて、１．８６ｇ（８４％）の標題化合物を得た。
【０２５２】 実施例５０ ２’−Ｏ−ヘキシルアミノイブプロフェニル−３’−Ｏ−スクシネート−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ6−ベンゾイルアデノシン ＬＣＡＡ−ＣＰＧ３５ 化合物３４（１．８０ｇ，１．７０ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン
（０．２１ｇ，１．７０ｍｍｏｌ）とを室温において無水アセトニトリル（１０
．０ｍｌ）中に溶解した。別のフラスコにおいて、２，２’−ジチオビス（５−
ニトロピリジン）（０．５３ｇ，１．７０ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（７
．０ｍｌ）と無水ジクロロメタン（６．０ｍｌ）中に溶解した。次に、この溶液
を第１フラスコに加えた。第３フラスコにおいて、トリフェニルホスフィン（０
．４５ｇ，１．７０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８．０ｍｌ）中に溶解してか
ら、第１フラスコと一緒にした。最後に、酸洗浄済みＬＣＡＡ−ＣＰＧ（７．３
８ｇ，０．８５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を〜２時間振とうした。得られた樹脂
をジクロロメタンとエーテルとによって３回洗浄した。次に、これをＰｅｒＳｅ
ｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨからのＣａｐ Ａ（３０ｍｌ）と
Ｃａｐ Ｂ（３０ｍｌ）溶液と一緒にして、さらに１時間振とうした。次に、樹
脂を再びジクロロメタンとエーテルとによって３回洗浄して、真空下に一晩置い
て、乾燥させた。最終負荷は５０μｍｏｌ／ｇであると判明した。
【０２５３】 実施例５１ 配列番号：６と７の方法 上記配列に下記修飾アミダイトを用いた：２’−Ｏ−メトキシエチル−チミジ
ン（ＲＩＣ，Ｉｎｃ．，ロット＃Ｅ１０５０−Ｐ−１０）、２’−Ｏ−メトキシ
エチル−５−メチルシチジン（ロット＃Ｓ１９４１／ＲＳ）、２’−Ｏ−メトキ
シエチル−アデノシン（ロット＃ＥＭＡ−Ｐ−１４ ＲＩＣ）、及び２’−Ｏ−
メトキシエチル−グアノシン（ロット＃ＥＭＧ−Ｐ−１８Ｕ ＲＩＣ）。ＩＳＩ
Ｓ ＃１１１４９４−１と１１１４９６−１の合成のためには化合物３５（ＣＰ
Ｇに付着する）を、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ固体サポートとして用いた。ＩＳＩＳ ＃
１１１４９５−１と１１１４９７−１の合成のためにはＭＤＣ−１３９５−９４
（化合物３１）を、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ固体サポートとして用いた。
【０２５４】 アセトニトリル中に溶解したアミダイト（非修飾ヌクレオシドの１Ｍ溶液と修
飾ヌクレオシドの１００ｍｇ／ｍｌ）の必要量を、乾燥バイアルに入れ、Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ ＥｘｐｅｄｉｔｅTM核酸合成系上の適当なポートに接続した（Ｉ
ＳＩＳ ４）。６０ｍｇの固体サポート樹脂を２ｘ１μｍｏｌｅ規模合成用の各
カラムに用いた。ホスホロチオエートバックボーンのためにＩＢＰ−ＰＳ（１μ
ｍｏｌｅ）二重カップリングプロトコールを用いて、合成を行なった。トリチル
報告は正常なカップリング結果を示した。
【０２５５】 合成後に、オリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム（水溶液）によって５
５℃において約１６時間脱保護した。次に、これらをＳａｖａｎｔ ＡＳ１６０
Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて蒸発させ（アンモニアを除去
するために）、濾過して、ＣＰＧ−樹脂を除去した。
【０２５６】 粗サンプルをＭＳ、ＨＰＬＣ及びＣＥによって分析した。次に、９９１デテク
ター付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ ＨＰＬＣ系上でＷａｔｅｒｓ Ｃ１８ Ｐｒ
ｅｐ．規模カラム（Ｃ１８ Ｐｒｅｐ．）と下記溶媒：Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモ
ニウム水溶液及びＢ：アセトニトリルを用いて、“Ｃ１８ＰＲＥＰ”方法によっ
て精製した。
【０２５７】 精製後に、オリゴを蒸発乾燥させてから、８０％酢酸によって室温において約
３０分間脱トリチル化し、再び蒸発させた。これらのオリゴヌクレオチドを濃水
酸化アンモニウムを含む水中に溶解し、これらをＣ１８ Ｐｒｅｐ．カラムに溶
媒として水を用いて通すことによって、オリゴヌクレオチドを脱塩した(desalte
d)。次に、これらのオリゴヌクレオチドをカラムからアセトニトリルによって洗
浄した。得られた精製済みオリゴヌクレオチドを蒸発させ、ＭＳ、ＣＥ及びＨＰ
ＬＣによって分析した。
【０２５８】
【表１４】
【０２５９】 1全ての下線付きヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル基を含有する。ＡI BU ＝２’−Ｏ−イブプロフェニル−アミノヘキシル−アデノシン｛イブプロフェ
ニル＝（４−イソブチルフェニル）イソプロピオニル｝。ＡPAL＝２’−Ｏ−パ
ルミチル−アミノヘキシル−アデノシン。
【０２６０】
【表１５】
【０２６１】 実施例５２ コレステロールコンジュゲート化完全２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）ホス
ホジエステルオリゴヌクレオチド配列番号：４（ＩＳＩＳ＃１６９５２非コンジ
ュゲート化、ＩＳＩＳ＃１６２９６コンジュゲート化）ＴＣＴ ＧＡＧ ＴＡＧ
ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣ 均一な２’−ＭＯＥ−ホスホジエステル２０マーアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの３’−位置にコレステロール基をコンジュゲートすることの効果を判定す
るために、コンジュゲート化オリゴヌクレオチドと非コンジュゲート化オリゴヌ
クレオチドの両方を調製した。シトシン塩基の全ては５−メチルシトシンであり
、全てのリボシル糖は、２’−ヒドロキシシチジンである、コレステロールが付
着した３’−末端ヌクレオシドを除いて、２’−Ｏ−ＭＯＥであった。コレステ
ロール基の付着はコンジュゲート化オリゴヌクレオチドの３’−位置において６
−アミノヘキシルオキシリンカーを介してであった。コレステロール分子はリン
カーのアミノ基にカルバメート結合を介して付着する。
【０２６２】 コレステロールコンジュゲート化オリゴヌクレオチド（3Ｈ，ＩＳＩＳ−１６
２９６）の血漿濃度を親オリゴヌクレオチド（3Ｈ，ＩＳＩＳ−１６９５２，図
２）の血漿濃度と比較した。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて 3 Ｈ放射能標識オリゴヌクレオチドのＩ．Ｖ．ボラス投与を用いて、研究を行な
った。コンジュゲート化オリゴヌクレオチドでは、血漿濃度がより高レベルに維
持され、より緩慢な速度で減少した。
【０２６３】 Ｉ．Ｖ．ボラス投与後に、２種類の放射能標識オリゴヌクレオチドの組織分布
をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて調べた（図３）。親オリゴヌク
レオチドの殆ど全てが２４時間後に腎臓皮質中に見られ、基底量のみのオリゴヌ
クレオチドが試験した他の主要器官（血漿、肝臓、脾臓、小腸、大腸及び腸間膜
リンパ節(mesent LN)）に見られた。コンジュゲート化オリゴヌクレオチドの分
布プロフィルは、親オリゴヌクレオチドよりも非常に高い濃度での全ての器官へ
の分布を示した。
【０２６４】 尿によって排泄された投与量の割合を、親オリゴヌクレオチドとコンジュゲー
ト化オリゴヌクレオチドとに関して０〜６時間と６〜２４時間にわたって算出し
た（図４）。親オリゴヌクレオチド又はその代謝産物の約３８％が投与の最初の
６時間以内に排泄された。同じ時間内に、コンジュゲート化オリゴヌクレオチド
の約５％のみが排泄された。
【０２６５】 同様な研究において、配列番号：５（ＩＳＩＳ−３０８２）をタンパク質結合
を含めた多様な比較薬物動態研究のために５ｚと共に調製した。親化合物、２０
マーホスホロチオエートをホスホロチオエート及びホスホジエステル２’−プロ
ポキシ類似体、２’−プロポキシジエステルウィングとホスホロチオエートデオ
キシセンターとを有するキメラ類似体、並びに５’−オクタデシルアミン及び５
’−（２’−Ｏ−ヘキシルアミノ−カルボニル−オキシ−コレステロール）ホス
ホロチオエート類似体と比較した。この研究は一部では、親ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドに比べてコレステロール修飾オリゴヌクレオチドの減少した
排泄を報告した（Ｃｒｏｏｋｅ等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｓ，１９９６，２７７：９２３−９３７）。
【０２６６】 実施例５３ ２’−メトキシエトキシ置換ホスホジエステル（ＰＯ／ＭＯＥ）オリゴヌクレオ
チドに対するコンジュゲーションの効果 ＰＯ／ＭＯＥ−コレステロールコンジュゲート化オリゴヌクレオチド（１６２
９６）がＰＯ／ＭＯＥ類似体（１６９５２）に比べて改良された結合を示したが
、２’−メトキシエトキシ置換ホスホロチオエート（ＰＳ／ＭＯＥ）オリゴヌク
レオチド（１１１５９）に比べるとまだ弱い結合剤であることが観察された。し
かし、ＰＯ／ＭＯＥ−イブプロフェンコンジュゲート（２７７００）は非コンジ
ュゲート化ＰＯ／ＭＯＥ類似体（１６９５２）に比べて改良された結合を示した
のみでなく、ＰＳ類似体（３０６７）又はＰＳ／ＭＯＥ類似体（１１１５９）よ
りも堅固な結合をも示した。これらの結果は以下の表ＸＶＩに示す。
【０２６７】
【表１６】
【０２６８】 実施例５４ オリゴヌクレオチドへのヒトα1−酸性糖タンパク質（ＡＡＧ）結合薬物のコン
ジュゲーション 下記薬物部分がＡＡＧに結合する薬物として同定された：アセノクマロール、
クロルプロマジン、ジピリダモール、イミプラミン、メタドン、ペルフェナジン
、フェニルブタゾン、ピンドロール、プロゲステロン、プロパノロール、ＲＵ４
２６３３、ＲＵ３８４８６、チオリダジン、チクロピジン、トリフルオペラジン
、ワルファリン及びフェナチアジン。
【０２６９】 種々なフェノチアジンリガンドの中で、２−クロロ−１０−（２−カルボキシ
エチル）−フェノチアジンをコンジュゲート化リガンドとして例示のために選択
した。２−クロロ−１０−（２−カルボキシエチル）−フェノチアジン（Ｍｅｌ
ｉｋｉａｎ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６：２２８，１９７７
）を、ペンタフルオロフェノールとＤＣＣとを用いて、ペンタフルオロフェニル
エステルに転化させる。この化合物を次に３’−Ｏ−（６−アミノヘキシル）−
５’−Ｏ−ＤＭＴウリジンと縮合させて、さらにその制御多孔質ガラス誘導体に
転化させる。オリゴヌクレオチドを制御多孔質ガラスから、他の実施例に関して
述べたように、合成する。
【０２７０】 実施例５５ オリゴヌクレオチドとの細胞表面インテグリンのコンジュゲーションによって改
良された細胞取り込み フィブリノーゲン由来ペプチド（ＲＧＤとＲＧＤ様）を標準ペプチド合成方法
によってコンジュゲーションのために調製する。
【０２７１】 ペプチドＩ ＲＩＡＲＧＤＦＰＤＤＲＫ（配列番号：８）（ＲＧＤペプチド
） ペプチドＩＩ ＤＥＬＡＥＧＧＧＶＲＧＰＲＶ（配列番号：９） これらのペプチドを固相合成装置において合成した。アミノ末端端部に、６−
ヘキセン−カルボン酸をカップリングさせる。このペプチドの脱保護後に、オレ
フィン結合をＯｓＯ4／Ｎ−メチル−モルホリンオキシドを用いてアルデヒドに
転化させ、続いてＮａＩＯ4酸化した。アルデヒド含有ペプチドを−Ｏ−ＮＨ2連
結オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせる。表面プラスモン共鳴実験は、こ
れらのペプチドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドが細胞表面インテグリンに
結合することを実証した。
【０２７２】 実施例５６ タンパク質と、これらのタンパク質が結合する基質タンパク質 基質 ビタミンＤ結合タンパク質 ビタミンＤ コルチゾール結合グロブリン コルチゾール 性ホルモン結合タンパク質 性ホルモン チロキシン結合グロブリンと プレアルブミン チロキシン
【０２７３】 実施例５７ 小薬物のスクシンイミドエステルを調製するための一般的方法 ４ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の１ｍｍｏｌの酸と１ｍｍｏｌのＮ−ヒドロキシ−スク
シンイミドとの溶液に、１ｍｍｏｌのジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）を加えた。この反応混合物を室温において２日間撹拌した。沈殿を濾別して
、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を３ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、生成物を厚
層クロマトグラフィー：Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ、２ｍｍプレートによって、
ＣＨ2Ｃｌ2中０〜５％のＭｅＯＨの勾配を用いて精製した。適当なフラクション
を回収し、減圧下で溶媒を除去し、生成物を減圧下で一晩乾燥させた。
【０２７４】
【表１７】
【０２７５】
【数１６】
【０２７６】
【数１７】
【０２７７】
【数１８】
【０２７８】 １８０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のアセチルサリチル酸と、１２４ｍｇ（１ｍｍｏｌ
）のｐ−チオクレゾールと、２０６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＤＣＣを４ｍｌの無水
ＴＨＦ中で室温において２日間撹拌することによって、アセチルサリチル酸のチ
オクレゾールエステルを調製した。沈殿を濾別し、濾液を減圧下で濃縮し、残渣
を３ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、分取厚層クロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｔｒｏｎ，２ｍｍプレート、ＣＨ2Ｃｌ2中０〜１０％のＭｅＯＨの勾配を用
いる）によって精製した。２５６ｍｇ（９０％収率）の白色固体が得られた。Ｒ f ＣＨ2Ｃｌ2中５％ＭｅＯＨにおいて０．９５．Ｃ16Ｈ14Ｏ3Ｓ．計算値：２８
６．
【０２７９】
【数１９】
【０２８０】 １８０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のアセチルサリチル酸と、２６６ｍｇ（１ｍｍｏｌ
）のペンタクロロフェノールと、２０６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＤＣＣを４ｍｌの
無水ＴＨＦ中で室温において２日間撹拌することによって、アセチルサリチル酸
のペンタクロロフェノールエステルを調製した。沈殿を濾別し、濾液を減圧下で
濃縮し、残渣を３ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、分取厚層クロマトグラフィー（
Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ，２ｍｍプレート、ＣＨ2Ｃｌ2中０〜１０％のＭｅＯ
Ｈの勾配を用いる）によって精製した。２６０ｍｇ（６１％収率）の淡黄色固体
が得られた。Ｒf ＣＨ2Ｃｌ2中５％ＭｅＯＨにおいて０．９．Ｃ15Ｈ7Ｏ4Ｃｌ5 ．計算値：４２６．
【０２８１】
【数２０】
【０２８２】 実施例５８ ３’−（２’−アミノプロピル）−ＴＣＴ ＧＡＧ ＴＡＧ ＣＡＧ ＡＧＧ
ＡＧＣ ＴＣ（配列番号：４ ＩＳＩＳ−１６９５２）への小分子のコンジュゲ
ート化活性エステルの一般的製造方法
【０２８３】
【化７】
【０２８４】 分析規模での製造は下記：２０ｍｌのＨ2Ｏ中の１０ＯＤｓのトリエチルアン
モニウム形（ＴＥＡ）の配列番号：４−３’−ＮＨ2；１００ｍｌの０．５Ｍ
緩衝液及び２５５ｍｌのＤＭＳＯと共に５００ｍｌの反応量、ｐＨ９（０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3）を用いた。この溶液に、ＤＭＳＯ中０．０５Ｍの
活性化エステル溶液 １２５ｍｌを加えた。この混合物を渦流させ、得られた不
均質な混合物を室温に維持した。アリコートを２、４、６及び１８時間後にＲＰ
−Ｃ18ＨＰＬＣによって分析した。反応が６時間目に完成したことが判明した。
これらのコンジュゲートはオリゴヌクレオチドよりも高い保持時間を有した。
【０２８５】
【表１８】
【０２８６】
【数２１】
【０２８７】 実施例５９ アセチルサリチル酸のコンジュゲーション アセチルサリチル酸の種々な活性化エステルを用いて、アスピリンをコンジュ
ゲートした。ペンタクロロフェノールエステルを用いると、より良い収率が得ら
れ、アスピリンコンジュゲートが６０％収率で得られた。この反応系列において
試験した幾つかの活性化エステルに関しては、オリゴヌクレオチドのアミノ基の
アセチル化のみが観察された。
【０２８８】
【表１９】
【０２８９】 実施例６０ 配列番号：４−アセチルサリチル酸コンジュゲートの安定性 配列番号：４−アスピリンコンジュゲートの安定性を種々な溶液中で試験した
。種々な条件下のコンジュゲートの安定性を種々なインキュベーション時間にお
けるＲＰ−Ｃ18ＨＰＬＣによるコンジュゲート溶液の分析によって評価した。
【０２９０】
【表２０】
【０２９１】 実施例６１ コンジュゲートの分取規模合成 分取規模(Preparative scale)において、１００ＯＤｓのＴＥＡ形の配列番号
：４−３’−ＮＨ2と、１００ｍｌの０．５Ｍ 緩衝液と、ＤＭＳＯ中の０．１
Ｍ活性化エステル溶液 ４００ｍｌとの不均質溶液を混合し、室温において６時
間渦流させた。過剰な活性化エステルをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を通してのゲ
ル濾過によって除去した。コンジュゲートをＲＰ−Ｃ18ＨＰＬＣによって精製し
、脱塩した。収量：３０〜５０ＯＤｓのコンジュゲート。
【０２９２】 実施例６２ ＩＳＩＳ 配列番号：４−サリチル酸コンジュゲート ０．１Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ７．５中で配列番号：４−アスピリンコンジュ
ゲートの１８時間の加水分解によって、標題コンジュゲートを得た。
【０２９３】 実施例６３ ワルファリンコンジュゲーション Ｉ．Ｃ６アミノオキシリンカーとそのホスホロアミダイトとの合成を下記スキ
ームによって行なった。
【０２９４】
【化８】
【０２９５】 化合物２ １，６−ヘキサンジオール，８．５ｇ（７２ｍｍｏｌ）を最初に無水ピリジン
（２ｘ５０ｍｌ）と共に共沸蒸発(coevaporation)によって乾燥させ、次に高真
空下で一晩乾燥させた。残渣を６０ｍｌの乾燥１，４−ジオキサンと１０ｍｌの
乾燥Ｐｙとの混合物中に溶解し、８．０ｇ（２３．６ｍｍｏｌ）のＤＭＴ−Ｃｌ
を４回に分けて加えた。この反応混合物をＡｒ下、ＲＴにおいて２日間撹拌した
。この溶液を減圧下で濃縮し、残渣を３００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、５％
ＮａＨＣＯ3水溶液によって、次にブラインによって洗浄した。有機相を減圧下
で濃縮した。０．２％Ｐｙ／ＣＨ2Ｃｌ2中０〜１０％のＭｅＯＨの勾配を用いる
カラムクロマトグラフィーによる精製によって、黄色油状物（９ｇ，２１．４ｍ
ｍｏｌ）を得た。
【０２９６】
【数２２】
【０２９７】 化合物３ 一置換ヘキサンジオール（化合物２）（１．６８ｇ，４ｍｍｏｌ）と、（０．
７ｇ，４．３ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシフタルイミドと、（１．４ｇ，４．２
ｍｍｏｌ）のＰＰｈ3とを無水ジオキサン中に溶解した。この溶液に、０．７ｍ
ｌ（３．６ｍｍｏｌ）のジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）を滴加し
、反応混合物を室温において一晩撹拌した。５％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2、１％Ｅ
ｔ3Ｎ中でのＴＬＣは反応の完成を実証した（化合物２のＲf０．６に比べて、Ｒ f ０．９の新スポット）。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン／酢
酸エチル（４／１）中にＣＨ2Ｃｌ2を添加して溶解した。生成物を分取カラムク
ロマトグラフィーによって精製し、１％Ｅｔ3Ｎ、ヘキサン／酢酸エチル（３／
２）によって溶出して、減圧下での乾燥後に２ｇ（８９％）の無色ガラス状物を
得た。
【０２９８】
【数２３】
【０２９９】 化合物４ 化合物３，１．１ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ
（９：１）中に溶解し、安定な赤色が出現するまでジクロロ酢酸を加え、室温に
さらに４５分間維持した。反応混合物を５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3水溶液によ
ってクエンチさせ、５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2によって希釈した。有機相を５０ｍｌ
のブラインによって洗浄し、減圧下で濃縮した。生成物を分取厚層クロマトグラ
フィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ，プレート２ｍｍ）によって精製した。適当
なフラクションを回収し、減圧下で乾燥させて、０．３６ｇ（７０％）の白色固
体を得た。５％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2、１％Ｅｔ3Ｎ中でのＲf０．６．ＭＳ（ポ
ジティブＭｅＯＨ）：２６４．２［Ｍ＋Ｈ］+
【０３００】
【数２４】
【０３０１】 化合物５ Ａｒ下において４ｍｌの無水ＭｅＣＮ中の化合物４（３００ｍｇ，１．１４ｍ
ｍｏｌ）の溶液に、５４３ｍｌ（１．７５ｍｍｏｌ，１．５当量）のホスホロア
ミダイト試薬（２−シアノエチル テトライソプロピル−ホスホロジアミダイト
）と２．２８ｍｌ（１．０３ｍｍｏｌ，０．９当量）のＭｅＣＮ中０．４５Ｍテ
トラゾール溶液とを加えた。数秒間内に沈殿が出現した。１時間後に、３００ｍ
ｌのＥｔ3Ｎを反応混合物に加え、続いて３０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3水溶液によ
ってクエンチした。生成物を５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2によって迅速に抽出し、有機
相を３０ｍｌのブラインによって、次に３０ｍｌの水によって洗浄し、減圧下で
濃縮した。生成物を１％Ｅｔ3Ｎを加えたヘキサン中５〜５０％酢酸エチルの勾
配での分取厚層クロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ，プレート２ｍ
ｍ）によって精製した。適当なフラクションを回収し、減圧下で乾燥させて、１
８８ｍｇ（３５％）の無色油状物を得た。ヘキサン／酢酸エチル／Ｅｔ3Ｎ（７
０／３０／５）中でのＲf０．４．31Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ）δ１４８．２
，１４８．０．
【０３０２】 実施例６４ ワルファリンホスホロアミダイトの合成
【０３０３】
【化９】
【０３０４】 化合物７ −１０℃における６ｍｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2中の１ｍｍｏｌの化合物３に、１．
１当量のメチルヒドラジンを加えたところ、白色沈殿が形成された。１時間後に
、さらに５ｍｌの冷ＣＨ2Ｃｌ2を加え、反応混合物を迅速に濾過した。沈殿を５
ｍｌの冷ＣＨ2Ｃｌ2によって洗浄した。ワルファリン（３０８ｍｇ，１ｍｍｏｌ
）を濾液に加えて、溶液を室温において１時間静置させた。ＴＬＣはＣＨ2Ｃｌ2 中２％ＭｅＯＨ，０．１％Ｅｔ3Ｎ中でＲｆ０．８を有する新しい蛍光スポット
を示した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗物質をＣＨ2Ｃｌ2，１％Ｅｔ3Ｎ中
０〜１０％ＭｅＯＨの勾配を用いた分取厚層クロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｔｒｏｎ，プレート２ｍｍ）によって精製した。０．３６ｇ（５０％）の無
色油状物が得られた。
【０３０５】
【数２５】
【０３０６】 化合物８ １０ｍｌの無水ピリジン中の化合物７（４００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）と２
０ｍｇのＤＭＡＰの溶液に、塩化ピバロイル（８４ｍｌ，０．７ｍｍｏｌ）を加
えた。添加後直ちに沈殿が出現した、不均質な反応混合物を室温において２時間
撹拌した。ＣＨ2Ｃｌ2中０．５％ＭｅＯＨ、０．１％Ｅｔ3ＮでのＴＬＣは、出
発物質がＲf０．４５を有するより疎水性の物質に完全に転化したことを示した
。反応を５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3水溶液によってクエンチし、生成物を２ｘ
５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2によって抽出した。有機相を５０ｍｌのブラインによって
洗浄してから、減圧下で濃縮し、乾燥させて、４４０ｍｇの油状物を得た。この
油状物をさらに精製せずに脱トリチル化した。
【０３０７】 脱トリチル化 該油状物を２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（９／１）中に溶解し、溶液の色
が安定するまでジクロロ酢酸を加えた。ＴＬＣ：５％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2中で
Ｒf０．４を有する、新しい極性のより大きいスポットが出現した。１００ｍｌ
の５％ＮａＨＣＯ3水溶液の添加後に、生成物を５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2によって
抽出した。有機相を４０ｍｌのブラインによって洗浄して、減圧下で濃縮した。
ＣＨ2Ｃｌ2中０〜５％ＭｅＯＨの勾配を用いた分取厚層クロマトグラフィー（Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ，プレート２ｍｍ）による精製後に、生成物が得られた
。収量：２００ｍｇ（７１％）の油状物。ＮＭＲスペクトルは比率８０／２０で
の２シグナルセットを示す。ＭＳ（ポジティブＭｅＯＨ）：５０８［Ｍ＋Ｈ］+
【０３０８】
【数２６】
【０３０９】 化合物９ 化合物８（０．１８ｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を５ｍｌの無水ＭｅＣＮ中に溶解
した。この溶液に、１６９ｍｌ（０．５３ｍｍｏｌ，１．５当量）のホスホロア
ミダイト試薬と０．７１ｍｌ（０．３２ｍｍｏｌ，０．９当量）のＭｅＣＮ中０
．４５Ｍ １Ｈ−テトラゾール溶液とを加えた。反応混合物をＡｒ下、室温にお
いて３時間撹拌した。ヘキサン／酢酸エチル／Ｅｔ3Ｎ（７０／３０／５）中の
ＴＬＣは、Ｒf０．６を有する新しいスポットをＲf０．５を有する蛍光スポット
と共に示した、これはピバロイル保護基の消失に由来した。この反応混合物に２
００ｍｌのＥｔ3Ｎと、続いて３０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3水溶液を加えた。生成
物を５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2によって迅速に抽出して、有機相を３０ｍｌのブライ
ン、２０ｍｌの水によって洗浄して、減圧下で濃縮した。ＣＨ2Ｃｌ2、１％Ｅｔ 3 Ｎ中０〜１０％ＭｅＯＨの勾配を用いた分取厚層クロマトグラフィー（Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｔｒｏｎ，プレート２ｍｍ）による精製後に、１８６ｍｇ（０．２６
ｍｍｏｌ，７２％）の無色油状物が得られた。31Ｐ ＮＭＲ（１６１ＭＨｚ、Ｍ
ｅＣＮ）δ１４８．２，１４８．０．純度は９８％より大であった。
【０３１０】 実施例６５ ワルファリン含有制御多孔質ガラスＣＰＧ１０ トリチル化 ２’−Ｏ−（エチルオキシフタルイミド）５−メチルウリジン，２２３ｍｇ（
０．５ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの無水ＭｅＣＮとの共沸蒸発によって乾燥させ、次
に減圧下で一晩乾燥させた。乾燥した化合物を５ｍｌの無水ピリジン中に溶解し
、２０３ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）のＤＭＴＣｌを加えた。室温における１時間後
に、ＴＬＣは反応が不完全であることを示した。追加のＤＭＴＣｌ（４０ｍｇ，
０．１ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間後に、５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3水溶液
を加えて、生成物を２ｘ６０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2によって抽出した。有機層を減圧
下で乾燥させた。生成物を分取厚層クロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒ
ｏｎ，プレート２ｍｍ）によってＣＨ2Ｃｌ2、３％Ｅｔ3Ｎ中０〜１０％ＭｅＯ
Ｈの勾配を用いて精製した。適当なフラクションを回収し、減圧下で乾燥させて
、１００ｍｇ（２６％）の淡黄色油状物をＦＷ７４９を得た。
【０３１１】
【数２７】
【０３１２】 コハク酸エステル １ｍｌの無水１，２−ジクロロエタン中の１７０ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）の
ＤＭＴ−ヌクレオシドの溶液に、１５ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ，０．５当量）
のＤＭＡＰ、３５ｍｌ（０．２５ｍｍｏｌ，１．１当量）のＥｔ3Ｎ及び３４ｍ
ｇ（０．３４ｍｍｏｌ，１．５当量）の無水コハク酸を加えた。この反応を無水
条件下で３０分間、５０℃において加熱した。１，２−ジクロロエタン（１５ｍ
ｌ）を加えて、溶液を２ｘ１０ｍｌの氷冷１０％クエン酸と２ｘ１０ｍｌの水と
によって洗浄した。有機層を濃縮し、高真空下で乾燥させて、１４９ｍｇの黄色
泡状物を得た。この泡状物を２ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、５０ｍｌのヘキサ
ン／エーテル（１／１，ｖ／ｖ）中で沈殿させた。白色粉末が得られた：８７ｍ
ｇ（４５％）．ＦＷ８４９．Ｃ45Ｈ43Ｎ3Ｏ14．，ＣＨ2Ｃｌ2中５％ＭｅＯＨ，
０．１％Ｅｔ3Ｎ中でＲf０．３
【０３１３】
【数２８】
【０３１４】 負荷 １ｍｌのＭｅＣＮ／ＣＨ2Ｃｌ2（０．７５／０．２５，ｖ／ｖ）中の３８ｍｇ
（０．１２ｍｍｏｌ）の２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）の溶液に
、ヌクレオシドスクシネート（８７ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）と、１ｍｌの無水Ｍ
ｅＣＮ中の１２．２ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを加えた。この混合物に
、０．５ｍｌのＭｅＣＮ中の２６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のトリフェニルホスフ
ィンの溶液を加えて、赤色溶液を得た。短時間撹拌した後に、０．５ｇの酸洗浄
済みＬＣＡＡ−ＣＰＧを加えた。懸濁液をさらに１時間撹拌した。樹脂を２０ｍ
ｌずつのＭｅＣＮ、ＣＨ2Ｃｌ2及びジエチルエーテルによって連続的に洗浄し、
続いて乾燥させた。残留アミノ基を２ｍｌのＣａｐ ＡとＣａｐ Ｂ溶液による
２時間の処理によってキャップした。樹脂をＭｅＣＮによって洗浄し、減圧下で
乾燥させた。ヌクレオシド負荷をトリチル試験：３０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中３％ジ
クロロ酢酸中６．５ｍｇの樹脂によって測定した。ＤＭＴ+の吸光度を５０４ｎ
ｍ、ｅ＝７６ｍｌｘｍｍｏｌ-1ｘｃｍ-1において測定した。得られた負荷７２．
８ｍｍｏｌ／ｇ ＣＰＧ１１ １０ｍｇのＣＰＧ−１０を１ｍｌのピリジン中０．５Ｍ酢酸ヒドラジン(hydra
zine acetate)によって室温において１時間処理してから、１ｍｌのピリジン、
メタノール、ＭｅＣＮによって連続的に洗浄し、乾燥させた。ＤＭＦ中のワルフ
ァリン（１ｍｌ，１Ｍ）の溶液を樹脂に加え、混合物を室温において２４時間振
とうし、３ｘ１ｍｌのＤＭＦ、２ｘ１ｍｌのＭｅＣＮによって洗浄し、乾燥させ
た。
【０３１５】 分析 ３％ＣＦ3ＣＯＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2による脱トリチル化； ０．５ｍｌの濃アンモニア水溶液、室温、１時間による切断； ＲＰ−ＨＰＬＣ，Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ18，３．９ｘ３００ｍｍ，流量１．
５ｍｌ／分；Ａ：０．１Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ；Ｂ：８０％ＭｅＣＮ，勾配：３０分
間に０〜６０％Ｂ．
【０３１６】
【表２１】
【０３１７】 ＲＰ−ＨＰＬＣ分析後に、１０％のアセトン・アダクツと共にワルファリン・
アダクツが得られた（８０％収率）。ＭＳ（ポジティブＭｅＯＨ）：６０８．２
［Ｍ＋Ｈ］+．酢酸ヒドラジンによるフタルイミド基の切断後のアミノオキシエ
チルヌクレオシドとアセトンとの反応によって、基準アセトン・アダクツを調製
した。
【０３１８】 ＣＰＧ１２ ＣＰＧ１１（３０ｍｇ）をピリジン中１Ｍ 塩化ピバロイルと０．０５Ｍ Ｄ
ＭＡＰとによって３０分間処理した（シリンジ方法）。次に、樹脂を５ｍｌのピ
リジン、１０ｍｌのＭｅＣＮによって洗浄して、乾燥させた。
【０３１９】 実施例６６ オリゴヌクレオチド（Ｔ12）（配列番号：１０）の５’−末端へのワルファリン
のオリゴマー化後コンジュゲーション Ｔ12オリゴヌクレオチドの５’−位置におけるアミノオキシリンカーの組み入
れのために、ホスホロアミダイト５を用いた。カップリング条件：０．１Ｍアミ
ダイト溶液、カップル当り１．９ｍｌのアミダイト、１７分間カップリング時間
、ＣＳＯ酸化、４分間、３ｍｇの樹脂を濃アンモニア水溶液によって室温におい
て１時間処理した。ＥＳ−ＭＳ：予想３７８３．８；実測３７８３．７５（フタ
ルイミド脱保護オリゴに関して）。
【０３２０】 ワルファリンカップリング アミノオキシリンカーを有する樹脂（４０ｍｇ）を１ｍｌの０．５Ｍ酢酸ヒド
ラジン溶液によって３０分間処理した（シリンジ方法）。樹脂を５ｍｌのピリジ
ン、５ｍｌのＭｅＯＨ、１０ｍｌのＭｅＣＮによって洗浄して、乾燥させた。樹
脂をエッペンドルフ管(eppendorf tube)に入れ、ＭｅＣＮ／ＤＭＦ（２／１，ｖ
／ｖ）中０．１５Ｍワルファリン溶液 １ｍｌを加えた。混合物を２４時間振と
うして、樹脂を１ｍｌのＤＭＦ、３ｘ１ｍｌのＭｅＣＮによって洗浄して、乾燥
させた。室温における１時間と５５℃における８時間の濃アンモニア水溶液中で
の切断は、同様なＲＰ−ＨＰＬＣプロフィルとＥＳ−ＭＳスペクトル：予想４０
７３、実測４０７３を生じた。それ故、ワルファリン−コンジュゲートは標準切
断／脱保護条件下で安定性を示した。ＨＰＬＣ精製後に、コンジュゲーション効
率はｄ＞９５％であった。
【０３２１】 実施例６７ オリゴヌクレオチドの５’−末端におけるワルファリンホスホロアミダイトの組
み入れ 完全ジエステルチミジン１２マー（Ｔ12，Ｐ＝Ｏ）、１．５ｍｍｏｌ規模、０
．１Ｍアミダイト溶液、カップル当り３８０ｍｌの溶液、カップリング時間１４
分間、ＣＳＯ酸化。濃アンモニア水溶液中での切断後、ＥＳ−ＭＳスペクトル：
予想４０７３、実測４０７４．ＨＰＬＣ：ＲＰ Ｃ18、Ａ：０．１Ｍ ＮＨ4Ｏ
Ａｃ；Ｂ：８０％ＭｅＣＮ、勾配：６０分間内に０〜６０％Ｂ． ５’−ワルファリン−３０８２を下記条件から調製した： １ｍｍｏｌ規模、１４分間カップリング、切断及び脱保護：濃アンモニア水溶液
、８時間、５５℃．ＨＰＬＣ後、合成は不完全ではなかった。ＥＳ−ＭＳ：予想
６４６９．７；実測６４６９．５．精製後に、１６ＯＤｓが得られた。
【０３２２】 実施例６８ ワルファリンコンジュゲート オリゴマー化後コンジュゲーション ２’−フタルイミドオキシエチル−Ｔを有するＣＰＧ−１０から出発する配列
番号：５の２ｍｍｏｌ合成を標準ＣＳＯプロトコールによって行なった。樹脂を
１ｍｌの０．５Ｍ酢酸ヒドラジン溶液によって１時間処理し、次に５ｍｌのＰｙ
、５ｍｌのＭｅＯＨ、５ｍｌのＭｅＣＮによって洗浄し、減圧下で１５分間乾燥
させた。ＤＭＦ中１Ｍワルファリン溶液 １ｍｌを加えて、混合物を一晩振とう
した。この溶液をデカントし、樹脂を２ｘ１ｍｌのＤＭＦ、３ｘ１ｍｌのＭｅＣ
Ｎによって洗浄して、乾燥させた。切断及び脱保護を濃アンモニア水溶液を用い
て、５５℃において８時間行なった。ＨＰＬＣとＥＳ−ＭＳは２種類の主要生成
物：６０％のワルファリン・アダクツ（算出６６５１（ＤＭＴ−オン）；実測６
６５２）と４０％のアセトン・アダクツ（６４０１）を示した。ＨＰＬＣ精製と
脱トリチル化後に、３０ＯＤｓが得られた。ＥＳ−ＭＳ：予想６３４９；実測６
３４９． 配列番号：５−３’−ワルファリンを同様な方法で合成した。１０ＯＤｓの精
製オリゴヌクレオチドが得られた（ＨＰＬＣ条件の最適化によってこの収率を高
めることができる筈である）。ＥＳ−ＭＳ：予想８０１１、実測８０１３． ＣＰＧ１２を用いる合成 １４ｍｇの樹脂（ＣＰＧ１２）と、０．１５Ｍアミダイト溶液と、ＣＳＯ酸化
とを用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。切断及び脱保護：濃アンモニア水
溶液中５５℃における８時間は、配列番号：４の配列を生じた。トリチル−オン
形におけるＨＰＬＣ精製とトリチル−オフ形における精製後に、１２ＯＤｓのオ
リゴヌクレオチドが得られた。ＥＳ−ＭＳ：予想８０１１、実測８０１４．
【０３２３】 実施例６９ α2−マクログロブリン結合に対する化学物質(chemistry)の効果 種々な化学物質の結合アフィニティを、実施例４２に述べる方法を用いて、タ
ーゲットタンパク質としてのα2−マクログロブリンによって評価した。
【０３２４】
【表２２】
【０３２５】 表から知ることができるように、ＰＯバックボーンを有してさえも、オリゴマ
ーが例えばコレステロール、イブプロフェン及びパルミチン酸のようなリガンド
を有する場合に、オリゴマーは良好な結合アフィニティを示す。これらのリガン
ドのなかで、パルミチン酸はα2−マクログロブリンに対して有利な結合を示し
、イブプロフェンは血清アルブミンに対して有利な結合を示す。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、イブプロフェンコンジュゲート（ひし形）に対するＨＳＡ結合（Ｓｉ
ｇｍａ Ａ３７８２ロット９４Ｈ９３１８）の、非コンジュゲート化対照（三角
形）との比較を示すグラフである。各配列のホスホロチオエートＤＮＡ類似体に
関する結合曲線も示す（円形）。オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）を明細書に述
べるように上昇する濃度のＨＳＡと共にインキュベートした。
【図２】 図２は、イブプロフェンコンジュゲート（ひし形）に対するＨＳＡ（Ｓｉｇｍ
ａ Ａ３７８２ ロット９７Ｈ７６０４）容量の、非コンジュゲート化ホスホロ
チオエートＤＮＡ（三角形）のＨＳＡ容量に比べた比較を示すグラフである。容
量は、５０ｍＭ ＨＳＡにおいてオリゴヌクレオチドの濃度を高めながら測定し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C057 AA17 AA18 BB02 BB05 CC03 DD03 MM01 MM02 MM04 MM07 MM09 4C076 AA95 FF31 FF34 FF63 4C084 AA13 NA03 NA11 NA12 NA13 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA03 NA11 NA12 NA13

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タンパク質と相互作用するリガンドにコンジュゲートしたオ
    リゴマー化合物。
  2. 【請求項２】 前記リガンドが前記タンパク質に結合する、請求項１記載の
    オリゴマー化合物。
  3. 【請求項３】 前記リガンドが薬物部分である、請求項１記載のオリゴマー
    化合物。
  4. 【請求項４】 前記薬物部分がワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロ
    フェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プ
    ラノプロフェン、カルプロフェン、ナプロキセン、ダンシルサルコシン、２，３
    ，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ミコフェノール酸、
    ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツ
    レート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤又は抗生物質であ
    る、請求項３記載のオリゴマー化合物。
  5. 【請求項５】 前記薬物部分がアスピリン、フェニルブタゾン、イブプロフ
    ェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラ
    ノプロフェン、パルミチル又はカルプロフェンである、請求項３記載のオリゴマ
    ー化合物。
  6. 【請求項６】 前記薬物部分がイブプロフェンである、請求項３記載のオリ
    ゴマー化合物。
  7. 【請求項７】 前記タンパク質が細胞タンパク質、血清タンパク質又は血管
    タンパク質である、請求項１記載のオリゴマー化合物。
  8. 【請求項８】 前記タンパク質が血清タンパク質である、請求項７記載のオ
    リゴマー化合物。
  9. 【請求項９】 少なくとも１種類の血清タンパク質によって２０μＭ未満の
    Ｋdを有する、請求項８記載のオリゴマー化合物。
  10. 【請求項１０】 前記血清タンパク質がアルブミン、免疫グロブリン、α−
    ２−マクログロブリン、α−１−糖タンパク質又はリポタンパク質である、請求
    項８記載のオリゴマー化合物。
  11. 【請求項１１】 前記リガンドをオリゴマー化合物に付着させる連結基をさ
    らに包含する、請求項１記載のオリゴマー化合物。
  12. 【請求項１２】 前記連結基が６−アミノヘキシルオキシである、請求項１
    １記載のオリゴマー化合物。
  13. 【請求項１３】 前記化合物が、共有ヌクレオシド間結合によって連結され
    た複数個のヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１記載のオリ
    ゴマー化合物。
  14. 【請求項１４】 前記結合がホスホジエステル結合である、請求項１３記載
    のオリゴマー化合物。
  15. 【請求項１５】 前記結合がホスホロチオエート結合である、請求項１３記
    載のオリゴマー化合物。
  16. 【請求項１６】 前記結合が非リン含有結合である、請求項１３記載のオリ
    ゴマー化合物。
  17. 【請求項１７】 前記ヌクレオシドの少なくとも１つが２’−置換基を有す
    る、請求項１３記載のオリゴマー化合物。
  18. 【請求項１８】 前記２’−置換基がＯ−アルキルアルコキシである、請求
    項１７記載のオリゴマー化合物。
  19. 【請求項１９】 前記２’−置換基がメトキシエトキシである、請求項１８
    記載のオリゴマー化合物。
  20. 【請求項２０】 前記薬物部分がアリールプロピオン酸である、請求項３記
    載のオリゴマー化合物。
  21. 【請求項２１】 前記アリールプロピオン酸が式： 【化１】 ［式中、Ｒ1とＲ2の一方がＣ1−Ｃ12アルキルであり、Ｒ1とＲ2の他方がアリー
    ルである；又はＲ1とＲ2の両方がＣ1−Ｃ12アルキルである；又はＲ1とＲ2の両
    方がアリールである］を有する、請求項２０記載のオリゴマー化合物。
  22. 【請求項２２】 前記アリールプロピオン酸がキラルである、請求項２１記
    載のオリゴマー化合物。
  23. 【請求項２３】 前記キラルアリールプロピオン酸がＳ立体配置を有する、
    請求項２２記載のオリゴマー化合物。
  24. 【請求項２４】 前記キラルアリールプロピオン酸がＲ立体配置を有する、
    請求項２２記載のオリゴマー化合物。
  25. 【請求項２５】 前記アリール基が置換された又は非置換のベンジル、フェ
    ニル、キシリル、ナフチル、トルイル、ピレニル、アントラシル、フェナントリ
    ル、アズリル、フェネチル、シンナミル、ベンズヒドリル及びメシチルであり、
    前記置換基がヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アルコール、ベンジル、フ
    ェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン若しくはアルキル、置換
    されたアルキル、アリール、アルケニル若しくはアルキニル基である、請求項２
    １記載のオリゴマー化合物。
  26. 【請求項２６】 血清中のオリゴヌクレオチドの濃度を高める方法であって
    、 （ａ）血清タンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択する工程
    と； （ｂ）前記薬物部分を前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コン
    ジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する工程と； （ｃ）前記コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを前記血清に加える工程と を含む前記方法。
  27. 【請求項２７】 前記血清タンパク質がアルブミン、免疫グロブリン、α−
    ２−マクログロブリン、α−１−糖タンパク質又はリポタンパク質である、請求
    項２６記載のオリゴマー化合物。
  28. 【請求項２８】 前記血清タンパク質がアルブミンである、請求項２６記載
    のオリゴマー化合物。
  29. 【請求項２９】 前記薬物部分がアスピリン、ワルファリン、フェニルブタ
    ゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ
    ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ナプロキセン、ダンシルサル
    コシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ミコ
    フェノール酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタ
    シン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤又
    は抗生物質である、請求項２６記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記薬物部分がアスピリン、フェニルブタゾン、イブプロ
    フェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プ
    ラノプロフェン、パルミチル又はカルプロフェンである、請求項２６記載の方法
    。
  31. 【請求項３１】 前記薬物部分がイブプロフェンである、請求項２６記載の
    方法。
  32. 【請求項３２】 前記タンパク質がアルブミンである、請求項３１記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】 前記薬物部分がアリールプロピオン酸である、請求項２６
    記載のオリゴマー化合物。
  34. 【請求項３４】 前記アリールプロピオン酸が式： 【化２】 ［式中、Ｒ1とＲ2の一方がＣ1−Ｃ12アルキルであり、Ｒ1とＲ2の他方がアリー
    ルである；又はＲ1とＲ2の両方がＣ1−Ｃ12アルキルである；又はＲ1とＲ2の両
    方がアリールである］を有する、請求項３３記載のオリゴマー化合物。
  35. 【請求項３５】 前記アリールプロピオン酸がキラルである、請求項３４記
    載のオリゴマー化合物。
  36. 【請求項３６】 前記キラルアリールプロピオン酸がＳ立体配置を有する、
    請求項３５記載のオリゴマー化合物。
  37. 【請求項３７】 前記キラルアリールプロピオン酸がＲ立体配置を有する、
    請求項３５記載のオリゴマー化合物。
  38. 【請求項３８】 前記アリール基が置換された又は非置換のベンジル、フェ
    ニル、キシリル、ナフチル、トルイル、ピレニル、アントラシル、フェナントリ
    ル、アズリル、フェネチル、シンナミル、ベンズヒドリル及びメシチルであり、
    前記置換基がヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アルコール、ベンジル、フ
    ェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン若しくはアルキル、置換
    されたアルキル、アリール、アルケニル若しくはアルキニル基である、請求項３
    ４記載のオリゴマー化合物。
  39. 【請求項３９】 オリゴヌクレオチドに対する血清の容量を高める方法であ
    って、 （ａ）血清タンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択する工程
    と； （ｂ）前記薬物部分を前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コン
    ジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する工程と； （ｃ）前記コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを前記血清に加える工程と を含む前記方法。
  40. 【請求項４０】 前記血清タンパク質が前記薬物部分に対する結合部位を有
    するタンパク質である、請求項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記血清タンパク質が前記オリゴヌクレオチドに対する結
    合部位を有するタンパク質である、請求項３９記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記血清タンパク質が前記オリゴヌクレオチドに対する結
    合部位と、前記薬物部分に対する結合部位とを有するタンパク質であり；前記オ
    リゴヌクレオチドに対する前記結合部位が前記薬物部分に対する前記結合部位と
    は全く異なるものである、請求項３９記載の方法。
  43. 【請求項４３】 血管系の一部に対するオリゴヌクレオチドの結合を増強す
    る方法であって、 （ａ）一部は循環血清中に存在し、一部は血管系の非循環部分中に存在するタ
    ンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択する工程と； （ｂ）前記薬物部分を前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コン
    ジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する工程と； （ｃ）前記コンジュゲート化オリゴヌクレオチドを前記血管系に加える工程と
    を含む前記方法。
  44. 【請求項４４】 前記薬物部分がアスピリン、ワルファリン、フェニルブタ
    ゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ
    ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ナプロキセン、ダンシルサル
    コシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ミコ
    フェノール酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタ
    シン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤又
    は抗生物質である、請求項４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記薬物部分がアスピリン、フェニルブタゾン、イブプロ
    フェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プ
    ラノプロフェン、パルミチル又はカルプロフェンである、請求項４３記載の方法
    。
  46. 【請求項４６】 前記薬物部分がイブプロフェンである、請求項４３記載の
    方法。
  47. 【請求項４７】 前記薬物部分がアリールプロピオン酸である、請求項４３
    記載のオリゴマー化合物。
  48. 【請求項４８】 前記アリールプロピオン酸が式： 【化３】 ［式中、Ｒ1とＲ2の一方がＣ1−Ｃ12アルキルであり、Ｒ1とＲ2の他方がアリー
    ルである；又はＲ1とＲ2の両方がＣ1−Ｃ12アルキルである；又はＲ1とＲ2の両
    方がアリールである］を有する、請求項４７記載のオリゴマー化合物。
  49. 【請求項４９】 前記アリールプロピオン酸がキラルである、請求項４８記
    載のオリゴマー化合物。
  50. 【請求項５０】 前記キラルアリールプロピオン酸がＳ立体配置を有する、
    請求項４９記載のオリゴマー化合物。
  51. 【請求項５１】 前記キラルアリールプロピオン酸がＲ立体配置を有する、
    請求項４９記載のオリゴマー化合物。
  52. 【請求項５２】 前記アリール基が置換された又は非置換のベンジル、フェ
    ニル、キシリル、ナフチル、トルイル、ピレニル、アントラシル、フェナントリ
    ル、アズリル、フェネチル、シンナミル、ベンズヒドリル及びメシチルであり、
    前記置換基がヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アルコール、ベンジル、フ
    ェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン若しくはアルキル、置換
    されたアルキル、アリール、アルケニル若しくはアルキニル基である、請求項４
    ８記載のオリゴマー化合物。
  53. 【請求項５３】 細胞中へのオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進する
    方法であって、 （ａ）細胞膜上に存在し、少なくとも部分的に前記膜の外側に達するタンパク
    質を選択する工程と； （ｂ）前記タンパク質に結合することが知られている薬物部分を選択する工程
    と； （ｃ）前記薬物部分を前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせて、コン
    ジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する工程と； （ｄ）前記細胞を前記コンジュゲート化オリゴヌクレオチドに暴露させる工程
    と を含む前記方法。
  54. 【請求項５４】 前記タンパク質が細胞表面インテグリンである、請求項３
    ５記載の方法。
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