KR20150082643A - 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오티드 치료법 분야, 및 특히, 올리고뉴클레오티드의 특성을 향상시키기 위한, 예를 들어 치료 지수를 개선하기 위한, 분할가능한, 예를 들어, 콘쥬게이트, 표적화 기 또는 차단기에 공유 부착된 포스포디에스테르 영역의 용도에 관한 것이다.

Description

올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 {OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATES}
본 발명은 올리고뉴클레오티드 치료법 분야, 및 특히, 올리고뉴클레오티드의 특성을 향상시키기 위한, 예를 들어 치료 지수를 개선하기 위한, 콘쥬게이트, 표적화 기 또는 차단기의 용도에 관한 것이다.
관련기술
본 출원은 참조로서 본원에 인용된 EP12192773.5, EP13153296.2, EP13157237.2 및 EP13174092.0 로부터의 우선권을 주장한다.
배경기술
올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는, 충분한 생체 내 효험을 수득하기 위해 필수적인 것으로 간주되는, siRNAs 에서 사용하기 위해 집중적으로 평가되었다. 예를 들어, WO2004/044141 을 참조하면 RNA 간섭 경로를 통해 유전자 발현을 조절하는 변형된 올리고머성 화합물을 말한다. 올리고머성 화합물은 부착된 올리고머성 화합물의 약동학적 및 약역학적 특성을 변형하거나 개선할 수 있는 하나 이상의 콘쥬게이트 일부분 (moiety) 을 포함한다.
반대로, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 콘쥬게이션 또는 제형 없이 치료학적으로 투여된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 주요한 표적 조직은 간 및 신장이지만, 림프절, 비장, 골수를 비롯한 광범위한 다른 조직도 또한 안티센스 양상에 의해 접근가능하다.
WO2008/113832 에서는 측면 영역이 LNA 뉴클레오시드 사이에 또는 이에 근접하여 하나 이상의 포스포디에스테르를 포함하는, LNA 포스포로티오에이트 갭머 (gapmer) 올리고뉴클레오티드가 기재되어 있다. 올리고머는 우선적으로는 신장을 표적하였다.
WO2004/087931 에서는 산 분할가능 친수성 중합체 (PEG) 콘쥬게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 언급한다.
WO 2005/086775 에서는 치료 화학적 일부분, 분할가능 링커 및 라벨링 (labeling) 도메인을 사용하여 특정 장기에 대한 치료제의 표적화된 전달을 언급한다. 분할가능 링커는 예를 들어, 디설파이드 기, 펩티드 또는 제한 효소 분할가능 올리고뉴클레오티드 도메인일 수 있다.
WO 2009/126933 에서는 표적 리간드와 엔도솜분해성 (endosomolytic) 성분을 조합함에 의한, siRNA 핵산의 특이적 전달을 언급한다.
WO 2011/126937 에서는 소형 분자 리간드와의 콘쥬게이션을 통한 올리고뉴클레오티드의 표적화된 세포내 전달을 언급한다.
WO2009/025669 에서는 피리딜 디설파이드 일부분을 함유하는 중합체성 (폴리에틸렌 글리콜) 링커를 언급한다. 또한 Zhao et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 758 - 766 를 참조한다.
Chaltin et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 827 - 836 에서는 덴드리머성 (dendrimeric) 전달 시스템을 생성하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 양이온성 리포좀 내로 도입하는데 사용되는 콜레스테롤 변형된 단량체성, 2량체성 및 4량체성 올리고뉴클레오티드를 언급한다. 콜레스테롤은 라이신 링커를 통해 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이트된다.
기타 비-분할가능 콜레스테롤 콘쥬게이트는 siRNA 및 안타고미르 (antagomir) 를 간에 표적하는데 사용되었다 - 예를 들어, Soutscheck et al., Nature 2004 vol. 432 173 - 178 및 Krutzfeldt et al., Nature 2005 vol 438, 685 - 689 를 참조한다. 부분적으로 포스포로티올화된 (phosphorothiolated) siRNA 및 안타고미르의 경우, 간 표적 실체로서의 콜레스테롤의 사용이 생체 내 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드의 고도로 효과적인 표적화된 전달이 뉴클레아제 불안정 뉴클레오시드의 짧은 영역, 예컨대 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드에 의해 올리고뉴클레오티드에 연결된 자동유도 (homing) 장치의 사용에 의해 달성된다는 발견에 기반한다.
발명의 요약
본 발명은 하기 3 개의 영역을 포함하는 올리고머성 화합물을 제공한다:
i) 7 - 26 개의 근접 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 영역 (영역 A);
ii) 1 - 10 개의 뉴클레오티드를 포함하는 제 2 영역 (영역 B), 이것은 인터뉴클레오시드 연결 (internucleoside linkage) 기, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 통해, 제 1 영역의 5' 또는 3' 뉴클레오티드에 공유 연결됨, 이때
a. 제 1 및 제 2 영역 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 연결이고, 제 1 영역에 인접한 [예컨대 바로 옆에] 제 2 영역의 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA 임; 및/또는
b. 제 2 영역의 적어도 1 개의 뉴클레오시드는 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드임;
iii) 콘쥬게이트 일부분, 표적화 일부분, 반응성 기, 활성화 기, 또는 차단 일부분을 포함하는 제 3 영역 (C), 상기 제 3 영역은 제 2 영역에 공유 연결됨.
일부 구현예에서, 영역 A 및 영역 B 는 길이 8 - 35 개의 뉴클레오티드의 단일 근접 뉴클레오티드 서열을 형성한다.
일부 양상에서, 제 1 및 제 2 영역 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 제 2 영역의 고려되는 부분일 수 있다.
일부 구현예에서, 제 2 및 제 3 영역 사이에 인 함유 연결 기가 있다. 인 연결 기는, 예를 들어, 포스페이트 (포스포디에스테르), 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 보라노포스페이트 기일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 인 함유 연결 기는 제 2 영역 및 제 3 영역에 부착된 링커 영역 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 기는 포스포디에스테르이다.
따라서, 일부 양상에서, 올리고머성 화합물은 2 개 이상의 포스포디에스테르 기를 포함하고, 하나 이상은 본 발명의 상기 언급에 따른 것과 같고, 다른 것은 제 2 및 제 3 영역 사이에, 임의로 링커 기 및 제 2 영역 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 제 3 영역은 활성화 기, 예컨대 콘쥬게이션에서 사용하기 위한 활성화 기이다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 영역 A 및 B 및 활성화 기, 예를 들어, 제 3 영역에 대한 후속 연결에 적합한, 예컨대 콘쥬게이션에 적합한 중간체를 포함하는 활성화된 올리고머를 제공한다.
일부 구현예에서, 제 3 영역은 반응성 기, 예컨대 콘쥬게이션에서 사용하기 위한 반응성 기이다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 영역 A 및 B 및 반응성 기, 예를 들어 제 3 영역에 대한 후속 연결에 적합한, 예컨대 콘쥬게이션에 적합한 중간체를 포함하는 활성화된 올리고머를 제공한다. 반응성 기는 일부 구현예에서, 알코올 기의 아민, 예컨대 아민 기를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 영역 A 는 하나 이상의, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 포스포디에스테르 이외의 인터뉴클레오시드 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및 보라노포스페이트, 및 메틸포스포네이트, 예컨대 포스포로티오에이트로 이루어지는 군으로부터 (임의로 독립적으로] 선택되는, 인터뉴클레오시드 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 A 는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 A 내의 인터뉴클레오시드 연결의 적어도 50%, 예컨대 적어도 75%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 모든 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 이외의 것, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, 영역 A 내의 모든 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 이외의 것이다.
일부 구현예에서, 올리고머성 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 제 1 영역, 및 임의로 제 2 영역일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 일부 구현예에서, 영역 B 는 (핵산) 표적에 상보적인 근접 핵염기 서열의 일부를 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, 영역 B 는 표적에 대한 상보성이 결여될 수 있다.
대안적으로 언급되는, 일부 구현예에서, 본 발명은 포스포디에스테르 연결을 통해 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오시드에 연결된 하나 이상의 말단 (5' 및/또는 3') DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 갖는, 비-포스포디에스테르 연결된, 예컨대 포스포로티오에이트 연결된, 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드) 를 제공하며, 이 때 말단 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드는 임의로 링커 일부분을 통해, 콘쥬게이트 일부분, 표적화 일부분 또는 차단 일부분에 추가로 공유 연결된다.
본 발명은 본 발명의 올리고머성 화합물 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 아쥬반트를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 세포 내 핵산 표적의 억제에 사용하기 위한 본 발명에 따른 올리고머성 화합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 용도는 시험관 내이다. 일부 구현예에서, 용도는 생체 내이다.
본 발명은 약품에서 사용하기 위한, 예컨대 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 올리고머성 화합물을 제공한다.
본 발명은 의학적 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 올리고머성 화합물을 제공한다.
본 발명은 질환 또는 질병, 예컨대 대사성 질환 또는 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 올리고머성 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 올리고머성 화합물, 예컨대 본 발명의 올리고머성 화합물의 합성 (또는 제조) 방법을 제공한다:
a) 하기 기 중 하나가 부착되는 [고상] 올리고뉴클레오티드 합성 지지체 [제 3 영역] 를 제공하는 단계:
i) 임의로 링커 기 (-Y-)
ii) 콘쥬게이트, 표적화 기, 차단기, 반응성 기 [예를 들어, 아민 또는 알코올] 또는 활성화 기(X-) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기를 포함하는 기 X, 또는 -Y - X 기
및
b) 영역 A 에 후속하는 영역 B 의 [순차적] 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계,
및/또는:
c) 제 1 영역 (A) 및 제 2 영역 (B) 의 [순차적] 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계, 상기 합성 단계에 후속하는,
d) 제 3 영역 [포스포라미디트 포함] 을 첨가하는 단계:
i) 임의로 링커 기 (-Y-)
ii) 콘쥬게이트, 표적화 기, 차단기, 반응성 기 [예를 들어, 아민 또는 알코올] 또는 활성화 기(X-) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기를 포함하는 기 X, 또는 임의로 -Y - X 기
이후,
e) [고상] 지지체로부터 올리고머성 화합물을 분할하는 단계
이때, 임의로 상기 방법은 하기 단계로부터 선택되는 추가의 단계를 추가로 포함한다:
f) 제 3 기가 활성화 기일 때, 활성화 기를 활성화시켜 반응성 기를 생성하고, 이후 콘쥬게이트, 차단, 또는 표적화 기를, 임의로 링커 기 (Y) 를 통해 반응성 기에 첨가하는 단계;
g) 제 3 영역이 반응성 기일 때, 콘쥬게이트, 차단, 또는 표적화 기를, 임의로 링커 기 (Y) 를 통해 반응성 기에 첨가하는 단계.
h) 제 3 영역이 링커 기 (Y) 일 때, 콘쥬게이트, 차단, 또는 표적화 기를 링커 기 (Y) 에 첨가하는 단계
상기 단계 f), g) 또는 h) 는 올리고뉴클레오티드 합성 지지체로부터 올리고머성 화합물을 분할하기 전에 또는 후속하여 수행된다. 일부 구현예에서, 방법은 표준 포스포라미디트 화학을 사용하여 수행될 수 있고, 영역 X 및/또는 영역 X 또는 영역 X 및 Y 가, 포스포라미디트로서, 올리고머 내로 도입 전에, 제공될 수 있다. 본 발명의 방법의 비-제한적인 양상을 예증하는 도면 5 - 10 을 참조한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 올리고머성 화합물, 예컨대 본 발명의 올리고머성 화합물의 합성 (또는 제조) 방법을 제공한다:
제 1 영역 (A) 및 임의로 제 2 영역 (B) 의 [순차적] 올리고뉴클레오티드 합성 단계, 이때 합성 단계에 이어 제 3 영역 [포스포라미디트 포함] 영역 X (또한 영역 C 로도 불림), 또는 Y, 예컨대 콘쥬게이트, 표적화 기, 차단기, 작용기, 반응성 기 [예를 들어, 아민 또는 알코올] 또는 활성화 기 (X) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 군, 또는 -Y - X 기를 포함하는 영역을 첨가한 후 [고상] 지지체로부터 올리고머성 화합물의 분할이 뒤따름.
그러나 영역 X 또는 X-Y 가 고체 지지체로부터의 분할 후에 첨가될 수 있다는 것으로 인지된다. 대안적으로는, 합성 방법은 제 1 (A), 및 임의로 제 2 영역 (B) 의 합성 단계 이후, 지지체로부터의 올리고머의 분할 단계를, 제 3 영역, 예컨대 X 또는 X-Y 기의 올리고머에 대한 후속 첨가 단계와 함께 포함할 수 있다. 제 3 영역의 첨가는, 예를 들어, 지지체로부터의 분할 후, 임의로 X 또는 Y (존재하는 경우) 기 상의 활성화 기를 통해, X 또는 X-Y 기에 합류되는데 사용될 수 있는, 올리고머 합성 (지지체 상에) 의 최종 단계에서 아미노 포스포라미디트 단위를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 분할가능 링커가 뉴클레오티드 영역이 아닌 구현예에서는, 영역 B 는 영역 X (또한 영역 C 로서 언급됨) 의 일부를 형성하거나 또는 영역 Y (또는 이의 일부) 일 수 있는, 비-뉴클레오티드 분할가능 링커 예를 들어 펩티드 링커일 수 있다.
방법의 일부 구현예에서, 영역 X (예컨대, C) 또는 (X-Y), 예컨대 콘쥬게이트 (예를 들어, GalNAc 콘쥬게이트) 는 활성화 기, (활성화된 작용기) 를 포함하고, 합성 방법에서 활성화된 콘쥬게이트 (또는 영역 x, 또는 X-Y) 는 제 1 및 제 2 영역, 예컨대 아미노 연결된 올리고머에 첨가된다. 아미노 기는 표준 포스포라미디트 화학에 의해, 예를 들어 올리고머 합성의 최종 단계로서 (이것은 전형적으로 올리고머의 5' 말단에서 아미노 기를 산출할 것임), 올리고머에 첨가될 수 있다. 예를 들어 올리고뉴클레오티드 합성의 최종 단계 동안 보호된 아미노-알킬 포스포라미디트, 예를 들어 TFA-아미노C6 포스포라미디트 (6-(트리플루오로아세틸아미노)-헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포라미디트) 가 사용된다.
영역 X (또는 본원에서 언급되는 바와 같은 영역 C), 예컨대 콘쥬게이트 (예를 들어, GalNac 콘쥬게이트) 는 NHS 에스테르 방법을 통해 활성화될 수 있고, 이후 아미노연결된 올리고머가 첨가된다. 예를 들어 N-히드록시석신이미드 (NHS) 가 영역 X (또는 영역 C, 예컨대 콘쥬게이트, 예컨대 GalNac 콘쥬게이트 일부분에 대한 활성화 기로서 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조되는 올리고머를 제공한다.
일부 구현예에서, 영역 X 및/또는 영역 X 또는 영역 X 및 Y 는 포스페이트 뉴클레오시드 연결, 예컨대 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트를 비롯한 본원에 기재된 것들을 통해, 또는 대안적인 기, 예컨대 트리아졸 기를 통해, 영역 B 에 공유 합류 (연결) 될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 올리고머성 화합물을 포함하는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서의 질환 또는 질병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 적합하게는 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 유용한 양으로, 상기 표적 유전자를 발현하는 세포에 본 발명에 따른 올리고머성 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내에서의 표적 유전자의 발현의 억제 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 시험관 내이다 (즉, 유기체 내에서는 아니지만, (예를 들어, 생체 외) 세포 또는 조직 내일 수는 있음). 일부 구현예에서, 방법은 생체 내이다.
본 발명은 또한 8 - 24 개의 포스포로티오에이트 연결된 뉴클레오시드의 근접 영역을 포함하고, LNA 올리고머에 근접한 1 내지 6 개의 DNA 뉴클레오시드를 추가로 포함하는 LNA 올리고머를 제공하며, 이때 DNA 사이의, 및/또는 DNA 뉴클레오시드(들) 에 인접한 인터뉴클레오시드 연결은 생리학적으로 불안정하다, 예컨대 포스포디에스테르 연결이다. 이러한 LNA 올리고머는 본원에 기재된 바와 같은 콘쥬게이트의 형태일 수 있거나, 또는, 예를 들어 후속 콘쥬게이션 단계에 사용되어지는 중간체일 수 있다. 콘쥬게이트화 될 때, 콘쥬게이트는, 예를 들어 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 또는 토코페롤일 수 있거나 이를 포함할 수 있고, 또는 (비-뉴클레오티드) 탄수화물, 예컨대 GalNac 콘쥬게이트, 예컨대 GalNac 클러스터 (cluster), 예를 들어, triGalNac, 또는 본원에 기재된 바와 같은 또다른 콘쥬게이트일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명은 안티센스 올리고머 및 아시알로당단백질 수용체 표적화 일부분 콘쥬게이트 일부분, 예컨대 GalNAc 일부분 (이것은, 추가의 영역 (영역 C 로서 언급됨) 의 일부를 형성할 수 있음) 을 포함하는, LNA 안티센스 올리고머 (이것은 본원에서 영역 A 로서 언급될 수 있음) 를 제공한다. LNA 안티센스 올리고머는 7 - 30 개의, 예컨대 8 - 26 개의 뉴클레오시드의 길이일 수 있고, 이것은 하나 이상의 LNA 단위 (뉴클레오시드) 를 포함한다.
본 발명은 (비-뉴클레오시드) 탄수화물 일부분, 예컨대 탄수화물 콘쥬게이트 일부분에 공유 합류된 (예를 들어, 연결된) LNA 안티센스 올리고머를 제공한다. 일부 구현예에서, 탄수화물 일부분은 선형 탄수화물 중합체가 아니다. 탄수화물 일부분은 그러나 다-원자가, 예컨대, 예를 들어 2, 3, 4 일 수 있고 또는 4 개의 일치하는 또는 비-일치하는 탄수화물 일부분은, 임의로 링커 또는 링커들을 통해, 올리고머에 공유적으로 합류될 수 있다.
본 발명은 안티센스 올리고머 및 탄수화물을 포함하는 콘쥬게이트 일부분, 예컨대 탄수화물 콘쥬게이트 일부분을 포함하는 LNA 안티센스 올리고머 (콘쥬게이트) 를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 LNA 올리고머성 화합물 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 아쥬반트를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 세포 내 핵산 표적의 억제에 사용하기 위한 본 발명에 따른 올리고머성 화합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 용도는 시험관 내이다. 일부 구현예에서, 용도는 생체 내이다.
본 발명은 약품에서 사용하기 위한, 예컨대 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 올리고머성 화합물을 제공한다.
본 발명은 의학적 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 올리고머성 화합물을 제공한다.
본 발명은 질환 또는 질병, 예컨대 대사성 질환 또는 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 올리고머성 화합물의 용도를 제공한다.
도 1: 활성화 기 (즉, 보호된 반응성 기 - 제 3 영역으로서) 에 부착된 본 발명의 올리고머의 비-제한적인 예시. 인터뉴클레오시드 연결 L 은, 예를 들어 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 예컨대 포스포디에스테르일 수 있다. PO 는 포스포디에스테르 연결이다. 화합물 a) 는 단일 DNA 또는 RNA 와 함께 영역 B 을 가지며, 제 1 및 제 1 영역 사이의 연결은 PO 이다. 화합물 b) 는 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 2 개의 DNA/RNA (예컨대, DNA) 뉴클레오시드를 갖는다. 화합물 c) 는 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 3 개의 DNA/RNA (예컨대, DNA) 뉴클레오시드를 갖는다. 일부 구현예에서, 영역 B 는 추가의 포스포디에스테르 DNA/RNA (예컨대, DNA 뉴클레오시드) 에 의해 추가로 확장될 수 있다. 활성화 기는 각각의 화합물의 죄측에 예시되어 있고, 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 또는 일부 구현예에서, 트리아졸 연결을 통해 영역 B 의 말단 뉴클레오시드에 임의로 연결될 수 있다. 화합물 d), e), & f) 는 영역 B 및 활성화 기 사이에 링커 (Y) 를 추가로 포함하고, 영역 Y 는 예를 들어, 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 또는 일부 구현예에서, 트리아졸 연결을 통해 영역 B 에 연결될 수 있다.
도 2: 도 1 에 제시된 바와 같은 동등한 화합물; 그러나 반응성 기가 활성화 기 대신에 사용된다. 반응성 기는, 일부 구현예에서, 활성화 기의 활성화 (예를 들어, 탈보호) 의 결과일 수 있다. 반응성 기는, 비-제한적인 예에서, 아민 또는 알코올일 수 있다.
도 3: 본 발명의 화합물의 비-제한적인 예시. 도 1 과 동일한 명명법. X 는 일부 구현예에서, 콘쥬게이트, 예컨대 친유성 콘쥬게이트 예컨대 콜레스테롤, 또는 본원에 기재된 바와 같은 또다른 콘쥬게이트일 수 있다. 또한, 또는 대안적으로는 X 는 표적화 기 또는 차단기일 수 있다. 일부 양상에서, X 는 활성화 기 (도 1 참조), 또는 반응성 기 (도 2 참조) 일 수 있다. X 는 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트를 통해 영역 B 에 공유 부착될 수 있거나, 또는 대안적인 연결, 예를 들어, 트리아졸 연결 (화합물 d), e), 및 f) 에서 L 참조) 을 통해 연결될 수 있다.
도 4. 화합물이 제 3 영역 (X) 및 제 2 영역 (영역 B) 사이에 임의의 링커를 포함하는, 본 발명의 화합물의 비-제한적인 예시. 도 1 과 동일한 명명법. 적합한 링커가 본원에 기재되어 있고, 예를 들어 알킬 링커, 예를 들어 C6 링커를 포함한다. 화합물 A, B 및 C 에서, X 및 영역 B 사이의 링커는 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트를 통해 영역 B 에 부착되거나, 또는 대안적인 연결, 예를 들어 트리아졸 연결 (Li) 을 통해 연결될 수 있다. 상기 화합물에서 Lii 는 제 1 (A) 및 제 2 영역 (B) 사이의 인터뉴클레오시드 연결을 나타낸다.
도 5a 및 b. 5b 는 본 발명의 화합물의 합성 방법의 비-제한적인 예를 보여준다. US 는 고체 지지체일 수 있는 올리고뉴클레오티드 합성 지지체를 나타낸다. X 는 제 3 영역, 예컨대 콘쥬게이트, 표적화 기, 차단기 등이다. 임의의 전-단계에서, X 는 올리고뉴클레오티드 합성 지지체에 첨가된다. 다르게는 X 가 이미 부착된 지지체가 수득될 수 있다 (i). 첫번째 단계에서, 영역 B (ii) 이후, 영역 A (iii) 가 합성되고, 이어서 올리고뉴클레오티드 합성 지지체로부터의 본 발명의 올리고머성 화합물의 분할 (iv) 이 후속된다. 대안적인 방법에서, 전-단계에는 영역 X 및 링커 기 (Y) 가 부착된 올리고뉴클레오티드 합성 지지체의 제공이 포함된다 (도 5a 참조). 일부 구현예에서, X 또는 Y (존재한다면) 는 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 또는 대안적인 연결, 예컨대 트리아졸 연결을 통해 영역 B 에 연결될 수 있다.
도 6. 제 3 영역 (X) 및 제 2 영역 (B) 사이에 링커 (Y) 를 포함하는 본 발명의 화합물의 합성 방법의 비-제한적인 예. US 는 고체 지지체일 수 있는 올리고뉴클레오티드 합성 지지체를 나타낸다. X 는 제 3 영역, 예컨대 콘쥬게이트, 표적화 기, 차단기 등이다. 임의의 전-단계에서, Y 는 올리고뉴클레오티드 합성 지지체에 첨가된다. 다르게는 Y 가 이미 부착된 지지체가 수득될 수 있다 (i). 첫번째 단계에서, 영역 B (ii) 이후, 영역 A (iii) 가 합성되고, 이어서 올리고뉴클레오티드 합성 지지체로부터의 본 발명의 올리고머성 화합물의 분할 (iv) 이 후속된다. 일부 구현예에서, (제시되는 바와 같이), 영역 X 는 분할 단계 (v) 후 링커 (Y) 에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, Y 는 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 또는 대안적인 연결, 예컨대 트리아졸 연결을 통해 영역 B 에 연결될 수 있다.
도 7. 활성화 기를 이용하는 본 발명의 화합물의 합성 방법의 비-제한적인 예. 임의의 전-단계에서, 활성화 기는 올리고뉴클레오티드 합성 지지체에 첨가되거나 (i), 또는 활성화 기를 가진 올리고뉴클레오티드 합성 지지체가 다르게 수득된다. 단계 ii) 에서 영역 B 가 영역 A 이후에 합성된다 (iii). 올리고머는 이후 올리고뉴클레오티드 합성 지지체로부터 분할된다 (iv). 중간체 올리고머 (활성화 기를 포함함) 가 그 다음 활성화될 수 있고 (vI) 또는 (viii), 임의로 링커 (Y) 를 통해 (ix) 제 3 영역 (X) 이 첨가된다 (vi). 일부 구현예에서, X (또는 존재하는 경우 Y) 는 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 또는 대안적인 연결, 예컨대 트리아졸 연결을 통해 영역 B 에 연결될 수 있다.
도 8. 2-작용성 올리고뉴클레오티드 합성 지지체가 사용되는 (i), 본 발명의 화합물의 합성 방법의 비-제한적인 예. 이러한 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 단계 (ii) - (iii) 의 초기 시리즈에서 합성된 후, 제 3 영역의 부착 (임의로 링커 기 Y 를 통해) 이 후속되고, 본 발명의 올리고머성 화합물이 이후 분할될 수 있다 (v). 대안적으로는, 단계 (vi) - (ix) 에서 제시되는 바와 같이, 제 3 영역 (임의로 링커 기 (Y) 를 가짐) 이 올리고뉴클레오티드 합성 지지체 (이것은 임의의 전-단계일 수 있음) 에 부착되거나 - 제 3 영역 (임의로 Y 를 가짐) 이 있는 올리고뉴클레오티드 합성 지지체가 다르게 제공되고, 올리고뉴클레오티드가 이후 합성된다 (vii - viii). 본 발명의 올리고머성 화합물이 이후 분할될 수 있다 (ix). 일부 구현예에서, X (또는 존재하는 경우 Y) 는 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 또는 대안적인 연결, 예컨대 트리아졸 연결을 통해 영역 B 에 연결될 수 있다. US 는 일부 구현예에서는, 방법 전에 (예컨대, 전-단계), 올리고뉴클레오티드의 독립적인 합성 및 지지체 (제시되는 대로) 에 대한 기 X, Y (또는 X 및 Y) 의 공유 부착 - 이것은 예를 들어 트리아졸 또는 뉴클레오시드 기를 사용하여 달성될 수 있음 - 을 가능하게 하는 양방향 (2-작용성) 기의 첨가 단계를 포함할 수 있다. 올리고머가 부착된, 양방향 (2-작용성) 기는 이후 지지체로부터 분할될 수 있다.
도 9. 본 발명의 화합물의 합성 방법의 비-제한적인 예: 초기 단계에서, 제 1 영역 (A) 에 이어서 (ii), 영역 B 가 합성된다. 일부 구현예에서, 제 3 영역은 이후, 임의로 포스페이트 뉴클레오시드 연결 (또는 예를 들어, 트리아졸 연결) 을 통해, 영역 B (iii) 에 부착된다. 본 발명의 올리고머성 화합물이 이후 분할될 수 있다 (iv). 링커 (Y) 가 사용되는 경우, 일부 구현예에서, 단계 (v) - (viii) 가 후속될 수 있다: 영역 B 의 합성 후, 링커 기 (Y) 가 첨가되고, 이후 (Y) 에 부착되거나 또는 후속 단계에서, 영역 X 가 첨가된다 (vi). 본 발명의 올리고머성 화합물이 이후 분할될 수 있다 (vii). 일부 구현예에서, X (또는 존재하는 경우 Y) 는 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 또는 대안적인 연결, 예컨대 트리아졸 연결을 통해 영역 B 에 연결될 수 있다.
도 10. 본 발명의 화합물의 합성 방법의 비-제한적인 예: 본 방법에서, 활성화 기가 사용된다: 단계 (i) - (iii) 는 도 9 에서와 같다. 그러나 올리고뉴클레오티드 합성 (단계 iii) 후, 활성화 기 (또는 반응성 기) 가, 임의로 포스페이트 뉴클레오시드 연결을 통해, 영역 B 에 첨가된다. 올리고뉴클레오티드는 이후 지지체로부터 분할된다 (v). 활성화 기가 이후에 활성화되어 반응성 기를 산출할 수 있고, 그 다음 제 3 영역 (X), 예컨대 콘쥬게이트, 차단기 또는 표적화 기가 반응성 기 (이것은 활성화된 활성화 기 또는 반응성 기일 수 있음) 에 첨가되어, 올리고머를 산출한다 (vi). (vii) - (viii) 에 제시되는 바와 같이, 분할 후, 링커 기 (Y) 가 첨가되고 (vii), 그 다음 (Y) 에 부착되거나 또는 후속 단계에서, 영역 X 가 첨가되어 올리고머를 산출한다 (viii). 대안적으로 단계 (ii) - (viii) 모두가 올리고뉴클레오티드 합성 지지체 상에 수행될 수 있고, 이러한 경우에 지지체로부터의 올리고머의 분할인 최종 단계가 수행될 수 있다는 것이 인식되어야만 한다. 일부 구현예에서, 반응성 기 또는 활성화 기는 인 뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트, 또는 대안적인 연결, 예컨대 트리아졸 연결을 통해 영역 B 에 연결될 수 있다.
도 11. 생체 내에서 콜레스테롤-콘쥬게이트를 이용한 ApoB mRNA 의 침묵화 (Silencing). 마우스에 1 mg/kg 의 단일 투여량의 비콘쥬게이트된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (#3833) 또는 상이한 링커와 함께 콜레스테롤에 콘쥬게이트된, 등몰량의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Tab. 3) 를 주입하고, 투여 후 1, 3, 7 및 10 일째에 희생시켰다. RNA 를 간 및 신장으로부터 단리하고, ApoB 특이적 RT-qPCR 에 적용하였다 A. GAPDH 에 대해 표준화되고, 동등한 식염수 대조군의 평균의 백분율로서 제시되는, 간 샘플로부터의 ApoB mRNA 의 정량화 B. GAPDH 에 대해 표준화되고, 동등한 식염수 대조군의 평균의 백분율로서 제시되는, 신장 샘플로부터의 ApoB mRNA 의 정량화.
도 12. 본 발명의 화합물에서 X-Y- 로서 사용될 수 있는 콜레스테롤 C6 콘쥬게이트를 나타낼 뿐 아니라, 예에서 사용되는 특정 화합물은 본 발명의 특정 화합물을 포함한다.
도 13. 실험에서 사용되는 콜레스테롤, 3가 GalNac, FAM, 엽산, 1가 GalNac 및 토코페롤 콘쥬게이트의 예 (예를 들어, 도 12 의 화합물).
도 14. 생체 내에서 콜레스테롤-콘쥬게이트를 이용한 ApoB mRNA 의 침묵화 (Silencing). 마우스에 1 mg/kg 의 단일 투여량의 비콘쥬게이트된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (#3833) 또는 상이한 링커와 함께 콜레스테롤에 콘쥬게이트된, 등몰량의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Tab. 3) 를 주입하고, 투여 후 1, 3, 7, 10, 13 및 16 일째에 희생시켰다. RNA 를 간 및 신장으로부터 단리하고, ApoB 특이적 RT-qPCR 에 적용하였다 A. GAPDH 에 대해 표준화되고, 동등한 식염수 대조군의 평균의 백분율로서 제시되는, 간 샘플로부터의 ApoB mRNA 의 정량화 B. GAPDH 에 대해 표준화되고, 동등한 식염수 대조군의 평균의 백분율로서 제시되는, 신장 샘플로부터의 ApoB mRNA 의 정량화.
도 15. 생체 내에서 간 및 신장에서의 특이적 LNA 올리고뉴클레오티드의 함량. 마우스에 1 mg/kg 의 단일 투여량의 비콘쥬게이트된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (#1) 또는 상이한 링커와 함께 콜레스테롤에 콘쥬게이트된, 등몰량의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Tab. 4) 를 주입하고, 투여 후 1, 3, 7, 10, 13 및 16 일째에 희생시켰다. LNA 올리고뉴클레오티드 함량을 LNA 기반 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.
도 16. 생체 내에서 콜레스테롤-콘쥬게이트를 이용한 PCSK9 mRNA 의 침묵화 (Silencing). 마우스에 10 mg/kg 의 단일 투여량의 비콘쥬게이트된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (#7) 또는 상이한 링커와 함께 콜레스테롤에 콘쥬게이트된, 등몰량의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Tab. 5) 를 주입하고, 투여 후 1, 3, 7 및 10 일째에 희생시켰다. RNA 를 간 및 신장으로부터 단리하고, PCSK9 특이적 RT-qPCR 에 적용하였다 A. BACT 에 대해 표준화되고, 동등한 식염수 대조군의 평균의 백분율로서 제시되는, 간 샘플로부터의 PCSK9 mRNA 의 정량화 B. BACT 에 대해 표준화되고, 동등한 식염수 대조군의 평균의 백분율로서 제시되는, 신장 샘플로부터의 PCSK9 mRNA의 정량화.
도 17 사용될 수 있는 트리-GalNac 콘쥬게이트의 예. 콘쥬게이트 1 - 4 는 4 개의 적합한 GalNac 콘쥬게이트 일부분을 예증하며, 콘쥬게이트 1a - 4a 는 콘쥬게이트를 올리고머 (영역 A 또는 생분할가능 (biocleavable) 링커, 예컨대 영역 B) 에 연결하는데 사용되는 부가적인 링커 일부분 (Y) 을 가진 동일한 콘쥬게이트를 말한다. 물결선은 올리고머에 대한 공유 연결을 나타낸다. 또한 제시되는 것은 콜레스테롤 및 토코페롤 콘쥬게이트 일부분 (5a 및 6a) 의 예이다. 물결선은 올리고머에 대한 공유 연결을 나타낸다.
도 18: 실시예 7a: FVII 혈청 단백질 수준
도 19: 실시예 7a: 제 4 일에 간 내 FVII mRNA 수준
도 20: 실시예 7a: 제 4 일에 간 및 신장 내 올리고뉴클레오티드 함량
도 21: 실시예 7b - FVII 혈청 단백질 수준
도 22: 제 24 일에 간 내 FVII mRNA 수준
도 23: 제 4 일에 간 및 신장 내 올리고뉴클레오티드 함량
도 24. 상이한 콘쥬게이트 및 PO-링커를 사용하는 ApoB mRNA 의 생체 내 침묵화.
마우스에 생분할가능 링커 없이, 디티오-링커 (SS) 또는 DNA/PO-링커 (PO) 가 있는, 상이한 콘쥬게이트와 함께 1 mg/kg 의 ASO 를 처리하였다. RNA 를 간 (A) 및 신장 샘플 (B) 로부터 단리하고, ApoB mRNA 녹 다운 (knock down) 에 대해 분석하였다. 데이터는 식염수에 대해 제시된다 (=1).
도 25. PO-링커가 있는 루프형 (looped) LNA ASO 로의 표적 X mRNA 의 시험관 내 침묵화.
Neuro 2a 세포에 각각 PO-링커가 없거나 있는 루프형 LNA ASO 를 처리하였다. 6 일 후, 짐노시스 (gymnosis) mRNA 를 추출하고, 표적 X mRNA 녹 다운에 대해 분석하였다. mRNA 발현을 거짓 (mock) 처리된 샘플의 백분율로서 제시한다.
본 발명은 (예를 들어, 1 - 10 개의) 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드(들) 을 포함하는 짧은 영역을 통해, 콘쥬게이트 기, 표적화 기, 반응성 기, 활성화 기, 또는 차단기에 공유 연결되는, 올리고머성 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
올리고머
본 발명은 세포 내에서 표적 핵산을 조절하는, 예컨대 억제하는데 사용하기 위해 올리고머성 화합물 (또한 본원에서 올리고머로서 언급됨) 을 이용한다. 올리고머는 8 - 35 개의 근접 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고 7 - 25 개의 근접 뉴클레오티드의 제 1 영역, 및 1 - 10 개의 근접 뉴클레오티드의 제 2 영역을 포함하며, 이 때, 예를 들어, 제 1 및 제 2 영역 사이의 인터뉴클레오시드 연결이 제 2 영역의 첫번째 (또는 유일한) DNA 또는 RNA 뉴클레오시드에 연결된 포스포디에스테르이거나, 또는 영역 B 는 하나 이상의 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 포함한다.
제 2 영역은, 일부 구현예에서, 포스포디에스테르 연결될 수 있는 추가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 제 2 영역은 예를 들어, 콘쥬게이트, 표적화 기 반응성 기, 및/또는 차단기일 수 있는 제 3 영역에 추가로 공유 연결된다.
일부 양상에서, 본 발명은 제 1 영역, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 콘쥬게이트 또는 작용기, 예를 들어, 표적화 또는 차단기를 연결하는, 불안정 영역, 제 2 영역의 제공에 기반한다. 불안정 영역은 하나 이상의 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 또는 RNA 를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머성 화합물은 분할가능 (불안정) 링커를 포함한다. 이와 관련하여, 분할가능 링커가 바람직하게는 영역 B (또는 일부 구현예에서, 영역 A 및 B 사이) 에 존재한다.
용어 "올리고머" 는 본 발명의 문맥에서, 2 개 이상의 뉴클레오티드 (즉, 올리고뉴클레오티드) 의 공유 연결에 의해 형성된 분자를 말한다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드 (단위) 가 또한 단량체 또는 단위로서 언급될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "뉴클레오시드", "뉴클레오티드", "단위" 및 "단량체" 는 상호교환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 또는 단량체의 서열을 말할 때, 염기 서열, 예컨대 A, T, G, C 또는 U 를 언급하는 것으로 인식될 것이다.
올리고머는 8 - 25 개, 예컨대 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 10 - 20 개의 뉴클레오티드 길이의 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 RNA (단위) 를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 화합물은, 제 1 영역, 또는 제 1 및 제 2 영역과 함께 (예를 들어, 단일 근접 서열로서) 선형 분자이거나 또는 선형 분자로서 합성된다. 올리고머는 따라서 단일 가닥 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 동일한 올리고머 내의 동등한 영역 (즉, 이중체) 에 상보적인, 예를 들어, 적어도 3, 4 또는 5 개의 근접 뉴클레오티드의 짧은 영역을 포함하지 않는다. 올리고머는, 일부 구현예에서, (본질적으로) 이중 가닥이 아닐 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 본질적으로 이중 가닥이 아니고, 예컨대 siRNA 가 아니다.
일부 구현예에서, 올리고머는 동일한 제 1 영역 내의 영역 (즉, 영역-내 이중체) 에 상보적인, 예를 들어, 적어도 3, 4 또는 5 개의 근접 뉴클레오티드의 짧은 영역을 포함하지 않는 제 1 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 첫번째 올리고머는 일부 구현예에서, 비-공유 연결된 상보성 가닥과 혼성화를 형성하지 않을 수 있다, 예를 들어, siRNA 의 일부를 형성하지 않는다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 올리고머성 화합물은 예를 들어, 제 1 영역이 siRNA 의 일부를 형성할 때 상보성 영역을 포함하지 않고, 또는 예를 들어, 제 3 영역이 앱타머 (aptamer) 또는 차단 올리고뉴클레오티드를 포함할 때, 본 발명의 올리고머성 화합물은 일부 구현예에서, 이중 가닥 핵산의 영역을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 예를 들어 3 개 이상, 예컨대 4 개 이상, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 6 개 이상의 뉴클레오티드의 길이의 이중체를 형성하는 이중 가닥 핵산의 영역은 제 3 영역 내에, 또는 제 3 영역 및 예를 들어 제 1 영역 사이에, 또는 일부 구현예에서, 제 2 영역, 또는 제 1 및 제 2 영역을 가로지르는 영역 (예를 들어, 제 3 영역이 올리고뉴클레오티드 차단 영역을 포함하는 경우) 에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머성 화합물은 (실질적으로) 상보적인 올리고뉴클레오티드와 이중체의 형태로 있지 않다 - 예를 들어, siRNA 가 아니다.
일부 구현예에서, 올리고머성 화합물은 LNA 올리고머, 예를 들어 안티센스 올리고머, 본원에서 정의되는 바와 같은 영역 B, 및 탄수화물 콘쥬게이트 (이것은 영역 C 로 언급될 수 있음) 를 포함하는 LNA 안티센스 올리고머 (이것은 본원에서 영역 A 로 언급될 수 있음) 이다. LNA 안티센스 올리고머는 7 - 30 개의, 예컨대 8 - 26 개의 뉴클레오시드 길이의 것일 수 있고, 이것은 하나 이상의 LNA 단위 (뉴클레오시드) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물 일부분은 선형 탄수화물 중합체가 아니다.
일부 구현예에서, 올리고머성 화합물은 LNA 올리고머, 예를 들어 안티센스 올리고머, 본원에서 정의되는 바와 같은 영역 B, 및 아시알로당단백질 수용체 표적화 일부분 콘쥬게이트 일부분, 예컨대 GalNAc 일부분 (이것은 영역 C 로 언급될 수 있음) 를 포함하는 LNA 안티센스 올리고머 (이것은 본원에서 영역 A 로 언급될 수 있음) 이다. 탄수화물 일부분은 다-원자가, 예컨대, 예를 들어 2, 3, 4 일 수 있고 또는 4 개의 일치하는 또는 비-일치하는 탄수화물 일부분은, 임의로 링커 또는 링커들 (예컨대, 영역 Y) 을 통해, 올리고머에 공유적으로 합류될 수 있다.
제 1 영역
일부 구현예에서, 제 1 영역은 핵산 기재 올리고머, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 영역은 7 - 25 개의 뉴클레오티드 길이의, 포스포로티오에이트 연결된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 제 1 영역은 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 (뉴클레오시드 유사체), 예컨대 하나 이상의 비시클릭 (bicyclic) 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA) 또는 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 영역의 뉴클레오시드 중 일부 또는 모두는 본원에 또한 뉴클레오시드 유사체로서 언급되는 변형된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 당-변형 (예를 들어, 리보오스 또는 데옥시리보오스 이외의 당 또는 당 대리물 일부분을 포함함) 된다.
일부 구현예에서, 제 1 영역은 안티센스 올리고머 (안티센스 올리고뉴클레오티드), 예컨대 핵산 표적에 상보적인 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고머이다.
일부 구현예에서, 제 1 영역은 갭머 (gapmer) 를 포함하거나 갭머이다. 일부 구현예에서, 제 1 영역은 믹스머 (mixmer) 를 포함하거나 믹스머이다. 일부 구현예에서, 제 1 영역은 토탈머 (totalmer) 를 포함하거나 토탈머이다.
일부 구현예에서, 제 1 영역은 하나 이상의, 예컨대 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 7 개, 적어도 8 개, 적어도 9 개, 적어도 10 개, 적어도 11 개, 적어도 12 개, 적어도 13 개, 적어도 14 개, 적어도 15 개, 적어도 16 개, 적어도 17 개, 적어도 18 개, 적어도 19 개, 적어도 20 개, 적어도 21 개, 적어도 22 개, 적어도 23 개, 적어도 24 개 또는 25 개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체는 (임의로 독립적으로, 비시클릭 뉴클레오시드 유사체 (예컨대, LNA), 및/또는 2' 치환된 뉴클레오시드 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 예컨대 (임의로 독립적으로) 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-AP, 2'-FANA, 2'-(3-히드록시)프로필, 및 2'-플루오로-DNA 단위, 및/또는 기타 (임의로) 당 변형된 뉴클레오시드 유사체, 예컨대, 모르폴리노, 펩티드 핵산 (PNA), CeNA, 비-연결된 핵산 (UNA), 헥시톨 핵산 (HNA). 비시클로-HNA (예를 들어, WO2009/100320 참조) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체는 이의 표적 핵산 (또는 상보적 DNA 또는 RNA 서열) 에 대한 제 1 영역의 친화성을 증가시킨다. 다양한 뉴클레오시드 유사체는 참조로서 인용된, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 올리고머, 예컨대 이의 제 1 영역, 예컨대 갭머, 믹스머 또는 토탈머는 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 영역은 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, LNA) 및/또는 2'-치환된 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 영역에 존재하는 뉴클레오시드 유사체는 모두 동일한 당 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 영역에 존재하는 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체는 비시클릭 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 7 개, 적어도 8 개, 적어도 9 개, 적어도 10 개, 적어도 11 개, 적어도 12 개, 적어도 13 개, 적어도 14 개, 적어도 15 개, 적어도 16 개, 예를 들어 모든 뉴클레오시드 유사체 (또는 토탈머 내에 모든 뉴클레오시드) 비시클릭 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA, 예를 들어, 베타-D-X-LNA 또는 알파-L-X-LNA (식 중, X 는 옥시, 아미노 또는 티오임), 또는 (R/S) cET, cMOE 또는 5'-Me-LNA 를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 기타 LNA 이다. 일부 구현예에서, 올리고머, 또는 이의 제 1 영역은 DNA 및 당 변형된 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 비시클릭 뉴클레오시드 유사체 및/또는 2'-치환된 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 DNA 및 LNA 뉴클레오시드 유사체를 포함한다.
WO05013901, WO07/027775, WO07027894 에서는 완전히 2'-치환된 올리고머, 예컨대 완전히 2'-O-MOE 를 언급한다. 일부 구현예에서, 올리고머의 제 1 영역은 2'-치환된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. WO07/027775 에서는 또한 microRNA 를 표적화하는데 사용하기 위한 MOE, LNA, DNA 믹스머를 언급한다.
일부 구현예에서, 제 1 영역, 또는 조합된 제 1 및 제 2 영역은 4 또는 5 개 초과의 연속 DNA 단위의 영역을 포함하지 않는다. 이러한 제 1 영역은 (본질적으로) RNAseH 를 모집할 수 없다.
제 1 영역은, 예컨대 5' 말단 또는 3' 말단 인터뉴클레오시드 연결, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 통해, 제 2 영역에 공유 연결된다. 따라서 포스포디에스테르 연결은 영역 A 의 5' 최대 뉴클레오시드 및 영역 B 의 3' 최대 뉴클레오시드 사이에, 및/또는 영역 A 의 3' 최대 뉴클레오시드 및 영역 B 의 5' 최대 뉴클레오시드 사이에 위치할 수 있다. 이와 관련하여, 일부 구현예에서, 하나는 영역 A 의 5' 말단에 하나는 영역 A 의 3' 말단에, 영역 A 에 공유 합류된 2 개의 영역 B 이 있다. 2 개의 영역 B 는 동일 또는 상이할 수 있으며, 이들은 동일 또는 상이한 제 3 영역에, 임의로 그리고 독립적으로 링커 (Y) 를 통해 공유 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 제 1 영역의 뉴클레오시드 중 일부 또는 모두는 본원에서 또한 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 당 변형된 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 비시클릭 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, LNA) 및/또는 2'-치환된 뉴클레오시드 유사체로서 언급되는 변형된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 영역에 존재하는 뉴클레오시드 유사체는 모두 동일한 당 변형을 포함하고, 예를 들어 모두 비시클릭 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA, 예를 들어, 베타-D-X-LNA 또는 알파-L-X-LNA (식 중, X 는 옥시, 아미노 또는 티오임), 또는 (R/S) cET, cMOE 또는 5'-Me-LNA 를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 기타 LNA 이다.
일부 구현예에서, 제 1 영역의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 이외의 하나 이상의 인터뉴클레오시드 연결을 포함하고, 예컨대 영역 A 중의 하나 이상의, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 75%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 100% 의 인터뉴클레오시드 연결이 포스포디에스테르 이외의 것이다. 일부 구현예에서, 포스포디에스테르 이외의 인터뉴클레오시드 연결은 황 함유 인터뉴클레오시드 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및 보라노포스페이트, 예컨대 포스포로티오에이트이다.
제 2 영역 (영역 B)
제 2 영역은 포스포디에스테르 연결을 통해 제 1 영역에 연결된 하나 이상의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 제 1 및 제 2 영역 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 영역 B 의 일부로서 간주된다.
일부 구현예에서, 제 2 영역은 적어도 1 내지 10 개의 연결된 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드를 포함하거나 이것으로 이루어진다. DNA/RNA 포스포디에스테르의 영역이 분할가능 링커의 제공에 중요하다고 간주되면서, 영역 B 가 또한 당-변형된 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 상기 제 1 영역에 언급된 것들을 포함하는 것이 가능하다. 그러나 일부 구현예에서, 영역 B 의 뉴클레오시드는 (임의로 독립적으로) DNA 및 RNA 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 영역 B 의 뉴클레오시드가 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 핵염기를 포함할 수 있다고 인식될 것이다. 영역 B 는 하나 이상의 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 (이것은 일부 구현예에서, 영역 A 에 인접한 첫번째 뉴클레오시드일 수 있음) 를 포함한다. 영역 B 가 다른 뉴클레오시드를 포함하는 경우, 영역 B 는 또한 포스포디에스테르 이외의 다른 뉴클레오시드 연결, 예컨대 (임의로 독립적으로) 포스포로티오에이트, 포스포디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸 포스포네이트를 포함할 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 영역 B 내의 모든 인터뉴클레오시드 연결은 포스포로티오에이트이다. 일부 구현예에서, 영역 B 의 모든 뉴클레오시드는 (임의로 독립적으로) 2'-OH 리보오스 당 (RNA) 또는 2'-H 당 - 즉, RNA 또는 DNA 를 포함한다.
일부 구현예에서, 제 2 영역은 적어도 1 내지 10 개의 (예를 들어, 포스포디에스테르) 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 (예를 들어, 포스포디에스테르) 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 영역 B 는 3 개 이하 또는 4 개 이하의 연속 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 (예컨대, DNA 뉴클레오시드) 를 포함한다. 이러한 영역 B 가 너무 짧아서 RNAseH 를 모집하지 않을 수 있으므로, 영역 B 가 표적에 상보적인 단일 근접 핵염기 서열의 일부를 형성하지 않는 경우, 중요할 수 있는 양상이다. 짧은 영역 B, 예를 들어, 1 - 4 nts 의 길이의 것이 또한 일부 구현예에서 바람직할 수 있는데, 이들이 서열 특이적 제한 효소의 표적이 아닌 것 같기 때문이다. 이처럼, 엔도뉴클레아제 분할에 대한 영역 B 의 감수성을 변화시키고, 따라서 생체 내에서, 또는 심지어 세포 내에서 활성 올리고머의 활성화 속도를 미세하게 조정하는 것이 가능하다. 적합하게는, 매우 빠른 활성화가 요구되는 경우에는, 더욱 긴 영역 B 및/또는 제한 효소의 인지 부위 (예를 들어, 세포 또는 조직 특이적 또는 차별적으로 발현됨) 를 포함하는 영역 B 가 사용될 수 있다.
예시에 예증되는 바와 같이, 영역 B 는, 예를 들어, 포스포디에스테르 연결, 및/또는 임의로 적합한 링커 기, 예컨대 본원에 제공된 것들을 포함할 수 있는 링커 기를 통해, 콘쥬게이트, 표적화 반응성 기, 활성화 기, 또는 차단기 (X) 에 콘쥬게이션될 수 있다. 예를 들어 포스페이트 뉴클레오시드 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포디티오에이트, 보라노포스페이트 또는 메틸포스포네이트) 또는 트리아졸 기. 일부 양상에서, 연결 기는 영역 A 및 B 사이의 연결 기와 동일하고, 포스포디에스테르 연결일 수 있다. 일부 양상에서, 연결 기는 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 구현예에서, 제 2 영역의 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드는 독립적으로 DNA 및 RNA 뉴클레오티드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제 2 영역의 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 제 2 영역의 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드이다.
제 2 영역의 문맥에서, 용어 DNA 및 RNA 뉴클레오시드는 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 염기 (또한 염기 유사체 또는 변형된 염기로서 언급됨) 를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제 2 영역은 기타 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 추가로 포함할 수 있다고 인식될 것이다. 일부 구현예에서, 제 2 영역은 오직 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 만을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 2 영역이 1 개 초과의 뉴클레오시드를 포함하는 경우, 제 2 영역 내의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 2 영역이 1 개 초과의 뉴클레오시드를 포함하는 경우, 제 2 영역 내의 인터뉴클레오시드 연결 모두는 포스포디에스테르 연결을 포함한다.
일부 구현예에서, 제 2 영역의 2 개 이상의 연속 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드 (예컨대, 적어도 3 또는 4 또는 5 개의 연속 DNA 뉴클레오티드) 이다. 일부 구현예에서, 제 2 영역의 2 개 이상의 연속 뉴클레오시드는 RNA 뉴클레오시드 (예컨대, 적어도 3 또는 4 또는 5 개의 연속 RNA 뉴클레오티드) 이다. 일부 구현예에서, 제 2 영역의 2 개 이상의 연속 뉴클레오시드는 하나 이상의 DNA 및 하나 이상의 RNA 뉴클레오시드이다. 영역 A 및 영역 B 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 일부 구현예에서, 영역 B 가 1 개 초과의 뉴클레오시드를 포함하는 경우, 하나 이상의 추가의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 - 예컨대 영역 A 에 인접한 2 (또는 3 또는 4 또는 5) 개의 뉴클레오시드 사이의 연결 기(들) - 이다.
제 2 영역은 한 면 (5' 또는 3') 상에는 제 1 영역, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 다른 면 (3' 또는 5') 상에 각각, 콘쥬게이트 일부분 또는 유사한 기 (예를 들어, 차단 일부분/기, 표적화 일부분/기 또는 치료적 소형 분자 일부분) 를 통해, 임의로 링커 기 (즉, 제 2 영역 및 콘쥬게이트/차단기 등 일부분 사이) 를 통해 옆에 위치한다.
이러한 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 식에 따라 설명될 수 있다:
5'-A-PO-B [Y)X- 3' 또는 3'-A-PO-B [Y)X- 5'
(식 중, A 는 영역 A 이고, PO 는 포스포디에스테르 연결이고, B 는 영역 B 이고, Y 는 임의의 연결 기이고, X 는 콘쥬게이트, 표적화, 차단기 또는 반응성 또는 활성화 기임).
일부 구현예에서, 영역 B 는 3'- 5' 또는 5'-3': i) 영역 A 의 5' 뉴클레오시드에 대한 포스포디에스테르 연결, ii) DNA 또는 RNA 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 뉴클레오시드, 및 iii) 추가의 포스포디에스테르 연결을 포함한다:
5'-A-PO-B - PO- 3' 또는 3'-A-PO-B - PO- 5'
추가의 포스포디에스테르 연결은 영역 B 뉴클레오시드를 하나 이상의 추가의 뉴클레오시드, 예컨대 하나 이상의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 연결시키거나, 또는 임의로 연결 기 (Y) 를 통해 X (는 콘쥬게이트, 표적화 또는 차단기 또는 반응성 또는 활성화 기임) 에 연결할 수 있다.
일부 구현예에서, 영역 B 는 3'- 5' 또는 5'-3': i) 영역 A 의 5' 뉴클레오시드에 대한 포스포디에스테르 연결, ii) 2 - 10 개의 DNA 또는 RNA 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 뉴클레오시드, 및 iii) 추가의 포스포디에스테르 연결을 포함한다:
5'-A-[PO-B]n - [Y]-X 3' 또는 3'-A-[PO-B]n -[Y]-X 5'
5'-A-[PO-B]n - PO-[Y]-X 3' 또는 3'-A-[PO-B]n - PO-[Y]-X 5'
식 중 A 는 영역 A 을 나타내고, [PO-B]n 은 영역 B 를 나타내고, 식 중 n 은 1 - 10, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이고, PO 는 영역 B 및 X (또는 존재하는 경우 Y)) 사이의 임의의 포스포디에스테르 연결 기이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 식 중 하나에 따른 (또는 포함하는) 화합물을 제공한다:
5' [영역 A] - PO - [영역 B] 3' -Y - X
5' [영역 A] - PO - [영역 B] -PO 3' -Y - X
5' [영역 A] - PO - [영역 B] 3' - X
5' [영역 A] - PO - [영역 B] -PO 3' - X
3' [영역 A] - PO - [영역 B] 5' -Y - X
3' [영역 A] - PO - [영역 B] -PO 5' -Y - X
3' [영역 A] - PO - [영역 B] 5' - X
3' [영역 A] - PO - [영역 B] -PO 5' - X
영역 B 는 예를 들어 하기를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다:
5' DNA3'
3' DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-3'
3' DNA-PO-DNA-5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
제 2 영역 내의 서열 선택:
일부 구현예에서, 영역 B 는 올리고뉴클레오티드 영역 A 및 B 가 상보적 표적 서열에 대해 정렬될 때 상보적 서열을 형성하지 않는다.
일부 구현예에서, 영역 B 는 올리고뉴클레오티드 영역 A 및 B 가 상보적 표적 서열에 대해 정렬될 때 상보적 서열을 형성한다. 이와 관련하여, 영역 A 및 B 는 함께 표적 서열에 대해 상보적인 단일 근접 서열을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 영역 B 내 염기 서열은 표적 조직 또는 세포 또는 세포-이하 구획 내에 존재하는 두드러진 엔도뉴클레아제 분할 효소에 근거하여, 최적의 엔도뉴클레아제 분할 부위를 제공하기 위해 선택된다. 이와 관련하여, 표적 조직 및 비-표적 조직으로부터의 세포 추출물을 단리함으로써, 영역 B 에서 사용하기 위한 엔도뉴클레아제 분할 서열은 비-표적 세포 (예를 들어, 신장) 와 비교하여, 바람직한 표적 세포 (예를 들어, 간/간세포) 에서 우선적인 분할 활성에 근거하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, 표적 하향-조절을 위한 화합물의 효험은 바람직한 조직/세포에 대해 최적화될 수 있다.
일부 구현예에서, 영역 B 는 서열 AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC, 또는 GG (식 중, C 는 5-메틸시토신일 수 있고, 및/또는 T 는 U 로 대체될 수 있음) 의 디뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 B 는 서열 AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC, 및 GGG (식 중, C 는 5-메틸시토신일 수 있고, 및/또는 T 는 U 로 대체될 수 있음) 의 트리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 B 는 서열 AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX, 및 GGGX (식 중, X 는 A, T, U, G, C 및 이의 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, C 는 5-메틸시토신일 수 있고, 및/또는 T 는 U 로 대체될 수 있음) 의 트리뉴클레오티드를 포함한다. (자연 발생적) 핵염기 A, T, U, G, C 를 언급할 때, 이들은 동등한 천연 핵염기 (예를 들어, 상보적 뉴클레오시드를 갖는 염기 쌍) 로서 작용하는 핵염기 유사체로 치환될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 1 개 초과의 콘쥬게이트 기 (또는 1 개 초과의 작용기 X - 예컨대 콘쥬게이트, 표적화, 차단 또는 활성화된 기 또는 반응성 또는 활성화 기), 예컨대 2 또는 3 개의 이러한 기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 영역 B 는 임의로 [예를 들어, 비-뉴클레오티드] 링커 기) 를 통해, 하나 이상의 작용기, 예컨대 2 또는 3 개의 작용기에 공유 연결된다. 일부 구현예에서, 제 1 영역은 (예를 들어, 인터뉴클레오시드 연결, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 통해), 2 개의 영역 B 에, 예를 들어, 하나의 5' 및 하나의 3' 이 제 1 영역에 공유 연결될 수 있으며, 각각의 영역 B 는 본원에 기재된 영역 B 로부터 (임의로 독립적으로) 선택될 수 있다. 이와 관련하여, 하나의 영역 B 는 하나 이상의 작용기를 가질 수 있고, 제 2 영역 B 는 하나 이상의 작용기를 가질 수 있으며, 각각의 영역 B 의 작용기는 콘쥬게이트, 표적화 기, 차단기 또는 반응성/활성화 기로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
폴리 올리고머성 화합물
본 발명은 제 1 영역 (영역 A), 제 2 영역 (영역 B) 및 제 3 영역 (영역 C) 을 포함할 수 있는 폴리 올리고머성 화합물을 제공하며, 상기 제 1 영역은 하나 이상의 추가의 올리고머성 화합물 (영역 A') 에 공유 연결되고, 상기 제 1 영역 (영역 A) 및 영역 A' 는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 제 2 영역으로서, 예를 들어 하나 이상의 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA (예컨대, DNA), 예컨대 2, 3, 4 또는 5 개의 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 (예컨대, DNA 뉴클레오시드) 의 영역일 수 있는 생분할가능 링커 (영역 B') 를 통해 공유 연결된다. 영역 B 및 B' 는 일부 구현예에서, 동일한 구조, 예를 들어, 동일한 수의 DNA/RNA 뉴클레오시드 및 포스포디에스테르 연결 및/또는 동일한 핵염기 서열을 가질 수 있다. 기타 구현예에서, 영역 B 및 B' 는 상이할 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리 올리고머성 화합물은 구조, 예컨대: (5' - 3' 또는 3' - 5') 콘쥬게이트-PO-ON-PO'-ON' (식 중, 콘쥬게이트는 영역 C 이고, PO 는 영역 B 이고, PO' 는 영역 B' 이고, ON 1 은 영역 A 이고, ON' 는 영역 A' 임) 를 가질 수 있다.
영역 A' 는 일부 구현예에서, 생분할가능 링커, 예를 들어: 콘쥬게이트-PO-ON-PO-ON'-PO''-ON'', 또는 콘쥬게이트-PO-ON-[PO-ON']n (식 중, n 은 예를 들어 1, 2 또는 3 일 수 있고, 각각의 ON' 는 동일 또는 상이할 수 있고, 상이한 경우, 동일 또는 상이한 표적을 가질 수 있음) 를 통해 연속으로 (또는 동시에) 연결된 복합의 추가의 올리고머성 화합물 (예컨대, 추가의 2 또는 3 개의 올리고머성 화합물) 을 포함할 수 있다고 이해되어야만 한다.
멀티 콘쥬게이트 올리고머성 화합물
일부 구현예에서, 올리고머성 화합물은 동일 또는 상이할 수 있는 1 개 초과의 콘쥬게이트 영역 (영역 C) 에 콘쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고머성 화합물은 하기와 같은 구조를 가질 수 있다: (5' - 3' 또는 3' - 5') ON-PO'-Conj1-PO''-Conj2 (식 중, Conj1 및 conj2 는 2 개의 콘쥬게이트 기이고, PO 또는 PO'' 중 하나 이상 또는 둘 다는 본원의 영역 B 에 따른 것과 같고, ON 는 영역 A 임). Conj1 및 Conj2 는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Conj1 및 Conj2 중 하나는 탄수화물 또는 스테롤 콘쥬게이트이고 다른 것은 친유성 콘쥬게이트, 예를 들어, 5'-3' 또는 3' - 5':ON-PO'-팔미토일-PO''-Chol 또는 ON-PO'-팔미토일-PO''-GalNac 이다.
이전 식에서 GalNac 로 나타내지는 탄수화물 콘쥬게이트 일부분 (예를 들어, conj1 또는 conj2 로서 사용되는 경우) 은 예를 들어, 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민, 및 N-이소부타노일갈락토오스-아민으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 친유성 콘쥬게이트 (예를 들어, conj1 또는 conj2 로서 사용되고, 이전 식에서 팔미토일로서 나타내지는 경우) 는 소수성 기, 예컨대 C16-20 소수성 기, 스테롤, 콜레스테롤일 수 있다. 사용될 수 있는 기타 탄수화물 및 친유성기가 예를 들어, 본원에 기재된다.
표적
일부 구현예에서, 비-제한적인 예의 경우, 본 발명의 올리고머는 mRNA, microRNA, lncRNA (긴 비-코딩 RNA), snRNA, snoRNA, 및 바이러스 RNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 (즉, 표적) 을 조절하는데 사용하기 위한 것이다.
예시적인, 그러나 비-제한적인 mRNA 및 microRNA 표적에는 예를 들어, 다음이 포함된다:
암에서 나타나는 유전자, 예컨대 Hif1-알파, 서바이빈 (survivin), Bcl2, Mcl1, Her2, 안드로겐 수용체, 베타-카테닌, 인간 형질전환 성장 인자 TGF-베타2, ras, TNF-알파, c-RAF, HSPs 예를 들어, Hsp27, eIF-4E (예를 들어, ISIS-EIF4ERx) STAT3 (예를 들어, ISIS-STAT3Rx), 클러스테린 (clusterin) (예를 들어, OGX-011), AurkB, AurkA, PBK, miR-155, miR-21, miR-10b, mir-34 (참조, WO2011088309), miR-199a, miR-182,
염증에 관여하는 유전자의 mRNA, 예를 들어, ICAM-1 (예를 들어, Alicoforsen), CD49d, VLA-4 오스테오폰틴, miR-21 (건선),
기타 의학적으로 관련있는 mRNA 표적에는 CTGF (국부 섬유증) 및 c-Raf-키나아제 (안 질환). miR-29 (심장 섬유증), Factor XI (응고), Factor VII (응고) miR15 miR-159 (후-MI 모델링 (후-MI 모델링), miR-138 (골-소실), mir-21 (참조, WO12148952) 및 mir214 (섬유증) 가 포함된다 - WO2012012716 을 참조한다.
대사성 질환 또는 질병 표적, 예컨대 Apo-B (고 LDL 콜레스테롤, ACS), ApoCIII (고 혈청 TG, 당뇨병), Apo(a) (심혈관 질환), FGFR4 (비만), GCCR (T2 당뇨병), GCGR (T2 당뇨병), PTP1B (T2 당뇨병), DGAT2 (NASH), PCSK9 (고지혈증 및 관련 질병), MtGPAT (비만 및 NAFLD), miR-122 (고 콜레스테롤), miR-33 (대사성 증후군, 죽상동맥경화증), miR-208 (만성 심부전), miR-499 (만성 심부전), miR-378 (심장 대사성 질환), mir-143 (혈관 질환), miR-145 (혈관 질환), miR-92 (말초 동맥 질환), miR-375 (당뇨병), miR-27b (당뇨병), miR-34a (당뇨병), miR-199a, miR-27a (심장병, 국소빈혈), miR-338 (당뇨병).
대사성 질환에는 예를 들어, 대사성 증후군, 비만, 고지혈증, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 결합 고지혈증 (FCHL), 후천성 고지혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상 심장병 (CHD), 죽상동맥경화증, 심장병, 당뇨병 (I 및/또는 II), NASH, 급성 관상 증후군 (ACS) 이 포함된다.
바이러스 질환: miR-451(적혈구증가), miR-122 (HCV), HBV, HCV, BKV, 등. 중증 및 희귀 질환에는 SMN2 (척수 근 위축증), TTR (TTR 아밀로이드증), GHr (말단비대증), AAT (AATD 연관 간 질환), Dystophin (뒤시엔느 (Duchennes) 근 위축증) 이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 간 발현 핵산, 예컨대 간 발현 mRNA, 예컨대 PCSK9, ApoB, 또는 MtGPAT 에 표적한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 PCSK9 mRNA 에 표적한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 ApoB mRNA 에 표적한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 간 발현 microRNA, 예컨대 miR-122 에 표적한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 표적 (예를 들어, 표적 핵산) 의 발현을 하향-조절 (예를 들어, 감소 또는 제거) 시킬 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 올리고머는 표적의 억제에 영향을 줄 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 표적 핵산에 결합하고, 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 20% 의 발현 억제, 더욱 바람직하게는 정상 발현 수준 (예컨대, 올리고머(들) 또는 콘쥬게이트(들) 의 부재 하의 발현 수준) 과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 억제에 영향을 준다. 일부 구현예에서, 이러한 조절은 0.04 내지 25nM, 예컨대 0.8 내지 20nM 농도의 본 발명의 화합물을 사용하는 경우 관찰된다. 동일 또는 상이한 구현예에서, 발현의 억제는 100% 미만, 예컨대 98% 억제 미만, 95% 억제 미만, 90% 억제 미만, 80% 억제 미만, 예컨대 70% 억제 미만이다. 발현 수준의 조절은 단백질 수준을 측정함으로써, 예를 들어, SDS-PAGE 와 같은 방법에 의해, 이후 표적 단백질에 대항하여 발생되는 적합한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로는, 발현 수준의 조절은 mRNA 의 수준을 측정함으로써, 예를 들어, 노던 블롯팅 또는 정량 RT-PCR 에 의해 결정될 수 있다. mRNA 수준을 통한 측정시, 적합한 투약량, 예컨대 0.04 내지 25nM, 예컨대 0.8 내지 20nM 농도를 사용하는 경우의 하향-조절의 수준은, 일부 구현예에서, 전형적으로 본 발명의 화합물, 콘쥬게이트 또는 조성물의 부재 시 정상 수준으로부터 10-20% 수준이다.
따라서 본 발명은 표적을 발현하고 있는 세포에서 표적의 발현을 하향-조절 또는 억제하기 위해 상기 세포에게 본 발명에 따른 올리고머 또는 콘쥬게이트를 투여하는 것을 포함하는, 표적을 발현하고 있는 세포에서 표적의 발현을 하향-조절 또는 억제하는 방법을 제공한다. 적합하게는 세포는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포이다. 투여는 일부 구현예에서, 시험관 내에서 일어날 수 있다. 투여는 일부 구현예에서, 생체 내에서 일어날 수 있다.
본 발명의 화합물, 예컨대 이의 올리고머 및 콘쥬게이트는 간에서 발현되는 상이한 표적, 예컨대 mRNA 또는 microRNA 또는 기타 핵산 표적에 표적할 수 있다 (NCBI Genbank/Gene ID 에 대한 참조가 본 발명의 화합물에 의해 표적될 수 있는 서열의 예로서 제시된다 - Genbank / NCBI 서열은 본원에 참조로서 인용된다).
ApoB
일부 구현예에서, 제 1 영역 (또는 제 1 및 제 2 영역) 은 ApoB mRNA 표적의 상응하는 영역 (즉, 표적들) ApoB-100 (NCBI Genbank ID NM_000384.2 GI:105990531, 본원에 참조로서 인용됨) 에 상보적인, 단일 근접 핵염기 서열을 형성한다.
ApoB 에 표적하는 본 발명의 화합물은 급성 관상 증후군의 치료에 사용될 수 있다 (참조, WO20100076248). 따라서 본 발명은 급성 관상 증후군의 치료에 사용하기 위해 ApoB100 을 표적으로 하는 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다. 따라서 본 발명은 급성 관상 증후군의 치료를 필요로 하는 대상에 대한 본 발명의 올리고머의 투여를 포함하는, 급성 관상 증후군의 치료 방법을 추가로 제공한다.
ApoB 에 표적하는 본 발명의 화합물은 죽상동맥경화증의 치료에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 죽상동맥경화증의 치료에 사용하기 위해 ApoB100 을 표적으로 하는 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다. 본 발명은 죽상동맥경화증의 치료를 필요로 하는 대상에 대한 본 발명의 올리고머의 투여를 포함하는, 죽상동맥경화증의 치료 방법을 추가로 제공한다.
ApoB 에 표적하는 본 발명의 화합물은 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증의 치료에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증의 치료에 사용하기 위해 ApoB100 을 표적으로 하는 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다. 본 발명은 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증의 치료를 필요로 하는 대상에 대한 본 발명의 올리고머의 투여를 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증의 치료 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 세포에서 ApoB 를 억제하도록 세포에 대한 본 발명에 따른 올리고머 또는 콘쥬게이트 또는 약학 조성물의 투여를 포함하는, ApoB 를 발현하고 있는 세포에서 ApoB 의 억제를 위한 생체 내 또는 시험관 내 방법을 제공한다.
본 발명의 올리고머/콘쥬게이트에서 제 1 영역으로서 사용될 수 있는 LNA 올리고머의 예에는, 예를 들어 본원에 참조로 인용되는 WO2007/031081, WO2008/113830, WO2007131238, 및 WO2010142805 에 기재된 것들이 포함된다. 구체적인 바람직한 화합물에는 하기가 포함된다:
Figure pct00001
이때 대문자는 베타-D-옥시 LNA 단위 (뉴클레오시드) 이고, 소문자는 DNA 단위이고, 아래첨자 s 는 포스포로티오에이트 연결이고, 대문자 C 앞의 위첨자 m 은 모든 LNA 시토신이 5-메틸 시토신인 것을 나타낸다. ApoB 에 표적하는 본 발명의 화합물은 본원에 기재된 바와 같이, 올리고머를 간에 표적화시키는 콘쥬게이트, 예컨대 탄수화물 또는 친유성 콘쥬게이트, 예컨대 GalNac 콘쥬게이트 또는 스테롤 콘쥬게이트 (예를 들어, 콜레스테롤 또는 토코페롤) 에 콘쥬게이션될 수 있다. 콘쥬게이트는 예를 들어, 올리고머 화합물의 5' 말단 또는 3' 말단 (적합하게는 영역 B 를 통해) 에 있을 수 있다. ApoB 에 표적하는 기타 올리고머는 WO03/011887, WO04/044181, WO2006/020676, WO2007/131238, WO2007/031081, 및 WO2010142805 에 기재된다.
PCSK9
일부 구현예에서, 제 1 영역 (또는 제 1 및 제 2 영역) 은 PCSK9 mRNA 표적의 상응하는 영역 (즉, 표적들), 예컨대 예컨대 인간 PCSK9 mRNA: NCBI Genbank ID NM_174936.3 GI:299523249 (본원에 참조로서 인용됨) 에 상보적인, 단일 근접 핵염기 서열을 형성한다.
본 발명은 예컨대 고콜레스테롤혈증 또는 관련 질환, 예컨대 죽상동맥경화증, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증 예를 들어, PCSK9 에서의 기능 돌연변이의 획득, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 고지혈증 (FCHL), 후천성 고지혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상 심장병 (CHD) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 치료를 위한, 약제로서 사용하기 위한, PCSK9 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다.
본 발명은 고콜레스테롤혈증 또는 관련 질환, 예컨대 죽상동맥경화증, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증 예를 들어, PCSK9 에서의 기능 돌연변이의 획득, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 고지혈증 (FCHL), 후천성 고지혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상 심장병 (CHD) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, PCSK9 에 표적하는 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
본 발명은 고콜레스테롤혈증 또는 관련 질환을 겪고 있는, 또는 겪기 쉬운 환자에게, PCSK9 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 고콜레스테롤혈증 또는 관련 질환, 예컨대 죽상동맥경화증, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증 예를 들어, PCSK9 에서의 기능 돌연변이의 획득, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 고지혈증 (FCHL), 후천성 고지혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상 심장병 (CHD) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 PCSK9 를 발현하고 있는 세포에서 PCSK9 를 억제하기 위해 상기 세포에게 PCSK9 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머를 투여하는 것을 포함하는, PCSK9 를 발현하고 있는 세포에서 PCSK9 의 억제를 위한 생체 내 또는 시험관 내 방법을 제공한다.
다음은 인간 PCSK9 mRNA 에 표적하는 올리고머이고, 본 발명의 화합물에서 영역 A 로서 사용될 수 있다.
Figure pct00002
이때 대문자는 베타-D-옥시 LNA 단위 (뉴클레오시드) 이고, 소문자는 DNA 단위이고, 아래첨자 s 는 포스포로티오에이트 연결이고, 대문자 C 앞의 위첨자 m 은 모든 LNA 시토신이 5-메틸 시토신인 것을 나타낸다. PCSK9 에 표적하는 본 발명의 화합물은 본원에 기재된 바와 같이, 올리고머를 간에 표적화시키는 콘쥬게이트, 예컨대 탄수화물 또는 친유성 콘쥬게이트, 예컨대 GalNac 콘쥬게이트 또는 스테롤 콘쥬게이트 (예를 들어, 콜레스테롤 또는 토코페롤) 에 콘쥬게이션될 수 있다. 콘쥬게이트는 예를 들어, 올리고머 화합물의 5' 말단 또는 3' 말단 (적합하게는 영역 B 를 통해) 에 있을 수 있다.
PCSK9 에 표적하는 기타 올리고머는 SEQ ID NO 36 - 52 로서 기재되고, 다른 것은 본원에 참조로서 인용된, WO2008/043753, WO2011/009697, WO08/066776, WO07/090071, WO07/146511, WO07/143315, WO09/148605, WO11/123621 및 WO11133871 에 기재된다.
miR-122
일부 구현예에서, 제 1 영역 (또는 제 1 및 제 2 영역) 은 microRNA-122, 예컨대 miR-122a (즉, 표적), 예컨대 has-miR-122 서열 (miRBase release 20: MI0000442), 예컨대:
Figure pct00003
의 상응하는 영역에 상보적인, 단일 근접 핵염기 서열을 형성한다.
miR-122 는 HCV 감염에서 나타나며, 이때 이것은 감염의 유지에 필요한 필수적인 숙주 인자이다. miR-122 의 억제제는 따라서 C 형 간염 감염의 치료에 사용될 수 있다.
miR-122 에 표적하는 본 발명의 화합물은 HCV 감염의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 HCV 감염의 치료에 사용하기 위해 miR-122 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다. 본 발명은 치료가 필요한 대상에 대한 본 발명의 올리고머의 투여를 포함하는, HCV 감염의 치료 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 HCV 감염의 치료 용 약제의 제조를 위한, miR-122 에 표적하는 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
본 발명은 HCV 감염을 겪고 있는 환자에게, miR-122 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, HCV 감염의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 세포에서 miR-122 를 억제하도록 세포에 대한 본 발명에 따른 올리고머 또는 콘쥬게이트 또는 약학 조성물의 투여를 포함하는, miR-122 를 발현하고 있는 세포, 예컨대 HCV 감염된 세포 또는 HCV 레플리콘 발현 세포에서 miR-122 의 억제를 위한 생체 내 또는 시험관 내 방법을 제공한다.
miR-122 는 또한 콜레스테롤 대사작용에서 나타나고, miR-122 의 억제가 혈장 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 치료에 사용될 수 있다는 것을 암시한다 (Esau, Cell Metab. 2006 Feb;3(2):87-98.)
miR-122 의 억제제는 따라서 혈장 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 치료에, 또는 증가된 수준의 콜레스테롤과 연관된 대사성 질환 (관련 질환), 예컨대 죽상동맥경화증, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상 심장병 (CHD) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증상의 치료에 사용될 수 있다.
miR-122 에 표적하는 본 발명의 화합물은 상승된 콜레스테롤 수준 또는 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 상승된 콜레스테롤 수준 또는 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 miR-122 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다. 본 발명은 추가로 상승된 콜레스테롤 수준 또는 관련 질환의 치료를 필요로 하는 대상에 대한 본 발명의 올리고머의 투여를 포함하는, 상승된 콜레스테롤 수준 또는 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 상승된 콜레스테롤 수준 또는 관련 질환의 치료 용 약제의 제조를 위한, miR-122 에 표적하는 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
본 발명은 상승된 콜레스테롤 수준 또는 관련 질환을 겪고 있는 환자에게, miR-122 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상승된 콜레스테롤 수준 또는 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 세포에서 miR-122 를 억제하도록 세포에 대한 본 발명에 따른 올리고머 또는 콘쥬게이트 또는 약학 조성물의 투여를 포함하는, miR-122 를 발현하고 있는 세포, 예컨대 HCV 감염된 세포 또는 HCV 레플리콘 발현 세포에서 miR-122 의 억제를 위한 생체 내 또는 시험관 내 방법을 제공한다.
miR-122 에 표적하는 올리고머는 WO2007/112754, WO2007/112753, WO2009/043353 에 기재되고, 믹스머 (mixmer), 예컨대 SPC3649, 또한 하기를 참조하여 Miravirsen 으로 언급됨, 또는 타이니 (tiny) LNA, 예컨대 WO2009/043353 에 기재된 것들 (예를 들어, 5'-ACACTCC-3', 5'-CACACTCC-3', 5'-TCACACTCC-3', 이때 대문자는 베타-D_옥시 LNA, 완전한 포스포로티오에이트이고, LNA C 는 5-메틸 시토신임) 일 수 있다. 일부 구현예에서, miR-122 표적화 올리고머는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 (또는 19, 20, 21, 22 또는 23 뉴클레오티드) 의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, miR-122 표적화 올리고머는 올리고머의 길이를 통해 측정된 바와 같이 miR-122 에 완전히 상보적인 서열, 및 바람직하게는 서열 5'-CACACTCC-3' 을 포함한다. 일부 구현예에서, microRNA, 예컨대 miR-122 에 표적하는 올리고머는 올리고머의 길이에 걸쳐 microRNA 의 상응하는 영역에 상보적이고, 일부 구현예에서, 올리고머의 3' 뉴클레오시드는 microRNA, 예컨대 miR-122 의 첫번째, 두번째, 세번째 또는 네번째 5' 뉴클레오티드, 예컨대 microRNA, 예컨대 miR-122 의 두번째 5' 뉴클레오티드에 상보적 (즉, 정렬) 이다.
다음은 has-miR-122 (인간 miR-122) 에 표적하는 올리고머이고, 본 발명의 화합물에서 영역 A 로서 사용될 수 있다.
Figure pct00004
본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 기타 miR-122 표적화 화합물 (영역 A) 은 WO2007/027894, WO2007/027775 에 기재된다.
MtGPAT: (NCBI Gene ID 57678 - 염색체: 10; NC_000010.10 (113907971..113975153, 보체) 미토콘드리아 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스페라아제 1 (EC 2.3.1.15, 또한 GPAT1, mtGPAT1, GPAM, mtGPAM 으로서 공지됨) 은 간의 트리글리세라이드 형성에 중요한 역할을 하는데, mtGPAT1 활성의 높은 수준은 지방간 (간지방증, hepatosteatosis) 을 야기하는 반면, mtGPAT1 의 부재는 낮은 수준의 간 트리글리세라이드 및 자극된 지방산 산화 (mtGPAT 에 표적하는 올리고머가 기재된 WO2010/000656 을 참조) 를 야기한다. MtGPAT 에 표적하는 본 발명의 화합물은 과체중, 비만, 지방간, 간지방증, 비 알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 비 알코올성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항, 당뇨병, 예컨대 비 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (NIDDM) 인 것과 같은 질병의 치료에 사용될 수 있다.
FactorVII (NCBI Gene ID 2155, NCBI J02933.1 GI:180333, 또는 EU557239.1 GI:182257998). 본 발명의 올리고머 또는 콘쥬게이트는 FactorVII 에 표적할 수 있어, 조직 인자 응고 경로의 핵심 성분인 Factor VII 의 생성을 억제한다. FactorVII 에 표적하는 본 발명의 화합물은 혈전증 질환 (전형적으로 출혈을 야기하지 않는) 및 심장 마비, 뇌졸중 및 혈전, 또는 염증성 증상의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 본원에 참조로서 인용되는 WO 2013/119979 및 WO 2012/174154 에는 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 FVII 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물이 기재되어 있다.
Factor XI (NCBI Genbank BC122863.1 GI:114108211)- Factor XI, 간에서 생성되는 응고 인자. 높은 수준의 Factor XI 는 심장 마비, 뇌졸중 및 혈전과 연관된다. 본원에 참조로서 인용된 WO 2013/070771 에서는, 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 XI 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물을 기재한다. FactorXI 에 표적하는 본 발명의 화합물은 혈전성 질환, 및 심장 마비, 뇌졸중 및 혈전, 또는 염증성 증상, 예컨대 관절염 및 대장염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
ApoCIII (NCBI Genbank BC027977.1 GI:20379764) 혈중 트리글리세라이드 대사작용을 조절하는 단백질. 높은 수준의 apoC-III 는 염증, 고 트리글리세라이드, 죽상동맥경화증 및 대사성 증후군과 연관된다. ApoCIII 에 표적하는 본 발명의 화합물은 단일제제로서 또는 기타 트리글리세라이드-저하제와 조합으로, 혈청 트리글리세라이드 수준을 감소시키기 위해 또는 예를 들어, 가족성 킬로미크론혈증 증후군 및 중증 고 트리글리세라이드의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 참조로서 인용된 WO11085271 에서는, 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 ApoCIII 에 표적하는 올리고뉴클레오티드를 기재한다.
Apo(a) (NCBI Genbank NM_005577.2 GI:116292749) 는 간 내 apo(a) 의 생성을 억제하고, 심혈관 질환에 대한 독립적인 위험 인자인 Lp(a) 에 대한 직접적인 접근법을 제공하도록 디자인된다. 높은 수준의 Lp(a) 는 죽상동맥경화증, 관상 심장병, 심장 마비 및 뇌졸중의 위험 증가와 연관된다. Lp(a) 는 동맥 내에서, 미성숙 플라크 증강, 또는 죽상동맥경화증을 촉진한다. Apo(a) 에 표적하는 본 발명의 화합물은 예를 들어, 죽상동맥경화증 및 관상 심장병의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 참조로서 인용된 WO05000201 및 WO03014307 에서는, 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 아포리포단백질 (a) 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물을 기재한다.
Hepatitis B (HBV) (참조, 예를 들어 NCBI D23684.1 GI:560092; D23683.1 GI: 560087; D23682.1 GI: 560082; D23681.1 GI: 560077; D23680.1 GI: 560072; D23679.1 GI: 560067; D23678.1 GI: 560062; D23677.1 GI: 560057; 모두 본원에 참조로서 인용됨)
HBV 에 표적하는 올리고머는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, WO96/03152, WO97/03211, WO2011/052911, WO2012/145674, WO2012/145697, WO2013/003520 및 WO2013/159109 를 참조한다.
HBV 에 표적하는 본 발명의 화합물은 HBV 감염 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 HBV 의 치료에 사용하기 위한 HBV 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다. 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상에 대한 본 발명의 올리고머의 투여를 포함하는, HBV 감염의 치료 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은, 예컨대 B 형 간염 감염 또는 관련 질환의 치료를 위한, 약제로서 사용하기 위한, B 형 간염 (HBV) 에 표적하는 본 발명의 올리고머 또는 콘쥬게이트를 제공한다.
본 발명은 B 형 간염 감염 또는 관련 질환의 치료 용 약제의 제조를 위한, B 형 간염 (HBV) 에 표적하는 본 발명에 따른 올리고머 또는 콘쥬게이트 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 B 형 간염 바이러스로 감염된 환자에게, HBV 에 표적하는 본 발명의 올리고머 또는 콘쥬게이트의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, B 형 간염 감염 또는 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 HBV 복제를 억제하도록 세포에 대한 HBV 에 표적하는 본 발명의 올리고머 또는 콘쥬게이트의 투여를 포함하는, HBV 로 감염된 세포에서 HBV 복제의 억제를 위한 생체 내 또는 시험관 내 방법을 제공한다. HBV 에 표적하는 LNA 올리고머의 예는 (WO2011/47312 에 기재된 바와 같은) 본 발명의 올리고머 (영역 A) 로서 사용될 수 있는
Figure pct00005
이다. 추가의 화합물은 본원에 참조로서 인용된, WO2011/47312 의 표 1, 및 WO2011/052911, WO2012/145674, WO2012/145697, WO2013/003520 및 WO2013/159109 에 기재된다.
RG-101 은 miR-122 에 표적하고 GalNac 콘쥬게이트를 포함하는 화합물로서, Regulus Therapeutics 사에 의해 HCV 의 치료를 위해 개발되고 있다.
ANGPTL3, (예를 들어, NCBI BC007059.1 GI: 14712025 또는 BC058287.1 GI: 34849466) ANGIOPOIETIN-LIKE 3 - 지질, 글루코오스 및 에너지 대사작용을 조절하는 단백질. 상승된 수준의 ANGPTL3 을 갖는 인간은 미성숙 심장 마비의 위험 증가와 연관된 고지혈증, 동맥 벽 두깨 증가 뿐 아니라 다중성 대사 이상, 예컨대 인슐린 저항이 있다. 대조적으로, 낮은 수준의 ANGPTL3 을 갖는 인간은 낮은 LDL-C 및 트리글리세라이드 수준을 갖고 심혈관 질환의 위험이 낮다. ANGPTL3 에 표적하는 본 발명의 화합물은 예를 들어, 고지혈증 및 관련 질환, 대사성 질환, 죽상동맥경화증, 관상 심장병 또는 인슐린 저항의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 참조로서 인용된 WO11085271 에서는, 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 ANGPTL3 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물을 기재한다.
글루카곤 수용체, 또는 GCGR (BC112041.1 GI: 85567507; L20316.1 GI: 405189): 글루카곤은 인슐린의 작용과 반대되고 특히 제 2 형 당뇨병에서, 간에서 글루코오스를 생성하도록 자극하는 호르몬이다. 진행된 당뇨병 환자에서, 비조절된 글루카곤 작용은 혈중 글루코오스 수준의 상당한 증가를 야기한다. 따라서, 글루카곤 작용의 약화는 중증 당뇨병 환자에서 상당한 글루코오스 저하 효과를 가질 수 있다. 또한, 감소하는 GCGR 은 좀더 활성인 글루카곤-유사 펩티드, 또는 GLP-1 (췌장 기능을 보전하고 인슐린 분비를 향상시키는 호르몬) 을 생성한다. GCGR 에 표적하는 본 발명의 화합물은 예를 들어, 인슐린 저항, 고혈당증, 당뇨병, 예컨대 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병의 치료에, 췌장 기능의 보존 및 혈중 글루코오스 수준의 조절에 사용될 수 있다. WO2007/134014 에는 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 GCGR 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물이 기재된다.
섬유아세포 성장 인자 수용체 4, 또는 FGFR4. (NCBI Gene 2264 - NC_000005.9 (176513906..176525143) FGFR4 는 간 및 지방 조직에서 발현되고, 신체의 지방 축적 능력을 감소시키는 동시에 지방 연소 및 에너지 소비를 증가시키는 것으로 나타난다. 많은 항-비만 약물이 식욕을 억제하기 위해 뇌에 작용하는데, 통상 CNS 부작용을 야기한다. FGFR4 에 표적하는 본 발명의 화합물은 예를 들어, 인슐린 저항, 고혈당증, 당뇨병, 예컨대 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병, 비만의 보존 (예를 들어, 식욕-억제 약물과 조합으로 사용되는 경우), 체중 감소, 및 인슐린 민감성 개선, 당뇨병, 예컨대 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병의 치료 및 혈중 글루코오스 수준의 조절에 사용될 수 있다. 본원에 참조로서 인용된 WO09046141 및 WO12174476 에서는 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 FGFR4 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물이 기재된다.
디아실글리세롤 아실트랜스페라아제-2, 또는 DGAT-2 (NCBI GENE ID 84649): 트리글리세라이드의 합성에 핵심 성분. DGAT 의 억제는 비알코올성 지방간염 (NASH) 환자에서 간 지방을 감소시킬 수 있고, 또한 제 2 형 당뇨병 및 인슐린 저항을 치료하기 위해 사용될 수 있다. DGAT-2 에 표적하는 본 발명의 화합물은 NASH 를 치료하고, 간 지방을 감소시키고, 당뇨병, 예컨대 제 2 형 당뇨병을 치료하고, 인슐린 저항을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 참조로서 인용된 WO05019418 및 WO2007136989 에서는 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 DGAT-2 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물이 기재된다.
글루코코르티코이드 수용체, 또는 GCCR (BC150257.1 GI: 152013043): 글루코코르티코이드 호르몬은 신체 전반에 걸쳐 다양한 과정에 영향을 주는데, 과도한 수준의 글루코코르티코이드 호르몬은 체내 많은 조직 및 기관에 악영향을 줄 수 있다. 쿠싱 증후군 (Cushing's Syndrome) 은 높은 수준의 글루코코르티코이드에 장기간 노출되어 야기된 고아 질환 (orphan disease) 이다. 치료되지 않으면, 쿠싱 증후군 환자는 고혈압, 당뇨병 및 손상된 면역 기능을 발달시킬 수 있고, 조기 사망의 위험이 증가한다. 쿠싱 증후군에 대한 승인된 치료법이 있지만, 현행의 약품은 상당한 부작용, 예컨대 고혈압 및 당뇨병과 연관이 있고, 상기 환자에 대한 신규한 치료법에 높은 충족되지 않은 의료적 필요성이 남아있다. GCCR-2 에 표적하는 본 발명의 화합물은 쿠싱 증후군 및 연관 증상 (예컨대, 상기 언급된 것들) 을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 참조로서 인용된 WO07035759 및 WO2007136988 에서는 본 발명의 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 GCCR 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물이 기재된다.
보체 성분 C5 (M57729.1 GI: 179982): 보체계는 숙주 방어를 위한 보호 메커니즘으로서 면역력에 있어서 중추적인 역할을 하지만, 이의 조절이상은, 그 중에서도 발작성 야간혈색 소뇨증 (PNH), 이례적인 용혈성-요독증 증후군 (aHUS), 중증 근무력증, 시각신경척수염을 포함하는 광범위한 인간 질환에서 심각한, 생명을 위협하는 합병증을 야기한다. 보체 성분 C5 에 표적하는 본 발명의 화합물은 상기 질환 중 하나 이상을 치료하는데 사용될 수 있다. C5 는 유전적으로 및 임상적으로 입증된 표적으로서; 기능 상실 인간 돌연변이는 특정 감염에 대항하여 약화된 면역 방어와 연관되고, 정맥 투여된 항-C5 모노클로날 항체 요법은 다수의 보체-매개 질환에서 임상적 활성 및 용인성 (tolerability) 을 입증하였다. 베타-지중해 빈혈 및 철 과부하 장애의 치료를 위한 막통과 프로테아제, 세린 6 (Tmprss6).
알파-1 항트립신 (AAT): (M11465.1 GI: 177826) 간 질환과 연관 - 본원에 참조로서 인용된 WO13142514 에서는 본 발명의 올리고머 또는 콘쥬게이트 내에 도입될 수 있는 AAT 에 표적하는 올리고뉴클레오티드 화합물을 기재한다. AAT 에 표적하는 본 발명의 화합물은 AIAT mRNA 및 단백질 발현을 감소시키고, 개인에서 섬유증, 예컨대, AIATD 연관 간 질환, 및 폐 질환, 예컨대, AIATD 연관 폐 질환을 치료하고, 개선시키고, 예방하고, 이의 진행을 늦추거나 이의 진행을 중단시키기 위한 방법에서 사용될 수 있다.
트랜스티레틴 (Transthyretin) - TTR (BC005310.1 GI: 13529049) : TTR 에 표적하는 본 발명의 올리고머는 조직 내에 누진적으로 축적되는, TTR 의 잘못폴딩된 형태를 생성하는 돌연변이 유전자를 물려받은 환자에서의 중증 및 희귀 유전 질환인 트랜스티레틴 아밀로이드증, 또는 TTR 아밀로이드증을 치료하는데 사용될 수 있다. TTR 아밀로이드증 환자에서, TTR 의 돌연변이 및 정상 형태 모두가 심장, 말초 신경, 및 위장관을 포함하는 조직 내에서 원섬유로서 쌓일 수 있다. TTR 원섬유의 존재는 상기 조직의 정상 기능을 간섭하고, TTR 단백질 원섬유가 거대해질수록 더 많은 조직에 손상이 일어나서 질환이 악화된다. TTR 은 혈액 내 갑상선 호르몬 및 레티놀을 운반하는 운반체 단백질이다. TTR 아밀로이드증 환자에서, TTR 의 돌연변이 및 정상 형태 모두가 조직 내에서 원섬유로서 쌓일 수 있다. 본 발명의 화합물은 TTR 아밀로이드증을 치료하는데 사용될 수 있다. Benson et al., Amyloid. 2010 Jun;17(2):43-9, 및 Ackermann et al., Amyloid. 2012 Jun;19 Suppl 1:43-4.) 를 참조한다. 본 발명의 올리고머 또는 콘쥬게이트에서 사용될 수 있는 TTR 에 표적하는 안티센스 화합물이 본원에 참조로서 인용된 US8101743, WO11139917 및 WO10017509 에 기재된다.
아미노레불리네이트 (Aminolevulinate) 신타아제-1 (ALAS-1) (BC011798.2 GI: 33877783; AK312566.1 GI: 164690365; NM_199166.2 GI: 362999012; NM_000688.5 GI: 362999011). ALAS1 은 포르피린증 (porphyrias) 의 치료, 예컨대 급성 간헐성 포르피린증 (AIP) 을 포함하는 간 포르피린증의 치료를 위한 입증된 표적이다. ALAS-1 에 표적하는 본 발명의 화합물은 상기 질환의 치료에 사용될 수 있다.
혈관 내피 성장 인자, 또는 VEGF (GENE ID 7422, 인간 서열: 염색체: 6; NC_000006.11 (43737946..43754224)). VEGF 는 암에서 나타난다. VEGF 에 표적하는 본 발명의 화합물은 과증식성 질환, 예컨대 암, 예컨대 간 암의 치료에 사용될 수 있다.
표 1 은 본 발명의 화합물에 의해 표적화될 수 있는 간 표적의 그룹, 뿐 아니라 이러한 화합물로 치료하는데 사용할 수 있는 의학적 징후/질환 (예컨대, 연관 질환을 겪고 있는 사람) 을 제공한다 (Sehgal et al., Liver as a target for oligonucleotide therapeutics, J. of Hepatology 2013, In Press 참조).
본 발명의 화합물은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 (예를 들어, mRNA 엔코딩, 또는 miRNA) 에 표적할 수 있다 F다음과 같은 질환 또는 질병의 치료용
AAT AAT-LivD
ALDH2 알코올 의존성
HAMP 경로 빈혈 또는 염증 /CKD
miR-33 죽상동맥경화증
Apo(a) 죽상동맥경화증/고 Lp(a)
miR-7 간 암
miR-378 심장대사성 질환
miR-21 간 암
Myc 간 암
miR-122 HCV
5'UTR HCV
5'UTR & NS5B HCV
NS3 HCV
TMPRSS6 혈색소침착증
항트롬빈 III Hemophilia A, B
ApoCIII 고트리글리세라이드혈증
ANGPLT3 고지혈증
MTP 고지혈증
DGAT2 NASH
ALAS1 포르피린증
항트롬빈 III 희귀 출혈 질환
혈청 아밀로이드 A SAA-아밀로이드증
Factor VII 혈전증
성장 호르몬 수용체 말단비대증
miR-122 Hepatitis C 바이러스
ApoB-100 고콜레스테롤혈증
ApoCIII 고트리글리세라이드혈증
PCSK9 고콜레스테롤혈증
CRP 염증성 장애
KSP 또는 VEGF 간 암
PLK1 간 암
miR-34 간 암
FGFR4 비만
Factor IXa 혈전증
Factor XI 혈전증
TTR TTR 아밀로이드증
GCCR 제 2 형 당뇨병
PTP-1B 제 2 형 당뇨병
GCGR 쿠싱 증후군
간 글루코오스 6-포스페이트 트랜스포터-1 글루코오스 항상성, 당뇨병, 제 2 형 당뇨병
서열
일부 구현예에서, 올리고머, 또는 이의 제 1 영역은 표적 핵산 (즉, 올리고머를 표적하는 서열) 내에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 역 보체 (reverse complement) 에 상응하는 근접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 표 3 은 관련 징후에 대해 올리고뉴클레오티드 화합물을 사용하는 전-임상적 또는 임상적 개발에 있고, 따라서 본 발명의 화합물로 표적하는데 적합한 mRNA 및 miRNA 표적의 그룹을 제공한다.
일부 구현예에서, 표적은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: miR-122, ApoB-100, ApoCIII, PCSK9, CRP, KSP, VEGF, PLK1, miR-34, FGFR4, Factor IXa, Factor XI, TTR, GCCR, PTP-1B, GCGR, AAT, ALDH2, HAMP 경로, miR-33, Apo(a), miR-7, miR-378, miR-21, Myc, miR-122, HCV 게놈, 예컨대 HCV 5'UTR 또는 HCV NS5B RNA 또는 NS3 RNA, TMPRSS6, 항트롬빈 III, ApoCIII, ANGPLT3, MTP, DGAT2, ALAS1, 항트롬빈 III, 혈청 아밀로이드 A 및 Factor VII.
일부 구현예에서, 근접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화되는 경우 단일 미스매치 (mismatch) 정도만을 포함한다. 영역 B 는 그러나 비-상보적일 수 있고, 따라서 상보성 정도를 결정할 때 무시될 수 있다.
본 발명의 올리고머 (또는 이의 영역) 과 핵산의 표적 영역, 예컨대 본원에 기재된 것들 사이의 "상보성" 정도를 결정할 때, "상보성" (또한, "상동성" 또는 "일치성") 정도는 올리고머 (또는 이의 영역) 의 서열과 이와 최상으로 정렬하는 표적 용역 (또는 표적 영역의 역 보체) 의 서열 사이의 % 일치성 (또는 % 상동성) 으로서 표현된다. 백분율은 2 개 서열 사이에 일치하는 정렬된 염기의 수를 세고, 올리고머 내 근접 단량체의 총 수로 나누고, 100 을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 갭이 존재하는 경우, 이러한 갭이 갭 내의 단량체의 수가 본 발명의 올리고머 및 표적 영역 사이에 상이한 영역 보다는 단지 미스매치인 것이 바람직하다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "상동" 및 "상동성" 은 용어 "일치성" 및 "일치" 와 상호교환적이다.
용어 "~ 에 상응하는" 및 "~ 에 상응한다" 는 올리고머의 뉴클레오티드 서열 (즉, 핵염기 또는 염기 서열) 또는 근접 뉴클레오티드 서열 (제 1 영역) 및 i) 핵산 표적의 역 보체의 서브-서열로부터 선택되는 추가의 서열의 동등한 근접 뉴클레오티드 서열 사이의 비교를 말한다. 뉴클레오티드 유사체는 이들의 동등한 또는 상응하는 뉴클레오티드와 직접 비교된다. i) 또는 ii) 하의 추가의 서열에 상응하는 제 1 서열은 전형적으로 제 1 서열 (예컨대, 근접 뉴클레오티드 서열) 의 길이에 대해 서열과 일치하거나, 또는 본원에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 상응하는 서열과 적어도 80% 상동, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 상동, 예컨대 100% 상동 (일치) 한다.
용어 "상응하는 뉴클레오티드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오티드" 는 뉴클레오티드 유사체 내의 뉴클레오티드 및 자연 발생적 뉴클레오티드가 일치하는 것을 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 2-데옥시리보오스 단위가 아데닌에 연결될 때, "상응하는 뉴클레오티드 유사체" 는 아데닌에 연결된 펜토오스 단위 (2-데옥시리보오스와 상이함) 를 함유한다.
본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "역 보체", "역 상보적" 및 "역 상보성" 은 용어 "보체", "상보적" 및 "상보성" 과 상호교환적이다.
올리고머의 근접 핵염기 서열 (제 1 영역 또는 제 1 및 제 2 영역) 은 따라서 표적, 예컨대 본원에 언급된 것들에 상보적일 수 있다.
일부 구현예에서, 제 1 영역 또는 제 1 및 제 2 영역은, 예를 들어, ApoB-100 (NM_000384.2 GI:105990531 또는 PCSK9 (NM_174936.3 GI:299523249) 를 포함하는, 본원에 언급된 것과 같은, mRNA 표적의 영역에 상보적인 단일 근접 핵염기 서열을 형성한다.
길이
올리고머는 총 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35 개의 근접 뉴클레오티드 길이의 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머는 총 10 - 22, 예컨대 12 - 18, 예컨대 13 - 17 또는 12 - 16, 예컨대 13, 14, 15, 16 개의 근접 뉴클레오티드 길이의 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 올리고머는 총 10, 11, 12, 13, 또는 14 개의 근접 뉴클레오티드 길이의 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 22 개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 20 개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 18 개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 15, 16 또는 17 개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 20 개 미만의 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고머, 또는 근접 뉴클레오티드 서열 길이에 대한 범위가 제시될 때, 이것은 범위 내에 제공된 하한 및 상한 길이도 포함되며, 예를 들어 10 내지 30 (또는 사이) 에는 10 과 30 도 모두 포함되는 것으로 이해되어야만 한다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체
본원에 사용되는 용어 "뉴클레오티드" 는 당 일부분 (또는 이의 유사체), 염기 일부분 및 공유 연결된 기 (연결 기), 예컨대 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 (internucleotide) 연결 기를 포함하는 글리코시드를 말하며, 자연 발생적 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 및 본원에서 "뉴클레오티드 유사체" 로서 언급되는 변형된 당 및/또는 염기 일부분을 포함하는 비-자연 발생적 뉴클레오티드 모두를 포괄한다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드 (단위) 는 또한 단량체 또는 핵산 단위로서 언급될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 용어 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 자연 발생적 뉴클레오티드/측면, 예컨대 DNA 및 RNA, 뿐 아니라 뉴클레오티드/측면 유사체 모두를 말하는 것으로 사용된다는 것이 인식될 것이다.
생화학 분야에서, 용어 "뉴클레오시드" 는 통상 당 일부분 및 염기 일부분을 포함하는 글리코시드를 말하는 것으로 사용되고, 따라서 올리고머의 뉴클레오티드 사이의 인터뉴클레오시드 연결에 의해 공유 연결된 뉴클레오티드 단위를 말할 때 사용될 수 있다. 생명공학 분야에서, 용어 "뉴클레오티드" 는 종종 핵산 단량체 또는 단위를 말하기 위해 사용되고, 올리고뉴클레오티드의 문맥에서는 염기 - 예컨대 "뉴클레오티드 서열" 을 말할 수 있으며, 전형적으로 핵염기 서열 (즉, 당 백본 및 인터뉴클레오시드 연결의 존재가 내포됨) 을 말한다. 마찬가지로, 특히 인터뉴클레오시드 연결 기 중 하나 이상이 변형된 올리고뉴클레오티드의 경우, 용어 "뉴클레오티드" 는 "뉴클레오시드" 를 말할 수 있다. 예를 들어 용어 "뉴클레오티드" 는 심지어 뉴클레오시드 사이의 연결의 존재 또는 특성을 구체화할 때 사용될 수 있다.
5' 말단 기를 포함할 수 있거나 없을 수 있지만, 당업자는, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드가 5' 인터뉴클레오시드 연결 기를 포함하지 않는다는 것을 인지할 것이다.
비-자연 발생적 뉴클레오티드는 변형된 당 일부분, 예컨대 비시클릭 뉴클레오티드 또는 2' 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오티드를 가진 뉴클레오티드를 포함한다.
"뉴클레오티드 유사체" 는 당 및/또는 염기 일부분 중의 변형에 의한, 천연 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 변이체이다. 유사체는 원칙적으로 올리고뉴클레오티드의 문맥에서 천연 뉴클레오티드에 대해 단지 "침묵" 또는 "동등한" 것일 수 있다, 즉 올리고뉴클레오티드가 표적 유전자 발현을 억제하기 위해 작동하는 방식에 기능적인 영향을 주지 않는다. 그럼에도 불구하고 이러한 "동등한" 유사체는, 예를 들어, 이들이 제조하기가 용이하거나 저렴할 때, 또는 저장 또는 제조 조건에서 더욱 안정할 때, 또는 태그 또는 라벨을 나타낼 때 유용할 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 유사체는, 예를 들어 표적에 대한 결합 친화성 증가 및/또는 세포내 뉴클레아제에 대한 내성 증가 및/또는 세포 내 수송의 용이성 증가를 산출함으로써, 올리고머가 발현을 억제하기 위해 작동하는 방식에 기능적인 영향을 줄 것이다. 뉴클레오시드 유사체의 특이적인 예는 예를 들어, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 및 하기 도식 1 에 의해 기재된다:
Figure pct00006
도식 1
올리고머는 따라서 자연 발생적 뉴클레오티드 - 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드 (본원에서 일반적으로 "DNA" 로서 언급됨), 그러나 또한 가능하게는 리보뉴클레오티드 (본원에서 일반적으로 "RNA" 로서 언급됨), 또는 이러한 자연 발생적 뉴클레오티드 및 하나 이상의 비-자연 발생적 뉴클레오티드, 즉, 뉴클레오티드 유사체의 조합의 단순한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 유사체는 적합하게는 표적 서열에 대한 올리고머의 친화성을 향상시킬 수 있다.
적합하고 바람직한 뉴클레오티드 유사체의 예는 WO2007/031091 에 의해 제공되거나 그 곳에 참조된다. 본 발명의 올리고머에서 사용될 수 있는 기타 뉴클레오티드 유사체에는 트리시클릭 핵산이 포함되고, 예를 들어 본원에 참조로서 인용된 WO2013154798 및 WO2013154798 을 참조한다.
올리고머 내에 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 또는 2'-치환된 당의 도입은 특이적으로 결합하는 올리고머의 크기를 감소시킬 수 있고, 또한 비-특이적 또는 일탈 결합이 일어나기 전에 올리고머의 크기에 대한 상한을 감소시킬 수 있다.
올리고머성 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 영역 A, 및 일부 선택적 구현예에서는, 영역 B 를 포함하는, 본원에 언급된 화합물은 당 기가 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드를 함유할 수 있다. 이러한 당 변형된 뉴클레오시드 (뉴클레오시드 유사체) 는 안티센스 화합물에 향상된 뉴클레아제 안정성, 증가된 결합 친화성, 또는 일부 기타 유리한 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드는 화학적으로 변형된 리보피라노오스 고리 일부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고머, 또는 이의 제 1 영역은, 하나 이상의, 예컨대 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24 또는 25 개의 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 당 변형된 뉴클레오시드 유사체를 포함한다.
비시클릭 뉴클레오시드 유사체는 리보오스 고리, (C4*-C2* 가교 또는 비라디칼 (2-라디칼)) 의 2 번째 및 4 번째 탄소를 연결하는 가교 (또는 비라디칼)을 포함하는 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 2 번째 및 4 번째 탄소 사이의 비라디칼의 존재는 리보오를 3' 엔도- (북쪽) 확인 (confirmation) 내로 잠그고, C2*-C4* 비라디칼을 가진 이러한 비시클릭 뉴클레오시드 유사체를 종종 잠금 핵산 (LNA: Locked nucleic acid) 이라고 부른다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체는 임의로 독립적으로, 예컨대 (임의로 독립적으로) 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-AP, 2'-FANA, 2'-(3-히드록시)프로필, 및 2'-플루오로-DNA 단위, 및/또는 기타 (임의로) 당 변형된 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 모르폴리노, 펩티드 핵산 (PNA), CeNA, 비-연결된 핵산 (UNA), 헥시톨 핵산 (HNA). 비시클로-HNA (예를 들어, WO2009/100320 참조) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 비시클릭 뉴클레오시드 유사체 (예컨대, LNA), 및/또는 2' 치환된 뉴클레오시드 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체는 제 1 영역의 이의 표적 핵산 (또는 상보적 DNA 또는 RNA 서열) 에 대한 친화성을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 올리고머는 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 영역은 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, LNA) 및/또는 2'-치환된 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 내에 존재하는 뉴클레오시드 유사체는 모두 동일한 당 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 영역 내에 존재하는 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체는 비시클릭 뉴클레오시드 유사체이다, 예컨대 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16 개의, 예를 들어 모든 뉴클레오시드 유사체 (영역 B 의 DNA 및 또는 RNA 뉴클레오시드 제외) 는 당 변형된 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 비시클릭 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA, 예를 들어, 베타-D-X-LNA 또는 알파-L-X-LNA (식 중, X 는 옥시, 아미노 또는 티오임), 또는 (R/S) cET, cMOE 또는 5'-Me-LNA 를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 기타 LNA 이다.
화학적으로 변형된 리보피라노오스 고리의 예에는, 제한 없이 치환기 군 (5' 및 2' 치환기 군 포함) 의 첨가; 비시클릭 핵산 (BNA) 을 형성하기 위한 비-같은자리 (geminal) 고리 원자의 가교; 리보실 고리 산소 원자의 S, N(R), 또는 C(R1)(R2) (R = H, C1 -C2 알킬 또는 보호기) 로의 대체; 및 이의 조합이 포함된다. 화학적으로 변형된 당의 예에는, 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오시드 (기타 기재된 5', 2'-비스 치환된 뉴클레오시드에 대해, 8/21/08 에 공개된, PCT 국제 출원 WO 2008/101157 을 참조함), 리보실 고리 산소 원자의 2'-위치에서의 추가 치환이 있는 S 로의 대체 (2005 년 6 월 16 일에 공개된, 공개 미국 특허 출원 US2005/0130923 참조), 또는, 대안적으로는, BNA 의 5'-치환 (LNA 가, 예를 들어, 5'-메틸 또는 5'-비닐 기로 치환된 11/22/07 에 공개된, PCT 국제 출원 WO 2007/134181 참조) 이 포함된다.
변형된 당 일부분을 갖는 뉴클레오시드의 예에는, 제한 없이, 5'-비닐, 5'-메틸 (R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 및 2'-O(CH2)2 O CH3 치환기 군을 포함하는 뉴클레오시드가 포함된다. 2' 위치에서의 치환기는 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, O (CH2)2SCH3, O (CH2)2- O -N(Rm)(Rn), 및 O -CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) (식 중, 각각의 Rm 및 Rn 은, 독립적으로, H 또는 치환된 또는 미치환된 C1-C10 알킬임) 으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "비시클릭 뉴클레오시드" 는 비시클릭 당 일부분을 포함하는 변형된 뉴클레오시드를 말한다. 비시클릭 뉴클레오시드의 예에는 제한 없이, 4' 및 2' 리보실 고리 원자 사이에 가교를 포함하는 뉴클레오시드가 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 화합물에는 가교가 4' 에서 2' 비시클릭 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오시드가 포함된다. 이러한 4' 에서 2' 비시클릭 뉴클레오시드의 예에는 제한 없이, 하기 식 중 하나 이상: 4'-(CH2)- O -2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4,-(CH2)2- O -2' (ENA); 4'-CH(CH3)- O -2' 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2*, 및 이의 유사체 (참조, 2008 년 7 월 15 일에 제출된, U.S. Patent 7,399,845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2', 및 이의 유사체 (참조, 2009 년 1 월 8 일에 공개된, 공개 PCT 국제 출원 WO2009/006478); 4'-CH2-N(OCH3)-2', 및 이의 유사체 (참조, 2008 년 12 월 11 일에 공개된, 공개 PCT 국제 출원 WO2008/150729); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (참조, 2004 년 9 월 2 일에 공개된, 공개 U.S. 특허 출원 US2004/0171570); 4'-CH2-N(R)- O -2' (식 중, R 은 H, C1-C10 알킬, 또는 보호기임) (참조, 2008 년 9 월 23 일에 제출된, U.S. Patent 7,427,672); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (참조, Chattopadhyaya, et al, J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134); 및 4'-CH2-C(=CH2)-2', 및 이의 유사체 (참조, 2008 년 12 월 8 일에 공개된, 공개 PCT 국제 출원 WO 2008/154401) 가 포함된다. 또한, 예를 들어: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; U.S. Patent Nos U.S. 6,670,461, 7,053,207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 7,399,845; 공개 PCT 국제 출원 WO 2004/106356, WO 94/14226, WO 2005/021570, 및 WO 2007/134181; U.S. 특허 출원 번호 US2004/0171570, US2007/0287831, 및 US2008/0039618; 및 U.S. 특허 일련 번호 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787, 및 61/099,844; 및 PCT 국제 출원 번호 PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154, 및 PCT/US2008/068922 를 참조한다. 하기 비시클릭 뉴클레오시드 각각은 예를 들어 a-L-리보푸라노오스 및 베타-D-리보푸라노오스를 포함하는 하나 이상의 입체화학 당 배치를 갖도록 제조될 수 있다 (참조, PCT 국제 출원 PCT DK98/00393, 1999 년 3 월 25 일 공개, WO 99/14226).
일부 구현예에서, BNA 뉴클레오시드의 비시클릭 당 일부분에는 제한 없이, 펜토푸라노실 당 일부분의 4' 내지 2' 위치 사이에 하나 이상의 가교를 갖는 화합물이 포함되고, 이러한 가교는 독립적으로 하기로부터 선택되는 1 또는, 2 내지 4 개의 연결된 기를 독립적으로 포함한다: -[CiRaXRb)],,-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, - O -, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, 및 -N(Ra)-; 식 중: x 는 0, 1, 또는 2 이고; n 은 1, 2, 3, 또는 4 이고; 각각의 Ra 및 Rb 는 독립적으로, H, 보호기, 히드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환족 라디칼, 치환된 C5-C7 지환족 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)- H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1) 이고; 각각의 J1 및 J2 는독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)- H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬, 또는 보호기임.
일부 구현예에서, 비시클릭 당 일부분의 가교는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n- O -, -C(RaRb)-N(R)- O - 또는, -C(RaRb)- O -N(R)- 이다. 일부 구현예에서, 가교는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'- (CH2)3-2', 4'-CH2- O -2', 4*-(CH2)2- O -2', 4'-CH2- O -N(R)-2', 및 4'-CH2-N(R)- O -2'- (식 중, 각각의 R 은 독립적으로, H, 보호기, 또는 C1-C12 알킬임) 이다.
일부 구현예에서, 비시클릭 뉴클레오시드는 이성체 배치에 의해 추가로 정의된다. 예를 들어, 4'-2' 메틸렌-옥시 가교를 포함하는 뉴클레오시드는 a-L 배치 또는 베타- D 배치로 있을 수 있다. 이전에, a-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA 는 안티센스 활성을 나타내는 안티센스 올리고뉴클레오티드 내로 도입되었다 (Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
일부 구현예에서, 비시클릭 뉴클레오시드에는 하기에 명시되는 바와 같은, (A) a-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (B) 베타-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F), 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) 메틸렌-티오 (4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노 (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 카르보시클릭 (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, 및 (J) 프로필렌 카르보시클릭 (4'-(CH2)3-2') BNA 가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
Figure pct00007
(식 중, Bx 는 염기 일부분이고, R 은 독립적으로, H, 보호기 또는 C1-C2 알 킬임). 일부 구현예에서, 비시클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 I 을 갖는다:
Figure pct00008
(식 중:
Bx 는 헤테로시클릭 염기 일부분이고;
-Qa-Qb-Qc- 는 -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O-, 또는 -N(Rc)-O-CH2 이고;
Rc 는 C1-C12 알킬 또는 아미노 보호기이고;
Ta 및 Tb 는 각각, 독립적으로, H, 히드록실 보호기, 콘쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 일부분, 또는 지지체 매질에 대한 공유 부착점임).
일부 구현예에서, 비시클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 II 를 갖는다:
Figure pct00009
(식 중:
Bx 는 헤테로시클릭 염기 일부분이고;
Ta 및 Tb 는 각각, 독립적으로, H, 히드록실 보호기, 콘쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 일부분, 또는 지지체 매질에 대한 공유 부착점이고; Za 는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티올임).
일부 구현예에서, 각각의 치환된 기는 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJc, NJ d, SJC, N3, OC(=X)Jc, 및 NJeC(=X)NJcJd (식 중, 각각의 Jc, Jd, 및 Je 는 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이고, X 는 O 또는 NJC 임) 로부터 독립적으로 선택되는 치환기 군으로 모노 또는 폴리 치환된다.
일부 구현예에서, 비시클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 III 을 갖는다:
Figure pct00010
(식 중:
Bx 는 헤테로시클릭 염기 일부분이고;
Ta 및 Tb 는 각각, 독립적으로, H, 히드록실 보호기, 콘쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 일부분, 또는 지지체 매질에 대한 공유 부착점이고;
Rd 는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 또는 치환된 아실 (C(=O)-) 임).
일부 구현예에서, 비시클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 IV 를 갖는다:
Figure pct00011
(식 중:
Bx 는 헤테로시클릭 염기 일부분이고;
Ta 및 Tb 는 각각, 독립적으로, H, 히드록실 보호기, 콘쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 일부분, 또는 지지체 매질에 대한 공유 부착점이고;
Rd 는 C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐이고; 각각의 qb, qc 및 qd 는 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-Ce 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕실, 치환된 Q- C6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-C6 아미노알킬, 또는 치환된 C1-C6 아미노알킬임);
일부 구현예에서, 비시클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 V 를 갖는다:
Figure pct00012
(식 중:
Bx 는 헤테로시클릭 염기 일부분이고;
Ta 및 Tb 는 각각, 독립적으로, H, 히드록실 보호기, 콘쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 일부분, 또는 지지체 매질에 대한 공유 부착점이고; qa, qb, qc 및 qf 는 각각, 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk 이거나; 또는 qe 및 qf 는 함께 =C(qg)(qh) 이고; qg 및 qh 는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C12 알킬, 또는 치환된 C1-C12 알킬임).
메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA 단량체 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민, 및 우라실의 합성 및 제조, 이들의 올리고머화와 함께, 및 핵산 인지 특성을 기재하였다 (예를 들어, Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630 참조). BNA 및 이의 제조는 또한 WO 98/39352 및 WO 99/14226 에 기재된다.
메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, 및 2'-티오-BNA 의 유사체가 또한 제조되었다 (예를 들어, Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222 참조). 핵산 폴리머라아제에 대한 기질로서 올리고데옥시리보뉴클레오티드 이중체를 포함하는 잠금 뉴클레오시드 유사체의 제조가 또한 기재된다 (예를 들어, Wengel et al., WO 99/14226 참조). 게다가, 신규한 형태적으로 제약된 고-친화성 올리고뉴클레오티드 유사체인 2'-아미노-BNA 의 합성이 당업계에 기재되어 있다 (예를 들어, Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039 참조). 또한, 2'- 아미노- 및 2'-메틸아미노-BNA 가 제조되었고, 상보적 RNA 및 DNA 가닥을 가진 이들의 이중체의 열 안정성은 이전에 보고되었다.
일부 구현예에서, 비시클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 VI 을 갖는다:
Figure pct00013
(식 중:
Bx 는 헤테로시클릭 염기 일부분이고;
Ta 및 Tb 는 각각, 독립적으로, H, 히드록실 보호기, 콘쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 일부분, 또는 지지체 매질에 대한 공유 부착점이고; 각각의 qj, qj, qk 및 ql 은 독립적으로, H, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕실, 치환된 C2-C12 알콕실, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk, 또는 (H)C(=S)NJjJk 이고; qi 및 qj 또는 ql 및 qk 는 함께 =C(qg)(qh) 이고, qg 및 qh 는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C12 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬임).
4'-(CH2)3-2' 가교 및 알케닐 유사체를 갖는 하나의 카르보시클릭 비시클릭 뉴클레오시드, 가교 4'-CH=CH-CH2-2' 가 기재된다 (예를 들어, Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 및 Albaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-77 '40). 카르보시클릭 비시클릭 뉴클레오시드의 합성 및 제조와 이들의 올리고머화 및 생화학적 연구가 또한 가 기재된다 (예를 들어, Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "4'-2' 비시클릭 뉴클레오시드" 또는 "4' 내지 2' 비시클릭 뉴클레오시드" 는 2' 탄소 원자 및 4' 탄소 원자를 연결하는 가교를 포함하는 푸라노스 고리를 포함하는 비시클릭 뉴클레오시드를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "모노시클릭 뉴클레오시드" 는 비시클릭 당 일부분이 아닌 변형된 당 일부분을 포함하는 뉴클레오시드를 말한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드의 당 일부분, 또는 당 일부분 유사체는 임의의 위치에서 변형되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "2'-변형된 당" 은 2' 위치에서 변형된 푸라노실 당을 의미한다. 일부 구현예에서, 이러한 변형은: 치환된 및 비치환된 알콕시, 치환된 및 비치환된 티오알킬, 치환된 및 비치환된 아미노 알킬, 치환된 및 비치환된 알킬, 치환된 및 비치환된 알릴, 및 치환된 및 비치환된 알키닐을 제한 없이 포함하는 할라이드로부터 선택된 치환기를 포함한다. 일부 구현예에서, 2' 변형은: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2 (식 중, n 및 m 은 1 내지 약 10 임) 를 포함하는 치환기로부터 선택되나 이에 제한되지 않는다. 다른 2'- 치환기 군은 또한: C1-C12 알킬; 치환된 알킬; 알케닐; 알키닐; 알크아릴; 아르알킬; O-알크아릴 또는 O-아르알킬; SH; SCH3; OCN; CI; Br; CN; CF3; OCF3; SOCH3; S02CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; R; 분할기; 리포터 기; 삽입제 (intercalator); 약동학 특성을 개선하기 위한 기; 및 안티센스 화합물의 약역학 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드는 2'-MOE 측쇄를 포함한다 (예를 들어, Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 1 1944-12000 참조). 이러한 2'-MOE 치환은 비변형된 뉴클레오시드 및 기타 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2'- O- 메틸, O-프로필, 및 O-아미노프로필과 비교해 개선된 결합 친화성을 갖는 것으로 기재된다. 2 -MOE 치환기를 갖는 올리고뉴클레오티드는 또한 생체 내 용도를 위한 유망한 특성을 가진 유전자 발현의 안티센스 억제제인 것으로 제시되었다 (예를 들어, Martin, P., He/v. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; and Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 테트라히드로피란 뉴클레오시드" 또는 "변형된 THP 뉴클레오시드" 는 정상 뉴클레오시드 내 펜토푸라노실 잔기에 대해 치환된 6-원 테트라히드로피란 "당" (당 대리물) 을 갖는 뉴클레오시드를 의미한다. 변형된-THP 뉴클레오시드는 헥시톨 핵산 (HNA), 아니톨 핵산 (ANA), 만니톨 핵산 (MNA) (참조, Leumann, CJ. Bioorg. and Med. Chem. (2002) 10:841-854), 플루오로 HNA (F-HNA) 으로서 당업계에서 언급되는 것들, 또는 하기 화학식 X 를 갖는 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다:
화학식
Figure pct00014
X (식 중, 화학식 X 의 상기 하나 이상의 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체의 각각에 대해 독립적으로:
Bx 는 헤테로시클릭 염기 일부분이고;
T3 및 T4 는 각각, 독립적으로, 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체를 안티센스 화합물에 연결하는 인터뉴클레오시드 연결 기이고 또는 T3 및 T4 중 하나는 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체를 안티센스 화합물에 연결하는 인터뉴클레오시드 연결 기이고 T3 및 T4 중 다른 것은 H, 히드록실 보호기, 연결된 콘쥬게이트 기, 또는 5' 또는 3'-말단 기이고; q1 q2 q3 q4 q5, q6 및 q7 은 각각, 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고; R1 및 R2 중 하나는 수소이고, 다른 것은 할로겐, 치환된 또는 미치환된 알콕시, NJ,J2, SJ,, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X) NJ1J2 및 CN 으로부터 선택되고, X 는 O, S, 또는 NJ1 이고, J1, J2, 및 J3 각각은, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬임).
일부 구현예에서, 화학식 X 의 변형된 THP 뉴클레오시드는 식 중 qm, qn, qp, qr, qs, qt, 및 qu 가 각각 H 인 것으로 제공된다. 일부 구현예에서, qm, qn, qp, qr, qs, qt 및 qu 중 하나 이상은 H 이외의 것이다. 일부 구현예에서, qm, qn, qp, qr, qs, qt 및 qu 중 하나 이상은 메틸이다. 일부 구현예에서, 화학식 X 의 THP 뉴클레오시드는 R1 및 R2 중 하나가 F 인 것으로 제공된다. 일부 구현예에서, R1 은 플루오로이고, R2 는 H 이고, R1 은 메톡시이고, R2 는 H 이고, R1 은 메톡시에톡시이고, R2 는 H 이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "2'-변형된" 또는 "2'-치환된" 은 H 또는 OH 이외의 2' 위치에 치환기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오시드를 말한다. 2'-변형된 뉴클레오시드는 비-가교 2' 치환기를 갖는 뉴클레오시드, 예컨대 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O- N(Rm)(Rn), 또는 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), (식 중, 각각의 Rm 및 R- 는, 독립적으로, H 또는 치환된 또는 미치환된 C1-C10 알킬임) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 2'-변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 당의 다른 위치에서 및/또는 핵염기에서 기타 변형을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "2'-F" 는 2' 위치에서 플루오로 기를 포함하는 당을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "2'-OMe" 또는 "2'-OCH3" 또는 "2'-O-메틸" 은 각각 당 고리의 2' 위치에서 -OCH3 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오시드를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "올리고뉴클레오티드" 는 다수의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 화합물을 말한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드의 다수 중 하나 이상은 변형된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 리보뉴클레오시드 (RNA) 및/또는 데옥시리보뉴클레오시드 (DNA) 를 포함한다.
많은 기타 비시클로 및 트리시클로 당 대리물 고리 시스템은 또한 안티센스 화합물 내로의 도입을 위해 뉴클레오시드를 변형하는데 사용될 수 있는 것으로 당업자에게 공지된다 (예를 들어, 리뷰 논문: Leumann, J. C, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854 참조). 이러한 고리 시스템은 활성을 향상시키기 위해 다양한 부가적인 치환을 겪을 수 있다. 변형된 당의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 변형된 당 일부분을 갖는 뉴클레오티드에서, 핵염기 일부분 (천연, 변형된, 또는 이의 조합) 은 적합한 핵산 표적으로의 혼성화를 위해 유지된다.
일부 구현예에서, 안티센스 화합물은 변형된 당 일부분을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 당 일부분은 2'-MOE 이다. 일부 구현예에서, 2'-MOE 변형된 뉴클레오티드는 갭머 모티프로 정렬된다. 일부 구현예에서, 변형된 당 일부분은 cEt 이다. 일부 구현예에서, cEt 변형된 뉴클레오티드는 갭머 모티프의 날개를 통해 정렬된다.
일부 구현예에서, BNA (LNA) 에서, R4* 및 R2* 는 함께 2-라디칼 -O-CH(CH2OCH3)- (2'O-메톡시에틸 비시클릭 핵산 - Seth at al., 2010, J. Org. Chem) - R- 또는 S- 배치 - 로 지정된다.
일부 구현예에서, BNA (LNA) 에서, R4* 및 R2* 는 함께 2-라디칼 -O-CH(CH2CH3)- (2'O-에틸 비시클릭 핵산 - Seth at al., 2010, J. Org. Chem). - R- 또는 S- 배치 - 로 지정된다.
일부 구현예에서, BNA (LNA) 에서, R4* 및 R2* 는 함께 2-라디칼 -O-CH(CH3)-. - R- 또는 S- 배치 - 로 지정된다. 일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 2-라디칼 -O-CH2-O-CH2- - (Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 로 지정된다.
일부 구현예에서, BNA (LNA) 에서, R4* 및 R2* 는 함께 2-라디칼 -O-NR-CH3-- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 로 지정된다.
일부 구현예에서, LNA 단위는 하기 군으로부터 선택되는 구조를 갖는다:
Figure pct00015
올리고머는 따라서 단순한 서열의 자연 발생적 뉴클레오티드 - 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드 (본원에서 일반적으로 "DNA" 로서 언급됨), 그러나 또한 가능하게는 리보뉴클레오티드 (본원에서 일반적으로 "RNA" 로서 언급됨), 또는 이러한 자연 발생적 뉴클레오티드 및 하나 이상의 비-자연 발생적 뉴클레오티드, 즉, 뉴클레오티드 유사체의 조합을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 유사체는 표적 서열에 대한 올리고머의 친화성을 적합하게 향상시킬 수 있다.
올리고머, 예컨대 BNA, (예를 들어) LNA 또는 2'-치환된 당 내의 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체의 도입은, 특이적으로 결합하는 올리고머의 크기를 감소실 수 있고, 또한 비-특이적 또는 일탈적 결합이 일어나기 전에 올리고머의 크기에 상한을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머는 적어도 1 개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머는 적어도 2 개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머는 3-8 개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어, 6 또는 7 개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 훨씬 가장 바람직한 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 유사체 중 하나 이상은 BNA, 예컨대 잠금 핵산 (LNA) 이고; 예를 들어 적어도 3 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7, 또는 8 개의 뉴클레오티드 유사체는 BNA, 예컨대 LNA 일 수 있다. 일부 구현예에서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 BNA, 예컨대 LNA 일 수 있다.
오로지 뉴클레오티드만으로 이루어지는 바람직한 뉴클레오티드 서열 모티프 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 때, 서열에 의해 정의된 본 발명의 올리고머가 상기 서열에 존재하는 뉴클레오티드 중 하나 이상 대신에 상응하는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대, 올리고머/표적 이중체 (즉, 친화성 향상 뉴클레오티드 유사체) 의 이중체 안정성/Tm 을 상승시키는 BNA 단위 또는 기타 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
바람직한 뉴클레오티드 유사체는 LNA, 예컨대 옥시-LNA (예컨대, 베타-D-옥시-LNA, 및 알파-L-옥시-LNA), 및/또는 아미노-LNA (예컨대, 베타-D-아미노-LNA 및 알파-L-아미노-LNA) 및/또는 티오-LNA (예컨대, 베타-D-티오-LNA 및 알파-L-티오-LNA) 및/또는 ENA (예컨대, 베타-D-ENA 및 알파-L-ENA) 이다. 가장 바람직한 것은 베타-D-옥시-LNA 이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 내에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 독립적으로, 예를 들어: 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, BNA 단위, 예를 들어, LNA 단위, 아라비노 핵산 (ANA) 단위, 2'-플루오로-ANA 단위, HNA 단위, INA (삽입형 핵산 -Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925, 본원에 참조로서 인용됨) 단위 및 2'MOE 단위로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머에 존재하는 상기 유형의 뉴클레오티드 유사체 중 오직 하나, 예컨대 제 1 영역, 또는 이의 근접 뉴클레오티드 서열이 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메톡시에틸-RNA (2'MOE), 2'-플루오로-DNA 단량체 또는 LNA 뉴클레오티드 유사체이고, 예컨대 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상기 3 개 유형의 유사체로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있거나, 또는 3 개 유형으로부터 선택되는 유사체 중 오직 하나의 유형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 유사체 중 하나 이상은 2'-MOE-RNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 2'-MOE-RNA 뉴클레오티드 단위이다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 유사체 중 하나 이상은 2'-플루오로 DNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 2'-플루오로-DNA 뉴클레오티드 단위이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 올리고머는 하나 이상의 BNA, 예를 들어, 잠금 핵산 (LNA) 단위, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 BNA/LNA 단위, 예컨대 3 - 7 또는 4 내지 8 개의 BNA/LNA 단위, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 BNA/LNA 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 BNA, 예컨대 LNA 이다. 일부 구현예에서, 올리고머는 베타-D-옥시-LNA, 및 하기 LNA 단위 중 하나 이상: 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, 및/또는 ENA 를 베타-D 또는 알파-L 배치 또는 이의 조합으로 모두 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 모든 BNA, 예컨대 LNA, 시토신 단위는 5'메틸-시토신이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 올리고머 (예컨대, 제 1 및 임의로 제 2 영역) 는 BNA 및 LNA 및 DNA 단위 둘다를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LNA 및 DNA 단위의 조합된 총 수는 10-25, 예컨대 10 - 24, 바람직하게는 10-20, 예컨대 10 - 18, 예컨대 12-16 이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 올리고머, 이의 제 1 영역의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 근접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 BNA, 예를 들어, LNA 로 이루어지고, 남아있는 뉴클레오티드 단위는 DNA 단위이다. 일부 구현예에서, 올리고머, 또는 이의 제 1 영역은, 오로지 BNA, 예를 들어, LNA, 뉴클레오티드 유사체 및 자연 발생적 뉴클레오티드 (예컨대, RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 뉴클레오티드) (임의로 변형된 인터뉴클레오티드 연결, 예컨대 포스포로티오에이트를 가짐) 를 포함한다.
용어 "핵염기" 는 뉴클레오티드의 염기 일부분을 말하고 자연 발생적 뿐 아니라 비-자연 발생적 변이체 모두를 포괄한다. 따라서, "핵염기" 는 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클 뿐 아니라 또한 이의 헤테로시클릭 유사체 및 토토머도 포괄한다. 영역 B 의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드는 자연 발생적 및/또는 비-자연 발생적 핵염기(들) 을 가질 수 있다는 것이 인식될 것이다.
핵염기의 예에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 잔틴, 하이포잔틴, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 5-메틸시토신으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 및 5-메틸시토신으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머에 존재하는 핵염기 중 하나 이상은 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 변형된 핵염기이다.
LNA
용어 "LNA" 는 C2* - C4* 2-라디칼 (가교) 을 포함하는 비시클릭 뉴클레오시드 유사체로서 불리고, "잠금 핵산" 으로 공지된다. 이것은 LNA 단량체를 말할 수 있고, 또는, "LNA 올리고뉴클레오티드" 의 문맥에서 사용되는 경우, LNA 는 하나 이상의 이러한 비시클릭 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 일부 양상에서, 비시클릭 뉴클레오시드 유사체는 LNA 뉴클레오티드이고, 상기 용어는 따라서 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이러한 구현예에서, 둘다 리보오스 당 고리의 C2' 및 C4' 사이에 링커 기 (예컨대, 가교) 의 존재에 의해 특징화된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물에 사용되는 LNA 는 바람직하게는 하기 일반 화학식 II 의 구조를 갖는다:
Figure pct00016
화학식 II
(식 중, Y 는 -O-, -CH2O-, -S-, -NH-, N(Re) 및/또는 -CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Z 및 Z* 은 인터뉴클레오티드 연결, RH, 말단 기 또는 보호기 중에서 독립적으로 선택되고; B 는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기 일부분 (핵염기) 을 구성하고, RH 는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고; Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re 는, 임의로 독립적으로, 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 히드록시, C1-12-알콕시, C2-12-알콕시알킬, C2-12-알케닐옥시, 카르복시, C1-12-알콕시카르보닐, C1-12-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로-아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적으로 활성인 기, 열화학적으로 활성인 기, 킬레이트기, 리포터 기, 및 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2 개의 같은자리 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 지정할 수 있고; RH 는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택됨). 일부 구현예에서, Ra, Rb, Rc, Rd 및 Re 는, 임의로 독립적으로, 수소 및 C1-6 알킬, 예컨대 메틸로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 대해, 비대칭 기는 R 또는 S 방향으로 발견될 수 있는데, 예를 들어, 2 개의 예시적 입체화학 이성체는 베타-D 및 알파-L 이소형을 포함하며, 이것은 하기와 같이 예증될 수 있다:
Figure pct00017
특이적인 예시적 LNA 단위가 하기에 제시된다:
Figure pct00018
Figure pct00019
β-D-옥시-LNA α-L-옥시-LNA
Figure pct00020
Figure pct00021
β-D-티오-LNA β-D-ENA
Figure pct00022
β-D-아미노-LNA
용어 "티오-LNA" 는 상기 일반 화학식 중의 Y 가 S 또는 -CH2-S- 로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 티오-LNA 는 베타-D 및 알파-L-배치 모두일 수 있다.
용어 "아미노-LNA" 는 상기 일반 화학식 중의 Y 가 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, 및 -CH2-N(R)- (식 중, R 는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택됨) 로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 아미노-LNA 는 베타-D 및 알파-L-배치 모두일 수 있다.
용어 "옥시-LNA" 는 상기 일반 화학식 중의 Y 가 -O- 를 나타내는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 옥시-LNA 는 베타-D 및 알파-L-배치 모두일 수 있다.
용어 "ENA" 는 상기 일반 화학식 중의 Y 가 -CH2-O- (-CH2-O- 의 산소 원자는 염기 B 에 대해 2'-위치에 부착됨) 인 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. Re 는 수소 또는 메틸이다.
일부 예시적인 구현예에서, LNA 는 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA, 특히 베타-D-옥시-LNA 로부터 선택된다.
RNAse 모집
올리고머성 화합물은 표적 mRNA 의 비 RNase 매개된 분해를 통해, 예컨대 번역의 입체 장애, 또는 다른 방법에 의해 작용할 수 있음을 인지한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 엔도리보뉴클레아제 (RNase), 예컨대 RNase H 를 모집할 수 있다.
이러한 올리고머, 예컨대 영역 A, 또는 근접 뉴클레오티드 서열은, 상보적 표적 RNA 와 이중체로 형성될 때, RNase 를 모집할 수 있는 적어도 6, 예컨대 적어도 7 개의 연속 뉴클레오티드 단위, 예컨대 적어도 8 또는 적어도 9 연속 뉴클레오티드 단위 (잔기) (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 연속 뉴클레오티드를 포함) 의 영역을 포함하는 것이 바람직하다. RNAse 를 모집할 수 있는 근접 서열은 본원에 기재된 바와 같은 갭머의 문맥에서 언급되는 바와 같은 영역 Y' 일 수 있다. 일부 구현예에서, RNAse 를 모집할 수 있는 근접 서열, 예컨대 영역 Y' 의 크기는 더 높을 수 있다, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 뉴클레오티드 단위일 수 있다.
EP 1 222 309 는 RNaseH 를 모집하는 능력을 측정하는데 사용될 수 있는 RNaseH 활성의 측정을 위한 시험관 내 방법을 제공한다. 올리고머는 상보적 RNA 표적과 함께 제공되는 경우 RNase H 를 모집할 수 있는 것으로 간주되는데, 이것은 EP 1 222 309 의 실시예 91 - 95 에 의해 제공되는 방법론을 사용하여, 올리고뉴클레오티드 내 모든 단량체 사이의 포스포로티오에이트 연결 기를 가진, 2' 치환이 없는, 동일한 염기 서열을 갖지만 DNA 단량체만을 함유하는 DNA 유일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 측정된, pmol/l/분으로 측정되는 바와 같은, 적어도 1%, 예컨대 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 의 초기 속도 또는 20% 초과의 초기 속도를 갖는다.
일부 구현예에서, 올리고머는 상보적 RNA 표적, 및 RNaseH 와 함께 제공되는 경우 RNaseH 를 모집할 수 없는 것으로 본질적으로 간주되는데, pmol/l/분으로 측정되는 바와 같은, RNaseH 초기 속도는 EP 1 222 309 의 실시예 91 - 95 에 의해 제공되는 방법론을 사용하여, 올리고뉴클레오티드 내 모든 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결 기를 가진, 2' 치환이 없는, 동등한 DNA 유일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 측정된, 1% 미만, 예컨대 5% 미만, 예컨대 10% 미만 또는 20% 미만의 초기 속도이다.
다른 구현예에서, 올리고머는 상보적 RNA 표적, 및 RNaseH 와 함께 제공되는 경우 RNaseH 를 모집할 수 있는 것으로 간주되는데, pmol/l/분으로 측정되는 바와 같은, RNaseH 초기 속도는 EP 1 222 309 의 실시예 91 - 95 에 의해 제공되는 방법론을 사용하여, 올리고뉴클레오티드 내 모든 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결 기를 가진, 2' 치환이 없는, 동등한 DNA 유일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 측정된, 적어도 20%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 80% 의 초기 속도이다.
전형적으로는 상보적 표적 RNA 와 이중체로 형성되는 경우 RNase 를 모집할 수 있는 연속 뉴클레오티드 단위를 형성하는 올리고머의 영역은 RNA 표적과 함께 DNA/RNA 유사 이중체를 형성하는 뉴클레오티드 단위로 이루어진다. 본 발명의 올리고머, 예컨대 제 1 영역은 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 모두를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 예를 들어, 갭머, 헤드머 또는 믹스머의 형태일 수 있다.
"헤드머" 는 영역 X' 의 3'-최대 단량체에 연결된 영역 Y' 의 5'-최대 단량체와 함께, 그곳에 근접한 영역 X' 및 영역 Y' 를 포함하는 올리고머로서 정의된다. 영역 X' 는 비-RNase 모집 뉴클레오시드 유사체의 근접 신장부 (stretch) 를 포함하고, 영역 Y' 는 RNase 에 의해 인식가능하고 분할가능한 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체의 근접 신장부 (예컨대, 적어도 7 개의 근접 단량체) 를 포함한다.
"테일머 (tailmer)" 는 영역 X' 의 3'-최대 단량체에 연결된 영역 Y' 의 5'-최대 단량체와 함께, 그곳에 근접한 영역 X' 및 영역 Y' 를 포함하는 올리고머로서 정의된다. 영역 X' 는 RNase 에 의해 인식가능하고 분할가능한 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체의 근접 신장부 (예컨대, 적어도 7 개의 근접 단량체) 를 포함하고, 영역 X' 는 비-RNase 모집 뉴클레오시드 유사체의 근접 신장부를 포함한다.
"믹스머" 로 불리는 기타 "키메라성" 올리고머는 (i) RNase 에 의해 인식가능하고 분할가능한 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체, 및 (ii) 비-RNase 모집 뉴클레오시드 유사체 단량체의 교대 조성물로 이루어진다.
일부 구현예에서, 표적 영역에 대한 올리고머의 친화성을 향상시키는 것 외에, 일부 뉴클레오시드 유사체는 또한 RNase (예를 들어, RNaseH) 결합 및 분할을 매개한다. α-L-LNA (BNA) 단량체가 RNaseH 활성을 특정 범위까지 모집하므로, 일부 구현예에서, α-L-LNA 단량체를 함유하는 올리고머의 gap 영역 (예를 들어, 본원에서 언급되는 영역 Y') 은 RNaseH 에 의해 인식가능하고 분할가능한 단량체로 적게 이루어지고, 믹스머 구축물 내에 좀더 유연성이 도입된다.
갭머 디자인
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머, 예컨대 제 1 영역은 갭머를 포함하거나 갭머이다. 갭머 올리고머는 RNAse, 예컨대 RNAseH 를 모집할 수 있는 뉴클레오티드의 근접 신장부, 예컨대 본원에서 영역 Y' (Y') 로 불리는 적어도 6 또는 7 개의 DNA 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 올리고머이고, 이때 영역 Y' 는 친화성 향상 뉴클레오티드 유사체의 영역에 의해, 예컨대 1 - 6 개의 뉴클레오티드 유사체 5' 및 3' 로부터 RNAse 를 모집할 수 있는 뉴클레오티드의 근접 신장부에, 5' 및 3' 모두의 측면에 있다 - 상기 영역은 각각 영역 X' (X') 및 Z' (Z') 로서 언급된다. 갭머의 예는 WO2004/046160, WO2008/113832, 및 WO2007/146511 에 기재된다.
일부 구현예에서, RNAse 를 모집할 수 있는 단량체는 DNA 단량체, 알파-L-LNA 단량체, C4' 알킬화된 DNA 단량체 (참조, PCT/EP2009/050349 및 Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300, 본원에 참조로서 인용됨), 및 UNA (비-연결된 핵산) 뉴클레오티드 (참조, Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, 본원에 참조로서 인용됨) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. UNA 는, 전형적으로 리보오스의 C2 - C3 C-C 결합이 제거되어, 미잠김 "당" 잔기를 형성하는 미잠김 (unlocked) 핵산이다. 바람직하게는 갭머는 식 (5' 에서 3'), X'-Y'-Z' 의 (폴리)뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서; 영역 X' (X') (5' 영역) 은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 하나 이상의 BNA (예를 들어, LNA) 단위, 예컨대 1-6 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어지거나 이를 포함하고; 영역 Y' (Y') 는 RNAse 를 모집할 수 있는 적어도 5 개의 연속 뉴클레오티드 (상보적 RNA 분자, 예컨대 mRNA 표적과 이중체를 형성하는 경우), 예컨대 DNA 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함하고; 영역 Z' (Z') (3' 영역) 은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 하나 이상의 BNA (예를 들어, LNA 단위), 예컨대 1-6 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 영역 X' 는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 BNA (예를 들어, LNA) 단위, 예컨대 2-5 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 2-5 개의 LNA 단위, 예컨대 3 또는 4 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 3 또는 4 개의 LNA 단위로 이루어지고; 및/또는 영역 Z' 는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 BNA (예를 들어, LNA) 단위, 예컨대 2-5 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 2-5 개의 BNA (예를 들어, LNA 단위), 예컨대 3 또는 4 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 3 또는 4 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다.
일부 구현예에서, Y' 는 RNAse 를 모집할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개의 연속 뉴클레오티드, 또는 RNAse 를 모집할 수 있는 6-10, 또는 7-9, 예컨대 8 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 Y' 는 하나 이상의 DNA 뉴클레오티드 단위, 예컨대 1-12 개의 DNA 단위, 바람직하게는 4-12 개의 DNA 단위, 더욱 바람직하게는 6-10 개의 DNA 단위, 예컨대 7-10 개의 DNA 단위, 가장 바람직하게는 8, 9 또는 10 개의 DNA 단위로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 영역 X' 는 3 또는 4 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 BNA (예를 들어, LNA) 로 이루어지고, 영역 X' 는 7, 8, 9 또는 10 개의 DNA 단위로 이루어지고, 영역 Z' 는 3 또는 4 개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 BNA (예를 들어, LNA) 로 이루어진다. 이러한 디자인에는 (X'-Y'-Z') 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 이 포함된다.
추가의 갭머 디자인은 본원에 참조로서 인용된 WO2004/046160 에 기재된다. 본원에 참조로서 인용된 US 가출원 60/977,409 로부터 우선권을 주장하는 WO2008/113832 는, '쇼트머 (shortmer)' 갭머 올리고머를 언급한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 올리고머는 이러한 쇼트머 갭머일 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머, 예를 들어, 영역 X' 는 총 10, 11, 12, 13 또는 14 개의 뉴클레오티드 단위의 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 근접 뉴클레오티드 서열은 식 (5' - 3'), X'-Y'-Z' (식 중, X' 는 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어지고; Y' 는 상보적 RNA 분자와 이중체를 형성할 때 RNAse 를 모집할 수 있는 (예컨대, mRNA 표적) 7, 8 또는 9 개의 근접 뉴클레오티드 단위로 이루어지고; Z' 는 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어짐) 를 포함하거나 이것이다.
일부 구현예에서, X' 는 1 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, X' 는 2 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, X' 는 3 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, Z' 는 1 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, Z' 는 2 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, Z' 는 3 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, Y' 는 7 개의 뉴클레오티드 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, Y' 는 8 개의 뉴클레오티드 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, Y' 는 9 개의 뉴클레오티드 단위로 이루어진다. 특정 구현예에서, 영역 Y' 는 10 개의 뉴클레오시드 단량체로 이루어진다. 특정 구현예에서, 영역 Y' 는 1 - 10 개의 DNA 단량체로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Y' 는 1 - 9 개의 DNA 단위, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 DNA 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, Y' 는 DNA 단위로 이루어진다. 일부 구현예에서, Y' 는 알파-L 배치로 있는 하나 이상의 BNA 단위, 예컨대 알파-L-배치로의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 LNA 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, Y' 는 하나 이상의 알파-L-옥시 BNA/LNA 단위를 포함하거나, 또는 알파-L- 배치로의 모든 LNA 단위는 알파-L-옥시 LNA 단위이다. 일부 구현예에서, X'-Y'-Z' 내에 존재하는 뉴클레오티드의 수는 (뉴클레오티드 유사체 단위 - 영역 Y' - 뉴클레오티드 유사체 단위): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, 또는; 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, 또는; 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, X'-Y'-Z' 내의 뉴클레오티드의 수는: 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, 및 4-7-3 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 각각의 영역 X' 및 Y' 는 3 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단량체로 이루어지고, 영역 Y' 는 8 또는 9 또는 10 개의 뉴클레오시드 단량체, 바람직하게는 DNA 단량체로 이루어진다. 일부 구현예에서, X' 및 Z' 모두는 2 개의 BNA (예를 들어, LNA) 단위 각각으로 이루어지고, Y' 는 8 또는 9 개의 뉴클레오티드 단위, 바람직하게는 DNA 단위로 이루어진다. 다양한 구현예에서, 기타 갭머 디자인은 영역 X' 및/또는 Z' 가 3, 4, 5 또는 6 개의 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 2'-O-메톡시에틸-리보오스 당 (2'-MOE) 을 함유하는 단량체 또는 2'-플루오로-데옥시리보오스 당을 함유하는 단량체로 이루어지고, 및 영역 Y' 가 8, 9, 10, 11 또는 12 개의 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 단량체로 이루어지는 것을 포함하며, 이때 영역 X'-Y'-Z' 는 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 또는 4-12-4 단량체를 갖는다. 추가의 갭머 디자인은 본원에 참조로서 인용된 WO 2007/146511A2 에 기재되어 있다.
스플라이스 스위칭 올리고머 (Splice switching oligomers)
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 스플라이스 스위칭 올리고머 - 즉, pre-mRNA 의 대안적인 스플라이상을 야기하는 pre-mRNA 에 표적하는 올리고머이다.
스플라이스 스위칭 올리고머에 대한 표적은 TNF 수용체를 포함할 수 있고, 예를 들어 SSO 은 본원에 참조로서 인용된 WO2007/058894, WO08051306 A1 및 PCT/EP2007/061211 에 기재된 TNFR SSO 중 하나 이상일 수 있다.
스플라이스 스위칭 올리고머는 RNaseH 를 전형적으로 (본질적으로) 모집할 수 없고, 그러한 갭머, 테일머 또는 헤드머 디자인은 일반적으로 바람직하지 않다. 그러나, 믹스머 및 토탈머 디자인은 SSO 에 대한 적합한 디자인이다.
스플라이스 스위칭 올리고머는 또한 뒤시엔느 (Duchennes) 근 위축증에서 디스트로핀 결핍에 표적하는데 사용되었다.
믹스머 (Mixmer)
대부분의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이들의 의도된 표적을 분해하기 위한 RNase 효소 (예컨대, RNaseH) 를 모집하기 위해 디자인된 화합물이다. 이러한 화합물에는 DNA 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 갭머, 헤드머 및 테일머가 포함된다. 상기 화합물은 전형적으로 적어도 5 또는 6 개의 DNA 뉴클레오티드의 영역을 포함하고, 갭머의 경우 친화성 향상 뉴클레오티드 유사체에 의해 어느 한 쪽의 측면 상에 위치한다.
본 발명의 올리고머는 RNase (예컨대, RNaseH) 독립적 메카니즘을 통해 작동할 수 있다. 비-RNaseH (또는 비-RNase) 메카니즘을 통해 작동하는 올리고머의 예는 믹스머 및 토탈머이다.
용어 '믹스머' 는, 갭머, 테일머, 및 헤드머와 반대로, 5 개 이하의 근접 서열이 없는, 일부 구현예에서, 4 개 이하의 연속, 예컨대 3 개 이하의 연속, 자연 발생적 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 단위가 없는, 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 뉴클레오티드 모두를 포함하는 올리고머를 말한다. 일부 구현예에서, 믹스머는 5 개 이하의 연속 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 BNA (LNA), 일부 구현예에서, 4 개 이하의 연속, 예컨대 3 개 이하의 연속, 연속 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 BNA (LNA) 를 포함하지 않는다. 이러한 믹스머에서 남아있는 뉴클레오시드는, 예를 들어 DNA 뉴클레오시드에 의해, 및/또는 비-비시클릭 뉴클레오시드 유사체에서, 예컨대 본원에 언급된 것들, 예를 들어, 2' 치환된 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 2'-O-MOE 및 또는 2'플루오로일 수 있다.
본 발명에 따른 올리고머는 믹스머일 수 있고 - 게다가 다양한 믹스머 디자인은 특히 mRNAs (Blockmirs) 상의 microRNA 결합 부위 또는 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO) 로서, microRNA (antimiR) 에 표적하는 경우, 올리고머 또는 이의 제 1 영역으로서 크게 효과적이다. 예를 들어 WO2007/112754 (LNA-AntimiRsTM), WO2008/131807 (LNA 스플라이스 스위칭 올리고머) 을 참조한다,
일부 구현예에서, 올리고머 또는 믹스머는 BNA 및 2' 치환된 뉴클레오시드 유사체 (임의로 DNA 뉴클레오시드로) 를 포함할 수 있다 - 예를 들어 본원에 참조로서 인용된 WO07027894 및 WO2007/112754 를 참조한다. 구체적인 예에는 LNA, 2'-O-MOE 및 DNA, LNA, 2'플루오로 및 2'-O-MOE, 2'-O-MOE 및 2'플루오로, 2'-O-MOE 및 2'플루오로 및 LNA, 또는 LNA 및 2'-O-MOE 및 LNA 및 DNA 를 포함하는 올리고머 또는 제 1 영역이 포함된다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 믹스머는 뉴클레오티드 유사체 및 자연 발생적 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체의 하나의 유형 및 뉴클레오티드 유사체의 두번째 유형의 반복 패턴의 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 반복 패턴은 예를 들어, 예를 들어 매 두번째 또는 매 세번째 일 수 있거나 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 BNA (LNA) 이고, 남아있는 뉴클레오티드 자연 발생적 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 이고, 또는 2'-치환된 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 본원에 언급된 2'플루오로 유사체의 2'MOE 이거나, 또는, 일부 구현예에서, 본원에 언급된 뉴클레오티드 유사체의 군으로부터 선택된다. 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위의 반복 패턴은, 고정된 위치에서 - 예를 들어, 5' 또는 3' 말단에서 뉴클레오티드 유사체와 조합될 수 있는 것으로 인지된다.
일부 구현예에서, 3' 말단으로부터 계산되는 올리고머 또는 믹스머의 첫번째 뉴클레오티드는, 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드이다.
동일 또는 상이할 수 있는 일부 구현예에서, 3' 말단으로부터 계산되는 올리고머 또는 믹스머의 두번째 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드이다.
동일 또는 상이할 수 있는 일부 구현예에서, 3' 말단으로부터 계산되는 올리고머 또는 믹스머의 7 번째 및/또는 8 번째 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드이다.
동일 또는 상이할 수 있는 일부 구현예에서, 3' 말단으로부터 계산되는 첫번째 및/또는 두번재 올리고머의 9 번째 및/또는 10 번째 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드이다.
동일 또는 상이할 수 있는 일부 구현예에서, 올리고머 또는 믹스머의 5' 말단은 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드이다.
상기 디자인 특징은, 일부 구현예에서, 믹스머 디자인, 예컨대 antimiR 믹스머 내로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 믹스머는 4 개 초과의 연속 DNA 뉴클레오티드 단위 또는 3 개의 연속 DNA 뉴클레오티드 단위의 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 믹스머는 2 개 초과의 연속 DNA 뉴클레오티드 단위의 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 믹스머는 적어도 2 개의 연속 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 적어도 2 개의 연속 LNA 단위로 이루어진 영역을 적어도 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 믹스머는 적어도 3 개의 연속 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 적어도 3 개의 연속 LNA 단위로 이루어진 영역을 적어도 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 또는 믹스머는 7 개 초과의 연속 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 LNA 단위의 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 또는 믹스머는 6 개 초과의 연속 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 LNA 단위의 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 또는 믹스머는 5 개 초과의 연속 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 LNA 단위의 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 또는 믹스머는 4 개 초과의 연속 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 LNA 단위의 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 또는 믹스머는 3 개 초과의 연속 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 LNA 단위의 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 또는 믹스머는 2 개 초과의 연속 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 LNA 단위의 영역을 포함하지 않는다.
믹스머는 4 개 이하의 연속 DNA 뉴클레오티드의 DNA 의 하나 이상의 짧은 영역을 포함할 수 있는 올리고머이고, 전형적으로는 뉴클레오티드 유사체 (예컨대, LNA 단위) 및 DNA 뉴클레오티드의 교대하는 영역, 임의로 기타 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어, 비-LNA 뉴클레오티드 유사체) 의 영역을 포함한다. 토탈머는 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드 (DNA 및 RNA 의 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있더라도) 를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 (예를 들어, 영역 A) 는 일부 구현예에서, 4 개 이하의 연속 DNA 뉴클레오티드, 또는 3 개 이하의 연속 DNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
하기 구현예는 믹스머 또는 토탈머 올리고머 (예를 들어, 영역 A 로서) 에 적용될 수 있다:
본 발명의 올리고머 (예를 들어, 영역 A) 는, 일부 구현예에서, LNA 및 비-LNA 뉴클레오티드 (예컨대, DNA 또는 2' 치환된 뉴클레오티드 유사체) 의 적어도 2 개의 교대하는 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 올리고머는, 일부 구현예에서, 식: 5' ([LNA 뉴클레오티드]1-5 및 [비-LNA 뉴클레오티드]1-4)2 - 12. 3' 의 근접 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 근접 뉴클레오티드 서열 (또는 올리고머) 의 5' 뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 근접 뉴클레오티드 서열의 3' 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 이고 또는 2, 3, 4, 5 3' 뉴클레오티드는 올리고머에 향상된 혈청 안정성을 부여하는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드, 또는 기타 뉴클레오티드 유사체이다.
일부 구현예에서, 올리고머의 근접 뉴클레오티드 서열은 식 5' ([LNA 뉴클레오티드]1-5 - [비-LNA 뉴클레오티드]1-4)2 - 11 - [LNA 뉴클레오티드]1-5 3' 을 갖는다.
일부 구현예에서, 올리고머의 근접 뉴클레오티드 서열은 LNA 및 비-LNA 뉴클레오티드의 2, 3 또는 4 개의 근접 영역을 갖고 - 예를 들어, 식 5' ([LNA 뉴클레오티드]1-5 및 [비-LNA 뉴클레오티드]1-4)2 - 3 을, 임의로 추가의 3' LNA 영역 [LNA 뉴클레오티드]1-5 와 함께 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고머의 근접 뉴클레오티드 서열은 5' ([LNA 뉴클레오티드]1-3 및 [비-LNA 뉴클레오티드]1-3)2 - 5 를, 임의로 추가의 3' LNA 영역 [LNA 뉴클레오티드]1-3 과 함께 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고머의 근접 뉴클레오티드 서열은 5' ([LNA 뉴클레오티드]1-3 및 [비-LNA 뉴클레오티드]1-3)3 을, 임의로 추가의 3' LNA 영역 [LNA 뉴클레오티드]1-3 과 함께 포함한다.
일부 구현예에서, 비-LNA 뉴클레오티드는 모두 DNA 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 비-LNA 뉴클레오티드는 DNA 단위, RNA 단위, 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 및 2'-플루오로-DNA 단위로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 또는 의존적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 비-LNA 뉴클레오티드는, 예컨대 (임의로 독립적으로) 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-AP, 2'-FANA, 2'-(3-히드록시)프로필, 및 2'-플루오로-DNA 단위, 및/또는 기타 (임의로) 당 변형된 뉴클레오시드 유사체 예컨대 모르폴리노, 펩티드 핵산 (PNA), CeNA, 미-연결된 핵산 (UNA), 헥시톨 핵산 (HNA). 비시클로-HNA (예를 들어, WO2009/100320 참조) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2' 치환된 뉴클레오시드 유사체로 이루어지는 군으로부터 임의로 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체는 이의 표적 핵산 (또는 상보적 DNA 또는 RNA 서열) 에 대한 제 1 영역의 친화성을 증가시킨다. 다양한 뉴클레오시드 유사체는 본원에 참조로서 인용된 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 에 기재된다.
일부 구현예에서, 비-LNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 근접 뉴클레오티드 서열은 혈청 안정성을 향상시키는 친화성 향상 뉴클레오티드 유사체 및/또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있는 LNA 뉴클레오티드 및 임의로 기타 뉴클레오티드 유사체 (예컨대, 비-LNA 뉴클레오티드로 나열된 뉴클레오티드 유사체)를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 근접 뉴클레오티드 서열은 상기 뉴클레오티드 유사체의 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 근접 뉴클레오티드 서열은 LNA 뉴클레오티드의 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 근접 뉴클레오티드 서열은 8 - 12, 예컨대 8 - 10, 또는 10 - 20, 예컨대 12 - 18 또는 14 - 16 nts 의 길이이다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 근접 뉴클레오티드 서열은 상보적 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 포스포디에스테르 인터뉴클레오시드 연결과 함께 이중체를 형성할 수 있으며, 이중체는 적어도 약 60℃, 예컨대 적어도 65℃ 의 Tm 을 갖는다.
Tm 어세이의 예: 올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드 및 RNA 표적 (PO) 이중체를 500 ml RNase-무함유 물 중 3 mM 로 희석하고, 500 ml 2x Tm-완충액 (200mM NaCl, 0.2mM EDTA, 20mM Na포스페이트, pH 7.0) 과 혼합한다. 용액을 95℃ 로 3 분 동안 가열한 다음, 실온에서 30 분 동안 어닐링 (anneal) 한다. 이중체 용융 온도 (Tm) 는 PE Templab 소프트웨어를 사용하는 Peltier 온도 프로그래머 PTP6 이 구비된 Lambda 40 UV/VIS Spectrophotometer (Perkin Elmer) 에서 측정한다. 온도를 20℃ 에서 95℃ 로 상승시킨 다음, 25℃ 로 하강시키고, 260 nm 에서의 흡광도를 기록한다. 첫번째 유도체 및 용융 및 어닐링 모두의 극대값을 이중체 Tm 을 평가하는데 사용한다.
토탈머
토탈머는 비-자연 발생적 뉴클레오시드, 예컨대 당-변형된 뉴클레오시드 유사체 만을 포함하는 단일 가닥 올리고머이다.
본 발명에 따른 제 1 영역은 토탈머일 수 있고 - 게다가 다양한 토탈머 디자인은 올리고머 또는 이의 제 1 영역으로서 (예를 들어, 특히 microRNA (antimiR) 에 표적할때) 또는 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO) 로서 매우 효과적이다. 일부 구현예에서, 토탈머는 하나 이상의 XYX 또는 YXY 서열 모티프, 예컨대 반복된 서열 XYX 또는 YXY (식 중, X 는 LNA 이고, Y 는 대안적인 (즉, 비 LNA) 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 2'-O-MOE RNA 단위 및 2'-플루오로 DNA 단위임) 를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 상기 서열 모티프는, 일부 구현예에서, 예를 들어 XXY, XYX, YXY 또는 YYX 일 수 있다.
일부 구현예에서, 토탈머는 7 내지 16 개의 뉴클레오티드, 예컨대 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 개의 뉴클레오티드, 예컨대 7 내지 12 개의 뉴클레오티드의 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 토탈머의 근접 뉴클레오티드 서열은 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 95%,예컨대 100% BNA (LNA) 단위를 포함한다. 남아있는 단위는 2'-O_알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, LNA 단위, PNA 단위, HNA 단위, INA 단위, 및 2'MOE RNA 단위, 또는 그룹 2'-OMe RNA 단위 및 2'-플루오로 DNA 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것들과 같이, 본원에 언급되는 비-LNA 뉴클레오티드 유사체로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 토탈머는 오로지 LNA 단위로만 이루어지는 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 토탈머, 예컨대 LNA 토탈머는, 7 - 12 개의 뉴클레오시드 단위의 길이이다. 일부 구현예에서, 토탈머 (올리고머 또는 이의 제 1 영역) 는 본원에 참조로서 인용된 WO2009/043353 에 언급되는 바와 같이 microRNA (즉, antimiR 임) 에 대해 표적할 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 근접 뉴클레오티드 서열은 LNA 뉴클레오티드 및 임의로 친화성 향상 뉴클레오티드 유사체일 수 있는 기타 뉴클레오티드 유사체 및/또는 혈청 안정성을 향상시키는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 근접 뉴클레오티드 서열은 상기 뉴클레오티드 유사체의 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 근접 뉴클레오티드 서열은 LNA 뉴클레오티드의 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
올리고머 또는 이의 제 1 영역을 통한 MicroRNA 조정.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 antimiR 이고, 이것은 성숙 microRNA 또는 이의 일부에 상응하거나 이에 완전히 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. microRNA 의 생체 내 활성을 통제하는데 있어 본 발명의 용도는 microRNA 가 전형적으로 대상 내의 수 많은 mRNA 를 조절한다는 사실로 인해 일차적으로 중요한 것으로 간주된다. 따라서, 치료적 antimiR 를 불활성화시키는 능력이 매우 요망된다.
수 많은 microRNA 는 다수의 질환과 관련이 있다. 예를 들어: 본 발명의 약학 조성물에 의해 치료될 수 있는 치료적 증상의 비-제한적인 예:
Figure pct00023

종양 억제 유전자 트로포마이신 (tropomysin) 1 (TPM1) mRNA 는 miR-21 의 표적으로서 나타난다. 마이트로핀 (myotrophin, mtpn) mRNA 는 miR 375 의 표적으로서 나타난다.
따라서 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 표적하는 즉, 상기 나열된 microRNA 중 하나 (이의 상응하는 영역) 에 완전히 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 또는 이에 대한 단일 미스매치 이하로 포함하는, antimir 일 수 있다.
그러므로, 본 발명의 일부 양상은 감염성 질환, 예컨대 바이러스 질환, 예컨대 C 형 간염 바이러스 및 HIV, 취약한 X 정신 지체, 염증성 질환, 암, 예컨대 만성 림프성 백혈병, 유방암, 폐암 및 대장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 microRNA 의 발현과 연관되는 질환의 치료에 관한 것이다.
MicroRNA (miRNA) 는 이들의 표적 mRNA 와의 염기-쌍형성에 의해 유전자 발현의 전사-후 조절자로서 작용하는 짧은 내생 RNA 의 풍부한 계열이다. 성숙 miRNA 는 RNAse III 리보뉴클레아제 Drosha 에 의해 보다 긴 헤어핀 전사물로부터 순차적으로 프로세싱된다. 성숙 microRNA (miR) 는 전형적으로 20 내지 25 개의 근접 RNA 뉴클레오티드를 갖는다. 여러 개의 microRNA 가 의학적 상태 및 질환과 연관되어 있다는 것이 이제는 널리 정립되고, 수 개의 회사가 microRNA 를 모방하거나 또는 질환 표현형과 연관된 특정 microRNA 에 특이적으로 혼성화하는 올리고머에 근거한 치료법을 개발하고 있으며 - 이러한 올리고머는 본원에서 각각 microRNA 모방체 및 antimiR 로서 언급되고, 올리고머 또는 이의 제 1 영역, 일부 구현예에서, 이러한 microRNA 조정 올리고머일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 올리고머 또는 이의 제 1 영역은, microRNA 서열, 예컨대 성숙 microRNA 서열, 예컨대 miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/mirna_summary.pl-org=hsa) 에 공개된 인간 microRNA 에 상응하는 또는 완전히 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, microRNA 는 바이러스 microRNA 이다. 본 명세서의 저술 시점에서, miRbase 19 에는, 각각의 인간 microRNA 의 성숙 microRNA 서열을 포함하여, 모두 본원에 참조로서 인용된 miRBase 에는 1600 개의 전구체 및 2042 성숙 인간 miRNA 서열이 있다. 올리고머 또는 이의 제 1 영역에 의해 표적될 수 있는 다른 인간 microRNA 는 본원에 참조로서 인용된 WO08040355A 에 기재된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 올리고머 또는 이의 제 1 영역은, hsa-miR19b, hsa-miR21, hsa-miR 122, hsa-miR 142 a7b, hsa-miR 155, 및 hsa-miR 375 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 microRNA 서열에 상응하거나 이에 완전히 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 올리고머 또는 이의 제 1 영역은, hsa-miR221 및 hsa-miR222 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 microRNA 서열에 상응하거나 이에 완전히 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 올리고머 또는 이의 제 1 영역은, hsa-miR122 (NR_029667.1 GI:262205241), 예컨대 성숙 has-miR-122 에 상응하거나 이에 완전히 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역이 miR-122 에 표적할 때, 올리고머는 C 형 간염 감염의 치료에 사용되기 위한 것이다.
AntimiR 올리고머
바람직한 올리고머 또는 이의 제 1 영역 'antimiR' 디자인 및 올리고머는 모두 본원에 참조로서 인용된 WO2007/112754, WO2007/112753, PCT/DK2008/000344 및 US 가출원 60/979217 및 61/028062 에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 믹스머 또는 토탈머인 antimiR 이다.
AntimiR 올리고머는 microRNA 서열, 또는 이의 상응하는 서브-서열에 완전히 상보적이거나, 또는 본질적으로 상보적인 (즉, 1 또는 2 개의 미스매치를 포함할 수 있는) 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 또는 이를 포함하는 올리고머이다. 이와 관련하여, antimiR 은 전체 성숙 microRNA 에 상보적이거나 또는 본질적으로 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 또는 antimiR 은 성숙 microRNA 또는 전-microRNA 의 서브-서열에 상보적이거나 또는 본질적으로 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고 - 이러한 서브-서열 (및 따라서 상응하는 근접 뉴클레오티드 서열) 은 전형적으로 적어도 8 개의 뉴클레오티드의 길이, 예컨대 8 내지 25 개의 뉴클레오티드, 예컨대 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 개의 뉴클레오티드의 길이, 예컨대 10-17 또는 10-16 개의 뉴클레오티드, 예컨대 12 - 15 개의 뉴클레오티드인 것으로 고려된다.
AntimiR 의 수 많은 디자인이 제안되었고, 전형적으로 치료적 용도를 위한 antimiR, 예컨대 이의 근접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 단위를 포함한다.
일부 구현예에서, antimiR 은 본원에 기재된 갭머 구조를 가질 수 있다. 그러나, WO2007/112754 및 WO2007/112753 에 설명되는 바와 같이, 기타 디자인이 예컨대 믹스머 또는 토탈머가 바람직할 수 있다.
둘다 참조로서 본원에 인용되는 WO2007/112754 및 WO2007/112753 은, 성숙 microRNA 에 상보적인 올리고머가 있는 antimiR 올리고머 및 antimiR 올리고머 디자인을 제공한다.
일부 구현예에서, antimiR 의 서브-서열은 miRNA 종자 (seed) 영역에 상응한다. 일부 구현예에서, 올리고머의 첫번째 또는 두번째 3' 핵염기는 microRNA 서열의 두번째 5' 뉴클레오티드에 상응한다.
일부 antimiR 구현예에서, 올리고머의 영역 3' 말단으로부터 측정된 올리고머의 핵염기 단위 1 내지 6 (포함적) 은 microRNA 종자 영역 서열에 상보적이다.
일부 antimiR 구현예에서, 올리고머의 영역 3' 말단으로부터 측정된 올리고머의 핵염기 단위 1 내지 7 (포함적) 은 microRNA 종자 영역 서열에 상보적이다.
일부 antimiR 구현예에서, 올리고머의 영역 3' 말단으로부터 측정된 올리고머의 핵염기 단위 2 내지 7 (포함적) 은 microRNA 종자 영역 서열에 상보적이다.
일부 구현예에서, antimiR 올리고머는, miRNA 종자 영역에 상보적인 영역 내에 있는 위치에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 하나 이상의 LNA 단위를 포함한다. antimiR 올리고머는, 일부 구현예에서, miRNA 종자 영역에 상보적인 영역 내에 있는 위치에서, 1 내지 6 개의 또는 1 내지 7 개의 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 1 내지 6 개의 및 1 내지 7 개의 LNA 단위를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 antimiR 은 7, 8 또는 9 개의 뉴클레오티드 길이이고, 인간 또는 바이러스 microRNA 의 종자 영역에 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 적어도 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90%, 예컨대 95%, 예컨대 100% 는 LNA 이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 antimiR 은 is 7, 8 또는 9 개의 뉴클레오티드 길이이고, 인간 또는 바이러스 microRNA 의 종자 영역에 상보적인 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 적어도 80% 는 LNA 이고, 인터뉴클레오티드 결합의 적어도 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90%, 예컨대 95%, 예컨대 100% 는 포스포로티오에이트 결합이다.
일부 구현예에서, antimiR 은 3' 말단으로부터 계산하여, 위치 3 내지 8 에서 1 또는 2 개의 LNA 단위를 포함한다. 이것은 올리고뉴클레오티드:microRNA 이중체, 구조가 RNA:RNA 이중체를 닮은 이중체에 의해 형성된 A-나선의 안정성에 대해 장점인 것으로 고려된다.
WO2007/112754 의 페이지 48 라인 15 내지 페이지 51, 라인 9 에 있는 표는 항 microRNA 올리고머 (즉, 올리고머 또는 이의 제 1 영역일 수 있는 antimiR) 의 예를 제공하고, 본원에 참조로서 구체적으로 인용된다.
MicroRNA 모방체
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 하나 이상의 mRNA 표적(들) 의 발현을 억압하도록 세포 내에 도입될 수 있는 miRNA 모방체의 형태이다. miRNA 모방체는 전형적으로 전장 miRNA 서열에 완전히 상보적이다. miRNA 모방체는 본원에 제공된 또는 참조된 miRNA 서열 중 하나, 또는 이상의 상응하는 영역에 상동인 근접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 화합물이다. miRNA 모방체 또는 antimiR 의 용도는 mRNA 표적을 (임의로) 추가 억압시키거나, 또는 miRNA 를 침묵 (하향-조절) 시킴으로써, 내생 miRNA 의 기능을 억제하여, mRNA 표적의 탈억제 및 증가된 발현을 야기하기 위해 사용될 수 있다 .
앱타머 (Aptamer)
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 치료적 앱타머인, 스피에겔머 (spiegelmer) 일 수 있다. 앱타머가 또한 리간드, 예컨대 수용체 리간드일 수 있고, 따라서 표적화 일부분 (즉, 영역 3) 으로서 사용될 수 있다는 것을 명시한다. 뉴클레오티드의 서열보다는 이들의 형태적 구조에 근거하여 선택된 20 내지 50 개의 뉴클레오티드의 길이의 핵산으로서 본 발명의 문맥에서 앱타머 (또한 스피에겔머로 언급됨) - 이들은 생체 내에서 직접 표적 단백질과의 결합에 의해 이들의 치료 효과를 유발하고, 이들은 따라서 이들의 표적이 역 보체를 포함하지 않는다 - 게다가 이들의 표적은 핵산이 아니고 단백질이다. 올리고머 또는 이의 제 1 영역일 수 있는 특이적 앱타머는 Macugen (OSI Pharmaceuticals) 또는 ARC1779, (Archemix, Cambridge, MA) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 앱타머가 아니다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 앱타머 또는 스피에겔머가 아니다.
siRNA 복합체
일부 구현예에서, 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 siRNA 복합체의 일부 - 즉, siRNA 복합체의 안티센스 또는 패신저 가닥일 수 있다. siRNA 복합체는 RNA 간섭을 매개할 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 복합체는 17 - 25 nts 의 길이, 예컨대 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 개의 뉴클레오티드의 길이, 예컨대 21-23 뉴클레오티드의 길이의 2 개의 단일 가닥 올리고머를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 의 센스 및/또는 안티센스 가닥은 3' 돌출부 (overhang), 전형적으로 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 적합하게는, 센스 및 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 복합체는 siLNA, 예컨대 모두 본원에 참조로서 인용된 WO2004/000192, WO2005/073378, WO2007/085485 에 기재된 siRNA 디자인이다. siLNA 는 하나 이상의 LNA 단위를 포함하는 siRNA 이다.
일부 구현예에서, siRNA 복합체는 sisiLNA, 예컨대 본원에 참조로서 인용된 WO2007/107162 에 기재된 것들이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 또는 이의 제 1 영역은 siRNA 의 센스 가닥이고, 예컨대 표적 (게다가, 의도된 표적에 대해 상동일 수 있음) 에 대해 비-상보적일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 또는 화합물은 siRNA 또는 siLNA 가 아니다.
인터뉴클레오티드 연결
본원에 기재된 올리고머 (예를 들어, 제 1 및 제 2 영역) 의 뉴클레오시드 단량체는 [인터뉴클레오시드] 연결 기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게, 각가의 단량체는 연결 기를 통해 3' 인접 단량체에 연결된다.
당업자는 본 발명의 문맥에서, 이것이 비록, 5' 말단 기를 포함할 수 있거나 포함할 수 없더라도, 올리고머의 말단에서 5' 단량체가 5' 연결 기를 포함하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
용어 "연결 기" 또는 "인터뉴클레오티드 연결" 은 2 개의 뉴클레오티드를 함께 공유 커플링할 수 있는 기를 의미하는 것으로 의도된다. 특이적이고 바람직한 예에는 포스페이트 기 및 포스포로티오에이트 기가 포함된다.
본 발명의 올리고머의 뉴클레오티드 또는 이의 근접 뉴클레오티드 서열은 연결 기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게는 각각의 뉴클레오티드는 연결 기를 통해 3' 인접 뉴클레오티드에 연결된다.
적합한 인터뉴클레오티드 연결은 WO2007/031091 내에 나열된 것들, 예를 들어 WO2007/031091 (본원에 참조로서 인용됨) 의 페이지 34 의 첫번째 단락에 나열된 인터뉴클레오티드 연결을 포함한다.
일부 구현예에서, 포스포디에스테르 연결(들) 또는 영역 B 이외에, 이의 정상 포스포디에스테르로부터 뉴클레아제 공격에 대해 더욱 저항성인 것으로 (예컨대 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트) 인터뉴클레오티드 연결을 변형하는 것이 바람직하고 - 상기 2 개는, RNase H 에 의해 분할가능하고, 또한 표적 유전자의 발현을 감소시키는데 안티센스 억제의 경로를 가능하게 한다.
본원에 제시되는 바와 같은 적합한 황 (S) 함유 인터뉴클레오티드 연결이, 예컨대 포스포로티오에이트 또는 포스포디티오에이트가 바람직할 수 있다. 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결은 또한, 예컨대 갭머, 믹스머, 안티미르 스플라이스 스위칭 올리고머 및 토탈머 중의 특히 제 1 영역에 대해 바람직하다.
갭머의 경우, 올리고머 중의 인터뉴클레오티드 연결은, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트일 수 있어, 표적화된 RNA 의 RNase H 분할을 허용하도록 한다. 포스포로티오에이트가, 개선된 뉴클레아제 저항성 및 다른 이유, 예컨대 제조의 용이함에 대해 바람직하다.
하나의 양상에서, 제 1 및 제 2 영역, 및 임의로 영역 B 사이의 포스포디에스테르 연결, 본 발명의 올리고머의 남아있는 인터뉴클레오시드 연결을 제외하고는, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트 기에 의해 서로 연결된다. 일부 구현예에서, 제 1 영역 중의 뉴클레오시드 사이의 인터뉴클레오시드 연결의 적어도 50%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 모두는 포스포디에스테르 (포스페이트) 이외의 것이고, 예컨대 포스포로티오에이트 포스포로디티오에이트, 또는 보라노포스페이트로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제 1 영역 중의 뉴클레오시드 사이의 인터뉴클레오시드 연결의 적어도 50%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 모두는 포스포로티오에이트이다.
WO09124238 은 중성 인터뉴클레오시드 연결에 의해 3' 또는 5' 말단에 부착된 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오시드를 갖는 올리고머성 화합물을 말한다. 본 발명의 올리고머는 따라서 중성 인터뉴클레오시드 연결, 예컨대 하나 이상의 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI, 아미드-3, 포름아세탈 또는 티오포름아세탈에 의해 3' 또는 5' 말단에 부착된 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오시드를 가질 수 있다. 남아있는 연결은 포스포로티오에이트일 수 있다.
콘쥬게이트, 표적화 일부분 및 차단기
용어 "콘쥬게이트" 는 하나 이상의 비-뉴클레오티드, 또는 비-폴리뉴클레오티드 일부분에 대해 본원에 기재된 올리고머의 공유 부착 ("콘쥬게이션") 에 의해 형성된 이종 분자를 나타내는 것으로 의도된다. 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 일부분의 예에는 고분자 작용제, 예컨대 단백질, 지방산 사슬, 당 잔기, 당단백질, 중합체, 또는 이의 조합이 포함된다. 전형적으로는 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 전형적인 중합체는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.
따라서, 다양한 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 뉴클레오티드의 근접 서열로 전형적으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 영역, 및 추가의 비-뉴클레오티드 영역 모두를 포함할 수 있다. 근접 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 본 발명의 올리고머를 언급할 때, 화합물은 비-뉴클레오티드 성분, 예컨대 콘쥬게이트 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 올리고머성 화합물은 리간드/콘쥬게이트에 연결되고, 이것은, 예를 들어, 올리고머성 화합물의 세포 섭취를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. WO2007/031091 은 적합한 리간드 및 콘쥬게이트를 제공하고, 이것은 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 화합물이 본원에 기재된 바와 같은 구체화된 핵산 또는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 다양한 구현예에서, 화합물은 또한 상기 화합물에 공유 부착된 하나 이상의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 일부분 (예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하지 않음) 을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 친유성 콘쥬게이트 또는 단백질 (예를 들어, 항체, 효소, 혈청 단백질); 펩티드; 비타민 (수용성 또는 지용성); 중합체 (수용성 또는 지용성); 약물, 독소, 리포터 분자, 및 수용체 리간드를 포함하는 소형 분자; 탄수화물 복합체; 핵산 분할 복합체; 금속 킬레이트제 (예를 들어, 포르피린 (porphyrin), 텍사피린 (texaphyrin), 크라운 에테르 등); 혼성 광뉴클레아제/삽입제를 포함하는 삽입제; 가교제 (예를 들어, 광활성, 산화환원 활성), 및 이의 조합 및 유도체일 수 있다. 수 많은 적합한 콘쥬게이트 일부분, 이들의 제조 및 올리고머성 화합물에 대한 연결이 예를 들어, 각각 전체가 본원에 참조로서 인용되는 WO 93/07883 및 U.S. Pat. No. 6,395,492 에 제공된다. 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 및 이들의 합성은 또한, 각각 전체가 본원에 참조로서 인용된 Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 및 Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103 에 포괄적인 리뷰로 보고된다. [0034]
콘쥬게이션 (콘쥬게이트 일부분에 대한) 은 본 발명의 올리고머의 활성, 세포 분포 또는 세포 섭취를 향상시킬 수 있다. 이러한 일부분에는 항체, 폴리펩티드, 지질 일부분, 예컨대 콜레스테롤 일부분, 콜산 (cholic acid, 담즙산), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-s-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-o-헥사데실-rac-글리세로-3-h-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 일부분, 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 일부분이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 올리고머는 또한 활성 약물 성분, 예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 설파 약물, 항당뇨병제, 항박테리아제 또는 행상제에 콘쥬게이션될 수 있다.
특정 구현예에서, 콘쥬게이션된 일부분은 스테롤, 예컨대 콜레스테롤이다.
다양한 구현예에서, 콘쥬게이션된 일부분은 양전하 중합체, 예컨대, 예를 들어 1 - 50, 예컨대 2 - 20 예컨대 3 - 10 아미노산 잔기의 길이의 양전하 펩티드, 및/또는 폴리알킬렌 옥시드, 예컨대 폴리에틸글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하거나 이것으로 이루어진다 - 본원에 참조로서 인용된 WO 2008/034123 참조.
콘쥬게이트의 사용은 종종 향상된 약동학 또는 약역학 동적 특성과 연관된다. 그러나, 콘쥬게이트 기의 존재는, 예를 들어 혼성화 또는 뉴클레아제 모집 (예를 들어, RNAseH 또는 RISC 모집) 를 예방하는 입체 장애를 통해, 이의 의도된 표적에 대항하는 올리고뉴클레오티드의 활성을 방해할 수 있다. 본 발명에 따라 올리고뉴클레오티드 (영역 A) 및 콘쥬게이트 일부분 (X) 사이의 DNA 및/또는 RNA 포스포디에스테르 영역 (영역 B) 의 사용은, 일단 표적 조직에서, 콘쥬게이트 기가 올리고뉴클레오티드의 효과적인 활성을 방지하지 않는 것을 확보하면서, 콘쥬게이트 기의 존재로 인해 개선된 특성을 허용한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 일부 구현예에서, 하나 이상의 콘쥬게이트 기에, 임의로 하나 이상의 링커를 통해 공유 부착된다. 산출되는 콘쥬게이트 화합물은, 예를 들어 비-콘쥬게이션된 올리고머성 화합물와 비교하여 변형된 향상된 특성, 예컨대 변형된 또는 향상된 약동학, 약역학, 및 기타 특성을 가질 수 있다. 올리고머성 화합물의 약동학 특성을 변형하거나 향상시킬 수 있는 콘쥬게이트 일부분은 올리고머성 화합물의 세포 분포, 생물학적이용능, 대사작용, 배출, 투과성, 및/또는 세포 섭취를 개선할 수 있다. 올리고머성 화합물의 약역학 특성을 변형하거나 향상시킬 수 있는 콘쥬게이트 일부분은 활성, 분해에 대한 저항성, 서열-특이적 혼성화, 섭취 등을 개선할 수 있다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 기는 올리고뉴클레오티드의 적합한 활성, 예를 들어, 비-표적 조직 또는 기관에서 오프 (off) 표적 활성 또는 활성을 감소 또는 방지할 수 있다. 이것은 예를 들어 콘쥬게이트일 수 있는 차단 일부분의 사용에 의해 달성될 수 있는데, 올리고뉴클레오티드 (임의로 링커를 통해) 에 공유 부착된 차단기의 존재는 올리고뉴클레오티드 혼성화 및/또는 활성을 방지 또는 방해할 수 있다. DNA/RNA 포스포디에스테르 영역의 분할 (예를 들어, 의도된 표적 부위에서) 은 의도된 부위에서 활성 올리고뉴클레오티드의 전달을 가능하게 하는 차단기를 제거한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 콘쥬게이트 기를 포함한다.
예를 들어 특이적 조직에 표적하기 위한 하나의 콘쥬게이트 기, 예를 들어 간에 표적하기 위한 친유성 기가 사용될 수 있고, 및 제 2 콘쥬게이트 기는 추가의 이점, 예를 들어 차단기 또는 추가의 치료 실체를 제공하는데 사용될 수 있다고 인식될 것이다. 콘쥬게이트/일부분의 적합한 하나 또는 둘 다는 본 발명에 따라 DNA/RNA 포스포디에스테르 영역을 통해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단에서, 임의로 링커를 통해 올리고뉴클레오티드에 공유 결합된다. 이와 관련하여, 2 개의 콘쥬게이트/일부분 기가 사용되는 경우, 하나는 5' 말단에, 하나는 3' 말단에 연결될 수 있다.
탄수화물 콘쥬게이트
일부 구현예에서, 콘쥬게이트 기는 탄수화물, 친유성 일부분, 중합체, 단백질 또는 펩티드, 라벨 또는 염료, 소형 분자, 예컨대 소형 분자 치료 일부분, 세포 표면 수용체 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 탄수화물이거나 탄수화물을 포함할 수 있고 또는 탄수화물 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 갈락토오스, 락토오스, n-아세틸갈락토사민, 만노오스, 및 만노오스-6-포스페이트로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 기는 만노오스 또는 만노오스-6-포스페이트이거나 이를 포함할 수 있다. 탄수화물 콘쥬게이트는 조직 범위에서, 예컨대 간 및/또는 근육에서 전달 또는 활성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, EP1495769, WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21. Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17 을 참조한다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트 기는 탄수화물 일부분이다. 또한, 올리고머는 하나 이상의 부가적인 콘쥬게이트 일부분을 추가로 포함할 수 있고, 이의 친유성 또는 소수성 일부분이 특히 관심이 있다. 이들은 예를 들어, 약동학 조절제로서 작용할 수 있고, 탄수화물 콘쥬게이트, 탄수화물 콘쥬게이트를 올리고머에 연결시키는 링커 또는 복합 탄수화물 콘쥬게이트 (다-원자가, multi-valent) 콘쥬게이트를 또는 올리고머에 연결시키는 링커, 임의로 링커, 예컨대 생-분할가능 링커를 통해 공유 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 탄수화물이거나 탄수화물을 포함할 수 있고 또는 탄수화물 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 갈락토오스, 락토오스, n-아세틸갈락토사민, 만노오스, 및 만노오스-6-포스페이트로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 기는 만노오스 또는 만노오스-6-포스페이트이거나 이를 포함할 수 있다. 탄수화물 콘쥬게이트는 조직 범위에서, 예컨대 간 및/또는 근육에서 전달 또는 활성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, EP1495769, WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21. Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17 을 참조한다.
GalNAc 콘쥬게이트
본 발명은 또한 아시알로당단백질 수용체 표적화 일부분에 콘쥬게이션된, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 LNA 안티센스 올리고머를 제공한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분 (예컨대, 제 3 영역 또는 영역 C) 은 아시알로당단백질 수용체 표적화 일부분, 예컨대 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민, 및 N-이소부타노일갈락토스-아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 갈락토오스 클러스터, 예컨대 N-아세틸갈락토사민 삼중체를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분은 GalNAc (N-아세틸갈락토사민), 예컨대 1-가, 2-가, 3-가 또는 4-가 GalNAc 를 포함한다. 3-가 GalNAc 콘쥬게이트는 화합물을 간에 표적하는데 사용될 수 있다. GalNAc 콘쥬게이트는 메틸포스포네이트 및 PNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, US 5,994517 및 Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701) 및 siRNA (예를 들어, WO2009/126933, WO2012/089352 & WO2012/083046) 와 함께 사용되었다. GalNAc 참조 및 그곳에 사용된 특이적 콘쥬게이트는 본원에 참조로서 인용된다. WO2012/083046 에는 본 발명에서 사용하기에 적합한 분할가능 약동학 조절제를 포함하는 GalNAc 콘쥬게이트 일부분을 가진 siRNA 가 기재된다. 바람직한 약동학 조절제는 C16 소수성 기, 예컨대 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E, 12E)-옥타데카-9,12-디에노일, 디옥타노일, 및 C16-C20 아실이다. '046 분할가능 약동학 조절제는 또한 콜레스테롤일 수 있다.
표적화 일부분 (콘쥬게이트 일부분) 은 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민, N-이소-부타노일갈락토스-아민, 갈락토오스 클러스터, 및 N-아세틸갈락토사민 삼중체로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 16 개 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 16-20 개의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E,12E)-옥타데카-9,12디에노일, 디옥타노일, 및 C16-C20 아실, 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약동학 조절제를 가질 수 있다. '046 에 기재된 특정 GalNac 클러스터에는 (E)-헥사데크-8-에노일 (C16), 올레일 (C18), (9,E,12E)-옥타데카-9,12-디에노일 (C18), 옥타노일 (C8), 도데세카노일 (C12), C-20 아실, C24 아실, 디옥타노일 (2xC8) 이 포함된다. 표적화 일부분-약동학 조절제 표적화 일부분은 생리학적으로 불안정한 결합 또는 예를 들어, 디설파이드 결합, 또는 PEG 링커를 통해 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 본 발명은 또한 올리고머 및 콘쥬게이트 기 사이의 포스포디에스테르 링커 (이들은 본원에서 영역 B 로서 언급되고, 적합하게는 LNA 올리고머 및 탄수화물 콘쥬게이트 기 사이에 위치함) 의 용도에 관한 것이다.
간 내 간세포에 표적하기 위해서, 바람직한 표적화 리간드는 갈락토오스 클러스터이다.
갈락토오스 클러스터는 2 내지 4 개의 말단 갈락토오스 유도체를 갖는, 예를 들어 포함하는 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 갈락토오스 유도체는 갈락토오스의 친화성과 동일한 또는 초과의 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 갈락토오스의 갈락토오스 및 유도체 둘다를 포함한다. 말단 갈락토오스 유도체는 그의 C-I 탄소를 통해 분자에 부착된다. 아시알로당단백질 수용체 (ASGPr) 는 간세포에 대해 독특하고, 분지형 갈락토오스-말단 당단백질에 결합한다. 바람직한 갈락토오스 클러스터는 각각 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는, 3 개의 말단 갈락토사민 또는 갈락토사민 유도체를 갖는다. 더욱 바람직한 갈락토오스 클러스터는 3 개의 말단 N-아세틸-갈락토사민을 갖는다. 당업계에 공통적인 다른 용어는 3-안테나형 (tri-antennary) 갈락토오스, 3-가 갈락토오스 및 갈락토오스 삼중체를 포함한다. 3-안테나형 갈락토오스 유도체 클러스터는 2-안테나형 또는 1-안테나형 갈락토오스 유도체 구조보다 큰 친화성으로 ASGPr 에 결합된다는 것이 공지된다 (Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982,1. Biol. Chern., 257,939-945). 다원자가는 nM 친화성을 달성하는데 필요하다. WO 2012/083046 에 따르면 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 가진 단일 갈락토오스 유도체의 부착은 전달 중합체와 함께 공동-투여되는 경우, 생체 내에서 간세포에 대한 RNAi 폴리뉴클레오티드의 기능적인 전달을 할 수 없게 한다.
갈락토오스 클러스터는 중심 분지 지점에 각각 연결된 2 개의 또는 바람직하게는 3 개의 갈락토오스 유도체를 포함할 수 있다. 갈락토오스 유도체는 당류의 C-l 탄소를 통해 중앙 분지 지점에 부착된다. 갈락토오스 유도체는 바람직하게는 링커 또는 스페이서 (spacer) (이것은 영역 Y 일 수 있음) 를 통해 분지 지점에 연결된다. 바람직한 스페이서는 유연한 친수성 스페이서이다 (U.S. Patent 5885968; Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). 바람직한 유연한 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG3 스페이서이다. 분지 지점은 3 개의 갈락토오스 유도체의 부착을 허용하고, 올리고머에 대한 분지 지점의 부착을 추가로 허용하는 임의의 소형 분자일 수 있다. 예시적인 분지 지점 그룹은 디-라이신이다. 디-라이신 분자는 3 개의 갈락토오스 유도체가 부착될 수 있는 것을 통해 3 개의 아민 기 및 디-라이신이 올리고머에 부착될 수 있는 것을 통해 카르복실 반응성 기를 함유한다. 올리고머에 대한 분지 지점의 부착은 링커 또는 스페이서를 통해 일어날 수 있다. 바람직한 스페이서는 유연한 친수성 스페이서이다. 바람직한 유연한 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG3 스페이서 (3 개의 에틸렌 단위) 이다. 갈락토오스 클러스터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 올리고머의 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.
바람직한 갈락토오스 유도체는 N-아세틸-갈락토사민 (GalNAc) 이다. 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 가진 기타 당류는 갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소-부타노일갈락토사민을 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다. 아시알로당단백질 수용체에 대한 수 많은 갈락토오스 유도체의 친화성은 연구되었고 (예를 들어: Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996,271,6686 참조) 또는 당업계에 전형적인 방법을 사용하여 쉽게 결정된다.
Figure pct00024
갈락토오스 클러스터의 하나의 구현예
Figure pct00025
분지점 및 핵산 사이에 PEC 스페이서를 갖는 갈락토오스 클러스터
GalNac 콘쥬게이트는 도 1 에 예시된다. 본 발명의 콘쥬게이트의 추가의 예가 하기에 예시된다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028

영역 A 는, 예를 들어, LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 기재되는 바와 같이, 탄수화물 콘쥬게이트 (예를 들어, GalNAc) 는 따라서 생분할가능 링커, 예컨대 본원에 정의된 바와 같은 영역 B, 및 임의로 영역 Y (이것은 상기 도표에 디-라이신으로서 예시됨) 를 통해 올리고머에 연결될 수 있다.
상기 GalNac 클러스터 콘쥬게이트 내에 소수성 또는 친유성 (또는 추가의 콘쥬게이트) 일부분 (즉, 약동학 조절제) 이 있는 곳은 BNA 또는 LNA 올리고머, 예컨대 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우 임의적이다.
본 연구에서 사용되는 특이적 GalNac 클러스터에 대한 도면을 참조한다, Conj 1, 2, 3, 4 및 Conj1a, 2a, 3a 및 4a (이것은 GalNac 클러스터를 올리고머에 연결하는 임의의 C6 링커와 함께 제시됨 - 도 12 및 17 참조).
GalNac 클러스터의 각각의 탄수화물 일부분 (예를 들어, GalNAc) 은 따라서 스페이서, 예컨대 (폴리)에틸렌 글리콜 링커 (PEG), 예컨대 디, 트리, 테트라, 펜타, 헥사-에틸렌 글리콜 링커를 통해 올리고머에 연결될 수 있다. 상기 제시되는 바와 같이 PEG 일부분은 갈락토오스 당 일부분 및 펩티드 (트리라이신이 제시됨) 링커 사이에 스페이서를 형성한다.
일부 구현예에서, GalNac 클러스터는 펩티드 링커, 예를 들어, Tyr-Asp(Asp) 트리펩티드 또는 Asp(Asp) 디펩티드를 포함하고, 이것은 2-라디칼 링커를 통해 올리고머에 (또는 영역 Y 또는 영역 B 에) 부착되며, 예를 들어 GalNac 클러스터는 하기 2-라디칼 링커를 포함할 수 있다:
Figure pct00029
R1 은 2-라디칼 바람직하게는 -C2H4-, -C3H6-, -C4H8-, -C5H10-, -C6H12-, 1,4-시클로헥실 (-C6H10-), 1,4-페닐 (-C6H4-), -C2H4OC2H4-, -C2H4(OC2H4)2- 또는 -C2H4(OC2H4)3- 으로부터 선택된다.
또한, 탄수화물 콘쥬게이트 (예를 들어, GalNAc), 또는 탄수화물-링커 일부분 (예를 들어, 탄수화물-PEG 일부분) 은, 예컨대 라이신, 디-라이신 또는 트리-라이신 또는 테트라-라이신과 같은 적합하게는 2 개 이상의 아미노 기 (예컨대, 3, 4, 또는 5 개) 를 포함하는 분지 지점 그룹, 예컨대, 아미노산, 또는 펩티드를 통해 올리고머 (또는 영역 B) 에 공유 합류 (연결) 될 수 있다. 트리-라이신 분자는 3 개의 탄수화물 콘쥬게이트 기, 예컨대 갈락토오스 & 유도체 (예를 들어, GalNAc) 및 추가의 콘쥬게이트 예컨대 소수성 또는 친유성 일부분/기가 부착될 수 있는 것을 통해 4 개의 아민 기 및 트리-라이신이 올리고머에 부착될 수 있는 것을 통해 카르복실 반응성 기를 함유한다. 추가의 콘쥬게이트, 예컨대 친유성/소수성 일부분은 올리고머에 부착된 라이신 잔기에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 (C) 는 1-가 GalNac 가 아니다.
본 발명은 또한 아시알로당단백질 수용체 표적화 일부분에 콘쥬게이션된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분 (예컨대, 제 3 영역 또는 영역 C) 은 아시알로당단백질 수용체 표적화 일부분, 예컨대 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민, 및 N-이소부타노일갈락토스-아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 갈락토오스 클러스터, 예컨대 N-아세틸갈락토사민 삼중체를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분은 GalNAc (N-아세틸갈락토사민), 예컨대 1-가, 2-가, 3-가 또는 4-가 GalNAc 를 포함한다. 3-가 GalNAc 콘쥬게이트는 화합물을 간에 표적하는데 사용될 수 있다. GalNAc 콘쥬게이트는 메틸포스포네이트 및 PNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, US 5,994517 및 Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701) 및 siRNA (예를 들어, WO2009/126933, WO2012/089352 & WO2012/083046) 와 함께 사용되었다. GalNAc 참조 및 그곳에 사용된 특이적 콘쥬게이트는 본원에 참조로서 인용된다. WO2012/083046 에는 분할가능 약동학 조절제를 포함하는 GalNAc 콘쥬게이트 일부분이 기재된다. 바람직한 약동학 조절제는 C16 소수성 기, 예컨대 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E, 12E)-옥타데카-9,12-디에노일, 디옥타노일, 및 C16-C20 아실이다. '046 분할가능 약동학 조절제는 또한 콜레스테롤일 수 있다. '046 표적화 일부분은 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민, N-이소-부타노일갈락토스-아민, 갈락토오스 클러스터, 및 N-아세틸갈락토사민 삼중체로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 16 개 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 16-20 개의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E,12E)-옥타데카-9,12디에노일, 디옥타노일, 및 C16-C20 아실, 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약동학 조절제를 가질 수 있다. '046 에 기재된 특정 GalNac 클러스터에는 (E)-헥사데크-8-에노일 (C16), 올레일 (C18), (9,E,12E)-옥타데카-9,12-디에노일 (C18), 옥타노일 (C8), 도데세카노일 (C12), C-20 아실, C24 아실, 디옥타노일 (2xC8) 이 포함된다. '046 에 따르면, 표적화 일부분-약동학 조절제 표적화 일부분은 생리학적으로 불안정한 결합 또는 예를 들어, 디설파이드 결합, 또는 PEG 링커를 통해 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있다.
기타 콘쥬게이트 일부분은, 예를 들어, 올리고당 및 탄수화물 클러스터, 예컨대 Tyr-Glu-Glu-(아미노헥실 GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3; 간세포 상의 Gal/GalNAc 수용체에 결합하는 글리코트리펩티드 (예를 들어, Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297 참조); 라이신-기재 갈락토오스 클러스터 (예를 들어, L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214 참조); 및 콜란-기재 갈락토오스 클러스터 (예를 들어, 아시알로당단백질 수용체에 대한 탄수화물 인지 모티프) 를 포함할 수 있다. 추가의 적합한 콘쥬게이트는 아시알로당단백질-수용체 (ASGP-R) 상에서 발견되는 탄수화물 인지 도메인 (CRD) 에 결합할 수 있는 올리고당을 포함할 수 있다. 올리고당 및/또는 탄수화물 복합체 함유 예시 콘쥬게이트 일부분은 그 전체가 참조로서 본원에 인용된 U.S. Pat. No. 6,525,031 에 제공된다.
약동학 조절제
본 발명의 화합물은 하나 이상의 부가적인 콘쥬게이트 일부분을 추가로 포함할 수 있고, 예컨대 콘쥬게이트 기가 탄수화물 일부분인 경우에 이의 친유성 또는 소수성 일부분이 특히 관심이 있다. 이러한 친유성 또는 소수성 일부분은 약동학 조절제로서 작용할 수 있고, 탄수화물 콘쥬게이트, 탄수화물 콘쥬게이트를 올리고머에 연결시키는 링커 또는 복합 탄수화물 콘쥬게이트 (다-원자가, multi-valent) 콘쥬게이트를 또는 올리고머에 연결시키는 링커, 임의로 링커, 예컨대 생-분할가능 링커를 통해 공유 연결될 수 있다.
올리고머 또는 콘쥬게이트 일부분은 따라서 약동학 조절제, 예컨대 친유성 또는 소수성 일부분을 포함할 수 있다. 이러한 일부분은 WO2012/082046 에서 siRNA 콘쥬게이트의 문맥 내에 기재된다. 소수성 일부분은 C8 - C36 지방산을 포함할 수 있고, 이들은 포화 또는 불포화일 수 있다. 일부 구현예에서, C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22, C24, C26, C28, C30, C32 및 C34 지방산이 사용될 수 있다. 소수성 기는 16 개 이상의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예시적인 적합한 소수성 기는 스테롤, 콜레스테롤, 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E, 12E)-옥타데카-9,12-디에노일, 디옥타노일, 및 C16-C20 아실을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. WO'346 에 따르면, 16 개 미만의 탄소 원자를 갖는 소수성 기는 폴리뉴클레오티드 표적화를 향상시키는데는 덜 효과적이지만, 이들은 효율을 향상시키기 위해 다중 카피 (예를 들어, 2x, 예컨대 2x C8 또는 C10, C12 또는 C14) 로 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 표적화 일부분으로서 유용한 약동학 조절제는 콜레스테롤, 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기, 및 아르알키닐 기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 이들 각각은 선형, 분지형 또는 시클릭일 수 있다. 약동학 조절제는 바람직하게는 오직 탄소 및 수소 원자만을 함유하는 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하는 치환 또는 헤테로원자, 예를 들어 불소가 허용될 수 있다.
놀랍게도, 본 출원인은 LNA 올리고머와 함께 사용하기 위한 GalNac 콘쥬게이트가 약동학 조절제를 필요로 하지 않으며, 이와 같이, 일부 구현예에서, GalNac 콘쥬게이트가 친유성 또는 소수성 일부분, 예컨대 예를 들어, C8 - C36 지방산 또는 스테롤을 포함하지 않는, 본원에 기재된 것들에 공유 결합되지 않는다는 것을 발견하였다. 본 발명은 따라서 또한 친유성 또는 소수성 약동학 조절제 또는 콘쥬게이트 일부분/기를 포함하지 않는 LNA 올리고머 GalNac 콘쥬게이트를 제공한다.
친유성 콘쥬게이트
본 발명의 화합물은 올리고머 (A) 및 친유성 콘쥬게이트 (C) 를 포함하는 콘쥬게이트일 수 있다. 생분할가능 링커 (B) 는 이러한 올리고머 콘쥬게이트의 활성을 유지 또는 향상시키는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 기 (C) 및 또는 링커 기 (Y) 는 친유성 기를 포함한다.
대표적인 콘쥬게이트 일부분은 스테롤 및 스테로이드 분자를 포함하는 친유성 분자 (방향족 및 비-방향족) 를 포함할 수 있다. 친유성 콘쥬게이트 일부분은 예를 들어, 올리고머성 화합물의 친수성 특성에 반하고 세포 침투를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 친유성 일부분은 예를 들어, 스테로이드 및 관련 화합물, 예컨대 콜레스테롤 (U.S. Pat. No. 4,958,013 및 Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al, Nucl Acids Res., 1992, 20, 533), 라노스테롤, 코프로스탄올 (coprostanol), 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 칼시페롤, 콜산, 데옥시콜산, 에스트론, 에스트라디올, 에스트라트리올, 프로게스테론, 스틸베스트롤, 테스토스테론, 안드로스테론, 데옥시코르티코스테론, 코르티손, 17-히드록시코르티코스테론, 이들의 유도체, 등을 포함한다.
기타 친유성 콘쥬게이트 일부분에는 지방족 기, 예컨대, 예를 들어, 직쇄, 분지형 및 시클릭 알킬, 알케닐, 및 알키닐이 포함된다. 지방족 기는 예를 들어, 5 내지 약 50, 6 내지 약 50, 8 내지 약 50, 또는 10 내지 약 50 개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예시 지방족 기에는 운데실, 도데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실, 테르펜, 보르닐, 아다만틸, 이의 유도체 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 지방족 기 내의 하나 이상의 탄소 원자는 헤테로원자, 예컨대 O, S, 또는 N 에 의해 대체될 수 있다 (예를 들어, 게라닐옥시헥실). 추가의 적합한 친유성 콘쥬게이트 일부분은 글리세롤의 지방족 유도체, 예컨대 알킬글리세롤, 비스(알킬)글리세롤, 트리스(알킬)글리세롤, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 및 트리글리세라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 친유성 콘쥬게이트는 디-헥실데실-rac-글리세롤 또는 1,2-디-O-헥실데실-rac-글리세롤 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea, et al., Nuc. Acids Res., 1990, 18, 3777) 또는 이의 포스포네이트이다. 포화 및 불포화 지방 작용기, 예컨대, 예를 들어, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 및 지방 아민은 또한, 친유성 콘쥬게이트 일부분으로서 담당할 수 있다. 일부 구현예에서, 지방 작용기는 약 6 개의 탄소 내지 약 30 개 또는 약 8 내지 약 22 개의 탄소를 함유할 수 있다. 예시 지방산은, 카프르산, 카프릴산, 라우르산, 팔미트산, 미리스트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 에이코센산 등을 포함한다.
추가의 구현예에서, 친유성 콘쥬게이트 기는 6 내지 약 50, 10 내지 약 50, 또는 14 내지 약 40 개의 탄소 원자를 갖는 폴리시클릭 방향족 기일 수 있다. 예시 폴리시클릭 방향족 기는 피렌, 퓨린, 아크리딘, 잔텐, 플루오렌, 페난트렌, 안트라센, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 나프탈렌, 이의 유도체 등을 포함한다. [0037] 기타 적합한 친유성 콘쥬게이트 일부분은 멘톨, 트리틸 (예를 들어, 디메톡시트리틸 (DMT)), 페녹사진, 리포산, 인지질, 에테르, 티오에테르 (예를 들어, 헥실-S-트리틸티올), 이의 유도체 등을 포함한다. 올리고머성 화합물의 친유성 콘쥬게이트의 제조는 당업계에, 예컨대, 예를 들어, Saison-Behmoaras et al, EMBO J., 1991, 10, 1111; Kabanov et al., FEBSLett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75, 49; (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229, 및 Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651 에 잘 기술된다.
저 밀도 지단백질 (LDL) 에 대한 친화성을 갖는 콘쥬게이트 일부분을 함유하는 올리고머성 화합물은 효과적인 표적화된 전달 시스템을 제공하는 것을 도울 수 있다. 종양 세포 상의 LDL 에 대해 수용체의 높은 발현 수준은 LDL 을 상기 세포에 대한 약물의 선택적 전달을 위한 매력적인 담체로 만든다 (Rump, et al., Bioconjugate Chem., 1998, 9, 341; Firestone, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 105; Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229). LDL 에 대한 친화성을 갖는 일부분은 많은 친유성 기, 예컨대 스테로이드 (예를 들어, 콜레스테롤), 지방산, 이의 유도체 및 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, LDL 친화성을 갖는 콘쥬게이트 일부분은 콜산의 디올레일 에스테르, 예컨대 케노데옥시콜산 및 리소콜산일 수 있다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트 기는 친유성 일부분, 예컨대 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤, 콜레스테릴, 콜레스탄올, 스티그마스테롤, 콜란산 및 에르고스테롤) 이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 콜레스테롤이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, Soutschek et al., Nature (2004) 432, 173; Krutzfeldt Nature 2005, NAR 2007 을 참조한다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 지질, 인지질 또는 친유성 알코올, 예컨대 양이온성 지질, 중성 지질, 스핑고지질, 및 지방산, 예컨대 스테아르산, 올레산, 엘라이드산, 리놀레산, 리놀레아이드산, 리놀렌산, 및 미리스트산이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지방산은 C4 - C30 포화 또는 불포화 알킬 사슬을 포함한다. 알킬 사슬은 선형 또는 분지형일 수 있다.
일부 구현예에서, 친유성 콘쥬게이트는 비오틴일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 친유성 콘쥬게이트는 글리세라이드 또는 그리세라이드 에스테르일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
친유성 콘쥬게이트, 예컨대 콜레스테롤 또는 본원에 기재된 것들은 예를 들어, 간 (전형적으로는 간세포) 에 대한 올리고뉴클레오티드의 전달을 향상시키는데 사용될 수 있다.
하기 참조는 친유성 콘쥬게이트의 용도를 언급한다: Kobylanska et al., Acta Biochim Pol. (1999); 46(3): 679 - 91. Felber et al,. Biomaterials (2012) 33(25): 599-65); Grijalvo et al., J Org Chem (2010) 75(20): 6806 - 13. Koufaki et al., Curr Med Chem (2009) 16(35): 4728-42. Godeau et al J. Med. Chem. (2008) 51(15): 4374-6.
중합체 콘쥬게이트
콘쥬게이트 일부분은 또한 중합체를 포함할 수 있다. 중합체는 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물의 침투, 세포 수송, 및 국부화에 영향을 주는 부가된 벌크 (added bulk) 및 다양한 작용기를 제공할 수 있다. 예를 들어, 올리고머성 화합물과 중합체와의 콘쥬게이션에 의해 야기되는 증가된 유체역학적 반경은 핵 내로의 유입을 방지하고 세포질 내 국부화를 권장하는 것을 도울 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 세포 섭취를 실질적으로 감소시키거나 상보적 가닥 또는 다른 표적에 대한 혼성화를 간섭하지 않는다. 추가의 구현예에서, 콘쥬게이트 중합체 일부분은 예를 들어, 약 40 미만, 약 30 미만, 또는 약 20 kDa 미만의 분자량을 갖는다. 부가적으로는, 중합체 콘쥬게이트 일부분은 수용성일 수 있고, 임의로 기타 콘쥬게이트 일부분, 예컨대 펩티드, 탄수화물, 약물, 리포터 기, 또는 추가의 콘쥬게이트 일부분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 중합체 콘쥬게이트는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 이의 공중합체 및 유도체를 포함한다. PEG 에 대한 콘쥬게이션은 올리고머성 화합물의 뉴클레아제 안정성을 증가시키는 것으로 제시된다. PEG 콘쥬게이트 일부분은 예를 들어, 약 100, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 5000, 약 10,000 이상을 포함하는 임의의 분자량의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG 콘쥬게이트 일부분은 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 또는 적어도 25 개의 에틸렌 글리콜 잔기를 함유한다. 추가의 구현예에서, PEG 콘쥬게이트 일부분은 약 4 내지 약 10, 약 4 내지 약 8, 약 5 내지 약 7, 또는 약 6 개의 에틸렌 글리콜 잔기를 함유한다. PEG 콘쥬게이트 일부분은 또한 말단 히드록실이 알콕시, 카르복시, 아실, 아미도, 또는 기타 작용기에 의해 대체되는 식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 비오틴 또는 플루오레세인을 포함하는 리포터 기와 같은 기타 콘쥬게이트 일부분은 또한 PEG 콘쥬게이트 일부분에 부착될 수 있다. PEG 의 공중합체가 또한 콘쥬게이트 일부분으로서 적합하다. [0047] 올리고뉴클레오티드의 폴리에틸렌 글리콜 콘쥬게이트의 제조 및 생물학적 활성은 예를 들어, Bonora, et al., Nucleosides Nucleotides, 1999, 18, 1723; Bonora, et al., Farmaco, 1998, 53, 634; Efimov, Bioorg. Khim. 1993, 19, 800; 및 Jaschke, et al, 핵산 Res., 1994, 22, 4810 에 기재된다. 추가 예시 PEG 콘쥬게이트 일부분 및 상응하는 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물의 제조는 각각 전체가 본원에 참조로서 인용된, 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 4,904,582 및 5,672,662 에 기재된다. 하나 이상의 PEG 일부분에 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물이 시판된다.
콘쥬게이트 일부분으로서 적합한 기타 중합체는 폴리아민, 폴리펩티드, 폴리메타크릴레이트 (예를 들어, 히드록실프로필 메타크릴레이트 (HPMA)), 폴리(L-락티드), 폴리(DL 락티드-코-글리콜라이드 (PGLA), 폴리아크릴산, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리알킬아크릴산, 폴리우레탄, 폴리아크릴아미드, N-알킬아크릴아미드, 폴리스페르민 (PSP), 폴리에테르, 시클로덱스트린, 이의 유도체 및 이의 공중합체를 포함한다. 많은 중합체, 예컨대 PEG 및 폴리아민은 특정 세포에 존재하는 수용체를 가져서, 세포 섭취를 용이하게 한다. 폴리아민 및 기타 아민-함유 중합체는 생리학적 pH 에서 양자화된 형태로 존재할 수 있어, 일부 올리고머성 화합물의 음이온성 백본에 효과적으로 반대작용을 하고, 세포 침투를 효과적으로 향상시킬 수 있다. 일부 예시 폴리아민은 폴리펩티드 (예를 들어, 폴리라이신, 폴리오르니틴, 폴리히스타딘, 폴리아르기닌, 및 이의 공중합체), 트리에틸렌테트라아민, 스페르민, 폴리스페르민, 스페르미딘, 신노르스페르미딘, C-분지형 스페르미딘, 및 이의 유도체를 포함한다. 폴리아민 콘쥬게이트의 제조 및 생물학적 활성은, 예를 들어, Guzaev, et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 3671; Corey, et al, J Am. Chem. Soc, 1995, 117, 9373; 및 Prakash, et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 1733 에 기재된다. 올리고뉴클레오티드의 예시 폴리펩티드 콘쥬게이트는 예를 들어, Wei, et al., Nucleic Acids Res., 1996, 24, 655 및 Zhu, et al., Antisense Res. Dev., 1993, 3, 265 에 제공된다. 수지상 중합체는 또한, 예컨대 그 전체가 본원에 참조로서 인용된 U.S. Pat. No. 5,714,166 에 기재되는 콘쥬게이트 일부분으로서 사용될 수 있다. [0049] 폴리아민 및 관련 중합체에 대해 상기 논의된 바와 같이, 기타 아민-함유 일부분은 또한 예를 들어, 생리학적 조건에서 양이온성 종의 형성으로 인해, 적합한 콘쥬게이트 일부분으로서 담당할 수 있다. 예시 아민-함유 일부분은 3-아미노프로필, 3-(N,N-디메틸아미노)프로필, 2-(2-(N,N-디메틸아미노)에톡시)에틸, 2-(N-(2-아미노에틸)-N-메틸아미노옥시)에틸, 2-(1-이미다졸릴)에틸, 등을 포함한다. G-clamp 일부분은 또한 아민-함유 콘쥬게이트 일부분으로서 담당할 수 있다 (Lin, et al., J. Am. Chem. Soc, 1998, 120, 8531).
일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리아미도아민 (PAA), 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리에틸렌이민 (PEI) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중합체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 갈락토오스, 락토오스, n-아세틸갈락토사민, 만노오스, 만노오스-6-포스페이트 일부 구현예에서, 중합체는 폴리양이온성 중합체이다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분은 양이온성 중합체일 수 있거나 이에 기재할 (포함할) 수 있다. 수 많은 연구는, 양이온성 알부민과 같은 양이온성 중합체가 특정 세포 유형 및/또는 조직에 대한 전달을 크게 향상시킬 수 있다는 것을 입증하였다 (예를 들어, 뇌 전달, 참조, Lu, W. et. al. (2005) J of Control Release 107:428-448). 상기 분자의 이점을 고려하면, 콘쥬게이트 일부분은 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민, 덴드리머, 폴리(알킬피리디늄) 염, 또는 양이온성 알부민일 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 친수성 중합체이다. 일부 구현예에서, 중합체는 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 이다. 일부 구현예에서, 중합체는 폴리아민 또는 폴리아미드이다 (예를 들어, US7,816,337 & US5525465. 중합체 콘쥬게이트에 대해, 예를 들어, Zhao et al., Bioconjugate Chem 2005, 16, 758-766); Kim et al., J. Control Release (2006) 116; 123. Pettit et al., Ther. Deliv. (2011) 2(7): 907-17. Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21. Winkler et al (2009) Eur J Med Chem 44(2): 670-7. Zelikin et al, Biomacromolecules (2007) 8(9): 2950-3 을 참조한다. 또한 효소 분할가능 폴리뉴클레오티드 전달 콘쥬게이트를 언급하는 WO12092373 을 참조한다.
단백질 및 펩티드 콘쥬게이트
기타 콘쥬게이트 일부분은 단백질, 서브유닛, 또는 이의 절편을 포함할 수 있다. 단백질은, 예를 들어, 효소, 리포터 효소, 항체, 수용체, 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 콘쥬게이트 일부분은 항체 또는 이의 절편일 수 있다 (Kuijpers, et al, Bioconjugate Chem., 1993, 4, 94). 항체는 종양 및 기타 질환-관련 항원과 같은 원하는 표적에 결합하도록 디자인될 수 있다. 추가의 구현예에서, 단백질 콘쥬게이트 일부분은 혈청 단백질, 예컨대 HAS 또는 당단백질, 예컨대 아시알로당단백질일 수 있다 (Rajur, et al., Bioconjugate Chem., 1997, 6, 935). 또다른 추가의 구현예에서, 올리고머성 화합물은 RNAi-관련 단백질, RNAi-관련 단백질 복합체, 서브유닛 및 이의 절편에 콘쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 올리고머성 화합물은 Dicer 또는 RISC 에 콘쥬게이션될 수 있다. [0067] 삽입제 및 작은 홈 결합제 (minor groove binder: MGB) 는 또한 콘쥬게이트 일부분으로서 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, MGB 는 반복하는 DPI (1,2-디히드로-3H-피롤로(2,3-e)인돌-7-카르복실레이트) 서브유닛 또는 이의 유도체를 함유할 수 있다 (Lukhtanov, et al., Bioconjugate Chem., 1996, 7, 564 and Afonina, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 3199). 적합한 삽입제는, 예를 들어, 폴리시클릭 방향족, 예컨대 나프탈렌, 페릴렌, 페난트리딘, 벤조페난트리딘, 페나진, 안트라퀴논, 아크리딘, 및 이의 유도체를 포함한다. 혼성 삽입제/리간드는 광뉴클레아제/삽입제 리간드 6-[[[9-[[6-(4-니트로벤즈아미도)헥실]아미노]아크리딘-4-일]카르보닐]아미노]헥산 오일-펜타플루오로페닐 에스테르를 포함한다. 상기 화합물은 삽입제인 아크리딘 일부분 및 광뉴클레아제인 p-니트로 벤즈아미도 기 모두이다. [0069] 추가의 구현예에서, 분할제는 콘쥬게이트 일부분으로서 담당할 수 있다. 분할제는 가수분해 또는 산화환원 분할 메카니즘에 의한 표적, 예컨대 표적 핵산의 분해를 용이하게 할 수 있다. 콘쥬게이트 일부분으로서 적합할 수 있는 분할기는, 예를 들어, 메탈로복합체, 펩티드, 아민, 효소, 및 뉴클레아제의 활성 부위의 구성성분을 함유하는 구성물, 예컨대 이미다졸, 구아니디늄, 카르복실, 아미노 기, 등) 을 포함한다. 예시 메탈로복합체는 예를 들어, Cu-테르피리딜 복합체, Fe-포르피린 복합체, Ru-복합체, 및 란탄족 복합체, 예컨대 다양한 Eu(III) 복합체를 포함한다 (Hall, et al., Chem. Biol, 1994, 1, 185; Huang, et al., J. Biol. Inorg. Chem., 2000, 5, 85; 및 Baker, et al, Nucleic Acids Res., 1999, 27, 1547). 분할 특성을 가진 기타 메탈로복합체는 메탈로포르피린 및 이의 유도체를 포함한다. 표적 분할 특성을 가진 예시 펩티드는 아연 핑거 (zinc finger) 를 포함한다 (U.S. Pat. No. 6,365,379; Lima, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 10010). 뉴클레아제 활성 부위 구성성분을 함유하는 예시 구성물은 비스이미아졸 및 히스타민을 포함한다.
콘쥬게이트 일부분은 또한 펩티드를 포함할 수 있다. 적합한 펩티드는 2 내지 약 30, 2 내지 약 20, 2 내지 약 15, 또는 2 내지 약 10 개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 아미노산 잔기는 D 및 L 이성질체를 모두 포함하는, 자연 발생적 또는 비-자연 발생적일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 콘쥬게이트 일부분은 pH 민감성 펩티드, 예컨대 융합생성 (fusogenic) 펩티드이다. 융합생성 펩티드는 올리고머성 화합물과 같은 작용제의 세포질로의 엔도솜 방출을 용이하게 할 수 있다. 융합생성 펩티드는 산성 pH 에서 형태가 변화하여, 엔도솜 막을 효과적으로 불안정화하여, 엔도솜 내용물의 세포질 전달을 향상시키는 것으로 여겨진다. 예시 융합생성 펩티드는 폴리믹신 B, 인플루엔자 HA2, GALA, KALA, EALA, 멜리틴-유래 펩티드, a-나선 펩티드 또는 알쯔하이머 (Alzheimer) 베타-아밀로이드 펩티드, 등으로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 융합생성 펩티드에 콘쥬게이션된 올리고뉴클레오티드의 제조 및 생물학적 활성은 예를 들어, Bongartz, et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 4681 및 U.S. Pat. Nos. 6,559,279 및 6,344,436 에 기재된다. 콘쥬게이트 일부분으로서 담당할 수 있는 기타 펩티드는 비교적 큰, 극성 분자 (펩티드, 올리고뉴클레오티드, 및 단백질 포함) 를 세포 막을 건너 수송하는 능력을 가진 전달 펩티드를 포함한다. 예시 전달 펩티드는 HIV Tat 단백질로부터의 Tat 펩티드 및 드로소필라 (Drosophila) 안테나 단백질로부터의 Ant 펩티드를 포함한다. Tat 및 Ant 의 올리고뉴클레오티드와의 콘쥬게인션은, 예를 들어, Astriab-Fisher, et al., Biochem. Pharmacol, 2000, 60, 83 에 기재된다. 콘쥬게이트 일부분으로서 사용될 수 있는 상기 및 기타 전달 펩티드는 하기 표 I 에 제공된다:
콘쥬게이션된 전달 펩티드는 예를 들어, 세포질, 핵, 핵소체, 및 소포체 (ER) 를 포함하는 세포의 특정 영역에 대한 올리고머성 화합물의 국부화를 통제하는 것을 도울 수 있다. 핵 국부화는 핵 국부화 신호 (NLS) 의 콘쥬게이션에 의해 영향을 받을 수 있다. 반대로, 세포질 국부화는 핵 배출 신호 (NES) 의 콘쥬게이션에 의해 용이해질 수 있다. [0054] 핵 내 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물의 국부화에 적합한 펩티드는, 예를 들어, N,N-디팔미틸글리실-apo E 펩티드 또는 N,N-디팔미틸글리실-아포리포단백질 E 펩티드 (dpGapoE) 를 포함한다 (Liu, et al, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 1999, 19, 2207; Chaloin, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 243, 601). 핵 또는 핵소체 국부화는 또한 아르기닌 및/또는 라이신 풍부 모티프를 가진 펩티드, 예컨대 HIV-1 Tat 에서, FXR2P, 및 안지오게닌 유래 펩티드에 의해 용이해질 수 있다 (Lixin, et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 284, 185). 부가적으로는, SV40 항원 T 유래의 핵 국부화 신호 (NLS) 펩티드 (Branden, et al., Nature Biotech, 1999, 17, 784) 는 세포의 핵에 콘쥬게션된 올리고머성 화합물을 전달하는데 사용될 수 있다. 핵 또는 핵소체 국부화 특성을 가진 기타 적합한 펩티드는 예를 들어, Antopolsky, et al., Bioconjugate Chem., 1999, 10, 598; Zanta, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999 (원숭이 바이러스 40 대형 종양 항원); Hum. Mol. Genetics, 2000, 9, 1487; 및 FEBSLett., 2002, 532, 36) 에 기재된다.
일부 구현예에서, 핵 또는 핵소체 국부화를 위한 전달 펩티드는 적어도 3 개의 연속 아르기닌 잔기 또는 적어도 4 개의 연속 아르기닌 잔기를 포함한다. 핵 국부화는 또한 RS, RE, 또는 RD 반복 모티프를 함유하는 펩티드 콘쥬게이트에 의해 용이해질 수 있다 (Cazalla, et al., Mol Cell. Biol, 2002, 22, 6871). 일부 구현예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 적어도 2 개의 RS, RE, 또는 RD 모티프를 함유한다.
올리고머성 화합물의 ER 에 대한 국부화는 예를 들어, 신호 펩티드 KDEL 에 대한 콘쥬게이션에 의해 영향을 받을 수 있다 (SEQ ID NO: 18) (Arar, et al., Bioconjugate Chem., 1995, 6, 573; Pichon, et al., Mol. Pharmacol. 1997, 57, 431). [0057] 올리고머성 화합물의 세포질 국부화는 예를 들어, 핵 배출 신호 (NES) 를 갖는 펩티드에 대한 콘쥬게이션에 의해 용이해질 수 있다 (Meunier, et al., Nucleic Acids Res., 1999, 27, 2730). NES 펩티드는 HIV-1 Rev (Henderson, et al., Exp. Cell Res., 2000, 256, 213), 전사 인자 III A, MAPKK, PKI-알파, 사이클린 B1, 및 액틴 (Wada, et al., EMBO J., 1998, 17, 1635) 및 관련 단백질 유래의 류신-풍부 NES 펩티드를 포함한다. 항미생물 펩티드, 예컨대 데르마셉틴 유도체는 또한 세포질 국부화를 용이하게 할 수 있다 (Hariton-Gazal, et al., Biochemistry, 2002, 41, 9208). RG 및/또는 KS 반복 모티프를 함유하는 펩티드는 또한 올리고머성 화합물을 세포질에 유도하는데 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 콘쥬게이트 일부분은 적어도 2 개의 RG 모티프, 적어도 2 개의 KS 모티프, 또는 1 개 이상의 RG 및 1 개의 KS 모티프를 함유한다. [0058] 전반적으로 사용되는 바와 같이, "펩티드" 는 본원에 언급된 특정 분자 또는 서열 (존재한다면) 을 포함할 뿐 아니라, 원하는 기능성이 보유되는 언급된 서열의 모두 또는 일부를 포함하는 이의 절편 및 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 절편은 6 개 이상의 아미노산을 함유한다. 펩티드는 또한 이의 기능적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 보존적 치환은 하기 세트의 기능적으로 유사한 아미노산 중에서 이루어질 수 있다: 중성-약한 소수성 (A, G, P, S, T), 친수성-산 아민 (N, D, Q, E), 친수성-염기성 (I, M, L, V), 및 소수성-방향족 (F, W, Y). 펩티드는 또한 상동 펩티드를 포함한다. 상동은 예를 들어, BLAST 알고리즘 (짧은 서열에 대해 디폴트 파라미터) 을 사용하여 %일치성에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 상동 펩티드는 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99 초과의 %일치성을 가질 수 있다. 올리고머성 화합물, 예컨대 올리고뉴클레오티드에 펩티드를 컨쥬게이션하는 방법은 예를 들어, 전체가 참조로서 본원에 인용된 U.S. Pat. No. 6,559,279 에 기재된다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분은 단백질 또는 펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 세포 침투 펩티드, 예를 들어, 페네트라틴 (Penetratin), 트랜스포르탄 (transportan), 펩타이볼 (Peptaibol) (예를 들어, 트리코로빈-XIIa (TV-XIIa)), TAT 펩티드 (HIV) 이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 폴리아르기닌 (예를 들어, 스테아릴-(RxR)(4)) 이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 테트라펩티드 Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG) 를 함유하는 N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 (HPMA) 이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 베타-아밀로이드 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩티드는 이의 절편 (에피토프 결합 부위) 을 함유하는 항체 또는 항원 결합 부위이다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 M6P-HPMA-GFLG (Yang et al 2009 참조) 이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 아르기닌 풍부 펩티드 (WO2005/115479) 이거나 이를 포함하고 - 또한 WO09005793 RGD 펩티드를 참조한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 단백질 담체 (예를 들어, 알부민, 알부민-PEG 콘쥬게이트 - RGD-PEG-알부민) (Kang et al) 이거나 이를 포함하고 또한 WO09045536 을 참조한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 히스티딜화된 올리고라이신 (예를 들어, WO0032764) 이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 당단백질: 트랜스페린-폴리양이온 (예를 들어, US5354844, WO9217210, WO9213570) 이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 아시알로당단백질 (US5346696) 이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 폴리양이온성 단백질 (예를 들어, US603095) 이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 폴리-슈도-라이신 콘쥬게이트 (예를 들어, WO07113531) 이거나 이를 포함한다.
리포터 및 염료 콘쥬게이트 기
콘쥬게이트 일부분으로서 적합한 리포터 기는 예를 들어, 분광학적 수단에 의해 검출될 수 있는 임의의 일부분을 포함한다. 예시 리포터 기는 염료, 플루로포르, 포스포어, 방사능표지, 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 기는 비오틴, 플로우레세인, 로다민, 코우마린, 또는 관련 화합물이다. 리포터 기는 또한 다른 콘쥬게이트 일부분에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 라벨 또는 염료, 예컨대 플루오로포르, 예컨대 FAM (카르복시플루오레세인) 이거나 이를 포함한다.
가교제는 또한 콘쥬게이트 일부분으로서 담당할 수 있다. 가교제는 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물과 기타 화합물과의 공유 연결을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 가교제는 이중-가닥 핵산을 공유 연결하여, 효과적으로 이중체 안정성을 증가시키고 약동학 특성을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 가교제는 광활성 또는 산화환원 활성일 수 있다. 예시 가교제는 광활성화에 의한 핵산의 사슬내 가교를 용이하게 할 수 있는 소랄렌 (psoralen) 을 포함한다 (Lin, et al, Faseb J, 1995, 9, 1371). 기타 가교제는 예를 들어, 미토마이신 C 및 이의 유사체를 포함한다 (Maruenda, et al., Bioconjugate Chem., 1996, 7, 541; Maruenda, et al., Anti-Cancer Drug Des., 1997, 12, 473; 및 Huh, et al, Bioconjugate Chem., 1996, 7, 659). 미토마이신 C 에 의해 매개되는 가교는 예컨대, 예를 들어, 생물학적 환원제를 사용하는 (예를 들어, NADPH-사이토크롬 c 환원효소/NADPH 시스템) 환원성 활성화에 의해 영향을 받을 수 있다. 추가의 광-가교제는 아릴 아지드, 예컨대, 예를 들어, N-히드록시석신이미딜-4-아지도벤조에이트 (HSAB) 및 N-석신이미딜-6(-4'-아지도-2'-니트로페닐-아미노)헥사노에이트 (SANPAH) 를 포함한다. 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이션된 아릴 아지드는 방사선 조사시 핵산 및 단백질과의 가교에 영향을 준다. 이들은 또한 어너 (earner) 단백질 (예컨대, KLH 또는 BSA) 과 가교될 수 있다.
다양한 작용 콘쥬게이트 기
기타 적합한 콘쥬게이트 일부분은, 예를 들어, 폴리보란, 카르보란, 메탈로폴리보란, 메탈로카르보란, 이의 유도체 등을 포함한다 (예를 들어, 이의 전체가 본원에 참조로서 인용된 U.S. Pat. No. 5,272,250 참조).
많은 약물, 수용체 리간드, 독소, 리포터 분자 및 기타 소형 분자는 콘쥬게이트 일부분으로서 담당할 수 있다. 소형 분자 콘쥬게이트 일부분은 종종 특정 수용체 또는 기타 생분자와 특이적인 상호작용을 가지며, 따라서 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물을 특이적 세포 또는 조직에 표적화하는 것을 허용한다. 예시 소형 분자 콘쥬게이트 일부분은 마이코페놀산 (이노신-5'-모노포스페이트 디히드로게나아제의 억제제; 건선 및 기타 피부 질환을 치료하는데 유용함), 커큐민 (건선, 암, 박테리아 및 바이러스 질환에 대한 치료적 적용을 가짐) 을 포함한다. 추가의 구현예에서, 소형 분자 콘쥬게이트 일부분은 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA) 의 리간드일 수 있다. HSA 의 수 많은 리간드가 공지되고, 예를 들어, 아릴프로피온산, 이부프로펜, 와파린, 페닐부타존, 수프로펜, 카르프로펜, 펜푸펜, 케토프로펜, 아스피린, 인도메타신, (S)-(+)-프라노프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요오도벤조산, 플루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투아트, 세팔로스포린, 설파 약물, 항박테리아제, 항생제 (예를 들어, 퓨로마이신 및 파마마이신), 등을 포함한다. 올리고뉴클레오티드-약물 콘쥬게이트 및 이들의 제조는, 예를 들어, 본원에 전체가 참조로서 인용된 WO 00/76554 에 기재된다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 소형 분자, 예컨대 소형 분자 약물 또는 전구-약물 (pro-drug) 일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 특정 약물은 특이적 표적 조직 또는 세포에 표적하는데 고도로 효과적이고, 이와 같이 이들은 올리고뉴클레오티드를 이들의 의도되는 작용 부위에 표적하는데 사용될 수 있다. 게다가, 소형 분자는 그 자체가 전형적으로는 일단 콘쥬게이트의 올리고뉴클레오티드 성분으로부터 분할되면, 치료 활성을 가질 수 있다. 예는 비스포스포네이트 (골다공증의 치료에 널리 사용되고 뼈 조직에 표적화하는데 효과적임), 항-암 약물 및 화학치료제 (예를 들어, 독소루비신 또는 마이토마이세인 C - 참조 US5776907) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 약물은 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 뉴클레오시드 폴리머라아제 억제제일 수 있다.
추가의 구현예에서, 소형 분자 콘쥬게이트는 특정 수용체 또는 세포에 표적하거나 결합할 수 있다. T-세포는 적합한 분자와 함께 Schiff 염기 복합체를 형성할 수 있는 노출된 아미노 기를 갖는 것으로 공지된다. 따라서, 노출된 아미노 기와 상호작용하거나 반응할 수 있는 알데히드와 같은 작용기를 함유하는 소형 분자는 또한 적합한 콘쥬게이트 일부분일 수 있다. 투카레솔 및 관련 화합물은 T-세포 표적과 상호작용하도록 알데히드를 자유롭게 남기는 식으로 올리고머성 화합물에 콘쥬게이션될 수 있다. 투카레솔과 T-세포와의 상호작용은 Schiff-염기 형성에 의해 면역계의 치료적 강화를 야기하는 것으로 여겨진다 (Rhodes, et al., Nature, 1995, 377, 6544).
일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 (예를 들어, 세포 표면) 수용체 리간드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 폴레이트 수용체 리간드, 예컨대 엽산 기이거나 이를 포함하고, 예를 들어, EP1572067 또는 WO2005/069994, WO2010/045584) 를 참조한다. 기타 세포 표면 수용체 리간드는 항체 및 이의 절편, 전립선-특이적 막 항원, 뉴런 표면 항원 (참조, WO2011/131693) 을 포함한다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분은 수용체에 대한 리간드이거나 또는 수용체와 (차례로) 연합되는 분자와 연합될 수 있다. 상기 계열에는 담즙산, 소형 분자 약물 리간드, 비타민, 앱타머, 탄수화물, 펩티드 (호르몬, 단백질, 단백질 절편, 항체 또는 항체 절편을 포함하나 이에 제한되지 않음), 바이러스 단백질 (예를 들어, 캡시드), 독소 (예를 들어, 박테리아 독소), 등이 포함된다. 또한 상기 계열에 포함되는 것은 사실 상 스테로이드성인, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜란산, 스티그마스테롤, 프레그놀론, 프로게스테론, 코르티코스테론, 알도스테론, 테스토스테론, 에스트라디올, 에르고스테롤, 등인 콘쥬게이트이다. 본 설명의 바람직한 콘쥬게이트 일부분은 콜레스테롤 (CHOL), 콜레스탄올 (CHLN), 콜란산 (CHLA), 스티그마스테롤 (STIG), 및 에르고스테롤 (ERGO) 이다. 특정 바람직한 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분은 콜레스테롤이다.
일부 구현예에서, 콘쥬게이트는, 임의로 링커, 예컨대 지방산 링커, 예를 들어, C6 링커를 포함하는, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 또는 토코페롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 콘쥬게이트는 Conj5a 또는 Conj 6a 를 포함한다.
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콘쥬게이트 일부분은 또한 비타민을 포함할 수 있다. 비타민은 수 많은 세포 수송 시스템에 의해 세포 내로 수송되는 것으로 공지된다. 전형적으로, 비타민은 수용성 또는 지용성으로 분류될 수 있다. 수용성 비타민은 티아민, 리보플라빈, 니코틴산 또는 니아신, 비타민 B6 피리독살 기, 판토텐산, 비오틴, 엽산, B]2 코바미드 (cobamide) 조효소, 이노시톨, 콜린 및 아스코르브산을 포함한다. 지용성 비타민은 비타민 A 계열, 비타민 D, 비타민 E 토코페롤 계열 및 비타민 K (및 파이톨) 를 포함한다. 관련 화합물은 레티노이드 유도체, 예컨대 타자로텐 및 에트레티네이트를 포함한다. [0040] 일부 구현예에서, 콘쥬게이트 일부분은 엽산 폴레이트) 및/또는 이의 다양한 형태 중 하나 이상, 예컨대 디히드로엽산, 테트라히드로엽산, 폴린산, 프테로폴리글루탐산, 디히드로폴레이트, 테트라히드로폴레이트, 테트라히드로프테린, 1-데아자, 3-데아자, 5-데아자, 8-데아자, 10-데아자, 1,5-디데아자, 5,10-디데아자, 8,10-디데아자 및 5,8-디데아자 폴레이트 유사체, 및 항폴레이트를 포함한다. 폴레이트는 핵산의 생합성에 관여하고 따라서 세포의 생존 및 증식에 영향을 준다. 폴레이트 조인자는 피리미딘 뉴클레오시드의 생합성에 필요한 1-탄소 수송에서 중요한 역할을 한다. 세포는 그러므로 폴레이트를 세포질 내로 수송하는 시스템을 갖는다. 폴레이트 수용체는 또한 많은 인간 암 세포에서 과발현되는 경향이 있고, 난소 암 세포에 대한 올리고뉴클레오티드의 폴레이트-매개 표적화가 보고되었다 (Li, et al, Pharm. Res. 1998, 15, 1540, 이것은 전체가 참조로서 본원에 인용됨). 핵산의 엽산 콘쥬게이트의 제조는, 예를 들어, 전체가 참조로서 본원에 인용된 U.S. Pat. No. 6,528,631 에 기재된다.
비타민 콘쥬게이트 일부분은, 예를 들어, 비타민 A (레티놀) 및/또는 관련 화합물을 포함한다. 레티노산 및 레티놀을 포함하는 비타민 A 계열 (레티노이드) 은 전형적으로, 특이적 단백질, 예컨대 시토졸 레티놀-결합 단백질 유형 II (CRBP-II), 레티놀-결합 단백질 (RBP), 및 세포 레티놀-결합 단백질 (CRBP) 과의 이들의 상호작용을 통해 표적 조직에 흡수되고 수송된다. 비타민 A 계열의 화합물은 다양한 계열 멤버에서 발견되는 산 또는 알코올 작용기를 통해 올리고머성 화합물에 부착될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 대해 펜턴트 링커 상의 아민 작용기에 대한 레티노산의 산 일부분의, N-히드록시 석신이미드 에스테르의 콘쥬게이션은 아미드 결합을 통한 올리고머성 화합물에 대한 비타민 A 화합물의 연결을 산출할 수 있다. 또한, 레티놀은 5' 콘쥬게이션에 유용한, 이의 포스포라미디트로 전환될 수 있다. 알파-토코페롤 (비타민 E) 및 기타 토코페롤 (베타~제타) 은 이들의 친유성 특성으로 인해 섭취를 향상시키기 위해 올리고머성 화합물에 콘쥬게이션될 수 있다. 또한, 비타민 D, 및 이의 에르고스테롤 전구체는, 히드록실 기를 먼저 활성화시켜 이들의 히드록실 기를 통해 올리고머성 화합물에, 예를 들어, 헤미석시네이트 에스테르에, 콘쥬게이션될 수 있다. 콘쥬게이션은 이후 올리고머성 화합물에 또는 올리고머성 화합물로부터 펜던트 아미노링커에 직접 영향을 줄 수 있다. 유사한 방식으로 올리고머성 화합물에 콘쥬게이션될 수 있는 기타 비타민은 티아민, 리보플라빈, 피리독신, 피리독사민, 피리독살, 데옥시피리독신을 포함한다. 지용성 비타민 K's 및 관련 퀴논-함유 화합물은 퀴논 고리 상에 카르보닐 기를 통해 콘쥬게이션될 수 있다. 비타민 K 의 파이톨 일부분은 또한 올리고머성 화합물의 세포에 대한 결합을 향상시키는 것을 담당할 수 있다.
본 발명의 화합물에서 콘쥬게이트로서 사용될 수 있는 기타 작용기는, 이미다졸 콘쥬게이트 - RNase A 촉매성 중심 모방체 (폴리아민-이미다졸 콘쥬게이트) - 를 포함하고, Guerniou et al Nucleic Acids Res (2007); 35 (20): 6778-87 을 참조한다.
콘쥬게이트는 전형적으로는 비-뉴클레오티드 일부분이다. 그러나, 차단기 또는 표적화 기, 또는 뉴클레오티드 유사 소형 치료법의 문맥에서, 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 DNA/RNA 포스포디에스테르 영역을 통해 뉴클레오티드 일부분에 공유 연결될 수 있다는 것이 인지된다. 적합하게는, 본 발명의 문맥에서 사용되는 바와 같은 핵산 기는 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 (영역 A) 의 표적에 대한 상보성이 결여될 수 있다.
일부 구현예에서, 차단 또는 표적화 일부분은 앱타머이다 (예를 들어, Meng et al., PLoS One (2012) 7(4): e33434, WO2005/111238 & WO12078637 참조).
차단기는 또한 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 이와 관련하여 차단 올리고뉴클레오티드는 DNA/RNA 포스포디에스테르 영역 (영역 b), 및 임의로 링커를 통해 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유 결합된다. 따라서 차단 올리고뉴클레오티드는 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 이중체를 형성할 수 있다. 적합하게는 차단 뉴클레오티드 서열 (제 3 영역 또는 영역 C 로서) 은 제 1 영역의 동등한 길이를 갖는 이중체 (즉, 이에 상보적인) 를 형성하는 예를 들어, 3 - 10 개의 뉴클레오티드 길이의 짧은 올리고뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 링커는 제 2 영역 및 차단 영역 사이에 사용된다.
전달 펩티드와 같이, 핵산은 또한 세포 내 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물의 국부화에 영향을 줄 수 있는 콘쥬게이트 유사 일부분으로서 담당할 수 있다. 예를 들어, 핵산 콘쥬게이트 일부분은 세포질 내에 폴리 A-함유 분자를 국부화할 수 있는, 폴리 A 결합 단백질 (PABP) 에 의해 인지되는 모티프인 폴리 A 를 함유할 수 있다 (Gorlach, et al., Exp. Cell Res., 1994, 211, 400). 일부 구현예에서, 핵산 콘쥬게이트 일부분은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 및 적어도 25 개의 연속 A 염기를 함유한다. 핵산 콘쥬게이트 일부분은 또한 하나 이상의 AU-풍부 서열 요소 (ARE) 를 함유할 수 있다. ARE 는 세포질로의 국부화를 용이하게 할 수 있는 ELAV 계열 단백질에 의해 인지된다 (Bollig, et al, Biochem. Bioophys. Res. Commun., 2003, 301, 665). 예시 ARE 는 UUAUUUAUU 및 상기 모티프의 다중 반복을 함유하는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 콘쥬게이트 일부분은 2 개 이상의 AU 또는 AUU 모티프를 함유한다. 유사하게는, 핵산 콘쥬게이트 일부분은 또한 단백질의 ELAV 계열의 HuR 및 또는 단백질 HuD 에 결합할 수 있는 하나 이상의 CU-풍부 서열 요소 (CRE) (Wein, et al, Eur. J. Biochem., 2003, 270, 350) 를 함유할 수 있다. ARE 와 같이, CRE 는 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물을 세포질에 국부화시키는 것을 도울 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 콘쥬게이트 일부분은 모티프 (CUUU)n (식 중, 예를 들어, n 은 1 내지 약 20, 1 내지 약 15, 또는 1 내지 약 11 일 수 있음) 을 함유한다. (CUUU)n 모티프는 임의로 하나 이상의 U 가 후속하거나 선행될 수 있다. 일부 구현예에서, n 은 약 9 내지 약 12 또는 약 11 이다. 핵산 콘쥬게이트 일부분은 또한 hnRNP 단백질 (이종 핵 리보뉴클레오단백질) 의 기질을 포함할 수 있고, 이중 일부는 핵 및 세포질 사이의 왕복 (shuttling) 핵산에 관여한다 (예를 들어, nhRNP Al 및 nhRNP K; 참조, 예를 들어, Mili, et al, Mol. Cell Biol, 2001, 21, 7307). 일부 예시 hnRNP 기질은 서열 UAGGA/U 또는 (GG)ACUAGC(A) 를 함유하는 핵산을 포함한다. 기타 핵산 콘쥬게이트 일부분은 예를 들어, linRNP I 에 결합될 수 있는 Y 스트링 (string) 또는 기타 트랙 (tract) 을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 콘쥬게이트는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 및 적어도 25 개의 연속 피리미딘 염기를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산 콘쥬게이트는 50 초과, 60 초과, 70 초과, 80 초과, 90 초과, 또는 95 % 초과의 피리미딘 염기를 함유할 수 있다.
기타 핵산 콘쥬게이트-유사 일부분은 예컨대, Wang, et al., Cell, 2002, 110, 501 에 기재된 바와 같은 푸밀리오 (pumilio) (puf 단백질) 인지 서열을 포함할 수 있다. 예시 푸밀리오 인지 서열은 UGUANAUR (식 중, N 은 임의의 염기일 수 있고, R 은 퓨린 염기일 수 있음) 을 포함할 수 있다. 세포질에 대한 국부화는 ARE 및/또는 CRE 를 함유하는 핵산 콘쥬게이트 일부분에 의해 용이해질 수 있다. hnRNP 의 기질로서 담당하는 핵산 콘쥬게이트-유사 일부분은 콘쥬게이션된 올리고머성 화합물의 세포질 (예를 들어, hnRNP Al 또는 K) 또는 핵 (예를 들어, hnRNP I) 에 대한 국부화를 용이하게 할 수 있다. 부가적으로는, 핵 국부화는 폴리피리미딘 트랙을 함유하는 핵산 콘쥬게이트-유사 일부분에 의해 용이해질 수 있다.
반응성 기
반응성 기는 화학 합성에서 사용되는 기이며, 이것은 본 발명의 문맥에서 올리고뉴클레오티드를 "콘쥬게이트", 또는 다르게는 올리고뉴클레오티드를 제 3 영역 (X), 예컨대 콘쥬게이트, 차단기 또는 표적화 기, 또는 임의로 링커 (Y) 에 공유 연결하는데 사용될 수 있다. 반응성 기의 예는 올리고뉴클레오티드 합성에 널리 사용되는 포스포라미디트이다.
활성화 기
활성화 기는 반응성 기를 형성하기 위해 활성화될 수 있는 기이다. 이와 관련하여, 활성화 기는 보호된 반응성 기로서 간주될 수 있고, 이것은 예를 들어 본원에 기재된 합성/제조 방법에서, 반응성 기의 사용을 가능하게 하기 전에 탈보호될 수 있다.
연결 기
뉴클레오시드 연결은 올리고뉴클레오티드 내 뉴클레오시드 사이의 연결 기이고, 또는 존재하는 경우, 또한 제 3 영역 (X 또는 C) 또는 링커 (Y) 를 영역 B 에 부착시키는 기를 설명명할 수 있다 - 예를 들어 상기 링커는 포스페이트 (함유) 연결 기 또는 트리아졸 기일 수 있다.
차단기 (또한 차단/차단기 일부분으로서 언급됨)
일부 양상에서, 제 3 영역은 차단 영역이다. 차단기는 전형적으로 콘쥬게이트 또는 올리고뉴클레오티드 (전형적으로 표적 영역에 상보적이지 않음) 이고, 이것은 예를 들어 (그러나 제한 없이) 입체 장애를 통해, 또는 제 1 영역 (또는 제 1 및 제 2 영역) 에 대한 혼성화를 통해, 올리고머의 활성을 방지 또는 감소시킨다. (차단된) 활성은 이의 의도된 표적 (표적) 또는 일부 구현예에서, 비의도된 표적 (오프-표적 (off-target)) 에 대한 것일 수 있다.
본 발명의 올리고머성 화합물은 따라서 제 1 영역, 예컨대 갭머 또는 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 화학식 X'Y'Z 의 갭머), 생분할가능 링커인 제 2 영역, 예컨대 본원에 기재된 영역 B, 및 제 1 영역의 상응하는 영역에 상보적인 적어도 2 개의 연속 뉴클레오시드, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 개의 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 제 3 영역인, 영역 C 을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 영역 C 의 적어도 2 개의 뉴클레오시드, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 뉴클레오시드는 고 친화성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA (BNA) 이고 - 일부 구현예에서, 이들은 영역 C 의 원위 부분을 형성할 수 있다. 영역 C 의 고 친화성 뉴클레오시드 유사체는 고 친화성 뉴클레오시드 유사체의 근접 서열을 형성할 수 있고, 여기에 기타 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 뉴클레오시드 (또한 영역 C 의 근위 부분으로서 언급되는 영역 C 의 일부) 가 측면에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 영역 C 는 2 - 8 (예컨대, 3, 4, 5, 6, & 7 개의 LNA (BNA) 뉴클레오티드, 및 동일 또는 상이한 구현예에서 2 - 16 개의 DNA 뉴클레오티드 (예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) 의 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 B 의 원위 부분은 고 친화성 뉴클레오티드 유사체의 근접 영역, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 LNA 뉴클레오티드의 근접 영역을 포함한다. 근위 영역은 비-LNA 뉴클레오티드의 근접 영역, 예컨대 본원에 언급된 것들, 예컨대 DNA 뉴클레오티드, 예컨대 2 - 16 개의 비-LNA 뉴클레오티드의 영역을 포함할 수 있다. 그러나 또한 근위 영역은 LNA 를 포함하는 고 친화성 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있으나, LNA 의 근접 영역은 근위 영역의 형태적 유연성을 제한할 수 있으므로 (이것은 루프로서 작용하는 것으로 여겨짐), 이것은 일부 구현예에서, 근위에서 LNA 의 긴 신장부 (또는 루프 형성 부분), 예컨대 4 개 이하의 연속 LNA, 예컨대 3 개 이하의 연속 LNAs, 또는 2 개 이하의 연속 LNA 의 사용을 제한하는데 유용할 수 있는 것으로 이해된다.
일부 구현예에서, 영역 C 내의 기타 뉴클레오티드의 영역 (예컨대, DNA 뉴클레오티드) 은 영역 B 와 함께 근접 서열을 형성하여, 즉, 영역 B 의 말단 뉴클레오티드에 대해 근위에 있어, 고 친화성 뉴클레오티드의 영역이 영역 B 에 대해 원위에 있도록 한다. 이러한 양상에서, 영역 B 및 영역 C 의 근위 부분 (예를 들어, DNA 뉴클레오티드를 포함하는 영역) 은 유연한 루프를 형성할 수 있는데, 이것은 영역 C 의 원위 부분이 제 1 영역과 혼성화하는 것을 허용한다. 영역 C 의 근위 부분은 영역 A 의 상응하는 부분에 상보적일 수 있거나 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 영역 C 의 원위 부분은 RNaseH 를 모집할 수 있는 영역, 예컨대 갭머의 갭 영역 (본원에서 영역 Y' 로 언급됨) 을 형성하는 뉴클레오티드에 상보적이다. 이러한 구현예에서, 차단 영역 (영역 C) 은 갭 영역, 또는 이의 일부와 이중체를 형성하여, 기타 분자 또는 표적 또는 오프-표적과 상호작용하기 위한 갭머의 중앙 영역의 이용가능성을 차단한다. 따라서 본 발명은 DNA 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 고유의 독성에 대한 해법을 제공하는데 (이것은 전형적으로 갭머의 갭 영역에 대해 사용됨), 이것이 표적 조직 또는 세포 내의 갭머 올리고머 (영역 A) 의 통제된 활성화에 대해 허용되기 때문이다. 이와 관련하여, 차단 영역의 사용은 전구-약물로서 작용할 수 있다. 차단 영역 (영역 C 또는 이의 원위 부분) 이 또한 믹스머 또는 토탈머 올리고머를 포함하는 올리고머의 다른 영역, 또는 갭머의 측면 영역을 향하여, 또는 갭머의 윙 (wing) 영역 및 갭 영역을 가로지르는 방향을 할 수 있다는 것이 인지된다. 이러한 구현예에서, 영역 C (또는 이의 원위 부분) 에서 영역 A (또는 영역 A 의 일부) 에 대한 혼성화는, 영역 A 의 상응하는 영역의 생분자에 대한 혼성화를 방지하고, 따라서 기타 생분자와의 비-의도된 상호작용을 방지하는데 사용될 수 있어, 특이성, 조직 특이적 활성을 향상시키고 독성의 위험을 감소시킬 수 있다. 영역 C 의 뉴클레오티드 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 이외의 것일 수 있고, 예컨대 포스포로티오에이트일 수 있다.
표적화 기 (또한 표적화 일부분으로서 언급됨)
표적화 일부분은 올리고머성 화합물 상의 그 존재가 올리고머성 화합물의 생체분포 (biodistribution) 및/또는 세포 섭취의 상이한 패턴을 야기하는 기이다. 표적화 기는 예를 들어, 수용체 리간드, 항체, 호르몬 또는 호르몬 유사체, 앱타머 등일 수 있다. 예는 표적화 기로서의 콜레스테롤의 사용을 보여주며 - 콜레스테롤은 간세포의 표면 내의 LDL 수용체에 의해 인지되어, 콜레스테롤 콘쥬게이션된 올리고뉴클레오티드의 간 내로의 우선적인 섭취를 야기한다. 예는 또한 표적화 기로서 GalNac, 토코페롤, 및 엽산의 사용을 예증한다.
올리고머 연결된 생분할가능 콘쥬게이트
올리고머성 화합물은 임의로, 올리고머 (영역 A 로서 언급됨) 및 콘쥬게이트 (영역 C 로서 언급됨) 사이에 위치한 제 2 영역 (영역 B) 을 포함할 수 있다. 영역 B 는 링커, 예컨대 분할가능 링커 (또한 생리학적으로 불안정한 연결로서 언급됨) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 올리고머 (또는 근접 뉴클레오티드 서열 또는 영역 A) 를 콘쥬게이트 일부분 (또는 영역 C) 에 합류시키는, 생분할가능 링커 (또한 생리학적으로 불안정한 링커, 뉴클레아제 감수성 생리학적 불안정 연결, 또는 뉴클레아제 감수성 링커로서 언급됨), 예를 들어 포스페이트 뉴클레오티드 링커 (예컨대, 영역 B) 또는 펩티드 링커를 포함한다.
본 발명에 따른 생분할가능 링커는 표적 조직 (즉, 생리학적으로 불안정한), 예를 들어 간 및/또는 신장에서 분할하기 쉬운 링커를 말한다. 표적 조직에서 관찰된 분할 속도가 혈청에서 발견된 것보다 큰 것이 바람직하다. 조직 (예를 들어, 간 또는 신장) 에서의 및 혈청에서의 분할 수준 (%) 를 결정하는데 적합한 방법은 실시예 6 에서 밝혀진다. 일부 구현예에서, 생분할가능 링커 (또한 생리학적으로 불안정한 링커, 또는 뉴클레아제 감수성 링커로서 언급됨), 예컨대 영역 B 는 본 발명의 화합물에서, 실시예 6 의 간 또는 신장 균질화물 어세이에서, 적어도 약 20% 분할, 예컨대 적어도 약 30% 분할, 예컨대 적어도 약 40% 분할, 예컨대 적어도 약 50% 분할, 예컨대 적어도 약 60% 분할, 예컨대 적어도 약 70% 분할, 예컨대 적어도 약 75% 분할된다. 일부 구현예에서, 실시예 6 에서의 어세이에서 사용되는 바와 같은 혈청 내 분할 (%) 는, 약 20% 미만, 예컨대 약 10% 미만, 예컨대 5% 미만, 예컨대 약 1% 미만이다.
본 발명에 따른 생분할가능 링커는 표적 조직 (즉, 생리학적으로 불안정한), 예를 들어 간 및/또는 신장에서 분할하기 쉬운 링커를 말한다. 표적 조직에서 관찰된 분할 속도가 혈청에서 발견된 것보다 큰 것이 바람직하다. 조직 (예를 들어, 간 또는 신장) 에서의 및 혈청에서의 분할 수준 (%) 를 결정하는데 적합한 방법은 실시예 6 에서 밝혀진다. 일부 구현예에서, 생분할가능 링커 (또한 생리학적으로 불안정한 링커, 또는 뉴클레아제 감수성 링커로서 언급됨), 예컨대 영역 B 는 본 발명의 화합물에서, 실시예 6 의 간 또는 신장 균질화물 어세이에서, 적어도 약 20% 분할, 예컨대 적어도 약 30% 분할, 예컨대 적어도 약 40% 분할, 예컨대 적어도 약 50% 분할, 예컨대 적어도 약 60% 분할, 예컨대 적어도 약 70% 분할, 예컨대 적어도 약 75% 분할된다. 일부 구현예에서, 실시예 6 에서의 어세이에서 사용되는 바와 같은 혈청 내 분할 (%) 는, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 예컨대 약 10% 미만, 예컨대 5% 미만, 예컨대 약 1% 미만이다.
동일 또는 상이할 수 있는 일부 구현예에서, 생분할가능 링커 (또한 생리학적으로 불안정한 링커, 또는 뉴클레아제 감수성 링커로서 언급됨), 예컨대 영역 B 는 본 발명의 화합물에서, S1 뉴클레아제 분할에 감수성이 있다. S1 분할에 대한 감수성은 실시예 6 에 제시된 S1 뉴클레아제 어세이를 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 생분할가능 링커 (또한 생리학적으로 불안정한 링커, 또는 뉴클레아제 감수성 링커로서 언급됨), 예컨대 영역 B 는 본 발명의 화합물에서, 실시예 6 에서 사용되는 어세이에 따라 S1 뉴클레아제와의 120 분 인큐베이션 후 적어도 약 30% 분할, 예컨대 적어도 약 40% 분할, 예컨대 적어도 약 50% 분할, 예컨대 적어도 약 60% 분할, 예컨대 적어도 약 70% 분할, 예컨대 적어도 약 80% 분할, 예컨대 적어도 약 90% 분할, 예컨대 적어도 95% 분할된다.
뉴클레아제 감수성 생리학적 불안정 연결: 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 (또한 올리고머성 화합물로서 언급됨) (또는 콘쥬게이트) 는 하기 3 개의 영역을 포함한다:
i) 제 1 영역 (영역 A), 10 - 18 개의 근접 뉴클레오티드를 포함함;
ii) 제 2 영역 (영역 B), 생분할가능 링커를 포함함
iii) 제 3 영역 (C), 콘쥬게이트 일부분, 표적화 일부분, 활성화 일부분을 포함하며, 제 3 영역은 제 2 영역에 공유 연결됨.
일부 구현예에서, 영역 B 는 포스페이트 뉴클레오티드 링커일 수 있다. 예를 들어 이러한 링커는 콘쥬게이트가 친유성 콘쥬게이트, 예컨대 지질, 지방산, 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 또는 토코페롤인 경우 사용될 수 있다. 포스페이트 뉴클레오티드 링커는 또한 기타 콘쥬게이트, 예를 들어 탄수화물 콘쥬게이트, 예컨대 GalNac 에 대해 사용될 수 있다.
펩티드 및 기타 링커
일부 구현예에서, 생분할가능 링커 (영역 B) 는 polyGalNac 콘쥬게이트, 예컨대 triGalNac 콘쥬게이트에 사용될 수 있는 펩티드, 예컨대 트리라이신 펩티드 링커이다.
디설파이드 링커 (또한 본원에서 디티오 또는 디설파이드로 언급됨) 를 포함하여 사용될 수 있는 당업계에 공지된 기타 링커이다. 기타 펩티드 링커는 예를 들어, Tyr-Asp(Asp) 트리펩티드 또는 Asp(Asp) 디펩티드를 포함한다.
포스페이트 뉴클레오티드 링커
일부 구현예에서, 영역 B 는 예컨대 인터뉴클레오시드 연결 기, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 통해 제 1 영역의 5' 또는 3' 뉴클레오티드에 공유 연결된 1 - 6 개의 뉴클레오티드를 포함한다, 이때
a. 제 1 및 제 2 영역 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 연결이고, 제 1 영역에 인접한 [예컨대 바로 옆에] 제 2 영역의 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA 임; 및/또는
b. 제 2 영역의 적어도 1 개의 뉴클레오시드는 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드임;
일부 구현예에서, 영역 A 및 영역 B 는 10 - 22, 예컨대 12 - 20 개의 뉴클레오티드 길이의 단일 근접 뉴클레오티드 서열을 형성한다.
일부 양상에서, 제 1 및 제 2 영역 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 제 2 영역의 고려된 부분일 수 있다.
링커
연결 또는 링커는 하나 이상의 공유 결합을 통해 관심의 하나의 화학 기 또는 분절을 관심의 또다른 화학 기 또는 분절에 연결하는 2 개의 원자 사이의 연결이다. 콘쥬게이트 일부분 (또는 표적화 또는 차단 일부분) 은 직접 또는 연결하는 일부분 (링커 또는 밧줄) - 링커를 통해 올리고머성 화합물에 부착될 수 있다. 링커는 제 3 영역, 예를 들어, 콘쥬게이트 일부분을, 올리고머성 화합물에 (예컨대, 영역 B 에) 공유 연결하는 것을 담당하는 2-작용성 일부분이다. 일부 구현예에서, 링커는 에틸렌 글리콜 또는 아미노산 단위와 같은 반복 단위의 사슬 구조 또는 올리고머를 포함한다. 링커는, 하나는 올리고머성 화합물에 부착하기 위한 것이고 다른 것은 콘쥬게이트 일부분에 부착하기 위한 것인 2 개 이상의 작용기를 가질 수 있다. 예시 링커 작용기는 올리고머 또는 콘쥬게이트 일부분 상의 친핵성 기와 반응할 수 있는 친전자성, 또는 친전자성 기와 반응하기 위한 친핵성일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 작용기는 아미노, 히드록실, 카르복실산, 티올, 포스포르아미데이트, 포페이트, 포스파이트, 불포화 (예를 들어, 이중 또는 삼중 결합) 등을 포함한다. 일부 예시 링커는 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (ADO), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 6-아미노헥산산 (AHEX 또는 AHA), 6-아미노헥실옥시, 4-아미노부티르산, 4-아미노시클로헥실카르복실산, 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도-카프로에이트) (LCSMCC), 석신이미딜 m-말레이미도-벤조일레이트 (MBS), 석신이미딜 N-e-말레이미도-카프로일레이트 (EMCS), 석신이미딜 6-(베타 - 말레이미도-프로피오아미도) 헥사노에이트 (SMPH), 석신이미딜 N-(a-말레이미도 아세테이트) (AMAS), 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), 베타-알라닌 (베타-ALA), 페닐글리신 (PHG), 4-아미노시클로헥산산 (ACHC), 베타-(시클로프로필) 알라닌 (베타-CYPR), 아미노 도데칸산 (ADC), 알릴렌 디올, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 등을 포함한다.
콘쥬게이트 일부분의 올리고머성 화합물에 대한 부착에 유용할 수 있는 광범위한 추가의 링커 기가 당업계에 공지된다. 유용한 링커 기의 많은 리뷰는, 예를 들어, Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350 에서 찾을 수 있다. 디설파이드 연결이 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 펩티드에 연결하는데 사용되었다 (Corey, et al., Science 1987, 238, 1401; Zuckermann, et al, J Am. Chem. Soc. 1988, 110, 1614; 및 Corey, et al., J Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8524). Nelson, et al., Nuc. Acids Res. 1989, 17, 7187 은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 비오틴을 부착하기 위한 연결 시약을 기술한다. 상기 시약인, N-Fmoc-O- DMT-3 -아미노-1,2-프로판디올은 Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.) 사에서 명칭 3'-아민으로 시판된다. 이것은 또한 명칭 3'-Amino-Modifier 시약으로 Glen Research Corporation (Sterling, Va.) 에서 시판된다. 상기 시약은 또한 Judy, et al., Tetrahedron Letters 1991, 32, 879 에서 보고된 바와 같이 펩티드를 올리고뉴클레오티드에 연결하기 위해 사용되었다. 올리고뉴클레오티드의 5 '-말단에 대한 연결을 위한 유사한 시판 시약은 5'-Amino-Modifier C6 이다. 상기 시약은 Glen Research Corporation (Sterling, Va.) 에서 시판된다. 상기 화합물 또는 유사한 것은 Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161 에 의해, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 플루오레세인을 연결시키기 위해 사용되었다. 아크리딘과 같은 기타 화합물은 폴리메틸렌 연결을 통해 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 포스페이트 기에 부착되었다 (Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297). [0074] 상기 기 중 임의의 것은 단일 링커로서 또는 하나 이상의 추가의 링커와 조합으로 사용될 수 있다.
링커 및, 올리고머성 화합물의 콘쥬게이트의 제조에서의 이들의 용도는 WO 96/11205 및 WO 98/52614 및 U.S. Pat. Nos. 4,948,882; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,580,731; 5,486,603; 5,608,046; 4,587,044; 4,667,025; 5,254,469; 5,245,022; 5,112,963; 5,391,723; 5,510475; 5,512,667; 5,574,142; 5,684,142; 5,770,716; 6,096,875; 6,335,432; 및 6,335,437 (이들 각각은 전체가 본원에 참조로서 인용됨) 과 같이 당업계 전반에 걸쳐 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은, 생리학적으로 불안정한 결합은 포유동물 체내에서 정상적으로 마주하는 또는 마주하는 것과 유사한 조건 하에서 분할가능한 불안정한 결합 (또한 분할가능 링커로서 언급됨) 이다. 생리학적으로 불안정한 연결 기는 특정 생리학적 조건으로 존재하는 경우 화학적 변형 (예를 들어, 분할) 을 겪는 그러한 것이 선택된다. 포유동물 세포내 조건은 포유동물 세포에서 발견되는 또는 여기서 마주하는 것과 유사한 화학적 조건, 예컨대 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 작용제, 및 염 농도를 포함한다. 포유동물 세포내 조건은 또한 단백질분해 또는 가수분해 효소와 같은 포유동물 세포에 정상적으로 존재하는 효소적 활성의 존재를 포함한다. 일부 구현예에서, 분할가능 링커는 예를 들어, 표적 세포에서 발현될 수 있는 뉴클레아제(들) 에 감수성이 있고 - 예컨대 본원에 상세화된 바와 같이, 링커는 짧은 영역 (예를 들어, 1 - 10) 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 뉴클레오시드일 수 있다.
화학적 변형 (불안정한 결합의 분할) 은 약학적으로 허용가능한 작용제의 세포에 대한 첨가에 의해 개시될 수 있거나 또는 불안정한 결합을 함유하는 분자가 적합한 세포내 및/또는 세포외 환경에 도달할 때 자발적으로 일어날 수 있다. 예를 들어, pH 불안정한 결합은 분자가 산성화된 엔도좀에 유입될 때 분할될 수 있다. 따라서, pH 불안정한 결합은 엔도솜 분할가능 결합인 것으로 고려될 수 있다. 효소 분할가능 결합은 엔도솜 또는 라이소좀에 또는 세포질에 존재하는 것과 같은 효소에 노출될 때 분할될 수 있다. 디설파이드 결합은 분자가 세포 세포질의 좀더 환원성인 환경으로 유입될 때 분할될 수 있다. 따라서, 디설파이드는 세포질성 분할가능 결합인 것으로 고려될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, pH-불안정한 결합은 산성 조건 (pH<7) 하에서 선택적으로 파손되는 불안정한 결합이다. 이러한 결합은 또한 엔도솜성 불안정한 결합으로서 불릴 수 있는데, 세포 엔도솜 및 라이소좀이 7 미만의 pH 를 갖기때문이다.
활성화된 올리고머
일부 구현예에서, 본 발명은 활성화된 올리고머 - 즉, 본 발명의 올리고머의 합성에 사용되는 중간체 - 예를 들어ㅡ 콘쥬게이션된 올리고머를 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명의 올리고머는 일부 구현예에서, 본원에 기재된 영역 A 및 영역 B, 및 올리고머의 콘쥬게이션에서의 사용에 적합한, 활성화 (또는 반응성) 기에 공유 연결된 영역 B 를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "활성화된 올리고머" 는 본원에 기재된 콘쥬게이트를 형성하기 위해, 하나 이상의 콘쥬게이션된 일부분에 대한, 즉, 핵산 또는 단량체 그 자체가 아닌 일부분에 대한 올리고머의의 공유 연결을 허용하는 하나 이상의 작용화된 일부분에 공유 연결된 (즉, 작용화된) 본 발명의 올리고머를 말한다. 전형적으로는, 작용화된 일부분은, 예를 들어, 아데닌 염기의 3'-히드록실 기 또는 엑소시클릭 NH2 기, 바람직하게는 친수성인 스페이서 및 콘쥬게이션된 일부분 (예를 들어, 아미노, 설프히드릴 또는 히드록실 기) 에 결합할 수 있는 말단 기를 통해 올리고머에 공유 결합될 수 있는 화학 기를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 말단 기는 보호되지 않는다, 예를 들어, NH2 기이다. 다른 구현예에서, 말단 기는, 예를 들어, "Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999) 에 기재된 것과 같은 임의의 적합한 보호기에 의해 보호된다. 적합한 히드록실 보호기의 예는 에스테르, 예컨대 아세테이트 에스테르, 아르알킬 기, 예컨대 벤질, 디페닐메틸, 또는 트리페닐메틸, 및 테트라히드로피란일을 포함한다. 적합한 아미노 보호기의 예는 벤질, 알파-메틸벤질, 디페닐메틸, 트리페닐메틸, 벤질옥시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 및 아실 기, 예컨대 트리클로로아세틸 또는 트리플루오로아세틸을 포함한다. 일부 구현예에서, 작용화된 일부분은 자가-분할된다. 다른 구현예에서, 작용화된 일부분은 생분해성이다. 예를 들어, 본원에 전체가 참조로서 인용된, U.S. Patent No. 7,087,229 를 참조한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 콘쥬게이션된 일부분의 올리고머의 5' 말단에 대한 공유 부착을 허용하게 하기 위해 5' 말단에서 작용화된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 3' 말단에서 작용화될 수 있다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 백본을 따라 또는 헤테로시클릭 염기 일부분 상에서 작용화될 수 있다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 5' 말단, 3' 말단, 백본 및 염기로부터 독립적으로 선택되는 1 개 초과의 위치에서 작용화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 작용화된 일부분에 공유 부착된 하나 이상의 단량체를 합성 동안 도입함으로써 합성된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 작용화되지 않은 단량체를 이용하여 합성되고, 올리고머가 합성의 완료시 작용화된다. 일부 구현예에서, 올리고머는 아미노알킬 링커를 함유하는 방해된 에스테르를 이용하여 작용화되고, 이때 알킬 부분은 식 (CH2)w (식 중, w 는 1 내지 10 의 범위의, 바람직하게는 약 6 의 정수임), 알킬아미노 기의 알킬 부분은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 작용기는 에스테르 기 (-O-C(O)-(CH2)wNH) 를 통해 올리고머에 부착된다.
다른 구현예에서, 올리고머는 (CH2)w-설프히드릴 (SH) 링커를 함유하는 방해된 에스테르를 이용하여 작용화되고 (식 중, w 는 1 내지 10 의 범위의, 바람직하게는 약 6 의 정수임), 알킬아미노 기의 알킬 부분은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 작용기는 에스테르 기 (-O-C(O)-(CH2)wNH) 를 통해 올리고머에 부착된다.
일부 구현예에서, 설프히드릴-활성화된 올리고뉴클레오티드는 폴리에틸렌 글리콜 또는 펩티드 (디설파이드 결합의 형성을 통해) 와 같은 중합체 일부분을 이용하여 콘쥬게이션된다.
상기 기재된 바와 같은 방해된 에스테르를 함유하는 활성화된 올리고머는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 특히 전체가 참조로서 본원에 인용된 PCT 공개 번호 WO 2008/034122 및 그곳의 예에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 미국 특허 번호 4,962,029 및 4,914,210 에 기재된 바와 같은 실질적으로 작용화 시약, 즉, 보호된 또는 비보호된 설프히드릴, 아미노 또는 히드록실 기를 포함하는 반대 말단에 대해 친수성 스페이서 사슬을 통해 연결된 하나의 말단에서 포스포라미디트를 갖는 실질적으로 선형 시약에 의해, 설프히드릴, 아미노 또는 히드록실 기를 올리고머 내로 도입함으로써 작용화된다. 이러한 시약은 올리고머의 히드록실 기와 일차적으로 반응한다. 일부 구현예에서, 이러한 활성화된 올리고머는 올리고머의 5'-히드록실 기에 커플링된 작용화 시약을 갖는다. 다른 구현예에서, 활성화된 올리고머는 3'-히드록실 기에 커플링된 작용화 시약을 갖는다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 올리고머의 백본 상의 히드록실 기에 커플링된 작용화 시약을 갖는다. 또다른 추가의 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 전체가 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 번호 4,962,029 및 4,914,210 에 기재된 바와 같은 작용화 시약 중 하나 초과를 이용하여 작용화된다. 작용화 시약의 합성 방법 및 이들을 단량체 또는 올리고머 내로 도입하는 방법은 미국 특허 번호 4,962,029 및 4,914,210 에 기재된다.
일부 구현예에서, 고체-상 결합된 올리고머의 5'-말단은 디에닐 포스포라미디트 유도체로 작용화된 후, Diels-Alder 시클로첨가 반응을 통해, 예를 들어, 아미노산 또는 펩티드를 이용하는 탈보호된 올리고머의 콘쥬게이션이 후속된다.
다양한 구현예에서, 2'-당 변형, 예컨대 2'-카르바메이트 치환된 당 또는 2'-(O-펜틸-N-프탈이미도)-데옥시리보오스 당을 함유하는 단량체의 올리고머 내로의 도입은 올리고머의 당에 대한 콘쥬게이션된 일부분의 공유 부착을 용이하게 한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 단량체의 2'-위치에 아미노-함유 링커를 갖는 올리고머는 예컨대, 예를 들어, 5'-디메톡시트리틸-2'-O-(e-프탈이미딜아미노펜틸)-2'-데옥시아데노신-3'--N,N-디이소프로필-시아노에톡시 포스포라미디트와 같은 시약을 사용하여 제조딘다. 예를 들어, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171 을 참조한다.
또다른 추가의 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 N6 퓨린 아미노 기 상에, 구아닌의 엑소시클릭 N2 상에, 또는 시토신의 N4 또는 5 위치 상에 것을 포함하는 핵염기 상에 아민-함유 작용화 일부분을 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, 이러한 작용기화는 올리고머 합성 중에 이미 작용기화되는 시판 시약을 사용함으로써 달성될 수 있다.
일부 작용화 일부분은 시판되는데, 예를 들어, 헤테로-2-작용성 및 호모-2-작용성 연결 일부분이 Pierce Co. (Rockford, III.) 로부터 이용가능하다. 기타 시판되는 연결 기는 5'-Amino-Modifier C6 및 3'-Amino-Modifier 시약으로서, 둘다 Glen Research Corporation (Sterling, Va.) 로부터 이용가능하다. 5'-Amino-Modifier C6 은 또한 ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) 로부터 Aminolink-2 로서 이용가능하고, 3'-Amino-Modifier 는 또한 Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.) 로부터 이용가능하다.
합성 및 제조 방법
본 발명은 또한 본 발명의 올리고머의 합성 또는 제조 방법을 제공한다. 올리고머는 고체 지지체, 예컨대 범용 지지체 상에서 전형적으로 수행되는 표준 올리고뉴클레오티드 합성을 사용하여 제조될 수 있다. 도 5 - 10 에 예시된 바와 같이, 본 발명의 올리고머는, 예를 들어, 제 1 영역 및 제 2 영역의 순차적 합성 후, 임의로 링커 (Y) 를 통한 제 3 영역 (X) 의 부가 (예를 들어, 콘쥬게이션) 에 의해 합성될 수 있다. 영역 Y 는 존재하는 경우, 영역 B 에 합류될 수 있고, 영역 X 가 이어서 영역 Y 에 부가되거나, 또는 영역 Y 및 X 가 단일 반응 단계에서 영역 B 에 부가될 수 있다.
대안적으로는, 올리고머 합성은 영역 X, 또는 영역 X 및 Y 의 올리고뉴클레오티드 지지체 컬럼에 대한 초기 커플링 이후, 영역 B 및 그 다음 영역 A 의 순차적인 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 일어날 수 있다.
대안적으로는, 올리고뉴클레오티드 합성 지지체 (초기 또는 전-단계에서) 에 부착된 분할가능 양방향 기의 사용은, 올리고뉴클레오티드 영역 B 및 A 가 2-작용기의 하나의 반응성 기 상에서 합성되고, 영역 X 또는 영역 X 및 Y 가 2-작용기의 두번째 반응성 기 상에서 합성되며, 이때 올리고뉴클레오티드 합성 또는 X (또는 X 및 Y) 의 지지체에 대한 부가가 임의의 순서로 또는 심지어 함께 일어날 수 있는 방법을 가능하게 한다. 지지체로부터의 2-작용기의 분할은 이후 본 발명의 올리고머를 생성한다. 2-작용기는 예를 들어, 하나의 일부분 (예를 들어, 영역 B 또는 X 또는 X-Y-) 은 뉴클레오시드 상의 포스페이트 함유 기 (예를 들어, 5' 또는 3' 기) 에 부착되고, 다른 것 (예를 들어, 영역 B 또는 X 또는 X-Y-) 은 예를 들어 핵염기 상에 존재하는 반응성 기에 부착되는 뉴클레오시드일 수 있다.
대안적으로는 영역 X 또는 X-Y 는 올리고뉴클레오티드 합성 후, 예컨대 분할 단계 후 올리고머 (영역 B) 에 합류될 수 있다. 본 발명은 따라서 또한 영역 A 및 B, 및 이후 영역 X 또는 영역 X 및 Y 를 영역 B 에 합류시키는데 사용되는 영역 B 에 부착된 반응성 또는 활성화 기를 포함하는 중간체 올리고머에 관한 것이다.
영역 Y 또는 영역 X 는 포스포라미디트로서 영역 B 에 연결될 수 있고, 예를 들어 - 단일 올리고뉴클레오티드 합성에서 올리고머의 형성 후, 올리고뉴클레오티드 합성 지지체 (US) 로부터 올리고머의 분할을 가능하게 한다. 이와 관련하여, 일부 구현예에서, 영역 B 및 영역 X 또는 Y 사이의 연결 기는 포스페이트 함유 기, 예컨대 뉴클레오시드 연결, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트 또는 기타, 예컨대 본원에 언급된 것들일 수 있다. 대안적으로는 기타 화학 연결이 트리아졸 기와 같이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제 3 영역 (X) 또는 X-Y- 는 영역 B 에, 5' 또는 3' 포스페이트 이외의 기를 통해, 예를 들어 또다른 위치에서 반응성 기를 통해, 예를 들어 반응성 기, 예컨대 영역 B 내의 뉴클레오시드의 염기 상의 아민을 통해 연결될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 합성은 5 ' - 3' 방향으로 일어날 수 있고, 또는 대부분의 올리고뉴클레오티드 합성에서 전형적인, 3' - 5' 방향으로 일어날 수 있다.
일부 비-제한적인 예에서, 올리고뉴클레오티드-콘쥬게이트 구축물은 상이한 방식으로, 예를 들어 하기와 같이 조립될 수 있다:
A) 구축물의 B - A 부분은 포스포로티오에이트 및 포스포로디에스테르 연결 모두를 합성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 합성 기계 상에서 제조될 수 있다. B - A 는 이후 X-A-B-A 를 제작하기 위한 빌딩 블록 X-A-P (부착된 링커를 가진 콘쥬게이트 일부분) 를 이용하는 또는 X-B-A 를 제작하기 위한 빌딩 블록 X-P (링커가 없는 콘쥬게이트 일부분) 를 이용하는 표준 포스포라미디트 화학에 의해 임의로 신장될 수 있음
Figure pct00031
B) 구축물의 B-A 부분은 포스포르티오에이트 및 포스포르디에스테르 연결 모두를 합성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 합성 기계 상에서 제조될 수 있다. B-A 는 이후 X 및 A 부분 사이에 PO 또는 PS 연결을 갖는 X-A-B-A 를 제작하기 위한 빌딩 블록 DMTrO-A-P 에 이어 빌딩 블록 X-P 를 사용하는 표준 포스포라미디트 화학에 의해 순차적으로 신장될 수 있음.
Figure pct00032
구축물의 B - A 부분은 포스포르티오에이트 및 포스포르디에스테르 연결 모두를 합성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 합성 기계 상에서 제조될 수 있다. B - A 는 이후 H2N-A-B-A 를 제작하기 위한 빌딩 블록 PGN-A-P 를 이용하는 표준 포스포라미디트 화학에 의해 임의로 순차적으로 신장될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 분할 및 탈보호 후 올리고뉴클레오티드의 자유 아민은 일부분 X 를 사용하여 콘쥬게이션될 수 있다 (식 중 X 의 작용기는 올리고뉴클레오티드의 말단 일차 아민과 반응하도록 활성화되었다).
조성물
본 발명의 올리고머는 약학 제형 및 조성물에 사용될 수 있다. 적합하게는, 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 아쥬반트를 포함한다. 참조로서 본원에 인용된 WO2007/031091 은 적합하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 아쥬반트를 제공한다. 적합한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 기타 치료제와의 조합, 전구-약물 제형이 또한 참조로서 본원에 인용된 WO2007/031091 에 제공된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 약학 조성물 또는 제형 제형의 제조를 위해 약학적으로 허용가능한 활성 또는 비활성 성분과 혼련될 수 있다. 조성물 및 약학 조성물의 제형을 위한 방법은, 투여 경로, 질환 범위, 또는 투여하고자 하는 투여량을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 범주에 따라 다르다.
안티센스 화합물은 안티센스 화합물과 적합한 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 조합함으로써 약학 조성물에서 이용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 를 포함한다. PBS 는 비경구로 전달하고자 하는 조성물에서 사용하기에 적합한 희석제이다.
안티센스 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 인간을 포함하는 동물에 투여 시, (직접적으로 또는 간접적으로) 생물학적으로 활성인 대사물질 또는 이의 잔기를 제공할 수 있는, 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 임의의 기타 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 설명은 안티센스 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 전구약물, 이러한 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염, 및 기타 생물학적등가물에 관한 것이다. 적합한 약학적으로 허용가능한 염은 나트륨 및 칼륨 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 전구약물은 활성 안티센스 화합물을 형성하기 위해, 체내에서 내생 뉴클레아제에 의해 분할되는 안티센스 화합물의 하나 또는 양 말단에서의 부가적인 뉴클레오시드의 도입을 포함할 수 있다. 이와 관련하여 전구약물은 본 발명에 따른 영역 B 및 콘쥬게이트, 표적화 또는 차단 일부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 전구약물이다.
본 발명에 따른 친유성 콘쥬게이트의 사용은 예를 들어, 간에 대한 올리고머의 전달에 특히 유용한 (예를 들어, siRNA), 리피도이드 (lipidoid) 또는 리포좀, 예를 들어, 양이온성 리포좀 (예를 들어, 양이온성 리포좀 SNALP (안정한 핵산 지질 입자) 내로의 본 발명의 올리고머의 도입을 가능하게 한다.
적용
본 발명의 올리고머는, 예를 들어, 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 유용할 수 있다.
연구에서, 일부 구현예에서, 이러한 올리고머는 세포 및 실험 동물에서 단백질의 합성 (전형적으로는 mRNA 의 분해 또는 억제에 의해, 따라서 단백질 형성을 방지함)을 특이적으로 억제하는데 사용되고, 이에 의해 표적의 작용적 분석 또는 치료적 개입을 위한 표적으로서 이의 유용성의 평가를 유용하게 할 수 있다.
치료법을 위해, 표적의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 질병을 갖는 것으로 의심되는 동물 또는 인간은 본 발명에 따른 올리고머성 화합물을 투여함으로써 치료된다. 추가로 제공되는 것은 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양의 본 발명의 하나 이상의 올리고머 또는 조성물을 투여함으로써 표적의 발현과 연관된, 질환 또는 상태를 갖는 것으로 의심되는 또는 갖기 쉬운 포유류를 치료하는, 예컨대 인간을 치료하는 방법이다. 본 발명에 따른 올리고머, 콘쥬게이트 또는 약학 조성물은 전형적으로 유효량으로 투여된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 콘쥬게이트의 용도, 또는 본원에 기재된 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명에 따른 화합물, 및/또는 본 발명에 따른 콘쥬게이트, 및/또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 본원에 언급된 질환의 치료 방법을 제공한다.
의학적 징후
일부 구현예에서, 질환은 암이다. 일부 구현예에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구현예에서, 질환은 심혈관 질환, 예컨대 이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 심근 경색 (MI) 이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 섬유증, 예컨대 간-섬유증, 심장 섬유증 또는 국부 섬유증이거나, 이를 야기하거나, 또는 이와 연관된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 혈액 응고 질환이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 골-상실이거나 이를 포함한다 (이를 야기하거나 이와 연관된다).
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 간 질환 또는 질병이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 예를 들어 간 질환 또는 질병, 및/또는 일부 양상에서, 심혈관 질환 또는 질병) 일 수 있는 대사성 질환이다.
심혈관/대사성 질환은 예를 들어, 대사성 증후군, 비만, 고지혈증, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 결합 고지혈증 (FCHL), 후천성 고지혈증, 스타틴-저항성, 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상 심장병 (CHD), 죽상동맥경화증, 심장병, 당뇨병 (I 및/또는 II), NASH, 급성 관상 증후군 (ACS), NASH, 만성 심부전, 심혈관 질환, 심장 대사성 질환, 고지혈증 및 관련 질환, 대사성 증후군, 죽상동맥경화증, 만성 심부전, 혈관 질환, 말초 동맥 질환, 심장병, 국소빈혈, 제 2 형 당뇨병, 제 1 형 당뇨병을 포함한다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 대사성 증후군, 비만, 고지혈증 , 죽상동맥경화증, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 결합 고지혈증 (FCHL), 후천성 고지혈증, 스타틴-저항성, 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상 심장병 (CHD) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 만성 심부전, 심혈관 질환, 심장 대사성 질환, 만성 심부전, 혈관 질환, 말초 동맥 질환, 심장병, 국소빈혈, 급성 관상 증후군 (ACS) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 제 2 형 당뇨병, 제 1 형 당뇨병이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 바이러스 질환, 예컨대 적혈구증가, C 형 간염, B 형 간염, BKV, HIV 이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 중증 및 희귀 질환 (또는 유전적 질환) 이다.
본 발명은 추가로 질환, 질병 또는 상태, 예컨대 본원에 언급된 것들의 치료용 약제의 제조에서의 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
일반적으로 언급되는, 본 발명의 일부 양상은 포유류에 하나 이상의 LNA 단위를 포함하는 표적에 표적되는 치료적 유효량의 올리고머를 투여하는 것을 포함하는, 비정상 수준의 표적과 연관되는 상태를 겪고 있는 또는 겪기 쉬운 포유류의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 올리고머, 콘쥬게이트 또는 약학 조성물은 전형적으로 유효량으로 투여된다.
본 발명의 흥미로운 양상은 본원에 언급된 질환, 질병 또는 상태의 치료용 약제의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 화합물의 용도에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 질환 또는 상태, 예컨대 본원에 언급되는 것들을 겪고 있는 대상의 치료 방법에 관한 것이다.
치료를 필요로 하는 환자는 질환 또는 질병을 겪고 있는 또는 겪을 것 같은 환자이다.
일부 구현예에서, 본원에 사용되는 바와 같은 용어 '치료' 는 존재하는 질환 (예를 들어, 본원에 언급되는 질환 또는 질병) 의 치료, 또는 질환의 방지, 즉, 예방 모두를 말한다. 따라서 본원에 언급되는 치료는 일부 구현예에서, 예방적일 수 있다는 것으로 인지될 것이다.
실시예
올리고뉴클레오티드 목록
하기 목록에서, 대문자는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다. 대문자 L 은 LNA, 예컨대 베타-D-옥시이고, 소문자 d 는 DNA 뉴클레오시드이다. LNA 시토신은 임의로 5'메틸 시토신이다. 영역 A 내의 인터뉴클레오시드는 포스포로티오에이트이고, 영역 B 내는 포스포디에스테르 (제시되는 바와 같음) 이다. 영역 A 및 B 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르이지만, 이때 영역 B 는 >1 DNA 뉴클레오티드이며, 임의로 포스포디에스테르 이외의 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트일 수 있음) 일 수 있다. 임의로, 영역 B 및 영역 C 사이에 추가의 링커 (Y), 예컨대 C6 링커가 있다. # 는 SEQ ID No.를 말한다.
ApoB 표적화 화합물
Figure pct00033
PCSK9 - 마우스 특이적 화합물
Figure pct00034

FVII (마우스 FVII)
Figure pct00035

FAM 라벨 콘쥬게이트를 가진 ApoB 표적화 화합물
Figure pct00036

표적 X 화합물 (인간 치료 표적)
Figure pct00037

상기 화합물에서, 영역 C 는 Seq (영역 A) 에 대한 보체를 포함하여, 영역 C 의 3' 뉴클레오티드는 5' 말단으로부터 영역 A 의 8 번째 뉴클레오티드와 정렬되도록 (염기 쌍을 형성하도록) 한다. 영역 C 는 따라서 다시 루프를 만들고 갭머의 3' 윙 및 DNA 갭 영역의 5 개 염기를 가로질러 영역 A 와 8 개 염기 혼성화를 형성하여, 링커 영역 (B) 이 분할될 때까지 비활성인 "전구-약물" 을 제작한다.
ApoB 표적화 화합물
Figure pct00038

PCSK9 화합물
Figure pct00039

원숭이 연구 화합물 ApoB
Figure pct00040

SEQ ID NO 53 은 SEQ ID NO 54 의 모체 화합물로서 제공된다.
마우스 실험: 다르게 명시되지 않는다면, 마우스 실험은 하기와 같이 수행될 수 있다:
투여량 투여 및 샘플채취:
7-10 주령 C57Bl6-N 마우스를 사용하였고, 동물은 연령 및 성별을 매치시켰다 (연구 1, 2 및 4 에 대해서는 암컷, 연구 3 에서는 수컷). 화합물을 꼬리 정맥 내로 i.v. 주사하였다. 중간체 혈청 샘플채취를 위해서는, 2-3 방울의 혈액을 안면정맥 (vena facialis) 의 천공에 의해 수집하였고, 마지막 출혈을 하대정맥으로부터 채취하였다. 혈청을 젤-함유 혈청-분리 튜브 (Greiner) 에 수집하고, 분석까지 동결 유지시켰다.
C57BL6 마우스에 제시된 정보에 따라 식염수에 제형화된 1mg/kg ASO (또는 제시된 양) 의 단일 투여량 또는 식염수 단독으로 i.v. 투여하였다. 동물을 투여 후 예를 들어, 4 일 또는 7 일 (또는 제시된 시간) 에 희생시키고 간 및 신장을 샘플채취하였다.
RNA 단리 및 mRNA 분석: 조직으로부터의 mRNA 분석을 제조사 프로토콜에 따라, Qantigene mRNA 정량화 키트 ("bDNA-assay", Panomics/Affimetrix) 를 사용하여 수행하였다. 조직 용해물의 경우, 50-80 mg 의 조직을 Proteinase K 를 함유하는 용해-완충액 1 ml 에서 초음파분쇄에 의해 용해시켰다. 용해물을 RNA 추출 없이 bDNA-어세이에 직접 사용하였다. 표적 및 GAPDH 에 대한 프로브세트를 Panomics 로부터 맞춤 디자인하여 수득하였다. 분석을 위해, 표적 유전자에 대해 수득된 발광 단위를 하우스키퍼 (housekeeper) GAPDH 에 대해 표준화시켰다.
ALT, AST 및 콜레스테롤에 대한 혈청 분석을 10μl 의 혈청을 사용하여 "Cobas INTEGRA 400 plus" clinical chemistry platform (Roche Diagnostics) 에서 수행하였다.
Factor VII 혈청 수준의 정량화를 위해, BIOPHEN FVII 효소 활성 키트 (#221304, Hyphen BioMed) 를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다.
올리고뉴클레오티드 정량화를 위해, 형광-라벨링된 PNA 프로브는 조직 용리액에서 관심의 올리고에 혼성화된다. 동일한 용리물이, 단지 정확하게 칭량된 양의 조직을 사용하여, bDNA-어세이에 대해 사용된다. 헤테로-이중체는 AEX-HPLC 및 형광 검출을 사용하여 정량된다.
실시예 1: 화합물 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5 의 합성
올리고뉴클레오티드를 Expedite 8900/MOSS 합성기 (Multiple Oligonucleotide Synthesis System) 또는 등가물 상에 4 μmol 규모에서, 포스포라미디트 접근법을 사용하여 우리딘 범용 지지체 상에서 합성하였다. 합성 종료시에, 올리고뉴클레오티드를 1-2 시간 동안 실온에서 수성 암모니아를 사용하여 고체 지지체로부터 분할하였고, 16 시간 동안 65℃ 에서 추가로 탈보호하였다. 올리고뉴클레오티드를 역상 HPLC (RP-HPLC) 에 의해 정제하고, UPLC 에 의해 특징화하고, 분자 질량을 ESI-MS 에 의해 추가로 확인하였다. 더욱 상세한 것은 하기를 참조한다.
올리고뉴클레오티드의 신장
β-시아노에틸- 포스포라미디트 (DNA-A(Bz), DNA- G(ibu), DNA- C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA- G(dmf), LNA-T 또는 C6-S-S 링커) 의 커플링은 아세토니트릴 중 0.1 M 의 5'-O-DMT-보호된 아미다이트 및 활성화제로서 아세토니트릴 (0.25 M) 중 DCI (4,5-디시아노이미다졸) 의 용액을 사용하여 수행된다. 최종 사이클을 위해, 시판 C6-연결된 콜레스테롤 포스포라미디트를 DCM 중에 0.1M 로 사용하였다. 포스포르티오에이트 연결의 도입을 위한 티올화 (thiolation) 는 잔탄 히드라이드 (아세토니트릴/피리딘 9:1 중 0.01 M) 를 사용하여 수행된다. 포스포르디에스테르 연결은 THF/피리딘/물 7:2:1 중 0.02 M 요오드를 사용하여 도입된다. 시약의 나머지는 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 사용되는 것들이다.
RP-HPLC 에 의한 정제:
미정제 화합물을 Phenomenex Jupiter C18 10μ 150x10 mm 컬럼 상의 분취용 RP-HPLC 에 의해 정제하였다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴을 5 mL/분의 유속으로 완충액으로서 사용하였다. 수집된 분획을 동결건조시켜, 전형적으로 백색 고체로서 정제된 화합물을 산출하였다.
약어:
DCI: 4,5-디시아노이미다졸
DCM: 디클로로메탄
DMF: 디메틸포름아미드
DMT: 4,4'-디메톡시트리틸
THF: 테트라히드로푸란
Bz: 벤조일
Ibu: 이소부티릴
RP-HPLC: 역상 고압 액체 크로마토그래피
실시예 2: LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인
실시예 및 도면에서 사용된 올리고머. SEQ# 는 실시예 및 도면 전반에 걸쳐 사용된 식별자이다.
표 2
Figure pct00041

실시예 3. 생체 내에서 콜레스테롤-콘쥬게이트를 이용한 ApoB mRNA 의 녹 다운.
C57BL6/J 마우스에 단일 투여량 식염수 또는 1 mg/kg 비-콘쥬게이션된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID #1) 또는 상이한 링커를 이용하여 콜레스테롤에 콘쥬게이션된 등몰량의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 주입하고, 표 3 에 따라 1-10 일에 희생시켰다.
RNA 를 간 및 신장으로부터 단리하고, ApoB mRNA 녹다운에 대해 분석하기 위해 ApoB 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하는 qPCR 에 적용하였다.
결론: 포스포디에스테르-백본 (Seq#4 및 5) 을 가진 2 또는 3 개의 DNA 로 구성된 링커를 이용해 ApoB LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이션된 콜레스테롤은 ApoB 의 간 특이적 녹 다운에 대해 바람직함을 나타낸다 (도 11). 이것은 비-콘쥬게이션된 화합물 (Seq #1) 과 비교하여, 뿐만 아니라 안정한 링커 (Seq#2) 및 디설파이드 링커 (Seq.#3) 를 가진 콜레스테롤 콘쥬게이트와 비교하여, 부수적으로 신장 조직에서의 Seq#4 및 #5 의 적은 녹 다운 활성과 함께, 간 조직에서 ApoB mRNA 녹 다운의 효율성 및 기간 증가를 의미한다.
재료 및 방법:
실험 디자인:
표 3
Figure pct00042
Figure pct00043

투여량 투여. 도착시 대략 20 g 인 C57BL/6JBom 암컷 동물에 표 3 에 따라 식염수에 제형화된 화합물 또는 식염수 단독을 10 ml/kg BW (제 0 일 체중에 따라) 로 i.v. 투여하였다.
간 및 신장 조직의 샘플채취. 동물을 70% CO2-30% O2 로 마취시키고, 표 3 에 따라 경부 탈구에 의해 희생시켰다. 큰 간 엽의 하나의 절반 및 하나의 신장을 다지고 RNAlater 에 수몰시켰다.
총 RNA 단리 및 첫번째 가닥 합성. 총 RNA 를 제조사의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 키트 (Qiagen cat. no. 74106) 를 사용하여 RLT-Lysis 완충액의 존재 하에 비드-밀링 (bead-milling) 에 의해 균질화된 최대 30 mg 의 조직으로부터 추출하였다. 첫번째 가닥 합성을 제조사의 지침에 따라 Ambion 으로부터의 Reverse Transcriptase 시약을 사용하여 수행하였다.
각각의 샘플에 대해 0.5 μg 총 RNA 를 RNase 자유 H2O 를 이용하여 (10.8 μl) 로 조절하고 2 μl 랜덤 10량체 (50 μM) 및 4 μl dNTP 믹스 (2.5 mM 각각 dNTP) 와 혼합하고, 70 ℃ 로 3 분 동안 가열한 다음, 이후 샘플을 빙상에서 빠르게 냉각시켰다. 2 μl 10x Buffer RT, 1 μl MMLV Reverse Transcriptase (100 U/μl) 및 0.25 μl RNase 억제제 (10 U/μl) 를 각각의 샘플에 첨가한 후, 42 ℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션, 95℃ 에서 10 분 동안 효소의 열 비활성화 및 이후 샘플을 4 ℃ 로 냉각시켰다. cDNA 샘플을 1: 5 로 희석하고, 제조사의 프로토콜에 따라 Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems Cat #4364103) 및 Taqman 유전자 발현 어세이 (mApoB, Mn01545150_m1 및 mGAPDH #4352339E) 를 사용하여 RT-QPCR 에 적용하고, Applied Biosystems RT-qPCR 기기 (7500/7900 또는 ViiA7) 에서 빠른 모드로 처리하였다.
실시예 4. 생체 내에 콜레스테롤-콘쥬게이트를 가진 ApoB mRNA 의 녹 다운 및 간 및 신장에 대한 LNA 분포.
C57BL6/J 마우스에 단일 투여량 식염수 또는 1 mg/kg 비-콘쥬게이션된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID #1) 또는 상이한 링커를 이용해 콜레스테롤에 콘쥬게이션된 등몰양의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 주입하고, 표 4 에 따라 1-16 일에 희생시켰다. RNA 를 간 및 신장으로부터 단리하고, ApoB mRNA 녹다운에 대해 분석하기 위해 ApoB 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하는 qPCR 에 적용하였다.
LNA 올리고뉴클레오티드 함량을 LNA 기재 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 간 및 신장에서 측정하였다.
결론: 포스포디에스테르-백본 (Seq#4, #5 및 #6) 을 가진 1, 2 또는 3 개의 DNA 로 구성된 링커를 이용해 ApoB LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이션된 콜레스테롤은 ApoB 의 간 특이적 녹 다운에 대해 바람직함을 나타낸다 (도 14). 이것은 비-콘쥬게이션된 화합물 (Seq #1) 과 비교하여, 부수적으로 신장 조직에서의 Seq#4, #5 및 #6 의 적은 녹 다운 활성과 함께, 간 조직에서 ApoB mRNA 녹 다운의 효율성 및 기간 증가를 의미한다. 콜레스테롤 콘쥬게이션된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-콘쥬게이션된 LNA 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 간에서 훨씬 높은 섭취 및 신장에서 훨씬 낮은 섭취를 갖는다 (도 15).
재료 및 방법:
실험 디자인:
표 4
Figure pct00044
Figure pct00045

투여량 투여. 도착시 대략 20 g 인 C57BL/6JBom 암컷 동물에 표 4 에 따라 식염수에 제형화된 화합물 또는 식염수 단독을 10 ml/kg BW (제 0 일 체중에 따라) 로 i.v. 투여하였다.
간 및 신장 조직의 샘플채취. 동물을 70% CO2-30% O2 로 마취시키고, 표 4 에 따라 경부 탈구에 의해 희생시켰다. 큰 간 엽의 하나의 절반 및 하나의 신장을 다지고 RNAlater 에 수몰시켰다.
총 RNA 단리 및 첫번째 가닥 합성. 총 RNA 를 제조사의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 키트 (Qiagen cat. no. 74106) 를 사용하여 RLT-Lysis 완충액의 존재 하에 비드-밀링 (bead-milling) 에 의해 균질화된 최대 30 mg 의 조직으로부터 추출하였다. 첫번째 가닥 합성을 제조사의 지침에 따라 Ambion 으로부터의 Reverse Transcriptase 시약을 사용하여 수행하였다.
각각의 샘플에 대해 0.5 μg 총 RNA 를 RNase 자유 H2O 를 이용하여 (10.8 μl) 로 조절하고 2 μl 랜덤 10량체 (50 μM) 및 4 μl dNTP 믹스 (2.5 mM 각각 dNTP) 와 혼합하고, 70 ℃ 로 3 분 동안 가열한 다음, 이후 샘플을 빙상에서 빠르게 냉각시켰다. 2 μl 10x Buffer RT, 1 μl MMLV Reverse Transcriptase (100 U/μl) 및 0.25 μl RNase 억제제 (10 U/μl) 를 각각의 샘플에 첨가한 후, 42 ℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션, 95℃ 에서 10 분 동안 효소의 열 비활성화 및 이후 샘플을 4 ℃ 로 냉각시켰다. cDNA 샘플을 1: 5 로 희석하고, 제조사의 프로토콜에 따라 Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems Cat #4364103) 및 Taqman 유전자 발현 어세이 (mApoB, Mn01545150_m1 및 mGAPDH #4352339E) 를 사용하여 RT-QPCR 에 적용하고, Applied Biosystems RT-qPCR 기기 (7500/7900 또는 ViiA7) 에서 빠른 모드로 처리하였다.
올리고 함량 샌드위치 ELISA: 간 및 신장 샘플 (100 mg) 을 투여 후 상이한 시간에 튜브에서 수집하였다. 샘플에 완충액, (pH 8.0 100 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.25 mM Tris), 프로테아제 k (1 %, Sigma P4850-5) 및 2 Tungsten Carbide Beads (3 mm) (Qiagen) 를 첨가하고, 8 분 (Retsch MM300, 25 Hz [l/s]) 동안 균질화시키고 균질화물을 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 샘플을 사용 전에 14000 g 에서 15 분 동안 스핀 (spin) 한다.
신장 및 간에서 표준 1-100 μg/g 의 LNA 올리고뉴클레오티드를 상기와 같이 제조하고 처리하였다. 표준 및 샘플을 비오티닐화 및 디곡시게닌 변형된 포획 및 검출 프로브의 35 nM 용액 (5 x SSCT 완충액 [(750 mM NaCl, 및 75 mM 나트륨 시트레이트, 0.05 % (v/v) Tween-20 pH 7.0 함유)] 150 μl 내에 (100 - 5000 ng/L) 로 희석하고, 1 시간 동안 혼합하였다. 스트렙타비딘-코팅된 (Nunc Immobilizer Streptavidin F96 CLEAR module plate Nunc Cat. No. 436014) 플레이트를 3 회 (5 x SSCT 완충액, 300 μL) 세척하였다. 샘플 100 μL 을 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 옮기고, 천천히 진탕시키면서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 흡입하고 300 μl 의 2 x SSCT 완충액 (0.05 % (v/v) Tween-20, pH 7.0 을 함유하는, 300 mM NaCl + 30 mM 나트륨 시트레이트) 으로 3 회 세척하였다. PBST (포스페이트 완충 식염수, pH 7.2) 에 1:4000 으로 희석된 100 마이크로리터의 항-Dig-AP Fab 절편 (Roche Applied Science, Cat. No. 11 093 274 910) 을 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 천천히 교반하면서 인큐베이션하였다. 웰을 흡입하고 300 μl 의 2 x SSCT 완충액으로 3 회 세척하였다. 100 마이크로리터의 기질 용액 (KPL BluePhos Microwell Phosphatase substrate system 50-88-00) 을 각각의 웰에 첨가하였다. 색상 발현의 강도를 진탕 후 615 nm 에서 매 5 분마다 분광광도측정에 의해 측정하였다. 시험 샘플을 표준 샘플에 대해 참조하였다.
실시예 5: 생체 내에서 콜레스테롤 콘쥬게이트를 이용한 PCSK9 mRNA 의 녹 다운.
NMRI 마우스에 단일 투여량 식염수 또는 10 mg/kg 비-콘쥬게이션된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID 7) 또는 상이한 링커를 이용하여 콜레스테롤에 콘쥬게이션된 등몰량의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 주입하고, 표 5 에 따라 1-10 일에 희생시켰다.
RNA 를 간 및 신장으로부터 단리하고, PCSK9 mRNA 녹다운에 대해 분석하기 위해 PCSK9 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하는 qPCR 에 적용하였다.
결론: 포스포디에스테르-백본 (Seq#9 및 10) 을 가진 2 개의 DNA 로 구성된 링커를 이용해 PCSK9 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이션된 콜레스테롤은 비-콘쥬게이션된 화합물 (Seq #7) 과 비교하여, 뿐만 아니라 안정한 링커 (Seq#8) 를 가진 콜레스테롤 콘쥬게이트와 비교하여, PCSK9 의 향상된 간 녹 다운을 나타냈다 (도 16).
재료 및 방법:
실험 디자인:
표 5
Figure pct00046
Figure pct00047

투여량 투여. 도착시 대략 20 g 인 NMRI 암컷 동물에 표 5 에 따라 식염수에 제형화된 화합물 또는 식염수 단독을 10 ml/kg BW (제 0 일 체중에 따라) 로 i.v. 투여하였다.
간 및 신장 조직의 샘플채취. 동물을 70% CO2-30% O2 로 마취시키고, 표 4 에 따라 경부 탈구에 의해 희생시켰다. 큰 간 엽의 하나의 절반 및 하나의 신장을 다지고 RNAlater 에 수몰시켰다.
총 RNA 를 제조사의 지침에 따라 MagNa Pure 96 Cellular RNA Large Volume Kit (Roche cat no. 5467535001) 를 사용하여 MagNA Pure LC RNA Isolation Tissue buffer (Roche cat.no 03 604 721 001) 의 존재 하에 비드-밀링 (bead-milling) 에 의해 균질화된 최대 10 mg 의 조직으로부터 추출하였다. 첫번째 가닥 합성을 제조사의 지침에 따라 Ambion 으로부터의 Reverse Transcriptase 시약을 사용하여 수행하였다.
각각의 샘플에 대해 0.5 μg 총 RNA 를 RNase 자유 H2O 를 이용하여 (10.8 μl) 로 조절하고 2 μl 랜덤 10량체 (50 μM) 및 4 μl dNTP 믹스 (2.5 mM 각각 dNTP) 와 혼합하고, 70 ℃ 로 3 분 동안 가열한 다음, 이후 샘플을 빙상에서 빠르게 냉각시켰다. 2 μl 10x Buffer RT, 1 μl MMLV Reverse Transcriptase (100 U/μl) 및 0.25 μl RNase 억제제 (10 U/μl) 를 각각의 샘플에 첨가한 후, 42 ℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션, 95℃ 에서 10 분 동안 효소의 열 비활성화 및 이후 샘플을 4 ℃ 로 냉각시켰다. cDNA 샘플을 1: 5 로 희석하고, 제조사의 프로토콜에 따라 Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems Cat #4364103) 및 Taqman 유전자 발현 어세이 (mPCSK9, Mn00463738_m1 및 mActin #4352341E) 를 사용하여 RT-QPCR 에 적용하고, Applied Biosystems RT-qPCR 기기 (7500/7900 또는 ViiA7) 에서 빠른 모드로 처리하였다.
실시예 6. 상이한 DNA/PO-링커의 시험관 내 분할
상이한 DNA/PO-링커 (PO 링커) 를 가진 FAM-라벨링된 ASO 를 S1 뉴클레아제 추출물 (도 6A), 간 또는 신장 균질물 또는 혈청에서 시험관 내 분할에 적용하였다
상이한 DNA/PO-링커를 가진 FAM-라벨링된 ASO 100 μM 을 20 및 120 분 동안 뉴클레아제 완충액 (60 U pr. 100 μL) 중의 S1 뉴클레아제에 의한 시험관 내 분할에 적용하였다 (A). EDTA 를 완충액에 첨가함으로써 효소적 활성을 중지시켰다. 이후 용액을 Dionex DNApac p-100 컬럼 및 10mM - 1 M 나트륨 퍼클로레이트 (pH 7.5) 의 범위의 구배를 사용하는 Dionex Ultimate 3000 상에서 AIE HPLC 분석에 적용하였다. 분할된 및 비-분할된 올리고뉴클레오티드의 함량을 615 nm 에서 형광 검출기 및 260 nm 에서 UV 검출기 모두를 사용하여 표준에 대해 결정하였다.
Figure pct00048
결론: PO 링커 (또는 본원에 언급되는 바와 같은 영역 B) 는 콘쥬게이트 (또는 그룹 C) 이 분할제거 (cleaved off) 되는 것을 야기하고, 링커의 길이 및/또는 서열 조성 모두는 영역 B 의 핵분해 분할에 대한 감수성을 조절하는데 사용될 수 있다. DNA/PO-링커의 서열은 뉴클레아제 S1 추출물에서 20 분 후에 제시되는 바와 같이 분할 속도를 조절할 수 있다. 영역 B 에 대한 (예를 들어, DNA/PO-링커에 대한) 서열 선택은 따라서 또한 표적 조직의 세포 내 및 혈청 내 분할 수준을 조정하는데 사용될 수 있다.
간, 신장 및 혈청 (B) 은 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO 16 을 이용하여 200 μg/g 조직의 농도로 급등하였다. NMRI 마우스로부터 수집된 간 및 신장 샘플을 균질화 완충액 (0,5% Igepal CA-630, 25 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, pH 8.0 (1 N NaOH 로 조정됨) 에 균질화하였다. 균질화물을 24 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하고 이후 균질화물을 페놀 - 클로로포름으로 추출하였다. 간 및 신장으로부터 및 혈청으로부터의 추출물 내 분할된 및 비 분할된 올리고뉴클레오티드의 함량을 상기 HPLC 방법을 사용하여 표준에 대해 측정하였다.
Figure pct00049

결론: PO 링커 (또는 본원에 언급된 영역 B) 는 간 또는 신장 균질화물 내에서는 올리고뉴클레오티드로부터 콘쥬게이트 (또는 그룹 C) 의 분할을 산출하지만, 혈청에서는 아니다.
참고: 상기 어세이에서의 분할은 분할가능 링커의 분할을 말하고, 올리고머 또는 영역 A 는 기능적으로 미손상되어 남아있어야만 한다. 상기 어세이에서의 분할에 대한 감수성은 링커가 생분할가능하거나 생리학적으로 불안정한지를 결정하는데 사용될 수 있다.
실시예 7a: FVII 의 생체 내 억제 (1mg/kg)
생체 내 마우스 연구는 총 6 개의 그룹의 마우스 (n=3) 를 사용하여 준비하였다. 각각의 마우스에 단일 i.v. 투여량의, FVII mRNA 에 표적하는 LNA 화합물을, 1mg/kg 또는 SEQ ID #12 와 비교하여 등몰량으로 투여하였다. 식염수 대조군 그룹을 포함시켰다. 마우스를 투여 전 1 일째에 미리 출혈시키고, 투여 후 1 및 2 일에 후속 출혈을 채취하였다. 마우스를 4 일에 희생시키고, 간, 신장 및 혈액 샘플을 채취하였다. 연구 설정에 대해서는 표 7 을 참조한다.
Factor VII 혈청 수준, mRNA 수준, 및 올리고뉴클레오티드 조직 함량을 표준 어세이 기법을 사용하여 측정하였다.
결론: 널리 사용되는 디티오 링커 (디설파이드) 를 비교할 때 (PO 링커 SEQ ID # 15 를 SS 링커 SEQ ID #14 와 비교함) 콜레스테롤 콘쥬게이트를 가진 LNA 올리고뉴클레오티드에 표적하는 FVII mRNA 에 대해, DNA/PO-링커 (PO) 는 혈청 내 FVII 단백질 하향 조절을 개선한다 (도 18). 콘쥬게이트로서 GalNAc 를 사용하면, 아미노연결된 콘쥬게이션된 LNA 올리고뉴클레오티드와 비교하는 경우 (PO 링커 SEQ ID #13 을 아미노 연결된 SEQ ID #12 와 비교함), PO 링커가 FVII 단백질의 하향 조절을 개선하는 것이 명백하다. GalNac 콘쥬게이트는 생분할가능 (가능하게는 펩티드 링커로 인해) 한 것으로 공지되고, 이와 같이 PO 링커가 표적 세포에서 활성이고 강력한 화합물의 방출을 추가로 향상시키는 것으로 보인다. 상기 데이터는 mRNA 발현 데이터에 상응한다 (도 19). 간 및 신장 내의 올리고뉴클레오티드의 조직 함량은 어떻게 콘쥬게이트가 분포를 변화시키는 지를 보여준다 (도 20). 2 개의 콜레스테롤 콘쥬게이션된 화합물이 유사한 분포 (SEQ ID #14 및 #15 를 비교함) 를 제공하고, PO 링커 화합물의 (SEQ ID #15) 향상된 mRNA 및 FVII 단백질 하향 조절을 가지고, SEQ ID #14 와 비교하는 경우 어떻게 PO 링커가 LNA 올리고뉴클레오티드에 표적하는 FVII 의 활성을 향상시키는지를 보여준다.
재료 및 방법:
실험 디자인:
표 7:
Figure pct00050

암컷 마우스에 iv 로 투여하고, 4 일에 희생시 간, 신장 및 혈액을 샘플채취하였다, 부가적인 혈액 채취는 투여 전 및 또한 투여 후 1 및 2 일에 시행하였다.
실시예 7b: FVII 의 생체 내 억제 (0,1 및 0,25mg/kg)
생체 내 마우스 연구를 총 7 개 그룹의 마우스 (n=3) 를 사용하여 준비하였다. 각각의 마우스에 단일 i.v. 투여량의, FVII mRNA 에 표적하는 LNA 화합물을, SEQ ID #12 와 비교하여 등몰량으로 0,1mg/kg 또는 0,25mg/kg 으로 투여하였다. 식염수 대조군 그룹을 포함시켰다. 마우스를 투여 전 1 일째에 미리 출혈시키고, 투여 후 4, 7, 11, 14, 및 18 일에 후속 출혈을 채취하였다. 마우스를 24 일에 희생시키고, 간, 신장 및 혈액 샘플을 채취하였다. 연구 설정에 대해서는 표 8 을 참조한다.
Factor VII 혈청 수준, mRNA 수준, 및 올리고뉴클레오티드 조직 함량을 표준 어세이 기법을 사용하여 측정하였다.
결론: 널리 사용되는 디티오 링커를 비교할 때 (PO 링커 SEQ ID # 15 를 SS 링커 SEQ ID #14 와 비교함) 0,1mg/kg 및 0,25mg/kg 모두에서 콜레스테롤 콘쥬게이트를 가진 LNA 올리고뉴클레오티드에 표적하는 FVII mRNA 에 대해, DNA/PO-링커 (PO) 는 FVII 단백질 하향 조절을 개선한다 (도 21). 콘쥬게이트로서 GalNAc 를 사용하면, mRNA 데이터 (도 22) 는 아미노연결된 콘쥬게이션된 LNA 올리고뉴클레오티드와 비교하는 경우 (PO 링커 SEQ ID #13 을 아미노 연결된 SEQ ID #12 와 비교함), PO 링커가 하향 조절을 개선하는 것을 제시한다. mRNA 발현 데이터 (도 22) 는 디티오 연결된 콘쥬게이트 (SEQ ID #14) 와 비교해 PO 링커 화합물 (SEQ ID #15) 의 개선된 활성을 지지한다. 신장 및 간에서의 올리고뉴클레오티드의 조직 함량은 어떻게 콘쥬게이트가 분포를 변화시키는 지를 보여준다 (도 23). 데이터는 PO 링커가 콜레스테롤 콘쥬게이트 및 GalNAc 콘쥬게이트 (SEQ ID #14 및 #15 를 비교하고 SEQ ID #13 대 #12 를 비교함) 모두에 대해 상기 투여 범위에서 간 및 신장 모두에서 섭취를 향상시킨다는 것을 암시한다.
재료 및 방법:
실험 디자인:
표 8:
Figure pct00051

수컷 마우스에 iv 로 투여하고, 24 일에 희생시 간, 신장 및 혈액을 샘플채취하였다, 부가적인 혈액 채취는 투여 전 및 또한 투여 후 4, 7, 11, 14, 및 18 일에 시행하였다.
실시예 8. 상이한 콘쥬게이트 및 PO-링커를 이용한 ApoB mRNA 의 생체 내 침묵화.
부가적인 콘쥬게이트에 대한 생분할가능 DNA/PO-링커의 영향을 탐구하기 위해 C57BL6I 마우스에 식염수 대조군과 함께 또는 모체 화합물 #1 에 대해 1 mg/kg kg 의 단일 투여량과 함께 또는 생분할가능 링커 없이, 디티오-링커 (SS) 와 함께 또는 DNA/PO-링커 (PO) 함께, Mono-GalNAc, 엽산, Fam 또는 토코페롤에 콘쥬게이션된 등몰의 ASO 를 i.v. 처리하였다. 7 일 후 동물을 희생시키고, RNA 를 간 및 신장 샘플로부터 단리하고, ApoB mRNA 발현에 대해 분석하였다 (도 24)
결론:
모든 4 개의 콘쥬게이트에 대해 DNA/PO-링커는 널리 사용되는 디티오-링커와 비교하여 (#27 과 #26, #30 과 #29, #33 과 #32 및 #36 과 #35 를 비교함) 간에서 ApoB 녹 다운을 개선한다. mono-GalNAc 및 토코페롤 (Tocopherol) 의 경우 DNA/PO-링커는 심지어 비-콘쥬게이션된 화합물과 비교할 때에도 (#30 및 #36 을 #1 과 비교함) 간에서 ApoB 의 녹 다운을 개선한다. DNA/PO-링커와 조합된 토코페롤은 신장에서 간으로 (A 와 B, #36 과 #1 을 비교함) 화합물의 재지시의 역량을 보여준다.
재료 및 방법:
실험 디자인:
표 9
Figure pct00052

Figure pct00053

투여량 투여 및 샘플채취. C57BL6 마우스에 상기 표에 따라 식염수에 제형화된 1mg/kg ASO 의 단일 투여량 또는 식염수 단독으로 i.v. 투여하였다. 동물을 투여 후 7 일에 희생시키고 간 및 신장을 샘플채취하였다.
RNA 단리 및 mRNA 분석. 총 RNA 를 간 및 신장 샘플로부터 추출하고, ApoB mRNA 수준을 분지화된 DNA 어세이를 사용하여 분석하였다.
실시예 9. PO-링커를 가진 루프형 (looped) LNA ASO 을 이용한 Target X mRNA 의 시험관 내 침묵화
차단기는 ASO 의 용인능, 특이성 또는 감소된 오프-표적 효과와 관련하여 유리할 수도 있으나, 본래의, 미차단된 ASO 의 활성을 보존하는 측면에서는 곤란한 점이 있다. 차단기에 대한 예로서, 헤어핀 루프를 발생시키는 비-상보적 뉴클레오티드 신장부에 의해 올리고뉴클레오티드에 연결된 상보적 서열을 사용하였다. 포스포디에스테르-백본 (PO-링커) 을 가진 3 개의 DNA 뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-백본을 가진 동일한 DNA 뉴클레오티드가 있는 루프 내의 쌍을 이루지 않은 염기. 루프형 LNA-ASO 의 활성을 시험하기 위해 Neuro 2a 세포를 짐노시스 어세이에서 1μM ASO 로 처리하였고, RNA 를 추출하고, RT-QPCR 에 적용하여 표적 X mRNA 녹 다운에 대해 분석하였다 (도 25).
결론: PO-링커 (Seq ID #21 및 #23) 를 가진 루프형 ASO 는 PO-링커 (Seq ID #22 및 #24) 가 없는 동일한 ASO 서열에 비해 개선된 표적 X mRNA 녹 다운을 나타냈다.
재료 및 방법:
N2a 세포에서의 짐노시스 (Gymnosis) 어세이:
Neuro 2a (마우스 신경아세포종) 세포를 24-웰 플레이트에 1.8x104 세포/웰로 시딩하고, DMEM+Glutamax (gibco-life, #61965-026), 2mM 글루타민, 10% FBS, 1mM 나트륨 피루베이트, 25μg/ml 젠타마이신) 중에, 각각 PO-링커와 함께 및 없이 1μM 루프형 LNA ASO 로 처리하였다.
총 RNA 단리 및 첫번째 가닥 합성. 총 RNA 를 제조사의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 키트 (Qiagen cat. no. 74106) 를 사용하여 6 일 짐노시스 (gymnosis) 후 추출하였다. 첫번째 가닥 합성을 제조사의 지침에 따라 Ambion 으로부터의 Reverse Transcriptase 시약을 사용하여 수행하였다.
각각의 샘플에 대해 0.5 μg 총 RNA 를 2 μl 랜덤 10량체 (50 μM) 및 4 μl dNTP 믹스 (2.5 mM 각각 dNTP) 와 혼합하고, 70 ℃ 로 3 분 동안 가열한 다음, 이후 샘플을 빙상에서 빠르게 냉각시켰다. 2 μl 10x Buffer RT, 1 μl MMLV Reverse Transcriptase (100 U/μl) 및 0.25 μl RNase 억제제 (10 U/μl) 를 각각의 샘플에 첨가한 후, 42 ℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션, 95℃ 에서 10 분 동안 효소의 열 비활성화 및 이후 샘플을 4 ℃ 로 냉각시켰다. cDNA 샘플을 1: 5 로 희석하고, 제조사의 프로토콜에 따라 표적 X 에 대항하여 Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems Cat #4364103) 및 Taqman 유전자 발현 어세이 (mApoB, Mn01545150_m1 및 mGAPDH #4352339E) 를 사용하여 RT-QPCR 에 적용하고, Applied Biosystems RT-qPCR 기기 (ViiA7) 에서 빠른 모드로 처리하였다. 표적 X mRNA 발현을 베타 액틴 mRNA 발현 (mBACT # 4352341E) 에 대해 표준화하고 거짓 (mock) mRNA 수준과 비교하였다.
실시예 10: 비-인간 영장류 연구
본 연구를 위한 일차적 목적은 시아노몰구스 (cynomolgus) 원숭이에 대한 항-PCSK9 및 항-ApoB LNA 콘쥬게이션된 화합물의 느린 일시 주입 후 7 주에 걸쳐 선택된 지질 마커를 조사하고 원숭이에서의 화합물의 잠재적 독성을 평가하기 위한 것이다. 본 연구에 사용된 화합물은 SEQ ID NOs 46 및 49, 5 및 54 으로, 이들은 멸균 식염수 (0.9%) 에서 0.625 및 2.5 mg/ml 의 초기 농도로 제조되었다.
적어도 24 개월 령의 수컷 (PCSK9) 또는 암컷 원숭이 (ApoB) 원숭이를 사용하고, 수돗물에 자유롭게 접근하게 하고, 180g 의 MWM(E) SQC SHORT 확장 규정식 (Dietex France, SDS, Saint Gratien, France) 을 동물마다 매일 분배할 것이다. 각 우리에 분배된 식품의 총 양은 그 날 우리에 동물의 수에 따라 계산될 것이다. 또한, 과일 또는 채소를 각각의 동물에게 매일 제공할 것이다. 동물을 처리 기간 시작 전에 적어도 14 일의 기간 동안 연구 조건에 대해 적응시킬 것이다. 상기 기간 동안, 전-처리 연구가 수행될 것이다. 동물에게 예를 들어, 0.25 mg/kg 또는 1 mg/kg 의 투여량으로 i.v. 투여한다. 투여 부피는 0.4 mL/kg 일 것이다. 그룹 당 2 마리의 동물을 사용한다. 상기 주 후, 데이터를 분석할 것이고 높은 또는 낮은 투여 섭생을 사용하는 동물의 두번째 그룹을 개시할 수 있다 - 예비 투여 설정은 0.5 mg/kg 및 1 mg/kg, 또는 첫번째 데이터 세트에 기반한 것보다 더 적다.
투여 제형은 1 일에 한번 투여될 것이다. 처리 후 7 주의 기간 동안 동물을 관찰할 것이며, 51 일에 연구로부터 방출시킬 것이다. 1 일은 처리 기간의 첫번째 날짜에 상응한다 임상적 관찰 및 체중 및 식품 섭취 (그룹 당) 를 연구 전 및 연구 동안 기록할 것이다.
하기 시점에 혈액을 샘플채취하고, 분석한다:
Figure pct00054

혈액 생화학
하기 파라미터를 하기 표시된 사건에 모든 살아남은 동물에 대해 결정할 것이다:
- 전 생화학 패널 (하기 완전한 목록) - -8, 15 및 50 일자에,
- 간 안정성 (오로지 ASAT, ALP, ALAT, TBIL 및 GGT) - 4, 8, 22 및 36 일자에,
- 지질 프로파일 (총 콜레스테롤, HDL-C, LDL-C 및 트리글리세라이드) 및 Apo-B 오직 - -1, 4, 8, 22, 29, 36, 및 43 일자에.
혈액 (대략 1.0 mL) 을 리튬 헤파린 튜브 내에 넣는다 (ADVIA 1650 혈액 생화학 분석기를 사용함): Apo-B, 나트륨, 칼륨, 클로라이드, 칼슘, 무기 인, 글루코오스, HDL-C, LDL-C, 우레아, 크레아티닌, 총 빌리루빈 (TBIL), 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 알칼리 포스파타아제 (ALP), 알라닌 아미노트랜스페라아제 (ALAT), 아스파르테이트 아미노트랜스페라아제 (ASAT), 크레아틴 키나아제, 감마-글루타밀 트랜스페라아제 (GGT), 락테이트 탈수소효소, 총 단백질, 알부민, 알부민/글로불린 비.
혈액 분석: PCSK9 분석을 위한 혈액 샘플을 그룹 16 동물로부터 오직 -8, -1, 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43 및 50 일자에 수집할 것이다.
정맬 혈액 (대략 2 mL) 을 Serum Separating Tube (SST) 내로 각각의 동물에 적합한 정맥으로부터 수집할 것이고 실온에서 적어도 60 ± 30 분 동안 혈액이 응고되게 한다. 혈액을 1000 g 에서 10 분 동안 냉장 조건 (+4℃ 로 유지하도록 설정함) 하에서 원심분리할 것이다. 혈청을 3 개의 개별적인 튜브 내로 이동시킬 것이고, ELISA 방법을 사용하여 CitoxLAB France 에 분석할 때까지 80℃ 에서 저장할 것이다 (Circulex Human PCSK9 ELISA 키트, CY-8079, 사이노몰구스 원숭이로부터의 샘플에 대해 입증됨).
기타 분석: WO2011009697 & WO2010142805 는 하기 분석을 위한 방법을 제공한다: qPCR, PCSK9 / ApoB mRNA 분석, 기타 분석에는 PCSK9 / ApoB 단백질 ELISA, ELISA 로의 혈청 Lp(a) 분석 (Mercodia No. 10-1106-01), 조직 및 혈장 올리고뉴클레오티드 분석 (약물 함량), 샘플, 표준 - 및 QC-샘플의 추출, ELISA 에 의한 올리고뉴클레오티드 함량 측정이 포함된다.
실시예 11: 래트에서의 간 및 신장 독성 평가.
본 발명의 화합물을 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트에서 이들의 독성 프로파일에 대해 평가할 수 있다. 예를 들어, 하기 프로토콜을 사용할 수 있다: Wistar Han Crl:WI(Han) 를 대략 8 주령의 연령에서 사용한다. 이 연령에서, 수컷은 대략 250 g 의 체중이어야만 한다. 모든 동물은 SSNIFF R/M-H 펠렛형 유지 규정식 (SSNIFF Spezialdiaten GmbH, Soest, Germany) 및 병에 담긴 수돗물 (0.22 μm 필터로 필터됨) 에 자유롭게 접근한다. 10 및 40mg/kg/투여량의 투여량 수준을 사용하고 (피하 투여) 1 및 8 일자에 투여한다. 동물을 15 일에 안락사시킨다. 소변 및 혈액 샘플을 7 및 14 일에 수집한다. 임상 병리학 측정을 14 일에 수행한다. 체중을 연구 전, 투여 첫째 날, 및 부검 1 주일 전에 측정한다. 그룹 당 식품 소비를 매일 측정할 것이다. 혈액 샘플을 금식 6 시간 후 꼬리 정맥을 통해 채취한다. 하기 혈청 분석을 수행한다: 백혈구 계수 평균 세포 부피 팩킹된 세포 부피 헤모글로빈 평균 세포 헤모글로빈 농도 평균 세포 헤모글로빈 혈소판 계수 백혈구 계수 세포 형태학을 가진 상이한 백혈구 계수 망상적혈구 계수, 나트륨 칼륨 클로라이드 칼슘 무기 인 글루코오스 우레아 크레아티닌 총 빌리루빈 총 콜레스테롤 트리글리세라이드 알칼리 포스파타아제 알라닌 아미노트랜스페라아제 아스파르테이트 아미노트랜스페라아제 총 단백질 알부민 알부민/글로불린 비. 소변분석을 수해한다: α-GST, β-2 Microglobulin, Calbindin, Clusterin, Cystatin C, KIM-1,Osteopontin, TIMP-1, VEGF, 및 NGAL. 7 가지 분석물 (Calbindin, Clusterin, GST-α, KIM-1, Osteopontin, TIMP-1, VEGF) 을 Panel 1 (MILLIPLEX® MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 1, RKTX1MAG-37K) 하에 정량할 것이다. 3 가지 분석물 (β-2 Microglobulin, Cystatin C, Lipocalin-2/NGAL) 을 Panel 2 (MILLIPLEX® MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 2, RKTX2MAG-37K) 하에 정량할 것이다. 래트 소변에서 상기 바이오마커의 농도의 측정을 위한 어세이는 Luminex xMAP® 기술에 근거한다. 항-α-GST / β-2 마이크로글로불린 / 칼빈딘 / 클루스테린 / 시스타신 C / KIM-1 / 오스테오폰틴 / TIMP-1 / VEGF / NGAL 항체로 코팅된 마이크로스피어를 2 가지 상이한 형광 염료로 색상-코드화한다. 하기 파라미터를 측정한다 (ADVIA 1650 를 사용하는 소변): 소변 단백질, 소변 크레아티닌. 정량적 파라미터: 부피, pH (10-Multistix SG 테스트 스트립/Clinitek 500 소변 분석기를 사용함), 비중 (굴절계를 사용함). 반-정량적 파라미터 (10-Multistix SG 테스트 스트립/Clinitek 500 소변 분석기를 사용함): 단백질, 글루코오스, 케톤, 빌리루빈, 니트라이트, 혈액, 유로빌리노겐, 침전물의 세포학 (현미경 시험에 의해). 정성적 파라미터: 외양, 색상. 희생 후, 체중 및 신장, 간 및 비장 중량을 측정하고 기관 대 체중 비를 계산한다. 신장 및 간 샘플을 취할 것이고 동결시키거나 포르말린에 저장할 것이다. 현미경 분석을 실시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Santaris Pharma A/S <120> OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATES <130> 1138WO <150> EP12192773.5 <151> 2012-11-15 <150> EP13153296.2 <151> 2013-01-30 <150> EP13157237.2 <151> 2013-02-28 <150> EP13174092.0 <151> 2013-06-27 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 1 gcattggtat tca 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 2 gcattggtat tca 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> disulphide linked 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 3 gcattggtat tca 13 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 4 tcagcattgg tattca 16 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 5 cagcattggt attca 15 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (2)..(14) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 6 agcattggta ttca 14 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 7 gtctgtggaa gcg 13 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 8 gtctgtggaa gcg 13 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 9 cagtctgtgg aagcg 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 10 ctgtctgtgg aagcg 15 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 11 nnnnnnnnnn nnn 13 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 GalNac cluster conjugate (Conj1a) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 12 nnnnnnnnnn nnn 13 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 GalNac cluster conjugate (Conj1a) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 13 cannnnnnnn nnnnn 15 <210> 14 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> disulphide linked 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 14 nnnnnnnnnn nnn 13 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 15 cannnnnnnn nnnnn 15 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 FAM conjugate <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 16 tcagcattgg tattca 16 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 FAM conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 17 cagcattggt attca 15 <210> 18 <211> 14 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 FAM conjugate <220> <221> misc_feature <222> (2)..(14) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 18 agcattggta ttca 14 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 FAM conjugate <220> <221> misc_feature <222> (4)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 19 gacgcattgg tattca 16 <210> 20 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 FAM conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 20 gcattggtat tca 13 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide + PO linker blocker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (16)..(19) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (19)..(27) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <400> 21 nnnnnnnnnn gcnnnnnnnn nnnnnnn 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 22 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnn 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide + PO linker blocker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (16)..(19) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (19)..(27) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <400> 23 nnnnnnnnnn gcnnnnnnnn nnnnnnn 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 24 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnn 27 <210> 25 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 folic acid conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 25 gcattggtat tca 13 <210> 26 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 disulphide linked folic acid conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 26 gcattggtat tca 13 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 folic acid conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 27 cagcattggt attca 15 <210> 28 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 mono galnac conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 28 gcattggtat tca 13 <210> 29 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 disulphide linked mono galnac conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 29 gcattggtat tca 13 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 mono galnac conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 30 cagcattggt attca 15 <210> 31 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 FAM conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 31 gcattggtat tca 13 <210> 32 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 disulphide linked FAM conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 32 gcattggtat tca 13 <210> 33 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 FAM conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 33 cagcattggt attca 15 <210> 34 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 tocopherol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 34 gcattggtat tca 13 <210> 35 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 disulphide linked tocopherol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 35 gcattggtat tca 13 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 tocopherol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 36 cagcattggt attca 15 <210> 37 <211> 14 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 37 tgctacaaaa ccca 14 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 38 aatgctacaa aaccca 16 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 39 aatgctacaa aaccca 16 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 40 gctgtgtgag cttgg 15 <210> 41 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 41 tgctgtgtga gcttgg 16 <210> 42 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 42 tgctgtgtga gcttgg 16 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 43 tcctggtctg tgttcc 16 <210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 44 tcctggtctg tgttcc 16 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(18) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 45 cacatgctac aaaaccca 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(18) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 46 caaatgctac aaaaccca 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(18) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 47 caaatgctac aaaaccca 18 <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(17) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 48 cagctgtgtg agcttgg 17 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(18) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 49 catgctgtgt gagcttgg 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(18) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 50 catgctgtgt gagcttgg 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(18) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 51 catcctggtc tgtgttcc 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(18) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 52 catcctggtc tgtgttcc 18 <210> 53 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> LNA nucleosides <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 53 gttgacactg tc 12 <210> 54 <211> 14 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA antisense gapmer oligonucleotide conjugate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> phosphodiester lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 cholesterol conjugate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(14) <223> phosphorothioate lnternucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> LNA nucleosides <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> LNA nucleosides, LNA C are 5-methyl C <400> 54 cagttgacac tgtc 14

Claims (28)

  1. 하기 3 개의 영역을 포함하는, 길이 8 - 35 개의 뉴클레오티드의 올리고머성 화합물:
    i) 7 - 26 개의 근접 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 영역 (영역 A);
    ii) 1 - 10 개의 뉴클레오티드를 포함하는 제 2 영역 (영역 B), 이것은 예컨대 인터뉴클레오시드 연결 (internucleoside linkage) 기, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 통해, 제 1 영역의 5' 또는 3' 뉴클레오티드에 공유 연결됨, 이때
    a. 제 1 및 제 2 영역 사이의 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르 연결이고, 제 1 영역에 인접한 제 2 영역의 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA 임; 및/또는
    b. 제 2 영역의 적어도 1 개의 뉴클레오시드는 포스포디에스테르 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드임;
    iii) 콘쥬게이트 일부분, 표적화 일부분, 반응성 기, 또는 차단 일부분을 포함하는 제 3 영역 (C), 상기 제 3 영역은 제 2 영역에 공유 연결됨.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 1 영역의 인터뉴클레오시드 연결이 포스포디에스테르 이외의 하나 이상의 인터뉴클레오시드 연결을 포함하는, 영역 A 내의 인터뉴클레오시드 연결의 예컨대 하나 이상, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 75%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 100% 가 포스포디에스테르 이외의 것인 올리고머.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 포스포디에스테르 이외의 인터뉴클레오시드 연결이 황 함유 인터뉴클레오시드 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및 보라노포스페이트, 예컨대 포스포로티오에이트인 올리고머.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 영역이 핵산 표적에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고머인 올리고머.
  5. 제 4 항에 있어서, 핵산 표적이 microRNA, mRNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 올리고머.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 영역이 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 올리고머.
  7. 제 6 항에 있어서, 올리고머, 예컨대 제 1 영역이 갭머, 믹스머 또는 토탈머를 포함하는 올리고머.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 올리고머, 예컨대 제 1 영역이 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오티드 유사체 (LNA) 를 포함하는 올리고머.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 영역 및 제 2 영역이 근접 뉴클레오티드 서열을 형성하는 올리고머.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 영역이 제 1 영역에 대해 5' 인 올리고머.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 영역이 제 1 영역에 대해 3' 인 올리고머.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 영역이 포스포디에스테르 연결에 의해 연결될 수 있는 DNA 및 RNA 단위의 군으로부터 선택되는, 2 개 이상의, 예컨대 3 개 이상의 연속 뉴클레오시드 단위를 포함하는 올리고머.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 영역이 제 2 영역의 말단 뉴클레오시드 (즉, 제 1 영역의 위치에 따라 3' 또는 5' 말단) 에서 제 3 영역에 공유 연결되는 올리고머.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 영역이 비-뉴클레오티드 일부분, 예컨대 콘쥬게이트 기, 예컨대 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤, 또는 탄수화물, 예컨대 GalNac/GalNac 클러스터를 포함하는 올리고머.
  15. 제 14 항에 있어서, 제 3 영역이, 친유성 기 (예를 들어, 지질, 지방산, 스테롤), 단백질, 펩티드, 항체 또는 이의 절편, 중합체, 리포터 기, 염료, 수용체 리간드, 소형 분자 약물, 전구약물, 및 비타민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일부분을 포함하는 올리고머.
  16. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 영역이 핵산 또는 이의 중합체, 예컨대 앱타머, 또는 차단 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고머.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 영역이 표적화 기를 포함하는 올리고머.
  18. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 영역이 활성화된 기를 포함하는 올리고머.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 및 제 3 영역이 링커 기에 의해 공유 합류되는 올리고머.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 및 제 3 영역 사이의 링커 기가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트 또는 보라노포스페이트 기, 예컨대 포스포디에스테르 기로부터 선택되는 기를 포함하는 올리고머.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 올리고머성 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 아쥬반트를 포함하는 약학 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 핵산 표적의 억제에 사용하기 위한 올리고머성 화합물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 약품에서 사용하기 위한 올리고머성 화합물.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 질환 또는 질병의 치료에서 사용하기 위한 올리고머성 화합물.
  25. 질환 또는 질병, 예컨대 대사성 질환 또는 질병의 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 올리고머성 화합물의 용도.
  26. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역, 및 임의로 링커 영역 (Y) 를 포함하는 올리고머성 화합물의 합성 방법:
    a) 하기 기 중 하나가 부착되는 [고상] 올리고뉴클레오티드 합성 지지체 [제 3 영역] 를 제공하는 단계:
    i) 링커 기 (-Y-)
    ii) 콘쥬게이트, 표적화 기, 차단기, 반응성 기 [예를 들어, 아민 또는 알코올] 또는 활성화 기(X-) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기,
    iii) -Y - X 기
    및
    b) 영역 A 에 후속하는 영역 B 의 [순차적] 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계,
    및/또는:
    c) 제 1 영역 (A) 및 제 2 영역 (B) 의 [순차적] 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계, 상기 합성 단계에 후속하는,
    d) 제 3 영역 [포스포라미디트 포함] 을 첨가하는 단계:
    i) 링커 기 (-Y-)
    ii) 콘쥬게이트, 표적화 기, 차단기, 반응성 기 [예를 들어, 아민 또는 알코올] 또는 활성화 기(X-) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기
    iii) -Y - X 기
    이후,
    e) [고상] 지지체로부터 올리고머성 화합물을 분할하는 단계
    이때, 임의로 상기 방법은 하기 단계로부터 선택되는 추가의 단계를 추가로 포함함:
    f) 제 3 기가 활성화 기일 때, 활성화 기를 활성화시켜 반응성 기를 생성하고, 이후 콘쥬게이트, 차단, 또는 표적화 기를, 임의로 링커 기 (Y) 를 통해 반응성 기에 첨가하는 단계;
    g) 제 3 영역이 반응성 기일 때, 콘쥬게이트, 차단, 또는 표적화 기를, 임의로 링커 기 (Y) 를 통해 반응성 기에 첨가하는 단계
    h) 제 3 영역이 링커 기 (Y) 일 때, 콘쥬게이트, 차단, 또는 표적화 기를 링커 기 (Y) 에 첨가하는 단계
    상기 단계 f), g) 또는 h) 는 올리고뉴클레오티드 합성 지지체로부터 올리고머성 화합물을 분할하기 전에 또는 후속하여 수행됨.
  27. 본 발명의 올리고머성 화합물을 포함하는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서의 질환 또는 질병의 치료 방법.
  28. 표적 유전자를 발현하고 있는 세포에게, 적합하게는 상기 세포에서 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 효과적인 양으로 본 발명에 따른 올리고머성 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법.
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