TW201446791A - 用於調節mir-122之微小rna化合物及方法 - Google Patents

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TW201446791A
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Balkrishen Bhat
Daniel Hogan
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Regulus Therapeutics Inc
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    • C12N2320/31—Combination therapy

Abstract

在此描述了用於抑制miR-122活性之組合物和方法。該等組合物具有產生miR-122活性有效抑制劑的某些核苷修飾。該等化合物可以包含共軛物以促進向肝臟遞送。可以向被丙型肝炎病毒感染的受試者給藥該等組合物作為用於丙型肝炎病毒和相關病狀之治療。

Description

用於調節MIR-122之微小RNA化合物及方法
在此提供了用於調節miR-122的活性之化合物和方法。此類方法包括治療與miR-122活性相關之疾病，如HCV感染。
微小RNA(MicroRNA或microRNA)又稱為“成熟微小RNA”，係為在植物和動物的基因組中編碼之小型(長度為大約18至24個核苷酸)非編碼RNA分子。在某些情況下，高度保守的、內源性表現之微小RNA藉由結合特定mRNA的3'-非翻譯區(3'-UTR)來調節基因之表現。已在植物和動物中鑒定出了多於1000種不同的微小RNA。某些成熟微小RNA似乎起源於長的內源性初級微小RNA轉錄物(又稱為初級微小RNA、pri-mir、pri-miR或初級先質微小RNA)，該等長的內源性初級微小RNA轉錄物通常長度為數百個核苷酸(李(Lee)等人，歐洲分子生物學雜誌(EMBO J.),2002,21(17),4663-4670)。
miR-122係一種在肝臟中豐富並且特異性表現之微小RNA，它係丙型肝炎病毒積聚的關鍵宿主因數(喬普林(Jopling)等人，科學雜誌(Science.)2005,309(5740),1577-81)。miR-122藉由結合HCV基因組的5’非編碼區 中的兩個緊密間隔的種子序列位點與HCV相互作用，從而引起HCV基因組的穩定化，支持複製和轉錄(詹格拉(Jangra)等人，病毒學雜誌(J Virol.),2010,84：6615-6625；Machlin等人，2011)。重要的是，miR-122結合位點在所有基因型和亞型之HCV基因組中是完全保守的(威爾遜(Wilson)等人，病毒學雜誌，2011,85：2342-2350)。用抗miR抑制miR-122引起小鼠和食蟹猴體內的總循環膽固醇水平降低以及參與膽固醇體內平衡、脂肪酸和脂質代謝的基因的表現變化(以撒(Esau)等人，2006，細胞代謝(Cell Metabolism),3：87-98)。在慢性HCV感染的黑猩猩中，每週靜脈內給藥抗miR來長久和可逆性地壓制HCV RNA水平並且降低總血清膽固醇(蘭德福(Lanford)等人，2010，科學雜誌，327：198-201)。在慢性治療原生HCV感染之患者中，抗miR-122治療導致血清HCV RNA降低，因此證明了臨床概念驗證(proof-of-concept)。
丙型肝炎(HCV)係黃病毒科中的一嗜肝性RNA病毒，並且除了引起HCV感染以外，還是慢性肝病和肝細胞癌的主要病因。目前的標準護理治療(聚乙二醇化干擾素與病毒唑組合)對於許多患者耐受不良，並且在一些患者中可以具有低達50%之反應率。當前已有若干種直接作用型抗病毒NS3蛋白酶抑制劑被批准用於HCV感染患者，然而在HCV中出現抗性突變需要使用另外的藥劑進行治療。正在開發的療法包括NS3/4A蛋白酶抑制劑、NS5A蛋白抑制劑、核苷/核苷酸NS5B聚合酶抑制劑以及非核苷NS5B抑制劑。然而，仍需要另外的療法來治療感染個體，該等感染個體對目前的治療沒有反 應、在成功治療之後復發或對一種或多種目前使用的藥物具有低耐受性。對抗病毒療法的抗性係與HCV的高突變率相關之主要問題，並且甚至在用藉由多種機制起作用的藥物的組合時也可見到。因此，靶向保守的、突變抗性病毒宿主因數(如miR-122)之療法代表了實現更高和更持久的治癒速率之機會。
在此提供了包含經修飾之寡核苷酸之化合物，該經修飾之寡核苷酸由16至22個連接之核苷組成，其中該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與miR-122(SEQ ID NO：1)互補並且其中該經修飾之寡核苷酸包含以5’至3’方向具有以下核苷型態I之至少16個連續核苷：(R)X-NQ-NQ-NB-NB-NQ-NB-NQ-NB-NQ-NB-NB-(NZ)Y
其中每個R獨立地是非雙環核苷或雙環核苷；X係4至10；每個NB獨立地是雙環核苷；每個NQ獨立地是非雙環核苷；Y係0或1；並且NZ係經修飾核苷或未經修飾核苷。
在某些實施方式中，在此提供的化合物包含經修飾之寡核苷酸，該經修飾之寡核苷酸包含具有核苷型態I之至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個或22個連續核苷。
在某些實施方式中，每個雙環核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷和ENA核苷。在某些實施方式中，至少兩個雙環核苷彼此不同。在某些實施方式中，所有雙環核苷具有與另一個雙環核苷相同的糖部分。在某些實施方式中，每個雙環核苷係cEt核苷。在某些實施方式中，cEt核苷係S-cEt核苷。在某些實施方式中，cEt核苷係R-cEt核苷。在某些實施方式中，每個雙環核苷係LNA核苷。
在某些實施方式中，至少兩個非雙環核苷包含彼此不同的糖部分。在某些實施方式中，每個非雙環核苷具有相同類型的糖部分。在某些實施方式中，每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷係2’-MOE核苷。在某些實施方式中，不多於兩個非雙環核苷是2’-MOE核苷，其中每個其他非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。在某些實施方式中，最5’端和最3’端的非雙環核苷係2’-MOE核苷，並且每個其他非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。在某些實施方式中，兩個非雙環核苷係2’-MOE核苷，並且每個其他非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，每個R係2’-MOE核苷。在某些實施方式中，X係4、5、6、7、8、9或10。在某些實施方式中，Y係0。在某些實施方式中，Y係1。
在某些實施方式中，X係7，每個R係2’-O-甲氧基乙基核苷，每個NB係S-cEt核苷，每個NQ係β-D-去氧核糖核苷，並且Y係0。
在某些實施方式中，X係4；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4，其中每個NR1和NR3係S-cEt核苷並且每個NR2和NR4係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1；並且NZ係β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，X係4；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷並且每個NR2和NR3係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1；並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些實施方式中，X係7；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3和NR4各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR5和NR7各自是β-D-去氧核糖核苷，並且NR6係S-cEt核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，X係7；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3、NR4和NR5各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR6係S-cEt核苷，並且NR7係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，X係7；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，並且NR7係 β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，X係10；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；NR8和NR10各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，X係10；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；並且NR8和NR10各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些實施方式中，X係4；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷，並且NR1和NR3各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，X係4；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1係2’-O-甲氧基乙基核苷，NR2和NR4各自是S-cEt核苷，並且NR3係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與miR-122之核鹼基序列(SEQ ID NO：1)至少90%、至少92%、至少93%、至少94%、至 少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%互補。
在某些實施方式中，其中至少一個核苷間鍵聯係經修飾之核苷間鍵聯，或其中每個核苷間鍵聯係經修飾之核苷間鍵聯，並且可隨意地，其中該經修飾核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列選自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：6，其中每個T獨立地選自T和U。
在某些實施方式中，相對於miR-122的核鹼基序列，該經修飾之寡核苷酸具有0、1、2或3個錯配。
在某些實施方式中，一種化合物具有以下結構：AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS；CSCASTTGUSCSACSACSTCSCSA；MeCSCATSTGTS MeCSAMeCSAMeCSTMeCS MeCSAE；AE MeCEAE MeCECASTTGUSCSACSACSTCSCS；AE MeCEAE MeCE MeCEASTTGUSCSACSACSTCSCS；AE MeCEAE MeCE MeCEAETTGUSCSACSACSTCSCS；MeCEAEAEAE MeCEAECSCASTTGUSCSACSACSTCSCS MeCEAEAEAE MeCEAECSCASTTGUSCSACSACSTCSCSTE；CSCAUSTGUSCSACSACSTCSCSA；或MeCECSAUSTGUSCSACSACSTCSCSAE
其中上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶；後面沒有下標的核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”的核苷係2’-MOE核苷；後面有下標“S”的核苷係S-cEt 核苷；並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在一些實施方式中，一種化合物具有以下結構：USTGUSCSACSACSTCSCSAS；或CSASCSASCSUSCSCS
其中後面沒有下標的核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“S”的核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些此類實施方式中，該化合物係化合物38591、38633、38998或38634。
在此提供的任何該等化合物都可以包含連接至該經修飾之寡核苷酸5’末端或3’末端上之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸的3’末端上之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸的5’末端上之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸的3’末端上的第一共軛部分和連接至該經修飾之寡核苷酸的5’末端上之第二共軛部分。在某些實施方式中，該共軛部分包含選自以下之至少一個配位基：碳水化合物、膽固醇、脂質、磷脂、抗體、脂蛋白、激素、肽、維生素、類固醇以及陽離子性脂質。
在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-MO，其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-X-MO，其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-X1-Nm-X2-MO，其中每 個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-X-Nm-Y-MO，其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-Y-Nm-Y-MO，其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；每個Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，如果n大於1，則Ln-接頭具有以下結構： 其中每個L獨立地是配位基；n係從1至10；S係骨架；並且Q’和Q”獨立地是連接基團。
在某些實施方式中，Q’和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。
在某些實施方式中，一骨架將2、3、4或5個配位基連接至經修飾之寡核苷酸上。在某些實施方式中，一骨架將3個配位基連接至經修飾之寡核苷酸上。
非限制性之示例性結構E係結構E(i)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3和R4各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(ii)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1係H或甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(iii)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的 C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(iv)： 其中L1和L2各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(v)： 其中L1和L2各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(vi)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷 基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(vii)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基；並且Z和Z’各自獨立地選自O和S。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁 基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。在一些實施方式中，在至少一個P原子上的Z或Z’係S，並且另一個Z或Z’係O(即，硫代磷酸酯鍵)。在一些實施方式中，每個-OP(Z)(Z’)O-都是硫代磷酸酯鍵。在一些實施方式中，在至少一個P原子上的Z和Z’均是O(即，磷酸二酯鍵)。在一些實施方式中，每個-OP(Z)(Z’)O-都是磷酸二酯鍵。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(viii)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3和R4各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自選自H和甲基。
例如PCT公開號WO 2013/033230；美國專利號8,106,022 B2；美國公開號2012/0157509 A1；美國專利號5,994,517；美國專利號7,491,805 B2；美國專利號8,313,772 B2；馬諾哈蘭馬(Manoharan,M.)，第16章，反義藥物技術(Antisense Drug Technology)，斯汀克魯克(Crooke,S.T.)、馬塞爾德克爾(Marcel Dekker)公司，2001,391-469描述了非限制性之示例性骨架和/或包含骨架之接頭及其合成。
在某些實施方式中，一化合物具有以下結構：其中：B選自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；MO係經修飾之寡核苷酸；RN選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基以及苯甲基；Z、Z’和Z”各自獨立地選自O和S；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷；m係從1至5；X選自磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且 波形線表明連接至這個或該等接頭和配位基的其餘部分。
在某些實施方式中，X係磷酸二酯鍵。在某些實施方式中，n係從1至5、1至4、1至3、或1至2。在某些實施方式中，n係3。
在某些實施方式中，至少一個配位基係碳水化合物。
在某些實施方式中，至少一個配位基選自：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-哌喃甘露糖、β-D-哌喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-哌喃葡萄糖、β-D-哌喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-哌喃半乳糖、β-D-哌喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-哌喃核糖、β-D-哌喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-哌喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸、N-乙醯基半乳糖胺。
在某些實施方式中，至少一個配位基選自：N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺以及N-異丁醯基-半乳糖胺。
在某些實施方式中，每個配位基都是N-乙醯基半乳糖胺。
在某些實施方式中，一化合物具有以下結構： 其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，在此提供之化合物包含經修飾之核苷酸和共軛部分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL，其中下標“L”表明LNA並且後面沒有下標的核苷係β-D-去氧核糖核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯，並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸3’末端上並且具有以下結構： 其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，X1和X2中的至少一個係磷酸二酯鍵。在某些實施方 式中，X1和X2各自是磷酸二酯鍵。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。
在某些實施方式中，Nm係N’pN”，其中每個N’獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且p係從0至4；並且N”係包含未經修飾之糖部分的核苷。在某些實施方式中，p係0。在某些實施方式中，p係1、2、3或4。
在某些實施方式中，每個N’包含未經修飾之糖部分。在某些實施方式中，每個未經修飾之糖部分獨立地是β-D-核糖或β-D-去氧核糖。在某些實施方式中，N”包含嘌呤核鹼基。在某些實施方式中，N”包含嘧啶核鹼基。在某些實施方式中，至少一個N’包含嘌呤核鹼基。在某些實施方式中，每個嘌呤核鹼基獨立地選自：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤以及7-甲基鳥嘌呤。在某些實施方式中，N”係β-D-去氧核糖腺苷或β-D-去氧核糖鳥苷。在某些實施方式中，至少一個N’包含嘧啶核鹼基。在某些實施方式中，每個嘧啶核鹼基獨立地選自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氫尿嘧啶。
在此描述的任何該等實施方式中，每個N之糖部分獨立地選自：β-D-核糖、β-D-去氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及雙環糖部分。在某些實施方式中，每個雙環糖部分獨立地選自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。在某些實施方式中，cEt糖部分係S-cEt糖部分。在某些實施方式中，cEt糖部分係R-cEt糖部分。在此描述的任何實施方式中，每個N之糖部分可以獨立地選自β-D-核糖、β-D-去氧核糖以及2’-氟糖。
在此提供了包含修飾的核苷酸和共軛部分之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS，其中後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷，後面有下標“E”之核苷係2’-MOE核苷，後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯；並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸的3’末端上並且具有以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在此提供了包含經修飾之核苷酸和共軛部分之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL，其中下標“L”表明LNA並且後面沒有下標的核苷係β-D-去氧核糖核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯，並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端上並且具有以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在一些實施方式中，所有CL核苷都是MeCL核苷，其中上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶。
在此提供了抑制細胞中miR-122的活性之方法，該等方法包括使細胞與在此提供的任何化合物相接觸。在某些實施方式中，細胞係在體內之細胞。在某些實施方式中，細胞係在體外。
在此提供了向HCV感染的受試者給藥在此提供的任何化合物之方法。在某些實施方式中，該給藥減少了HCV感染的症狀。在某些實施方式中，該給藥防止了血清HCV RNA的回升。在某些實施方式中，該給藥延緩了血清HCV RNA之回升。在某些實施方式中，選擇具有HCV感染之受試者用於使用在此提供的化合物進行治療。在某些實施方式中，HCV感染的受試者被選自以下的一種或多種HCV基因型感染：基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5以及基因型6。在某些實施方式中，在給藥在此提供之化合物之前，確定該受試者被選自以下的一種或多種HCV基因型感染：基因型 1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5以及基因型6。在某些實施方式中，該HCV基因型選自：基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型2c、基因型2d、基因型3a、基因型3b、基因型3c、基因型3d、基因型3e、基因型3f、基因型4a、基因型4b、基因型4c、基因型4d、基因型4e、基因型4f、基因型4g、基因型4h、基因型4i、基因型4j、基因型5a以及基因型6a。在某些實施方式中，該HCV基因型選自基因型1a、基因型1b和基因型2。
這裡提供的任何方法都可以包括給藥至少一種另外的治療劑。在某些實施方式中，該至少一種治療劑選自：蛋白酶抑制劑、聚合酶抑制劑、輔助因數抑制劑、RNA聚合酶抑制劑、結構蛋白抑制劑、非結構蛋白抑制劑、親環蛋白抑制劑、進入抑制劑、TLR7激動劑以及干擾素。在某些實施方式中，該至少一種治療劑選自：蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS3/4A抑制劑、核苷NS5B抑制劑、核苷酸NS5B抑制劑、非核苷NS5B抑制劑、親環蛋白抑制劑以及干擾素。在某些實施方式中，該至少一種治療劑選自：干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素alfacon-1、聚乙二醇干擾素α-2b、聚乙二醇干擾素α-2a、緩釋型干擾素-α-2b、干擾素λ、索菲布韋(sofosbuvir)、利巴韋林(ribavirin)、特拉普韋(telapravir)、波普瑞韋(boceprevir)、伐尼普韋(vaniprevir)、阿森那普韋(asunaprevir)、利托那韋(ritonavir)、斯約伯韋(setrobuvir)、迪卡拉斯他韋(daclastavir)、斯密普韋(simeprevir)、阿拉泊韋(alisporivir)、麥瑞斯他濱(mericitabine)、替格布韋 (tegobuvir)、丹諾普韋(danoprevir)、索伐普韋(sovaprevir)以及尼塞普韋(neceprevir)。在某些實施方式中，該至少一種治療劑選自：干擾素、利巴韋林和特拉普韋。
在某些實施方式中，受試者被對至少一種治療劑有抗性之HCV變體感染。在某些實施方式中，受試者被對直接作用型抗病毒劑有抗性之HCV變體感染。在某些實施方式中，受試者被對選自以下的至少一種治療劑有抗性之HCV變體感染：蛋白酶抑制劑、聚合酶抑制劑、輔助因數抑制劑、RNA聚合酶抑制劑、結構蛋白抑制劑、非結構蛋白抑制劑以及親環蛋白抑制劑。在某些實施方式中，受試者被對選自以下的至少一種治療劑有抗性之HCV變體感染：蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS3/4A抑制劑、核苷NS5B抑制劑、核苷酸NS5B抑制劑、非核苷NS5B抑制劑以及親環蛋白抑制劑。在某些實施方式中，受試者被對選自以下的至少一種治療劑有抗性的HCV變體感染：索菲布韋、利巴韋林、特拉普韋、波普瑞韋、伐尼普韋、阿森那普韋、利托那韋、斯約伯韋、迪卡拉斯他韋、斯密普韋、阿拉泊韋、麥瑞斯他濱、替格布韋、丹諾普韋、索伐普韋以及尼塞普韋。
在某些實施方式中，HCV感染之受試者係對至少一種治療劑無反應者。在某些實施方式中，HCV感染之受試者係干擾素無反應者。在某些實施方式中，HCV感染之受試者係直接作用型抗病毒性無反應者。
在此提供之任何該等方法都可以包括選擇具有每毫升血清大於350,000個拷貝的HCV RNA水平的受試者。在某些實施方式中，受試者具有每毫升 血清在350,000個與3,500,000個拷貝之間之HCV RNA水平。在某些實施方式中，受試者具有每毫升血清大於3,500,000個拷貝之HCV RNA水平。
在某些實施方式中，HCV感染之受試者具有HCV相關性疾病。在某些實施方式中，HCV相關性疾病係肝硬化、肝纖維化、脂肪性肝炎、脂肪變性或肝細胞癌。
在某些實施方式中，HCV感染之受試者具有不是HCV相關性疾病的一種或多種疾病。在某些實施方式中，HCV感染的受試者被一種或多種除HCV以外的病毒感染。在某些實施方式中，HCV感染之受試者被人免疫缺陷病毒(HIV)感染。在某些實施方式中，在此提供的該等方法包括給藥另外的治療劑，該另外的治療劑係在治療HIV感染中使用之抗病毒劑。在某些實施方式中，另外的治療劑係非核苷逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)。在某些實施方式中，另外的治療劑係核苷逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)。在某些實施方式中，另外的治療劑係蛋白酶抑制劑。在某些實施方式中，另外的治療劑係進入抑制劑或融合抑制劑。在某些實施方式中，另外的治療劑係整合酶抑制劑。在某些實施方式中，另外的治療劑選自：依法韋侖(efavirenz)、依曲韋林(etravirine)、奈韋拉平(nevirapine)、阿巴卡韋(abacavir)、恩曲他濱(emtricitabine)、替諾福韋(tenofovir)、拉米夫定(lamivudine)、齊多夫定(zidovudine)、阿紮那韋(atazanavir)、地瑞那韋(darunavir)、福沙那韋(fosamprenavir)、利托那韋、恩夫韋地(enfuvirtide)、馬拉威諾(maraviroc)以及雷特格韋(raltegravir)。
在此提供的任何該等方法都可以包括給藥足以降低HCV RNA水平之劑量之化合物。在某些實施方式中，該給藥劑量之化合物使HCV RNA水平降低至每毫升血清40個拷貝以下。在某些實施方式中，該給藥劑量的化合物實現HCV RNA水平降低至少2個對數。在某些實施方式中，給藥在此提供的化合物實現了持續的病毒反應。在某些實施方式中，該給藥劑量的化合物足以實現HCV RNA水平降低至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.5倍、至少2.0倍或至少2.5倍。在某些實施方式中，在第一次給藥該化合物兩週、三週、四週、五週或六週之後實現HCV RNA水平降低。在某些實施方式中，每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次或每月一次給藥在此提供的化合物。在某些實施方式中，每兩個月一次或每三個月一次給藥在此提供的化合物。在一些實施方式中，每四週一次給藥在此提供之化合物。
在某些實施方式中，所給藥化合物的劑量係小於或等於每週5mg/kg、小於或等於5mg/kg、小於或等於4.5mg/kg、小於或等於4.0mg/kg、小於或等於3.5mg/kg、小於或等於3.0mg/kg、小於或等於2.5mg/kg、小於或等於2.0mg/kg、小於或等於1.5mg/kg、或小於或等於1.0mg/kg。在某些實施方式中，化合物的給藥劑量在1mg/kg至5mg/kg、或1mg/kg至4mg/kg、或2mg/kg至5mg/kg、或2mg/kg至4mg/kg範圍內。在某些實施方式中，所給藥化合物的劑量係小於或等於10mg/kg、小於或等於7.5mg/kg、小於或等於每週10mg/kg、或小於或等於每週7.5mg/kg。
在某些實施方案中，給藥在此提供之化合物使肝酶水平正常化，其中該 肝酶可隨意地是丙胺酸轉胺酶。
在此提供之任何該等實施方式中，該化合物存在於藥物組合物中。
在此提供了用於治療HCV-感染之受試者之化合物。
在某些實施方式中，受試者係人。
圖1A和1B.抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。(A)在指定劑量下單次給藥化合物之後抗miR-122作用之起效和持續時間。(B)在指定劑量下單次劑量之抗miR-122化合物七天后ALDOA之去阻抑。
圖2.包含三個GalNAc配位基的共軛部分之結構。
圖3A、3B和3C.共軛的經修飾之寡核苷酸結構。
圖4A、4B和4C. GalNAc共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖5A和5B.反義抑制miR-122減小了HCV滴度。
圖6A和6B. GalNAc共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖7A和7B. GalNAc共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖8A和8B. GalNAc共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖9A和9B. 抗miR-122化合物之藥物動力學。
除非以另外方式定義，否則在此使用的所有技術和科學術語具有與本發 明所屬的領域之普通技術人員通常理解相同之含義。除非提供了具體定義，否則與在此描述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學結合使用之術語以及其程序和技術係本領域中熟知並且通常使用的。針對在此之術語存在多個定義情況下，此部分中之定義優先。化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及治療受試者可以使用標準技術。某些此類技術和程序可以例如在桑薇(Sangvi)和科克(Cook)編輯的“反義研究中的碳水化合物修飾(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)”，美國化學學會(American Chemical Society)，華盛頓哥倫比亞特區(Washington D.C.),1994；和“雷明頓的藥物科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)，”麥克出版有限公司(Mack Publishing Co.)，伊斯頓(Easton)，賓夕法尼亞州(Pa.)，第18版，1990中找到；並且出於任何目的，該等參考文件特此藉由引用結合。在允許的情況下，貫穿在此的整個揭露內容所涉及的所有的專利、專利申請、公佈的申請案及出版物、GENBANK序列、網站以及其他公開的材料，除非另外指出，否則藉由引用以其全部內容結合。應當理解，在提及URL或其他此類識別符或位址的情況下，此類識別符會變化，並且網際網路上之具體資訊也會變化，但是等效資訊可以藉由搜索網際網路來找到。如此提及證明了此種資訊的可用性和公眾傳播。
在揭露及描述本發明之該等組合物和方法之前，應當理解在此使用之術語僅是出於描述具體實施方式之目的而不欲具有限制性。必須指出，如在說明書和所附申請專利範圍中所使用，單數形式“一/一個/一種(a/an)”和“該 (the)”包括複數個指示物，除非上下文另外清楚地指明。
定義
“HCV感染”意指被丙型肝炎病毒的一種或多種基因型感染。
“HCV感染的受試者”意指已被丙型肝炎病毒的一種或多種基因型感染之受試者。HCV感染的受試者可能或可能不展現出HCV感染之症狀。HCV感染之受試者包括已被HCV的一種或多種基因型感染之受試者，但是該受試者的血液中之HCV RNA係在可檢測水平以下。
“HCV相關性疾病”意指由HCV感染所介導的病理性過程。HCV相關性疾病包括但不限於肝硬化、肝纖維化、脂肪性肝炎以及肝細胞癌。
“血液HCV RNA”意指存在於HCV感染之受試者血液中之丙型肝炎病毒RNA。血液包括全血和血清。
“血清HCV RNA回升”意指在先前HCV RNA水平降低之後之HCV RNA水平增加。
“HCV RNA水平”意指在給定體積之受試者血液中之HCV RNA之量。HCV RNA水平可以表達為每毫升之RNA拷貝數。“HCV RNA水平”也可以稱為“HCV病毒載量”或“HCV RNA滴度”。
“持續之病毒反應”意指在治療之整個過程結束時和在另外六個月後受試者血液中之丙型肝炎病毒RNA不可檢測。在某些實施方式中，HCV RNA在每毫升血液40個拷貝以下被認為是不可檢測的。
“無反應者”意指已接受治療但是沒有經歷疾病標誌或症狀上的臨床上可 接受的改善之受試者。
“干擾素無反應者”意指已接受用干擾素治療但是沒有經歷HCV RNA水平上的臨床上可接受的降低的HCV感染之受試者。
“直接作用型抗病毒劑”意指抑制HCV酶之活性之藥劑。
“直接作用型抗病毒性無反應者”意指已接受用直接作用型抗病毒劑治療但是沒有經歷HCV RNA水平上之臨床上可接受的降低的HCV感染之受試者。在某些實施方式中，病毒已發展出對該直接作用型抗病毒劑之抗性。
“miR-122相關性病狀”意指可以藉由調節miR-122來治療、預防或改善的任何疾病、病症或病狀。miR-122相關性疾病不需要特徵在於過量的miR-122。miR-122相關性疾病包括但不限於HCV感染、膽固醇升高和鐵負載過高病症。
“鐵負載過高病症”意指特徵在於身體內的鐵過量之任何疾病、病症或病狀。“受試者”意指選擇用於治療或療法之人或非人動物。
“有需要之受試者”意指被鑒定為有療法或治療需要之受試者。
“疑似患有之受試者”意指展現出疾病的一個或多個臨床指標之受試者。
“給藥”意指向受試者提供藥劑或組合物，並且包括但不限於由醫學專家給藥和自給藥。
“腸胃外給藥”意指藉由注射或輸注給藥。腸胃外給藥包括但不限於皮下給藥、靜脈內給藥和肌肉內給藥。
“皮下給藥”意指在皮膚下方給藥。
“靜脈內給藥”意指給藥進入靜脈中。
“同時給藥”係指以任何方式向受試者共同給藥兩種或更多種藥劑，其中每種藥劑的藥理學作用都存在於受試者體內。同時給藥不要求以單一的藥物組合物、以相同劑型或藉由相同的給藥途徑來給藥兩種藥劑。這兩種藥劑的作用不需要同時存在。該等作用僅需要一段時間重疊並且不需要共延。
“持續時間”意指活性或事件持續的一段時間。在某些實施方式中，治療持續時間係給藥多個劑量的藥劑或藥物組合物的一段時間。
“療法”意指疾病治療方法。在某些實施方式中，療法包括但不限於化學療法、放射療法或給藥藥劑。
“治療”意指施加用於治癒或改善疾病的一種或多種特定程序。在某些實施方式中，該特定程序係給藥一種或多種藥劑。
“改善”意指減輕病狀或疾病的至少一個指標之嚴重性。在某些實施方式中，改善包括延緩或減慢病狀或疾病的一個或多個指標之進展。可以藉由熟習該項技術者已知的主觀測量或客觀測量來確定指標之嚴重性。
“處於發展之風險”意指受試者易於發展病狀或疾病之狀態。在某些實施方式中，處於發展病狀或疾病的風險的受試者展現出該病狀或疾病的一種或多種症狀，但是沒有展現出診斷患有該病狀或疾病的足夠數量之症狀。在某些實施方式中，處於發展病狀或疾病的風險的一受試者展現出該病狀或疾病的或多種症狀，但達到診斷該病狀或疾病所要求的更小程度。
“預防發作”意指在處於發展該疾病或病狀的風險的一受試者中預防病狀 或疾病之發展。在某些實施方式中，處於發展該疾病或病狀的風險的受試者接受與已經患有該疾病或病狀的受試者所接受的治療類似的治療。
“延緩發作”意指在處於發展該疾病或病狀的風險的受試者中延緩病狀或疾病之發展。在某些實施方式中，處於發展該疾病或病狀的風險之受試者接受與已經患有該疾病或病狀的受試者所接受的治療類似之治療。
“治療劑”意指用於治癒、改善或預防疾病之藥劑。
“劑量”意指在單次給藥中提供的藥劑之指定量。在某些實施方式中，劑量可以兩個或更多個大丸劑、片劑或注射劑形式給藥。例如，在某些實施方式中，在希望皮下給藥的情況下，所希望的劑量要求不是藉由單次注射容易地提供之體積。在此類實施方式中，可以使用兩次或更多次注射達到所希望之劑量。在某些實施方式中，劑量可以兩次或更多次注射給藥以使個體體內之注射部位反應減到最小。在某些實施方式中，劑量藉由緩慢輸注給藥。
“劑量單位”意指提供藥劑的形式。在某些實施方式中，劑量單位係含有凍乾寡核苷酸之小瓶。在某些實施方式中，劑量單位係含有復原寡核苷酸之小瓶。
“治療有效量”係指對動物提供治療益處之藥劑之量。
“藥物組合物”意指包括藥劑的適合用於向個體給藥的物質之混合物。例如，藥物組合物可以包含無菌水溶液。
“藥劑”意指當向受試者給藥時提供治療作用之物質。
“活性藥物成分”意指藥物組合物中提供希望的作用之物質。
“改善的器官功能”意指趨向于正常限制之器官功能變化。在某些實施方式中，藉由測量存在於受試者的血液或尿液中的分子來評價器官功能。例如，在某些實施方式中，藉由血液肝轉胺酶水平降低來測量改善之肝功能。在某些實施方式中，藉由血液尿素氮減少、蛋白尿減少、清蛋白尿減少等來測量改善之腎功能。
“可接受的安全性特徵”意指處於臨床上可接受的限制之內的副作用之型態。
“副作用”意指除希望之作用以外的可歸因於治療之生理反應。在某些實施方式中，副作用包括但不限於：注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝毒性、腎毒性、中樞神經系統異常以及肌病。此類副作用可以被直接或間接檢測。例如，血清中的轉胺酶水平增加可以表明肝毒性或肝功能異常。例如，膽紅素增加可以表明肝毒性或肝功能異常。
“注射部位反應”意指在個體注射部位處之皮膚之炎症或異常發紅。
“受試者依從性”意指受試者對建議或規定的療法之順從性。
“遵從”意指受試者對建議之療法順從。
“建議之療法”意指醫學專家建議的治療、改善、延緩或預防疾病之治療。
“miR-122”意指具有核鹼基序列UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQ ID NO：1)的微小RNA。
“miR-122莖環”意指具有核鹼基序列 CCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCUAAACUAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUACUGCUAGGC(SEQ ID NO：2)之微小RNA先質。
“抗miR”意指具有與微小RNA互補之核鹼基序列之寡核苷酸。在某些實施方式中，抗miR係經修飾之寡核苷酸。
“抗miR-122”意指具有與miR-122互補之核鹼基序列之寡核苷酸。在某些實施方式中，抗miR-122與miR-122完全互補(即，100%互補)。在某些實施方式中，抗miR-122係至少90%、至少93%、至少94%、至少95%或100%互補。在某些實施方式中，抗miR-122係經修飾之寡核苷酸。
“靶核酸”意指低聚化合物被設計與其進行雜交之核酸。
“靶向”意指將與靶核酸雜交的核鹼基序列的設計和選擇過程。
“對......靶向”意指具有將允許與靶核酸雜交的核鹼基序列。
“調節”意指干擾功能、量或活性。在某些實施方式中，調節意指功能、量或活性增加。在某些實施方式中，調節意指功能、量或活性減少。
“表現”意指基因之編碼資訊轉變成存在於細胞中並且在細胞中起作用之結構所借助之任何功能和步驟。
“5’靶位點”意指與特定寡核苷酸之最3’端核鹼基互補的靶核酸之核鹼基。
“3’靶位點”意指與特定寡核苷酸之最5’端核鹼基互補的靶核酸之核鹼基。
“區”意指核酸內的連接的核苷的一部分。在某些實施方式中，寡核苷酸 具有與靶核酸的區互補的核鹼基序列。例如，在某些此類實施方式中，寡核苷酸與微小RNA序列的區互補。在某些此類實施方式中，寡核苷酸與微小RNA的區完全互補。
“區段”意指區的較小或子部分。
“核鹼基序列”意指無關任何糖、鍵聯和/或核鹼基修飾，典型地以5’至3’方向列出的低聚化合物或核酸中的連續核鹼基之順序。
“連續核鹼基”意指在核酸中彼此緊鄰之核鹼基。
“核鹼基互補性”意指兩個核鹼基經由氫鍵結非共價配對之能力。
“互補”意指一個核酸能夠與另一個核酸或寡核苷酸雜交。在某些實施方式中，互補係指寡核苷酸能夠與靶核酸雜交。
“完全互補”意指寡核苷酸的每個核鹼基能夠與靶核酸中的每個對應位置上之核鹼基配對。在某些實施方式中，寡核苷酸與微小RNA完全互補，即，該寡核苷酸的每個核鹼基與該微小RNA中的對應位置上的核鹼基互補。在某些實施方式中，其中每個核鹼基與微小RNA序列的區內的核鹼基互補之寡核苷酸與該微小RNA序列完全互補。
“互補性百分比”意指寡核苷酸中與靶核酸的等長部分互補之核鹼基百分比。藉由將該寡核苷酸中與該靶核酸中的對應位置上之核鹼基互補之核鹼基數除以該寡核苷酸中的核鹼基總數來計算互補性百分比。
“同一性百分比”意指第一核酸中與第二核酸中的對應位置上的核鹼基相同的核鹼基數除以該第一核酸中的核鹼基總數。在某些實施方式中，該第一 核酸係微小RNA並且該第二核酸係微小RNA。在某些實施方式中，該第一核酸係寡核苷酸並且該第二核酸係寡核苷酸。
“雜交”意指藉由核鹼基互補性發生的互補核酸之退火。
“錯配”意指第一核酸中不能夠與第二核酸的對應位置上之核鹼基發生沃森-克裡克(Watson-Crick)配對之鹼基。
在核鹼基序列背景下的“相同”意指無關糖、鍵聯和/或核鹼基修飾和無關存在的任何嘧啶之甲基狀態，具有相同核鹼基序列。
“微小RNA”意指長度介於18與25個之間的核鹼基之內源性非編碼RNA，該內源性非編碼RNA係由酶Dicer裂解先質微小RNA的產物。成熟的微小RNA的實例可在稱為miRBase(http：//microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA數據庫中找到。在某些實施方式中，微小RNA縮寫為“微小RNA”或“miR”。
“先質微小RNA”或“先質miR”意指具有髮夾結構之非編碼RNA，該非編碼RNA係由稱為Drosha的雙股RNA特異性核糖核酸酶裂解先質miR之產物。
“莖環序列”意指具有髮夾結構並且含有成熟微小RNA序列之RNA。先質微小RNA序列和莖環序列可以重疊。莖環序列的實例可在稱為miRBase(http：//microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA數據庫中找到。
“初級微小RNA”或“初級miR”意指具有髮夾結構的非編碼RNA，該非編碼RNA係雙股RNA特異性核糖核酸酶Drosha的底物。
“微小RNA先質”意指起源于基因組DNA並且包含含有一個或多個微小RNA序列非編碼結構RNA之轉錄物。例如，在某些實施方式中，微小RNA先質係先質微小RNA。在某些實施方式中，微小RNA先質係初級微小RNA。
“微小RNA調節的轉錄物”意指由微小RNA調節之轉錄物。
“單順反子轉錄物”意指含有單個微小RNA序列之微小RNA先質。
“多順反子轉錄物”意指含有兩個或更多個微小RNA序列之微小RNA先質。
“種子序列”意指包含成熟微小RNA序列之5’-末端之核鹼基1至9之6至8個連續核鹼基的核鹼基序列。
“種子匹配序列”意指與種子序列互補並且長度與該種子序列相同之核鹼基序列。
“低聚化合物”意指包含多個連接的單體亞單元之化合物。低聚化合物包括寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指包含多個連接的核苷的化合物，該等連接之核苷可以各自獨立地是經修飾或未經修飾的。
“天然存在的核苷間鍵聯”意指核苷之間的3’至5’磷酸二酯鍵。
“天然糖”意指在DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中發現之糖。
“核苷間鍵聯”意指相鄰核苷之間之共價鍵。
“連接的核苷”意指藉由共價鍵聯接之核苷。
“核鹼基”意指能夠與另一個核鹼基非共價配對的雜環部分。
“核苷”意指連接至糖部分之核鹼基。
“核苷酸”意指具有共價連接至核苷的糖部分的磷酸酯基團之核苷。
“包含由許多連接的核苷組成的經修飾之寡核苷酸之化合物”意指包括具有指定數目的連接的核苷的經修飾之寡核苷酸之化合物。因此，該化合物可以包括另外的取代基或共軛物。除非另外指明，否則該化合物不包括超出該經修飾之寡核苷酸之核苷之任何另外的核苷。
“經修飾之寡核苷酸”意指相對于天然存在的末端、糖、核鹼基和/或核苷間鍵聯具有一個或多個經修飾之寡核苷酸。經修飾之寡核苷酸可以包含未修飾的核苷。
“單股經修飾之寡核苷酸”意指不與互補股雜交的經修飾之寡核苷酸。
“修飾的核苷”意指與天然存在的核苷相比具有任何變化的核苷。修飾的核苷可以具有經修飾之糖和未經修飾之核鹼基。經修飾之核苷可以具有經修飾之糖和經修飾之核鹼基。經修飾之核苷可以具有天然糖和經修飾之核鹼基。在某些實施方式中，經修飾之核苷係雙環核苷。在某些實施方式中，經修飾之核苷係非雙環核苷。
“2’-修飾之核苷”意指當位置係在2-去氧核糖或核糖中編號時，包含在等效於呋喃糖基環的2’位置之位置上具有任何經修飾之糖之核苷。應當理解，2’-修飾的核苷包括但不限於包含雙環糖部分的核苷。
“經修飾之核苷間鍵聯”意指與天然存在的核苷間鍵聯相比的任何變化。
“硫代磷酸酯核苷間鍵聯”意指其中非橋聯原子之一係硫原子之核苷之間的鍵聯。“硫代磷酸酯鍵”意指具有與硫代磷酸酯核苷間鍵聯例如-OP(O)(S)O-相同結構的兩個化學部分之間之鍵聯。
“磷酸二酯鍵”意指具有與磷酸二酯核苷間鍵聯例如-OP(O)2O-相同結構的兩個化學部分之間之鍵聯。
“未經修飾之核鹼基”意指RNA或DNA的天然存在的雜環鹼基：嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)；以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)和尿嘧啶(U)。
“5-甲基胞嘧啶”意指包含連接至5位置上的甲基之胞嘧啶。
“非甲基化的胞嘧啶”意指不具有連接至5位置上的甲基之胞嘧啶。
“經修飾之核鹼基”意指不是未經修飾之核鹼基之任何核鹼基。
“呋喃糖基”意指包含由四個碳原子和一個氧原子組成的5員環之結構。
“天然存在的呋喃糖基”意指如在天然存在的RNA中發現的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中發現的呋喃去氧核糖基。
“糖部分”意指天然存在的呋喃糖基或經修飾之糖部分。
“經修飾之糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。
“取代的糖部分”意指不是天然存在的呋喃糖基之呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限於在天然存在的呋喃糖基的2’-位置、5’-位置和/或4’-位置上包含修飾的糖部分。某些取代的糖部分係雙環糖部分。
“糖替代物”意指不包含呋喃糖基並且能夠替代核苷的天然存在的呋喃糖 基之結構，這樣使得所得到的核苷能夠(1)結合到寡核苷酸中並且(2)與互補核苷進行雜交。此類結構包括該呋喃糖基相對簡單之變化，如環包含不同的原子數(例如，4員環、6員環或7員環)；該呋喃糖基的氧置換為非氧原子(例如，碳、硫或氮)；或原子數和氧置換這兩種變化。此類結構還可以包含與針對取代的糖部分所描述的那些取代相對應之取代(例如，6元碳環雙環糖替代物可隨意地包含另外的取代基)。糖替代物還包括更複雜之糖置換(例如，肽核酸的非環體系)。糖替代物包括但不限於啉化合物、環己烯化合物和環己六醇化合物。
“β-D-去氧核糖”意指天然存在的DNA糖部分。
“β-D-核糖”意指天然存在的RNA糖部分。
“2’-O-甲基糖”或“2’-OMe糖”意指在2’位置上具有O-甲基修飾的糖。
“2’-O-甲氧基乙基糖”或“2’-MOE糖”意指在2’位置上具有O-甲氧基乙基修飾的糖。
“2’-O-氟基”或“2’-F”意指在2’位置上具有氟基修飾的糖。
“雙環糖部分”意指包含4至7員環的經修飾之糖部分(包括但不限於呋喃糖基)，該經修飾之糖部分包含連接該4至7員環的兩個原子之橋聯以形成第二環，從而產生雙環結構。在某些實施方式中，該4至7員環係糖環。在某些實施方式中，該4至7員環係呋喃糖基。在某些此類實施方式中，該橋聯連接該呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。非限制的示例性雙環糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt和R-cEt。
“鎖核酸(LNA)糖部分”意指在4’呋喃糖環原子與2’呋喃糖環原子之間包含(CH2)-O橋聯的取代的糖部分。
“ENA糖部分”意指在4’呋喃糖環原子與2’呋喃糖環原子之間包含(CH2)2-O橋聯的取代的糖部分。
“約束乙基(cEt)糖部分”意指在4'呋喃糖環原子與2'呋喃糖環原子之間包含CH(CH3)-O橋聯之取代的糖部分。在某些實施方式中，該CH(CH3)-O橋聯約束為S方向。在某些實施方式中，該CH(CH3)-O橋聯約束為R方向。
“S-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖環原子與2'呋喃糖環原子之間包含S-約束的CH(CH3)-O橋聯之取代的糖部分。
“R-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖環原子與2'呋喃糖環原子之間包含R-約束的CH(CH3)-O橋聯之取代的糖部分。
“2’-O-甲基核苷”意指具有2’-O-甲基糖修飾的經修飾之核苷。
“2’-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2’-O-甲氧基乙基糖修飾的經修飾之核苷。2’-O-甲氧基乙基核苷可以包含經修飾或未經修飾之核鹼基。
“2’-氟核苷”意指具有2’-氟基糖修飾的經修飾之核苷。2’-氟核苷可以包含經修飾或未經修飾之核鹼基。
“雙環核苷”意指具有雙環糖部分的經修飾之核苷。雙環核苷可以具有經飾或未經修飾之核鹼基。
“cEt核苷”意指包含cEt糖部分之核苷。cEt核苷可以包含經修飾或未經修飾之核鹼基。
“S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分之核苷。
“R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分之核苷。
“非雙環核苷”意指具有除雙環糖以外的糖之核苷。在某些實施方式中，非雙環核苷包含天然存在的糖。在某些實施方式中，非雙環核苷包含經修飾之糖。在某些實施方式中，非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。在某些實施方式中，非雙環核苷係2’-O-甲氧基乙基核苷。
“β-D-去氧核糖核苷”意指天然存在的DNA核苷。
“β-D-核糖核苷”意指天然存在的RNA核苷。
“LNA核苷”意指包含LNA糖部分的核苷。
“ENA核苷”意指包含ENA糖部分的核苷。
“基序”意指寡核苷酸中的經修飾和/或未經修飾的核鹼基、糖和/或核苷間鍵聯之型態。在某些實施方式中，基序係核苷型態。
“核苷型態”意指在經修飾之寡核苷酸或其區中的核苷修飾之型態。核苷型態係描述核苷修飾在寡核苷酸中的排列之基序。
“完全經修飾之寡核苷酸”意指每個核鹼基、每種糖和/或每個核苷間鍵聯都被修飾。
“均一經修飾之寡核苷酸”意指每個核鹼基、每種糖和/或每個核苷間鍵聯在整個該經修飾之寡核苷酸中具有相同修飾。
“穩定性修飾”意指在核酸酶存在下，相對於藉由由磷酸二酯核苷間鍵聯連接的2’-去氧核苷提供之穩定性，為經修飾之寡核苷酸提供增強的穩定性的 對核苷之修飾。例如，在某些實施方式中，穩定性修飾係穩定性核苷修飾。在某些實施方式中，穩定性修飾係核苷間鍵聯修飾。
“穩定性核苷”意指相對於2’-去氧核苷提供之核酸酶穩定性，被修飾以對寡核苷酸提供增強的核酸酶穩定性之核苷。在一個實施方式中，穩定性核苷係2’-修飾之核苷。
“穩定性核苷間鍵聯”意指相對於磷酸二酯核苷間鍵聯提供之核苷酶穩定性，為寡核苷酸提供提高的核酸酶穩定性之核苷間鍵聯。在一個實施方式中，穩定性核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
如在此所使用的“連接基團”係指經由一個或多個共價鍵將第一化學實體連接至第二化學實體的原子或原子團。
如在此所使用的“接頭”係指經由一個或多個共價鍵將一個或多個配位基連接至經修飾或未經修飾之核苷的原子或原子團。該經修飾或未經修飾之核苷可以是如在此所描述的經修飾之寡核苷酸之部分，或可以藉由磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵連接至經修飾之寡核苷酸。在一些實施方式中，該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端。在一些實施方式中，該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端。在一些實施方式中，該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾或未經修飾之核苷，該經修飾或未經修飾之核苷被連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端。在一些實施方式中，該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾或未經修飾之核苷，該經修飾或未經修飾之核苷被連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端。當該接頭將一個或 多個配位基連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端或被連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端的經修飾或未經修飾之核苷時，在一些實施方式中，該接頭的連接點可以是修飾或未經修飾之糖部分之3’碳。當該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端或被連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端的經修飾或未經修飾之核苷時，在一些實施方式中，該接頭的連接點可以是修飾或未經修飾之糖部分之5’碳。
綜述
為了鑒定miR-122之有效抑制劑，設計並且合成了許多抗miR-122化合物。該等化合物包含長度以及雙環核苷和非雙環核苷之數目、位置以及特性不同的經修飾之寡核苷酸。在體外螢光素酶測定中測試一系列初始化合物，該體外螢光素酶測定將一個子集的化合物鑒定為體外活性化合物。然後在體內測定中測試該等體外活性化合物以鑒定作為體內miR-122的有效抑制劑的那些化合物。藉由初始的體外和體內篩選，某些化合物被選擇為用於設計另外的化合物之基礎。實驗觀察到的結構與活性之間的相關性(在體外和在體內兩者中)用來為該等另外化合物的設計提供資訊，其中另外在長度和雙環與非雙環核苷的選擇和安排方面有所變化。對該等另外化合物重複進行該等體外和體內篩選測定。還測試了某些化合物的其他特性，例如對核酸外切酶活性的敏感性、組織積累和組織半衰期。
在這個過程中體外篩選的超過400種化合物中，大約150種化合物被鑒定為在體外螢光素酶測定中具有活性。進一步評估大約70種該等化合物之體 內效力和安全性。藉由設計和篩選化合物的這種反復過程，觀察到某些化合物(未共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸和共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸兩者)係體內miR-122的有效抑制劑。因此，該等化合物適用於調節由miR-122的活性促進之細胞過程。另外，此類化合物適用於治療、預防和/或延緩與miR-122相關的疾病發作。此類疾病包括但不限於HCV感染和HCV相關性併發症，如肝硬化、肝纖維化、脂肪性肝炎、脂肪變性以及肝細胞瘤。
某些抗miR-122化合物
在此提供了具有雙環和非雙環核苷的某些型態之經修飾之寡核苷酸。具有在此鑒定的該等型態的經修飾之寡核苷酸係miR-122活性之有效抑制劑。
在此說明的該等核苷型態各自以5’至3’方向示出。
在某些實施方式中，在此提供了包含由16至22個連接的核苷組成的經修飾之寡核苷酸的化合物，其中該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與miR-122(SEQ ID NO：1)互補，並且其中該經修飾之寡核苷酸按5’至3’方向包含具有以下核苷型態I之至少16個連續核苷：(R)X-NQ-NQ-NB-NB-NQ-NB-NQ-NB-NQ-NB-NB-(NZ)Y
其中每個R獨立地是非雙環核苷或雙環核苷；X係從4至10；每個NB獨立地是雙環核苷；每個NQ獨立地是非雙環核苷；Y係0或1；並且 NZ係經修飾之核苷或未經修飾之核苷、非雙環核苷或雙環核苷。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸包含具有核苷型態I之至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個或22個連續核苷。
在某些實施方式中，每個雙環核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷和ENA核苷。
在某些實施方式中，至少兩個雙環核苷彼此不同。
在某些實施方式中，所有雙環核苷具有相同類型之糖部分。
在某些實施方式中，每個雙環核苷係cEt核苷。在某些實施方式中，該cEt核苷係S-cEt核苷。在某些實施方式中，該cEt核苷係R-cEt核苷。
在某些實施方式中，每個雙環核苷係LNA核苷。
在某些實施方式中，至少兩個非雙環核苷包含彼此不同之糖部分。在某些實施方式中，每個非雙環核苷具有相同類型之糖部分。
在某些實施方式中，每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷係2’-MOE核苷。
在某些實施方式中，不多於兩個非雙環核苷係2’-MOE核苷。在某些實施方式中，不多於兩個非雙環核苷係2’-MOE核苷，並且每個其他非雙環核 苷係β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，5’-末端和3’-末端的非雙環核苷係2’-MOE核苷，並且每個其他非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，兩個非雙環核苷係2’-MOE核苷，並且每個其他非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，R的每個核苷係2’-MOE核苷。
在某些實施方式中，X係4、5、6、7、8、9或10。
在某些實施方式中，Y係0。在某些實施方式中，Y係1。
在某些實施方式中，R由七個連接之核苷組成，其中每個核苷係2’-O-甲氧基乙基核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，R由四個連接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4組成，其中NR1和NR3各自是S-cEt核苷並且NR2和NR4各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1；並且NZ係β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，R由四個連接之核苷NR1-NR2-NR3-NR4組成，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷並且NR2和NR3各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1；並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些實施方式中，R由七個連接之核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7組 成，其中NR1、NR2、NR3和NR4各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR5和NR7各自是β-D-去氧核糖核苷，並且NR6係S-cEt核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，R由七個連接之核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7組成，其中NR1、NR2、NR3、NR4和NR5各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR6係S-cEt核苷，並且NR7係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，R由七個連接之核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7組成，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，並且NR7係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，R由十個連接之核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10組成，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；NR8和NR10各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0。
在某些實施方式中，R由十個連接之核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10組成，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；並且NR8和NR10各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些實施方式中，R由四個連接之核苷NR1-NR2-NR3-NR4組成，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷，並且NR1和NR3各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，R由四個連接之核苷NR1-NR2-NR3-NR4組成，其中NR1係2’-O-甲氧基乙基核苷，NR2和NR4各自是S-cEt核苷，並且NR3係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與miR-122的核鹼基序列(SEQ ID NO：1)至少90%、至少93%、至少94%、至少95%或100%互補。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與miR-122互補，這樣使得SEQ ID NO：1的位置2與該寡核苷酸的3’-末端核鹼基配對。例如：5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3'(miR-122；SEQ ID NO：1)
3'-CCTCACACTGTTACCACA-5'(an anti-miR-122；SEQ ID NO：4)
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與miR-122互補，這樣使得SEQ ID NO：1的位置1與該寡核苷酸之3’-末端核鹼基配對。例如：5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3'(miR-122；SEQ ID NO：1)
3'-ACCTCACACTGTTACC-5'(an anti-miR-122；SEQ ID NO：3)；以及5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3'(miR-122；SEQ ID NO：1)
3'-TCCTCACACTGTTACCACAAAC-5'(an anti-miR-122；SEQ ID NO：6)
在某些實施方式中，至少一個核苷間鍵聯係修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，每個核苷間鍵聯都是經修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，經修飾之核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的至少一個嘧啶包含5-甲基基團。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的至少一個胞嘧啶係5-甲基胞嘧啶。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的每個胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些實施方式中，包含胞嘧啶的每個修飾的核苷酸都包含5-甲基胞嘧啶。在某些實施方式中，包含胞嘧啶的每個2’-O-甲氧基乙基核苷都包含5-甲基胞嘧啶。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列選自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：6，其中每個T獨立地選自T和U。
在某些實施方式中，相對於miR-122之核鹼基序列，該經修飾之寡核苷酸具有0、1、2或3個錯配。在某些實施方式中，相對於miR-122之核鹼基序列，該經修飾之寡核苷酸具有0個錯配。在某些實施方式中，相對於miR-122之核鹼基序列，該經修飾之寡核苷酸具有1個錯配。在某些實施方式中，相對於miR-122之核鹼基序列，該經修飾之寡核苷酸具有2個錯配。
在在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由多於22個連接之核苷組成，並且包含具有核苷型態I的至少8個連接之核苷。除了由核苷型態I描述的該等核苷以外的存在的核苷係經修飾或未經修飾的。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由少於16個連接的核苷組成，並且包含具有核苷型態I的至少8個連接的核苷。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有如在表1中所示的核鹼基序列和修飾。核苷酸和核鹼基指明如下：上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶；後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”之核苷係2’-MOE核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在一些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有如下所示之核鹼基序列和修飾：USTGUSCSACSACSTCSCSAS；或 CSASCSASCSUSCSCS其中後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些此類實施方式中，化合物係38591、38633、38998或38634。
包含共軛物的抗miR-122化合物
在某些實施方式中，在此提供的化合物包含共軛至一個或多個部分之經修飾之寡核苷酸，該一個或多個部分增強該寡核苷酸的活性、細胞分佈和/或細胞攝取。例如，可以藉由使用作為細胞表面受體的配位基的共軛物來實現化合物的細胞攝取增加。共軛至外源分子(例如，藥物)之配位基與它的細胞表面受體結合導致該共軛的分子內化，從而增強該外源分子的跨膜轉運。在此提供的任何該等抗miR-122修飾之寡核苷酸可以連接至一個或多個部分以形成包含共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之化合物。
在某些實施方式中，在此提供的化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之5’末端或3’末端之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之5’末端之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端之第一共軛部分和連接至該經修飾之寡核苷酸的5’末端之第二共軛部分。
在某些實施方式中，共軛部分包含選自以下的至少一個配位基：碳水化合物、膽固醇、脂質、磷脂、抗體、脂蛋白、激素、肽、維生素、類固醇或陽離子性脂質。
配位基可以藉由任何適合的接頭共價連接至經修飾之寡核苷酸上。各種接頭係本領域中已知的，並且例如在PCT公開號WO 2013/033230和美國專利號8,106,022 B2中描述了某些非限制的示例性接頭。在一些實施方式中，可以選擇在體內對酶裂解有抗性的接頭。在一些實施方式中，可以選擇在體內對水解裂解有抗性的接頭。在一些實施方式中，可以選擇將在體內經受酶裂解的接頭。在一些實施方式中，可以選擇將在體內經受水解裂解的接頭。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物具有以下結構：L-X1-Nm-X2-MO；其中每個L係配位基；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。在某些實施方式中，m係1並且X1和X2各自是磷酸二酯。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸之化合物具有結構A：Ln-接頭-MO； 其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸之化合物具有結構B：Ln-接頭-X1-Nm-X2-MO；其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物具有結構C：Ln-接頭-X-Nm-Y-MO；其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修 飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物具有結構D：Ln-接頭-Y-Nm-Y-MO；其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；每個Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在一些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，當n大於1時，該接頭包含能夠將多於一個L連接至該化合物的其餘部分上(即，連接至該經修飾之寡核苷酸(MO)上、連接至X1-Nm-X2-MO上、連接至X-Nm-Y-MO上，等等)之骨架。在一些此類實施方式中，該化合物(如結構A、結構B、結構C或結構D的化合物)的Ln-接頭部分包含結構E： 其中每個L獨立地是配位基；n係從1至10；S係骨架；並且Q’和Q”獨立地是連接基團。
在某些實施方式中，每個Q’和Q”獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。
在某些實施方式中，骨架將2、3、4或5個配位基連接至經修飾之寡核苷酸上。在某些實施方式中，骨架將3個配位基連接至經修飾之寡核苷酸上。
一種非限制性之示例性結構E係結構E(i)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3和R4各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧 基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(ii)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1係H或甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(iii)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(iv)： 其中L1和L2各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2和Q”各自獨立地是連接基團； 並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(v)： 其中L1和L2各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(vi)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(vii)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連 接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基；並且Z和Z’各自獨立地選自O和S。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。在一些實施方式中，至少一個P原子上的Z或Z’係S，並且另一個Z或Z’係O(即，硫代磷酸酯鍵)。在一些實施方式中，每個-OP(Z)(Z’)O-都是硫代磷酸酯鍵。在一些實施方式中，至少一個P原子上的Z和Z’均是O(即，磷酸二酯鍵)。在一些實施方式中，每個-OP(Z)(Z’)O-都是磷酸二酯鍵。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(viii)： 其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3和R4各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6 烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自選自H和甲基。
例如PCT公開號WO 2013/033230；美國專利號8,106,022 B2；美國公開號2012/0157509 A1；美國專利號5,994,517；美國專利號7,491,805 B2；美國專利號8,313,772 B2；馬諾哈蘭馬(Manoharan,M.)，第16章，反義藥物技術(Antisense Drug Technology)，斯汀克魯克(Crooke,S.T.)、馬塞爾德克爾(Marcel Dekker)公司，2001,391-469描述了非限制性的示例性骨架和/或包含骨架的接頭及其合成。
在某些實施方式中，該化合物的Ln-接頭部分包含結構F： 其中：B選自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z- P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；MO係經修飾之寡核苷酸；RN選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基以及苯甲基；Z、Z’和Z”各自獨立地選自O和S；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷；m係從1至5；X選自磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且波形線表明連接至這個或該等接頭和配位基的其餘部分。
在某些實施方式中，波形線表明連接至以上結構E。
在某些實施方式中，n係從1至5、1至4、1至3、或1至2。在某些實施方式中，n係1。在某些實施方式中，n係2。在某些實施方式中，n係3。在某些實施方式中，n係4。在某些實施方式中，n係5。
在某些實施方式中，該化合物的Ln-接頭部分包含結構G： 其中：B選自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-； MO係經修飾之寡核苷酸；RN選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基以及苯甲基；Z、Z’和Z”各自獨立地選自O和S；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷；m係從1至5；X選自磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；每個L獨立地是配位基；n係從1至10；S係骨架；並且Q’和Q”獨立地是連接基團。
在某些實施方式中，每個Q’和Q”獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。化合物的一非限制的示例性Ln-接頭部分(例如，具有結構F或結構G)在以下結構H中示出： 其中波形線表明連接至該經修飾之寡核苷酸(MO)上、例如結構B中的X1上或例如結構C或結構D中的X或Y上。
在某些實施方式中，每個配位基都是碳水化合物。當被細胞表面凝集素識別時，包含碳水化合物共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物轉運穿過細胞膜進入細胞中。在某些實施方式中，細胞表面凝集素係C型凝集素。在某些實施方式中，該C型凝集素存在於枯否細胞(Kuppfer cell)上。在某些實施方式中，C型凝集素存在於巨噬細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在于內皮細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在于單核細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在於白細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在於樹突狀細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在於B細胞上。共軛物可以促進抗miR-122化合物攝取到表現C-型凝集素的任何細胞類型中。
在某些實施方式中，C型凝集素係無唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)。在某些實施方式中，共軛物包含對該ASGPR具有親和性的一個或多個配位基，包括但不限於半乳糖或半乳糖衍生物。在某些實施方式中，對該ASGPR具有親和性的配位基係N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖 胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺或N-異丁醯基半乳糖胺。此類共軛物促進化合物攝取到表現該ASGPR的細胞中，例如肝細胞和樹突狀細胞。
在某些實施方式中，配位基係選自以下的碳水化合物：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-哌喃甘露糖、β-D-哌喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-哌喃葡萄糖、β-D-哌喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-哌喃半乳糖、β-D-哌喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-哌喃核糖、β-D-哌喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-哌喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸以及N-乙醯基半乳糖胺。
在某些實施方式中，配位基選自：N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺以及N-異丁醯基-半乳糖胺。
在某些實施方式中，配位基係N-乙醯基半乳糖胺。
在某些實施方式中，化合物包含以下結構： 其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，化合物包含以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之 核苷，並且m係從1至5；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，化合物包含修飾的核苷酸和共軛部分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL，其中下標“L”表明LNA並且後面沒有下標的核苷係β-D-去氧核糖核苷，並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯，並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸的3’末端並且具有以下結構： 其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。 在一些實施方式中，所有CL核苷都是MeCL核苷，其中上標“Me”表明5-甲基 胞嘧啶。
在一些實施方式中，化合物具有以下結構： 其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，X1和X2中的至少一個係磷酸二酯鍵。在某些實施方式中，X1和X2各自是磷酸二酯鍵。
在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在此描述的任何該等實施方式中，Nm可以是N’pN”，其中每個N’獨立地 是經修飾或未經修飾之核苷，並且p係從0至4；並且N”係包含未經修飾之糖部分的核苷。
在某些實施方式中，p係0。在某些實施方式中，p係1、2、3或4。在某些實施方式中，當p係1、2、3或4時，每個N’包含未經修飾之糖部分。
在某些實施方式中，未經修飾之糖部分係β-D-核糖或β-D-去氧核糖。
在某些實施方式中，在p係1、2、3或4的情況下，N’包含嘌呤核鹼基。在某些實施方式中，N”包含嘌呤核鹼基。在某些實施方式中，嘌呤核鹼基選自：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤以及7-甲基鳥嘌呤。在某些實施方式中，N’係β-D-去氧核糖腺苷或β-D-去氧核糖鳥苷。在某些實施方式中，N”係β-D-去氧核糖腺苷或β-D-去氧核糖鳥苷。
在某些實施方式中，p係1,N’和N”各自是β-D-去氧核糖腺苷，並且N’和N”藉由磷酸二酯核苷間鍵聯連接。在某些實施方式中，p係1,N’和N”各自是β-D-去氧核糖腺苷，並且N’和N”藉由磷酸二酯核苷間鍵聯連接。在某些實施方式中，p係1,N’和N”各自是β-D-去氧核糖腺苷，並且N’和N”藉由硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接。
在某些實施方式中，在p係1、2、3或4的情況下，N’包含嘧啶核鹼基。在某些實施方式中，N”包含嘧啶核鹼基。在某些實施方式中，嘧啶核鹼基選自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氫尿嘧啶。
在某些實施方式中，每個N的糖部分獨立地選自：β-D-核糖、β-D-去氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及雙環糖部分。在某些實施方 式中，每個雙環糖部分獨立地選自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。在某些實施方式中，該cEt糖部分係S-cEt糖部分。在某些實施方式中，該cEt糖部分係R-cEt糖部分。
在某些實施方式中，化合物包含以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，化合物包含以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵；m係2；每個N係β-D-去氧核糖腺苷；N的核苷藉由磷酸二酯核苷間鍵聯連接；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷 酸。
在某些實施方式中，化合物包含修飾的核苷酸和共軛部分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS，其中後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”之核苷係2’-MOE核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯；並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端並且具有以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，化合物包含修飾的核苷酸和共軛部分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL，其中下標“L”表明LNA並且後面沒有下標的核苷係β-D-去氧核糖核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯，並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸的3’末端並且具有以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在一些實施方式中，所有CL核苷都是MeCL核苷，其中上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有如在表2中所示之核鹼基序列和修飾。核苷酸和核鹼基指明如下：上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶；後面沒有下標的核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”的核苷係2’-MOE核苷；後面有下標“S”的核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在某些實施方式中，在此提供的化合物包含經修飾之核苷酸和共軛部分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構CSASCSASCSUSCSCS，其中下標“S”表明S-cEt並且後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯，並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸的3’末端並且具有以下結構： 其中X1和X2係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
用於共軛至經修飾之寡核苷酸的另外的部分包括吩嗪、菲啶、蒽醌、吖啶、螢光素、繞單寧(rhodamine)、香豆素以及染料。在某些實施方式中，共軛基團係直接連接至經修飾之寡核苷酸上。
某些代謝產物
當在體外或體內暴露於核酸外切酶和/或核酸內切酶時，化合物可以經受 在整個化合物的不同位置上之裂解。此種裂解的產物可以保留一定程度的母體化合物之活性，並且因此被認為是活性代謝物。因此，化合物的代謝產物可以用於在此描述的該等方法中。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸(未共軛或共軛的)經受5’末端和/或3’末端上之裂解，從而產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在5’末端和/或3’末端上少1個、2個或3個核苷酸之代謝產物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸經受5’末端上之裂解，釋放5’-末端的核苷酸並且產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在5’末端上少1個核苷酸之代謝產物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸經受5’末端上之裂解，釋放兩個5’-末端的核苷並且產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在5’末端上少兩個核苷酸之代謝產物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸經受3’末端上之裂解，釋放3’-末端的核苷酸並且產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在3’末端上少一個核苷酸的代謝產物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸經受3’末端上之裂解，釋放兩個3’-末端的核苷並且產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在3’末端上少兩個核苷酸之代謝產物。
包含連接至共軛部分的經修飾之寡核苷酸的化合物還可以經受該經修飾之寡核苷酸與配位基之間的接頭內的一位點上之裂解。在某些實施方式中，裂解產生包含一部分共軛部分的母體經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，裂解產生在經修飾之寡核苷酸與配位基之間包含接頭的一個或多個亞單位的母體經修飾之寡核苷酸。例如，在化合物具有結構Ln-接頭-Nm-P-MO的情況下，在一些實施方式中，裂解產生包含Nm的一個或多個核苷酸的母體經 修飾之寡核苷酸。在一些實施方式中，共軛的經修飾之寡核苷酸的裂解產生母體經修飾之寡核苷酸。在一些此類實施方式中，例如，在化合物具有結構Ln-接頭-Nm-P-MO的情況下，在一些實施方式中，裂解產生不包含Nm的任何核苷酸的母體經修飾之寡核苷酸。
某些核鹼基序列
成熟miR-122之核鹼基序列和它的對應莖環序列可在miRBase(在microrna.sanger.ac.uk中找到的微小RNA序列和注釋之可線上搜索數據庫)中找到。該miRBase序列數據庫中的條目代表微小RNA轉錄物的預測的髮夾部分(莖環)，具有成熟微小RNA序列的位置和序列方面的資訊。該數據庫中的該等微小RNA莖環序列不是嚴格地先質微小RNA(先質微小RNA)，並且在一些情況下可以包括先質微小RNA和來自假定的初級轉錄物的一些側翼序列。在此描述的該等微小RNA核鹼基序列涵蓋任何型式的微小RNA，包括在miRBase序列數據庫的發佈版15.0中描述之序列和在miRBase序列數據庫的任何早期發佈版中描述之序列。一序列數據庫發佈版可能引起某些微小RNA重新命名。本發明涵蓋與在此描述的該等微小RNA的任何核鹼基序列型式互補的經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，靶向miR-122的經修飾之寡核苷酸的每個核鹼基都能夠經受與miR-122或其先質的核鹼基序列中的對應位置上的核鹼基進行鹼基配對。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列可以相對於它的靶微小RNA或先質序列具有一個或多個錯配之鹼基對，並且仍保持能夠與 它的靶序列雜交。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有與miR-122先質之核鹼基序列(如miR-122莖環序列)互補之核鹼基序列。當miR-122被包含在miR-122先質序列內時，具有與miR-122互補的核鹼基序列的經修飾之寡核苷酸也與miR-122先質之區互補。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有與SEQ ID NO：1之核鹼基1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、1至21或1至22互補之核鹼基序列。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有與SEQ ID NO：1之核鹼基2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至21或2至22互補之核鹼基序列。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有與SEQ ID NO：1之核鹼基3至17、3至18、3至19、3至20、3至21或3至22互補之核鹼基序列。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接的核苷數小於該miR-122或其先質之長度。在某些此類實施方式中，寡核苷酸具有與miR-122或其先質的區互補之核鹼基序列。具有小於miR-122長度的連接的核苷數之經修飾之寡核苷酸(其中經修飾之寡核苷酸的每個核鹼基與miR-122核鹼基序列中的對應位置上的每個核鹼基互補)被認為是具有與miR-122完全互補的核鹼基序列的經修飾之寡核苷酸。例如，由19個連接的核苷組成的經修飾之寡核苷酸(其中核苷1至19之核鹼基各自與miR-122之對應位置互補，其中miR- 122長度為22個核鹼基)與miR-122的19個連續核鹼基完全互補。這種經修飾之寡核苷酸具有與miR-122的核鹼基序列100%互補之核鹼基序列。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接之核苷數比miR-122的長度小1。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸在5’末端上少一個核苷。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸在3’末端上少一個核苷。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸在5’末端上少兩個核苷。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸在3’末端上少兩個核苷。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的15個連續核鹼基各自與miR-122的15個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的16個連續核鹼基各自與miR-122的16個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的17個連續核鹼基各自與miR-122的17個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的18個連續核鹼基各自與miR-122的18個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的19個連續核鹼基各自與miR-122的19個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的20個連續核鹼基各自與miR-122的20個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的21個連續核鹼基各自與miR-122的21個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的22個連續核鹼基各自與miR-122的22個連續核鹼基互補。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含與種子序列互補之核鹼基序列，即經修飾之寡核苷酸包含種子匹配序列。在某些實施方式中，種子序列 係六聚體種子序列。在某些此類實施方式中，種子序列係miR-122的核鹼基1-6。在某些此類實施方式中，種子序列係miR-122的核鹼基2-7。在某些此類實施方式中，種子序列係miR-122的核鹼基3-8。在某些實施方式中，種子序列係七聚體種子序列。在某些此類實施方式中，七聚體種子序列係miR-122的核鹼基1-7。在某些此類實施方式中，七聚體種子序列係miR-122的核鹼基2-8。在某些實施方式中，該種子序列係八聚體種子序列。在某些此類實施方式中，八聚體種子序列係miR-122的核鹼基1-8。在某些實施方式中，八聚體種子序列係miR-122的核鹼基2-9。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接之核苷數大於miR-122序列的長度。在某些此類實施方式中，另外的核苷之核鹼基與miR-122莖環序列之核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接之核苷數比miR-122的長度大1。在某些此類實施方式中，該另外的核苷係處於經修飾之寡核苷酸之5’末端上。在某些此類實施方式中，該另外的核苷係處於經修飾之寡核苷酸之3’末端上。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接之核苷數比miR-122的長度大2。在某些此類實施方式中，這兩個另外的核苷係處於經修飾之寡核苷酸之5’末端上。在某些此類實施方式中，這兩個另外的核苷係處於經修飾之寡核苷酸之3’末端上。在某些此類實施方式中，一個另外的核苷位於經修飾之寡核苷酸之5’末端上並且一個另外的核苷位於經修飾之寡核苷酸之3’末端上。在某些實施方式中，寡核苷酸的區可以與miR-122之核鹼基序列完全互補，但是整個經修飾之寡核苷酸不與miR-122完全互補。 例如，由23個連接的核苷組成之經修飾之寡核苷酸(其中核苷1至22的核鹼基各自與長度為22個核鹼基的miR-122的對應位置互補)具有與miR-122的核鹼基序列完全互補的22個核苷部分。
在某些實施方式中，化合物包含藉由包含一個或多個核苷的接頭連接至配位基的經修飾之寡核苷酸。出於計算互補性百分比的目的，該接頭的任何另外的核苷都被認為是該接頭的部分而不是該經修飾之寡核苷酸的部分。因此，共軛化合物的經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列可以仍然與miR-122 100%互補，甚至在該接頭包含不與miR-122互補的一個或多個核苷的情況下。
在此列出的該等miR-122核鹼基序列(包括但不限於在實例中和在序列表中找到的那些)與對核酸的任何修飾無關。因此，由SEQ ID NO定義的核酸可以獨立地包含對一個或多個糖部分、對一個或多個核苷間鍵聯和/或對一個或多個核鹼基的一個或多個修飾。
雖然本文件所附序列表將每個核鹼基序列根據需要鑒定為“RNA”或“DNA”，但實際上那些序列可以用化學修飾的任何組合進行修飾。熟習該項技術者將易於領會，如“RNA”或“DNA”這樣的名稱描述經修飾之寡核苷酸在一定程序上是任意的。例如，包含含有2'-OH糖部分和胸腺嘧啶鹼基的核苷的經修飾之寡核苷酸可以被描述為具有修飾的糖(針對DNA的天然2'-H為2'-OH)之DNA或具有修飾的鹼基(針對RNA的天然尿嘧啶為胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))之RNA。
因此，在此提供的核酸序列(包括但不限於序列表中的那些)旨在涵蓋 含有天然或修飾的RNA和/或DNA的任何組合之核酸，包括但不限於具有經修飾之核鹼基的此類核酸。作為實例而不是限制，具有核鹼基序列“ATCGATCG”的經修飾之寡核苷酸涵蓋具有此種核鹼基序列的任何寡核苷酸，無論是經修飾的或未經修飾的，包括但不限於包含RNA鹼基的此類化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些化合物和具有一些DNA鹼基和一些RNA鹼基如“AUCGATCG”的那些化合物以及具有其他修飾之鹼基如“ATmeCGAUCG”之寡核苷酸，其中meC表明5-甲基胞嘧啶。類似地，具有核鹼基序列“AUCGAUCG”的經修飾之寡核苷酸涵蓋具有此種核鹼基序列的任何寡核苷酸，無論是經修飾的或未經修飾的，包括但不限於包含DNA鹼基的此類化合物，如具有序列“ATCGATCG”的那些化合物和具有一些DNA鹼基和一些RNA鹼基如“AUCGATCG”的那些化合物以及具有其他經修飾的鹼基如“ATmeCGAUCG”之寡核苷酸，其中meC表明5-甲基胞嘧啶。
miR-122組合物的某些用途
微小RNA miR-122係肝臟表現的微小RNA，該微小RNA係用於HCV複製的關鍵內源性“宿主因數”，並且靶向miR-122的寡核苷酸阻斷HCV複製(喬普林等人(2005)科學雜誌309,1577-81)。在被丙型肝炎病毒慢性感染的黑猩猩中抑制miR-122降低了HCV RNA水平。在HCV感染的患者中，抑制miR-122引起5個每週劑量抗miR-122化合物之後HCV RNA水平降低平均2個對數。在此描述的該等化合物係miR-122活性之有效抑制劑。因此，這裡提供了用於治療HCV感染之方法，該等方法包括向HCV感染的受 試者給藥在此提供之化合物。
在此提供了用於治療HCV感染的受試者之方法，該等方法包括向該受試者給藥在此提供之化合物。在某些實施方式中，在此提供之該等方法包括選擇HCV感染的受試者。在某些實施方式中，該受試者係人。
在某些實施方式中，該給藥減少了HCV感染的症狀。HCV感染的症狀包括但不限於肝臟疼痛、黃疸、噁心、食欲不振以及疲勞。
在HCV治療方案之後，HCV感染之受試者可能經歷HCV RNA水平降低，接著是HCV RNA水平增加，該後續增加稱為HCV RNA水平回升。在某些實施方式中，在此提供之該等化合物和方法預防HCV RNA水平回升。在某些實施方式中，在此提供之該等化合物和方法延緩HCV RNA水平回升。
HCV RNA水平可以用來診斷HCV感染，監測疾病活性並且監測受試者對治療的反應。在某些實施方式中，給藥在此提供的化合物降低了HCV RNA水平。在某些實施方式中，以足以降低HCV RNA水平之劑量給藥在此的化合物。在某些實施方式中，在此提供的該等方法包括選擇具有每毫升血清大於350,000個拷貝、每毫升血清在350,000個與3,500,000個拷貝之間或每毫升血清大於3,500,000個拷貝的HCV RNA水平的受試者。在某些實施方式中，在此提供的該等方法包括降低HCV RNA水平。在某些實施方式中，在此提供的該等方法包括將HCV RNA水平降低至每毫升血清200個拷貝以下、每毫升血清100個拷貝以下或每毫升血清40個拷貝以下。HCV RNA水 平可以稱為“病毒載量”或“HCV RNA滴度”。
HCV RNA水平的變化可以被描述為對數變化。例如，從60,000下降至600將是HCV RNA水平下降2個對數。在某些實施方式中，在此提供的該等方法實現了大於或等於2個對數之HCV RNA水平降低。在某些實施方式中，在此提供之該等方法實現了HCV RNA水平降低至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.5倍、至少2.0倍或至少2.5倍。
在某些實施方式中，在此提供的該等方法包括實現持續之病毒反應。
HCV感染之受試者可能發展HCV相關性疾病。HCV感染的主要肝臟病學後果係肝硬化及其併發症，包括出血、肝功能不全和肝細胞癌。另外的併發症係纖維化，該纖維化係引起細胞外基質組分沈積的慢性炎症的結果，這導致肝架構變形並且阻斷微循環和肝功能。隨著肝硬化進展和纖維化組織形成，接著發生嚴重的壞死性炎症活性並且脂肪變性開始。脂肪變性導致肝外病變，包括糖尿病、蛋白質營養不良、高血壓、細胞毒素、肥胖以及缺氧。隨著纖維化和脂肪變性變得嚴重，肝將最終衰竭並且需要肝移植。HCV感染的受試者還可能發展肝細胞癌。在某些實施方式中，HCV感染的受試者具有HCV相關性疾病。在某些實施方式中，該HCV相關性疾病係肝硬化、纖維化、脂肪性肝炎、脂肪變性和/或肝細胞癌。
在某些實施方式中，HCV感染的受試者具有一種或多種疾病。在某些實施方式中，HCV感染的受試者被除HCV以外的一種或多種病毒感染。在某些實施方式中，HCV感染的受試者被人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
在此提供的該等化合物可以與一種或多種另外的治療劑同時給藥。在某些實施方式中，該一種或多種另外的治療劑包括：免疫療法、免疫調節劑、治療性疫苗、抗纖維化劑、抗炎劑、支氣管擴張劑、粘液溶解劑、抗毒蕈鹼劑、抗白三烯劑、細胞粘附抑制劑、抗氧化劑、細胞因數激動劑、細胞因數拮抗劑、肺表面活性劑、抗微生物劑、抗病毒劑、抗HCV劑、抗癌劑、抗miR-122化合物、RNAi劑或親環蛋白抑制劑。
在某些實施方式中，該一種或多種另外的治療劑可以選自：蛋白酶抑制劑、聚合酶抑制劑、輔助因數抑制劑、RNA聚合酶抑制劑、結構蛋白抑制劑、非結構蛋白抑制劑、親環蛋白抑制劑、進入抑制劑、TLR7激動劑以及干擾素。
在某些實施方式中，該另外的治療劑係具有結構CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL之經修飾之寡核苷酸，其中後面沒有下標的核苷表明β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“L”的核苷表明LNA核苷；並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方式中，治療劑係GalNAc共軛的CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL。在一些實施方式中，所有該等CL核苷都是MeCL核苷，其中上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶。
在某些實施方式中，該另外的治療劑選自：蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS3/4A抑制劑、核苷NS5B抑制劑、核苷酸NS5B抑制劑、非核苷NS5B抑制劑、親環蛋白抑制劑以及干擾素。
在某些實施方式中，該另外的治療劑選自：干擾素α-2a、干擾素α-2b、 干擾素αcon-1、聚乙二醇干擾素α-2b、聚乙二醇干擾素α-2a、緩釋的干擾素-α-2b、干擾素λ、索菲布韋、利巴韋林、特拉普韋、波普瑞韋、伐尼普韋、阿森那普韋、利托那韋、斯約伯韋、迪卡拉斯他韋、斯密普韋、阿拉泊韋、麥瑞斯他濱、替格布韋、丹諾普韋、索伐普韋以及尼塞普韋。在某些實施方式中，該另外的治療劑選自帕拉德福韋(faldaprevir)、ABT-450、MK-5172、麥瑞斯他濱、雷迪帕韋(ledipasvir)、歐姆比斯他韋(ombitasvir)、GS-5816、MK-8742、達撒布韋(dasabuvir)、BMS-791325以及ABT-072。
在某些實施方式中，該另外的治療劑選自：干擾素、利巴韋林和特拉普韋。在某些實施方式中，該干擾素選自：干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素αcon-1、聚乙二醇干擾素α-2b以及聚乙二醇干擾素α-2a。
在某些實施方式中，該另外的治療劑包括聚乙二醇干擾素α-2b和利巴韋林。例如，受試者可以接受包含在此提供的化合物、聚乙二醇干擾素α-2b和利巴韋林的療法。在某些實施方式中，該至少一種另外的治療劑包括聚乙二醇干擾素α-2a和利巴韋林。例如，受試者可以接受包含在此提供之化合物、聚乙二醇干擾素α-2a和利巴韋林的療法。在某些實施方式中，該等另外的治療劑係歐姆比斯他韋和ABT-450。在某些實施方式中，該等另外的治療劑係阿森那普韋、迪卡拉斯他韋和BMS-791325。在某些實施方式中，該等另外的治療劑係索菲布韋和雷迪帕韋。在某些實施方式中，該等另外的治療劑係MK-8742和MK-5172。
接受特定療法(例如干擾素或利巴韋林療法)的某些受試者可能不經歷 顯著的或治療上有益的HCV RNA水平降低。此類受試者可以獲益於給藥一種或多種另外的治療劑。在某些實施方式中，在此提供的該等方法的受試者係無反應者。在某些實施方式中，受試者係干擾素無反應者。在某些實施方式中，受試者係直接作用型抗病毒性無反應者。
在某些實施方式中，另外的治療劑係在治療HIV感染中使用之抗病毒劑。在某些實施方式中，另外的治療劑係非核苷逆轉錄酶抑制劑(NNRTI)。在某些實施方式中，另外的治療劑係核苷逆轉錄酶抑制劑(NRTI)。在某些實施方式中，另外的治療劑係蛋白酶抑制劑。在某些實施方式中，另外的治療劑係進入抑制劑或融合抑制劑。在某些實施方式中，另外的治療劑係整合酶抑制劑。在某些實施方式中，另外的治療劑選自：依法韋侖、依曲韋林、奈韋拉平、阿巴卡韋、恩曲他濱、替諾福韋、拉米夫定、齊多夫定、阿紮那韋、地瑞那韋、福沙那韋、利托那韋、恩夫韋地、馬拉威諾以及雷特格韋。
被HCV感染的受試者可能經歷異常肝功能，該異常肝功能藉由測量膽紅素、白蛋白和凝血酶原時間中的一種或多種來評價。進行該等肝酶(丙胺酸轉胺酶(ALT)和天冬胺酸轉胺酶(AST))之測量來評價肝臟炎症。該等標記物的一種或多種異常水平可以表明異常肝功能。在某些實施方式中，在此提供的該等方法包括使肝功能正常化。在某些實施方式中，在此提供的該等方法包括使肝酶水平正常化。
在此提供的任何該等方法中，化合物可以存在於藥物組合物中。
在此提供的該等化合物可以用於療法。在某些實施方式中，化合物用於治療HCV感染的受試者。在某些實施方式中，受試者係人。在某些實施方式中，用於治療HCV感染的受試者之化合物可以用於在此描述的任何治療方法。
在此提供了包括向患有miR-122相關性病狀的受試者給藥在此提供的化合物之方法。在某些實施方式中，miR-122相關性病狀係HCV感染。
在某些實施方式中，miR-122相關性病狀係膽固醇升高。在某些實施方式中，向受試者給藥抗miR-122化合物引起血清膽固醇降低。因此，在某些實施方式中，在此提供了降低受試者的膽固醇之方法，該等方法包括向受試者給藥在此提供的化合物。在某些實施方式中，膽固醇水平可以單獨地或結合另一種效力指示劑(例如，HCV RNA水平降低)用作評價在此提供之抗miR-122化合物的活性之生物標記物。因此，在此提供了包含向受試者給藥在此提供之化合物、從該受試者收集血液樣品並且測量來自該受試者的血液樣品中的膽固醇之方法。膽固醇之水平可以用作該受試者體內的抗miR-122化合物活性之指示劑。
在某些實施方式中，miR-122相關性病狀係脂肪變性。因此，在某些實施方式中，在此提供了減少受試者的脂肪變性之方法，該等方法包括向該受試者給藥在此提供之化合物。
在某些實施方式中，miR-122相關性病狀係鐵負載過高病症。鐵負載過高病症可以因為引起身體吸收過量鐵的基因突變而發生。鐵負載過高病症還 可以具有非基因病因，包括但不限於長期輸血、慢性肝炎或攝入過量鐵。在某些實施方式中，鐵負載過高病症選自輸血鐵負載過高、膳食鐵負載過高、遺傳性血色病、鐮形細胞貧血病、地中海貧血、伴X染色體的鐵粒幼紅細胞性貧血、丙酮酸激酶缺乏症以及葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶缺乏症。在某些實施方式中，鐵負載過高病症係選自以下的遺傳性血色病：1型血色病、2A型血色病、2B型血色病、3型血色病、4型血色病(或膜鐵轉運蛋白疾病)、亞洲血色病、新生兒血色病、遺傳性銅藍蛋白缺乏症以及缺轉鐵蛋白血。在某些實施方式中，向患有鐵負載過高病症的受試者給藥在此提供的化合物引起該受試者身體體內的過量鐵減少。
某些修飾
經修飾之寡核苷酸可以包含對核鹼基、糖和/或核苷間鍵聯的一種或多種修飾。可以因為希望的特性(例如像細胞攝取增強、對其他寡核苷酸或核酸靶標的親和性增強以及在核酸酶存在下的穩定性增加)選擇修飾之核鹼基、糖和/或核苷間鍵聯優先於未修飾之形式。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含一種或多種修飾的核苷。在某些實施方式中，經修飾之核苷係穩定性核苷。穩定性核苷的一個實例係2’-修飾的核苷。
在某些實施方式中，經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，包含經修飾之糖部分之經修飾之核苷包含未經修飾之核鹼基。在某些實施方式中，經修飾之糖包含經修飾之核鹼基。在某些實施方式中，經修飾 之核苷係2’-修飾之核苷。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷包含雙環糖部分。在某些此類實施方式中，該雙環糖部分係呈α構型之D糖。在某些此類實施方式中，該雙環糖部分係呈β構型之D糖。在某些此類實施方式中，該雙環糖部分係呈α構型之L糖。在某些此類實施方式中，該雙環糖部分係呈β構型之L糖。
在某些實施方式中，該雙環糖部分在2'碳原子與4'碳原子之間包含橋聯基團。在某些此類實施方式中，該橋聯基團包含1至8個連接的雙基團。在某些實施方式中，該雙環糖部分包含1至4個連接的雙基團。在某些實施方式中，該雙環糖部分包含2個或3個連接之雙基團。在某些實施方式中，該雙環糖部分包含2個連接之雙基團。此類4’至2’糖取代基的實例包括但不限於：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'；4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)和4'-C-H(CH2OCH3)-O-2'及其類似物(參見，例如於2008年7月15日頒予的美國專利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其類似物(參見，例如於2009年1月8日公佈的WO 2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其類似物(參見，例如於2008年12月11日公佈的WO 2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見，例如於2004年9月2日公佈的US 2004/0171570)；4'-CH2-O-N(R)-2和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每個R獨立地是H、保護基團或C1-C12烷基；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R係H、C1-C12烷基或保護基團(參見，於2008年9月23日頒予的美國專利 7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見，例如查多帕迪亞亞(Chattopadhyaya)等人，有機化學雜誌(J.Org.Chem.),2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(=CH2)-2'及其類似物(參見，於2008年12月8日公佈的公佈PCT國際申請WO 2008/154401)。
在某些實施方式中，此類4’至2’橋聯獨立地包含1個或2至4個連接的基團，該等連接的基團獨立地選自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-C(=NRa)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(=O)x-以及-N(Ra)-；其中：X係0、1或2；n係1、2、3或4；每個Ra和Rb獨立地是H、保護基團、羥基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、雜環基、取代的雜環基、雜芳基、取代的雜芳基、C5-C7脂環基、取代的C5-C7脂環基、鹵素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、醯基(C(=O)-H)、取代的醯基、CN、磺醯基(S(=O)2-J1)或亞磺醯基(S(=O)-J1)；並且每個J1和J2獨立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、醯基(C(=O)-H)、取代的醯基、雜環基、取代的雜環基、C1-C12胺基烷基、取代的C1-C12胺基烷基、或保護基團。
包含雙環糖部分之核苷稱為雙環核苷或BNA。在某些實施方式中，雙環核苷包括但不限於如下所描繪的(A)α-L-亞甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亞甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)伸乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)胺基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧基胺基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亞甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(又稱為約束的乙基或cEt)；(G)亞甲基硫代(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亞甲基-胺基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳環(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)c-MOE(4’-CH2-OMe-2’)BNA以及(K)、伸丙基碳環(4’-(CH2)3-2’)BNA。
其中Bx係核鹼基部分，並且R獨立地是H、保護基團或C1-C12烷基。
在某些實施方式中，2’-修飾的核苷包含選自以下的2'-取代基：鹵基、烯 丙基、胺基、疊氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-、S-或N(Rm)-烷基；O-、S-或N(Rm)-烯基；O-、S-或N(Rm)-炔基；O-亞烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)，其中每個Rm和Rn獨立地是H、胺基保護基團或取代或未取代的C1-C10烷基。該等2'-取代基可以進一步被獨立地選自以下的一個或多個取代基取代：羥基、胺基、烷氧基、羰基、苯甲基、苯基、硝基(NO2)、硫醇基、硫代烷氧基(S-烷基)、鹵素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷包含選自以下的2’-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O-CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH=CH2、O-CH2-CH=CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及N-取代的乙醯胺(O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn))，其中每個Rm和Rn獨立地是H、胺基保護基團或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷包含選自以下的2’-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及O-CH2-C(=O)-N(H)CH3。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷包含選自以下的2’-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷係4’-硫代修飾之核苷。在某些實施方 式中，2’-修飾之核苷係4’-硫代-2’-修飾之核苷。4'-硫代修飾之核苷具有β-D-核糖核苷，其中4'-O被4'-S替代。4'-硫代-2'-修飾之核苷係2'-OH置換為2'-取代基的4'-硫代修飾之核苷。適合的2'-取代基包括2'-OCH3、2'-O-(CH2)2-OCH3和2'-F。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含一種或多種核苷間修飾。在某些此類實施方式中，經修飾之寡核苷酸的每個核苷間鍵聯係修飾的核苷間鍵聯。在某些實施方式中，經修飾之核苷間鍵聯包含磷原子。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在某些實施方式中，經修飾之核苷間鍵聯不包含磷原子。在某些此類實施方式中，核苷間鍵聯由短鏈烷基核苷間鍵聯形成。在某些此類實施方式中，核苷間鍵聯由環烷基核苷間鍵聯形成。在某些此類實施方式中，核苷間鍵聯由混合的雜原子與烷基核苷間鍵聯形成。在某些此類實施方式中，核苷間鍵聯由混合的雜原子與環烷基核苷間鍵聯形成。在某些此類實施方式中，核苷間鍵聯由一個或多個短鏈雜原子核苷間鍵聯形成。在某些此類實施方式中，核苷間鍵聯由一個或多個雜環核苷間鍵聯形成。在某些此類實施方式中，核苷間鍵聯具有醯胺骨架。在某些此類實施方式中，核苷間鍵聯具有混合的N、O、S和CH2組分部分。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含一個或多個經修飾之核鹼 基。在某些實施方式中，經修飾之核鹼基選自7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、2-胺基吡啶以及2-吡啶酮。在某些實施方式中，經修飾之核鹼基選自：5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些實施方式中，經修飾之核鹼基包含多環雜環。在某些實施方式中，經修飾之核鹼基包含三環雜環。在某些實施方式中，經修飾之核鹼基包含吩衍生物。在某些實施方式中，該吩可以進一步被修飾以形成本領域中稱為G-夾之核鹼基。
在某些此類實施方式中，該化合物包含具有一個或多個穩定性基團的經修飾之寡核苷酸，該一個或多個穩定性基團連接至經修飾之寡核苷酸的一個或兩個末端以增強例如像核酸酶穩定性的特性。穩定性基團中包括帽結構。該等末端修飾保護經修飾之寡核苷酸免受核酸外切酶降解，並且可以幫助遞送和/或定位在細胞內。該帽可以存在於5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)，或可以存在於這兩個末端上。帽結構包括例如反向去氧無鹼基帽。
適合之帽結構包括：4',5'-亞甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳環核苷酸、1,5-脫水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修飾的鹼基核苷酸、二硫代磷酸酯鍵、蘇式呋喃戊糖基核苷酸、無環3',4'-開環核苷酸、無環3,4-二羥基丁基核苷酸、無環3,5-二羥基戊基核苷酸、3'-3'-反向核苷酸部分、3'-3'-反向無鹼基部分、3'-2'-反向核苷酸部分、3'-2'-反向無鹼基 部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-胺基磷酸酯、己基磷酸酯、胺基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯之甲基磷酸酯部分和非橋聯之甲基磷酸酯部分5'-胺基-烷基磷酸酯、1,3-二胺基-2-丙基磷酸酯、3-胺基丙基磷酸酯、6-胺基己基磷酸酯、1,2-胺基十二烷基磷酸酯、羥基丙基磷酸酯、5'-5'-反向核苷酸部分、5'-5'-反向無鹼基部分、5'-胺基磷酸酯、5'-硫代磷酸酯、5'-胺基、橋聯和未橋聯的5'-胺基磷酸酯、硫代磷酸酯以及5'-巰基部分。
某些合成方法
可以使用本領域中已知的自動化固相合成方法來制得經修飾之寡核苷酸。在固相合成過程中，亞磷醯胺單體依次與共價連接至固體載體上的核苷偶聯。此核苷係該經修飾之寡核苷酸的3’末端核苷。典型地，該偶聯循環包括四步：脫三苯甲基(用酸去除5’-羥基保護基團)、偶聯(將活化的亞磷醯胺連接至載體結合的核苷或寡核苷酸)、氧化或硫化(用氧化劑或硫化劑轉化新形成之亞磷酸三酯)，並且加帽(乙醯化未反應之5’-羥基)。在最後的偶聯循環之後，使該固體載體結合的寡核苷酸經受脫三苯甲基步驟，接著是裂解和去保護步驟，該裂解和去保護步驟同時使寡核苷酸從固體載體上釋放並且使保護基團從鹼基上去除。藉由過濾去除固體載體，濃縮濾液並且測試所得到的溶液的特性和純度。然後例如使用填充有陰離子交換樹脂的柱來純化寡核苷酸。
可以使用與產生未共軛的寡核苷酸的固相合成類似的自動固相合成來制得GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸。在合成GalNAc共軛的寡核苷酸過程 中，該等亞磷醯胺單體依次與共價連接至固體載體上的GalNAc共軛物偶聯。GalNAc共軛物和GalNAc共軛物固體載體的合成例如在美國專利號8,106,022和國際申請公開號WO 2013/033230中描述，為了描述含碳水化合物之共軛物(包括包含一個或多個GalNAc部分的共軛物)的合成和共價連接至固體載體上的共軛物的合成，每個該等參考文件藉由引用以其全部內容結合在此。
某些藥物組合物
在此提供的任何該等化合物都可以製備成藥物組合物。在某些實施方式中，以劑量單位(例如，片劑、膠囊、大丸劑等等)的形式給藥藥物組合物。在一些實施方式中，藥物組合物包含選自以下範圍內之劑量之在此提供之化合物：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg以及400mg至600mg。在某些實施方式中，此類藥物組合物包含以選自以下的劑量存在的在此提供之化合物：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210 mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg以及800mg。在某些此類實施方式中，藥物組合物包含選自以下的劑量的在此提供之化合物：25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg以及800mg。
在某些實施方式中，藥物組合物包含在以下劑量下給藥的在此提供之化合物：10mg/kg或更少、9mg/kg或更少、8mg/kg或更少、7.5mg/kg或更 少、7mg/kg或更少、6.5mg/kg或更少、6mg/kg或更少、5.5mg/kg或更少、5mg/kg或更少、4.5mg/kg或更少、4mg/kg或更少、3.5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、2.5mg/kg或更少、2mg/kg或更少、1.5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.75mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.25mg/kg或更少。
在某些實施方式中，藥劑係用適合的稀釋劑(例如，注射用無菌水或注射用無菌鹽水)復原的無菌凍乾化合物。在稀釋到鹽水中之後，復原的產品以皮下注射或靜脈內輸注形式給藥。凍乾之藥物產品由化合物組成，該化合物已在注射用水中或在注射用鹽水中製備，在製備過程中用酸或鹼調節至pH 7.0-9.0，並且然後凍乾。凍乾之化合物可以是25mg至800mg的寡核苷酸。應當理解，這涵蓋了25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg以及800mg的經修飾之凍乾寡核苷酸。此外，在一些實施方式中，凍乾之化合物以在以下範圍內之量存在：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg、或400mg至600mg。凍乾的藥物產品可以被包裝在 2mL I型透明玻璃小瓶(經過硫酸銨處理的)中，用溴丁基橡膠封閉件塞住並且用鋁FLIP-OFF®密封件密封。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含治療有效量之化合物。在某些實施方式中，該治療有效量足以預防、緩解或改善疾病的症狀或延長正治療的受試者之存活期。確定治療有效量完全處於熟習該項技術者之能力之內。
在某些實施方式中，在此提供的該等藥物組合物可以另外包含其他本領域熟知用量的在藥物組合物中常規存在之輔助組分。因此，例如該等組合物可以包含另外的、可相容的藥物活性材料，例如像止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可以包含對物理配製本發明該等組合物之各種劑型有用的另外的材料，如染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩定劑。然而，當添加此類材料時，它們不應當過度干擾本發明的該等組合物的組分的生物活性。可以對該等配製品進行滅菌並且必要時與助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、用於影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色物質、芳香物質和/或芬芳物質等進行混合，該等助劑不與該配製品中的這個或該等寡核苷酸發生有害的相互作用。
脂質部分已用於各種方法中的核酸療法中。在一方法中，核酸被引入到預形成的脂質體或由陽離子性脂質與中性脂質之混合物製成的脂質複合物中。在另一個方法中，在沒有中性脂質存在的情況下形成與單陽離子性脂質或聚陽離子性脂質的DNA複合物。在某些實施方式中，選擇脂質部分來增加 藥劑向特定細胞或組織之分佈。在某些實施方式中，選擇脂質部分來增加藥劑向脂肪組織之分佈。在某些實施方式中，選擇脂質部分來增加藥劑向肌肉組織之分佈。
在某些實施方式中，使用英脫利匹特(INTRALIPID)來製備包含寡核苷酸的藥物組合物。英脫利匹特係製備用於靜脈內給藥之脂肪乳液。它由10%大豆油、1.2%蛋黃磷脂、2.25%甘油以及注射用水組成。另外，添加氫氧化鈉以調節pH使得最終產品pH範圍係6至8.9。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含聚胺化合物或與核酸複合的脂質部分。此類製備描述在PCT公佈WO/2008/042973中，為了揭露脂質製備該文獻藉由引用以其全部內容結合在此。某些另外的製備描述在埃克裡克(Akinc)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)26,561-569(2008年5月1日)中，為了揭露脂質製備，該參考文件藉由引用以其全部內容結合在此。
在某些實施方式中，在此提供之多種藥物組合物包含一種或多種化合物和一種或多種賦形劑。在某些此類實施方式中，賦形劑選自：水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、澱粉酶、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素以及聚乙烯吡咯啶酮。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物使用已知的技術，包括但不限於混合、溶解、造粒、制糖丸、粉碎、乳化、囊封、截留或壓片工藝來製備。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物係液體(例如，混懸液、酏劑和/或溶液)。在某些此類實施方式中，液體藥物組合物使用本領域已知的成分，包括但不限於水、二醇、油、醇、芳香劑、防腐劑以及著色劑來製備。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物係固體(例如，散劑、片劑和/或膠囊)。在某些此類實施方式中，包含一種或多種寡核苷酸的固體藥物組合物使用本領域已知的成分，包括但不限於澱粉、糖、稀釋劑、粒化劑、潤滑劑、粘合劑以及崩解劑來製備。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物被配製成儲積型(depot)製劑。某些此類儲積型製劑典型地比非儲積型製劑作用更長。在某些實施方式中，此類製劑藉由植入(例如，皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射來給藥。在某些實施方式中，儲積型製劑使用適合的聚合材料或疏水材料(例如，可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂或作為微溶性衍生物(例如作為微溶性鹽)來製備。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含遞送系統。遞送系統的實例包括但不限於脂質體和乳液。某些遞送系統適用於製備某些藥物組合物，包括包含疏水化合物的那些組合物。在某些實施方式中，使用了某些有機溶劑，如二甲亞碸。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含被設計成將在此提供的一種或多種化合物遞送至特定組織或細胞類型的一種或多種組織特異性遞送 分子。例如，在某些實施方式中，藥物組合物包括塗有組織特異性抗體的脂質體。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含共溶劑系統。某些此類共溶劑系統包含例如苯甲醇、非極性表面活性劑、水不可混溶的有機聚合物以及水相。在某些實施方式中，此類共溶劑系統用於疏水化合物。這種共溶劑系統的一個非限制性實例係VPD共溶劑系統，該VPD共溶劑系統係包含3% w/v苯甲醇、8% w/v非極性表面活性劑聚山梨醇酯80TM和65% w/v聚乙二醇300的無水乙醇溶液。此類共溶劑系統中的比例可以在不顯著改變它們溶解性和毒性特徵情況下大幅度改變。此外，共溶劑組分之特性可以改變：例如，可以使用其他表面活性劑代替聚山梨醇酯80TM；聚乙二醇的部分大小可以改變；其他生物可相容聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯啶酮；並且其他糖或多糖可以取代葡萄糖。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含持續釋放系統。這種持續釋放系統的一非限制性實例係固體疏水聚合物之半滲透基質。在某些實施方式中，持續釋放系統可以取決於它們化學性質在數小時、數天、數週或數月的時間裡釋放藥劑。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物被製備用於口服給藥。在某些此類實施方式中，藥物組合物藉由將包含經修飾之寡核苷酸的一種或多種化合物與一種或多種藥學上可接受的載劑組合來配製。某些此類載劑能夠使藥物組合物配製成用於由受試者口服攝入的片劑、大丸劑、糖衣丸、膠囊、 液體、凝膠、糖漿、漿料、混懸劑等。在某些實施方式中，用於口服使用的藥物組合物藉由將寡核苷酸與一種或多種固體賦形劑混合來獲得。適合的賦形劑包括但不限於：填充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素製劑，例如像玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、土豆澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。在某些實施方式中，可隨意地研磨這種混合物並且可隨意地添加助劑。在某些實施方式中，使藥物組合物成形以獲得片劑或糖衣丸芯。在某些實施方式中，添加崩解劑(例如，交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉)。
在某些實施方式中，糖衣丸芯具有塗層。在某些此類實施方式中，可以使用濃縮的糖溶液，該等濃縮的糖溶液可以可隨意地包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液以及適合的有機溶劑或溶劑混合物。可以將染料或顏料添加至片劑或糖衣丸塗層中。
在某些實施方式中，用於口服給藥的藥物組合物係由明膠製成的推入配合膠囊。某些此類推入配合膠囊包含與一種或多種填充劑如乳糖、粘合劑如澱粉和/或乳化劑如滑石或硬脂酸鎂以及可隨意地穩定劑相混合的本發明的一種或多種藥劑。在某些實施方式中，用於口服給藥的藥物組合物係由明膠和增塑劑(如甘油或山梨醇)製成的軟密封膠囊。在某些軟膠囊中，本發明的一種或多種藥劑被溶解或懸浮在適合的液體中，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，可以添加穩定劑。
在某些實施方式中，藥物組合物被製備用於經頰給藥。某些此類藥物組合物係以常規方式配製的片劑或錠劑。
在某些實施方式中，藥物組合物被製備用於藉由注射(例如，靜脈內、皮下、肌肉內等)來給藥。在某些此類實施方式中，藥物組合物包含載劑並且被配製在水溶液中，如水或生理上相容的緩衝液如漢克斯溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液。在某些實施方式中，包括其他成分(例如，幫助溶解或充當防腐劑的成分)。在某些實施方式中，使用適當的液體載劑、懸浮劑等來製備可注射混懸液。某些注射用藥物組合物以單位劑型存在，例如在安瓿中或在多劑量容器中。某些注射用藥物組合物係油性或水性媒介物中的混懸液、溶液或乳液，並且可以包含配製劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。適合用於注射用藥物組合物的某些溶劑包括但不限於：親脂性溶劑和脂肪油，如芝麻油；合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；以及脂質體。水性注射混懸液可以包含增加該混懸液的粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。可隨意地，此類混懸液還可以包含適合的穩定劑或增加藥劑溶解性以允許製備高濃度溶液的試劑。
在某些實施方式中，藥物組合物被製備用於透粘膜給藥。在某些此類實施方式中，在配製品中使用了適合於透過屏障的滲透劑。此類滲透劑通常是本領域中已知的。
在某些實施方式中，在此提供的一種或多種經修飾之寡核苷酸以前藥形式給藥。在某些實施方式中，當體內給藥時，前藥以化學或酶促方式轉化為 寡核苷酸的生物學上、藥學上或治療上更有活性之形式。在某些實施方式中，前藥係有用的，因為它們比對應的活性形式更容易給藥。例如，在某些情況下，前藥可以是比對應的活性形式更具有可生物利用性(例如，藉由口服給藥)。在某些實施方式中，前藥具有優良的跨細胞膜傳輸。在某些實施方式中，前藥有利於經修飾之寡核苷酸遞送至所希望之細胞類型、組織或器官。在某些實施方式中，前藥係包含共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物。在某些實施方式中，與對應活性形式相比，前藥可以具有提高的溶解性。在某些實施方式中，前藥比對應的活性形式的水溶性小。在某些實施方式中，前藥係酯。在某些此類實施方式中，當給藥時，該酯被代謝水解成羧酸。在某些情況下，含有羧酸的化合物係對應的活性形式。在某些實施方式中，前藥包含結合至酸基團之短肽(聚胺基酸)。在某些此類實施方式中，當給藥時，該肽裂解以形成對應的活性形式。在某些實施方式中，藉由修飾藥物活性化合物以使得該活性化合物在體內給藥時將再生來產生前藥。該前藥可以被設計成改變藥物的代謝穩定性或運輸特徵，掩蔽副作用或毒性，改進藥物的香味或改變藥物的其他特徵或特性。憑藉體內的藥物動力學過程和藥物代謝的知識，熟習該項技術者一旦已知藥物活性化合物，就可以設計該化合物的前藥(參見，例如諾甘地(Nogrady)(1985)藥物化學A生物化學方法(Medicinal Chemistry A Biochemical Approach)，牛津大學出版，紐約，第388-392頁)。
某些給藥途徑
在某些實施方式中，向受試者給藥包括腸胃外給藥。在某些實施方式中，向受試者給藥包括靜脈內給藥。在某些實施方式中，向受試者給藥包括皮下給藥。
在某些實施方式中，向受試者給藥包括動脈內、肺部、口服、直腸、透粘膜、腸內、小腸內、局部、透皮、栓劑、鞘內、心室內、腹膜內、鼻內、眼內、肌肉內、髓內以及瘤內給藥。
某些miR-122試劑盒
本發明還提供了試劑盒。在一些實施方式中，試劑盒包含在此提供的一種或多種化合物。在一些實施方式中，在此提供的化合物存在於小瓶內。在例如分配包裝中可以存在多個小瓶，如10個。在一些實施方式中，小瓶製造成注射器可接近。試劑盒還可以包含在此提供的該等化合物的使用說明書。
在一些實施方式中，該等試劑盒可以用於向受試者給藥在此提供的化合物。在此類情況下，除了包含在此提供的至少一種化合物以外，該試劑盒可以進一步包括以下中的一個或多個：注射器、酒精棉簽、棉球和/或紗布墊。在一些實施方式中，與miR-122互補的該等化合物可以存在於預填充注射器(如具有例如帶針保護器的27號、½英吋針頭之單劑量注射器)中，而不是小瓶中。在例如分配包裝中可以存在多個預填充注射器，如10個。試劑盒還可以包含在此提供的化合物的給藥說明書。
某些實驗模型
在某些實施方式中，本發明提供了在實驗模型中使用和/或測試在此提供 的化合物之方法。熟習該項技術者能夠選擇和修改用於該等實驗模型的方案以評估在此提供之化合物。
在給藥抗miR化合物之後反義抑制微小RNA之作用可以藉由本領域已知的各種方法來評價。在某些實施方式中，該等方法用來定量體外或體內細胞或組織中之微小RNA水平。在某些實施方式中，藉由微陣列分析來測量微小RNA水平之變化。在某些實施方式中，藉由若干商業上可獲得的PCR測定之一如TaqMan®微小RNA測定(應用生物系統，生命科技品牌)來測量微小RNA水平之變化。
可以使用螢光素酶細胞培養測定來評價抗miR化合物之體外活性。在這個測定中，微小RNA螢光素酶感測器構建體被工程改造成包含融合至螢光素酶基因的相關微小RNA的一個或多個結合位點。當微小RNA結合該螢光素酶感測器構建體中它的同源位點時，螢光素酶表現被壓制。當將適當的抗miR引入到細胞中時，它結合靶微小RNA並且解除螢光素酶表現的壓制。因此，在這個測定中，作為相關微小RNA的有效抑制劑的抗miR將引起螢光素酶表現增加。
可以藉由測量微小RNA的靶標的mRNA和/或蛋白質水平來評價抗miR化合物之活性。微小RNA結合一個或多個靶RNA內的互補位點，導致靶RNA被壓制，因此抑制微小RNA引起該微小RNA的靶標的mRNA和/或蛋白質之水平增加(即，去阻抑)。可以在體內或體外測量一個或多個靶RNA之去阻抑。例如，miR-122的靶標係醛縮酶A(ALDOA)。抑制miR-122引 起ALDOA mRNA之水平增加，因此ALDOA mRNA水平可以用來評估抗miR-122化合物之抑制活性。
可以在HCV複製子測定中測量抗miR-122化合物對HCV複製之作用。在這個測定中，化合物被引入到細胞系(例如，人肝細胞癌細胞系)中，該細胞系包含具有穩定的螢光素酶報導體和三個細胞培養適應突變(luc-ubi-neo/ET)的HCV的亞基因組複製子。該螢光素酶報導體用作HCV複製的間接指標。所使用的複製子可以是親本HCV基因型或具有賦予抗病毒劑抗性的突變之HCV基因型。可以單獨地或與用於治療HCV感染的其他藥劑組合來評估抗miR-122化合物。在一些實施方式中，可以在體內或體外測定中測試經修飾之寡核苷酸，並且隨後共軛以形成用於在此描述的該等方法中使用的化合物。
實例
提出以下實例以便更完全地說明本發明的一些實施方式。然而，該等實例決不應當解釋為對本發明寬泛範圍之限制。
熟習該項技術者將易於在不背離本發明精神情況下，採用本發現的基本原理來設計各種化合物。
實例1：抗miR-122化合物的設計和評估
為了鑒定miR-122的有效抑制劑，設計和合成了許多抗miR-122修飾之寡核苷酸。該等經修飾之寡核苷酸在長度以及在雙環核苷和非雙環核苷的數目、位置以及特性上不同。在許多測定中評估該等化合物以鑒定出作為適用 於治療HCV感染的治療劑之抗miR。以反復的方式進行該等化合物的評估，其中藉由設計變化進一步優化高度活性之化合物，並且接著使得到的化合物受到另外的篩選。化合物評估過程包括評價效力、安全性以及物理化學特徵。
在第一螢光素酶細胞培養活性測定中，總共設計和測試了超過400種抗miR-122修飾之寡核苷酸。在另一個螢光素酶測定之後並且為了測量某些化合物的代謝穩定性，選擇大約70種該等化合物用於進一步體內測試。這70種化合物中大約有10種化合物被鑒定為具有適合之體內效力(例如，小於5mg/kg的ED50)。該等化合物的一子集被鑒定為在齧齒動物和非人靈長類動物中具有特定安全性特徵。因此，篩選的數百種化合物中，僅初始超過400種化合物中的一小子集滿足某些效力、安全性以及物理化學標準。
某些抗miR-122化合物在表A中示出。“miR-122上之位置”係從5’末端SEQ ID NO：1計數，在該列中的核苷與SEQ ID NO：1互補之位置。
糖部分指明如下：後面沒有下標的核苷表明β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”的核苷表明2’-MOE核苷；後面有下標“S”的核苷表明S-cEt核苷；後面有下標“L”的核苷表明LNA核苷。每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。上標“Me”表明在核苷的鹼基上的5-甲基基團。
效力 體外和體內效力
使用體外螢光素酶測定來測量每種化合物抑制細胞培養物中的miR-122的活性的能力。在這個測定中，對微小RNA螢光素酶感測器構建體進行工程改造以包含融合至螢光素酶基因的多個miR-122結合位點。當miR-122結合該螢光素酶感測器構建體中它的靶位點時，螢光素酶表現被壓制。當將活性抗miR-122化合物引入到細胞中時，它結合miR-122並且解除螢光素酶表現的壓制。因此，在這個測定中，作為miR-122的有效抑制劑的抗miR-122化合物將引起螢光素酶表現增加。
將螢光素酶感測器構建體和表現miR-122的第二構建體引入到海拉細胞(Hela cell)中。將若干不同濃度的抗miR-122化合物轉染到細胞中。使具有小於100nM的EC50之化合物經受另一個螢光素酶測定(抗miR濃度的範圍比初始螢光素酶測定寬)來證實活性。如在表B中所指明，在兩個分開的實驗中測試化合物。每種化合物的平均EC50在表B中示出。結果證明了糖部分或核鹼基的改變可以影響抗miR-122化合物的體外效力。
為了確定體內效力，評估某些化合物使通常受到miR-122活性壓制的基因肝臟醛縮酶A(ALDOA)表現去阻抑的能力。抑制miR-122導致ALDOA表現增加，因此ALDOA mRNA水平可以用來測量體內的miR-122抑制活性。在表C指明的量下以單次劑量向小鼠給藥化合物，並且在研究終止7天后，藉由定量PCR測量從肝臟分離的RNA中之ALDOA mRNA水平。除了 化合物38910以外，在同一研究中測試表C中的每種化合物。相對於鹽水，計算ALDOA mRNA的倍數變化以確定體內效力(“ND”表明“未確定”)。
如在表C中可以看出，糖部分或核鹼基的位置的單一變化可以對體內效力具有影響。例如，38872與38011之間僅有的差異係cEt糖部分的位置，然而0011的體內效力顯著低於38872的體內效力，其中相當水平的ALDOA去阻抑僅在38011的較高劑量10mg/kg下達到，相比之下化合物38872的劑量為3mg/kg。相對於38016，化合物38021具有LNA代替cEt糖部分，並且具有與38016類似的效力，因此這種差異不影響效力。在這組化合物中，化合物38012、38016、38021和38872被鑒定為活性化合物。
進行另外的研究以評估某些另外的抗miR-122化合物。該等研究的結果 在表D中示出。在一個體內研究中一同測試了化合物38646、38647、38648、38649、38650、38651和38652，並且在另一個體內研究中一同測試了化合物38659和38660。
如上，該等數據說明了糖部分的位置的單一變化可以對體內效力具有相當大的影響。此外，表明體外和體內效力不一定相關。例如，化合物38659具有低體外效力，但確是體內miR-122的非常有效的抑制劑。
抗miR-122化合物結構和體內效力的比較揭示與一組活性抗miR-122共有的11個核苷的核心序列。這個核心序列(其中B-D-去氧糖部分和雙環糖部分位於抗miR-122核苷酸序列上的相同位置)在表D-2中突出顯示。具有該 11個核苷核心的核鹼基序列與miR-122(SEQ ID NO：1)之核鹼基2至12互補。
該等數據說明了產生體內miR-122的有效抑制劑的某一核心核苷型態之發現。
HCV複製子研究
使用HCV複製子測定來確定抗miR-122化合物抑制HCV(包括親本HCV基因型和具有賦予抗病毒劑抗性的突變的HCV基因型)複製能力。在這個測定中測試化合物38649以確定它抑制基因型1a(H77病毒株)、基因型1b以及基因型1b的若干變體(A156T、A156S、D168a和V36M)的HCV亞基因組複製子複製能力。
針對這個測定，使用的細胞系係細胞系ET，一包含具有穩定的螢光素酶報導體和三個細胞培養適應性突變的HCV之亞基因組複製子(luc-ubi-neo/ET)的Huh7人肝細胞癌細胞系。螢光素酶報導體用作HCV複製之間接指標。HCV複製子抗病毒評估測定檢驗處於每種化合物6次半對數濃度的化合物之作用。納入人干擾素α-2b作為陽性對照化合物。將ET系的亞融合培養物鋪放到96孔板中，並且第二天用陽離子性脂質將抗miR-122化合物轉染到細胞中。72小時後在該等細胞仍然是亞融合時對細胞進行處理。HCV複製子水平被評價為HCV RNA複製子產生的螢光素酶活性。計算每種HCV基因型的EC50(觀察到50%抑制時的濃度)，並且在表E中示出。還計算了選擇性指數(SI50，病毒複製的EC50與固有細胞毒性的EC50的比率)並且在表E中示出。
來自該複製子測定的結果證明了化合物38649針對多種HCV基因型的抗病毒活性。該抗病毒活性持續該測定進行的時間段(18天)。化合物38649的活性針對包含已知對治療HCV感染開處的某些蛋白酶抑制劑有抗性的突變之HCV複製子同樣有效。
抗miR-122的單一劑量研究
在小鼠中，在單一劑量研究中測試化合物38649以確定在0.3mg/kg至30mk/kg範圍內的劑量下的作用起效、最大靶標去阻抑以及作用持續時間。也從這個研究中計算出ED50。
向每組5只小鼠腹膜內給藥0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg和30mg/kg劑量的抗miR化合物。針對0.3mg/kg和1.0mg/kg劑量，各組動物在第3天、第7天和第28天處死。針對3.0mg/kg、10mg/kg和30mg/kg劑量，各組動物在第3天、第5天、第7天、第14天、第21天和第28天處 死。藉由定量PCR來測量肝臟中之ALDOA mRNA水平，並且與鹽水處理過的小鼠的肝臟中的ALDOA mRNA水平進行比較來計算ALDOA表現之倍數變化。
如在圖1A中所示，早在第3天就觀察到ALDOA去阻抑，並且在給予化合物38649之後維持多於28天。最大靶標去阻抑在10mg/kg下達成。從第7天的數據計算出6.7mg/kg的ED50(圖1B)。
物理化學特徵
物理化學特徵的評估可以包括：測量粘度，確定抗miR的溶液是否適合用於經由某些類型的腸胃外給藥來進行給藥，例如皮下給藥；計算肝臟中的抗miR半衰期，以便估計在人受試者中可以給藥抗miR-122化合物的頻率；以及代謝穩定性測定，以鑒定可能易受核酸酶裂解之化合物。
藉由將抗miR-122化合物與非人靈長類動物肝臟溶胞產物一起孵育來評估代謝穩定性。藉由使用參比寡核苷酸來證實肝臟組織勻漿中的核酸酶活性，該等參比寡核苷酸包括對核酸酶活性具有已知抗性之化合物，易受3’-核酸外切酶活性影響的化合物以及易受核酸內切酶活性影響之化合物。使用內標物化合物來控制萃取效率。在0小時和24小時時間點，對每個樣品進行高效液相層析法-飛行時間質譜法(HPLC-TOF MS)以測量寡核苷酸長度和量。藉由在0小時和24小時時間點比較全長化合物的量來確定損失百分比。化合物38646、38647、38648、38649、38650、38651、38652、38659和38660在24小時時間點展示出10%或更少的損失百分比。化合物38012在24 小時時間點展現出大約50%之損失百分比。
在小鼠中進行另一個單一劑量研究來估計化合物38649的半衰期。估計肝臟中的半衰期為至少兩週。
安全性
為了評價各種安全性參數，針對某些在此描述的化合物在齧齒動物體內進行體內研究來評估該等化合物引發促炎性反應的潛力。評價的參數包括：器官重量變化，如脾重量和肝重量；和肝臟中的干擾素誘導基因的表現，如IFIT和OASL。還評估了血清化學性質。另外，針對某些化合物，在非人靈長類動物中評估了安全性參數，並且包括血液學端點、血清化學性質、器官重量、凝結、補體啟動、細胞因數/趨化因數變化以及促炎性基因表現。
雖然該等測試的化合物在評估的該等安全性參數之中展現出一些可變性，但是發現若干化合物(包括化合物38649)具有特別適合之安全性特徵。
實例2：共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸
將抗miR-122修飾之寡核苷酸共軛至含GalNAc的部分上，以確定該共軛是否將提高該等寡核苷酸的效力。
藉由將圖2中的結構共軛至38649修飾之寡核苷酸之3’末端上來形成含GalNAc之化合物。該含GalNAc的部分與38649之3’-末端之間的鍵聯有所不同，如在表F-1中所示。例如，在化合物38368中，該含GalNAc的部分藉由磷酸二酯鍵直接連接至38649之3’-末端核苷上，如在圖3C中所示，其中X係磷酸二酯鍵並且MO係化合物38649。在化合物38458中，該含GalNAc的 部分藉由β-D-去氧核苷連接至38649之3’-末端核苷上，其中在38649之3’-末端核苷之間具有硫代磷酸酯鍵並且在該β-D-去氧核苷與該含GalNAc的部分之間具有磷酸二酯鍵，如在圖3A中所示，其中X2係硫代磷酸酯鍵，m係1,Nm係β-D-去氧核苷，X1係磷酸二酯鍵，並且MO係化合物38649。
評價GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸之體內效力，未共軛的經修飾之寡核苷酸從該GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸的釋放以及肝臟和組織濃度。
根據以上描述的用來評估該等未共軛的經修飾之寡核苷酸之方案來進行 效力研究。將化合物注射到小鼠體內，並且在第7天藉由測量ALDOA的去阻抑來評價體內效力。共軛化合物的劑量表明所給藥的經修飾之寡核苷酸的劑量。
如在圖4中所示，測試的這三種GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸中的每一種都比未共軛的經修飾之寡核苷酸更有效。相對於未共軛之38649，化合物38368和38371展現出效力增加大約3倍(圖4A)。化合物38458和38459(每種化合物均具有β-D-去氧核糖核苷連接基團)展現出效力增加至少10倍(圖4B)。化合物38597和38598(每種化合物均具有2’-糖修飾的連接基團)也展現出效力增加至少10倍(圖4C)。在另外的研究中，針對化合物38459、38458、38597和38598，已觀察到效力增加高達20倍。
進行另一個實驗以包括更寬範圍的化合物38459之劑量。向小鼠給藥化合物38459(n=6)或化合物38649(n=3)，並且七天后測量肝臟中的ALDOA水平和血液中之膽固醇水平。計算平均ALDOA和膽固醇水平並且在表F-2中示出。如在表F-2中所示，關於增加ALDOA水平和降低膽固醇水平，化合物38459的單次皮下劑量展示出相對於未共軛的化合物38649效力有所增加。在這個實驗中，化合物38459的計算ED50係0.19mg/kg，並且化合物38649的計算ED50係3.5mg/kg(效力相差18倍)。
還測量了在1mg/kg和3mg/kg劑量下單次皮下給予化合物38368和38371以及在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg劑量下單次皮下給予化合物38458和38459第7天后的肝臟和腎臟組織中的未共軛的經修飾之寡核苷酸的量。對每個樣品進行高效液相層析法-飛行時間質譜法(HPLC-TOF MS)以測量寡核苷酸長度和量。由這種方法定量的下限(LLOQ)係0.2μg/g至1.0μg/g。
發現該等GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸具有不同的未共軛的經修飾之寡核苷酸之形成速率。例如，在給藥化合物38368之後，在肝臟中檢測到小於10%的化合物38649(一種未共軛的經修飾之寡核苷酸)。在給藥化合物38371之後，在化合物38371的任一劑量下，在肝臟中都檢測不到化合物38649。相反地，在皮下給藥化合物38459七天后，僅檢測到的未共軛的經修飾之寡核苷酸種類係未共軛的38649；未檢測到母體化合物38459。在給藥化合物38458之後，檢測到兩種形式的未共軛的經修飾之寡核苷酸：38649以及38649-PO-A(化合物38458的一種代謝物)。在高於未共軛的38649的水平處檢測到這種代謝物。
還測量了在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg劑量下單次皮下給予化合物 38458和38459之後24小時肝臟中的未共軛的經修飾之寡核苷酸的量。藉由LC-TOF測量抗miR水平。由這種方法定量的下限(LLOQ)係0.2μg/g至1.0μg/g。觀察到在給藥化合物38459之後，存在於肝臟中的總化合物的90%係未共軛的化合物38649。在給藥38458之後，存在於肝臟中的總化合物的大約46%係未共軛的化合物38649。因此，未共軛的化合物38649從化合物38459之釋放從化合物38458之釋放快。該等數據表明共軛的化合物的代謝作用受接頭與經修飾之寡核苷酸之間之連接影響。
寡核苷酸一般在腎臟組織中的積累水平最高，接著是肝臟組織。關於未共軛的化合物，為了確定GalNAc共軛物相比於腎臟組織是否改變了化合物在肝臟組織中的積累，還測量了腎臟組織中未共軛的38649的量。如上所述，在給藥化合物38459之後，在肝臟中發現的總化合物的100%都是未共軛的38649，這表明38649從該GalNAc共軛的化合物38459中完全釋放。在給藥化合物38459之後，關於給藥化合物38649之後化合物38649的積累，與肝臟相比化合物38649在腎臟中積累較少(即展現出較低的腎臟：肝臟比率)。因此，與未共軛的38649相比，38459可以優先將化合物38649遞送至肝臟，同時使向腎臟的遞送減至最少。
在體內研究中評估了化合物38459的作用的起效和持續時間。給予各組小鼠0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的化合物38459的單次皮下(SC)劑量。對另一組小鼠給藥10mg/kg劑量的化合物38649。來自每種治療的一組動物在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第14 天、第21天、第28天和第56天的每一天處死。從肝臟中分離出RNA，並且藉由即時PCR測量ALDOA mRNA水平。計算每組的平均ALDOA水平。相對於對照組(PBS處理過的)之倍數變化在表G中示出。
表G中的數據證明化合物38459以及化合物38649具有快速的作用起效，如藉由早在單次給予化合物1天后的ALDOA去阻抑所證實。另外，在單次給予化合物之後，ALDOA去阻抑維持至少8週。
該等數據證明：效力比未共軛的38649化合物高至少10倍的GalNAc共軛的化合物38459在顯著更低的肝臟組織濃度下即可實現這種效力，其中優先遞送至肝臟組織。另外，化合物38459展現出快速的作用起效和至少8週之作用持續時間。
還測試了在表H中示出的含LNA的未共軛和共軛的經修飾之寡核苷酸。
糖和鍵聯部分指明如下：其中後面沒有下標之核苷表明β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“L”之核苷表明LNA核苷；並且每個核苷間鍵聯係一種硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
根據與以上所述相同的方案測試化合物36848和36852的體內效力，以評估該等化合物抑制miR-122活性和增加ALDOA表現之能力。雖然每種化合物均是miR-122的有效抑制劑，但是GalNAc共軛的化合物36852展現出比未共軛的化合物36848高的效力(大約高3倍)。
根據與以上所述類似的方案，在0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0 mg/kg、3.0mg/kg和10.0mg/kg的劑量下，在單一劑量給藥研究中還測試了化合物36632的體內效力。相對於PBS處理過的對照，化合物36632證明ALDOA表現分別增加1.6、2.7、3.7、4.3、4.7、6.0倍。在1.0mg/kg、3.0mg/kg和10mg/kg的劑量下，化合物36848引起ALDOA表現分別增加1.6、2.5和5.3倍。相對於未共軛的化合物，對於共軛的化合物而言，化合物36632與化合物36848的比較揭示效力增加大約30倍。
實例3：HCV感染之小鼠模型
由於宿主病原體特異性，HCV僅可以感染人和黑猩猩。因此，典型地用於體內研究實驗的較小物種(如小鼠)不能被HCV感染用來測試用於治療HCV感染的候選藥劑。為了解決這個問題，可以使用人肝臟嵌合小鼠模型(參見，例如畢思吉(Bissig)等人，美國科學院院報(Proc Natl Acad Sci US A),2007,104：20507-20511；畢思吉等人，臨床研究雜誌(J Clin Invest.),2010,120：924-930)。在這個模型中，用人肝細胞重新填充免疫缺陷的小鼠之肝臟，產生大多數肝細胞係人肝細胞的嵌合肝臟。然後用HCV感染該小鼠並且用抗HCV劑治療。這個小鼠模型可以從例如PhoenixBio商購獲得。
在具有已被感染HCV的人嵌合肝臟的小鼠中測試抗miR-122化合物。各組動物(n=5-10)接受一個或多個劑量的抗miR-122化合物，例如在由治療方案研究確定劑量下。為了藥物動力學分析和測量HCV RNA水平，在不同時間點收集血漿。當研究終止時，收集肝臟組織。
在一些實施方式中，藉由測量人ALDOA mRNA水平來證實miR-122的抑制。預料到，給藥抗miR-122化合物降低小鼠血清中的HCV RNA水平。
實例4：響應於miR-122抑制之HCV RNA水平降低
使用人嵌合小鼠肝臟模型來評估miR-122抑制對miR-122靶基因表現和HCV病毒滴度的影響。
人嵌合肝臟小鼠
在不具有HCV感染的人嵌合肝臟小鼠中評估miR-122抑制對靶基因表現的影響。用單次劑量的PBS、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg或10mg/kg的化合物38459處理各組小鼠(n=6)。處理七天后，終止研究並且收集肝臟組織用於測量ALDOA表現和化合物組織濃度。相對於PBS處理過的小鼠中的ALDOA mRNA水平，ALDOA mRNA水平有所增加，然而，ALDOA表現之去阻抑比在野生型小鼠中觀察到的ALDOA表現之去阻抑低3倍至5倍。相對於野生型小鼠中的濃度，嵌合肝臟小鼠中的化合物38459水平低3倍。相對於野生型小鼠，該等觀察與人嵌合肝臟小鼠中去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的表現減少一致。因為化合物在肝臟細胞中的積累係取決於ASGPR的攝取，所以ASGPR的表現減少預料將引起GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸積累減少和因此對化合物38459去阻抑miR-122的內源性靶標(如ALDOA)的能力之敏感性降低。因此，該人嵌合肝臟小鼠模型可能低估ASGPR表現得到維持的受試者體內化合物38459之活性。初步數據表明：相對於未受HCV感染的受試者的肝臟，HCV感染的患者的肝臟中ASGPR表現 維持在類似水平。
HCV感染的人嵌合肝臟小鼠之處理
在HCV感染的人嵌合肝臟小鼠模型中測試抗miR-122化合物。用人肝細胞重新填充免疫缺陷的小鼠的肝臟，產生大多數肝細胞係人肝細胞的嵌合肝臟。在用HCV基因型1a接種之後大約3.5週，選擇HCV RNA水平>1×106個拷貝/毫升的小鼠用於包括在本研究中(第-7天)。
針對單週研究，在第0天用單次10mg/kg劑量的38459處理一組3只動物。在第-7天、第0天、第3天和第7天收集血液。當除了血液以外還收集肝臟組織和腎臟組織時，在第7天終止該研究。在這個研究中，HCV RNA水平在第3天和第7天降低。
針對多週研究，每組5只動物如下處理：PBS(n=5)；3mg/kg 38459(n=5)；10mg/kg 38459(n=4-5)；或30mg/kg 38459(n=4-5)。用10mg/kg未共軛化合物36848處理另一組動物(n=5)。在第0天給藥單次皮下注射處理。在第-7天、第0天、第3天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天、第24天、第28天和第35天收集血液。根據常規方法藉由即時PCR來測量血液中的HCV RNA水平，並且在表I中示出。除非另外指明，否則每個治療組包含5只動物。如在表I中所示，早在第3天，在用10mg/kg或30mg/kg化合物38459處理之組中，HCV RNA水平顯著降低，該降低持續直到至少第35天。藉由歸一化為PBS處理的動物中的平均HCV RNA水平的化合物處理的動物中的平均HCV RNA水平的雙向ANOVA分析來計 算統計顯著性。在本研究中，未共軛的化合物36848沒有降低HCV RNA水平。該等結果還以圖形形式在圖5A中圖示。
該等結果證明：單次給藥GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸38459之後，在HCV感染的動物中HCV病毒滴度顯著降低，而作用起效早和作用持續時間延長。
進行另一個研究來評估化合物38459在HCV感染的人嵌合肝臟小鼠模型中的作用，其中該等小鼠被HCV基因型3a感染。每組5只動物處理如下：PBS(n=4)；10mg/kg 38459(n=5)；或30mg/kg 38459(n=5)。用HCV基因型3a接種小鼠。在處理前七天，從小鼠中收集血液用於測量病毒滴 度。在第0天給藥單次皮下注射處理。在處理後第0天、第3天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天、第24天和第28天收集血液。根據常規方法藉由即時PCR來測量血液中的HCV RNA水平。如在圖5B中所示，早在第3天，在用10mg/kg或30mg/kg化合物38459處理之組中HCV RNA水平顯著降低，並且這種降低維持直到至少第28天。
還觀察到在用化合物38459處理的小鼠的肝臟中脂肪變性實質性減少。在被HCV感染的小鼠中和在未感染的小鼠中觀察到脂肪變性減少，表明抑制miR-122可以減少存在和不存在HCV感染這兩種情況下的脂肪變性。
實例5：共軛的較短修飾寡核苷酸
藉由將圖3中的結構共軛至表J中示出的經修飾之寡核苷酸的3’末端來形成含GalNAc的化合物。糖部分、核苷間鍵聯以及核鹼基指明如下：後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
為了確定體內效力，評估該等化合物使肝臟醛縮酶A(ALDOA)的表現去阻抑之能力。向小鼠給藥化合物，並且藉由定量PCR測量從肝臟中分離出的RNA中的ALDOA mRNA水平。相對於鹽水，計算ALDOA mRNA的倍數變化以確定體內效力(圖6A和6B以及圖7A和7B)。從那些實驗結果計算的ED50(ALDOA去阻抑是最大值的50%時之化合物濃度)和ED90(ALDOA去阻抑係最大值的90%時之化合物濃度)在表K和表L中示出。
如在表K中所示，根據本發明之GalNAc共軛使8聚體抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少100倍。如在表L中所示，根據本發明之GalNAc共軛使13聚體抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少10倍。
還確定了化合物38634和38998對另一種miR-122靶基因CD320之去阻抑。結果類似於針對在表K中示出的ALDOA所獲得的結果：根據本發明之GalNAc共軛分別使實驗1和實驗2中的ED50提高343倍和272倍，並且分別使實驗1和實驗2中之ED90提高492倍和545倍。
在此描述的GalNAc共軛還提高了針對包含GalNAc的該等化合物所觀察到的膽固醇下降效力。來自實驗1的示例性結果在圖8A和8B中示出。作為GalNAc共軛物的化合物38633和38634比缺乏GalNAc的化合物38591和38998更有效。針對實驗2獲得類似結果(數據未示出)。
實例6：抗miR-122化合物在非人靈長類動物中之藥效學活性
在正常的非人靈長類動物(食蟹猴)中測試了抗miR-122化合物。皮下給藥單次劑量的GalNAc共軛的化合物38459或未共軛的化合物38649(對於每種化合物，n=3)。給藥PBS作為對照處理(n=5)。在給藥化合物後第 4天和第8天，收集肝臟組織，並且分離RNA用於測量ALDOA水平。在第8天測量血液中的總膽固醇。如在表L中所示，在每種劑量的化合物38459(包括最低劑量1mg/kg)下，在第4天和第8天觀察到ALDOA去阻抑。使用最低劑量的化合物38459也觀察到膽固醇下降。因此，相對於未共軛的化合物38649,GalNAc共軛的化合物38459在非人靈長類動物中顯著更有效。另外，在非人靈長類動物中單次劑量之後，這兩種化合物均具有至少一週的作用持續時間。
實例7：共軛的抗miR-122化合物的藥物動力學活性
在小鼠和非人靈長類動物中評估抗miR-122化合物的血漿和組織藥物動力學。
向CD-1小鼠給藥單次皮下劑量之化合物38649或GalNAc共軛的化合物38459。在給藥之後，持續24小時時間段在多個時間點收集血液，並且藉由基於雜交的ELISA測量該血液中的化合物之總量。
向非人靈長類動物給藥單次皮下劑量的化合物38649或GalNAc共軛的化合物38459。在給藥之後，持續24小時時間段在多個時間點收集血液，並且藉由LC-MS測量該血液中的化合物之總量。
如在圖9中所示，在小鼠(圖9A)和非人靈長類動物(圖9B)中，與未共軛的化合物38649相比，GalNAc共軛的化合物38459更快速地從血漿中清除。在給藥GalNAc共軛的化合物38459之後，沒有檢測到未共軛的化合物38649，表明共軛的化合物38459在血液中沒有代謝(數據未示出)。
在本研究中，還在小鼠(表M)和非人靈長類動物(表N)的肝臟和腎臟中測量了化合物的組織水平。
在給藥之後，化合物38459在肝臟和腎臟中快速地代謝成未共軛的化合物38649。另外，與來自以上描述的小鼠研究的數據一致，化合物38459的腎臟與肝臟比率顯著低於化合物38649的腎臟與肝臟比率。
基於給藥後24小時肝臟中的化合物的濃度，估計大約6μg/g的GalNAc共軛的化合物38459和大約30μg/g的未共軛的化合物38459在第7天產生90%的最大效力(如藉由ALDOA去阻抑所測量)。因此，相對於未共軛的化合物38649，化合物38459在更低的肝臟組織濃度下產生更大的效力。
該等數據證明在非人靈長類動物和小鼠中，共軛至含GalNAc部分使得經修飾之寡核苷酸向肝臟的遞送顯著增強。此外，低ED50結合較低腎臟與肝臟比率表明GalNAc共軛的化合物38459可以具有高治療指數。
實例8：抗miR-122化合物的毒理學和安全性研究
在小鼠、齧齒動物和非人靈長類動物中進行多個研究以評估GalNAc共軛的化合物38459的安全性和耐受性。
例如，在大鼠中，在促炎性研究中評估化合物38459。對雄性斯普拉道來大鼠(Sprague Dawley rat)給藥單次皮下劑量的化合物38459。在給藥後第14天，在肝臟中測量ALDOA和CXCL13(一種干擾素誘導性基因)之表現。
如在表O中所示，在高達100mg/kg的劑量下沒有檢測到CXCL13表現增加，而在1mg/kg劑量下ALDOA水平開始上升。還測試了一種已知的炎性抗miR-122化合物，並且在10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg劑量下引起CXCL13水平增加2倍至2.5倍。
在小鼠和非人靈長類動物(食蟹猴)中進行另外的毒理學研究，並且在治療相關的劑量下沒有觀察到顯著不良作用。
實例9：共軛的較短修飾寡核苷酸
藉由將膽固醇共軛至在表P中示出的經修飾之寡核苷酸之3’末端來形成含膽固醇之化合物。糖部分、核苷間鍵聯以及核鹼基指明如下：後面沒有下標的核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯，除了由下標(O)指示的核苷間鍵聯以外，該等核苷間鍵聯係磷酸二酯鍵。
為了確定體內效力，評估該等化合物使肝臟醛縮酶A(ALDOA)之表現去阻抑之能力。向小鼠給藥化合物，並且藉由定量PCR測量從肝臟中分離出的RNA中之ALDOA mRNA水平。相對於鹽水，計算ALDOA mRNA的倍數變化以確定體內效力。從那些實驗的結果中計算的EDS0(ALDOA去阻抑係最大值的50%時之化合物濃度)和ED90(ALDOA去阻抑係最大值的90%時之化合物濃度)在表Q中示出。
如在表Q中所示，根據本發明之膽固醇共軛使8聚體抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少30倍。
還確定了化合物38070和38998對另一種miR-122靶基因CD320的去阻抑。結果類似於針對ALDOA所獲得的結果(數據未示出)。
在此描述的膽固醇共軛還提高了膽固醇下降效力。在測試的大多數濃度下，化合物38070使膽固醇降低的程度比相同濃度的化合物38998大(數據未示出)。
除了在此描述的那些修改之外，本發明的各種修改將因前述說明而對熟習該項技術者變得清楚。意欲此類修改也處於所附申請專利範圍的範圍之內。本申請中引用的每個參考文件(包括，但不限於雜誌文章、美國專利案和非美國專利案、專利申請公佈、國際專利申請公佈、GENBANK®保藏編號等)藉由引用以其全部內容明確結合在此。
<110> 美商雷格勒斯治療公司(REGULUS THERAPEUTICS INC.)
<120> 用於調節MIR-122之微小RNA化合物及方法
<130> REGUL-32975/TW-1/ORD
<140> TW 103115662
<141> 2014-04-30
<150> US 61/818,432
<151> 2013-05-01
<150> US 61/822,112
<151> 2013-05-10
<150> US 61/839,550
<151> 2013-06-26
<150> US 61/895,784
<151> 2013-10-25
<150> US 61/898,704
<151> 2013-11-01
<150> US 61/927,897
<151> 2014-01-15
<160> 10
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 85
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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<210> 6
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<212> DNA
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<210> 7
<211> 15
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<400> 7
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<211> 13
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<210> 9
<211> 8
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 9
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10

Claims (114)

  1. 一種化合物，其包含由16至22個連接的核苷組成之經修飾之寡核苷酸，其中該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與miR-122(SEQ ID NO：1)互補並且其中該經修飾之寡核苷酸以5’至3’方向包含具有以下核苷型態I之至少16個連續核苷：(R)X-NQ-NQ-NB-NB-NQ-NB-NQ-NB-NQ-NB-NB-(NZ)Y其中每個R獨立地是非雙環核苷或雙環核苷；X係從4至10；每個NB獨立地是雙環核苷；每個NQ獨立地是非雙環核苷；Y係0或1；並且NZ係修飾的核苷或未修飾的核苷。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸包含具有核苷型態I之至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個或22個連續核苷。
  3. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中每個雙環核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷和ENA核苷。
  4. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中至少兩個雙環核苷彼此不同。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之化合物，其中所有雙環核苷 具有彼此相同之糖部分。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之化合物，其中每個雙環核苷係cEt核苷。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之化合物，其中該cEt核苷係S-cEt核苷。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之化合物，其中該cEt核苷係R-cEt核苷。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之化合物，其中每個雙環核苷係LNA核苷。
  10. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中至少兩個非雙環核苷包含彼此不同之糖部分。
  11. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之化合物，其中每個非雙環核苷具有相同類型之糖部分。
  12. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。
  13. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷。
  14. 如申請專利範圍第1至9和11項中任一項所述之化合物，其中每個非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。
  15. 如申請專利範圍第1至9和11項中任一項所述之化合物，其中每個非雙環核苷係2’-MOE核苷。
  16. 如申請專利範圍第1至10、12和13項中任一項所述之化合物，其中不多於兩個非雙環核苷係2’-MOE核苷，其中每個其他非雙環核苷係β-D- 去氧核糖核苷。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之化合物，其中最5’端和最3’端的非雙環核苷係2’-MOE核苷，並且每個其他非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。
  18. 如申請專利範圍第16項所述之化合物，其中兩個非雙環核苷係2’-MOE核苷，並且每個其他非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。
  19. 如申請專利範圍第1至13和15至18項中任一項所述之化合物，其中每個R係2’-MOE核苷。
  20. 如申請專利範圍第1至19項中任一項所述之化合物，其中X係4、5、6、7、8、9或10。
  21. 如申請專利範圍第1至20項中任一項所述之化合物，其中Y係0。
  22. 如申請專利範圍第1至20項中任一項所述之化合物，其中Y係1。
  23. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中：a)X係7；每個R係2’-O-甲氧基乙基核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0；b)X係4；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR3各自是S-cEt核苷，並且NR2和NR4各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷； Y係1；並且NZ係β-D-去氧核糖核苷c)X係4；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷，並且NR2和NR3各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1；並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷d)X係7；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3和NR4各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR5和NR7各自是β-D-去氧核糖核苷，並且NR6係S-cEt核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0；e)X係7；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3、NR4和NR5各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR6係S-cEt核苷，並且NR7係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0；f)X係7；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，並且NR7係β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷； 每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0；g)X係10；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；NR8和NR10各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；並且Y係0；h)X係10；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；並且NR8和NR10各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷；i)X係4；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷，並且NR2和NR3各自是β-D-去氧核糖核苷；每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係β-D-去氧核糖核苷；j)X係4；(R)X係NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1係2’-O-甲氧基乙基核苷，NR2和NR4各自是S-cEt核苷，並且NR3係β-D-去氧核糖核苷； 每個NB係S-cEt核苷；每個NQ係β-D-去氧核糖核苷；Y係1並且NZ係2’-O-甲氧基乙基核苷。
  24. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與miR-122之核鹼基序列(SEQ ID NO：1)至少90%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%互補。
  25. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中至少一個核苷間鍵聯係經修飾之核苷間鍵聯，或其中每個核苷間鍵聯係經修飾之核苷間鍵聯，並且可隨意地，其中該經修飾之核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  26. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列係選自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：6，其中每個T獨立地選自T和U。
  27. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸相對於miR-122之核鹼基序列具有0、1、2或3個錯配。
  28. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，具有以下結構：a)AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS；b)CSCASTTGUSCSACSACSTCSCSA；c)MeCSCATSTGTS MeCSAMeCSAMeCSTMeCS MeCSAE； d)AE MeCEAE MeCECASTTGUSCSACSACSTCSCS；e)AE MeCEAE MeCE MeCEASTTGUSCSACSACSTCSCS；f)AE MeCEAE MeCE MeCEAETTGUSCSACSACSTCSCS；g)MeCEAEAEAE MeCEAECSCASTTGUSCSACSACSTCSCSh)MeCEAEAEAE MeCEAECSCASTTGUSCSACSACSTCSCSTE；i)CSCAUSTGUSCSACSACSTCSCSA；或j)MeCECSAUSTGUSCSACSACSTCSCSAE其中上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶；後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”之核苷係2’-MOE核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  29. 如以上申請專利範圍中任一項所述之化合物，其中該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之5’末端或3’末端之共軛部分。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之化合物，其中該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端之共軛部分。
  31. 如申請專利範圍第29項所述之化合物，其中該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之5’末端之共軛部分。
  32. 如申請專利範圍第29項所述之化合物，其中該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端之第一共軛部分和連接至該經修飾之寡核苷酸之5’末端之第二共軛部分。
  33. 如申請專利範圍第29至32項中任一項所述之化合物，其中該共軛部分包含選自以下的至少一個配位基：碳水化合物、膽固醇、脂質、磷脂、 抗體、脂蛋白、激素、肽、維生素、類固醇以及陽離子性脂質。
  34. 如申請專利範圍第29至33項中任一項所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：Ln-接頭-MO其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
  35. 如申請專利範圍第29至33項中任一項所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：Ln-接頭-X-MO其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
  36. 如申請專利範圍第29至33項中任一項所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：Ln-接頭-X1-Nm-X2-MO其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
  37. 如申請專利範圍第29至33項中任一項所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：Ln-接頭-X-Nm-Y-MO 其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
  38. 如申請專利範圍第29至33項中任一項所述之化合物，其中該化合物具有以下結構：Ln-接頭-Y-Nm-Y-MO其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；每個Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
  39. 如申請專利範圍第34至38中任一項所述化合物，其中如果n大於1，則Ln-接頭具有以下結構： 其中每個L獨立地是配位基；n係從1至10；S係骨架；並且Q’和Q”獨立地是連接基團。
  40. 如申請專利範圍第39項所述之化合物，其中Q’和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。
  41. 如申請專利範圍第39或40項所述之化合物，其中該骨架將2個、3個、4個或5個配位基連接至經修飾之寡核苷酸。
  42. 如申請專利範圍第41項所述之化合物，其中該骨架將3個配位基連接至經修飾之寡核苷酸。
  43. 如申請專利範圍第34至42項中任一項所述之化合物，其中該化合物具有以下結構： 其中：B選自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；MO係經修飾之寡核苷酸；RN選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基以及苯甲基；Z、Z’和Z”各自獨立地選自O和S；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷；m係從1至5；X選自磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且波形線表明連接至該或該等接頭和配位基之其餘部分。
  44. 如申請專利範圍第35、37、39和43項中任一項所述之化合物，其中X係磷酸二酯鍵。
  45. 如申請專利範圍第34至43項中任一項所述之化合物，其中n係從1至5、1至4、1至3、或1至2。
  46. 如申請專利範圍第34至43項中任一項所述之化合物，其中n係3。
  47. 如申請專利範圍第34至46項中任一項所述之化合物，其中至少一個配位基係碳水化合物。
  48. 如申請專利範圍第34至47項中任一項所述之化合物，其中至少一個配位基選自：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-哌喃甘露糖、β-D-哌喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-哌喃葡萄糖、β-D-哌喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-哌喃半乳糖、β-D-哌喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-哌喃核糖、β-D-哌喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-哌喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸、N-乙醯基半乳糖胺。
  49. 如申請專利範圍第34至47項中任一項所述之化合物，其中至少一個配位基選自N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺以及N-異丁醯基-半乳糖胺。
  50. 如申請專利範圍第34至47項中任一項所述之化合物，其中每個配位基係N-乙醯基半乳糖胺。
  51. 如申請專利範圍第34至50項中任一項所述之化合物，其中該化合物具有以下結構： 其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
  52. 一種化合物，其包含經修飾之核苷酸和共軛部分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL，其中下標“L”表明LNA並且後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯，並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端並且具有以下結構： 其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
  53. 如申請專利範圍第51項或如申請專利範圍第52項所述之化合物，其中X1和X2中的至少一個係磷酸二酯鍵。
  54. 如申請專利範圍第51至53項中任一項所述之化合物，其中X1和X2各自是磷酸二酯鍵。
  55. 如申請專利範圍第35至54項中任一項所述之化合物，其中m係1。
  56. 如申請專利範圍第35至54項中任一項所述之化合物，其中m係2、3、4或5。
  57. 如申請專利範圍第35至56項中任一項所述之化合物，其中Nm係N’pN”，其中每個N’獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且p係從0至4；並且N”係包含未經修飾之糖部分的核苷。
  58. 如申請專利範圍第57項所述之化合物，其中p係0。
  59. 如申請專利範圍第57項所述之化合物，其中p係1、2、3或4。
  60. 如申請專利範圍第55至59項中任一項所述之化合物，其中每個N’包含未經修飾之糖部分。
  61. 如申請專利範圍第57至60項中任一項所述之化合物，其中每個未經修飾之糖部分獨立地是β-D-核糖或β-D-去氧核糖。
  62. 如申請專利範圍第57至61項中任一項所述之化合物，其中N”包含嘌呤核鹼基。
  63. 如申請專利範圍第57至61項中任一項所述之化合物，其中N”包含嘧啶核鹼基。
  64. 如申請專利範圍第57或59至62項中任一項所述之化合物，其中至少一個N’包含嘌呤核鹼基。
  65. 如申請專利範圍第62或64項所述之化合物，其中每個嘌呤核鹼基獨立地選自：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤以及7-甲基鳥嘌呤。
  66. 如申請專利範圍第57至62、64和65項中任一項所述之化合物，其中N”係β-D-去氧核糖腺苷或β-D-去氧核糖鳥苷。
  67. 如申請專利範圍第57或59至66項中任一項所述之化合物，其中至少一個N’包含嘧啶核鹼基。
  68. 如申請專利範圍第63或67項所述之化合物，其中每個嘧啶核鹼基獨立地選自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氫尿嘧啶。
  69. 如申請專利範圍第35至68項中任一項所述之化合物，其中每個N的該糖部分獨立地選自：β-D-核糖、β-D-去氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及雙環糖部分。
  70. 如申請專利範圍第69項所述之化合物，其中每個雙環糖部分獨立地選自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。
  71. 如申請專利範圍第70項所述之化合物，其中該cEt糖部分係S-cEt糖部分。
  72. 如申請專利範圍第70項所述之化合物，其中該cEt糖部分係R-cEt糖部分。
  73. 一種化合物，其包含經修飾之核苷酸和共軛部分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS，其中後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷，後面有下標“E”之核苷係2’-MOE核苷，後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯；並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端並且具有以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係該經修飾之寡核苷酸。
  74. 一種化合物，其包含經修飾之核苷酸和共軛部分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL，其中下標“L”表明LNA並且後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯，並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸的3’末端並且具有以下結構： 其中X係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係該經修飾之寡核苷酸。
  75. 一種抑制細胞中的miR-122的活性之方法，該方法包括使細胞與如以上申請專利範圍第1至0如上項中任一項所述之化合物相接觸。
  76. 如以上申請專利範圍第75所述之方法，其中該細胞係在體內。
  77. 如以上申請專利範圍第75所述之方法，其中該細胞係在體外。
  78. 一種方法，包括向HCV感染的受試者給藥如申請專利範圍第1至74項中任一項所述之化合物。
  79. 如申請專利範圍第78項所述之方法，其中該給藥減少HCV感染的症狀。
  80. 如申請專利範圍第78項或如申請專利範圍第79項所述之方法，其中該給藥預防血清HCV RNA回升。
  81. 如申請專利範圍第78項或如申請專利範圍第79所述之方法，其中該給藥延緩血清HCV RNA回升。
  82. 如申請專利範圍第78至81項中任一項所述之方法，包括選擇患有HCV感染的受試者。
  83. 如申請專利範圍第78至82項中任一項所述之方法，其中該受試者被選自以下的一種或多種HCV基因型感染：基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5以及基因型6。
  84. 如申請專利範圍第78至83項中任一項所述之方法，其中在給藥該化合物之前，確定該受試者被選自以下的一種或多種HCV基因型感染：基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5以及基因型6。
  85. 如申請專利範圍第83項或如申請專利範圍第84項所述之方法，其中該HCV基因型選自：基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型2c、基因型2d、基因型3a、基因型3b、基因型3c、基因型3d、基因型3e、基因型3f、基因型4a、基因型4b、基因型4c、基因型4d、基因型4e、基因型4f、基因型4g、基因型4h、基因型4i、基因型4j、基因型5a以及基因型6a。
  86. 如申請專利範圍第83項或如申請專利範圍第84項所述之方法，其中該HCV基因型選自：基因型1a、基因型1b以及基因型2。
  87. 如申請專利範圍第78至86項中任一項所述之方法，包括給藥至少一種另外的治療劑。
  88. 如申請專利範圍第78至87項中任一項所述之方法，其中該受試者被對至少一種治療劑有抗性的HCV變體感染。
  89. 如申請專利範圍第87項或如申請專利範圍第88項所述之方法，其中該至少一種治療劑選自：蛋白酶抑制劑、聚合酶抑制劑、輔助因數抑制劑、RNA聚合酶抑制劑、結構蛋白抑制劑、非結構蛋白抑制劑、親環蛋白抑制劑、進入抑制劑、TLR7激動劑以及干擾素。
  90. 如申請專利範圍第87項或如申請專利範圍第88項所述之方法，其中該至少一種治療劑選自：蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS3/4A抑制劑、核苷NS5B抑制劑、核苷酸NS5B抑制劑、非核苷NS5B抑制劑、親環蛋白抑制劑以及干擾素。
  91. 如申請專利範圍第87項或如申請專利範圍第88項所述之方法，其中該至少一種治療劑選自：干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素alfacon-1、聚乙二醇干擾素α-2b、聚乙二醇干擾素α-2a、緩釋的干擾素-α-2b、干擾素λ、索菲布韋(sofosbuvir)、利巴韋林(ribavirin)、特拉普韋(telapravir)、波普瑞韋(boceprevir)、伐尼普韋(vaniprevir)、阿森那普韋(asunaprevir)、利托那韋(ritonavir)、斯約伯韋 (setrobuvir)、迪卡拉斯他韋(daclastavir)、斯密普韋(simeprevir)、阿拉泊韋(alisporivir)、麥瑞斯他濱(mericitabine)、替格布韋(tegobuvir)、丹諾普韋(danoprevir)、索伐普韋(sovaprevir)以及尼塞普韋(neceprevir)。
  92. 如申請專利範圍第87項或如申請專利範圍第88項所述之方法，其中該至少一種治療劑選自：干擾素、利巴韋林和特拉普韋。
  93. 如申請專利範圍第78至92項中任一項所述之方法，其中該受試者係對至少一種治療劑無反應者。
  94. 如申請專利範圍第93項所述之方法，其中該受試者係干擾素無反應者。
  95. 如申請專利範圍第93項或如申請專利範圍第94項所述之方法，其中該受試者係直接作用型抗病毒性無反應者。
  96. 如申請專利範圍第78至95項中任一項所述之方法，包括選擇具有每毫升血清大於350,000個拷貝的HCV RNA水平之受試者。
  97. 如申請專利範圍第78至95項中任一項所述之方法，包括選擇具有每毫升血清在350,000個與3,500,000個拷貝之間的HCV RNA水平之受試者。
  98. 如申請專利範圍第78至95項中任一項所述之方法，包括選擇具有每毫升血清大於3,500,000個拷貝的HCV RNA水平的受試者。
  99. 如申請專利範圍第78至98項中任一項所述之方法，其中該受試者患有HCV相關性疾病。
  100. 如申請專利範圍第99項所述之方法，其中該HCV相關性疾病係肝硬 化、肝纖維化、脂肪性肝炎、脂肪變性或肝細胞癌。
  101. 如申請專利範圍第78至100項中任一項所述之方法，包括給藥足以降低HCV RNA水平的劑量之該化合物。
  102. 如申請專利範圍第101項所述之方法，包括給藥使HCV RNA水平降低至每毫升血清40個拷貝以下的劑量之該化合物。
  103. 如申請專利範圍第101項所述之方法，包括給藥足以實現HCV RNA水平降低至少2個對數的劑量之該化合物。
  104. 如申請專利範圍第78至103項中任一項所述之方法，其中該給藥實現了持續的病毒反應。
  105. 如申請專利範圍第78至104項中任一項所述之方法，包括給藥足以實現HCV RNA水平降低至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.5倍、至少2.0倍或至少2.5倍的劑量之該化合物。
  106. 如申請專利範圍第105項所述之方法，其中在第一次給藥該化合物兩週、三週、四週、五週或六週之後實現該HCV RNA水平降低。
  107. 如申請專利範圍第78至106項中任一項所述之方法，其中每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次、每兩月一次或每三月一次給藥該化合物。
  108. 如申請專利範圍第78至107項中任一項所述之方法，其中該化合物之劑量小於或等於10mg/kg、小於或等於7.5mg/kg、小於或等於每週5mg/kg、小於或等於4.5mg/kg、小於或等於4.0mg/kg、小於或等於3.5 mg/kg、小於或等於3.0mg/kg、小於或等於2.5mg/kg、小於或等於2.0mg/kg、小於或等於1.5mg/kg、或小於或等於1.0mg/kg。
  109. 如申請專利範圍第78至108項中任一項所述之方法，其中該給藥使肝酶水平正常化，其中該肝酶可隨意地是丙胺酸轉胺酶。
  110. 如申請專利範圍第78至109項中任一項所述之方法，其中該受試者係人。
  111. 如申請專利範圍第78至110項中任一項所述之方法，其中該化合物存在於藥物組合物中。
  112. 如申請專利範圍第1至74項中任一項所述之化合物，用於療法中。
  113. 如申請專利範圍第1至74項中任一項所述之化合物，用於治療HCV感染的受試者。
  114. 一種化合物，用於根據申請專利範圍113項所述之用途，其中該受試者係人。
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