JPH10503364A

JPH10503364A - Ｃ型肝炎ウイルスのアンチセンス阻害

Info

Publication number: JPH10503364A
Application number: JP7529188A
Authority: JP
Inventors: 隆字脇田; ジャックアール．ワンズ
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1994-05-10
Filing date: 1995-05-08
Publication date: 1998-03-31
Also published as: EP0759979A4; US6001990A; WO1995030746A1; EP0759979A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびHCV RNA翻訳を阻害するために該アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する方法に特徴を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 C 型肝炎ウイルスのアンチセンス阻害本発明は、米国国立衛生研究所（National Institute of Health）によって付与された承認番号CA-35711およびAA-08169のもとでアメリカ合衆国政府により一部支援を受けた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。発明の背景本発明は、C型肝炎ウイルスRNAの翻訳のアンチセンス阻害に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、細胞およびウイルスの遺伝子の機能を研究する際に有用なツールである（Uhlmann et al．，Chem．Rev．90（ 4）：543-584，1990; Stein et al．，Science261：1004-1012，1993参照）。さらにアンチセンスオリゴはウイルスのRNA配列を特異的に標的とすることができ、したがって宿主特異的な遺伝子発現に影響を与える可能性が低いため、ウイルスの複製を阻害するのに理想的な試薬であると考えられる。アンチセンスオリゴは、細胞培養系でHIV(Zamecnik et al.，Proc．Natle．Acad．Sci．USA83:4143- 4146，1986; Matsukura et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 7706-7710， 1987; Lisziewicz et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA89: 11209-11213，1992 参照)、インフルエンザ(Kabanov et al.，FEBS Lett．259: 327-330，1990参照) 、単純庖疹(Smith et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83: 2787-2791，1986 参照)、小水抱性口内炎(Lemaitre et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 64 8-652，1987参照)、およびB型肝炎ウイルス(Goodarzi et al.，J．Gen．Virol． 71: 3021-3025，1990、Blum et al.，Lancet 337: 1230，1991、Wu et al.，J.B iol．Chem．267(18): 12436-12439，1992、Offensperger et al.，EMBO J．12: 1257-1262，1993参照)を含む数多くのウイルスの複製を阻害する目的で用いられてきた。アンチセンスオリゴウイルス活性に対する阻害効果は特異性が高い。例えば、リスジーウィックズ(Lisziewicz)らは、二つのオーバーラップする28ヌクレオチドアンチセンスオリゴが、HIVの複製を阻害するが、効果において20倍の差異があることを発見した（Lisziewicz et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89: 11209-11213，1992参照）。 C型肝炎ウイルス(HCV)は輸血後の肝炎を引き起こす主要な原因である(Kuo et al.，Science 244: 362-364，1989参照)。持続性のHCV感染はしばしば、慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞癌を引き起こす(Kiyosawa et al.，Hepatol．12: 671 -675，1990参照)。インターフェロンアルファは慢性のHCV感染症を治療するための抗ウイルス薬として広く用いられている（Hoofnagle et al.，N．Engl．J．Me d．315: 1575-1578，1986、Yoshioka et al.，Hepatol．16: 293-299，1992参照）。しかしながら、インターフェロンの抗ウイルス効果は、限定された一過性のものであることが多い。発明の概要本発明は、HCV RNAの翻訳を阻害するための方法を特徴とする。この方法においてHCV RNAは、HCV RNAの一部に実質的に相補的で、配列番号:1〜28からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴと接触させる。本明細書において、オリゴは、生理的な条件下においてある核酸にハイブリダイズする能力があるならば、その核酸に対して「実質的に相補的」または「アンチセンス」であると記載される。本発明の方法で用いられるオリゴは好ましくは、長さが約10個から約400個のヌクレオチドの範囲にあり、更に好ましくは長さが約250個以下のヌクレオチドで、更に好ましくは長さが約100個以下のヌクレオチドで、更に好ましくは長さが約50個以下のヌクレオチドで、最も好ましくは長さが約12個と約28 個の間のヌクレオチドである。このオリゴは、その相補鎖にハイブリダイズするオリゴの能力を保存しているDNA、RNA、またはそれらの修飾物もしくは組合せからなっていてもよい。例えばオリゴは、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、もしくはメチルホスホネートオリゴヌクレオチドであってもよいし、またはこれらおよびその他のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド間結合のいかなる組み合わせを含んでいてもよい。「ホスホロチオエートオリゴ」とは、ホスホロチオエートのヌクレオチド内結合を一つまたはそれ以上含んでいるオリゴであると定義され、「メチルホスホネートオリゴ」とはメチルホスホネートのヌクレオチド内結合を一つまたはそれ以上含んでいるオリゴと定義される。これらの両方のタイプのオリゴにおいて、修飾されたヌクレオチド内結合がオリゴの特定の領域、例えば5'末端および／または3'末端に存在していてもよいし、オリゴ内のランダムな位置に存在していてもよいし、またはオリゴの全体に渡って存在していてもよい。本発明のオリゴがリボヌクレオチドである場合、本明細書に記載された各配列における「T」は「U」を意味する。好ましい態様において、オリゴは、配列番号：2、6、7、14、16、17、20、および23〜26からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。他の態様において、オリゴは、配列番号：1、3、5、8〜13、15、18、19、21、22、27、および28 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の好ましい態様において、オリゴのヌクレオチド配列は、配列番号：2、6、7、14、16、17、20、2 3、24、25、または26を含む。本発明の方法は、HCV RNAのI型、II型、III型、IV型、およびV型の翻訳を阻害するために用いることができる。本方法はインビボ、エクスビボ、またはインビトロで実施できる。HCV RNAは、ヒトまたはチンパンジーなどの哺乳動物から得ることができる動物細胞、例えば肝細胞に存在しうる。好ましい態様において、細胞内でオリゴリボヌクレオチドとしてオリゴを生成するように転写される配列を含むベクターを細胞に導入することにより、オリゴおよびHCV RNAを、一つの細胞（例えばヒトの肝細胞、またはチンパンジーの肝細胞）内で互いに接触させる。他の面において、本発明はオリゴリボヌクレオチドとして本発明のオリゴを生成するように動物細胞内で転写されるヌクレオチド配列を含むベクターを特徴とする。好ましくは、この転写されるヌクレオチド配列は、肝細胞で機能する転写調節配列に機能的に結合していることが好ましい。転写調節配列は、転写のプロモーターおよび／またはエンハンサー、並びに転写の終結を調節する配列を含んでいてもよい。転写調節配列が転写されるヌクレオチド配列を調節するのであれば、該転写調節配列および転写されるヌクレオチド配列は「機能的に結合」していると本明細書において記載される。本発明のベクターで用いることのできる転写調節配列としては、例えばアルブミン、アルファ−フェトプロテイン、アルファ1アンチトリプシン、レチノール結合タンパク質、およびアシアロ糖タンパク質受容体のプロモーターなどの肝細胞特異的プロモーターを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。例えばサイトメガロウイルス、単純庖疹ウイルス（I型およびII型）、肝炎ウイルス（A、B、およびC型）、並びにラウス肉腫ウイルス（RSV； Fang et al.，Hepatology 10: 781-787，1989）のようなウイルスのプロモーターおよびエンハンサーも本発明で用いることができる。「ベクター」とは、複製可能な核酸構築物として定義される。本発明のベクターはプラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むが、これらに限られるわけではない。本発明の好ましいウイルスベクターには、複製能欠損肝炎ウイルス（例えば、HBVおよびHCV）、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、複製能欠損単純庖疹ウイルスに由来するベクター、およびこれらのベクターに何らかの変形を加えたものが挙げられるが、これらに限られるわけではない。最後の面において、本発明はHCV感染症の治療または予防の方法において用いることのできる治療用組成物であることを特徴とする。この治療用組成物は、薬剤学的に許容される担体、例えば生理食塩水中に本発明のオリゴを含む。関連する面において、本発明は、動物細胞においてオリゴリボヌクレオチドとして本発明のオリゴを産生するように転写されるヌクレオチド配列を含むベクターを、薬剤学的に許容される担体中に含む治療用組成物を特徴とする。本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および請求の範囲より明らかとなろう。図面の簡単な説明図１は、HCVゲノムの5'領域の構造および組織を示す概略図である。4個のAUG コドンの位置が下向きの矢印で示されている。三つの小さなオープンリーディングフレーム（ORF 1〜3）が斜線を施した四角で示されており、コアタンパク質をコードするORFが大きな模様なしの四角で示されている。18S rRNA相補配列はORF 2とORF3の間に位置しており（Brown et al.，Nucl.Acids Res．20: 5041-5045， 1992参照）、それは黒い四角で示されている。二つのIRES領域は5'NCRに存在することが報告されており、それらは小さい方の模様なしの四角で示されている（ Tsukiyama-Kohara et al.，J．Virol．66: 1476-1483，1992、Wang et al.，J． Virol．67: 3338-3344，1993参照）。本発明のオーバーラップするオリゴは、HC Vのコアをコードする領域の5’NCRおよび5’末端を完全に含んでいる。水平方向の矢印は、本研究において用いたセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴを示している。この矢印の先端は、オリゴの3’末端を示している。図2Aは、本研究においてHCV RNAを発現させるために用いたベクターの構造的な組織を示す概略図である。T7プロモーターおよびHCVのII型またはHCVのIII型のいずれかのcDNA配列（それぞれヌクレオチドの位置が1から1321、または2から 1321）がpUC19ベクターに挿入された。番号はHCV cDNAの対応するヌクレオチドの位置を示している。HCVコアのオープンリーディングフレームのAUGコドンが示されている。P22はHCVのヌクレオキャプシドタンパク質と推定されており、gp35 はHCVのエンベロープタンパク質の一つと推定されている(Hijikata et al.，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 88: 5547-5551，1991参照)。図2Bは、II型のHCV RNAのインビトロでの翻訳産物を、SDS-PAGEによって分画したオートラジオグラムである。主要なコア−エンベロープタンパク質産物は、図示されているように約34キロダルトン（kD）の位置に移動する。図3Aは、アンチセンスオリゴA161（配列番号：6）によってHCV RNA翻訳が用量依存的に阻害されることを示す表である。この実験においてセンスオリゴS120（配列番号：32）を陰性対照として用いた。オリゴを、鋳型のHCV RNAに対してモル比率を1：1から100：1まで変化させて反応液に加えた。二つのオリゴによるタンパク質合成の阻害のパーセント割合が示されている。図3Bは、ルシフェラーゼmRNAの翻訳に対する、アンチセンスオリゴA161（配列番号:6）およびセンスオリゴS120（配列番号：32）の効果を示した表である。図4は、HCV RNAのA377（配列番号：17）により決定される領域におけるアンチセンスオリゴの効果について配列を詳細に分析した結果を示すグラフである。「A」の後ろの数字は、対応するHCVゲノムのオリゴの5'末端の位置を示しており、括弧内の数字はオリゴの長さを示している。オリゴの位置および配列の特異性は左に図示されている。この矢印の先端はオリゴの3'末端を示している。示されたそれぞれのオリゴによるII型HCV RNAの翻訳を阻害するパーセント割合は、右に示されている。図5は、cDNA合成反応物を6％変性（尿素）ポリアクリルアミドゲル上で分画したオートラジオグラムである。この反応は、鋳型としてHCV RNAを用い、プライマーとしてオリゴA65（配列番号：2、レーン1）、A103（配列番号：4、レーン2 ）、A377（配列番号：17、レーン3）、およびA387（配列番号：18、レーン14）を用いて行った。優勢なcDNA産物は番号を付した矢印で示されており、展開されなかったオリゴプライマーはゲル（ODN）の底部に示されている。図6は、インビトロで翻訳反応を行った際のHCV RNAの安定性を示したオートラジオグラムである。［α-³³P］で標識されたHCV RNAを、アンチセンスオリゴA 377（配列番号：17、レーン1）、アンチセンスオリゴA367（配列番号：16、レーン2）、センスオリゴS120（配列番号：32、レーン3）、および関連のないオリゴ（レーン4および5）とともにインキュベートした。このRNA混合物をウサギの網状赤血球の溶菌液（レーン1〜4）とともにインキュベートした後、抽出した。レーン5は、ウサギの網状赤血球の溶菌液と混合してから、30℃で15分間のインキュベートを行うことなくすぐに抽出したHCV RNAを示している。全長HCV RNA（1 300ヌクレオチド）が「a」で示されており、約900および380ヌクレオチドの開裂したHCV RNA産物がそれぞれ「b」および「c」で示されている。詳細な説明本発明は、HCV RNA翻訳を阻害する方法において用いることのできるアンチセンスオリゴを提供する。本発明のアンチセンスオリゴには、DNA、RNA、またはそれらの修飾物もしくは組合せが含まれる。オリゴに含まれる修飾物の例としては、ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド内結合、例えばホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルホスホジエステル結合、ホスホロジチオネート結合、ホスホルアミデート結合、ホスホトリエステル結合、またはホスフェートエステル結合があり（Uhlman et al.，Chem．Rev．90(4): 544-584，1990 、Anticancer Reserch 10:1169，1990参照）、それらはオリゴ中に存在し、結果としてオリゴの安定性を増大させる。またオリゴの安定性は、3’−デオキシチミジンまたは2’位を（例えばアルキル基で置換された）置換されたヌクレオチドを合成過程で導入することによって、フェニルイソ尿素誘導体としてオリゴを提供することによって、またはアミノアクリジンもしくはポリリジンなどの他の分子をオリゴの3'末端に結合させること（例えば、Anticancer Reserch 10: 116 9-1182，1990参照）によっても増大させることができる。本発明のオリゴを含む RNAおよび／またはDNAヌクレオチドの修飾は、オリゴ全体に渡って存在していてもよいし、またはオリゴの選択された領域、例えば5’末端および／または3’末端に存在していてもよい。またアンチセンスオリゴは、標的組織に侵入する能力を高めるために、例えば親油性の化合物に結合させることによって修飾することもできる。本発明のアンチセンスオリゴは、下記に記載するような、標準的な化学合成、構成成分であるオリゴの連結、およびオリゴをコードするDNAの転写を含む、当技術分野において既知のいかなる方法によって製造してもよい。肝細胞はHCV感染を受けやすく、したがって本発明のアンチセンスオリゴの好ましい標的細胞である。肝細胞をアンチセンスオリゴの標的とさせるには、肝細胞特異的な受容体のリガンドにこのオリゴを結合させることによって達成することができる。例えば、このオリゴはアシアロオロソムコイド、（ポリ）Ｌリジンアシアロオロソムコイド、または肝臓アシアロ糖タンパク質受容体のその他のいかなるリガンドに結合させてもよい（Spiess，Biochemistry 29(43): 10009-100 18，1990、Wuetal.,J．Biol．Chem．267(18): 12436-12439，1992、Wu et al.， Biotherapy 3: 87-95，1991参照）。同様にアンチセンスオリゴは、肝細胞−特異的な受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体との複合体にすることによって肝細胞を標的にできる。またアンチセンスオリゴは、下記に記載したような特異的なベクターを用いて肝細胞を標的とすることもできる。本発明のアンチセンスオリゴは、外因的に標的の肝細胞に提供してもよい。また別の方法では、アンチセンスオリゴは、そのアンチセンスオリゴをコードする配列に機能的に結合したプロモーター配列を含む核酸分子を転写することによって標的細胞内で産生させることもできる。この方法において、核酸分子は、非複製の線状もしくは環状のDNAまたはRNA分子内に含まれているか、自律複製するプラスミドもしくはウイルスベクター内に含まれているか、または宿主のゲノムに組み込まれている。肝細胞を形質転換することができるベクターは本発明の方法で用いることができる。好ましいベクターはウイルスのベクターであって、例えば複製能欠損肝炎ウイルス類（例えばHBVおよびHCV）由来のベクター、レトロウイルス類（例えば、WO89/07136; Rosenberg et al.，N．Eng．J．Med．323(9):5 70-578，1990参照）由来のベクター、アデノウイルス（例えば、Morsey et al. ，J．Cell．Biochem.，Supp．17E，1993参照）由来のベクター、アデノー随伴ウイルス（Kotin et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA87: 2211-2215，1990参照）由来のベクター、複製能欠損単純庖疹ウイルス類（HSV、Lu et al.，Abstract ，page 66，Abstracts of the Meeting on Gene Therapy，Sept．22-26，1992， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York参照）由来のベクター、およびこれらのベクターに何らかの修飾を加えたベクターが含まれる。発現ベクターを構築する方法は、当業者に周知である（例えば、Molecular Cl oning: A Laboratory Manual，Sambrook et al.，eds.，Cold Spring Harbor La boratory，2nd Edition，Cold Spring Harbor，New York，1989参照）。適切な調節配列を、当業者に周知の方法を用いて本発明のベクターに挿入することができる。その方法としては例えば、相同的組換え法（Graham et al.，J． Gen．Virol．36: 59-72，1977参照）、または他の適当な方法（Molecular Cloni ng: A Laboratory Manual，Sambrook et al.，eds.，Cold Spring Harbor Labor atory，2nd Edition，Cold Spring Harbor，New York，1989参照）が挙げられる。プロモーターが、アンチセンスオリゴをコードする核酸配列の５’に機能的に結合するように、ベクターに挿入される。真核細胞内で転写を直接的に開始させることのできるプロモーターを本発明で用いることができる。例えば、非組織特異的プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（DeBernardi et al.，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 88: 9257-9261，1991、およびそれに記載の文献参照）、マウスのメタロチオニンI遺伝子（Hammer et al.，J．Mol．Appl．Gen．1: 273- 288，1982参照）、HSVチミジンキナーゼ（McKnight，Cell 31: 355-365，1982参照）、および初期SV40（Benoist et al.，Nature 290: 304-310，1981参照）などのプロモーターを用いることができる。本発明のアンチセンスオリゴのウイルス配列に対する特異性のため、非組織特異的プロモーターによって誘導される非肝胞でのアンチセンスHCVオリゴの発現は非肝細胞に無害であると考えられるため、非組織特異的プロモーターを本発明で用いることができる。しかしながら、本発明で用いられる好ましいプロモーターは、肝細胞−特異的なプロモーターであり、このプロモーターの利用によりアンチセンスオリゴが主として肝細胞で発現するのを確実にすることができる。好ましい肝細胞−特異的プロモーターとしては、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ1アンチトリプシン、レチノール結合タンパク質、およびアシアロ糖タンパク質受容体のプロモーターなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。例えばサイトメガロウイルス、単純庖疹ウイルス（I型およびII型）、肝炎ウイルス（A、B、およびC型）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV； Fang et al.，Hepatology 10: 781-787 ，1989）から得られるようなウイルスのプロモーターおよびエンハンサーも本発明で用いることができる。本発明のアンチセンスオリゴ、およびそれらをコードする核酸配列を含む組換えベクターを、HCV感染の予防または治療のための治療用組成物で用いることができる。一般的にアンチセンスオリゴの治療への応用については、例えば「LeDo an et al.，Bull．Cancer 76: 849-852，1989」、「Dolnick，Biochem，Pharmac ol．40: 671-675，1990」、「Crooke，Annu．Rev．Pharmacol．Toxicol．32，32 9-376，1992」などの文献に記載されている。本発明の治療用組成物は単独で、または混合剤としても用いることができる。または、一つまたは複数の、他のアンチセンスオリゴもしくは組換えベクターを含む物質、オリゴもしくはその組換えベクターの生物学的な安定性を高める物質、または選択的に肝細胞に侵入できる治療用組成物の能力を高める物質を化学的に組み合わせてもよい。本発明の治療用組成物は、薬剤学的に許容される担体（例えば生理食塩水）に入れて投与することができる。この担体は投与の方法および経路に基づいて、並びに標準的な薬剤学的実用法に基づいて選択される。好ましい薬剤学的な担体、および薬剤学的処方において薬剤学的に用いられる必要成分は、当分野において標準的な参考書である「Remington's Pharmaceutical Sciences」、およびUSP／NFに記載されている。本発明の治療用組成物は、当業者によって適切であると決定された用量で投与することができる。適切な用量は、HCV感染によって引き起こされる疾病を緩解する効果を持つ量であるか、および／またはHCV感染を妨げる効果のある量である。特定の薬剤の薬物動態学的および薬力学的の特徴、並びに投与の方法および経路に依存してその用量が変化することが予測される。それは受け入れ側の年齢、体重、および健康状態（腎臓および肝臓の機能を含む）、疾病の性質および程度、治療の頻度および期間、もしあれば同時に行う治療の型、並びに望まれる効果にも同様に依存する。有効用量は、体重１キログラムあたり約0.1〜100mgの有効成分を含むと予測される。分割用量で、または徐放性の形態で与えられる体重１キログラムあたり通常0.5〜50mgの有効成分、好ましくは1〜10mgの活性成分が適当である。本発明の治療用組成物は、例えば経口投与、腹腔内投与、または静脈内投与などの、当業者によって決定されるいかなる適当な方法によっても患者に投与することができる。また、必要であれば、外科的に標的組織に治療薬を投与することもできる。本発明の治療薬は、当業者の決定により、必要に応じて繰り返し投与される。また本発明は、真核細胞に核酸をインビトロで転移する他の方法も含んでいる。例えば核酸は、リポソーム、非ウイルス性核酸に基づくベクター、赤血球ゴースト、またはマイクロスフェア（微粒子：例えば、米国特許第4,789,734号、米国特許第4,925,673号、米国特許第3,625,214号; Gregoriadis，Drug Carriers i n Biology and Medicine，pp．287-341(Academic Press，1979)参照）に包含されていてもよい。さらに、アンチセンスオリゴの輸送は、例えば燐酸カルシウム沈澱物として、または脂質と結合させて、そのオリゴを標的組織に直接注入することによって行うこともできる。実験データ材料および方法 HCV cDNAの構造および発現二人の日本人の抗HCV陽性血清(THおよびNT。名古屋大学のカクム・シンイチ（ Shinichi Kakumu）博士のご厚意により頂いた)から、既述されているように(Yos hioka et al.，Hepatol．16:293-299，1992)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、HCV cDNA(ヌクレオチド1位から1321位)を単離した。増幅されたcDNA断片をpUC19クローニングベクターに挿入した。各個体から得た３個のクローンのヌクレオチド配列を、ジデオキシチェーンターミネーション配列決定法によって決定した。これらのクローンは、同一個体内で0.3から0.6％のヌクレオチド配列変異を示し、２つの個体間では、21.6から21.9％のヌクレオチド配列変異を示した。THからのクローンは、II型HCVクローンであるHCV-BK(Takamizawa et al.，J． Virol.65:1105-1113，1991)およびHCV-J(Kato et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA ，87:9524-9528，1990)に、94.2から95.1％のヌクレオチド配列相同性を示した。さらに解析を進めるために、THからのクローンの一つで、2-2と名付けられたクローンを選んだ。NTからのクローンは、III型HCVクローンであるHCV-J6(Okamo to et al.，J．Gen．Virol．72:2697-2704，1991)に、94.2から94.5％のヌクレオチド配列相同性を示した。さらに研究するために、患者NTから、4-1と名付けられたクローンを選んだ。HCV挿入配列の5’末端上流に、バクテリオファージT7 のプロモーター配列を挿入し(図２)、それによってできた発現ベクターを、II型 HCV遺伝子型についてはpTHと名付け、III型HCV遺伝子型についてはpNTと名付けて、次の実験に用いた。オリゴヌクレオチドの設計および合成ミリゲン／バイオサーチ8750合成機を用いた標準的なホスホロアミダイト化学法により、pTHII型HCVの配列に基づいて、一連のセンス鎖、アンチセンス鎖デオキシオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴは、55℃で(６時間)脱アンモニアし、逆相HPLC(Tritylon，TEAA 0.1 M pH 7.25)およびアセトニトリル勾配によって、0.1 M NaHC0₃でNAP25カラム(ファルマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を通して脱塩し、精製した。オリゴを凍結乾燥し、１M酢酸で１時間脱保護し、TEAで中和してNAP 10カラムにかけ、凍結乾燥した。本実験で用いられたオリゴの、HCVヌクレオチドに相当する位置を図１に示す。組み合わせると、アンチセンスオリゴは、HCVの5'NCR全域およびHCVコア領域の一部に対して相補的である。各オリゴに付けた番号は、オリゴの5'末端に相当する、HCVのゲノムマップ上の位置を示している。図４に示されている括弧の中の数字は、オリゴの長さを示している。オリゴヌクレオチドの長さおよびG-C含量を表１に示す。実験に用いられたオリゴのモル濃度は、配列の長さに応じて調整した。 HCV RNAのインビトロでの転写および翻訳 pTHおよびpNTを、インビトロで転写させる前に、HindIIIを用いて直鎖化し、プロテアーゼKで消化し、フェノール／クロロフォルムで抽出して、エタノールで沈殿させた。T7 RNAポリメラーゼ(プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン)を用いて転写反応を行い、この結果できた転写産物を尿素-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(尿素-PAGE)によって精製した後、エタノールで沈殿させた。転写反応の間、必要に応じて、RNA転写産物を[α-³³P]UTP(ニューイングランドヌクレア社、マサチューセッツ州ビレリカ)で標識した。特に示さない限り、II型HCV RNAを実験に用いた。 1μgのHCV RNAを、10倍のモル数のセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴと、または蒸留水と混合した。標的HCV RNAおよびオリゴを完全にアニールさせるために、混合液を70℃で5分間加熱して、50℃に10分間置いた後、室温で10分間インキュベートした。いくつかの実験では、アニーリングの段階を省いた。オリゴ非存在下でインキュベートしたHCV RNA、およびHCV RNA非存在下でインキュベートしたウサギ網状赤血球溶解物を対照として用いた。インビトロ翻訳反応は、僅かな修正は加えたが、既述されたところ(Pelham et al.，Eur．J．Biochem．6 7:247-256，1976)に従って行なった。ウサギ網状赤血球溶解物(プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン)に、HCV RNA、またはRNA-オリゴハイブリッドを、[³⁵S ]-メチオニン(ニューイングランドヌクレア社、マサチューセッツ州ビレリカ)の存在下で最終容量が25μlになるように添加した。30℃で1時間インキュベートした後、各反応液から4μlを採って、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で解析した。ゲルを乾燥させて、X線フィルムに感光させ、フィルムを現像してデンシトメーターによるスキャニングにより解析した。各反応液を2μlずつTCAで沈殿させた。液体シンチレーションカウンターを用いて(Pe1ham et al.，Eur．J．Biochem．67:247-256，1976)、翻訳された蛋白質産物への放射活性の特異的な取り込みを測定した。典型的には、翻訳された蛋白質産物で500〜5000 cpm/μlが検出された。HCV RNAを含まない対照の混合液のバックグランド値は、およそ500 cpm/μlであった。対照反応で産生されるHCVコア・エンベロープの融合蛋白質の量を基準にして、オリゴヌクレオチド存在下で合成されたHCV蛋白質の量を、バックグランド値を引いた後に比較した。このデータを用いて、各オリゴによるHCV RNAの翻訳阻害の割合を百分率で計算した。 HCV RNAからのcDNA合成オリゴA65、A103、A377およびA387(それぞれ配列番号:2、4、17および18)を、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ(プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン)を用いて、[γ³³P]-ATP(ニューイングランドヌクレア社、マサチューセッツ州ビレリカ) で末端標識した。セファデックスG-25スピンカラム(ベーリンガー・マンハイム社、ドイツ)に通して精製した後、オリゴへの放射活性の特異的な取り込みを測定した。適当な量の非標識オリゴを加えて、各オリゴの特異的活性を標準化した。標識したオリゴを、インビトロ翻訳反応に関して述べたのと同じ条件で、HCV RNA とハイブリダイズさせ、cDNAをモロニー（Moloney）マウス白血病ウイルス逆転写酵素(ギブコBRL社、メリーランド州ゲティスバーグ)を加えて合成した。各反応混合液から等量をとって、変性尿素-PAGEで分画した。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーを用いて生成物を可視化した。 HCV RNAの安定性インビトロ翻訳反応液中に存在するRNaseII活性のレベルを測定するために、オリゴA377(配列番号:17)およびA387(配列番号:18)を[α-³³P]で標識したHCV RN Aとハイブリダイズさせて、上記と同じ条件でインキュベートし、ウサギ網状赤血球溶解物に加えた。30℃で15分間インキュベートした後、RNAを抽出し(Chomcz ynski et al.，Anal．Biochem．162:156-159，1987)、抽出したRNAの等量分を変性尿素-PAGEで解析した。結果 HCV蛋白質のインビトロ翻訳 HCVのコア・エンベロープ融合蛋白質を発現させ、アンチセンスオリゴヌクレオチドがHCV RNAの翻訳を阻害できるかを判定するために、無細胞のインビトロ翻訳系を用いた。これらの実験で用いられた発現ベクターには、完全長のHCV 5 ’NCR、並びにII型およびIII型HCV cDNAのコア全域およびエンベロープ領域の一部を含む構造コーディング領域が含まれている(図２)。このベクターから転写されるRNAには、HCVのコーディング領域の980ヌクレオチドが含まれる。II型HCV R NAからのインビトロ翻訳産物は、電気泳動で34 kDの蛋白質として分画される(図２)。インビトロ蛋白質翻訳産物がHCVに関係していることは、ポリクローナル抗 HCV抗体、および組み換えHCVコア蛋白質に対して作製したモノクローナル抗体による免疫沈殿によって確認された。アンチセンスオリゴによるHCV RNAの阻害 HCV 5’NCRに対応する一連のアンチセンスオリゴおよびセンスオリゴの、HCV RNAのインビトロ翻訳に対する効果を解析した(図１)。これらの実験は二重に行ない、図１に示した各オリゴについて少なくとも2回は反復した。HCV RNAは、各オリゴとハイブリダイゼーションした後、ウサギ網状赤血球溶解物の系に入れてインキュベートした。そして、これらの反応で産生された蛋白質の量を、コア・エンベロープ融合蛋白質に取り込まれる放射活性レベルを測って定量した。感光したX線フィルムをデンシトメーターでスキャンニングして、さらに詳しく定量した。これらの解析結果を表Iにまとめ、各オリゴのII型およびIII型HCV RNAの翻訳に対する効果を示した。センスオリゴは、HCV RNAの翻訳をほんの僅かに低下させるか、または実際には、オリゴを含まない反応に較べて、HCVの蛋白質合成を促進した。これに対して、アンチセンスオリゴのほとんどは、オリゴを含まない反応に較べて、HCV RNAの翻訳を有意なレベルにまで阻害した。例えば、A65 、A161、A175、A339、A367およびA377(それぞれ、配列番号:2、6、7、14、16および17)の6個のアンチセンスオリゴは、II型HCV RNAおよびIII型HCV RNAの翻訳に対して、50％以上の阻害効果を示した。A161(配列番号：6)の標的配列は、HCV 5’NCRの中で高度に保存されたドメインにある。しかし、この領域と重複するその他のアンチセンスオリゴは、A161よりも有意に低いHCV RNAの翻訳阻害を示した。例えば、A147(配列番号:5)は、20.4％の阻害を示したにすぎない。A367( 配列番号:16)は、開始コドンおよびHCVコアのコーディング領域に相補的であるが、このオリゴが、調べたオリゴの中では最も高いレベルでHCV RNAの翻訳阻害( 97.6％)を示した。オリゴA367(配列番号:16)およびオリゴA377(配列番号:17)は、互いに17ヌクレオチド長の領域で重複しており、pNT II型HCV RNAは、A367(配列番号:16)オリゴの標的配列と比較して1ヌクレオチドの突然変異またはミスマッチを有しているにも関わらず、II型HCVコア蛋白質の合成も、III型HCVコア蛋白質の合成も実質的に阻害した。しかし、この領域で重複する他のオリゴは、オリゴA349(配列番号:15)およびオリゴA387(配列番号:18)からも分かるように、A3 49(配列番号:15)のようにコアのAUG開始コドンに相補的であっても、僅かな阻害的な効果しか示さなかった。別のHCVコアのコーディング領域のアンチセンスオリゴであるA446(配列番号:19)も、僅かな阻害効果を示した。これらをまとめると、これらの結果から、HCVコアのオープンリーディングフレームの最初のAUGコドンの直下流の配列が、アンチセンスオリゴによるHCV RNAの翻訳阻害に関するよい標的であることが示された。A65 (配列番号:2)も、このオリゴに相当するHCV RNAの領域が、開始コドンからかなり上流であるにも関わらず、実質的な程度まで、HCV RNAの翻訳を阻害した。興味深いことに、オリゴA211(配列番号:8)は、18S r RNAと推定される相補的な配列(Brown et al.，Nucl．Acids．Res．20:5041-5045，1992)に結合するが、II型 HCVRNAの翻訳に対しても、III型HCV RNAの翻訳に対しても阻害的な効果をもたないことが明らかになった。さまざまなオリゴのG-C含量およびT_mは、オリゴが示すRNA翻訳阻害の程度に関係していなかった(表Ｉ)。 A161(配列番号:6；図３)が用いられたとき、HCV RNAの翻訳に対する用量依存的な阻害的な効果が観察された。用いた中で最も高いA161濃度で(オリゴ：RNAのモル比=100:1)、HCV蛋白質の合成は、ほとんど完全に阻止された。このような高濃度でも、センスオリゴ(S120；配列番号:32)は、HCV RNAの翻訳に阻害的な効果を持たなかったことは、注目に値する。さらに、対照として、これらの両オリゴを、ルシフェラーゼをコードする無関係なmRNAとともにインキュベートした。A1 61(配列番号:6)もS120(配列番号:32)も、使用したいずれの濃度においてもルシフェラーゼmRNAの翻訳を阻害しなかった(図３)。他のアンチセンスオリゴは、実際には、ルシフェラーゼmRNAの翻訳を促進した(表II)。この観察結果は、HCV RN Aの翻訳が、一定のセンスオリゴによって刺激されるという観察(表Ｉ)を連想させる。要約すると、一定のアンチセンスオリゴは、インビトロで、無関係なmRNA の翻訳レベルをどちらかといえば上昇させるけれども、配列特異的な方法でHCVR NAの翻訳を阻害する。インビトロの翻訳反応の前に、アンチセンスオリゴが標的RNAにアニールすることが、翻訳を効果的に阻害するために必要か否かを判定するために、アニーリング段階を省いた翻訳反応を行なった。HCV RNAの翻訳の直前に、アンチセンスオリゴを加えて阻害の程度を測定した。アニーリング段階を省くと、アニーリング段階を行った場合に比べて、HCV RNAの翻訳を阻害するレベルは同じか、または高くなった(表II)。 A377（配列番号：17）領域内の短いアンチセンスオリゴによるHCV RNA翻訳の特異的な阻害 II型およびIII型HCV RNAの翻訳の阻害因子として調べた中で、オリゴA377(配列番号:16)およびオリゴA377(配列番号:17)が最も効果的であった(表Ｉ)。III型 HCV RNAの350番目のヌクレオチドには突然変異があり（図5）、この位置に相補的な配列が、オリゴA367には含まれているが、オリゴA377には含まれていないため、オリゴA377(配列番号:17)で決定されるHCVの領域を、さらに、HCV RNAの翻訳の阻害に必要な特異的なヌクレオチド配列を調べるための実験に用いることにした。A377(配列番号:17)で決定されるHCVの領域に由来する異なった長さのオリゴを、II型HCV RNAを用いたインビトロ翻訳アッセイで調べた。A377(配列番号:1 7)配列の3’末端からオリゴヌクレオチドを欠失させてゆくと、欠失させた長さに比例して阻害程度が減少した。これに対して、A377(配列番号:17)の5’末端からの欠失により、阻害効果が78.4％(A377；配列番号:17；27ヌクレオチド)からA 367(配列番号:16；17ヌクレオチド)で96.9％まで増加した。長さが12ヌクレオチドしかないA362(配列番号:25)が、HCV RNAの翻訳を有意に阻害した(80.7％)ことは注目に値する。10ヌクレオチド長しかないオリゴ、例えば、オリゴA362(配列番号:27)およびA360(配列番号:28)を用いると、翻訳の阻害は実質的に低下した。これらの実験の結果、II型およびIII型HCVクローンで、ともに高度に保存されているHCV RNAの351〜367位のヌクレオチド領域が、アンチセンスオリゴによる阻害にとって、特に好適なウイルスRNA標的であることが明らかになった。アンチセンスオリゴによるHCV cDNA合成さまざまなアンチセンスオリゴが示す、HCV RNAの翻訳に対する阻害程度を決定する上で、アンチセンスオリゴの結合効率およびヌクレオチド配列特異性がいずれも一定の役割を担っているようである。異なったアンチセンスオリゴのHCV RNAに対する相対的な結合親和性を測定するために、cDNA合成アッセイを行なった。HCV RNAの翻訳を阻害するオリゴA65(配列番号:2)およびA377(配列番号:17) 、それぞれオリゴA65(配列番号:2)およびA377(配列番号:17)と同じHCVゲノムの一般的な領域に由来するが後者とは異なりHCVの翻訳を阻害しないオリゴA103(配列番号:4)およびA387(配列番号:18)を解析に用いた。オリゴを[γ-³³P]ATPで標識し、すべての実験において、特異的活性を標準化した。翻訳アッセイで用いたのと同じHCV RNA対オリゴの比率(1:10)を、cDNA合成反応に用いた。図５は、これらの実験結果を示している。主なcDNA産物を、尿素-PAGEによって予想される大きさに分画した。いくつかの小さなバンドがレーン３および４で検出された(図５)が、これらは、一部、cDNAの伸長を妨げる、鋳型RNAの二次構造によるためかもしれない。H CV RNAの翻訳を阻害するオリゴA377(配列番号:17；図５、レーン３)を含む反応と、HCV RNAの翻訳を阻害しないオリゴA387(配列番号:18；図５、レーン４)を含む反応において生成されるDNAラダーのパターンは、ほとんど同一であった。これらのデータによって、HCV RNAの翻訳の阻害は、オリゴが非特異的にHCV RNA標的配列に結合することから生じる作用ではなく、むしろ、HCV RNA標的配列／アンチセンスオリゴの相互関係の特異性によるということが示された。さらに、プライマーとして異なったアンチセンスオリゴを用いた反応において産生されるcD NA産物のレベルが同じだったことから、これらのデータは、異なったアンチセンスオリゴを用いたときに観察される、HCV RNA翻訳の阻害の差違は、オリゴの異なった結合親和性によるのではなく、HCV RNAへのオリゴの結合特異性によることを示している。 HCV RNAの安定性 RNase H活性が、アンチセンスオリゴの阻害効果の主な機構のひとつであることが、提唱されている(Uhlmann et al.，Chem．Rev．90(4):543-584，1990)。インビトロ翻訳反応におけるHCV RNAの安定性を決定するために、[³³P]標識したHC V RNAを合成して、ゲル電気泳動によって精製した。標識したHCV RNAをオリゴとハイブリダイズさせ、翻訳アッセイでウサギ網状赤血球溶解物とともにインキュベートした。30℃で15分間インキュベートした後、HCV RNAを抽出して、変性条件下でゲルに流した。オリゴなしでインキュベートしたHCV RNAは、予想される全長の転写産物、および少量の分解産物を示した(図６、レーン４および５)。しかし、オリゴとハイブリダイズさせたRNAは、さらに二本の主要なバンドを示した(図６、レーン１および２)。短い方のRNAバンドのサイズは、RNase H活性によって生じる切断産物と長さが一致する。これらの条件の下で、標識したHCV RNA が完全に分解されなかったことに注意すべきである。さらに、阻害効果をもつオリゴでも、持たないオリゴでも、HCV RNAの切断レベルは同様であることが観察された。したがって、RNase Hによる分解は、上述のアンチセンスオリゴがHCV R NAの翻訳を阻害する主な機構ではないと考えられる。その他の態様上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を、容易に把握することができ、本発明の意図および範囲を逸脱することなく、さまざまな用法および条件に合わせるために、本発明にさまざまな改変および修正を行うことができる。オリゴの生物学的機能（すなわち、HCV RNAにハイブリダイズしてその翻訳を阻害する、オリゴの能力）に影響を及ぼさない、開示された配列を少し変化させたオリゴも、本発明の範囲に含まれると理解されるべきである。本明細書に引用された全ての文献は、全体が参照として本明細書に含まれる。

Claims

【特許請求の範囲】 1．RNAを該RNAの一部に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、C型肝炎ウイルスのRNAの翻訳を阻害する方法であって、該オリゴヌクレオチドが配列番号：1〜28からなる群より選択される配列を含むRNAまたはDNA分子であり、該オリゴヌクレオチドが約10〜約400ヌクレオチドの長さである、方法。 2．オリゴヌクレオチドが約250ヌクレオチド以下の長さである、請求の範囲1の方法。 3．オリゴヌクレオチドが約100ヌクレオチド以下の長さである、請求の範囲2の方法。 4．オリゴヌクレオチドが約50ヌクレオチド以下の長さである、請求の範囲3の方法。 5．オリゴヌクレオチドが約12〜約28ヌクレオチドの長さである、請求の範囲4の方法。 6．Ｃ型肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスのI型、II型、III型、IV型、およびV型からなる群より選択されるものである請求の範囲1の方法。 7．Ｃ型肝炎ウイルスRNAが動物細胞内に存在する、請求の範囲1の方法。 8．動物細胞が肝細胞である、請求の範囲7の方法。 9．動物細胞が咄乳動物に存在する、請求の範囲7の方法。 10．哺乳動物がヒトである、請求の範囲9の方法。 11．接触が、動物細胞においてオリゴリボヌクレオチドとしてオリゴヌクレオチドを生成するように転写される配列を含むベクターを該動物細胞に導入することによって行われる、請求の範囲7の方法。 12．オリゴヌクレオチドが配列番号：2、6、7、14、16、17、20、および23〜26 からなる群より選択される配列を含む、請求の範囲1の方法。 13．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：2を含む、請求の範囲1 の方法。 14．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：6を含む、請求の範囲1 の方法。 15．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：7を含む、請求の範囲1 の方法。 16．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：14を含む、請求の範囲 1の方法。 17．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：16を含む、請求の範囲 1の方法。 18．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：17を含む、請求の範囲 1の方法。 19．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：20を含む、請求の範囲 1の方法。 20．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：23を含む、請求の範囲 1の方法。 21．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：24を含む、請求の範囲 1の方法。 22．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：25を含む、請求の範囲 1の方法。 23．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：26を含む、請求の範囲 1の方法。 24．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号：1、3、5、8〜13、15 、18、19、21、22、27、および28からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求の範囲1の方法。 25．C型肝炎ウイルスのRNAの一部に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドであって、配列番号：1〜28からなる群より選択される配列を含むRNAまたはDNA分子であり、約10〜約400ヌクレオチドの長さである、オリゴヌクレオチド。 26．約250ヌクレオチド以下の長さである、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 27．約100ヌクレオチド以下の長さである、請求の範囲26のオリゴヌクレオチド。 28．約50ヌクレオチド以下の長さである、請求の範囲27のオリゴヌクレオチド。 29．約12〜約28ヌクレオチドの長さである、請求の範囲28のオリゴヌクレオチド。 30．ヌクレオチド配列が配列番号：2、6、7、14、16、17、20、および23〜26からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 31．ヌクレオチド配列が配列番号：2を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 32．ヌクレオチド配列が配列番号：6を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 33．ヌクレオチド配列が配列番号：7を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 34．ヌクレオチド配列が配列番号：14を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 35．ヌクレオチド配列が配列番号：16を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 36．ヌクレオチド配列が配列番号：17を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 37．ヌクレオチド配列が配列番号：20を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 38．ヌクレオチド配列が配列番号：23を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 39．ヌクレオチド配列が配列番号：24を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 40．ヌクレオチド配列が配列番号：25を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 41．ヌクレオチド配列が配列番号：26を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 42．ヌクレオチド配列が配列番号：1、3、5、8〜13、15、18、19、21、22、27、および28からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 43．動物細胞内で請求の範囲23のオリゴヌクレオチドを生成するように転写されるヌクレオチド配列を含むベクターであって、該オリゴヌクレオチドがオリゴリボヌクレオチドである、ベクター。 44．転写されるヌクレオチド配列が肝細胞で機能する転写調節配列に機能的に結合している、請求の範囲43のベクター。 45．オリゴデオキシヌクレオチドである、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 46．オリゴリボヌクレオチドである、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 47．ホスホロチオネートオリゴヌクレオチドである、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 48．メチルホスホネートオリゴヌクレオチドである、請求の範囲25のオリゴヌクレオチド。 49．請求の範囲25のオリゴヌクレオチドを薬剤学的に許容される担体中に含む、治療用組成物。 50．請求の範囲43のベクターを薬剤学的に許容される担体中に含む、治療用組成物。