DE69330372T2 - ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN FüR DIE BEHANDLUNG VON MIT HEPATITIS C VIREN ASSOZIIERTEN KRANKHEITEN - Google Patents

ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN FüR DIE BEHANDLUNG VON MIT HEPATITIS C VIREN ASSOZIIERTEN KRANKHEITEN

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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Planung und die Synthese von Antisense- Oligonucleotiden, die verabreicht werden können, um die Replikation von Hepatitis C-Viren in vivo oder in vitro zu hemmen und um Krankheiten zu behandeln, die mit Hepatitis C-Viren assoziiert sind. Diese Verbindungen können entweder prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden, um die Ernsthaftigkeit von Krankheiten zu reduzieren, die mit Hepatitis C- Viren assoziiert sind. Es werden Oligonucleotide offenbart, die spezifisch mit RNA-Zielen hybridisierbar sind.
  • Die vorherrschende Form von Hepatitis, die gegenwärtig von Transfusionen resultiert, steht nicht in Zusammenhang mit dem kürzlich charakterisierten Hepatitis A-Virus oder Hepatitis B-Virus, und ist als Nicht-A, Nicht-B Hepatitis (NANBH) bezeichnet worden. NANBH ist gegenwärtig für über 90% der Fälle an Hepatitis nach einer Transfusion verantwortlich. Eine Abschätzung der Häufigkeit von NANBH bei Empfängern von Transfusionen bewegt sich zwischen 5%-13% bei denen, die Blut von Freiwilligen erhalten, oder 25%-54% bei denen, die Blut von kommerziellen Quellen erhalten.
  • Obwohl akute NANBH oft weniger ernsthaft ist als die akute Erkrankung, die von Hepatitis A-Viren oder Hepatitis B-Viren verursacht wird, führt sie gelegentlich zu ernsthafter oder fulminanter Hepatitis. Von größerem Bedenken ist, dass das Fortschreiten zu chronischer Hepatitis nach NANBH viel stärker verbreitet ist als nach Infektion mit entweder Hepatitis A oder Hepatitis B. Es ist berichtet worden, dass chronische NANBH in 10%-70% der infizierten Individuen auftritt. Diese Form von Hepatitis kann sogar von asymptomatischen Patienten übertragen werden und schreitet häufig fort zu bösartigen Krankheiten, wie Zirrhose und hepatozellulären Karzinomen. Chronische aktive Hepatitis, mit oder ohne Zirrhose, wird in 44%-90% der Hepatitisfälle nach Transfusion gesehen. Von den Patienten, die Zirrhose entwickeln, starb etwa ein Viertel an Leberversagen.
  • Chronische aktive NANBH ist ein bedeutendes Problem für Hämophile, die von Blutprodukten abhängen; 5%-11% der Hämophilen sterben an chronischer Lebererkrankung im Endstadium. Fälle an NANBH, die auf eine andere Ursache als Blut oder Blutprodukte zurückgeführt werden können, sind häufig assoziiert mit Krankenhausaufenthalt, zufälligem Nadelstich oder Tätowierung. Eine Übertragung durch engen persönlichen Kontakt kommt ebenfalls vor, obwohl dies bei NANBH weniger allgemein ist als bei Hepatitis B.
  • Die Ursache für die Mehrzahl von NANBH ist kürzlich identifiziert worden und wird nunmehr als Hepatitis C-Virus (HCV) bezeichnet. Houghton et al., EP-Offenlegungsschrift 318,216; Choo et al., Science 1989, 244, 359-362. Basierend auf serologischen Untersuchungen unter Verwendung von Antigenen, die mittels rekombinanter DNA-Technik hergestellt wurden, ist es nun klar, dass HCV die Ursache für die Mehrzahl von NANBH nach Transfusion ist. Clone von cDNA, die aus Nucleinsäure hergestellt wurden, die aus konzentrierten Viruspartikeln isoliert worden war, wurden ursprünglich mittels ihrer Fähigkeit isoliert, Polypeptide zu codieren, die mit Seren von NANBH-Patienten reagieren. Diese Clone hybridisieren mit RNA, aber nicht mit DNA, die aus infiziertem Lebergewebe isoliert worden war, was die Anwesenheit eines RNA-Genoms anzeigte. Hybridisierungsanalysen und die Sequenzierung der cDNA-Clone zeigten, dass die in infizierter Leber und Partikeln anwesende RNA die selbe Polarität wie der codierende Strang der cDNAs besaß; in anderen Worten ist das Virusgenom ein positives oder plus-Strang-RNA-Genom. Die EP-Offenlegungsschrift 318,216 (Houghton et al.) offenbart partielle genomische Sequenzen von HCV-1 und lehrt rekombinante DNA-Verfahren zur Clonierung und Expression von HCV-Sequenzen und HCV-Polypeptiden, Verfahren der HCV-Immundiagnostik, Verfahren der HCV- Sondendiagnostik, Antikörper gegen HCV, und Verfahren zur Isolierung neuer HCV- Sequenzen. Houghton et al. offenbaren auch zusätzliche HCV-Sequenzen und lehren die Anwendung dieser Sequenzen und Polypeptide bei der Immundiagnostik, Sondendiagnostik, bei der Herstellung von Antikörpern gegen HCV, bei der PCR-Technik und den Verfahren der rekombinanten DNA-Technik. Das Konzept der Verwendung von Antisense-Polynucleotiden als Inhibitoren der viralen Replikation wird offenbart, aber es werden keine spezifischen Ziele gelehrt. Ebenso werden Oligomersonden und -primer, die auf den offenbarten Sequenzen basieren, bereitgestellt. Die EP-Offenlegungsschrift 419,182 (Miyamura et al.) offenbart die neuen HCV-Isolate J1 und J7 und die Verwendung von Sequenzen, die unterschiedlich sind zu den HCV-1-Sequenzen, für die Durchmusterung und Diagnostik.
  • WO 92/12992 (Kotwal und Baroudy) offenbart neue immunogene HCV-Polypeptide mit Epitopen, die einzigartig sind für HCV und aus der strukturellen Region eines menschlichen HCV-Isolats abgeleitet sind. Bevorzugte Ausführungsformen sind dabei zwei HCV-Polypeptide, die als FGB1 und FGB2 bezeichnet werden und die vermutlich nahe der Nbeziehungsweise C-Enden einer mutmaßlichen Aminosäuresequenz abgeleitet sind, die vom 5'-Ende eines menschlichen HCV-Isolats codiert wird. Darüber hinaus offenbart das Dokument die entsprechenden Polynucleotidsequenzen und einzelsträngige Antisense-DNA- und -RNA-Sequenzen, die davon abgeleitet sind und von denen beschrieben wird, dass sie in der Lage sind, an HCV-RNA zu binden und die Translation zu blockieren und/oder die RNA- Replikation zu verhindern. Es scheint jedoch, dass die offenbarten Antisense-Sequenzen nicht funktionsfähig sind. Weiterhin erörtert es die Herstellung von Antikörpern gegen die immunogenen HCV-Polypeptide und von anti-idiotypischen Antikörpern zum Nachweis von HCV-Proteinen beziehungsweise anti-HCV-Antikörpern, und Impfstoffe zur Prophylaxe gegen eine HCV-Infektion, die die immunogenen Polypeptide umfassen. WO 92/02642 (Houghton et al.) ist gerichtet auf den Nachweis einer HCV-Sequenz und auf ein Verfahren zur Herstellung von Blut, das HCV-frei ist, unter Verwendung von Oligomeren, die in der Lage sind, an spezifische Bereiche des HCV-Genoms zu hybridisieren. Das Dokument ist jedoch nicht auf Antisense-Oligonucleotide gerichtet, die in der Lage sind, die Funktion von HCV-RNA zu hemmen. Hu et al., J. Clin. Invest. 1992, 89, 2040-2045, offenbaren die Verwendung von hochspezifischer cDNA und von Ribosonden aus dem nichttranslatierten 5'- Bereich des HCV-Genoms für die Hybridisierung, die von Nutzen sind für den Nachweis zirkulierender HCV-RNA. Das Dokument offenbart jedoch nicht Antisense-Oligonucleotide, die in der Lage sind, die Funktion von HCV-RNA zu hemmen.
  • EP-A 0 518 313, ein Dokument unter Art. 54(3) und (4) EPC, offenbart ein neues Gen, das HCV-Polypeptid einschließlich einem HCV-assoziierten Antigen codiert, und das entsprechenden Polypeptid, das für die Serumdiagnose von Hepatitis C und zur Herstellung eines Impfstoffs gegen das Hepatitis C-Virus von Nutzen ist. Das Dokument betrifft auch Antisense-DNA-Fragmente, die von spezifischen HCV-Sequenzen abgeleitet sind. Das Dokument lehrt jedoch nicht oder legt auch nicht nahe, welche Arten von Oligonucleotiden in der Tat für die Hemmung der Funktion von genomischer HCV-RNA oder messenger-RNA von Nutzen sind.
  • Das einzige Behandlungsschema, das bei der Behandlung von chronischer NANBH wirksam ist, ist Interferon-α. Die meisten NANBH-Patienten zeigen während der Interferon- Behandlung eine Verbesserung der klinischen Symptome, aber bei mindestens der Hälfte der Fälle wird bei Unterbrechung der Behandlung ein Rückfall beobachtet. Eine signifikante Verbesserung der antiviralen Therapie ist daher sehr wünschenswert.
  • Es ist ein Ziel dieser Erfindung, Oligonucleotide bereitzustellen, die in der Lage sind; mit der RNA von HCV zu hybridisieren, um die Synthese oder Funktion besagter RNA zu hemmen.
  • Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, Oligonucleotide bereitzustellen, die in der Lage sind, mit der RNA von HCV zu hybridisieren, um die Replikation des Virus zu hemmen.
  • Es ist ein weiteres Ziel, Oligonucleotide bereitzustellen, die die Expression von HCV durch Antisense-Wechselwirkung mit viraler RNA modulieren können.
  • Noch ein anderes Ziel dieser Erfindung ist es, Verfahren für die Prophylaxe, Diagnostika und Therapeutika für die akute oder chronische HCV-Infektion bereitzustellen.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, Wirkstoffe für die Prophylaxe, Diagnostika und Therapeutika für Krankheiten bereitzustellen, die mit HCV zusammenhängen.
  • Verfahren, Materialien und Kits zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von HCV oder HCV-RNA in einer Probe, von der vermutet wird, dass sie es oder sie enthält, ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung.
  • Diese und anderer Ziele werden dem Durchschnittsfachmann durch Lesen der vorliegenden Beschreibung und der beigefügten Ansprüche offensichtlich.
  • Fig. 1 ist die Sequenz der Nucleotide 1-686, die den gesamten nichttranslatierten 5'- Bereich (Nucleotide 1-341) und eine Kernbereichssequenz von 145 Nucleotiden umfaßt.
  • Fig. 2 ist eine Balkengraphik, die die Hemmung der Translation des HCV- Kernproteins durch Antisense-Oligonucleotide zeigt, die komplementär zu dem Bereich von Nucleotid 1 bis 350 von HCV-RNA sind.
  • Fig. 3 ist eine Balkengraphik, die die Hemmung der Translation des HCV- Kernproteins durch 2'-O-methylierte Antisense-Oligonucleotide und ausgewählte nicht modifizierte Oligonucleotide der selben Sequenz zeigt.
  • Fig. 4 ist eine Autoradiographie, die die hemmenden Aktivitäten der Oligonucleotide IA-80, IA-110, IA-140, IA-260, IA-300 und IA-360 für die Translation des HCV-Kernproteins in vitro zeigt.
  • Fig. 5 ist eine Balkengraphik, die die Hemmung der Translation des HCV- Kernproteins in dem modifizierten in vitro-Translationstest durch Oligonucleotide zeigt, die komplementär zu dem Bereich von Nucleotid 1 bis 371 von HCV-RNA sind.
  • Fig. 6 ist eine Balkengraphik, die die Hemmung der Translation von HCV durch 2'- O-Methyl/P=O Antisense-Oligonucleotide um den Schleife C-Bereich und den AUG- Codon/Kernprotein-Codierungsbereich zeigt.
  • Fig. 7 ist eine Liniengraphik, die die Dosis-abhängige Hemmung der Translation des HCV-Kernproteins durch P=O, P=S, P=O/2'-O-Me- und P=S/2'-O-Me-Versionen von IA-340 zeigt.
  • Fig. 8 ist eine Balkengraphik, die die Ergebnisse einer Durchmusterung von Phosphorthioat-Oligonucleotiden mittels eines in vitro-Translationstests nach Behandlung mit RNase H zeigt.
  • Fig. 9 ist eine Balkengraphik, die die hemmenden Aktivitäten von 2'-O-Propyl- und 2'-O-Methyl-Oligonucleotiden zeigt.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen zur Modulierung der Wirkungen von HCV-Infektionen bereitgestellt. Antisense-Oligonucleotide, die komplementär sind zu HCV-RNA und in der Lage, ihre Funktion zu hemmen, werden bereitgestellt. Die HCV-Haarnadelschleife am 5'-Ende, die 6-Basenpaar-Wiederholung am 5'- Ende, der nichttranslatierte 5'-Bereich, das Polyprotein-Translation-Initiationscodon, der Kernprotein-Codierungsbereich, das ORF-3-Translation-Initiationscodon, der nichttranslatierte 3'-Bereich, der palindromische Bereich am 3'-Ende, die R2-Sequenz und die Haarnadelschleife am 3'-Ende sind die Ziele. Arzneimittel, die die Antisense-Oligonucleotide umfassen, für die Diagnose oder die Behandlung von Krankheitszuständen, entweder allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, für die Verabreichung an Tiere, von denen vermutet wird, dass sie eine HCV-assoziierte Krankheit haben, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Das Verhältnis zwischen der Ziel-RNA und den Oligonucleotiden, die mindestens zu einem Teil des Ziels komplementär sind und spezifisch damit hybridisieren können, wird im allgemeinen als "Antisense" bezeichnet. Die Oligonucleotide sind auch in der Lage, die Funktion von viraler RNA zu hemmen, indem sie mit ihrer Replikation, ihrer Transkription in mRNA, ihrer Translation in Proteine, ihrer Verpackung in virale Partikel oder jeder anderen Aktivität, die für ihre generelle biologische Funktion erforderlich ist, interferieren. Das Versagen der RNA, alle oder einen Teil ihrer Funktionen auszuführen, resultiert in dem Versagen, den gesamten oder einen Teil des normalen Lebenszyklus des Virus auszuführen.
  • Es ist gefunden worden, dass Antisense-Oligonucleotide, die entsprechend den Zielviren geplant wurden, bei der Eindämmung von viralen Infektionen wirksam sein können. Es wird bevorzugt, dass Oligonucleotide zwischen etwa 5 und etwa 50 Nucleotideinheiten haben. Die Oligonucleotide sind spezifisch hybridisierbar mit der HCV-Haarnadelschleife am 5'-Ende, der 6-Basenpaar-Wiederholung am 5'-Ende, dem nichttranslatierten 5'-Bereich, dem Polyprotein-Translation-Initiationscodon, dem Kernprotein-Codierungsbereich, dem ORF-3- Translation-Initiationscodon, dem nichttranslatierten 3'-Bereich, dem palindromischen Bereich am 3'-Ende, der R2-Sequenz und der Haarnadelschleife am 3'-Ende. Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um die Nuclease-Resistenz und die Wirksamkeit zu erhöhen.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird die virale RNA in einem Ausmaß gestört, die ausreicht, die HCV-Infektion und/oder HCV-Replikation zu hemmen. Deshalb werden Oligonucleotide umfaßt, die in der Lage sind, mit Teilen der HCV-RNA zu interagieren. Tiere, von denen vermutet wird, dass sie eine Krankheit haben, die mit HCV zusammenhängt, werden mit einem Oligonucleotid in Kontakt gebracht, das gemäß dieser Erfindung gemacht wurde. Insbesondere wird angenommen, dass die vorliegende Erfindung bei der Behandlung von akuten und chronischen HCV-Infektionen und von HCV-assoziierter Krankheit wirksam ist, entweder prophylaktisch oder therapeutisch.
  • Es ist zu erwarten, dass bei der RNA von HCV von verschiedenen Stämmen und von verschiedenen Typen innerhalb eines Stammes Unterschiede bestehen. Deshalb wird zum Beispiel angenommen, dass die Bereiche der verschiedenen HCV-Stämme im wesentlichen die selbe Funktion für die entsprechenden Stämme haben und dass die Interferenz mit der Expression der genetischen Information in den verschiedenen Stämmen ähnliche Ergebnisse zeigen wird. Man glaubt, dass dies so ist, obwohl bei der Nucleotidsequenz zwischen den Stämmen Unterschiede existieren.
  • Entsprechend sind die Nucleotidsequenzen, die in der vorliegenden Beschreibung dargestellt sind, so zu verstehen, dass sie für den besonderen beschriebenen Stamm repräsentativ sind. Homologe oder analoge Sequenzen für verschiedene Stämme von HCV werden spezifisch so betrachtet, dass sie innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegen.
  • Antisense-Oligonucleotide sind als therapeutische Mittel zur Behandlung vieler menschlicher Krankheiten vielversprechend. In den meisten Fällen binden Oligonucleotide, die komplementär zu spezifischen RNA-Zielsequenzen sind, mittels Watson-Crick- Basenpaarung an prä-mRNA oder reife mRNA und hemmen damit den Fluß der genetischen Information von der DNA zum Protein. Im Falle von RNA-Viren, wie HCV, werden Oligonucleotide so geplant, dass sie mit viraler genomischer RNA, mRNA oder replikativer intermediärer RNA spezifisch hybridisieren und mit der Funktion der RNA so interferieren, dass die virale Replikation oder Proteinexpression moduliert wird.
  • Zahlreiche neuere Studien haben den Nutzen von Antisense-Oligonucleotiden als biochemische Hilfsmittel zum Studium von Zielproteinen dokumentiert. Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. 1989, 81, 1539-1544; Zon, G. Pharmaceutical Res. 1987, 5, 539-549. Wegen der neueren Fortschritte in der Oligonucleotidchemie, der Synthese von Nucleaseresistenten Oligonucleotiden und der Verfügbarkeit von Arten an Oligonucleotiden, die eine erhöhte Aufnahme in die Zelle zeigen, ist es jetzt möglich, die Verwendung von Antisense- Oligonucleotiden als eine neue Form von Therapeutika zu betrachten.
  • Für Therapeutika wird ein Tier, von dem man annimmt, dass es eine HCV-Infektion oder eine HCV-assoziierte Krankheit hat, durch Verabreichung von Oligonucleotiden gemäß dieser Erfindung behandelt. Oligonucleotide können in einem Arzneimittel formuliert sein, das Träger, Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Konservierungsmittel, grenzflächenaktive Mittel und dergleichen zusätzlich zum Oligonucleotid enthält. Arzneimittel können auch einen oder mehrere aktive Inhaltsstoffe zusätzlich zum Oligonucleotid umfassen, wie zum Beispiel antimikrobielle Mittel, entzündungshemmende Mittel, Betäubungsmittel und dergleichen.
  • Das Arzneimittel kann verwendet werden, um mittels einer Anzahl von Wegen verabreicht zu werden in Abhängigkeit davon, ob lokale oder systemische Behandlung erwünscht ist, und von dem zu behandelnden Gebiet. Die Verabreichung kann topisch sein (einschließlich ophthalmologisch, vaginal, rektal, intranasal), oral, durch Inhalation oder parenteral, zum Beispiel durch intravenöse Infusion, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion.
  • Formulierungen für die topische Verabreichung können Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Puder sein. Herkömmliche pharmazeutische Träger, wäßrige Puder- oder Ölbasen, Verdickungsmittel und dergleichen können erforderlich oder wünschenswert sein. Beschichtete Kondome können auch von Nutzen sein.
  • Arzneimittel für die orale Verabreichung können Puder oder Granulate, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nicht-wässrigen Medien, Kapseln, Riechkissen oder Tabletten umfassen. Verdickungsmittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispersionshilfen oder Bindemittel können erwünscht sein.
  • Formulierungen für die parenterale Verabreichung können sterile wäßrige Lösungen umfassen, die ebenfalls Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusatzstoffe enthalten können.
  • Die Dosierung hängt von der Schwere und dem Ansprechen des zu behandelnden Zustands ab, wird aber üblicherweise eine oder mehrere Dosen pro Tag sein, wobei die Behandlungsdauer mehrere Tage bis zu mehrere Monate sein kann oder bis eine Heilung oder eine Verringerung des Krankheitszustandes erreicht ist. Die Dosierung und die Frequenz werden variieren in Abhängigkeit von zum Beispiel dem Körpergewicht des Patienten und dem Verabreichungsweg. Einzelne Dosen bewegen sich üblicherweise im Bereich von etwa 0.001 mg bis zu 500 mg, können aber höher oder niedriger sein. Durchschnittsfachleute können leicht optimale Dosierungen, Dosierungsverfahren und Wiederholungsraten bestimmen.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet Oligonucleotide, die komplementär zu spezifischen Bereichen von HCV-RNA sind, für die Antisense-Hemmung von HCV. Im Kontext dieser Erfindung bedeutet der Ausdruck "Oligonucleotid" ein Oligomer oder Polymer von Ribonucleinsäure oder Desoxyribonucleinsäure. Dieser Ausdruck umfaßt Oligomere, die aus natürlich vorkommenden Basen, Zuckern und Zwischenzucker (Rückgrat)-Bindungen bestehen ebenso wie Oligomere, die nicht natürlich vorkommende Anteile haben, die ähnlich funktionieren. Solche modifizierten oder substituierten Oligonucleotide werden oft wegen ihrer Eigenschaften, wie zum Beispiel erhöhte zelluläre Aufnahme oder erhöhte Stabilität in der Gegenwart von Nucleasen, den nativen Formen vorgezogen.
  • Spezifische Beispiele einiger bevorzugter Oligonucleotide, die für diese Erfindung in Betracht kommen, können Phosphorothioat-, Phosphotriester-, Methylphosphonat-, Kettenalkyl- oder cyclische Alkylbindungen zwischen den Zuckern oder kurzkettige heteroatomare oder heterocyclische Bindungen zwischen den Zuckern haben. Am meisten bevorzugt sind diejenigen mit einem CH&sub2;-NH-O-CH&sub2;, CH&sub2;-N(CH&sub3;)-O-CH&sub2;, CH&sub2;-O-N(CH&sub3;)- CH&sub2;-, CH&sub2;-N(CH&sub3;)-N(CH&sub3;)-CH&sub2;- und O-N(CH&sub3;)-CH&sub2;-CH&sub2;-Rückgrat (wobei Phosphodiester O-P-O-CH&sub2; ist). Ebenfalls bevorzugt sind Oligonucleotide, die eine Morpholino- Rückgratstruktur haben. Summerton, J. E. und Weiler, D. D. US 5,034,506. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen, wie dem Protein-Nucleinsäure (PNA)-Rückgrat, kann das Phosphodiester-Rückgrat des Oligonucleotids durch ein Polyamid-Rückgrat ersetzt werden, wobei die Basen direkt oder indirekt an die Aza-Stickstoffatome des Polyamid-Rückgrats gebunden sind. P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science 1991, 254, 1497. Andere bevorzugte Oligonucleotide können Alkyl-, Halogen- oder anders substituierte Zuckerreste enthalten, die eine der folgenden Gruppen an der 2'-Position umfassen: OH, SH, SCH&sub3;, F, OCN, O(CH&sub2;)nNH&sub2; oder O(CH&sub2;)nCH&sub3;, worin n von 1 bis etwa 10 ist; einen niederen C&sub1; bis C&sub1;&sub0;-Alkylrest, ein substituierter niederer Alkyl-, Alkaryl- oder Aralkylrest; Cl; Br; CN; CF&sub3;; OCF&sub3;; einen O-, S- oder N-Alkylrest; einen O-, S- oder N-Alkenylrest; SOCH&sub3;; SO&sub2;CH&sub3;; ONO&sub2;; NO&sub2;; N&sub3;; NH&sub2;; einen Heterocycloalkylrest; einen Heterocycloalkarylrest; einen Aminoalkylaminorest; einen Polyalkylaminorest; einen substituierten Silylrest; eine RNA- spaltende Gruppe; ein Konjugat; eine Reportergruppe; einen Intercalator; eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonucleotids oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonucleotids und andere Substituenten, die ähnliche Eigenschaften haben. Oligonucleotide können auch Zuckermimetika, wie Cyclobutyle, anstelle der Pentofuranosylgruppe haben. Modifizierte oder ungewöhnliche Basen können auch verwendet werden; am meisten bevorzugt unter diesen ist Inosin, das eine "universelle Base" ist, die mit A, C, G oder T eine Watsom-Crick-Paarung eingehen kann. Andere universelle Basen können ebenfalls bevorzugt sein. So haben die Oligonucleotide der Erfindung in einer Ausführungsform eine universelle Base an einer Position, die komplementär zu einem Nucleotid in der HCV-RNA ist, welches innerhalb der HCV-Stämme variabel ist.
  • Alle diese Oligonucleotide werden von dieser Erfindung umfaßt, solange sie bei der Hybridisierung mit HCV-RNA effektiv funktionieren. Die Oligonucleotide gemäß der Erfindung umfassen vorzugsweise etwa 5 bis etwa 50 Nucleinsäurebaseneinheiten. Es ist stärker bevorzugt, wenn solche Oligonucleotide etwa 8 bis 30 Nucleinsäurebaseneinheiten umfassen, und noch mehr bevorzugt, wenn sie etwa 14 bis 26 Nucleinsäurebaseneinheiten umfassen. Es sollte verstanden werden, dass eine Nucleinsäurebaseneinheit eine Basen- Zucker-Kombination ist, die in geeigneter Weise mit der benachbarten Nucleinsäurebaseneinheit mittels einer Phosphodiester- oder anderen Bindungen gebunden ist.
  • In bevorzugten Ausführungsformen sind die Antisense-Oligonucleotide komplementär zu und hybridisierbar mit mindestens einem Teil des Schleife B-Bereichs oder Schleife C- Bereichs des nichttranslatierten 5'-Bereichs der HCV-RNA. Insbesondere geeignete Antisense-Oligonucleotide umfassen zum Beispiel die SEQ ID Nr: 33, SEQ ID Nr: 41, SEQ ID Nr: 20, SEQ ID Nr: 38, SEQ ID Nr: 39, SEQ ID Nr: 40, SEQ ID Nr: 42, SEQ ID Nr: 44 und SEQ ID Nr: 45.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antisense-Oligonucleotide komplementär zu und hybridisierbar mit mindestens einem Teil des Schleife F-Bereichs des nichttranslatierten 5'-Bereichs der HCV-RNA. Ein besonders geeignetes Antisense- Oligonucleotid umfasst zum Beispiel die SEQ ID Nr: 62.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antisense-Oligonucleotide hybridisierbar mit der folgenden Nucleotidsequenz (A), die am nichttranslatierten 5'-Bereich des HCV-Genoms vorkommt, oder mit einer Nucleotidsequenz, die mit besagter Nucleotidsequenz in hohem Maße homolog ist und die sich von besagter Nucleotidsequenz (A) nur durch eine oder zwei Baseneinheiten unterscheidet:
  • (A) GCCUCCAGGACCCC
  • Solche Oligonucleotide sind mindestens 14 Nucleotide lang, vorzugsweise 14 bis 26 Nucleotide lang. Somit enthalten die Oligonucleotide mindestens eine Antisense- Nucleotidsequenz zu besagter Nucleotidsequenz (A).
  • Stärker bevorzugte Oligonucleotide haben eine Nucleotidsequenz, die mit besagter Nucleotidsequenz hybridisierbar ist und weiterhin eine Nucleotidsequenz enthält, die zu der folgenden Nucleotidsequenz (B), die die Nucleotide 104-129 des nichttranslatierten 5'- Bereichs der HCV-RNA umfaßt, die vom HCV-Genom abstammen, oder zu einer kontinuierlichen Nucleotidsequenz von einem etwa 20mer innerhalb der Nucleotidsequenz (B) komplementär ist:
  • (B) CGUGCAGCCUCCAGGACCCCCCCUCC
  • (fettgedruckter Bereich entspricht vorstehender Sequenz (A).
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Oligonucleotide mit mindestens einem Teil des Polyprotein-Translation-Initiationscodons oder mindestens einem Teil des Kernprotein-Codierungsbereichs hybridisierbar. In einer bevorzugteren Ausführungsformen enthalten die Oligonucleotide die Antisense-Nucleotidsequenz GGAT, die speziell mit der Nucleotidsequenz AUCC des Genoms von HCV oder einem benachbarten Bereich davon hybridisierbar ist, die bei den Nucleotiden 352 bis 355 in dem Kernprotein-Codierungsbereich in der Nähe des Polyprotein-Translation-Initiationscodons vorhanden ist. Geeignete Beispiele für die Oligonucleotide, die mit mindestens einem Teil des Polyprotein-Translation- Initiationscodons hybridisierbar sind, sind SEQ ID Nr: 81, SEQ ID Nr: 82, SEQ ID Nr: 72, SEQ ID Nr: 76, SEQ ID Nr: 77, SEQ ID Nr: 78, SEQ ID Nr: 79 und SEQ ID Nr: 80, und geeignete Beispiele für die Oligonucleotide, die mit mindestens einem Teil des Kernprotein- Codierungsbereichs einer HCV-RNA hybridisierbar sind, sind SEQ ID Nr: 84, SEQ ID Nr: 85, SEQ ID Nr: 86, SEQ ID Nr: 87, SEQ ID Nr: 88, SEQ ID Nr: 89, SEQ ID Nr: 90 und SEQ ID Nr: 91. Außerdem sind geeignete Beispiele für die Oligonucleotide, die mit einer Nucleotidsequenz von Nucleotid Nummer 352 bis 355 (AUCC) der HCV-DNA oder benachbarten Bereich davon hybridisierbar sind, SEQ ID Nr: 76, SEQ ID Nr: 77, SEQ ID Nr: 78, SEQ ID Nr: 79, SEQ ID Nr: 80, SEQ ID Nr: 84, SEQ ID Nr: 85, SEQ ID Nr: 86 und SEQ ID Nr: 87.
  • Die gemäß dieser Erfindung verwendeten Oligonucleotide können bequem und routinemäßig mittels des wohl bekannten Verfahrens der Festphasensynthese hergestellt werden. Die Ausrüstung für solche Synthesen wird von mehreren Anbietern einschließlich Applied Biosystems verkauft. Jedes andere Verfähren für solche Synthesen kann auch verwendet werden; die aktuellen Synthesen der Oligonucleotide sind jedoch Bestandteil des Könnens eines Routinefachmanns. Die Verwendung ähnlicher Verfahren zur Herstellung anderer Oligonucleotide, wie Phosphorothioate und alkylierte Derivate ist ebenfalls gut bekannt.
  • Gemäß dieser Erfindung ist es dem Durchschnittsfachmann verständlich, dass messenger-RNA nicht nur die Sequenzinformation umfaßt, die unter Verwendung des genetischen Drei-Buchstaben-Codes ein Protein codiert, sondern auch assoziierte Ribonucleotide, die solchen Personen bekannte Bereiche bilden, wie den nichttranslatierten 5'- Bereich, den nichttranslatierten 3'-Bereich und den 5'-Kappen-Bereich, ebenso wie Ribonucleotide, die verschiedene Sekundärstrukturen bilden. Somit können gemäß dieser Erfindung Oligonucleotide formuliert werden, die vollständig oder teilweise zu diesen assoziierten Ribonucleotiden ebenso wie zu den codierenden Ribonucleotiden zielgerichtet sind. Somit ist das Oligonucleotid spezifisch mit der HCV-Haarnadelschleife am 5'-Ende, der 6-Basenpaar-Wiederholung am 5'-Ende, dem ORF-3-Translation-Initiationscodon (die alle im nichttranslatierten 5'-Bereich enthalten sind), dem Polyprotein-Translation-Initiationscodon, dem Kernprotein-Codierungsbereich, dem nichttranslatierten 3'-Bereich, dem R2-Bereich, der 3'-Haarnadelschleife und dem palindromischen Bereich am 3'-Ende hybridisierbar.
  • Die Größe des HCV-Genoms ist ungefähr 9400 Nucleotide mit einem einzigen translationalen Leserahmen, der ein Polyprotein codiert, das anschließend zu mehreren strukturellen und nicht-strukturellen Proteinen prozessiert wird.
  • Mehrere Bereiche des HCV-Genoms sind in der vorliegenden Erfindung als Antisense- Ziele identifiziert worden. Es sollte festgehalten werden, dass die Verfügbarkeit von Sequenzen und die Schemata für die Numerierung der Nucleotide von Stamm zu Stamm variieren. Der nichttranslatierte 5'-Bereich von HCV besteht aus ungefähr 350 Nucleotiden stromaufwärts vom Polyprotein-Translation-Initiationscodon. Von einer Haarnadelschleife, die bei den Nucleotiden 1-22 am 5'-Ende des Genoms (HCV-1) vorhanden ist und die hier als "Haarnadelschleife am 5'-Ende" identifiziert ist, nimmt man an, dass sie als Erkennungssignal für die virale Replicase oder die Nucleocapsid-Proteine dient. Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 1711-1715. Von dem nichttranslatierten 5'-Bereich nimmt man an, dass er eine Sekundärstruktur hat, die sechs Stamm-Schleifen-Strukturen umfaßt, die als Schleifen A-F bezeichnet werden. Die Schleife A liegt ungefähr bei den Nucleotiden 13-50, die Schleife B ungefähr bei den Nucleotiden 51-88, die Schleife C ungefähr bei den Nucleotiden 100-120, die Schleife D ungefähr bei den Nucleotiden 147-162, die Schleife E ungefähr bei den Nucleotiden 163-217 und die Schleife F ungefähr bei den Nucleotiden 218-307. Tsukiyama- Kohara et al., J. Virol. 1992, 66, 1467-1483. Diese Strukturen sind zwischen den beiden HCV- Hauptgruppen gut erhalten.
  • Drei kleine (je 12-16 Aminosäuren) offene Leserahmen (ORFs) liegen in dem nichttranslatierten 5'-Bereich der HCV-RNA. Diese ORFs können in die Kontrolle der Translation involviert sein. Das ORF-3-Translation-Initiationscodon, wie es hier bezeichnet wird, wird bei den Nucleotiden 215-217 von HCV-1 gefunden, entsprechend dem Schema von Han et al. " Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 1711-1715; und bei den Nucleotiden -127 bis - 125, entsprechend dem Schema von Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 2451-2455.
  • Das Polyprotein-Translation-Initiationscodon, wie es hier bezeichnet wird, ist eine AUG-Sequenz, die bei den Nucleotiden 342-344 von HCV-1 liegt, entsprechend Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 1711-1715, oder bei den Nucleotiden 1-3 entsprechend dem HCV-1 Numerierungsschema von Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 2451-2455. Stromabwärts (gegen das 3'-Ende) von dem Polyprotein-AUG ist der Kernprotein- Codierungsbereich.
  • Der nichttranslatierte 3'-Bereich, wie er hier bezeichnet wird, besteht aus Nucleotiden stromabwärts der Polyprotein-Translation-Terminationsstelle (die entsprechend Choo et al. bei nt 9037 endet; und entsprechend den Schemata vom Han und Inchauspe bei nt 9377). Die Nucleotide 9697-9716 (Numerierungsschema von Inchauspe für HCV-H) am 3'-Ende des Genoms innerhalb des nichttranslatierten 3'-Bereichs können zu einer stabilen Haarnadelschleifen-Struktur organisiert sein, die hier als 3'-Haarnadelschleife identifiziert ist. Von einem kurzen Nucleotideabschnitt (R2), unmittelbar stromaufwärts (nt 9691-9696 von HCV-H) von der 3'-Haarnadel und hier als "die R2-Sequenz" bezeichnet, nimmt man an, dass er bei der Cyclisierung der viralen RNA eine Rolle spielt, möglicherweise in Kombination mit einer Reihe von 6-Basenpaar-Wiederholungen am 5'-Ende mit der selben Sequenz bei den nt 23-28 und 38-43 (Inchauspe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 10292-10296), die hier als "6-Basenpaar-Wiederholung am 5'-Ende" identifiziert ist. Palindromische Sequenzen, die in der Nähe des 3'-Endes des Genoms (Nucleotide 9312-9342 entsprechend dem Schema von Takamizawa et al., J. Virol. 1991, 65, 1105-1113) anwesend sind, sind in der Lage, eine stabile Sekundärstruktur zu bilden. Diese wird hier als der palindromische Bereich am 3'-Ende bezeichnet.
  • Oligonucleotide von Nutzen bei dieser Erfindung sind komplementär zur HCV-RNA. Somit nimmt man von den Oligonucleotiden, deren Sequenzen in Tabelle 1 gezeigt werden, an, dass sie gegen HCV von Nutzen sind. Bevorzugt wird jedes dieser Oligonucleotide oder ein wirksamer Teil davon, wie vorstehend gezeigt, oder jedes der ähnlichen Oligonucleotide, die Durchschnittsfachleute mit dem Wissen der bevorzugten Antisense-Ziele herstellen können, für die Modulation der HCV-Infektion verwendet. TABELLE 1 RNA-SEQUENZ-ZIELE UND ANTISENSIE-OLIGONUCLEOTIDE FÜR HCV [Sequenzen sind von HCV-1 (US) und HCV-J (Japan)]
  • Die Oligonucleotide dieser Erfindung können in Diagnostik, Therapie und als Forschungsreagentien und Kits verwendet werden. Da die Oligonucleotide dieser Erfindung mit RNA von HCV hybridisieren, können leicht Sandwich- und andere Tests hergestellt werden, um diese Tatsache auszunutzen. Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung eines Oligonucleotids mit HCV oder HCV-RNA in einer Probe, von der man vermutet, dass sie es oder sie enthält, können routinemäßig durchgeführt werden. Solche Vorkehrungen können Enzymkonjugation, Radiomarkierung oder jedes andere geeignete Nachweissystem umfassen. Es können auch Kits zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von HCV hergestellt werden.
  • Die folgenden spezifischen Beispiele werden nur zur Veranschaulichung gegeben und sind nicht als Beschränkung der Erfindung gedacht.
    • Beispiel 1
  • Oligonucleotidsynthese: nicht modifizierte DNA-Oligonucleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems Modell 380B) unter Verwendung der Standard-Phosphoramiditchemie mit Oxidation durch Jod synthetisiert. β- Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite wurden bei Applied Biosystems (Foster City, CA) gekauft. Für die Phosphorothioat-Oligonucleotide wurde die Standard-Oxidationsflasche durch eine 0,2 M Lösung von 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitril für die stufenweise Thiation der Phosphitbindungen ersetzt. Der Warteschritt beim Thiationszyklus wurde auf 68 Sekunden erhöht und wurde von dem Schritt gefolgt, bei dem eine Kappenstruktur angefügt wurde ("capping step").
  • 2'-O-Methyl-Oligonucleotide wurden unter Verwendung von 2'-O-Methyl-β- Cyanoethyldiisopropylphosphoramiditen (Chemgenes, Needham MA) und dem Standardzyklus für nicht modifizierte Oligonucleotide durchgeführt, außer dass der Warteschritt nach der Pulsabgabe von Tetrazol und Base auf 360 Sekunden erhöht wurde. Die 3'-Base, die zum Start der Synthese verwendet wurde, war ein 2'-Desoxyribonucleotid.
  • 2'-O-Propyl-Oligonucleotide wurden von 2'-Desoxy-2'-O-Propyl-Ribosiden der Nucleinsäurebasen A, G, U (T) und C hergestellt, die durch Modifikationen von Literaturverfahren hergestellt worden waren, beschrieben von B. S. Sproat, et al., Nucleic Acids Research 18: 41-49 (1990) und H. Inoue, et al., Nucleic Acids Research 15: 6131-6148 (1987).
  • Nach der Abspaltung von der Glassäule mit kontrollierten Poren (Applied Biosystems) und Entblockung in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 55ºC für 18 Stunden wurden die Oligonucleotide durch zweimaliges Ausfällen aus 0,5 M NaCl mit 2,5 Volumina Ethanol gereinigt. Analytische Gelelektrophorese wurde in 20% Acrylamid, 8 M Harnstoff, 45 mM Tris-Borat-Puffer, pH 7,0, durchgeführt.
    • Beispiel 2
  • Transkription und Translation von HCV-RNA in gentechnisch veränderten Zellen: Ein rekombinanter DNA-Vektor, der in der Lage ist, HCV-Gene in Säugerzellen zu exprimieren, wird unter Verwendung von Standardverfahren der Gentechnik konstruiert. Ein cDNA- Fragment, das die HCV-mRNA oder ein genomisches Transkript darstellt, wird so hinter einen induzierbaren eukaryontischen Promotor, wie den LTR vom Maus-Brustkrebstumorvirus, gesetzt, dass die Transkription der HCV-cDNA an der geeigneten Nucleotidposition beginnt. Am 3'-Ende des Gens wird ein Polyadenylierungssignal eingeführt, um die Termination an der geeigneten Nucleotidposition sicherzustellen. Es kann von Vorteil sein, die codierende Sequenz durch die Einführung einer Reporterdomäne (z. B. die enzymatisch aktive Domäne des Leuchtkäfer-Luciferase-Gens) im Leserahmen zu modifizieren, was die Nachweisverfahren für die Expression des Fusionsproteins erleichtern kann. Der Vektor enthält auch ein oder mehrere genetische Selektionsmarker wie Neomycinresistenz.
  • Der beschriebene Vektor wird in Säugerzellen unter Verwendung des Calciumchlorid- Transfektionsverfahrens eingebracht. Zellen, die die transfizierte DNA enthalten, werden durch Wachstum auf Selektionsmitteln, wie Neomycin, identifiziert und durch beschränkte Verdünnung cloniert. Die Expression von HCV-RNA in clonierten Transfektanten kann unter Verwendung einer Reihe Tests, wie Northern-Blots, RNA-Polymerasekettenreaktion oder Nucleaseschutz verifiziert werden. Die Proteinexpression kann unter Verwendung des Westernblot-Verfahrens oder Immunpräzipitation mit spezifischen HCV-Antikörpern oder durch die Messung der Anwesenheit nachweisbarer enzymatischer Aktivitäten, die vom Einbau einer nachweisbaren Reporterdomäne resultieren, verifiziert werden. Wenn ein induzierbarer Promotor, wie der MMTV-LTR, bei der Konstruktion des Vektors verwendet wird, sollte ein Glucocorticoid-Induktor, wie Dexamethason, vor dem Test zu den transfizierten Zellen zugegeben werden, um die Genexpression zu induzieren.
    • Beispiel 3
  • Bestimmung der Antisense-Oligonucleotid-Hemmung der HCV-Genexpression von gentechnisch veränderten Zellen: Säugerzellen, die mit Expressionsvektoren transfiziert sind, wie den in Beispiel 2 beschriebenen, werden über Nacht in einem Medium inkubiert, das Antisense-Oligonucleotide enthält. Nach Behandlung mit dem Oligonucleotid werden die Zellen mit Dexamethason behandelt, um die Expression der HCV-Genprodukte zu induzieren. Nach einer geeigneten Inkubationszeit (4-24 Stunden) werden die Zellen geerntet, und die Expression der spezifischen HCV-Polypeptide kann immunologisch unter Verwendung spezifischer Antiseren in einem Western-Blot oder in einem Immunpräzipitationstest nachgewiesen werden. Wenn die Zellen einen Vektor enthalten, der eine Reporterdomäne enthält, wie die für Leuchtkäfer-Luciferase, die im Rahmen mit dem HCV-Polypeptid fusioniert ist, können Zellextrakte gesammelt werden und auf enzymatische Aktivität der Reporterdomäne beurteilt werden.
    • Beispiel 4
  • Transkription und Translation von HCV-RNA von cytoplasmatischen Virusvektoren: Ein cDNA-Fragment, das die HCV-mRNA oder ein genomisches Transkript darstellt, wird so hinter einen Vacciniavirus-Promotor gebracht, dass die Transkription der HCV-cDNA an der geeigneten Nucleotidposition beginnt. Am 3'-Ende des Gens wird ein Polyadenylierungssignal eingeführt, um die Termination an der geeigneten Nucleotidposition sicherzustellen. Es kann in einigen Fällen von Vorteil sein, die codierende Sequenz durch die Einführung einer Reporterdomäne (z. B. die enzymatisch aktive Domäne des Leuchtkäfer-Luciferase-Gens) im Leserahmen zu modifizieren, was die Nachweisverfahren für die Expression des Fusionsproteins erleichtern kann.
  • Das Einbringen der Expressionseinheit in das Genom eines sich cytoplasmatisch replizierenden DNA-Virus, wie Vaccinia, wird durch den Einbau von Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts der Expressionseinheit erleichtert, die homolog zum Vacciniavirus-Genom sind. Die Co-Transfektion des Vektors in Vacciniavirus-infizierte Säugerzellen kann in homologer Rekombination des Vektors mit Vaccinia resultieren. Wenn ein geeigneter enzymatischer Marker, wie β-Galactosidase, an der entsprechenden Rekombinationsstelle des Virus anwesend ist, dann können rekombinante Plaques durch ihren Farbmangel unter geeigneten Substratbedingungen identifiziert werden. Das clonierte Virus kann in geeigneten Säugerwirtszelllinien vermehrt werden und die Expression der HCV- Genprodukte verwirklicht werden, wie in Beispiel 2 beschrieben.
    • Beispiel 5
  • Bestimmung der Antisense-Oligonucleotid-Hemmung der HCV-Genexpression von cytoplasmatischen Virusvektoren in Säugerzellen: Säugerzellen werden über Nacht in einem Medium inkubiert, das Antisense-Oligonucleotide enthält. Nach der Behandlung mit Oligonucleotiden werden die Zellen mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert, das HCV- Genprodukte exprimiert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit (4-24 Stunden) werden die Zellen geerntet, und die Expression der spezifischen HCV-Polypeptide kann immunologisch unter Verwendung spezifischer Antiseren in einem Western-Blot oder in einem Immunpräzipitationstest nachgewiesen werden. Wenn die Zellen einen Vektor enthalten, der eine Reporterdomäne enthält, wie die für Leuchtkäfer-Luciferase, die im Rahmen mit dem HCV-Polyprotein fusioniert ist, können Zellextrakte gesammelt werden und auf enzymatische Aktivität der Reporterdomäne beurteilt werden.
    • Beispiel 6
  • Bestimmung der Antisense-Oligonucleotid-Hemmung des HCV-Partikel-Zusammenbaus in Zellen, die mit HCV-Genen transfiziert sind oder die mit cytoplasmatischen Virusvektoren infiziert sind, die HCV-Gene exprimieren: Genomische HCV-RNA und HCV-Protein werden in Zellen exprimiert, die mit HCV-cDNA-Expressionsvektoren trasnfiziert sind, oder in Zellen, die mit Vacciniavirus-Vektoren infiziert sind, die die HCV- cDNA exprimieren. Es ist wahrscheinlich, dass sich die RNA-Genome und die Proteine zusammenlagern, um HCV-ähnliche Partikel zu bilden. Die Anwesenheit dieser Partikel kann unter Verwendung der Elektronenmikroskopie verifiziert werden. Um die Wirkung von Oligonucleotiden zu beurteilen, die komplementär zu angenommenen Verpackungssignalen der viralen RNA für den Partikelzusammenbau sind, können spezifische biochemische Tests entwickelt werden, um das Erscheinen von extrazellulären Partikeln zu messen, die sowohl HCV-Nucleinsäure als auch -Proteine enthalten.
  • Säugerzellen, die mit Expressionsvektoren, wie den in Beispiel 2 beschriebenen, transfiziert sind, werden über Nacht in einem Medium inkubiert, das Antisense- Oligonucleotide enthält. Nach Behandlung mit dem Oligonucleotid werden die Zellen mit Dexamethason behandelt, um die Expression der HCV-Genprodukte zu induzieren. Nach einer geeigneten Inkubationszeit (4-24 Stunden) wird extrazelluläre Flüssigkeit von behandelten Zellen geerntet, und Partikel werden durch Pelletbildung in der Ultrazentrifuge konzentriert. Proteine und Nucleinsäuren werden aus dem Pellet extrahiert und jeweils mittels Northern Blot- bzw. Western Blot-Analyse quantifiziert, wie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben. Ein ähnliches Verfahren könnte verwendet werden, um die Wirkungen der Oligonucleotid- Behandlung auf den Zusammenbau von Virus-Partikeln zu überwachen, die von der Infektion von Zellen mit rekombinantem Vacciniavirus resultieren, das das HCV- Polyprotein exprimiert.
    • Beispiel 7 Durchmusterung von Oligonucleotiden mittels eines in vitro-Translationstests: 1. Herstellung von HCV-RNA zur Verwendung bei der Translation in vitro:
  • Eine RNA, die eine Sequenzhomologie zu den Basen Nummer 1-686 der HCV-Gen- Nucleotidsequenz hat, wurde auf die folgende Weise hergestellt, wobei das Stopcodon (TGA) am 3'-Ende hinzugefügt wurde.
    • (1) Herstellung von Matrizen-HCV-cDNA für die Polymerasekettenreaktion (PCR):
  • Basierend auf einer cDNA-Nucleotidsequenz, die von den Erfindern durch Clonierung von Hepatitis C aus dem Serum eines japanischen Patienten hergestellt wurde, wobei die besagte cDNA möglicherweise die gesamte Länge der HCV-Aminosäuresequenz codiert, wurde eine cDNA cloniert, die eine 686 Nucleotid-Sequenz enthielt, die die volle Länge des nichttranslatierten 5'-Bereichs des HCV-Gens (341. Nucleotid-Sequenz) umfaßt und einen Kernbereich (345 Nucleotide-Sequenz), der bis dorthin mittels einer bekannten Technik am 5'-Ende fortgeführt wurde, und der Clon wurde nachstehend (3) als Matrize für das PCR- Verfahren verwendet. Es wurde gefunden, dass die Nucleotidzahlen für diese cDNA-Sequenz gut mit denen von Han et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 1711-1715) übereinstimmen.
    • (2) Herstellung eines Primers für die PCR:
  • Es wurden ein Sense-Primer, der eine 41 Nucleotide-Sequenz umfaßte, die 7 Basen, die die EcoRI-Spaltstelle umfaßten, 20 Basen, die eine Funktion als T7-Promotor haben, und 14 Basen (Nucleotid-Nummer 1-14) der HCV-Nucleotidsequenz, in dieser Anordnung vom 5'- Ende aus enthielt, und es wurde auch ein Antisense-Primer, der eine 27 Nucleotide-Sequenz umfaßte, die 9 Basen, die die EcoRI-Spaltstelle umfaßten, 3 Basen, die komplementär zum Stop-Codon (TGA) sind, und 15 Basen, die komplementär sind zu dem Bereich der Basen Nummer 672-686 der HCV-Nucleotidsequenz, in dieser Anordnung vom 5'-Ende aus enthielt, mittels des Festphasen-Phosphoamidit-Verfahrens mit dem Cyclone Plus DNA-Synthesegerät (hergestellt von MilliGen/Biosearch) hergestellt.
    • (3) Herstellung von Matrizen-DNA zur Synthese von RNA mittels PCR:
  • Unter Verwendung der vorstehend in (1) erhaltenen cDNA als Matrize wurde eine PCR (20 Cyclen) mit den vorstehenden (2) Primern durchgeführt. Die PCR wurde unter den Bedingungen der Denaturierung: 94ºC für eine Minute, Anlagerung: 55ºC für 2 Minuten, Polymerase-Reaktion: 72ºC für 2 Minuten durchgeführt. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit EcoRI behandelt und und in die EcoRI-Stelle von pUC19 insertiert, und der E. coli- Stamm JM 109 wurde mit dem resultierenden rekombinanten Plasmid mittels herkömmlicher Verfahren transformiert. Durch Sequenzierung des Teils, der mit dem rekombinanten Plasmid in die Mehrzahl der Clone in den so erhaltenen Kolonien insertiert worden war, mittels des Didesoxy-Verfahrens wurde bestätigt, dass die 686-Nucleotid-Sequenz mit HCV-Ursprung, die durch die Plasmide von allen Clonen insertiert worden war, gut übereinstimmte mit dem entsprechenden Bereich der Matrizen-cDNA. Ein Plasmid, das von einem der Clone erhalten worden war, wurde als "pUIA1" bezeichnet.
    • (4) Herstellung von RNA, die einen Teil der Nucleotidsequenz des HCV-Gens hat:
  • Ein insertiertes Fragment mit der vorstehenden Nucleotidsequenz wurde aus pUIA1 durch Behandlung mit EcoRI herausgenommen und durch Verwendung besagten Fragments als Matrize wurde mit dem MEGAscript in vitro Transkriptions-Kit (hergestellt von Ambion) eine RNA synthetisiert und damit wurde ein RNA-Fragment erhalten, das eine 698 Nucleotide-Sequenz hat, welche den Nucleotid-Sequenzteil 1-686 der HCV- Nucleotidsequenz, das Stop-Codon (UGA) und 9 Basen, die die EcoRI-Spaltstelle einschließen, in dieser Reihenfolge vom 5'-Ende aus umfaßt. Dieses Fragment wurde als "R- IA-1" bezeichnet. Die Nucleotidsequenz der 686 Basen, die in besagtem R-IA-1 aus HCV abgeleitet ist, wird in der begleitenden Fig. 1 gezeigt.
    • 2. Synthese des HCV-Kernproteins in einem Zell-freien Translationssystem.
  • Ein HCV-Kernprotein wurde aus R-IA-1 in einem zellfreien System unter Verwendung eines Kaninchen-Retikulocyten-Lysats translatiert, und die Expression wurde mittels ELISA wie folgt bestätigt.
    • (1) Herstellung eines ELISA-Systems zur quantitativen Bestimmung des HCV- Kernproteins:
  • Der Kernbereich von HCV wurde mittels herkömmlicher Verfahren in E. coli direkt exprimiert. Eine Maus wurde mit dem so erhaltene exprimierten Protein immunisiert, und zwei Arten von monoclonalen Antikörpern, RJC4-1 (IgM-Typ) und RJC4-2 (IgG-Typ) wurden mittels Behandlung mit einem herkömmlichen Verfahren davon erhalten. Der besagte monoclonale Antikörper RJC4-1 wurde mit 10 mM PBS verdünnt und der verdünnte RJC4-1 (Konzentration 50 ug/ml, 50 ul) wurde zu jeder Mulde einer MaxiSorp F8-Platte (Nung) zugegeben und durch Stehenlassen über Nacht bei 4ºC fixiert, und danach wurde die restliche Antikörperlösung durch Absaugen von der Mulde entfernt. PBS, das 1% Kälberserumalbumin (150 ul) enthielt, wurde zu jeder Mulde zugegeben und über Nacht bei 4ºC stehengelassen, um die Blockierung des Antikörpers zu erreichen, und dann wurde ein Waschvorgang durchgeführt. Das zu testende Kernprotein, das vorstehend unter Verwendung eines Kaninchen-Retikulocyten-Extrakts hergestellt worden war, wurde mit PBS, das 1% Kälberserumalbumin enthielt, in eine geeignete Konzentration verdünnt, und das verdünnte Kernprotein (50 ul) wurde zu jeder Mulde zugegeben, das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden einer Reaktion unterzogen und dann gewaschen. Danach wurde der Antikörper RJC4-2 (50 ul), an den Meerrettich-Deroxidase gebunden war, zu jeder Mulde zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC 1 Stunde einer Reaktion unterzogen und dann gewaschen. Zuletzt wurde eine wäßrige Lösung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (50 ul) zu jeder Mulde zugegeben, das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten einer Reaktion unterzogen, und dann wurde die Reaktion mit 1 N Schwefelsäure abgeschreckt. Die Absorption des Reaktionsgemisches wurde unmittelbar bei 450 nm gemessen. Als Ergebnis wurde gefunden, dass das HCV-Kernprotein mittels ELISA quantitativ bestimmt werden konnte.
    • (2) Expression des HCV-Kernproteins mit einem Kaninchen-Retikulocyten-Lysat:
  • Eine Lösung von R-IA-1 (20 umol) in TE (10 ul) und von TE (10 ul), die keine RNA enthielt, wurden jeweils mit einer wäßrigen Lösung von Methionin (2 ul) gemischt (zu einer Endkonzentration an Methionin von 10 uM). Zu jedem Gemisch (12 ul) wurde ein Kaninchen- Retikulocyten-Lysat (In Vitro-Translations-Kit, hergestellt von STRATAGENE, 20 ul) zugegeben, und das Gemisch wurde bei 30ºC 2. Stunden inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde "fach"-verdünnt und dann das Kernprotein mit ELISA quantitativ bestimmt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass das HCV-Kernprotein in der positiven Kontrolle synthetisiert wurde, aber kein HCV-Kernprotein wurde in der negativen Kontrolle gefunden.
    • 3. Suche des Zielbereichs von Antisense-Verbindungen:
  • Oligonucleotide, die komplementär zum nichttranslatierten 5'-Bereich waren, wurden wie folgt auf ihre Fähigkeit getestet, die Translation des HCV-Kernproteins in vitro zu hemmen.
    • (1) Herstellung von synthetischen Antisense-DNA-Oligonucleotiden:
  • Antisense-Oligonucleotide wurden mittels eines Festphasen-Phosphoamidit-Verfahrens, wie in Beispiel 1 (für Oligonucleotide, die mit "IA-" bezeichnet werden), oder unter Verwendung eines Cyclone Plus DNA-Synthesegeräts (hergestellt von MilliGen/Biosearch) (für Oligonucleotide, die mit "CAS-" bezeichnet werden) hergestellt. Das so erhaltene Produkt wurde mit Phenol behandelt und einer Ethanolfällung unterworfen. Der Niederschlag wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) - 1 mM EDTA-Lösung zur Verwendung im folgenden Verfahren gelöst.
  • Die Antisense-Oligonucleotide waren jeweils 20 Nucleotide lang. Die "CAS-" oder "IA-" Nummern, die zur Bezeichnung jeder Sequenz verwendet wurden, beziehen sich auf die Nummer des am meisten 5' stehenden Nucleotids der entsprechenden HCV-RNA- Zielsequenz, die in der begleitenden Fig. 1 gezeigt wird.
    • (2) Bewertung der hemmenden Aktivität der Antisense-Oligonucleotide:
  • R-IA-1 (20 umol) und eine zu testende Antisense-DNA (100 umol) wurden in TE (Endvolumen 10 ul) gemischt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten gelassen. Zu der Lösung wurden eine wäßrige 10 mM Lösung von Methionin (2 ul) zugegeben und außerdem wurde zu dem Gemisch (12 ul) ein Kaninchen-Retikulocyten-Lysat (In Vitro- Translations-Kit, hergestellt von STRATAGENE, 20 ul) zugegeben, und das Gemisch wurde bei 30ºC 2 Stunden inkubiert. Nach Abschluß der Reaktion wurde das in dem Reaktionsgemisch gebildete Kernprotein mittels ELISA quantitativ bestimmt, und es wurde das Verhältnis der Menge an Kernprotein in besagtem Reaktionsgemisch zu der des Kernproteins berechnet, das in TE gebildet wurde, der keine Antisense-DNA enthielt. Die hemmende Aktivität (%) wurde durch Abzug des vorstehenden erhaltenen Verhältnisses von 1 (eins) und durch Ausdruck des Ergebnisses als Prozentsatz berechnet.
    • (3) Durchmusterung nach Zielbereichen, die bei der Hemmung des Wachstums von HCV wirksam sind:
  • Es wurden Antisense-Oligonucleotide synthetisiert, die komplementär sind zu Zielsequenzen, die in 10-Nucleotid-Abständen von Nucleotid 1 bis 339 im nichttranslatierten 5'-Bereich der HCV-RNA liegen. Die Sequenzen dieser Oligonucleotide, CAS-1 bis CAS- 320, werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Antisense-Oligonucieotide gegen HCV
  • Die hemmende Aktivität dieser Antisense-Oligonucleotide wurde unter Verwendung des in vitro-HCV-Kernprotein-Translationstests getestet. Bei Oligonucleotid CAS-110, das komplementär zu einem Bereich von der Schleife C ist, wurde gefunden, dass es eine Hemmung von mehr als 80% verursacht, und es wird am meisten bevorzugt. Diese Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt.
    • (4) Detailliertere Analyse im Bereich der Basennummer 100-130:
  • Zusätzliche Oligonucleotide, die komplementär sind zu dem Bereich von Nucleotid 100 bis 140 von HCV-RNA, was den Bereich von Schleife C umfaßt, wurden synthetisiert und wie vorstehend getestet. Diese Oligonucleotide werden in Tabelle 2 gezeigt. Wie in Fig. 2 gezeigt, wurde bei den Nucleotiden CAS-104, CAS-106 und CAS-108 gefunden, dass sie die HCV-Kernprotein-Translation in vitro zu 70% oder mehr hemmen, und diese werden bevorzugt. Die Antisense-Oligonucleotide, die komplementär sind zu dem 26 Basen-Bereich der HCV-RNA von den Nucleotiden 104 bis 129, zeigten eine starke hemmende Aktivität der Translation der HCV-RNA im Vergleich mit den Antisense-Oligonucleotiden, die komplementär sind zu anderen Bereichen des nichttranslatierten 5'-Bereichs. Oligonucleotide, die mit diesem Bereich hybridisierbar sind, werden daher bevorzugt.
    • (5) Bewertung von Antisense-Oligonucleotiden, bei denen die Base Nummer 119 durch Inosin ersetzt wurde:
  • Weil das Nucleotid an Position 119 Bereich von Schleife C eine hohe Variationsrate zwischen den HCV-Stämmen hat, wurden verschiedene Antisense-Oligonucleotide hergestellt, in denen das Adenosin an dieser Position durch die "universelle Base" Inosin ersetzt war, um, wie folgt, zu bewerten, ob die substituierten Oligonucleotide wirksam bei der Inhibition verschiedener Virus-Stämme sind.
  • In der Nucleotidsequenz von CAS-110 wurde das Thymidin, das dem Adenosin bei Nucleotid Nummer 119 entspricht, durch Inosin ersetzt und ergab CAS-110-I-119. Zum Vergleich wurde auch CAS-110-G-119 hergestellt, worin besagtes Thymidin durch Guanosin ersetzt war, um so eine künstliche Fehlpaarung zu erzeugen. Die Sequenzen werden in Tabelle 2 gezeigt. Die hemmende Aktivität dieser Oligonucleotide wurde wie vorstehend bewertet. Als Ergebnis zeigte CAS-110-I-119 eine hemmende Aktivität, die zu mehr als 70% der von CAS- 110 ähnlich war, aber CAS-110-G-119 zeigte eine viel niedrigere Aktivität. CAS-110-I-119 wird daher bevorzugt. Nach diesem Ergebnis ist es wahrscheinlich, dass die Verbindung, die durch den Austausch von Thymidin durch Inosin erhalten wird, wirksam gegen andere Virus- Stämme ist, bei denen das Adenosin in Position 119 durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist.
    • (6) Bewertung von 2'-O-Methyl Antisense-Oligonucleotiden:
  • Die Bindungsaffinität von Antisense-Oligonucleotiden für ihre Zielsequenz wird durch Methoxylierung der 2'-Position des Zuckerrests in dem Antisense-Oligonucleotide erhöht. 2'- O-methylierte Oligonucleotide wurden hergestellt, die die in Tabelle 2 (anders als die zwei durch Inosin substituierten) gezeigten Sequenzen haben, und ihre hemmende Aktivität wurde bewertet. In den meisten Fällen waren die 2'-O-methylierten Oligonucleotide in ihrer hemmenden Aktivität ähnlich wie ihre unveränderten Gegenstücke. Einige Oligonucleotide (CAS-80, CAS-360) schienen nach 2'-O-Methylierung weniger aktiv zu sein, und CAS-260, das an den Bereich der Schleife F hybridisiert, schien nach 2'-O-Methylierung deutlich mehr aktiv zu sein und zeigte eine Hemmung von mehr als 75%. Diese Sequenz wird daher bevorzugt. Die Aktivitäten von einigen der getesteten Oligonucleotide werden in Fig. 3 gezeigt.
    • Beispiel 8 Bestimmung der hemmenden Aktivität von Antisense-Oligonucleotiden, die komplementär sind zu der Nucleotidsequenz um das Polyprotein-Translations- Initiationscodon und den benachbarten Kernprotein-Codierungsbereich:
  • (1) Um die hemmende Aktivität von Antisense-Oligonucleotiden zu bestimmen, die komplementär sind zu der Nucleotidsequenz um das Translations-Initiationscodon (Nucleotid Nummer 342-344) von HCV-RNA und den benachbarten Kernprotein-Codierungsbereich, wurde eine Reihe von 20mer-Antisense-Oligonucleotiden hergestellt, die komplementär sind zu dem Bereich von Nucleotid 320 bis Nucleotid 379. Von diesen enthalten CAS-324 bis CAS-344 die gesamte oder einen Teil der Sequenz CAT, welche komplementär ist zu dem AUG-Initiationscodon selbst. Die Nucleotidsequenz dieser Antisense-Oligonucleotide wird in der anschließenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Antisense-Oligonucleotide gegen HCV
  • Die hemmende Aktivität dieser 21 Antisense-Oligonucleotide wurde auf die selbe Weise wie vorstehend bei einer Konzentration von 40 umol Antisense-Oligonucleotiden bestimmt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, zeigten die Antisense-Oligonucleotide CAS-328, CAS- 336, CAS-338, CAS-340, CAS-342, CAS-344, CAS-346, CAS-348, CAS-350, CAS-352, CAS-354, CAS-356, CAS-358 und CAS-360 eine hemmende Aktivität von mehr als 70%, und diese werden bevorzugt. Von diesen zeigten CAS-336, CAS-338, CAS-340, CAS-342, CAS- 344, CAS-346, CAS-348, CAS-350 und CAS-352 eine extrem hohe hemmende Aktivität von mehr als 95% und werden am meisten bevorzugt. Von diesen hybridisieren CAS-346 bis CAS-360 an den Kernprotein-Codierungsbereich direkt neben dem Translation- Initiationscodon und sind nicht komplementär zu AUG selbst, zeigten aber noch eine extrem hohe hemmende Aktivität. Andererseits sind die 6 Antisense-Oligonucleotide CAS-324, CAS- 326, CAS-328, CAS-330, CAS-332 und CAS-334 komplementär zum Translations- Initiationscodon, zeigten aber eine niedrigere hemmende Aktivität als die 9 aktivsten vorstehenden Antisense-Sequenzen.
  • Die HCV-Zielsequenzbereiche, die komplementär sind zu den vorstehenden 9 aktivsten Antisense-Oligonucleotiden, haben die vier Nucleotide von Nummer 352 bis 355 im Kernprotein-Codierungsbereich in der Nähe des Polyprotein-Translation-Initiationscodons gemeinsam. Deshalb wird nahegelegt, dass es von Nutzen ist, diese vier Basen einzuschließen, um die Translation zu hemmen. Dementsprechend sind Oligonucleotide, die die Sequenz GGAT umfassen, bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
  • (2) Bewertung von Antisense-Oligonucleotiden, bei denen die zwischen den Stämmem als variabel bekannten Nucleotide durch Inosin substituiert waren:
  • Es ist bekannt, dass in der Nucleotidsequenz um Kernprotein-Codierungsbereich in der Nähe des Translation-Initiationscodon eine Variation der Basen zwischen den Stämmen gelegentlich bei den Nucleotiden 350, 351, 352, 362 und 362 auftritt. Basierend auf diesem Wissen wurde untersucht, ob eine Substitution dieser Basen durch die "universelle Base" Inosin bei der Hemmung der verschiedenen Viren wirksam wäre.
  • Es wurde durch Substitution der Base bei der Basennummer 350 in CAS-344 durch Inosin eine Antisense-DNA hergestellt, die als CAS-344-i1 bezeichnet wurde. Vergleichsweise wurden eine Antisense-DNA, bei der die drei Basen bei der Basenummer 350, 356 und 362 durch Inosin substituiert waren und die als CAS-344-i3 bezeichnet wurde, und eine Antisense-DNA hergestellt, bei der fünf Basen bei der Basennummer 350, 351, 352, 356 und 362 durch Inosin substituiert waren und die als CAS-344-i5 bezeichnet wurde. Die hemmende Aktivität dieser Antisense-Oligonucleotide wurde wie vorstehend (1) bestimmt. Als Ergebnis zeigten CAS-344i1 und CAS344-i3 eine hohe hemmende Aktivität, was nahelegt, dass die Antisense-Oligonucleotide, die bis zu etwa drei Inosin-Substitutionen bei der Sequenz CAS-344 haben, eine hohe hemmende Aktivität zeigen können. Diese Oligonucleotide sind bevorzugt. Ihre hemmenden Aktivitäten werden in der begleitenden Tabelle 3 gezeigt.
    • Beispiel 9 Bewertung von Antisense-DNA in HCV-Kernprotein-Expressionszellen: (1) Herstellung von Phosphorothioat-Oligonucleotiden:
  • Weil die Sequenzen CAS-110, CAS-260 und CAS-344 eine hohe hemmende Aktivität als Phosphodiester (P=O) im Test der in vitro-Translation zeigten, wurden die entsprechenden Phosphorothioat (P=S)-Oligonucleotide hergestellt. Diese Oligonucleotide werden durch den Zusatz "S" nach dem Namen von jedem Stamm-Olilgonucleotid bezeichnet, wie "CAS-110S", "CAS-260S" und dergleichen. Als negative Kontrolle wurde ein Oligonucleotid mit Zufallssequenz hergestellt.
    • (2) Herstellung einer für Leberzell-Transformante:
  • Ein Expressionsplasmid wurde durch Insertion eines Genes (1,3 kbp), das den 5'-NCR- Kern-env-Bereich von HCV codiert, mittels herkömnnlicher Verfahren hergestellt.
  • Das so hergestellte Expressionsplasmid wurde mittels des Lipofectin-Verfahrens in einen menschlichen Leberzellstamm (H8Ad17) transfiziert. Ein chemisch resistenter Stamm wurde auf der Basis des chemischen Resistenzmarker-Gens (G418), das in das Expressionsplasmid insertiert war, selektioniert, und dadurch wurde die gewünschte Leberzell- Transformante erhalten, die das HCV-Kernprotein exprimierte.
    • (3) Nachweissystem für das Kernprotein, das von der Leberzell-Transformante exprimiert wurde:
  • Das Kernprotein, das von der Leberzell-Transformante exprimiert wurde, wurde mittels eines ELISA-Verfahrens nachgewiesen unter Verwendung eines monoclonalen anti- HCV-Kern-Antikörpers der Maus als Festphasen-Antikörper; eines polyclonalen menschlichen anti-HCV-Antikörpers als primärem Antikörper; und eines HRP (Meerrettich- Peroxidase)-konjugierten, monoclonalen, anti-menschliches IgG Antikörpers der Maus als sekundärem Antikörper. Unter Verwendung dieses Nachweissystems wurde das Kernprotein, das von der Leberzell-Transformante exprimiert wurde, gemessen.
    • (4) Bewertung von Antisense-Oligonucleotiden:
  • Die Leberzell-Transformante (2,5 · 10&sup5; Zellen) wurde auf 6-Mulden-Platten inokuliert, und die Zellen wurden darauf fixiert. Zu jeder Platte wurde jedes der vorstehend erhaltenen fünf Antisense-Oligonucleotide (jedes in einer Konzentration von 5 uM) zugegeben. Nach zwei Tagen wurden die Zellen geerntet und gezählt. Die Zellen wurden einmal gewaschen und mit einem lytischen Mittel für Zellen lysiert und dann wurde die hemmende Aktivität mittels des ELISA-Verfahrens gemessen.
  • Unter der Annahme, daß eine Inhibitionsrate von 0% der Menge des Kernproteins in dem Falle entspricht, in dem keine Antisense-Verbindung zugegeben wurde, wurden die hemmenden Aktivitäten der fünf P=S Antisense-Oligonucleotide berechnet. Als Ergebnis zeigten CAS-110S, CAS260S, CAS-344S und CAS-345S eine hemmende Aktivität von etwa 30-45% in diesem in vivo-Test. Die Zelltoxizität dieser Antisense-Oligonucleotide wurde ebenfalls überprüft. Als Ergebnis wurde bei all diesen Antisense-Oligonucleotiden keine Zelltoxizität beobachtet.
    • Beispiel 10 Bewertung von Oligonucleotiden in einem modifizierten in vitro-Kernprotein- Translationstest:
  • Der in Beispiel 7 beschriebene Test wurde durch die Konstruktion eines T7-HCV- Kern-env-Fusionsplasmids modifiziert, um den PCR-Amplifikationsschritt zu eliminieren. Es wurde ein T7-Expressionsplasmid konstruiert, in dem das Hind III- bis Bam HI-Fragment, das den nichtcodierenden 5'-Bereich der Kernsequenzen von HCV enthält, in das Plasmid pGEM4Z insertiert wurde. Das resultierende Plasmid wurde mit Bam HI linearisiert und mittels T7 RNA-Polymerase transkribiert. ³&sup5;S-markierte in vitro-Translationsprodukte wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die optimale Menge an T7 RNA- Transkript zur Verwendung in dem Translationstest wurde zu ungefähr 2,2 umol RNA pro Reaktion bestimmt. Die in vitro-Translation von HCV-RNAs verschiedener Größen ergab ebenfalls Produkte der erwarteten Größen.
  • Eine Anzahl von Phosphodiester (nichtmodifiziert)-Oligonucleotiden, die den zuvor, wie in Beispiel 7 beschrieben, bewerteten entsprachen, wurde in dem modifizierten in vitro- Translationstest bewertet. Oligonucleotide wurden erneut synthetisiert und wurden bei einem molaren Verhältnis von 20 : 1 getestet. Wie in Fig. 4 gezeigt, zeigten die Oligonucleotide IA- 80, IA-110, IA-140 und IA-360 (identisch mit den zuvor getesteten CAS-80-, CAS-110-, CAS-140- beziehungsweise CAS-360-Sequenzen; das "IA"- oder "CAS"-Präfix bedeutet verschiedene Ansätze, die an verschiedenen Einrichtungen synthetisiert wurden) in dem modifizierten Test eine Aktivität, die vergleichbar ist zu der in den vorhergehenden Beispielen. Die Oligonucleotide IA-140, IA-260 und IA-300 (identisch mit den vorstehend getesteten CAS-140-, CAS-260- und CAS-300-Sequenzen) zeigten in diesem Test keine gute Hemmumg. IA-110 und IA-360 zeigten die beste Aktivität und auch die IA-80-Sequenz war bei diesem Test hemmend, obwohl das Ausmaß an Inhibition, das mit diesem Oligonucleotid gesehen wurde, von der RNA-Matrize beeinflußt wurde, die bei diesem Test verwendet wurde.
    • Oligonukleotide mit 2'-O-Methyl-Modifikationen:
  • Oligonucleotidsequenzen, die zuvor als nichtmodifizierte Phosphodiesterverbindungen: (P=O) getestet worden waren, wurden einheitlich als 2'-O-Methyl/P = O synthetisiert und in dem modifizierten in vitro-Translationstest getestet. Die Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt. Die Oligonucleotide IA-110, 112, 260, 325 und 340 zeigten hemmende Aktivität in Übereinstimmung mit den vorstehend mit P=O-Oligonucleotiden erhaltenen Ergebnissen und sind bevorzugt. Wie unter Verwendung des Originaltestsystems gefunden wurde, war das Oligonucleotid 260 in der 2'-O-Methyl/P=O-Form aktiver als nichtmodifizierter Phosphodiester.
  • Ein Satz an einheitlichen 2'-O-methylierten Phosphodiester-Oligonucleotiden, komplementär zu den Schleife C-Sequenzen, wurde bewertet unter Verwendung des modifizierten in vitro-Translationstests, um die Oligonucleotide mit der größten hemmenden Aktivität zu identifizieren. Ein zweiter Satz an 2'-O-methylierten Phosphodiester- Oligonucleotiden, komplementär zu dem Polyprotein-Initiationscodon-Bereich, wurde ebenfalls getestet. Die Ergebnisse dieser Tests werden in den Fig. 5 und 6 gezeigt. Diese Ergebnisse bestätigten, dass Antisense-Oligonucleotide, die komplementär zu der Schleife C (um Nucleotid 110) und zum Polyprotein-Translation-Initiationscodon (um Nucleotid 340) und zum anschließenden Kernprotein-Codierungsbereich sind, eine gute hemmende Aktivität zeigen. Solche Oligonucleotide sind bevorzugt.
    • Bewertung von Phosphorothioat (P=S)-Oligonucleotiden
  • Phosphorothioat-Oligonucleotide IA-110 und IA-340 mit durchgängiger 2'-O-Methyl- Modifikation wurden unter Verwendung des modifizierten in vitro-Translationstests bewertet. Ein Vergleich der hemmenden Aktivitäten von Phosphorothioat (P=S)-, Phosphodiester (P=O)-, 2'-O-me/P=S- und 2'-O-me/P=O-Oligonucleotiden wurde durchgeführt. Zufällige Oligonucleotide (P=S R, 2'-O-Me/P=S R, 2'-O-Me/P=O R) wurden in die Tests eingeschlossen, um die Spezifität zu zeigen. Alle IA-110-Oligonucleotide, unabhängig von der Modifikation, zeigten eine ähnliche Fähigkeit, die HCV-Kernprotein-Translation zu hemmen. Die zufällige 110-Sequenz zeigte auch eine vergleichbare hemmende Aktivität, obwohl die Zufälligkeit nicht absolut war, weil 13 von 20 Nucleotiden in dieser Sequenz G sind. Oligonucleotid 340 zeigte eine sequenzspezifische Hemmung der HCV-Kernprotein- Translation, da zufällige 340-Oligonucleotide eine merklich niedrigere hemmende Aktivität als Antisense-Oligonucleotide zeigten. P=O-, 2'-O-Me/P=O- oder 2'-O-Me/P=S- Oligonucleotide (340-Sequenz) zeigten eine ähnliche, fast vollständige Reduktion der HCV- Kernprotein-Translation, die konzentrationsabhängig war, wie in Fig. 7 gezeigt.
  • Weil Phosphorothioat-Oligonucleotide dahin tendierten, ein gewisses Maß an nichtspezifischer Hemmung der in vitro-Translation in vorstehendem Test zu zeigen, wurde eine Anzahl an Phosphorothioaten in einem erneuten Test durchmustert, bei dem vor der in vitro-Translation eine RNase H-Behandlung durchgeführt wurde. 2,2 umol RNA, 4,4 umol Antisense-Oligonucleotid und 0,23 Einheiten RNase H wurden in einem Gesamtvolumen von 4 ul RNase H-Puffer kombiniert, der aus 40 mM Tris HCl, pH 8,0, 20 mM MgCl&sub2;, 200 mM KCl und 10% Sucrose bestand. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Die in vitro-Translation und SDS-PAGE wurden, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, durchgeführt. Die RNase H wird nur dann zur Spaltung von Ziel-RNA aktiviert, wenn Oligonucleotid an die RNA hybridisiert ist. Sowohl P=O- als auch P=S-, aber nicht 2'-O- Methyl-Oligonucleotide sind in der Lage, die RNase H-Spaltung von RNA zu aktivieren. RNA, die gespalten wurde, wird nicht in Protein translatiert. So zeigt die Hemmung der Translation in diesem Test die erfolgreiche Bindung von Oligonucleotid an die Ziel-RNA an. Zufällige P=S-Kontrollsequenzen zeigten keine Aktivität bei diesem Test, was zeigte, dass sie nicht an die Ziel-RNA binden. Die Ergebnisse werden in Fig. 8 gezeigt.
    • Beispiel 11 2'-O-Propyl- und andere zusätzliche Oligonucleotide:
  • Die in Tabelle 4 gezeigten zusätzlichen P=S-, P=O- und 2'-modifizierten Oligonucleotide (durchgängig modifiziert) wurden synthetisiert. Die 2'-O-Propyl- Oligonucleotide wurden in dem modifizierten in vitro-Translationstest getestet und mit den 2'- O-Methyl-Oligonucleotiden derselben Sequenz verglichen. Wie in Fig. 9 gezeigt, inhibierten in den meisten Fällen die 2'-O-Propyl-Oligonucleotde die HCV-Kernprotein-Translation in etwa demselben Ausmaß wie ihre 2'-O-Methyl-Gegenstücke. Die aktivsten Sequenzen waren IA-110, IA-260 und IA-340; dies sind bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Im Falle von IA-360 hatte das 2'-O-Propyl-Oligonucleotid eine größere hemmende Aktivität als die 2'- O-Methyl-Version. Tabelle 4 Antisense-Oligonucleotide gegen HCV
  • P=S: Phosporthioat;
  • P=O: Phosphodiester;
  • 2'-O-Me: 2'-O-Methyl
  • 2'-O-Pro: 2'-O-Propyl
    • SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (i) ANMELDER: Juridical Foundation the Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute et al.
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von mit Hepatitis C-Virus assoziierten Krankheiten
  • (iii) ANZAHL AN SEQUENZEN: 96
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) ADRESSAT: AOYAMA & PARTNERS
  • (B) STRASSE: TWIN 21 MID Tower, 1-61, Shiromi 2-chome, Chuo-ku
  • (C) STADT: Osaka-shi
  • (D) STAAT: Osaka
  • (E) LAND: JAPAN
  • (F) POSTLEITZAHL: 540
  • (v) COMPUTER-LESBARE FORM:
  • (A) MEDIUM-TYP: DISKETE, 3,5 INCH, 1,44 Mb SPEICHER
  • (B) COMPUTER: IBM PS/2
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS
  • (D) SOFTWARE: WORDPERFECT 5.1
  • (vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER: n/a
  • (B) ANMELDEDATUM: Hiermit
  • (C) KLASSIFIKATION:
  • (vii) DATEN DER VORHERGEHENDEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER:
  • (B) ANMELDEDATUM:
  • (viii) INFORMATION ZUM ANWALT/AGENT:
  • (A) Name: AOYAMA Tamotsu
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 6214
  • (C) REFERENZ/AKTEN-NUMMER: 645640
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION:
  • (A) TELEFON: (81) 6-949-1261
  • (B) TELEFAX: (81) 6-949-0361
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 1:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
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  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 2:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
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  • (iv) ANTISENSE: Ja
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  • CGAGTGATCT ATGGTGGAGT G 21
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  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
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  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
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  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 9:
  • GTTCCTCACA GGGGAGTGAT T 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 10:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 10:
  • TACTAACGCC ATGGCTAGAC G 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 11:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 11:
  • CTATGGCTCT CCCGGGAGGG G 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 12:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 12:
  • CCACTATGGC TCTCCCGGGA G
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 13:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 13:
  • CGGTGTACTC ACCGGTTCCG C 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 14:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 14:
  • CTGGCAATTC CGGTGTACTC A 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 15:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 15:
  • GGGGCACGCC CAAATCTCCA G 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 16:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 16:
  • CCTTTCGCGA CCCAACACTA C 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 17:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 17:
  • CCCTATCAGG CAGTACCACA A 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 18:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 18:
  • CTCCCGGGGC ACTCGCAAGC A 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 19:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 19:
  • CATGGTGCAC GGTCTACGAG A 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 20:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 20:
  • GTCCTGGAGG CTGCACGACA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 21:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 21:
  • TTTAGGATTC GTGCTCATGG T 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 22:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 22:
  • GAGTGGTTAG CCCAATCTTC A 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 23:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 23:
  • TATTGGCCTG GAGTGGTTAG C 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 24:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 24:
  • AGGGAATGGC CTATTGGCCT G 21
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 25:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 686 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 25:
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 26:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 26:
  • GCCCCGAATC GGGGGCTGGC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 27:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 27:
  • TGGAGTGTCG CCCCCAATCG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 28:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 28:
  • TGATCTATGG TGGAGTGTCG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 29:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 29:
  • CACAGGGGAG TGATCTATGG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 30:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 30:
  • AGTAGTTCCT CACAGGGGAG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 31:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 31:
  • GCGTGAAGAC AGTAGTTCCT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 32:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 32:
  • GACGCTTTCT GCGTGAAGAC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 33:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 33:
  • GCCATGGCTA GACGCTFCT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 34:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 34:
  • TCATACTAAC GCCATGGCTA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 35:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 35:
  • TGCACGACAC TCATACTAAC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 36:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 36:
  • TCCTGGAGGC TGCACGACAC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 37:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 37:
  • GGTCCTGGAG GCTGCACGAC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 38:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 38:
  • GGGGTCCTGG AGGCTGCACG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 39:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 39:
  • GGGGGGTCCT GGAGGCTGCA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 40:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 40:
  • AGGGGGGGTC CTGGAGGCTG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 41:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 41:
  • GGAGGGGGGG TCCTGGAGGC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 42:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (ix) EIGENSCHAFT:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: andere Eigenschaft
  • (B) LAGE: 42
  • (D) ANDERE INFORMATION: N ist Inosin
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 42:
  • GGAGGGGGGG NCCTGGAGGC
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 43:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 43:
  • GGAGGGGGGG GCCTGGAGGC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 44:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 44:
  • CGGGAGGGGG GGTCCTGGAG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 45:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 45:
  • CCCGGGAGGG GGGGTCCTGG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 46:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 46:
  • CTCCCGGGAG GGGGGGTCCT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 47:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 47:
  • CTCTCCCGGG AGGGGGGGTC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 48:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 48:
  • GGCTCTCCCG GGAGGGGGGG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 49:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 49:
  • AGACCACTAT GGCTCTCCCG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 50:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 50:
  • CCGGTTCCGC AGACCACTAT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 51:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 51:
  • GGTGTACTCA CCGGTTCCGC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 52:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 52:
  • TGGCAATTCC GGTGTACTCA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 53:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 53:
  • CCGGTCGTCC TGGCAATTCC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 54:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 54:
  • AAGAAAGGAC CCGGTCGTCC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 55:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 55:
  • GGGTTGATCC AAGAAAGGAC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 56:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 56:
  • GGCATTGAGC GGGTTGATCC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 57:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 57:
  • CAAATCTCCA GGCATTGAGC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 58:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 58:
  • GGGGCACGCC CAAATCTCCA 20
  • (2) INIFORMATION ZU SEQ ID Nr: 59:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 59:
  • CAGTCTCGCG GGGGCACGCC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 60:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 60:
  • ACTCGGCTAG CAGTCTCGCG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 61:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 61:
  • ACCCAACACT ACTCGGCTAG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 62:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 62:
  • GCCTTTCGCG ACCCAACACT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 63:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 63:
  • GTACCACAAG GCCTTTCGCG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 64:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 64:
  • CTATCAGGCA GTACCACAAG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 65:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 65:
  • CGCAAGCACC CTATCAGGCA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 66:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 66:
  • CCGGGGCACT CGCAAGCACC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 67:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 67:
  • ACGAGACCTC CCGGGGCACT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 68:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 68:
  • TGCACGGTCT ACGAGACCTC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 69:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 69:
  • GGTGCACGGT CTACGAGACC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 70:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 70:
  • ATGGTGCACG GTCTACGAGA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 71:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 71:
  • TCATGGTGCA CGGTCTACGA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 72:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 72:
  • GCTCATGGTG CACGGTCTAC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 73:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 73:
  • GTGCTCATGG TGCACGGTCT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 74:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 74:
  • TCGTGCTCAT GGTGCACGGT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 75:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 75:
  • ATTCGTGCTC ATGGTGCACG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 76:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 76:
  • GGATTCGTGC TCATGGTGCA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 77:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 77:
  • TAGGATTCGT GCTCATGGTG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 78:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 78:
  • TTTAGGATTC GTGCTCATGG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 79:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 79:
  • GGTTTAGGAT TCGTGCTCAT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 80:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 80:
  • GAGGTTTAGG ATTCGTGCTC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 81:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (ix) EIGENSCHAFT:
  • (C) NAME/SCHLÜSSEL: andere Eigenschaft
  • (D) LAGE:81
  • (D) ANDERE INFORMATION: N ist Inosin
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 81:
  • GAGGTTTAGG ATTNGTGCTC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 82:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
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  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (ix) EIGENSCHAFT:
  • (E) NAME/SCHLÜSSEL: andere Eigenschaft
  • (F) LAGE: 82
  • (D) ANDERE INFORMATION: N ist Inosin
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 82:
  • GNGGTTTNGG ATTNGTGCTC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 83:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
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  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (ix) EIGENSCHAFT:
  • (G) NAME/SCHLÜSSEL: andere Eigenschaft
  • (H) LAGE: 83
  • (D) ANDERE INFORMATION: N ist Inosin
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 83:
  • GNGGTTTNGG ANNNGTGCTC
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 84:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstramg
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 84:
  • TTGAGGTTTA GGATTCGTGC 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 85:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 85:
  • CTTTGAGGTT TAGGATTCGT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 86:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 86:
  • TTCTTTGAGG TTTAGGATTC 20
  • (2) INIFORMATION ZU SEQ ID Nr: 87:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 87:
  • TTTTCTTTGA GGTTTAGGAT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 88:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
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  • (iv) ANTISENSE: Ja
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  • GTTTTTCTT GAGGTTTAGG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 89:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 89:
  • TGGTTTTTCT TTGAGGTTTA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 90:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 90:
  • TTTGGTTTTT CTTTGAGGTT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 91:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
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  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 91:
  • CGTTTGGTTT TTCTTTGAGG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 92:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 92:
  • CAAGGCCTTT CGCGACCCAA 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 93:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
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  • CATGGTGCAC GGTCTACGAG 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 94:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
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  • GTTACGTTTG GTTTTTCTTT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 95:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
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  • (iv) ANTISENSE; Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 95:
  • TGGTGTTACG TTTGGTTTT 20
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr: 96:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (iv) ANTISENSE: Ja
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 96:
  • GGTTGGTGTT ACGTTTGGTT 20

Claims (31)

1. Antisense-Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die mindestens zu einem Teil der genomischen oder messenger-RNA von HCV komplementär ist, wobei das Oligonucleotid fähig ist, die Funktion der RNA zu hemmen, wobei der Teil der RNA aus der Haarnadelschleife am 5'-Ende, dem 6- Basenpaar-Wiederholung am 5'-Ende, des 5'-nichttranslatierten Bereich, dem Polyprotein-Translation-Initiationscodon, dem ORF-3-Translation- Initiationscodon, dem Kernprotein-Codierungsbereich, dem 3'- nichttranslatierten Bereich, dem palindromischen Bereich am 3'-Ende, der R2-Sequenz oder der Haarnadelschleife am 3'-Ende einer HCV-RNA besteht.
2. Oligonucleotid nach Anspruch 1, das eine chemisch modifizierte Verbindung ist.
3. Oligonucleotid nach den Ansprüchen 1 und 2, das 5 bis 50 Nucleotide umfaßt.
4. Oligonucleotid nach Anspruch 3, das eine der Sequenzen aus Tabelle 1 umfaßt.
5. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das hybridisierbar ist mit der folgenden Nucleotidsequenz (A) oder einer Nucleotidsequenz, die eine hohe Homologie zur Nucleotidsequenz (A) hat, welche im 5'-nichttranslatierten Bereich der Nucleotidsequenz des Hepatitis C Virus-Genoms liegt:
(A) GCCUCCAGGACCCC.
6. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Oligonucleotid mindestens 14 Nucleinsäure-Basen-Einheiten hat.
7. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Oligonucleotid mindestens eine Antisense-Nucleotidsequenz zur Nucleotidsequenz (A) enthält.
8. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Oligonucleotid eine Nucleinsäure mit 20 Basen-Einheiten ist, die eine Antisense-Nucleotidsequenz zur Nucleotidsequenz (A) enthält.
9. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Oligonucleotid mindestens eine Antisense-Nucleotidsequenz zur Nucleotidsequenz (A) enthält und ferner ein Antisense-Oligonucleotid enthält, das zu einer Nucleinsäure mit 14 bis 26 kontinuierlich aufeinanderfolgenden Nucleotiden der folgenden Nucleotidsequenz (B) komplementär ist:
(B) CGUGCAGCCUCCAGGACCCCCCCUCC.
10. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Oligonucleotid eine Phosphorthioat-Verbindung ist.
11. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das mit den Nucleotiden der Nummern 352 bis 355 (AUCC) einer Nucleotidsequenz der HCV-DNA oder damit benachbarten Nucleotiden hybridisierbar ist.
12. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die RNA mindestens einen Teil des Schleife B-Bereichs oder des Schleife C-Bereichs des 5'-nichttranslatierten Bereichs einer HCV-RNA umfaßt.
13. Oligonucleotid nach Anspruch 12, wobei die RNA die Nucleotide 104 bis 129 des 5'- nichttranslatierten Bereichs einer HCV-RNA umfaßt.
14. Oligonucleotid nach Anspruch 12, umfassend die SEQ ID Nr: 33, SEQ ID Nr: 41, SEQ ID Nr: 20, SEQ ID Nr: 38, SEQ ID Nr: 39, SEQ ID Nr: 40, SEQ ID Nr: 42, SEQ ID Nr: 44 oder die SEQ ID Nr: 45.
15. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die RNA mindestens einen Teil des Schleife F-Bereichs des 5'-nichttranslatierten Bereichs einer HCV-RNA umfaßt.
16. Oligonucleotid nach Anspruch 15, das die SEQ ID Nr: 62 umfaßt.
17. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die RNA mindestens einen Teil des Polyprotein-Translation-Iniatiationcodons einer HCV-RNA umfaßt.
18. Oligonucleotid nach Anspruch 17, das die SEQ ID Nr: 81, SEQ ID Nr: 82, SEQ ID Nr: 72, SEQ ID Nr: 76, SEQ ID Nr: 77, SEQ ID Nr: 78, SEQ ID Nr: 79 oder die SEQ ID Nr: 80 umfaßt.
19. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die RNA mindestens einen Teil der für das Kernprotein codierenden Region einer HCV-RNA umfaßt.
20. Oligonucleotid nach Anspruch 19, das die Sequenz GGAT umfaßt.
21. Oligonucleotid nach Anspruch 19, das die; SEQ ID Nr: 84, SEQ ID Nr: 85, SEQ ID Nr: 86, SEQ ID Nr: 87, SEQ ID Nr: 88, SEQ ID Nr: 89, SEQ ID Nr: 90 oder die SEQ ID Nr: 91 umfaßt.
22. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 21, das mindestens eine Phosphvrthioat-Interzucker-Verknüpfung umfaßt.
23. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 22, das eine Modifikation an der 2'- Position mindestens einer Zuckereinheit umfaßt.
24. Oligonucleotid nach Anspruch 23, wobei die Modifikation eine -O-Alkyl-Modifikation ist.
25. Oligonucleotid nach Anspruch 24, wobei die -O-Alkyl-Modifikation eine -O-Methyl- Modifikation oder eine -O-Propyl-Modifikation ist.
26. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 25, das eine universelle Base an einer Position hat, die komplementär zu einem Nucleotid in der HCV-RNA ist, das innerhalb verschiedener HCV-Stämme variabel ist.
27. Oligonucleotid nach Anspruch 26, wobei die universelle Base Inosin ist.
28. Arzneimittel, das ein Antisense-Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 27 umfaßt, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichem Träger.
29. Arzneimittel nach Anspruch 28 zur Behandlung von HCV-assoziierten Krankheiten von Tieren, bei denen HCV-assoziierte Krankheiten vermutet werden.
30. Verwendung des Oligonucleotides nach einem der Ansprüche 1 bis 28 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer HCV-assoziierten Krankheit.
31. Verwendung des Oligonucleotides nach einem der Ansprüche 1 bis 27 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung der Aktivität des Hepatitis C-Virus, das das Inkontaktbringens von Virus oder von mit dem Virus infizierten Zellen mit dem Antisense-Oligonucleotid umfaßt.
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Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174868B1 (en) * 1992-09-10 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis C virus-associated diseases
ATE310817T1 (de) * 1992-09-28 2005-12-15 Chiron Corp Verfahren und zusammensetzungen zur kontrolle der übersetzung der hcv-proteine
US6824976B1 (en) 1993-04-02 2004-11-30 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Method for selective inactivation of viral replication
EP0759979A4 (de) * 1994-05-10 1999-10-20 Gen Hospital Corp Die antisense-inhibition des hepatitis c virus
ZA964446B (en) * 1995-06-06 1996-12-06 Hoffmann La Roche Oligonucleotides specific for hepatitis c virus
EP0831854A4 (de) * 1995-06-06 2001-01-24 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonukleotide mit phosphorothioat-bindungen von hoher chiraler reinheit
US6090557A (en) * 1997-04-18 2000-07-18 Roche Molecular Systems, Inc. Neisseria gonorrhoeae-specific oligonucleotides
EP1002878A3 (de) * 1998-11-19 2003-11-12 Tosoh Corporation Hepatitis C Viren RNS-bindendes oligo DNS und Verfahren für dessen Herstellung
MY164523A (en) 2000-05-23 2017-12-29 Univ Degli Studi Cagliari Methods and compositions for treating hepatitis c virus
NZ547204A (en) 2000-05-26 2008-01-31 Idenix Cayman Ltd Methods and compositions for treating flaviviruses and pestiviruses
WO2003018747A2 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Molecular interaction sites of hepatitis c virus rna and methods of modulating the same
US20050059617A1 (en) * 2001-09-17 2005-03-17 Takeshi Imanishi Novel anitsense oligonucleotide derivatives against to hepatitis c virus
HUE033832T2 (en) 2002-11-15 2018-01-29 Idenix Pharmaceuticals Llc 2'-methyl nucleosides in combination with interferon and Flaviviridae mutation
FR2848572B1 (fr) * 2002-12-12 2005-12-09 Univ Joseph Fourier Molecules inhibitrices de la synthese proteique du virus de l'hepatite c et procede de criblage desdites molecules inhibitrices
US7833987B2 (en) * 2004-03-12 2010-11-16 Indian Institute Of Science Small synthetic RNA, a method of preparing the same and uses thereof
EP2325314B1 (de) * 2004-09-24 2014-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting von Zwischenprodukten zur Gegenstrangreplikation von einzelstrangigen Viren durch RNAi
FR2884522A1 (fr) * 2005-04-19 2006-10-20 Larissa Balakireva Methode d'inhibition de la traduction et/ou la replication d'une sequence d'arn par multimerisation d'une de ses regions d'arn non codant replie
US8163708B2 (en) * 2006-04-03 2012-04-24 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotide
CA3024953A1 (en) 2006-04-03 2007-10-11 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
CA2666191C (en) * 2006-10-09 2017-07-11 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
WO2009024834A2 (en) * 2006-12-05 2009-02-26 Rosetta Genomics Ltd Nucleic acids involved in viral infection
US20080261913A1 (en) 2006-12-28 2008-10-23 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of liver disorders
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
CA2681406A1 (en) * 2007-03-22 2008-09-25 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the inhibition of apo-b100 expression
US8691965B2 (en) 2007-06-14 2014-04-08 Mirx Therapeutics Aps Oligonucleotides for modulating target RNA activity
CA2697970A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of fabp4/ap2
EA019939B1 (ru) 2007-10-04 2014-07-30 Сантарис Фарма А/С МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОЛИГОМЕР ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА микроРНК В КЛЕТКЕ
EP2268811A1 (de) * 2008-03-07 2011-01-05 Santaris Pharma A/S Pharmazeutische zusammensetzungen zur behandlung von krankheiten in verbindung mit microrna
EP2315832B1 (de) 2008-08-01 2015-04-08 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Micro-rna-vermittelte modulation koloniestimulierender faktoren
WO2010122538A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of hcv patients that are non-responders to interferon
US8563528B2 (en) 2009-07-21 2013-10-22 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting PCSK9
WO2012007477A1 (en) * 2010-07-12 2012-01-19 Santaris Pharma A/S Anti hcv oligomers
EP3702460A1 (de) 2010-11-12 2020-09-02 The General Hospital Corporation Polycombassoziierte nichtcodierende rnas
JP2014514295A (ja) 2011-03-31 2014-06-19 アイディニックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス感染の治療のための化合物および薬学的組成物
EP2755983B1 (de) 2011-09-12 2017-03-15 Idenix Pharmaceuticals LLC. Substituierte carbonyloxymethylphosphoramidatverbindungen und pharmazeutische zusammensetzungen zur behandlung von virusinfektionen
TW201331221A (zh) 2011-10-14 2013-08-01 Idenix Pharmaceuticals Inc 嘌呤核苷酸化合物類之經取代的３’，５’－環磷酸酯及用於治療病毒感染之醫藥組成物
US20150152410A1 (en) 2012-05-16 2015-06-04 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
US9109001B2 (en) 2012-05-22 2015-08-18 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3′,5′-cyclic phosphoramidate prodrugs for HCV infection
EA031301B1 (ru) 2012-05-22 2018-12-28 Иденикс Фармасьютикалз Ллс D-аминокислотные химические соединения для лечения заболеваний печени
US9296778B2 (en) 2012-05-22 2016-03-29 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3′,5′-cyclic phosphate prodrugs for HCV infection
EP2861611B1 (de) 2012-05-25 2016-07-13 Janssen Sciences Ireland UC Uracyl-spirooxetan-nukleoside
WO2014052638A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Esters and malonates of sate prodrugs
MX353422B (es) 2012-10-08 2018-01-12 Idenix Pharmaceuticals Llc Análogos de 2'-cloronucleósido para infección por vhc.
ES2659747T3 (es) * 2012-10-18 2018-03-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Ensayo de doble sonda para la detección de poblaciones heterogéneas de amplicón
EP2909222B1 (de) 2012-10-22 2021-05-26 Idenix Pharmaceuticals LLC 2',4'-verbrückten nukleoside für hcv-infektion
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
EP2935304A1 (de) 2012-12-19 2015-10-28 IDENIX Pharmaceuticals, Inc. 4'-fluor-nukleoside zur behandlung von hcv
US11274998B2 (en) 2012-12-26 2022-03-15 Ventana Medical Systems, Inc. Specimen processing systems and methods for holding slides
US9309275B2 (en) 2013-03-04 2016-04-12 Idenix Pharmaceuticals Llc 3′-deoxy nucleosides for the treatment of HCV
US9339541B2 (en) 2013-03-04 2016-05-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Thiophosphate nucleosides for the treatment of HCV
US20140271547A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Amino acid phosphoramidate pronucleotides of 2'-cyano, azido and amino nucleosides for the treatment of hcv
US9187515B2 (en) 2013-04-01 2015-11-17 Idenix Pharmaceuticals Llc 2′,4′-fluoro nucleosides for the treatment of HCV
US20140309164A1 (en) 2013-04-12 2014-10-16 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Deuterated nucleoside prodrugs useful for treating hcv
WO2014197578A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 1',4'-thio nucleosides for the treatment of hcv
SI3013959T1 (sl) 2013-06-27 2020-04-30 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Protismiselni oligomeri in konjugati, ki ciljajo PCSK9
WO2015017713A1 (en) 2013-08-01 2015-02-05 Idenix Pharmaceuticals, Inc. D-amino acid phosphoramidate pronucleotides of halogeno pyrimidine compounds for liver disease
US10202411B2 (en) 2014-04-16 2019-02-12 Idenix Pharmaceuticals Llc 3′-substituted methyl or alkynyl nucleosides nucleotides for the treatment of HCV
US10858650B2 (en) 2014-10-30 2020-12-08 The General Hospital Corporation Methods for modulating ATRX-dependent gene repression
WO2016130943A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Rana Therapeutics, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
EP3271460A4 (de) 2015-03-17 2019-03-13 The General Hospital Corporation Rna-interaktom des polycomb-repressiven komplexes 1 (prc1)

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5264423A (en) * 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5714596A (en) 1987-11-18 1998-02-03 Chiron Corporation NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
CN1049686C (zh) 1987-11-18 2000-02-23 希龙股份有限公司 非ａ和非ｂ肝炎病毒的诊断及疫苗
US5004810A (en) * 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
JP2656995B2 (ja) * 1989-03-17 1997-09-24 カイロン コーポレイション Ｎａｎｂｖの診断用薬
US5166195A (en) * 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
HUT69140A (en) * 1990-08-10 1995-08-28 Chiron Corp Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus
EP0571554A1 (de) * 1991-01-14 1993-12-01 James N. Gamble Institute Of Medical Research Grundstruktur immunogener polypeptide mit epitopen für hcv, antikörper, polynukleotidsequenzen, impfstoffe und verfahren
CZ288720B6 (cs) * 1991-05-08 2001-08-15 Chiron Corporation Nukleová kyselina, kompozice s jejím obsahem, způsob tvorby hybridizačního produktu a způsob detekce genotypů HCV
CA2070952A1 (en) * 1991-06-11 1992-12-12 Makoto Seki Gene of hepatitis c virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same
US5610054A (en) * 1992-05-14 1997-03-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecule targeted against Hepatitis C virus
US5922857A (en) 1992-09-28 1999-07-13 Chiron Corporation Methods and compositions for controlling translation of HCV proteins
JP3028171B2 (ja) * 1993-08-31 2000-04-04 日本ピラー工業株式会社 複合ガスケット

Also Published As

Publication number Publication date
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ATE202383T1 (de) 2001-07-15

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