EA019939B1 - МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОЛИГОМЕР ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА микроРНК В КЛЕТКЕ - Google Patents

МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОЛИГОМЕР ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА микроРНК В КЛЕТКЕ Download PDF

Info

Publication number
EA019939B1
EA019939B1 EA201070421A EA201070421A EA019939B1 EA 019939 B1 EA019939 B1 EA 019939B1 EA 201070421 A EA201070421 A EA 201070421A EA 201070421 A EA201070421 A EA 201070421A EA 019939 B1 EA019939 B1 EA 019939B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
zna
units
nucleotide
cells
oligomer
Prior art date
Application number
EA201070421A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201070421A1 (ru
Inventor
Сусанна Обад
Сакари Кауппинен
Йоаким Элмен
Мортен Линдов
Маркус Хейденблад
Original Assignee
Сантарис Фарма А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40526747&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA019939(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Сантарис Фарма А/С filed Critical Сантарис Фарма А/С
Publication of EA201070421A1 publication Critical patent/EA201070421A1/ru
Publication of EA019939B1 publication Critical patent/EA019939B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Настоящее изобретение относится к олигомеру непрерывной последовательности длиной 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных единиц, используемому для уменьшения эффективного количества микроРНК-мишени в клетке или организме, где олигомер является комплементарным последовательности микроРНК, выбранной из группы, состоящей из микроРНК с SEQ ID NO: 40-976, где по меньшей мере 70% нуклеотидных единиц олигомера выбраны из группы, состоящей из единиц ЗНК и 2'-замещенных нуклеотидных аналогов, и где по меньшей мере 50% нуклеотидных единиц олигомера представляют собой единицы ЗНК, и где по меньшей мере одной из имеющихся межнуклеозидных связей между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности является фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, и к применению указанного олигомера для лечения гепатита С и гиперхолистеринемии и связанных с ними нарушений.

Description

Настоящее изобретение относится к очень коротким олигонуклеотидам, ингибирующим микроРНК ίη νίνο, мишенью для которых являются микроРНК, и к их применению в лекарственных средствах и фармацевтических композициях.
Уровень изобретения
МикроРНК (миРНК) представляют собой многочисленный класс коротких эндогенных РНК, которые действуют как посттранскрипционные регуляторы генной экспрессии путем спаривания оснований с их целевой матричной РНК (мРНК). Они процессируются из более длинных (около 70-80 нуклеотидов (нт)) шпилькообразных предшественников, называемых пре-миРНК, посредством дайсер-фермента РНКазы III. Сборка микроРНК происходит в рибонуклеопротеиновых комплексах, называемых ιηιΚΝΡ, при этом миРНК распознают свои участки-мишени посредством антисмысловой комплементарности, что, таким образом, содействует даун-регуляции их генов-мишеней. Почти совершенная или совершенная комплементарность между миРНК и ее сайтом-мишенью приводит к гидролизу мРНК-мишени, тогда как ограниченная комплементарность микроРНК и ее сайта-мишени приводит к трансляционному ингибированию гена-мишени.
Сущность роли микроРНК в заболеваниях человека и ингибирование микроРНК с использованием одноцепочечных олигонуклеотидов рассмотрены в патентах νϋ 2007/112754 и νϋ 2007/112753, которые оба полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Патент νϋ 2008046911, включенный в настоящее описание посредством ссылки, описывает последовательности микроРНК, связанные с раковыми заболеваниями. Существует связь многих микроРНК с фенотипами заболеваний, и поэтому желательно получить вещества, способные модулировать доступность микроРНК ίη νίνο. В патентах νϋ 2007/112754 и νϋ 2007/112753 раскрыты короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, для которых предполагается образование мощных дуплексов с миРНК-мишенью. Согласно патентам νϋ 2007/112754 и νϋ 2007/112753 раскрытые в них последовательности 8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 1-45 представляют собой примеры антимикроРНК олигонуклеотидов.
Родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет четырех заявок: И8 № 60/977497, поданной 4 октября 2007 г., И8 № 60/979217, поданной 11 октября 2007 г., И8 № 61/028062, поданной 12 февраля 2008 г., и ЕР 08104780, поданной 17 июля 2008 г., все из которых включены со ссылкой в настоящее изобретение посредством ссылки. Кроме того, авторы ссылаются на патенты νϋ 2007/112754 и νϋ 2007/112753, которые являются более ранними заявками этих же заявителей, и включают их в настоящее изобретение посредством ссылки.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на открытии, что использование очень коротких олигонуклеотидов, нацеленных на микроРНК и имеющих высокое соотношение нуклеотидных аналогов нуклеотидов, таких как ЗНК-нуклеотидов (замкнутых нуклеиновых кислот (ΕΝΆ)), является высокоэффективным для облегчения репрессии РНК, таких как мРНК, посредством нацеленных микроРНК ίη νίνο.
Настоящее изобретение относится к олигомеру непрерывной последовательности длиной 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных единиц, используемому для уменьшения эффективного количества микроРНК-мишени в клетке или организме, где олигомер является комплементарным последовательности микроРНК, выбранной из группы, состоящей из микроРНК с 8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 40-976, где по меньшей мере 70% нуклеотидных единиц олигомера выбраны из группы, состоящей из единиц ЗНК (замкнутой нуклеиновой кислоты) и 2'-замещенных нуклеотидных аналогов, и где по меньшей мере 50% нуклеотидных единиц олигомера представляют собой единицы ЗНК, и где по меньшей мере одной из имеющихся межнуклеозидных связей между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности является фосфоротиоатная межнуклеозидная связь.
Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором все межнуклеозидные связи, расположенные между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности, являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.
Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором длина олигомера составляет 7, 8 или 9 непрерывных нуклеотидов, где все непрерывные нуклеотидные единицы независимо выбраны из группы, состоящей из единиц ЗНК и 2'-замещенных нуклеотидных аналогов.
Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором по меньшей мере 70% нуклеотидных единиц олигомера представляют собой единицы ЗНК.
Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором все нуклеотидные единицы представляют собой единицы нуклеотидных аналогов.
Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором все межнуклеозидные связи, расположенные между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности, являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.
Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором единицы нуклеотидных аналогов выбраны из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК, 2'-ОМе-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, ЗНК и 2'-МОЕ-РНК.
- 1 019939
Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором все нуклеотидные единицы представляют собой единицы ЗНК.
Настоящее изобретение относится к олигомеру по изобретению, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области Й8а-т1В-122 с 8ЕО ГО N0: 150.
Настоящее изобретение относится к применению олигомера по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения клинического нарушения или заболевания, выбранного из группы, состоящей из гепатита С и гиперхолестеринемии и связанных с ними нарушений.
Настоящее изобретение относится к способу ίη νίίτο уменьшения количества миРНК в клетке, включающему введение в клетку, которая экспрессирует указанную миРНК, олигомера по изобретению.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Схематическое отображение 8-мерных ЗНК-антимикроРНК: т1В-21, т1В-155 и ш1В-122, с указанием положений мишеней с полной ЗНК-модифицированной и фосфоротиолированной ЗНК-антиιηίΡ. Также обозначены предпочтительные положения гибридизации для 7-мерных, 8-мерных, 9-мерных и 10-мерных олигонуклеотидов ЗНК на зрелой микроРНК.
Фиг. 2. Оценка антагонизма т1В-21 с помощью ЗЕО ГО N0: 3205 и 8Е0 ГО N0: 3204 ЗНК-анти-т1В в клетках МСТ-7 (МюЫдап Сапсег Еоипбайоп-7) с использованием люцифераза-сенсорного анализа. Клетки МСЕ-7 котрансфицировали люцифераза-чувствительными плазмидами, содержащими полностью совпадающий сайт-мишень для т1В-21 или ошибочный сайт-мишень (тт2) и ЗНК-анти-т1В в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Все показанные средние значения соотношения люцифераз Веш11а/светлячка в трех отдельных экспериментах (черта сверху = стандартная ошибка среднего 8.е.т.) были стандартизованы по 0 нМ рыСНЕСК2 (=контроль).
Фиг. 3. Оценка антагонизма ιηίΡ-21 с помощью ЗЕО ГО N0: 3205 и 8Е0 ГО N0: 3204 ЗНК-анти-тгй в клетках НеЬа с использованием люцифераза-сенсорного анализа. Клетки НеЬа были котрансфицированы люцифераза-чувствительными плазмидами, содержащими полностью совпадающий сайт-мишень для ιηίΡ-21 (ши-21) или ошибочный сайт-мишень (тт2) и ЗНК-анги-тгК. в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Все показанные средние значения соотношения люцифераз ВепШа/светлячка в трех отдельных экспериментах (черта сверху = к.е.т.) были стандартизованы по 0 нМ р§1СНЕСК2 (=контроль).
Фиг. 4. Оценка антагонизма ιηίΡ-155 с помощью с ЗЕО ГО N0: 3206 и 8Е0 ГО N0: 3207 ЗНК-антиιηίΡ в обработанных ЛПС (липополисахаридом) мышиных клетках РАУ с использованием люциферазасенсорного анализа. Клетки ВАУ были котрансфицированы ιηίΡ-155 и разными ЗНК-анти-ιηίΡ в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Все показанные средние значения соотношения люцифераз Веш11а/светлячка были стандартизованы по 0 нМ р81СНЕСК2.
Фиг. 5. Оценка антагонизма ιηίΡ-122 с помощью с ЗЕО ГО N0: 3208 и 8Е0 ГО N0: 4 ЗНК-анти-т1В в клетках НиН-7 с использованием люцифераза-сенсорного анализа. Клетки НиН-7 котрансфицировали люцифераза-чувствительной ιηίΡ-122, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень ιηίΡ-122 и отличающиеся ЗНК-анги-т1В в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Все показанные средние значения соотношения люцифераз Веш11а/светлячка в трех отдельных экспериментах (черта сверху = к.е.т.) были стандартизованы по 0 нМ рыСНЕСК2 (=контроль).
Фиг. 6. Схематическое представление репортерных конструкций т1В-21-люциферазы.
Фиг. 7. Оценка антагонизма ιηίΡ-21 с помощью 8-мерных ЗНК-анти-т1В (ЗЕО ГО N0: 3205) по сравнению с 15-мерными ЗНК-анти-т1В (ЗЕО ГО N0: 3204) в клетках РС3 с использованием люцифераза-сенсорного анализа. Клетки РС3 были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий сайт-мишень ιηίΡ-21 или ошибочный сайт-мишень и ЗНКанти-ιηίΡ при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = к.е.т.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз ВепШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности т1В-21 и конструкция и положение замкнутых нуклеиновых кислот ЗНК-анти-т1В. Нуклеотиды ЗНК обозначены овалами, и остатки ДНК обозначены черточками.
Фиг. 8. Оценка специфичности антагонизма т1В-21 с помощью 8-мерных ЗНК-анти-т1В в клетках НеЬа с использованием анализа с люциферазным репортером. Клетки НеЬа котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий или ошибочный сайтмишень для т1В-21 и ЗНК-анти-т1В (8Е0 ГО N0: 3205) или 8-мерный ЗНК-ошибочный контрольный олигонуклеотид (8Е0 ГО N0: 3218) при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = к.е.т.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз Веш11а/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности т1В-21 и конструкция и положение замкнутых нуклеиновых кислот ЗНК-анти-т1В. Несовпадения обозначены черными овалами.
Фиг. 9. Оценка возможной наиболее короткой длины полностью ЗНК-модифицированной ЗНК
- 2 019939 анти-т1К, которая содействует эффективному антагонизму Ш1К-21. Клетки НеЬа были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий или ошибочный сайт-мишень для Ш1К-21 и ЗНК-анти-ш1К при разных концентрациях (8ЕО ГО N0: 3209 = 6-мерная и 8Е0 ГО N0: 3210 = 7-мерная). Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = з.е.ш.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз КепШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности Ш1К-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-т1К.
Фиг. 10. Оценка длины полностью ЗНК-замещенных ЗНК-анти-тгК, которые являются антагонистами Ш1К-21. Клетки НеЬа котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий или ошибочный сайт-мишень для Ш1К-21 и ЗНК-анти-шгК при разных концентрациях (8Е0 ГО N0: 3211 = 9-мерная, 8Е0 ГО N0: 3212 = 10-мерная, 8Е0 ГО N0: 3213 = 12мерная и 8Е0 ГО N0: 3214 = 14-мерная). Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = з.е.ш.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз КеиШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайтамишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности Ш1К-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-т1К.
Фиг. 11. Определение наиболее оптимального положения для 8-мерных ЗНК-анти-шгК в распознаваемой последовательности-мишени Ш1К. Клетки НеЬа были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающий или ошибочный сайт-мишень для шгК21 и ЗНК-анти-шгК при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = з.е.ш.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз КеиШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности Ш1К-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-т1К.
Фиг. 12. Признание взаимодействия Рбсб4-3'-ИТК и Ш1К-21 с помощью 8-мерных 8Е0 ГО N0: 3205 ЗНК-анти-т1К. Клетки НеЬа котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей часть 3'иТК из гена Рбсб4 и ЗНК-анти-т1К при разных концентрациях (8Е0 ГО N0: 3205 = 8-мерные, полностью совпадающие; 8Е0 ГО N0: 3218 = 8-мерные, ошибочные; 8Е0 ГО N0: 3204 = 15-мерные, смесь ЗНК/ДНК; 8Е0 ГО N0: 3220 = 15-мерные, с разрывом (даршег)). Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны соотношения люцифераз КеиШа/светлячка, стандартизованные по 0 нМ. Также показано схематическое представление последовательности т1К-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-т1К.
Фиг. 13. Сравнение 8-мерной ЗНК-анти-т1К (8Е0 ГО N0: 3207) с 15-мерной ЗНК-анти-ш1К (8Е0 ГО N0: 3206) в отношении антагонизма к тгК-155 в мышиных клетках КЛ^. Мышиные клетки КЛ^ котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полностью совпадающие Ш1К-155 и разные ЗНК-анти-тгК в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = з.е.ш.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз КеиШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени тгК-155 (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности Ш1К-155 и конструкция и положение ЗНК-анти-тгК.
Фиг. 14. Оценка с/ЕВРег ЗНК-анти-т1К (8Е0 ГО N0: 3207) с 15-мерной ЗНК-анти-т1К (8Е0 ГО N0: 3206) в отношении антагонизма к тгК-155 в клетках КЛ^ мыши. Клетки КЛ^ мыши были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полное совпадение к тгК-155, и через 20 ч клетки собирали и анализировали белковые экстракты из клеток КЛ^ с помощью вестернблоттинга. Обозначены разные изоформы с/ΕΒΡβ, и ниже показаны соотношения, вычисленные по с/ΕΒΡβ ЫР и β-тубулину.
Фиг. 15. Антагонизм Ш1К-106Ь с помощью полностью ЗНК-модифицированной 8-мерной (8Е0 ГО N0: 3221) ЗНК-анти-т1К или 15-мерной (8Е0 ГО N0: 3228) анти-т1К с чередующимися короткими участками (миксмер). Клетки НеЬа были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полные совпадения для Ш1К-106Ь и отличающиеся ЗНК-анти-тгК при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения четырех репликаций, в которых соотношения люцифераз КеиШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени миРНК (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности Ш1К-106Ь и конструкция и положение ЗНК-анти-тгК.
Фиг. 16. Антагонизм Ш1К-19Ь с помощью полностью ЗНК-модифицированной 8-мерной (8Е0 ГО N0: 3222) ЗНК-анти-т1К и 15-мерной (8Е0 ГО N0: 322 9) анти-т1К с чередующимися короткими участками. Клетки НеЬа были котрансфицированы люциферазными репортерными плазмидами, содержащими полные совпадения для т1К-19а и две ЗНК-анти-тгК в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения четырех репликаций, в которых соотношения люцифераз КеиШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени
- 3 019939 ш1В-19а (=контроль). Показано также схематическое представление последовательности ш1В-19а и конструкция и положение ЗНК-анти-штВ
Фиг. 17. Схематическое изображение, показывающее зрелые человеческие последовательности ιηίΡ-221 и Ш1В-222. В квадрате показана исходная последовательность (7-мерная), которая сохранена в обеих последовательностях миРНК.
Фиг. 18. Направленное воздействие на семейство микроРНК с использованием короткой, полностью ЗНК-замещенной ЗНК-анти-ш1В. Клетки РС3 котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами для ш1В-221 и ш1В-222 раздельно или вместе и с разным ЗНК-анти-ш1В при варьирующих концентрациях. При котрансфекции ЗНК-анти-шЖ. (15-мерными) 8ЕО ГО N0: 3223 (против Ш1ГО221) и 8ЕС ГО N0: 3224 (против ш1В-222) общая концентрация составляла 2 нМ (1 нМ каждой), а при трансфекции клеток 8ЕС ГО N0: 3225 (7-мерной) концентрации составляли 0, 1, 5, 10 или 25 нМ. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = 5.С.111.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз ВеиШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени миРНК (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности ш1В-221/222 и конструкция и положение ЗНК-анти-ш1В.
Фиг. 19. Оценка уровней белка р27 как функционального показателя антагонизма семейства ш1В221/222 с помощью 7-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3225 ЗНК-анти-ш1В. Клетки РС3 трансфицировали 7-мерной ЗНК-анти-ш1В 8Е0 ΙΌ N0: 3225, направленной и на ш1В-221, и на ш1В-222 при варьирующих концентрациях. Через 24 ч клетки собирали и измеряли уровни белка с помощью вестерн-блоттинга. Показаны соотношения р27/тубулин.
Фиг. 20. Оценка антагонизма ш1В-21 с помощью 8-мерной ЗНК-анти-ш1В (8Е0 ΙΌ N0: 3205) по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-ш1В (8Е0 ΙΌ N0: 3204) и 8-мерной последовательностью с 2 ошибками (8Е0 ΙΌ N0: 3218) в клетках НерС2 с использованием анализа с люциферазным репортером. Клетки НерС2 котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень ш1В-21 и ЗНК-анти-ш1В в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = к.е.ш.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз ВеиШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Показано также схематическое представление последовательности ш1В-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-ш1В.
Фиг. 21. Признание взаимодействия Рбсб4 3'ИТВ и ш1В-21 с помощью 8-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3205 ЗНК-анти-ш1В по сравнению с 15-мерной (8Е0 ΙΌ N0: 3204) и 8-мерной последовательности с двумя несоответствиями (8Е0 ΙΌ N0: 3218).
Клетки Ний-7 котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей часть 3'ИТВ из гена Рбсб4. пре-ш1В-21 (10 нМ) и ЗНК-анти-ш1В при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = к.е.ш.) трех независимых экспериментов, в которых соотношения люцифераз ВеиШа/светлячка были стандартизованы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (=контроль). Также показано схематическое представление последовательности ш1В-21 и конструкция и положение ЗНК-анти-ш1В.
Фиг. 22. Антагонизм ш1В-21 посредством 8Е0 ΙΌ N0: 3205 приводит к увеличению уровня белка Рбсб4.
Клетки НеЬа трансфицировали 5 нМ ЗНК-анти-ш1В 8Е0 ΙΌ N0: 3205 (полностью совпадающей), или скремблированной 8Е0 ΙΌ N0: 3219 ЗНК (8-мерной) или 8Е0 ΙΌ N0: 3218 (8-мерной несоответствующей). Через 24 ч клетки собирали и проводили вестерн-блоттинг с антителом Рбсб4.
Фиг. 23. Уровни АЛТ (аланинаминотрансферазы) и АСТ (аспартатаминотрансферазы) у мышей, которым вводили 8Е0 ΙΌ N0: 3205 (полностью совпадающую) или 8Е0 ΙΌ N0: 3218 (контрольную, несоответствующую). Мышей умерщвляли через 14 дней и после введения 25 мг/кг через день.
Фиг. 24. Оценка уровней белка РИ.1 как функционального показателя антагонизма шШ-155 с помощью короткой ЗНК-анти-ш1В (8Е0 ΙΌ N0: 3207).
Клетки ТНР-1 котрансфицировали пре-ш1В-155 (5 нмоль) и добавляли разные олигонуклеотиды ЗНК (5 нМ) и 100 нг/мл ЛПС. Через 24 ч клетки собирали и способом вестерн-блоттинг анализировали экстракты белка из клеток ТНР-1. Обозначены РИ.1 и тубулин.
Фиг. 25. Оценка уровней белка р27 как функционального показателя антагонизма семейства ш1В221/222 с помощью 7-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3225 ЗНК-анти-ш1В.
Клетки РС3 были трансфицированы 7-мерной ЗНК-анти-ш1В 8Е0 ΙΌ N0: 3225, направленной и на ш1В-221, и на ш1В-222 и в качестве контроля скремблированной ЗНК в количестве 5 и 25 нМ. Через 24 ч клетки собирали и измеряли уровни белка с помощью вестерн-блоттинга. Показаны соотношения р27/тубулин.
Фиг. 26. Нокдаун ш1В-221/222 посредством 7-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3225 (полностью совпадающей) ЗНК-анти-ш1В уменьшает образование колоний клеток РС3 на мягком агаре.
Клетки РС3 трансфицировали 25 нМ 7-мерной ЗНК-анти-шШ 8Е0 ΙΌ N0: 3225, направленной на ш1В-221 и на ш1В-222 или на 7-мерную скремблированную контрольную последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 3231). Через 24 ч клетки собирали и высевали на мягкий агар. Подсчет колоний проводили через 12
- 4 019939 дней. Один эксперимент проводили три раза.
Фиг. 27. Обзор семейства человеческого 1е1-7 и тестированных антагонистов (вверху). Последовательности представляют зрелую миРНК для каждого участника, в квадрате показаны нуклеотиды 2-16, и ЗНК-анти-ш1К обычно являются антагонистами для указанных положений. Колонки справа показывают число нуклеотидных отличий по сравнению с 1с1-7а. в пределах исходной (8: положение 2-8), расширенной исходной (Е8; положение 2-9) и остающейся последовательности, которые обычно являются мишенью для ЗНК-анти-т1К (ΝΕ; положение 9-16), соответственно. Нуклеотиды, выделенные белым на черном фоне, являются измененными по сравнению с 1с1-7а (ниже). Обобщены данные тестированных антагонистов против семейства 1е1-7, включающие информацию о конструкции, длине и абсолютно комплементарных мишенях. Все соединения являются полностью фосфоротиолированными.
Фиг. 28. Оценка антагонизма 1е1-7 с помощью шести разных ЗНК-анти-тЖ в клетках Ний-7, с помощью анализа с люциферазным репортером. Клетки Ний-7 котрансфицировали люциферазными репортерными плазмидами, содержащими частичный ген НМОА2 3'ϋΤΚ. (с четырьмя 1е1-7 сайтами связывания), с предшественником 1е1-7а или без (серые и черные столбцы, соответственно), и с 6 разными ЗНКанти-тЖ при возрастающих концентрациях. Клетки собирали через 24 часа и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения соотношений Кеш11а/светлячка для двукратных измерений и допустимые отклонения в каждом анализе. В каждой группе ЗНК-анти-тЖ все отношения были стандартизированы по среднему числу лунок, не содержащих предшественник 1е1-7а (черные столбцы).
Фиг. 29. Результаты люциферазного анализа клеток Ний-7, трансфицированных сенсорной плазмидой НМОА2 3'ИТК, нуклеиновыми кислотами ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ N0: 3226 (слева) и 8Е0 ГО N0: 3227 (справа) и предшественником-тЖ (пре-тЖ) для 1е1-7а (А), 1е1-7б (В), 1е1-7е (С) и 1е1-71 (Ό). Серые столбцы показывают целевую дерепрессию после включения предшественников т1, а черные столбцы контроля отображают эквивалентный уровень без добавления пре-тЖ. Каждое соотношение показано на основе четырехкратных измерений и стандартизировано по среднему числу лунок, не содержащих предшественника (черные столбцы) в каждой группе введения.
Фиг. 30. Результаты люциферазного анализа клеток НеЬа, трансфицированных сенсорной плазмидой НМСА2 3'ИТК или контрольным вектором, и ЗНК-анти-тЖ 8Е0 ГО N0: 3227 в разных концентрациях. Каждое соотношение показано на основе четырехкратных измерений и стандартизировано по пустому контрольному вектору без введения (0 нМ) (р§1-СНЕСК-2; серые столбцы).
Фиг. 31. Оценка антагонизма тЖ-21 с помощью 8-мерной (8Е0 ГО N0: 3205) в клетках НСТ116 в анализе с люциферазной репортерной плазмидой. Клетки НСТ116 котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень тЖ-21 (серые столбцы) и ЗНК-анти-тЖ и контрольные олигонуклеотиды в разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показан один типичный пример из двух, в котором соотношения КеиШа/светлячка стандартизированы по пустому вектору 0 нМ (= черные столбцы).
Фиг. 32. Сайленсинг тЖ-21 с помощью 8-мерной 8Е0 ГО N0: 3205 ЗНК-анти-тЖ уменьшает образование колоний в мягком агаре в клетках РС3. Клетки РС3 были трансфицированы 25 нМ 8-мерной ЗНК-анти-тЖ 8Е0 ГО N0: 3205, нацеленной на тЖ-21. Через 24 ч клетки собирали и высевали на мягком агаре. Подсчет колоний проводили через 12 дней. Показаны средние значения в трех отдельных экспериментах, каждый из которых проводили трижды, и указанные значения стандартизированы по контролю 0 нМ (то есть трансфекция, но без ЗНК). р=0,01898 для 8Е0 ГО N0: 3205.
Фиг. 33. Нокдаун тЖ-21 посредством 8-мерной 8Е0 ГО N0: 3205 ЗНК-анти-тЖ уменьшает образование колоний клеток НерС2 на мягком агаре. Клетки НерС2 трансфицировали 25 нМ 8-мерной ЗНКанти-тЖ 8Е0 ГО N0: 3205, направленной на тЖ-21. Через 24 ч клетки собирали и высевали на мягкий агар. Подсчет колоний проводили через 17 дней. Показаны средние значения из трех повторов одного эксперимента (черта сверху = 8ЕМ).
Фиг. 34. Закрытие раны в инвазивной клеточной линии РС3 простаты человека после введения 8Е0 ГО N0: 3205. (А) Клетки РС3 трансфицировали на 3 день ЗНК-анти-тЖ и контрольными олигонуклеотидами в количестве 25 нМ, 8Е0 ГО N0: 3205 (8-мерной, полностью совпадающей) и 8Е0 ГО N0: 3219 (8-мерной, ошибочной) и на следующий день наносили экскориацию. Через 24 ч делали снимки для контроля миграции. (В) В каждой точке времени измеряли зону с помощью программного обеспечения 1таде 1 и стандартизировали по соответствующей точке времени 0 ч.
Фиг. 35. Оценка длины полностью ЗНК-замещенных ЗНК-анти-тЖ, которые являются антагонистами для тЖ-155. Клетки КАА котрансфицировали люциферазной репортерной плазмидой, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень тЖ-155, и олигонуклеотидами ЗНК-анти-тЖ при разных концентрациях. Клетки собирали через 24 ч и измеряли активность люциферазы. Показаны средние значения (черта сверху = к.е.т) для трех независимых экспериментов, где соотношения Кеш11а/светлячка были стандартизированы по 0 нМ пустого вектора без сайта-мишени (= тоск). Также показано схематическое представление последовательности тЖ и конструкция и положения ЗНК-анти-тЖ.
Фиг. 36. Связывание меченной 5'-ЕАМ (флуорофор карбоксифлуоресцеин) ЗНК-анти-тЖ-21 (8Е0 ГО N0: 3205) с мышиным белком плазмы. (А) % несвязанного соединения ЗНК-анти-тЖ-21 в зависимости от концентрации олигонуклеотида в плазме мыши. (В) Концентрация несвязанного соединения 3НК
- 5 019939 анти-ш1К-21 8ЕО Ш N0: 3205 в зависимости от концентрации № 3205 в плазме мыши.
Фиг. 37. Количественный вестерн-блот анализ уровней белка Яак.
A. Изображение геля, показывающее белки Яак и тубулин (внутренний стандарт) в образцах легкого и почки, обработанных (анти-1е!-7; 8-мерной) по сравнению с необработанными (солевой раствор). В. Количественные анализы уровней белка Яак в легком и почке, соответственно, у мышей после введения ЗНК-анти-т1Я (черные столбцы), стандартизированные по эквивалентным контрольным образцам (введение солевого раствора - серые столбцы), с использованием тубулина в качестве контроля равномерного внесения.
B. Сайленсинг т1Я-21 посредством 8Е0 Ш N0: 3205 приводит к возрастанию уровней белка Рбеб4 ίη νίνο.
C. Мышам вводили солевой раствор или ЗНК-анти-т1Я в дозе 25 мг/кг (8Е0 Ш N0: 3205) на протяжении 14 дней через день, в общей сложности в 5 доз. Мышей умерщвляли, выделяли белок из почки и подвергали его вестерн-блот анализу с антителом Рбеб4. А. Изображение геля, показывающее белки Рбеб4 и Сарбй (внутренний стандарт) в образцах почки (М1, мышь 1; М2, мышь 2), обработанных (антит1Я-21; 8-мерной) по сравнению с необработанными (солевой раствор). В. Количественный анализ уровня белка Рбеб4 в почках мышей, обработанных ЗНК-анти-т1Я (темно-серые столбцы), стандартизированного по среднему уровню эквивалентного введения контрольного солевого раствора (светло-серые столбцы), используя Сарбй в качестве контрольного внесения.
Подробное описание изобретения
Короткие олигонуклеотиды, включающие ЗНК, известны в области реагентов ίη νίΐτο (см., например, патенты \У0 2005/098029 и \У0 2006/069584). Вместе с тем, молекулы, разработанные для диагностики или использования в качестве реагентов, значительно отличаются по конструкции от молекул, применяемых ίη νίνο или для фармацевтического использования. Например, терминальными нуклеотидами реагента олиго обычно являются не ЗНК, а ДНК, и межнуклеозидные связи обычно не являются фосфоротиоатными, представляющими собой предпочтительную связь для использования в олигонуклеотидах по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение рассматривает, по существу, новый класс олигонуклеотидов (упоминаемых здесь как олигомеры).
Следующие варианты осуществления относятся к конкретным вариантам осуществлениям олигомера по настоящему изобретению, который можно применять в фармацевтической композиции. Аспекты, относящиеся к олигомеру, могут также относиться к смежной последовательности нуклеотида, и наоборот.
Олигомер.
Олигомер по настоящему изобретению представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид, который содержит нуклеотидные аналоги, такие как ЗНК, которые образуют часть нуклеотидной последовательности или всю непрерывную нуклеотидную последовательность олигонуклеотида. Нуклеотидная последовательность олигомера состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности.
Термин олигонуклеотид (или просто олиго), который используется попеременно с термином олигомер, в контексте настоящего изобретения относится к молекуле, образованной ковалентной связью двух или нескольких нуклеотидов. Термин олигонуклеотид, используемый в контексте олигонуклеотида по изобретению (который также относится к одноцепочечному олигонуклеотиду), в одном варианте осуществления может иметь, например, от 7 до 10 нуклеотидов, например в отдельных вариантах осуществления 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов.
Термин нуклеотид относится к нуклеотидам, таким как ДНК и РНК, и к нуклеотидным аналогам. Необходимо признать, что в некоторых аспектах также можно использовать термин нуклеиновое основание для описания нуклеотида, который может быть природного или искусственного происхождения, то есть в этом отношении термины нуклеиновое основание и нуклеотид можно использовать в настоящем изобретении попеременно.
В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 7 нуклеотидных аналогов. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотида состоит из 8 нуклеотидных аналогов. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 9 нуклеотидных аналогов.
В одном варианте осуществления по меньшей мере около 50% нуклеотидов в олигомере являются нуклеотидными аналогами, например по меньшей мере около 55%, например по меньшей мере около 60 или по меньшей мере около 65%, или по меньшей мере около 70%, например по меньшей мере около 75%, например по меньшей мере около 80%, например по меньшей мере около 85%, например по меньшей мере около 90%, например по меньшей мере около 95% или, например, 100%. Также будет очевидно, что олигонуклеотид может содержать последовательность нуклеотидов, которая состоит только из нуклеотидных аналогов.
Соответственно, олигомер может содержать по меньшей мере один мономер ЗНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мономеров ЗНК. Как описано ниже, непрерывная последовательность нуклеотида может состоять только из единиц ЗНК (включая связывающие группы, такие как фосфоротиоатные связи), или может состоять из элементов ЗНК и ДНК, или из ЗНК и других нуклеотидных аналогов. В некоторых
- 6 019939 вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов содержит или один, или два ДНК-нуклеотида, и остальные нуклеотиды являются нуклеотидными аналогами, такими как указанные ЗНК.
В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 6 нуклеотидных аналогов и единственного ДНК-нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления непрерывный нуклеотид состоит из 7 аналогов нуклеотида и единственного ДНК-нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 8 нуклеотидных аналогов и единственного ДНК-нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 9 нуклеотидных аналогов и единственного ДНК-нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 7 нуклеотидных аналогов и двух ДНК-нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления непрерывная последовательность нуклеотидов состоит из 8 нуклеотидных аналогов и двух ДНК-нуклеотидов.
Олигомер может состоять из непрерывной последовательности нуклеотидов.
В особенно предпочтительном варианте осуществления все нуклеотидные аналоги представляют собой ЗНК. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления все нуклеотиды в олигомере являются ЗНК. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления все нуклеотиды в олигомере являются ЗНК, и все межнуклеозидные связывающие группы являются фосфоротиоатными.
Согласно настоящему изобретению термин азотистое основание охватывает пурины и пиримидины, такие как ДНК-основания А-аденин, С-цитозин, Т-тимин и С-гуанин, РНК-основания А, С, И-урацил и С, а также не-ДНК/РНК нуклеиновые основания, такие как 5-метилцитозин (МеС), изоцитозин, псевдоизоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинил-6-фторурацил, 5-метилтиазолурацил, 6аминопурин, 2-аминопурин, инозин, 2,6-диаминопурин, 7-пропин-7-деазааденин, 7-пропин-7деазагуанин и 2-хлор-6-аминопурин, в частности МеС.
Подразумевается, что фактический выбор не-ДНК/РНК нуклеиновых оснований будет зависеть от соответствующего (или комплементарного) нуклеотида, расположенного в цепочке микроРНК, которая считается мишенью для олигонуклеотида. Например, если соответствующим нуклеотидом является С, обычно необходимо выбирать не-ДНК/РНК основание, которое может образовывать водородные связи с С. В этом конкретном случае, где соответствующим нуклеотидом является С, типичным примером предпочтительного не-ДНК/РНК основания является МеС.
Необходимо понимать, что понятие в одном варианте осуществления не обязательно должно ограниченно относиться к одному конкретному варианту осуществления, но может относиться к признаку, который может присутствовать в некоторых вариантах осуществления или даже служить родовым признаком изобретения. Аналогично, использование понятия некоторые варианты осуществления может иметь место для описания признака одного конкретного варианта осуществления или группы вариантов осуществления или даже быть родовым признаком изобретения.
Понятия соответствующий чему-либо и соответствовать относятся к сравнению нуклеотидной последовательности олигомера или непрерывной нуклеотидной последовательности (первая последовательность) с эквивалентной непрерывной нуклеотидной последовательностью другой последовательности, выбираемой из ί) суб-последовательности обратно комплементарной нуклеиновой кислоты микроРНК-мишени (например, микроРНК-мишени, выбираемая из последовательностей 8ЕО Ш N0: 40-976, и/или ίί) последовательности нуклеотидов, рассматриваемой в настоящем изобретении, такой как группа, состоящая из 8ЕО ГО N0: 977-1913, или 8ЕО ГО N0: 1914-2850, или 8ЕО ГО N0: 2851-3787. Нуклеотидные аналоги сравнивают непосредственно с их эквивалентными или соответствующими нуклеотидами. Первая последовательность, которая соответствует другой последовательности из пп. ί) или и), обычно идентична указанной последовательности по длине первой последовательности (например, непрерывной нуклеотидной последовательности).
Длина нуклеотидной молекулы, как указано в изобретении, соответствует числу мономерных единиц, то есть нуклеотидов, безотносительно того, являются ли эти мономерные единицы нуклеотидами или нуклеотидными аналогами. Что касается нуклеотидов или нуклеиновых оснований, термины мономер и единица используются в настоящем изобретении попеременно.
Подразумевается, что понятие около, используемое в настоящем раскрытии в контексте конкретных значений или диапазонов значений, включает конкретное значение или упоминаемый диапазон.
Используемый в настоящем изобретении термин гибридизация означает образование водородной связи, которое может происходить по Уотсону-Крику, по Хугстену (Ноо§51ееп). путем обратного водородного связывания Хугстена и т.д., между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями. Четыре нуклеиновых основания, обычно обнаруживаемые в ДНК, обозначаются С, А, Т и С, которые представляют собой пары С-С и А-Т. В РНК Т замещен на урацил (И), который становится парой для А. Химические группы в нуклеиновых основаниях, которые участвуют в стандартном образовании дуплексов, составляют плоскость Уотсона-Крика. Несколько лет спустя Хугстен показал, что пуриновые нуклеиновые основания (С и А) дополнительно к плоскости Уотсона-Крика имеют плоскость Хугстена, которую можно распознать снаружи дуплекса и использовать для связи пиримидиновых олигонуклеотидов водородной связью, образуя таким образом тройную спиральную структуру.
- 7 019939
В контексте настоящего изобретения термин комплементарность относится к способности двух нуклеотидных последовательностей точно выстраивать пары друг с другом. Например, если нуклеотид в определенном положении в олигонуклеотиде способен к образованию водородной связи с нуклеотидом в соответствующем положении в молекуле ДНК или РНК, то считается, что олигонуклеотид и ДНК или РНК являются комплементарными друг к другу в этом положении. Цепочки ДНК или РНК считаются комплементарными друг к другу, если достаточное число нуклеотидов в олигонуклеотиде может образовывать водородные связи с соответствующими нуклеотидами в ДНК-мишени или РНК-мишени, что позволяет создать устойчивый комплекс. Для устойчивости ίη νίΐτο или ίη νίνο олигонуклеотидная последовательность не должна быть на 100% комплементарной к его микроРНК-мишени. Таким образом, термины комплементарность и специфично гибридизуемый подразумевают, что олигонуклеотид связывается достаточно мощно и специфично с молекулой-мишенью, чтобы достичь желательного влияния на нормальную функцию мишени, не воздействуя при этом на функцию нецелевых РНК. Вместе с тем, в одном предпочтительном варианте осуществления термин комплементарность будет означать 100% комплементарность или полную комплементарность.
В предпочтительном примере олигонуклеотид по изобретению на 100% комплементарен последовательности миРНК, например человеческой последовательности микроРНК, или одной из последовательностей микроРНК, упоминаемых в изобретении.
В предпочтительном примере олигонуклеотид по изобретению содержит непрерывную последовательность, которая на 100% комплементарна исходной области человеческой последовательности микроРНК.
Предпочтительно термин микроРНК или миРНК в контексте настоящего изобретения означает олигонуклеотид РНК, имеющий длину от 18 до 25 нуклеотидов. В функциональном плане миРНК обычно представляют собой регуляторные эндогенные молекулы РНК.
Термины целевая микроРНК или миРНК-мишень относятся к микроРНК, играющей биологическую роль в заболеваниях человека, например, в качестве ап-регуляторной, онкогенной миРНК или миРНК опухолевой супрессии при раке, что, таким образом, является целью терапевтического вмешательства при рассматриваемом заболевании.
Термины ген-мишень или мРНК-мишень относятся к регуляторным мРНК-мишеням для микроРНК, в которых микроРНК на основе почти абсолютной или абсолютной комплементарности между миРНК и ее сайтом-мишенью пост-транскрипционно регулирует указанный ген-мишень или мРНКмишень, что приводит к расщеплению мРНК-мишени; или на основе ограниченной комплементарности, которая часто относится к комплементарности между так называемой исходной последовательностью (нуклеотиды 2-7 из миРНК) и сайтом-мишенью, что приводит к трансляционному ингибированию мРНК-мишени.
В контексте настоящего изобретения олигонуклеотид является одноцепочечным, это относится к ситуации, когда отсутствует комплементарный олигонуклеотид для указанного олигонуклеотида, то есть не образуется двухцепочечный олигонуклеотидный комплекс, такой как 81РНК. В одном варианте осуществления композиция по изобретению не содержит другой олигонуклеотид, у которого существует область комплементарности с олигомером из 5 или более, например из 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных нуклеотидов, например, из восьми или больше нуклеотидов.
Длина.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что такие короткие анти-шРК. обеспечивают улучшенное специфичное ингибирование микроРНК ίη νίνο, сохраняя высокую специфичность для микроРНК-мишени. Было выявлено дополнительное преимущество, а именно способность ингибировать несколько микроРНК одновременно благодаря консервации гомологичных коротких последовательностей между видами микроРНК, таких как исходные области, описанные в изобретении. Согласно настоящему изобретению было выявлено особое преимущество коротких олигонуклеотидов в 7, 8, 9, 10 нуклеотидов, например в 7, 8 или 9 нуклеотидов.
Последовательности.
Непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной (например, комплементарной на 100%, то есть абсолютно комплементарной) соответствующей области последовательности микроРНК (миРНК) млекопитающих, человека или вируса, предпочтительно человеческой или вирусной последовательности миРНК.
Подходящей последовательностью микроРНК может быть зрелая микроРНК. В некоторых вариантах осуществления микроРНК может быть микроРНК-предшественником.
Человеческую последовательность микроРНК можно выбирать из 8ЕЦ Ш N0: 1-558 согласно раскрытию в патенте \¥0 2008/046911, который полностью и конкретно включен посредством ссылки в настоящее изобретение. Как описано в патенте \¥0 2008/046911, эти микроРНК связаны с раком.
В некоторых вариантах осуществления вирусную последовательность микроРНК можно выбирать из группы, состоящей из вируса простого герпеса 1, вируса герпеса, ассоциированного с саркомой Капоши, вируса Эпштейна-Барра и цитомегаловируса человека.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность является компле
- 8 019939 ментарной (например, 100%-комплементарной) соответствующей области миРНК последовательности, выбираемой из группы миРНК, перечисленных в табл. 1. Табл. 1 показывает нацеленные на человеческие и вирусные микроРНК 7-мерные, 8-мерные и 9-мерные олигомеры, которые приведены в базе данных шЖВакс (выпуск 12.0 - 1шр://т1сгогпа.5апдсг.ас.ик/5сс.|испсс5/).
В некоторых вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут состоять из непрерывной последовательности нуклеотидов или содержать такую последовательность, которая комплементарна соответствующей последовательности микроРНК, выбираемой из группы, состоящей из тЖ.-1, тЖ-10Ь, тЖ.-17-3р, тЖ.-18, тЖ-19а, тЖ-19Ь, тЖ.-20, тЖ.-21, тЖ.-34а, тЖ.-93, тЖ.-106а, тЖ.-106Ь, тЖ-122, тЖ.-133, тЖ.-134, тЖ.-138, тЖ.-155, тЖ.-192, тЖ.-194, тЖ.-221, тЖ.-222, тЖ.-375.
Поэтому в одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) выбирают из группы, состоящей из тЖ-1, тЖ.-10Ь, тЖ.-17-3р, 1111.-18, тЖ-19а, тЖ.-19Ь, тЖ.-20, 1111.-21, тЖ-34а, тЖ-93, тЖ.-106а, Ш1В-106Ь, тЖ-122, тЖ-133, т1В-134, Ш1К-138, Ш1К-155, Ш1К-192, тЖ-194, тЖ-221, тЖ-222 и т1В-375.
В одном варианте осуществления миРНК-мишень входит в состав кластера тЖ 17-92, например тЖ 17, тЖ 106а, тЖ 106Ь, тЖ 18, тЖ. 19а, тЖ 19Ь/1, тЖ. 19Ь/2, тЖ20/93, тЖ.92/1, тЖ.92/2 и тЖ25.
В некоторых вариантах осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной соответствующей области последовательности микроРНК (миРНК), выбираемой из группы, состоящей из тЖ.-21, тЖ.-155, тЖ.-221, Ш1Т-222 и Ш1Т-122.
В некоторых вариантах осуществления указанные миРНК выбирают из группы, состоящей из тЖ,1, тЖ.-10, тЖ.-29, тЖ.-125Ь, тЖ.-126, тЖ-133, тЖ.-141, тЖ.-143, тЖ.-200Ь, тЖ.-206, тЖ.-208, тЖ,302, ШЖ.-372, ШЖ.-373, ШЖ.-375 и тЖ.-520с/с.
В некоторых вариантах осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области последовательности микроРНК (миРНК), присутствующей в кластере тЖ. 17-92, например, микроРНК, выбираемой из группы, состоящей из тЖ-17-5р, тЖ-20а/Ь, тЖ-93, тЖ.-106а/Ь, тЖ-18а/Ь, тЖ.-19а/Ь, тЖ-25, тЖ.-92а, тЖ.-363.
В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой тЖ-21, например, Ьва-тЖ.-21. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой тЖ.-122, например 115а-тЖ-122. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНКмишень) представляет собой тЖ-19Ь, например 115а-тЖ-19Ь. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой тЖ.-155, например 118а-тЖ-155. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой тЖ.-375, например 115а-тЖ-375. В одном варианте осуществления миРНК (то есть миРНК-мишень) представляет собой тЖ.-375, например 118атЖ.-106Ь.
Соответственно, непрерывная нуклеотидная последовательность может быть комплементарна соответствующей области микроРНК, такой как Ьва-тЖ, которую выбирают из группы, состоящей из 19Ь, 21, 122, 155 и 375.
Исходная область и исходные олигомеры (сидмеры).
Авторы настоящего изобретения выявили, что тщательно сконструированные короткие одноцепочечные олигонуклеотиды содержат или состоят из нуклеотидных аналогов, таких как высокоаффинные нуклеотидные аналоги, например единицы замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК), проявляющие значительный сайленсинг микроРНК, который приводит к снижению уровня микроРНК. Было выявлено большое значение прочного связывания указанных олигонуклеотидов с так называемой исходной последовательностью микроРНК мишеней, обычно от 2 до 8 нуклеотидов или от 2 до 7, считая от 5'-конца. Нуклеотид 1 из микроРНК-мишеней представляет собой непарное основание и, наиболее вероятно, спрятан в связывающем кармане белка Адо 2. Без связи с конкретной теорией авторы настоящего изобретения полагают, что при выборе исходной области последовательностей, в частности с олигонуклеотидами, которые содержат ЗНК, предпочтительно единицы ЗНК в области, которая комплементарна исходной области, дуплекс миРНК и олигонуклеотида имеет особую эффективность в нацеливании на миРНК, избегаются эффекты мишеней и, возможно, обеспечивается дополнительный признак, которая предотвращает действие миРНК, направленное на индуцированный РНК комплекс сайленсинга (К18С).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сайленсинг микроРНК еще больше возрастает, если ЗНК-модифицированные одноцепочечные олигонуклеотиды не содержат на 3'-конце нуклеотид, соответствующий указанному непарному нуклеотиду 1. Было дополнительно обнаружено, что по меньшей мере две единицы ЗНК на 3'-конце олигонуклеотидов по изобретению делают указанные олигонуклеотиды высоко устойчивыми к нуклеазам.
В одном варианте осуществления первые или вторые 3'-нуклеотида в олигомере соответствуют вторым 5'-нуклеотидам в последовательности микроРНК и могут быть нуклеотидным аналогом, таким как ЗНК.
В одном варианте осуществления нуклеотидные единицы 1-6 (включительно) олигомера, считая от 3'-конца области олигомера, являются комплементарными последовательности исходной области микроРНК, и все они могут представлять собой нуклеотидные аналоги, такие как ЗНК.
В одном варианте осуществления нуклеотидные единицы 1-7 (включительно) олигомера, считая от
- 9 019939
3'-конца области олигомера, являются комплементарными последовательности исходной области микроРНК, и все могут быть нуклеотидными аналогами, такими как ЗНК.
В одном варианте осуществления нуклеотидные единицы 2-7 (включительно) олигомера, считая от 3'-конца области олигомера, являются комплементарными последовательности исходной области микроРНК, и все могут быть нуклеотидными аналогами, такими как ЗНК.
В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере одну единицу нуклеотидного аналога, например по меньшей мере одну единицу ЗНК, в положении, которое находится в пределах области, комплементарной исходной области миРНК. В одном варианте осуществления олигомер может содержать от около 1 до 6 или от 1 до 7 единиц нуклеотидного аналога, например в диапазоне от 1 до 6 и от 1 до 7 единиц ЗНК, в положении, которое находится в пределах области, комплементарной исходной области миРНК.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность состоит из последовательности или содержит последовательность, комплементарную (например, на 100% комплементарную) исходной последовательности указанной микроРНК.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность состоит из последовательности или содержит последовательность, выбираемую из любой из сидмерных последовательностей, перечисленных в табл. 1.
В одном варианте осуществления 3'-нуклеотиды сидмера образуют 3' большинство нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности, при этом непрерывная нуклеотидная последовательность может необязательно содержать один или два дополнительных 5'-нуклеотидов к сидмерной последовательности.
В одном варианте осуществления олигомер не содержит нуклеотид, который соответствует первому нуклеотиду, присутствующему в последовательности микроРНК, считая от 5'-конца.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид согласно изобретению не содержит нуклеотид на 3'-конце, который соответствует первым нуклеотидам 5'-конца в микроРНК-мишени.
Нуклеотидные аналоги.
Согласно настоящему изобретению было обнаружено особое преимущество коротких олигонуклеотидов из 7, 8, 9, 10 нуклеотидов, например из 7, 8 или 9 нуклеотидов, в которых по меньшей мере 50%, например 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или, например, 100% нуклеотидных единиц олигомера являются нуклеотидными аналогами (предпочтительно высокоаффинными), такими как нуклеотидная единица замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК).
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 7, 8 или 9 нуклеотидов и содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая комплементарна исходной области человеческой или вирусной микроРНК и в которой по меньшей мере 75%, например по меньшей мере 80, например по меньшей мере 85, например по меньшей мере 90, например по меньшей мере 95, например 100% нуклеотидов представляют собой нуклеотидные единицы замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК).
В таких олигомерах в некоторых вариантах осуществления связывающие группы представляют собой не фосфодиэфирные связи, а являются, например, фосфоротиоатными связями.
В одном варианте осуществления все нуклеотидные единицы непрерывной нуклеотидной последовательности являются нуклеотидными единицами ЗНК.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 7, 8, 9 или 10, предпочтительно из непрерывных нуклеотидных единиц ЗНК.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 7, 8 или 9 нуклеотидов и содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая комплементарна исходной области человеческой или вирусной микроРНК и в которой по меньшей мере 80% нуклеотидов является ЗНК, и в которой по меньшей мере 80%, например 85, например 90, например 95, например 100% межнуклеотидных связей являются фосфоротиоатными связями. Подразумевается, что непрерывная нуклеотидная последовательность олигомера (сидмера) может выходить за пределы исходной области.
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 7 нуклеотидов, все из которых являются ЗНК.
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 8 нуклеотидов, из которых до 1 нуклеотида может не быть ЗНК. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет длину 9 нуклеотидов, из которых до 1 или 2 нуклеотида могут отличаться от ЗНК. В некоторых вариантах осуществления длина олигонуклеотида изобретения составляет 10 нуклеотидов, из которых 1, 2 или 3 нуклеотида могут отличаться от ЗНК. Нуклеотиды, отличные от ЗНК, могут представлять собой, например, ДНК или 2'-замещенные нуклеотидные аналоги.
Высокоаффинные нуклеотидные аналоги являются нуклеотидными аналогами, которые образуют олигонуклеотиды, обладающие более высокой температурной дуплексной стабильностью с комплементарным РНК-нуклеотидом, в отличие от связывающей аффинности эквивалентного ДНК-нуклеотида. Это можно определить путем измерения Тт.
- 10 019939
В некоторых вариантах осуществления единицы нуклеотидных аналогов, присутствующие в непрерывной нуклеотидной последовательности, необязательно независимо выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы ЗНК, единицы протеин-нуклеиновой кислоты (ПНК), единицы гексит-нуклеиновой кислоты (ГНК), единицы ΙΝΑ (ИНК) и единицы 2'-МОЕ-РНК.
В некоторых вариантах осуществления единицы нуклеотидных аналогов, присутствующие в непрерывной нуклеотидной последовательности, необязательно независимо выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы ЗНК и единицы 2'-МОЕ-РНК.
Термин 2'-фтор-ДНК относится к аналогу ДНК с замещением на фтор в 2' положении (2Т). Предпочтительной формой 2'-фтор-ДНК является 2'-фтор-нуклеотид.
В некоторых вариантах осуществления олигомер содержит по меньшей мере 4 единицы нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 5 единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 6 единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 7 единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 8 единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 9 единиц нуклеотидных аналогов, например 10 единиц нуклеотидных аналогов.
В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере 3 единицы ЗНК, например по меньшей мере 4 единицы ЗНК, например по меньшей мере 5 единиц ЗНК, например по меньшей мере 6 единиц ЗНК, например, по меньшей мере 7 единиц ЗНК, например, по меньшей мере 8 единиц ЗНК, например, по меньшей мере 9 единиц ЗНК, например 10 единиц ЗНК.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов, например, единица ЗНК, является или цитозином, или гуанином, как, например, между 1-10 из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, находится или цитозин, или гуанин, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, представляют собой или цитозин, или гуанин.
В одном варианте осуществления по меньшей мере два из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, представляют собой или цитозин, или гуанин. В одном варианте осуществления по меньшей мере три из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере четыре из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере пять из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере шесть из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере семь из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином. В одном варианте осуществления по меньшей мере восемь из нуклеотидных аналогов, таких как единицы ЗНК, являются или цитозином, или гуанином.
В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидные аналоги обладают более высокой температурной дуплексной стабильностью для комплементарного РНК-нуклеотида в отличие от связывающей аффинности эквивалентного ДНК-нуклеотида к указанному комплементарному РНК-нуклеотиду.
В одном варианте осуществления нуклеотидные аналоги повышают стабильность сыворотки к одноцепочечному олигонуклеотиду.
В списке последовательностей и в табл. 1 указаны конкретные 8ΕΟ ΙΌ, относящиеся к олигомерам мономеров ЗНК с фосфоротиоатным (Р8) скелетом, вместе с тем подразумевается, что настоящее изобретение также охватывает использование других нуклеотидных аналогов и/или связей, или в качестве альтернативы, или в комбинации с ЗНК. Также последовательность нуклеотидов (оснований), указанная в списках последовательностей, может быть последовательностью ЗНК, такой как 3НК/Р8, ЗНК или может представлять собой олигомеры, имеющие альтернативную химию скелета, например, сахарные химические связи, сохраняя при этом ту же основную последовательность (А, Т, С или С).
Поскольку предполагается, что в олигомерах по изобретению могут быть полезны другие нуклеотидные аналоги, такие как 2'-МОЕ-РНК или 2'-фтор-нуклеотид, предпочтительной является высокая пропорция олигомеров, например, по меньшей мере 50% нуклеотидов ЗНК.
Нуклеотидный аналог может быть аналогом ДНК, таким как аналог ДНК, в котором 2'-Н группа замещена заместителем, отличным от -ОН(РНК), например, путем замещения -О-СН3, -О-СН2-СН2-О-СН3, -Θ-ΟΗ2-ΟΗ2-ΟΗ2-ΝΗ2, -О-СН2-СН2-СН2-ОН или -Г.
Нуклеотидный аналог может быть аналогами РНК, такими как аналог РНК, модифицированный в его группе 2'-ОН, например, путем замещения группой, отличной от -Н(ДНК), например, -О-СН3, -ОСН2-СН2-О-СН3, -Θ-ΟΗ2-ΟΗ2-ΟΗ2-ΝΗ2, -Θ-ΟΗ2-ΟΗ2-ΟΗ2-ΘΗ или -Г. В одном варианте осуществления аналогом нуклеотида является ΕΝΑ.
Замкнутые нуклеиновые кислоты.
Используемые в контексте настоящего изобретения термины единица ЗНК, мономер ЗНК, остаток ЗНК, единица замкнутой нуклеиновой кислоты, мономер замкнутой нуклеиновой кислоты или остаток замкнутой нуклеиновой кислоты относятся к бициклическому нуклеозидному аналогу. Единицы ЗНК описаны, среди прочего, в следующих патентах: АО 99/14226, АО 00/56746, АО 00/56748, АО
- 11 019939
01/25248, \νϋ 02/28875, \νϋ 03/006475 и \νϋ 03/095467. Определение единицы ЗНК можно также давать по ее химической формуле. Таким образом, единица ЗНК, используемая в настоящем изобретении, имеет химическую структуру, показанную на схеме 1 ниже
в которой X выбирают из группы, состоящей из О, 8 и ΝΚΗ, где К. представляет собой Н или С1_4-алкил; Υ является (-СН2)Г, где г составляет целое число от 1 до 4 и В является азотистым основанием.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения г равен 1 или 2, в частности 1, то есть предпочтительная единица ЗНК имеет химическую структуру, показанную в схеме 2 ниже
в которой определение X и В приведено выше.
В интересном варианте осуществления единицы ЗНК, включенные в олигонуклеотиды по изобретению, независимо выбирают из группы, состоящей из единиц тио-ЗНК, единиц амино-ЗНК и единиц оксиЗНК.
Таким образом, единица тио-ЗНК может иметь химическую структуру согласно схеме 3 ниже
в которой определение В приведено выше.
Предпочтительно единица тио-ЗНК находится в своей β-Ό-форме, то есть имеет структуру, показанную в схеме ЗА выше, аналогично единица амино-ЗНК может иметь химическую структуру согласно схеме 4 ниже
в которой определение В и К1 приведено выше.
Предпочтительно единица амино-ЗНК находится в своей β-Ό-форме, то есть имеет структуру, показанную в схеме 4А выше.
Единица окси-ЗНК может иметь химическую структуру, показанную на схеме 5 ниже
в которой определение В приведено выше.
Предпочтительно единица окси-ЗНК находится в своей β-Ό-форме, то есть имеет структуру, пока- 12 019939 занную в схеме 5А выше. Как обозначено выше, В представляет собой азотистое основание, которое может быть природного или синтетического происхождения. Конкретные примеры азотистых оснований включают аденин (А), цитозин (С), 5-метилцитозин (МеС), изоцитозин, псевдоизоцитозин, гуанин (С), тимин (Т), урацил (И), 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинил-6,7-метилтиазолурацил, 6аминопурин, 2-аминопурин, инозин, 2,6-диаминопурин, 7-пропин-7-деазааденин, 7-пропин-7деазагуанин и 2-хлор-6-аминопурин.
Термин единица тио-ЗНК относится к единице ЗНК, в которой X на схеме 1 является 8. Единица тио-ЗНК может находиться и в β-Ό-форме, и в α-Б-форме. В общем, предпочтительной является β-Όформа единицы тио-ЗНК. Единицы тио-ЗНК в β-Ό-форме и α-Б-форме показаны на схеме 3 как соединения 3А и 3В соответственно.
Термин единица амино-ЗНК относится к единице ЗНК, в которой X на схеме 1 представляет собой ΝΗ или ΝΚΗ, где Ян является водородом или С1-4-алкилом. Единица амино-ЗНК может быть и в β-Όформе, и в α-Б-форме. В общем, предпочтительной является β-Ό-форма единицы амино-ЗНК. Единицы амино-ЗНК в β-Ό-форме и α-Б-форме показаны на схеме 4 как соединения 4А и 4В соответственно.
Термин единица окси-ЗНК относится к единице ЗНК, в которой X на схеме 1 представляет собой О. Единица окси-ЗНК может быть и в β-Ό-форме, и в α-Б-форме. В общем, предпочтительной является β-В-форма единицы окси-ЗНК. Единицы окси-ЗНК в β-Ό-форме и α-Б-форме показаны на схеме 5 как соединения 5А и 5В соответственно.
В настоящем описании термином С1-6-алкил обозначена линейная или разветвленная насыщенная углеводородная цепь, при этом самые длинные цепи имеют от одного до шести атомов углерода, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, неопентил и гексил. Разветвленной углеводородной цепью считается С1-6-алкил, замещенный по любому атому углерода углеводородной цепью.
В настоящем описании термин С1-4-алкил предназначен для обозначения линейной или разветвленной насыщенной углеводородной цепи, при этом самые длинные цепи имеют от одного до четырех атомов углерода, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил и третбутил. Разветвленной углеводородной цепью считают С1-4-алкил, замещенный по любому атому углерода углеводородной цепью.
Используемый в настоящем изобретении термин С1-6-алкокси означает С1-6-алкил-окси, например метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентокси, изопентокси, неопентокси и гексокси.
В настоящем описании термин С2-6-алкенил означает линейную или разветвленную углеводородную группу, имеющую от двух до шести атомов углерода и содержащую одну или более двойных связей. Иллюстративные примеры С2-6-алкенильных групп включают аллил, гомо-аллил, винил, кротил, бутенил, бутадиенил, пентенил, пентадиенил, гексенил и гексадиенил. Ненасыщенным (двойной связью) может быть любое положение в углеродной цепи.
В настоящем описании термин С2-6-алкинил означает линейные или разветвленные углеводородные группы, содержащие от двух до шести атомов углерода и содержащие одну или более тройных связей. Иллюстративные примеры С2-6-алкинильных групп включают ацетилен, пропинил, бутинил, пентинил и гексинил. Ненасыщенным (тройной связью) может быть любое положение в углеродной цепи. Большее чем одна связь может быть ненасыщенной таким образом, что С2-6-алкинил может представлять собой ди-ин, или енеди-ин, что известно специалисту в данной области техники.
В отношении замещения единицы ДНК на соответствующую ей единицу ЗНК в контексте настоящего изобретения термин соответствующая единица ЗНК означает, что единицу ДНК заменили на единицу ЗНК, содержащую то же самое азотистое основание, что и замененная единица ДНК, например на единицу ЗНК, содержащей азотистое основание А, соответствующую единице ДНК, которая также содержит азотистое основание А. Исключение состоит в том, что если единица ДНК содержит основание С, то соответствующая единица ЗНК может содержать основание С или основание МеС, предпочтительно Ме С.
Термин единица не-ЗНК, используемый в настоящем изобретении, относится к нуклеозиду, отличающемуся от единицы ЗНК, то есть термин единица не-ЗНК содержит единицу ДНК, а также единицу РНК. Предпочтительная единица не-ЗНК представляет собой единицу ДНК.
Термины единица, остаток и мономер используются в изобретении взаимозаменяемо.
Термин по меньшей мере один охватывает целое число, которое больше или равно 1, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д.
Единственное число, используемое в отношении нуклеотида, агента, единицы ЗНК и т.д., предназначено означать один или более. В частности, выражение компонент (например, нуклеотид, агент, единица ЗНК или подобное), выбираемый из группы, состоящей из ... означает, что один или более указанных компонентов можно выбирать. Таким образом, такие выражения, как компонент, выбираемый из группы, состоящей из А, В и С, указывают, что все комбинации А, В и С, то есть А, В, С, А+В, А+С, В+С и А+В+С, включены в число рассматриваемых компонентов.
- 13 019939
Межнуклеозидные связи.
Термин группа межнуклеозидной связи означает группу, способную к ковалентному связыванию двух нуклеотидов, например образованию связи между единицами ДНК, между единицами ДНК и нуклеотидными аналогами, между двумя единицами не-ЗНК, между единицей не-ЗНК и единицей ЗНК, и между двумя единицами ЗНК и т.д. Примеры включают фосфатные, фосфодиэфирные группы и фосфо ротиоатные группы.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из связей или, например, все межнуклеозидные связи в олигомере являются фосфодиэфирными. Однако в условиях использования ίη νίνο могут быть предпочтительными фосфоротиоатные связи.
Обычными группами межнуклеозидных связей в олигонуклеотидах являются фосфатные группы, но их можно заменять на нефосфатные группы межнуклеозидной связи. В дополнительном представляющем интерес варианте осуществления изобретения модифицируют структуру группы межнуклеозидной связи в олигонуклеотиде по изобретению, то есть модифицированный олигонуклеотид содержит группу межнуклеозидной связи, которая отличается от фосфатной группы. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну группу межнуклеозидной связи, которая отличается от фосфатной группы.
Конкретные примеры групп межнуклеозидной связи, которые отличаются от фосфатной группы (-О-Р(О)2-О-), включают -ϋ-Ρ(ϋ,8)-ϋ-, -ϋ-Ρ(8)2-ϋ-, -8-Ρ(ϋ)2-ϋ-, -8-Ρ(ϋ,8)-ϋ-, -8-Ρ(8)2-ϋ-, -ϋ-Ρ(ϋ)2-8-, -ϋ-Ρ(ϋ,8)-8-, -8-Ρ(ϋ)2-8-, -ϋ-Ρϋ(ΚΗ)-ϋ-, Ο-ΡΟ(Ο('1Ι;)-Ο-. -Ο-ΡΟ(ΝΚη)-Ο-, -0-ΡΟ(ΟΟΗ2ΟΗ28-Β)-0-, -ϋΡϋ(ΒΗ3)-ϋ-, -ϋ-Ρϋ(ΝΗΒΗ)-ϋ-, -Ο-Ρ(Ο)2-ΝΚη-, -ΝΚη-Ρ(Ο)2-Ο-, А'Н'-СО-О-. -ΝΚΗ-Οϋ-ΝΚΗ-, -О-СО-О-, -ϋ-Οϋ-ΝΒΗ-, -№н-СО-СН2-, -О-СН2-СО-ИВН-, -О-СН2-СН2-№н-, -СО-№н-СН2-, -СН2-ИВН-СО-, -ОСН2-СН2-8-, -8-СН2-СН2-О-, -8-СН2-СН2-8-, -СН2-8О2-СН2-, -СН2-СО-1МКН-, -О-СН2-СН2-1МКН-СО-, -СН2Ν0Η3-ϋ-0Η2-, где ЯН является водородом или С1-4-алкилом.
При модификации группы межнуклеозидной связи предпочтительной группой межнуклеозидной связи является фосфоротиоатная группа (-О-Р(О,8)-О-). В предпочтительном варианте осуществления все группы межнуклеозидной связи олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению являются фосфоротиоатными.
Межнуклеозидную связь можно выбирать из группы, состоящей из -О-Р(О)2-О-, -ϋ-Ρ(ϋ,8)-ϋ-, -ОΡ(δ)2-ϋ-, -δ-Ρ(ϋ)2-ϋ-, -8-Ρ(Ο,8)-Ο-, -8-Ρ(8)2-ϋ-, -ϋ-Ρ(ϋ)2-8-, -ϋ-Ρ(ϋ,8)-8-, -8-Ρ(ϋ)2-8-, -Ο-ΡΟ(Βη)-Ο-, ОГО(ОСНз)-О-, -Ο-ΡΟ(ΝΚη)-Ο-, -Ο-ΡΟ(Ο€Η2€Η28-Κ)-Ο-, -О-РО(ВН3)-О-, -Ο-ΡΟ(ΝΗΒη)-Ο-, -Ο-Ρ(Ο)2-ΝΚη-, -ΝΚη-Ρ(Ο)2-Ο-, -Ν^-ΤΌ-Ο-, -ΝΒΗ-ίΌ-ΝΚΗ-, и/или межнуклеозидную связь можно выбирать из группы, состоящей из -О-СО-О-, -О-СО-ХЯ-. -ХЯ'-СО-С!Р-. -О-С1Р-СО-ХЯ'-. -О-СН.-СН.-ХЯ-. -СО-Х'ЯСН2-, -СΗ;-ХЯ-Сϋ-. -О-СН2-СН2-8-, -8-СН2-СН2-О-, -8-СН2-СН2-8-, -СН2-8О2-СН2-, -€Η2-€Ο-ΝΒη-, -ОСΗ2-СΗ2-NЯΗ-Сϋ-, -СН2-ИСН3-О-СН2-, в которой ЯН выбирают из водорода и С1-4-алкила. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления могут быть предпочтительными межнуклеозидные связи, содержащие серу (8), как указано выше. Межнуклеозидные связи можно независимо выбирать, или все они могут быть одинаковыми, такими как фосфоротиоатные связи.
В одном варианте осуществления по меньшей мере 75%, например 80, или 85, или 90, или 95%, или все межнуклеозидные связи, расположенные между нуклеотидными единицами непрерывной последовательности нуклеотидов, являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.
Олигонуклеотиды микро-тй, мишенью для которых является более одной микроРНК.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей последовательности по меньшей мере из двух последовательностей миРНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательностей миРНК. Использование единственного универсального основания может способствовать тому, что единственный олигомер по изобретению будет нацелен на две независимых микроРНК, из которых или одна, или обе имеют единственное несовпадение в том участке, который соответствует олигомеру в месте расположения универсального нуклеотида.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна последовательности по меньшей мере из двух областей исходной последовательности миРНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательностям области исходной миРНК.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области и т|Я-221, и т|Я-222.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области больше чем одного кластера т1Я-17-92, например двум или больше, или всем т1Я-17-5р, т|Я-20а/Ь, т1В-93, т1Я-106а/Ь; или двум или больше, или всем т1В-25, т|Я-92а и т1В-363.
В одном варианте осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна 5'ССТЛСЛТ3'.
Конструкция олигомера.
В одном варианте осуществления первый нуклеотид олигомера согласно изобретению, считая от 3'конца, является нуклеотидным аналогом, таким как единица ЗНК. В одном варианте осуществления, который может быть аналогичным или другим, последний нуклеотид олигомера согласно изобретению,
- 14 019939 считая от З'-конца, является нуклеотидным аналогом, таким как единица ЗНК.
В одном варианте осуществления второй нуклеотид олигомера по изобретению, считая от З'-конца, является нуклеотидным аналогом, например единицей ЗНК.
В одном варианте осуществления девятый и/или десятый нуклеотид олигомера по изобретению, считая от З'-конца, является нуклеотидным аналогом, например единицей ЗНК.
В одном варианте осуществления девятый нуклеотид олигомера по изобретению, считая от 3'конца, является нуклеотидным аналогом, например единицей ЗНК.
В одном варианте осуществления десятый нуклеотид олигомера согласно изобретению, считая от З'-конца, является нуклеотидным аналогом, например, единицей ЗНК.
В одном варианте осуществления и девятый, и десятый нуклеотиды олигомера по изобретению, считая от З'-конца, являются нуклеотидными аналогоми, например единицей ЗНК.
В одном варианте осуществления олигомер по изобретению не содержит область из более З последовательных нуклеотидных единиц ДНК. В одном варианте осуществления олигомер по изобретению не содержит область из более 2 последовательных нуклеотидных единиц ДНК.
В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере область, состоящую по меньшей мере из двух последовательных единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере из двух последовательных единиц ЗНК. В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере область, состоящую по меньшей мере из трех последовательных единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере из трех последовательных единиц ЗНК.
Другие образцы нуклеотидных аналогов, такие как ЗНК в олигомере.
Предполагается, что олигомеры, содержащие по меньшей мере 6 ЗНК, например по меньшей мере 7 нуклеотидных единиц, могут быть предпочтительными, поэтому открытие эффективности настолько коротких олигомеров в нацеливании на микроРНК ίη νίνο можно использовать для подготовки более коротких олигомеров согласно изобретению, которые содержат другие нуклеотидные аналоги, такие как высокоаффинные нуклеотидные аналоги. Фактически, комбинация ЗНК с другими высокоаффинными нуклеотидными аналогами рассматривается как часть настоящего изобретения.
Модификация нуклеотидов в положениях 1-2, считая от З'-конца.
Нуклеотид в положениях 1 и/или 2 может быть нуклеотидным аналогом, например высокоаффинным нуклеотидным аналогом, таким как ЗНК, или нуклеотидным аналогом, выбираемым из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фторДНК, единицы 2'-МОЕ-РНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК. Таким образом, два З'-нуклеотида могут представлять собой Хх, хХ, XX или хх, в которых: в одном варианте осуществления X представляет собой ЗНК, и х является ДНК или другим нуклеотидным аналогом, например 2'-замещенным нуклеотидным аналогом, который выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-Оалкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, ЗНК и единицы 2'МОЕ-РНК. Указанная единица не-ЗНК (х), таким образом, может представлять собой 2'-МОЕ-РНК или 2'-фтор-ДНК. Альтернативно X является нуклеотидным аналогом, и х представляет собой ДНК.
Вышеупомянутая модификация в 2-х З'-концевых нуклеотидах может сочетаться с модификацией нуклеотидов в положениях З-8, считая от З'-конца, как описано ниже. В этом отношении нуклеотиды, обозначенные как X и х, везде в олигомере могут быть одинаковыми. Необходимо отметить, что можно не учитывать 8-ой нуклеотид, считая от З'-конца, если длина олигомера составляет только 7 нуклеотидов. В нижеупомянутых вариантах осуществления, которые относятся к модификации нуклеотидов в положениях З-8, считая от З'-конца, единицы ЗНК в одном варианте осуществления могут заменяться на другие нуклеотидные аналоги, такие как упомянутые в настоящем изобретении. Поэтому X можно выбирать из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы 2'-МОЕ-РНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК. х предпочтительно является ДНК или РНК, наиболее предпочтительно ДНК. Вместе с тем, X предпочтительно представляет собой ЗНК.
В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотиды по изобретению модифицируют в положениях З-8, считая от З'-конца. Конструкцию этой последовательности можно определять по количеству присутствующих единиц не-ЗНК или по количеству присутствующих единиц ЗНК. В предпочтительном варианте осуществления в указанной последовательности по меньшей мере один, например, один нуклеотид в положении от третьего до восьмого, считая от З'-конца, является единицей не-ЗНК. В другом варианте осуществления по меньшей мере два, например, два нуклеотида в положении от третьего до восьмого, считая от З'-конца, являются единицами не-ЗНК. В еще одном варианте осуществления по меньшей мере три, например три нуклеотида в положении от третьего до восьмого, считая от З'-конца, являются единицами не-ЗНК. Еще в одном варианте осуществления по меньшей мере четыре, например четыре нуклеотида в положении от третьего до восьмого, считая от З'-конца, являются единицами неЗНК. В дополнительном варианте осуществления по меньшей мере пять, например, пять нуклеотидов от третьего до восьмого, считая от З'-конца, является единицами не-ЗНК. Еще в одном дополнительном варианте осуществления все шесть нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от З'-конца, являются единицами не-ЗНК.
- 15 019939
Альтернативно указано как вариант осуществления, что олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере три единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. В варианте осуществления указанного олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит три единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. Образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, можно выбирать из группы, состоящей из ХХХххх, хХХХхх, ххХХХх, хххХХХ, ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, ХхХХхх, ХххХХх, ХхххХХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ, хХхХхХ и ХхХхХх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В предпочтительном варианте осуществления образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, выбирают из группы, состоящей из ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, ХхХХхх, ХххХХх, ХхххХХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ, хХхХхХ и ХхХхХх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В более предпочтительном варианте осуществления образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, выбирают из группы, состоящей из хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ и хХхХхХ, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В одном варианте осуществления образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, представляет собой хХхХхХ или ХхХхХх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК. В одном варианте осуществления образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, представляет собой хХхХхХ, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК.
В дополнительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере четыре единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. В варианте осуществления указанного олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит четыре единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. Образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, можно выбирать из группы, состоящей из ххХХХХ, хХхХХХ, хХХхХХ, хХХХхХ, хХХХХх, ХххХХХ, ХхХхХХ, ХхХХхХ, ХхХХХх, ХХххХХ, ХХхХхХ, ХХхХХх, ХХХххХ, ХХХхХх и ХХХХхх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК.
Еще в одном дополнительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере пять единиц ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. В одном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит пять единиц ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. Образец замены для нуклеотидов в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, можно выбирать из группы, состоящей из хХХХХХ, ХхХХХХ, ХХхХХХ, ХХХхХХ, ХХХХхХ и ХХХХХх, в которой X обозначает единицу ЗНК и х обозначает единицу не-ЗНК.
Предпочтительно олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит одну или две единицы ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. Считается, что для стабильности Аспирали, образованной олиго, обладают преимуществом: дуплекс микроРНК, дуплекс, сходный с РНК: дуплексная структура РНК.
Еще в одном дополнительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере шесть единиц ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит от трех до шести единиц ЗНК в положениях от третьего до восьмого, считая от 3'-конца, и дополнительно в той же области он содержит от одного до трех других высокоаффинных нуклеотидных аналогов, таким образом, что общее количество высокоаффинных нуклеотидных аналогов (включающих в себя единицы ЗНК) в области от третьего до восьмого положения, считая от 3'-конца, составляет шесть.
В некоторых вариантах осуществления, например, когда X представляет собой ЗНК, указанная единица не-ЗНК (х) является другой единицей нуклеотидного аналога, например 2'-замещенного нуклеотидного аналога, которую выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМеРНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, ЗНК и единицы 2'-МОЕ-РНК. Указанная единица не-ЗНК (х) поэтому может представлять собой 2'-МОЕ-РНК или 2'-фтор-ДНК.
В олигомерах, имеющих 9 или 10 нуклеотидов, нуклеотид в положениях 9 и/или 10 может быть нуклеотидным аналогом, например высокоаффинным нуклеотидным аналогом, таким как ЗНК, или нуклеотидным аналогом, который выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы 2'-МОЕ-РНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК. Два 5'-нуклеотида поэтому могут представлять собой Хх, хХ, XX или хх, в которых в одном варианте осуществления X представляет собой ЗНК, и х является ДНК или другим нуклеотидным аналогом, например 2'-замещенным нуклеотидным аналогом, который выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, ЗНК и единицы 2'-МОЕ-РНК. Указанная единица не-ЗНК (х) поэтому может представлять собой 2'-МОЕ-РНК или 2'-фтор-ДНК. Альтернативно X является нуклеотидным аналогом, и х представляет собой ДНК.
- 16 019939
Вышеупомянутую модификацию в 2-х 5'-концевых нуклеотидах и/или в 2-х 3' нуклеотидах можно комбинировать с модификацией нуклеотидов в положениях 3-8, считая от З'-конца, как описано выше. В этом отношении нуклеотиды, обозначенные X и х, могут быть одинаковыми во всем олигомере.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит единицу ЗНК на 5'-конце. В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит единицу ЗНК в первых двух положениях, считая от 5'-конца.
В одном варианте осуществления изобретение дополнительно относится к олигомеру, описание которого приведено в контексте фармацевтической композиции изобретения, или для использования ίη νίνο в организме, например, в качестве лекарственного средства, при этом указанный олигомер (или непрерывная нуклеотидная последовательность) содержит или
ί) по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, и/или ίί) по меньшей мере одну 3 '-концевую единицу ЗНК, и/или ίίί) по меньшей мере одну 5'-концевую единицу ЗНК.
Таким образом, олигомер может содержать по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, например иметь все фосфоротиоатные связи, и по меньшей мере одну З'-концевую единицу ЗНК, и по меньшей мере одну 5'-концевую единицу ЗНК.
В большинстве терапевтических применений предпочтительным является полностью фосфоротиолированный олигонуклеотид, за исключением терапевтических олигонуклеотидов для введения в ЦНС, например в мозг или спинной мозг, где фосфоротиолирование может быть токсичным, и благодаря отсутствию нуклеаз можно использовать фосфодиэфирные связи даже между смежными единицами ДНК.
Как упомянуто в настоящем изобретении в отношении олигонуклеотида согласно изобретению, другим аспектом является то, что второй З'-нуклеотид, и/или 9-й и 10-й (от З'-конца), в случае их присутствия, также могут представлять собой ЗНК.
В одном варианте осуществления олигомер содержит по меньшей мере пять единиц нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере пять единиц ЗНК, в положениях, которые комплементарны исходной области миРНК.
В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность олигомера, комплементарного последовательности исходной области микроРНК, выбирают из группы, состоящей из (Х)хХХХХХ, (Х)ХхХХХХ, (Х)ХХхХХХ, (Х)ХХХхХХ, (Х)ХХХХхХ и (Х)ХХХХХх, где X обозначает нуклеотидный аналог, например единицу ЗНК, (X) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу.
В одном варианте осуществления олигомер содержит шесть или семь единиц нуклеотидных аналогов, например шесть или семь единиц ЗНК, в положениях, которые комплементарны исходной области миРНК.
В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность олигомера, который комплементарен последовательности исходной области микроРНК, выбирают из группы, состоящей из ХХХХХХ, ХхХХХХХ, ХХхХХХХ, ХХХхХХХ, ХХХХхХХ, ХХХХХхХ и ХХХХХХх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНКнуклеотидную единицу.
В одном варианте осуществления два нуклеотидных мотива в положении 7-8, считая от З'-конца олигомера, выбирают из группы, состоящей из хх, XX, хХ и Хх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу.
В одном варианте осуществления два нуклеотидных мотива в положении 7-8, считая от З'-конца олигомера, выбирают из группы, состоящей из XX, хХ и Хх, где X обозначают аналог нуклеотида, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу.
В одном варианте осуществления олигомер содержит 12 нуклеотидов, при этом два нуклеотидных мотива в положении 11-12, считая от З'-конца олигомера, выбирают из группы, состоящей из хх, XX, хХ и Хх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу.
В одном варианте осуществления олигомер содержит 12 нуклеотидов, при этом два нуклеотидных мотива в положении 11-12, считая от З'-конца олигомера, выбирают из группы, состоящей из XX, хХ и Хх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как единица ЗНК, например единицу ЗНК, и х обозначает ДНК- или РНК-нуклеотидную единицу, например единицу ДНК.
В одном варианте осуществления олигомер содержит на 5'-конце единицу нуклеотидного аналога, такую как единица ЗНК.
В одном варианте осуществления единицы нуклеотидных аналогов, например, X, независимо выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-аминоДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы 2'-МОЕ-РНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК.
В одном варианте осуществления все нуклеотиды олигомера по настоящему изобретению представляют собой единицы нуклеотидных аналогов.
- 17 019939
В одном варианте осуществления единицы нуклеотидных аналогов, например X, независимо выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-фтор-ДНК и единицы ЗНК.
В одном варианте осуществления олигомер содержит указанную по меньшей мере одну единицу аналога ЗНК и по меньшей мере одну дополнительную единицу нуклеотидного аналога, отличную от ЗНК.
В одном варианте осуществления единицу или единицы не-ЗНК нуклеотидного аналога независимо выбирают из единиц 2'-ОМе-РНК и единиц 2'-фтор-ДНК.
В одном варианте осуществления олигомер состоит по меньшей мере из одной последовательности ΧΥΧ или ΥΧΥ, в которых X представляет собой ЗНК, и Υ является или единицей 2'-Оме-РНК или единицей 2'-фтор-ДНК.
В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность олигомера состоит из альтернативных единиц Χ и Υ.
В одном варианте осуществления олигомер содержит чередующиеся единицы ЗНК и ДНК (Хх) или (хХ). В одном варианте осуществления олигомер содержит мотив из чередующихся ЗНК, сопровождающихся 2 единицами ДНК (Ххх), хХх или ххХ.
В одном варианте осуществления по меньшей мере одна из ДНК- или не-ЗНК-единиц нуклеотидного аналога заменена на ЗНК-нуклеотид в положении, которое выбирают из положений, обозначаемых ЗНК-нуклеотидными единицами в любом из вариантов осуществления, упомянутых выше. В одном варианте осуществления Χ является донором единицы ЗНК.
Дополнительные конструкции олигомеров по изобретению.
В табл. 1 ниже приведены неограничивающие объем настоящего изобретения примеры коротких последовательностей микроРНК, которые могут иметь преимущество в качестве мишеней для олигонуклеотидов по настоящему изобретению.
Олигонуклеотиды согласно изобретению, такие как раскрытые в табл. 1, в одном варианте осуществления могут иметь последовательность в 7, 8, 9 или 10 ЗНК-нуклеотидов 5'-3' ЛЛЬ(Ь) (Ь) (Ь) (Ь), или иметь последовательность нуклеотидов, которую выбирают из группы, состоящей из первых 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов следующих мотивов:
ί<ιΐΜΐ(ΐ)(ά)((ΐ)(ΐ.)(<ιχΐ)(6)(ΐχι.>, ωί6ίΜΐχάχάχι.χι.)(ΐ_χά)(ΐ.)(ΐ.), ίΜΙΜΜΗί)(ΜχΜχΐ-)(Μχΐ.ΧΜΧΙ.χΐ-), ιμιμι_ι_(1_χμ)(μ>(1_χι)(ι_χμ)(γχι_), ЬРИ=ЕЦС)(Р)(РХ1-)(РХи)(РХ1)(и)1 ΙΕΙΕΙΙ(ί)(ΕΧΡ)(ί-)(1)(ί)(Ε)(1)(1), И каждые третьи конструкции, например, ί601ά6(ΐχ6Χ6χΐ)(6)(άΜΙ)(ά)(άχθ(6)·6166Ε6(άχΐ)(ά)(άχΐ)(άχ6)(ΐχ6)(άχΐ), ааьбсщдхамьхбхахкхдхахихаха). ΐΜΜίΜΜΟΜχΜχίχΜχΜχι,χΜχΜχΐ-χΜ), МШМЬМ(М)(Ь)(МХМ)(1)(М)(М)(1-)(М)(М)(1.), ММ1ММЦМ)(МХЬ)(МХМХЕХМХМХ1-)(МХМ), ίΡΡΕΕΡ(ΐχρχρχιχρ)(ρχίχρχρχί)(ρ>> ριρρι.ρ(ρχι.χρχρχιχρχρχΐ-χρχρχι.), РРЕРРЦРХЕХЬХРХРХЬХРХРХкХЕХР), апб 61.61.61.(6)06ΧίΧά)(ί)(ό)(ΐχεΙ)(1_)(ε1) „ каждые вторые конструкции, например, 1.61.6(.606)(1)(6)(1)^1)(6)(1-)^1.), ΜΙΜίΜΙ(Μ)(ίΜΜ)(ί)(Μ)(1)(Μ)(1)(Μχΐ)(Μ), кМЬМЬМ(Ь)(М)(ЬХМХЬХМ)(ЬХМ)(1)(М)(1), Γΐ_ρι.ΡΜΕχι.χΓ)(ΐχρχι.)(ρχι.χΕχιχρ), и (_ΕΙ-Ε1.Γ(1.)(Ε)(1-)(Ε)(1-)(Ε)(1-ΧΕ)(Ι_ΧΡΧΙ-); в которых 1_ = единица ЗНК, б = единица ДНК. М = 2’-метоксиэтил-РНК.
Е - 2'-фтор, и остатки в скобках являются необязательными
Фармацевтическая композиция и применение в медицине.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей олигомер по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
Изобретение дополнительно предусматривает использование олигонуклеотида согласно изобретению, например олигонуклеотидов, которые могут входить в состав фармацевтической композиции, для производства лекарственного средства для лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией (ап-регуляцией) микроРНК.
Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК, включающему стадию введения нуждающемуся в лечении человеку композиции (например, фармацевтической композиции) по изобретению.
Изобретение дополнительно относится к способу уменьшения эффективного количества миРНК в клетке или в организме, включающему введение в клетку или организм композиции (например, фармацевтической композиции) по изобретению или олигомера по изобретению. Снижение эффективного количества в этом контексте относится к уменьшению содержания в клетке или организме функциональной миРНК. Признается, что предпочтительные олигонуклеотиды по изобретению возможно не всегда значительно уменьшают фактическое количество миРНК в клетке или организме, поскольку обычно они образуют очень устойчивые дуплексы с их миРНК-мишенями. В одном варианте осуществления можно измерить снижение эффективного количества миРНК в клетке путем определения клеточного уровня дерепрессии миРНК-мишени.
Изобретение дополнительно относится к способу дерепрессии мРНК-мишени из миРНК в клетке
- 18 019939 или в организме, включающему введение в клетку или организм композиции (например, фармацевтической композиции) или олигомера по изобретению.
Изобретение дополнительно относится к использованию олигомера, имеющего длину от 7 до 10, например 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов, для производства лекарственного средства для лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК.
В одном варианте осуществления клиническое состояние (или болезнь) представляет собой гепатит С (НСУ) и миРНК представляет собой ш1В-122.
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению предназначена для применения в лечении клинического нарушения или болезни, выбираемой из группы, состоящей из вирусной инфекции гепатита С и гиперхолестеринемии и связанных с ними нарушений, и раковых заболеваний.
В одном варианте осуществления клиническое нарушение или заболевание представляет собой патологию ЦНС, например заболевание ЦНС, для которого известна одна или более идентифицированных микроРНК.
В контексте связанных с гиперхолестеринемией патологий рассматриваются такие болезни, как атеросклероз или гиперлипидемия. Дополнительные примеры связанных с гиперхолестеринемией заболеваний также включают различные типы холестеринового дисбаланса ИНВП/ЛННП (липопротеины высокой плотности/липопротеины низкой плотности); дислипидемии, например семейная сочетанная гиперлипидемия (РСНЬ), приобретенная гиперлипидемия, статин-резистентная гиперхолестеринемия; заболевание коронарных артерий (ЗКА), ишемическая болезнь сердца (ИБС), атеросклероз.
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению дополнительно содержит второй независимый активный компонент, который является ингибитором пути сборки УБОБ (липопротеинов очень низкой плотности), например ингибитор АроВ или ингибитор МТР (микросомального белка, переносящего триглицериды) (например, раскрытые в патенте США 60/977497, включенном ссылкой в настоящее изобретение).
Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК, включающему стадию введения нуждающемуся в лечении человеку композиции (например, фармацевтической композиции), которая содержит олигомер, имеющий длину от 7 до 10, например 7, 8, 9 или 10, нуклеотидов.
Изобретение дополнительно относится к способу уменьшения эффективного количества миРНКмишени (т.е. доступных миРНК) в клетке или организме, включающему введение в клетку или организм композиции (например, фармацевтической композиции), которая содержит олигомер, имеющий длину от 6-7 до 10, например 7, 8, 9 или 10, нуклеотидов.
Необходимо считать, что уменьшение эффективного количества одной или более микроРНК в клетке или организме относится к ингибированию функции микроРНК в клетке или организме. Клеткой предпочтительно является клетка млекопитающего или человеческая клетка, которая экспрессирует одну микроРНК или несколько микроРНК.
Изобретение дополнительно относится к способу дерепрессии в клетке или организме мРНКмишени из миРНК, которые содержат олигомер, имеющий длину от 7 до 10, например 7, 8, 9 или 10, нуклеотидов (или композиция, содержащая указанный олигонуклеотид) в клетке или организме.
Как упомянуто выше, микроРНК связаны со многими заболеваниями. Следовательно, четвертый аспект изобретения относится к применению олигонуклеотида по изобретению для производства лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с экспрессией микроРНК, которое выбрано из группы, состоящей из спинальной мышечной атрофии, синдрома Туретта, гепатита С, синдрома умственной отсталости с ломкой Х-хромосомой, синдрома Ди Г еорга и рака, в качестве неограничивающего примера, хронического лимфоцитарного лейкоза, рака молочной железы, рака легкого и рака ободочной кишки, в частности рака.
Способы синтеза
Изобретение дополнительно относится к способу синтеза олигомера, нацеленного на человеческую микроРНК, например олигомера, описанного в настоящем изобретении, при этом указанный способ содержит следующие этапы:
a) необязательно выбор первого нуклеотида, считая от З'-конца, который является нуклеотидным аналогом, таким как нуклеотид ЗНК;
b) необязательно выбор второго нуклеотида, считая от З'-конца, который является нуклеотидным аналогом, таким как нуклеотид ЗНК;
c) выбор области олигомера, который соответствует исходной области миРНК, при этом указанная область представляет собой область, определенную по изобретению;
й) выбор седьмого и необязательно восьмого нуклеотидов, указанных по изобретению;
е) необязательно выбор одного или двух дополнительных 5'-концов олигомера согласно изобретению;
при этом синтез осуществляют путем последовательного синтеза областей, указанных в этапах а-е, при этом указанный синтез можно проводить или в направлении 3'-5' (от а) к е)), или в направлении 5'-3'
- 19 019939 (от е) к а)), и при этом указанный олигомер комплементарен последовательности миРНК-мишени.
Изобретение дополнительно относится к способу получения олигомера (такого как олигомер по изобретению), при этом указанный способ включает этапы а) сравнения последовательностей двух или более последовательностей миРНК для идентификации двух или более последовательностей миРНК, которые содержат общую непрерывную последовательность нуклеотидов с длиной по меньшей мере 7 нуклеотидов, например 7, 8, 9 или 10, нуклеотидов (т.е. последовательность, обнаруживаемую в обеих неидентичных миРНК), Ь) изготовления последовательности олигомера, содержащей или состоящей из непрерывной нуклеотидной последовательности, которая комплементарна указанной общей непрерывной нуклеотидной последовательности, при этом указанный олигомер является олигомером по изобретению. В предпочтительном примере общая непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из исходной области каждой из указанных двух или более последовательностей миРНК (которые содержат общую непрерывную нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 6 нуклеотидов). В одном варианте осуществления исходные области двух или более миРНК являются идентичными. Соответственно, олигомер содержит или состоит из сидмерной последовательности длиной 7 или 8 нуклеотидов, которая содержит последовательность, комплементарную указанным двум или более миРНК. Этот способ можно использовать в сочетании с этапом с) вышеупомянутого способа.
Способ синтеза олигомера согласно изобретению можно осуществлять с использованием стандартного твердофазного синтеза олигонуклеотидов.
В одном варианте осуществления способ синтеза олигомера, нацеленного против человеческой микроРНК, осуществляют в направлении а-е от 3'- к 5'-концу.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является способ уменьшения уровня микроРНК-мишени путем контакта микроРНК-мишени с олигонуклеотидом, как указано в изобретении, при этом олигонуклеотид (ί) комплементарен последовательности микроРНК-мишени, (ίί) на З'-конце не содержит нуклеотид, который соответствует первым нуклеотидам микроРНК-мишени 5'-конца.
Стабильность дуплекса и температура Тт.
В одном варианте осуществления олигомер по настоящему изобретению способен к образованию дуплекса с комплементарной одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты РНК (обычно примерно аналогичной длины указанного одноцепочечного олигонуклеотида) с фосфодиэфирными межнуклеозидными связями, при этом дуплекс имеет температуру Тт в диапазоне от 30 и до 70 или 80°С, например от 30 и до 60, до 70°С или от 30 до 50 или до 60°С. В одном варианте осуществления Тт составляет по меньшей мере 40°С. Можно определять Тт, определяя Тт олигомера и комплементарной РНК-мишени со следующими буферными условиями: 100 мМ №С1, 0,1 мМ этилендиамин-тетрауксусной кислоты ЭДТА, 10 мМ №-фосфата, уровень рН 7,0 (см. примеры подробного протокола). Высокоаффинные аналоги можно определить как аналог, который при использовании в олигомере по изобретению приводит к повышению Тт олигомера по сравнению с идентичным олигомером, содержащим только ДНК-основания.
Конъюгаты.
В одном варианте осуществления указанный олигомер конъюгирован с одним или несколькими ненуклеотидными (или полинуклеотидными) соединениями.
В настоящем описании термин конъюгат применяется для обозначения гетерогенной молекулы, образованной ковалентным присоединением (конъюгацией) олигомера, описанного в изобретении, к одному или нескольким ненуклеотидным или неполинуклеотидным функциональным группам. Примеры ненуклеотидных или неполинуклеотидных функциональных групп включают макромолекулярные агенты, такие как белки, цепи жирных кислот, остатки сахаров, гликопротеины, полимеры или их комбинации. Обычные белки могут представлять собой антитела к белку-мишени. Обычные полимеры могут представлять собой полиэтиленгликоль.
Таким образом, в разных вариантах осуществления олигомер по изобретению может содержать как полинуклеотидную область, которая обычно состоит из непрерывной последовательности нуклеотидов и комплементарной области ненуклеотида. В отношении олигомера по изобретению, состоящего из непрерывной нуклеотидной последовательности, соединение может содержать ненуклеотидные компоненты, например компонент конъюгат.
В разных вариантах осуществления изобретения олигомерное соединение присоединено к лигандам/конъюгатам, которые можно использовать, например, для увеличения клеточного захвата олигомерных соединений. В патенте А0 2007/031091, включенном со ссылкой в настоящее изобретение, рассмотрены подходящие лиганды и конъюгаты.
Изобретение также относится к конъюгату, который содержит описанное в изобретении соединение и по меньшей мере одну ненуклеотидную или неполинуклеотидную функциональную группу, ковалентно присоединенную к указанному соединению. Поэтому в разных вариантах осуществления, где соединение по изобретению состоит из конкретной нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, раскрытых в изобретении, соединение также может содержать по меньшей мере одну ненуклеотидную или неполинуклеотидную функциональную группу (например, не содержащую один или более нуклеотидов или нуклеотидных аналогов), присоединенную ковалентно к указанному соединению.
Конъюгация (к функциональной группе конъюгата) может увеличить активность, распределение в
- 20 019939 клетке или клеточный захват олигомера по изобретению. Такие функциональные группы включают без ограничения антитела, полипептиды, липидные функциональные группы, например группы холестерина, холевой кислоты, тиоэфира, например гексил-к-тритилтиол, тиохолестерин, алифатическую цепь, например остатки додекандиола или ундецила, фосфолипиды, например дигексадецил-гас-глицерин или триэтиламмония 1,2-ди-о-гексадецил-гас-глицеро-3-й-фосфоната, цепи полиамингликоля или полиэтиленгликоля, адамантануксусную кислоту, функциональные группы пальмитила, окстадециламина или гексиламинокарбонил-оксихолестерина.
Олигомеры по настоящему изобретению также могут конъюгироваться с действующей лекарственной субстанцией, например с аспирином, ибупрофеном, сульфа-препаратом, противодиабетическим, антибактериальным средством или антибиотиком.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированная функциональная группа представляет собой стерин, например холестерин.
В разных вариантах осуществления конъюгированная функциональная группа содержит или состоит из положительно заряженного полимера, например из положительно заряженных пептидов, например, длиной от 1 до 50, например от 2 до 20, например от 3 до 10, аминокислотных остатков, и/или из окисиполиалкилена, например из полиэтиленгликоля (ПЭГ) или полипропиленгликоля - см. патент А0 2008/034123, включенный в настоящее изобретение ссылкой. Соответственно положительно заряженный полимер, например окись полиалкилена, можно присоединять к олигомеру по изобретению посредством линкера, например свободного линкера, описанного в А0 2008/034123.
В конъюгатах по настоящему изобретению можно использовать в качестве примера следующие конъюгированные функциональные группы:
ОЛИГОМЕР-3'
Активированные олигомеры.
Термин активированный олигомер, используемый в настоящем изобретении, относится к олигомеру по изобретению, ковалентно связанному (т.е. функционализированному) по меньшей мере с одной функциональной группой, которая допускает ковалентное связывание олигомера с одной или несколькими конъюгированными функциональными группами, т.е. с группами, которые сами по себе не являются нуклеиновыми кислотами или мономерами, для образования конъюгата, описанного в изобретении. Обычно функциональная группа содержит химическую группу, которая способна к ковалентному соединению с олигомером, например, посредством 3'-гидроксильной группы или экзоциклической N4^ группы аденинового основания, спейсер, который предпочтительно является гидрофильным, и терминальную группу, способную к связыванию с конъюгированной функциональной группой (например, амино, сульфгидрильная или гидроксильная группа). В некоторых вариантах осуществления указанная терминальная группа не является защищенной, например группа N4^. В других вариантах осуществления терминальная группа защищена, например, любой подходящей защитной группой, например, как описанной в издании РгсИесНуе Сгоирк ίη 0гдаи1с 8уи1йек1к авторов Тйеобога А Сгееие и Ре1ег С.М. АнК 3гб еб1ΐίοη (.Гойи А11еу & 8оик, 1999). Примеры подходящих гидроксильных защитных групп включают сложные эфиры, такие как уксусный эфир, аралкильные группы, такие как бензил, дифенилметил или трифенилметил и тетрагидропиранил. Примеры подходящих защитных аминогрупп включают бензил, аметилбензил, дифенилметил, трифенилметил, бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, и ацильные группы, такие как трихлоруксусная или трифторуксусная группы. В некоторых вариантах осуществления функциональная группа является саморасщепляемой. В других вариантах осуществления функциональная группа является биоразлагаемой. См., например, патент США № 7087229, который полностью включен посредством ссылки в настоящее изобретение.
В некоторых вариантах осуществления олигомеры по изобретению являются функционализированными на 5'-конце для возможности ковалентного присоединения конъюгированной функциональной группы к 5'-концу олигомера. В других вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированными на 3'-конце. Еще в одних вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированными по всему скелету или в гетероциклическом основании функциональной группы. Еще в одних вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированными более чем в одном положении, независимо выбираемом из 5'-конца, 3'-конца, скелета и основания.
В некоторых вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению синтезируют путем включения в них во время синтеза одного или более мономеров, ковалентно присоединенных к функциональной группе. В других вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению синтезируют с мономерами, которые не были функционализированы, и функционализацию олиго
- 21 019939 мера осуществляют после завершения синтеза. В некоторых вариантах осуществления олигомеры функционализированы с затрудненными сложными эфирами, содержащими аминоалкильный линкер, в котором алкильная часть имеет формулу (СН2)„, в которой \ν является целым числом в диапазоне от 1 до 10, предпочтительно около 6, и в котором алкильная часть алкиламиногруппы может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь и в котором функциональная группа присоединена к олигомеру посредством эфирной группы (-0-С(0)-(СН2)„НН).
В других вариантах осуществления олигомеры функционализированы с затрудненными сложными эфирами, содержащими (СН2)„-сульфгидрильный (8Н) линкер, при этом ν составляет целое число в диапазоне от 1 до 10, предпочтительно около 6, в котором алкильная часть алкиламиногруппы может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь и в котором функциональная группа присоединена к олигомеру посредством эфирной группы (-0-С(О)-(СН2)„8Н).
В некоторых вариантах осуществления сульфгидрил-активированные олигонуклеотиды конъюгированы с полимерными функциональными группами, такими как полиэтиленгликоль или пептиды (посредством образования дисульфидной связи).
Активированные олигомеры, содержащие затрудненные сложные эфиры, как описано выше, можно синтезировать любым способом, известным в данной области техники, и, в частности, способами, раскрытыми в опубликованной РСТ А0 № 2008/034122 и в примерах указанной заявки, которая включена посредством ссылки полностью в настоящее изобретение.
Еще в одних вариантах осуществления олигомеры по изобретению являются функционализированными путем введения в олигомер сульфгидрильной, амино или гидроксильной группы посредством, по существу, функционализирующего реактива, как описано в патентах США №№ 4962029 и 4914210, то есть, по существу, линейного реактива, имеющего фосфорамидит на одном конце, связанный посредством гидрофильной спейсерной цепи с противоположным концом, который содержит защищенную или незащищенную сульфгидрильную, амино или гидроксильную группу. Такие реактивы прежде всего реагируют с гидроксильными группами олигомера. В некоторых вариантах осуществления такие активированные олигомеры имеют функционализирующий реактив, соединенный с 5'-гидроксильной группой олигомера. В других вариантах осуществления активированные олигомеры имеют функционализирующий реактив, соединенный с 3'-гидроксильной группой. Еще в одних вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению имеют функционализирующий реактив, соединенный с гидроксильной группой в скелете олигомера. В других дополнительных вариантах осуществления олигомер по изобретению функционализирован более чем одним из функционализирующих реактивов, как описано в патентах США №№ 4962029 и 4914210, включенных в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте. Способы синтезирования таких функционализирующих реактивов и включения их в мономеры или олигомеры раскрыты в патентах США №№ 4962029 и 4914210.
В некоторых вариантах осуществления 5'-конец твердофазного связанного олигомера является функционализированным с производным диенил-фосфорамидита, с последующей конъюгацией олигомера со снятой защитой, например аминокислоты или пептида, посредством реакции циклоприсоединения Дильса-Альдера.
В разных вариантах осуществления включение в олигомер мономеров, содержащих 2'-сахарные модификации, например 2'-карбаматзамещенный сахар или сахар 2'-(О-пентил-Ы-фталимидо)дезоксирибозу, облегчает ковалентное присоединение конъюгированных функциональных групп к сахару олигомера. В других вариантах осуществления изготавливают олигомер с аминосодержащим линкером в 2' положении в одном или более мономере, используя такой реактив, как, например, 5'диметокситритил-2'-О-(е-фталимидиламинопентил)-2'-дезоксиаденозин-3'-Ы,№диизопропилцианэтокси фосфорамидит. См., например, Мапойагап, е! а1., Тейайебгоп Ьейетк, 1991, 34, 7171.
Еще в дополнительных вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут иметь аминсодержащие функциональные группы в нуклеотиде, включающем пуриновые аминогруппы в положении N6, гуанин на экзоциклическом положении N2 или цитозин на N4 или 5 положениях. В разных вариантах осуществления такая функционализация может быть достигнута при использовании коммерческого реактива, который уже функционализирован в синтезе олигомера.
Некоторые функциональные группы доступны коммерчески, например гетеробифункциональные и гомобифункциональные связывающие группы можно приобретать в компании Р1егсе Со. (Воск£огб, ΙΙΙ.). Другие коммерчески доступные связывающие группы представляют собой реактивы 5'-аминомодификатор С6 и 3'-аминомодификатор, которые продает корпорация 61еп Векеатсй Сотротайоп (8!ет11пд, Уа.). Компания ΑΒΙ (Аррйеб Вюкуйешк Шс., Еойет Сйу, Калифорния) продает 5'-аминомодификатор С6 под маркой Ашто11пк-2, и 3'-амино-модификатор доступен в компании С1оп1ес11 ЬаЬота1опе5 Шс. (Ра1о А1Ю, Калифорния).
Терапия и фармацевтические композиции - рецептура и введение.
Согласно исходному объяснению олигонуклеотиды по настоящему изобретению входят в состав подходящих препаратов с улучшенными свойствами. Конструирование эффективного и безопасного препарата требует точной регуляции разных параметров, таких как аффинность/специфичность, устойчивость в биологических жидкостях, клеточный захват, механизм действия, фармакокинетические свой
- 22 019939 ства и токсичность.
Соответственно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант. Предпочтительно указанный носитель представляет собой солевой раствор или буферный солевой раствор.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Предполагается, что дозировка зависит от степени тяжести патологического состояния и его восприимчивости к лечению, и курс лечения продолжается от нескольких дней до нескольких месяцев или до достижения лечебного эффекта или уменьшения симптомов болезни. Оптимальные схемы введения дозы можно рассчитать по измерению накопления препарата в организме пациента. Оптимальные дозы могут варьировать в зависимости от относительной мощности отдельных олигонуклеотидов. В общем, основанием для оценки дозы могут быть показатели ЕС50 (средней дозы воздействия, вызывающей определенный эффект в 50%), при которых выявлен эффект в моделях животных ίη νίΐτο и ίη νίνο. В общем, доза составляет от 0,01 мкг до 1 г на 1 кг веса тела и может вводиться однократно или чаще ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже однократно каждые 2-10 лет, или путем постоянного вливания в течение от нескольких часов до нескольких месяцев. Частота повторного введения дозы устанавливается на основе измерения времени нахождения и концентраций препарата в жидкостях или тканях организма. После успешного лечения может быть желательным проведение поддерживающего лечения пациента с целью предотвращения рецидива болезни.
Как указано выше, изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере один олигонуклеотид по изобретению в качестве активного компонента. Подразумевается, что фармацевтическая композиция согласно изобретению необязательно содержит фармацевтический носитель и что фармацевтическая композиция необязательно содержит дополнительные соединения, такие как химиотерапевтические соединения, противовоспалительные соединения, противовирусные соединения и/или иммуномодулирующие соединения.
Олигонуклеотиды по изобретению можно использовать как есть или в виде ряда фармацевтически приемлемых солей. Используемый в изобретении термин фармацевтически приемлемые соли относится к солям, которые сохраняют желательное биологическое действие указанных в изобретении олигонуклеотидов и проявляют минимальные нежелательные токсические эффекты.
Такие соли в качестве неограничивающих примеров могут быть образованы с органической аминокислотой, и аддитивные соли оснований образуют с катионами металлов, такими как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий, натрий, калий и т.п., или с катионом, образованным аммонием, Ν,Ν-дибензилэтилен-диамином, Ό-глюкозамином, тетраэтиламмонием или этилендиамином.
В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид может находиться в форме пролекарства. Олигонуклеотиды в силу отрицательного заряда являются ионами. Благодаря липофильной природе клеточной мембраны захват олигонуклеотидов клеткой уменьшен по сравнению с нейтральными или липофильными эквивалентами. Можно избежать помехи, обусловленной такой полярностью, применяя пролекарственный подход (см., например, Сгооке, КМ. (1998) ίη Сгооке, 8. Т. Апбкепке гекеагсЬ апб Аррбсабоп. 8рппдег-Уег1ад, ВегКп. Сегтапу, νοί. 131, рр. 103-140).
Фармацевтически приемлемые связующие агенты и адъюванты могут составлять часть рецептуры препарата.
Примеры способов доставки для доставки терапевтических агентов, описанных в изобретении, а также подробности фармацевтических рецептур, солей могут быть хорошо описаны в других источниках, например в предварительных заявках США №№ 60/838710 и 60/788995, которые включены посредством ссылки в изобретение, и в датской заявке РА 200600615, которая также включена в качестве ссылки в настоящее изобретение.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают без ограничения растворы, эмульсии и рецептуры, содержащие липосомы. Эти композиции можно получать из ряда компонентов, которые включают без ограничения подготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Доставку препарата в опухолевую ткань можно увеличить с помощью носителей-медиаторов доставки, которые включают без ограничения катионоактивные липосомы, циклодекстрины, производные порфирина, дендримеры с разветвленной цепью, полимеры полиэтиленимина, наночастицы и микросферы (Эа88 С.К ί. РЬагт. РЬагтасо1. 2002; 54(1):3-27). Фармацевтические рецептуры по настоящему изобретению, приемлемые для монолитной лекарственной формы, можно изготовлять согласно обычным способам, известным в фармацевтической промышленности. Такие способы включают этап соединения в ассоциацию активных компонентов с фармацевтическим носителем (носителями) или наполнителем (наполнителями). В общем, рецептуры изготавливают путем однородного и тщательного соединения в ассоциацию активных компонентов с жидкими носителями или мелкодисперсными твердыми носителями или и с теми, и другими, и затем, в случае необходимости, формования продукта. Рецептуру композиций по настоящему изобретению можно создавать в виде лю
- 23 019939 бой из многих возможных лекарственных форм, таких как таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели и суппозитории, но не ограничиваясь вышеперечисленным. Композиции по настоящему изобретению также могут создаваться в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы. Соединения по изобретению также могут быть конъюгированы с действующей лекарственной субстанцией, например, с аспирином, ибупрофеном, сульфапрепаратом, противодиабетическим препаратом, антибактериальным препаратом или антибиотиком.
В другом варианте осуществления композиции по изобретению могут содержать одно или несколько олигонуклеотидных соединений, нацеленных на первую микроРНК, и одно или несколько дополнительных олигонуклеотидных соединений, нацеленных на вторую микроРНК-мишень. Два или более объединенных соединения можно использовать совместно или последовательно.
Композиции, раскрытые в настоящем изобретении, являются полезными в ряде терапевтических применений, как указано выше. В целом, способы лечения по изобретению включают введение млекопитающему, в частности человеку, терапевтически эффективного количества олигонуклеотида. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей (а) одно или несколько соединений по изобретению и (Ь) один или несколько химиотерапевтических агентов. При использовании с соединениями по изобретению такие химиотерапевтические агенты могут применяться отдельно, последовательно или в комбинации с одним или более другими указанными химиотерапевтическими агентами или в комбинации с лучевой терапией. Все химиотерапевтические агенты, известные специалистам в данной области техники, включены в изобретение в качестве комбинированного лечения вместе с соединением согласно изобретению. Также в композициях по изобретению можно объединять другие активные вещества, такие как противовоспалительные препараты, включающие без ограничения нестероидные противовоспалительные препараты и кортикостероиды, противовирусные препараты и иммуномодулирующие препараты. Два или несколько комбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.
Примеры медицинских показаний, для лечения которых можно применять фармацевтические композиции по изобретению:
микроРНК Возможные медицинские показания
ηηίΚ-1 сердечная аритмия
ΓΤ1ΪΚ-21 глиобластома, рак молочной железы, гепатоцеллюлярная карцинома, рак ободочной и прямой кишки, сенсибилизация к цитотоксическим препаратам при глиомах, гипертрофия сердца
πίιΚ-21, ΓηίΚ-200ό и τηΐΗ-141 восприимчивость к химиотерапии и регуляция роста холангиокарциномы
πίϊΚ-122 гиперхолестеринемия, инфекция гепатита С, гемохроматоз
т|К-19Ь лимфома и другие виды опухолей
т'1К-26а остеобластная дифференцировка человеческих стволовых клеток
ηηίΗ-155 лимфома, рост опухоли поджелудочной железы, рак молочной железы и рак легкого
тгК-203 псориаз
γπΉ-375 диабет, болезни обмена веществ, глюкозоиндуцированная секреция инсулина эндокринными клетками поджелудочной железы
ηηΐΚ-181 миобластная дифференцировка, аутоиммунные болезни
ΠΊίΚ-ЮЬ инвазия клеток рака молочной железы и метастазирование
т|К-125Ь-1 рак молочной железы, рак легкого и рак шейки матки
Γηί К-221 и 222 карцинома простаты, папиллярный рак щитовидной железы человека, гепатоцеллюлярная карцинома человека
миРНК-372 и -373 опухоли из тестикулярных зародышевых клеток
ηηίΚ-142 В-клеточный лейкоз
кластер гтнР-17-1ЭЬ В-клеточные лимфомы, рак легкого, гепатоцеллюлярная карцинома
Было установлено, что ген опухолевой супрессии тропомизин 1 (ТРМ1) мРНК является мишенью для Щ1К-21. Установлено, что миотрофин (ш1рп) мРНК является мишенью для т1К 375.
Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида по изобретению для производства лекарственного средства для лечения болезни, выбранной из группы, состоящей из следующих заболеваний: атеросклероз, гиперхолестеринемия и гиперлипидемия; рак, глиобластома, рак молочной железы, лимфома, рак легкого; диабет, нарушения обмена веществ; миобластная дифференцировка; иммунные нарушения.
- 24 019939
Изобретение дополнительно относится к олигонуклеотидам по изобретению для использования в лечении болезни, выбранной из группы, состоящей из следующего: атеросклероз, гиперхолестеринемия и гиперлипидемия; рак, глиобластома, рак молочной железы, лимфома, рак легкого; диабет, нарушения обмена веществ; миобластная дифференцировка; иммунные нарушения.
Изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего заболеванием или состоянием, выбранным из следующей группы: атеросклероз, гиперхолестеринемия и гиперлипидемия; рак, глиобластома, рак молочной железы, лимфома, рак легкого; диабет, нарушения обмена веществ; миобластная дифференцировка; иммунные нарушения, при этом способ включает стадию введения олигонуклеотида или фармацевтической композиции по изобретению нуждающемуся в этом субъекту.
Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему фармацевтическую композицию согласно изобретению и второй независимый активный компонент, представляющий собой ингибитор пути сборки УЬПЬ, такой как ингибитор АроВ, или ингибитор МТР.
Рак.
Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида по изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака. В другом аспекте настоящее изобретение касается способа лечения или профилактики рака, и указанный способ включает введение олигонуклеотида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению пациенту, который нуждается в таком введении.
Указанные раковые заболевания могут включать лимфоретикулярную неоплазию, лимфобластный лейкоз, опухоли головного мозга, опухоли желудка, плазмоцитомы, множественную миелому, лейкоз, опухоли соединительной ткани, лимфомы и солидные опухоли.
В отношении применения соединения по изобретению в изготовлении лекарства для лечения рака, оно может быть предназначено для такой формы указанного рака, как солидная опухоль. Аналогично, раскрытый в изобретении способ лечения рака может быть предназначен для такой формы указанного рака, как солидная опухоль.
Кроме того, указанный рак также относится к карциноме. Карциному обычно выбирают из группы, состоящей из злокачественной меланомы, базальноклеточной карциномы, карциномы яичника, карциномы молочной железы, немелкоклеточного рака легкого, карциномы почечных клеток, карциномы мочевого пузыря, рецидивирующего поверхностного рака мочевого пузыря, карциномы желудка, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легкого, цервикальной карциномы, цервикальной дисплазии, папилломатоза гортани, карциномы ободочной кишки, карциномы ободочной и прямой кишки и карциноидных опухолей. Чаще указанную карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной меланомы, немелкоклеточного рака легкого, карциномы молочной железы, карциномы ободочной кишки и карциномы почечных клеток. Злокачественную меланому обычно выбирают из группы, состоящей из поверхностной распространенной меланомы, узловой меланомы, меланомы 1спЦдо та11дпа, акральной меланомы, амеланотической меланомы и десмопластической меланомы.
Альтернативно, указанный рак может относиться к саркоме. Форму саркомы выбирают из группы, состоящей из остеосаркомы, саркомы Эвинга, хондросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, фибросаркомы и саркомы Капоши.
Альтернативно рак соответственно может представлять собой глиому.
Дополнительный вариант осуществления направлен на применение олигонуклеотида согласно изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака, при этом указанное лекарственное средство дополнительно содержит химиотерапевтический агент, выбираемый из группы, состоящей из следующих агентов: адренокортикостероиды, такие как преднизон, дексаметазон или декадрон; алтретамин (гексален, гексаметилмеламин (НММ)); амифостин (этиол); аминоглутетимид (цитадрен); амсакрин (М-АМ8А); анастрозол (аримидекс); андрогены, такие как тестостерон; аспарагиназа (элспар); бацилла Кальметта-Герена; бикалутамид (касодекс); блеомицин (бленоксан); бусульфан (милеран); карбоплатин (параплатин); кармустин (БСЫи, ЫСЫИ); хлорамбуцил (лейкеран); хлордезоксиаденозин (2СЭЛ, кладрибин, лейстатин); цисплатин (платинол); цитозин арабинозид (цитарабин); дакарбазин (ΌΤΙί.'); дактиномицин (актиномицин-Ό, космеген); даунорубицин (церубидин); доцетаксел (таксотер); доксорубицин (адриомицин); эпирубицин; эстрамустин (эмцит); эстрогены, такие как диэтилстилбестрол (ΌΕ8); этопозид (УР-16, вепезид, этопофос); флударабин (флудара); флутамид (эулексин); 5-ΕυΌΒ (флоксуридин); 5-фторурацил (5-Еи); гемцитабин (гемзар); госерелин (зодалекс); герцептин (трастузумаб); гидроксимочевина (гидреа); идарубицин (идамицин); ифосфамид; интерлейкин ИЛ-2 (пролейкин, алдеслейкин); интерферон альфа (интрон А, роферон А); иринотекан (камптосар); леупролид (лупрон); левамизол (эргамизол); ломустин (ССЫи); мехлоратамин (мустарген, хлорметин); мелфалан (алкеран); меркаптопурин (пуринетол, 6-МР); метотрексат (мексат); митомицин-С (мутамуцин); митоксантрон (новантрон); октреотид (сандостатин); пентостатин (2-дезоксикоформицин, нипент); пликамицин (митрамицин, митрацин); прокарбазин (матулан); стрептозоцин; тамоксифин (нолвадекс); таксол (паклитаксел); тенипозид (вумон, УМ-26); тиотепа; топотекан (хикамтин); третиноин (весаноид, ол-транс-ретинойная кислота); винбластин (валбан); винкристин (онковин) и винорелбин (навелбин). Подходящим является выбор дополнительного химиотерапевтического агента из группы таксанов, например таксола, паклитак
- 25 019939 села или доцетаксела.
Также изобретение дополнительно относится к применению олигонуклеотида по изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака, при этом указанное лечение дополнительно включает введение дополнительного химиотерапевтического агента, выбираемого из группы, состоящей из следующих агентов: адренокортикостероиды, такие как преднизон, дексаметазон или декадрон; алтретамин (гексален, гексаметилмеламин (НММ)); амифостин (этиол); аминоглутетимид (цитадрен); амсакрин (М-АМ8А); анастрозол (аримидекс); андрогены, такие как тестостерон; аспарагиназа (элспар); бацилла Кальметта-Герена; бикалутамид (касодекс); блеомицин (бленоксан); бусульфан (милеран); карбоплатин (параплатин); кармустин (ВСNυ, ΒίΟΝυ); хлорамбуцил (лейкеран); хлордезоксиаденозин (2СЭЛ. кладрибин, лейстатин); цисплатин (платинол); цитозин арабинозид (цитарабин); дакарбазин (ЭТ1С); дактиномицин (актиномицин-Ό, космеген); даунорубицин (церубидин); доцетаксел (таксотер); доксорубицин (адриомицин); эпирубицин; эстрамустин (эмцит); эстрогены, такие как диэтилстилбестрол (ΌΕ8); этопозид (УР-16, вепезид, этопофос); флударабин (флудара); флутамид (эулексин); 5-ЕиОЯ (флоксуридин); 5-фторурацил (5-Еи); гемцитабин (гемзар); госерелин (зодалекс); герцептин (трастузумаб); гидроксимочевина (гидреа); идарубицин (идамицин); ифосфамид; интерлейкин ИЛ-2 (пролейкин, алдеслейкин); интерферон α (интрон А, роферон А); иринотекан (камптосар); леупролид (лупрон); левамизол (эргамизол); ломустин (СС^Б); мехлоратамин (мустарген, хлорметин); мелфалан (алкеран); меркаптопурин (пуринетол, 6-МР); метотрексат (мексат); митомицин-С (мутамуцин); митоксантрон (новантрон); октреотид (сандостатин); пентостатин (2-дезоксикоформицин, нипент); пликамицин (митрамицин, митрацин); прокарбазин (матулан); стрептозоцин; тамоксифин (нолвадекс); таксол (паклитаксел); тенипозид (вумон, УМ-26); тиотепа; топотекан (хикамтин); третиноин (весаноид, ол-транс-ретинойная кислота); винбластин (валбан); винкристин (онковин) и винорелбин (навелбин). Подходящим при указанном лечении является дополнительное введение дополнительного химиотерапевтического агента, выбираемого из группы таксанов, например таксола, паклитаксела или доцетаксела.
С другой стороны, цель настоящего изобретения, кроме того, относится к способу лечения рака, включающему введение олигонуклеотида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению пациенту, который нуждается в таком введении, и дополнительно включающему введение дополнительного химиотерапевтического агента. Указанное дополнительное введение можно осуществлять, например, с дополнительным химиотерапевтическим агентом, конъюгированным с соединением по изобретению, присутствующим в фармацевтической композиции, или с его введением в отдельной рецептуре.
Инфекционные заболевания.
Установлено, что соединения по изобретению можно широко применять при широком диапазоне инфекционных заболеваний, таких как дифтерия, столбняк, коклюш, полиомиелит, гепатит В, гепатит С, гемофильный грипп, корь, свинка и краснуха.
При инфекции гепатита С выявляют Нка-т1Я122, и, таким образом, олигонуклеотиды согласно изобретению, мишенью для которых является т1Я-122, можно использовать для лечения гепатита С.
Соответственно, еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению для производства лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания, а также к способу лечения инфекционного заболевания, при этом указанный способ включает введение олигонуклеотида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению пациенту, который нуждается в таком введении.
В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к комбинированному лечению с использованием олигомера анти-т1Я-122 в комбинации с ингибитором сборки УБЭБ, таким как ингибитор АроВ или МТР.
Воспалительные заболевания.
Важным механизмом защиты организма против атаки возбудителей инфекций является воспалительная реакция, которая также вовлечена в патогенез многих острых и хронических заболеваний, включающих в себя аутоиммунные нарушения. Воспалительный ответ должен бороться с патогенами, но несмотря на это, его эффекты могут быть разрушающими. В этой связи часто необходимо ограничить симптоматологию воспаления путем применения противовоспалительных препаратов. Воспаление представляет собой комплексный процесс, обычно запускаемый повреждением тканей, которое включает активацию большого разнообразия ферментов, повышение проницаемости сосудов и транссудацию жидкостей крови, клеточную миграцию и высвобождение химических медиаторов, и целью всех указанных механизмов является и разрушение, и восстановление поврежденной ткани.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению для производства лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания, а также к способу лечения воспалительного заболевания, при этом указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или фармацевтической композиции согласно изобретению нуждающемуся в этом пациенту.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения воспалительное заболевание представляет собой ревматическую болезнь и/или болезни соединительной ткани, такие как ревматоид
- 26 019939 ный артрит, системная красная волчанка (СКВ) или волчанка, склеродерма, полимиозит, воспалительная болезнь кишечника, дерматомиозит, язвенный колит, болезнь Крона, васкулит, псориатический артрит, эксфолиативный псориатический дерматит, вульгарный пемфигус и синдром Шегрена, в частности воспалительную болезнь кишечника и болезнь Крона.
Альтернативно воспалительное заболевание может быть неревматическим воспалением, представляя собой, например, бурсит, синовит, капсулит, тендинит и/или другие воспалительные повреждения травматического и/или спортивного происхождения.
Нарушения обмена веществ.
Нарушение обмена веществ представляет собой патологию, вызываемую накоплением химических продуктов, вырабатываемых организмом. Эти заболевания обычно являются тяжелыми, некоторые из них даже представляют опасность для жизни. Другие могут замедлять физическое развитие или вызывать задержку умственного развития. У большинства новорожденных с такой патологией вначале не проявляются очевидные признаки заболевания. Надлежащее скрининговое обследование при рождении может часто выявить такие проблемы. При ранней диагностике и лечении нарушения обмена веществ могут часто эффективно контролироваться.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата для производства лекарственного средства для лечения нарушения обмена веществ, а также к способу лечения нарушения обмена веществ, при это указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата, или фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, который нуждается в таком введении.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нарушение обмена веществ выбирают из группы, состоящей из следующего: амилоидоз, биотинидаза, ΟΜΙΜ (Интернетбаза данных Менделевское наследование в человеке), синдром Криглера-Наджара, диабет, группа поддержки и информации Фабри (ЕаЬгу 8иррог1 & ΙηίοπηαΙίοη Сгоир), нарушения окисления жирных кислот, галактоземия, дефицит глюкозы-6-фосфатдегидрогеназы (66ΡΌ), глутаровая ацидурия, Международная организация по глутаровой ацидурии, глутаровая ацидемия Ι типа, глутаровая ацидемия ΙΙ типа, глутаровая ацидемия I типа, глутаровая ацидемия II типа, Ε-ΗΥΡΌΚΚ-семейная гипофосфатемия, витамин Ό резистентный рахит, болезнь Краббе, дефицит длинноцепочечной З-гидроксиацил СоА дегидрогеназы (ЬСНЛЭ), группа маннозидоза, болезнь кленового сиропа, митохондриальные нарушения, мукополисахаридозные синдромы: болезнь Нимана-Пика, органические ацидемии, фенилкетонурия (ФКУ), болезнь Помпа, порфирия, метаболический синдром, гиперлипидемия и наследственные липидные нарушения, триметиламинурия: синдром рыбного запаха и нарушения цикла мочевины.
Заболевания печени.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата для производства лекарственного средства для лечения заболеваний печени, а также к способу лечения заболеваний печени, при этом указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению, или его конъюгата, или фармацевтической композиции согласно изобретению нуждающемуся в этом пациенту. В одном предпочтительном варианте осуществления болезни печени выбирают из группы, состоящей из атрезии желчных протоков, синдрома Алажилля, а-1антитрипсиновой недостаточности, тирозинемии, гепатита новорожденных и болезни Вильсона.
Другие применения.
Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать в качестве реактивов для диагностических, терапевтических и профилактических исследований. В целях исследования олигонуклеотид можно применять для специфичного ингибирования синтеза генов-мишеней в клетках и экспериментальных животных, что, таким образом, облегчает функциональный анализ мишени или оценку ее полезности в качестве цели для терапевтического вмешательства.
Олигонуклеотиды можно использовать в диагностике для обнаружения и подсчета экспрессии мишени в клетке и тканях с помощью анализа нозерн-блоттинг, гибридизации ίη δίΐιι или подобными способами. Для лечения животного или человека с предполагаемым заболеванием или нарушением, которые можно лечить с помощью модуляции экспрессии мишени, указанное лечение осуществляют путем введения олигонуклеотидных соединений согласно настоящему изобретению. Дополнительно рассматриваются способы лечения животного, в частности мыши и крысы, и способы лечения человека с подозрением на наличие или склонность к заболеванию или к состоянию, связанному с экспрессией мишени, путем введения терапевтически или профилактически эффективного количества одного или более олигонуклеотидных соединений или композиций по изобретению.
Терапевтическое применение олигонуклеотидов, нацеленных на ттК.-122а.
Авторы показали, что ЗНК-анти-т1К, которая нацелена на ттК.-122а, уменьшает уровень холестерина в плазме. Поэтому другим аспектом изобретения является применение в качестве лекарственного средства описанных выше олигонуклеотидов, нацеленных на ттК.-122а.
Еще одним аспектом изобретения является использование описанных выше олигонуклеотидов, нацеленных на ттК.-122а, в изготовлении лекарственного средства для лечения повышенного уровня холестерина в плазме (или гиперхолестеринемии и связанных с этим патологий). Специалисту в данной об
- 27 019939 ласти техники будет понятно, что повышение в плазме уровня холестерина является нежелательным, поскольку при этом увеличивается риск разных состояний, например развития атеросклероза.
Еще одним аспектом изобретения является использование описанных выше олигонуклеотидов, нацеленных на тЖ.-122а, для ап-регуляции содержания №бд3, А1бо А, Векбк или СИ320 в мРНК.
Варианты осуществления
Следующие варианты осуществления настоящего изобретения можно использовать в комбинации с другими вариантами осуществлениями, описанными в изобретении.
1. Фармацевтическая композиция, содержащая олигомер длиной от 6 до 12 нуклеотидов, в которой указанный олигомер содержит непрерывную нуклеотидную последовательность общей длиной от 6 до 12 нуклеотидов, например 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 нуклеотидных единиц, в которой по меньшей мере 50% нуклеиновых оснований единиц олигомера представляют собой высокоаффинные единицы нуклеотидных аналогов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
2. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 1, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области последовательности микроРНК (миРНК) млекопитающего, человека или вируса.
3. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 2, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области последовательности миРНК, выбранной из группы миРНК, которые перечислены в одной из табл. 3, 4 или 5.
4. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 2 или 3, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна исходной последовательности указанной микроРНК.
5. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 2-4, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которую выбирают из любой из последовательностей, перечисленных в табл. 3 или 4.
6. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 4 или 5, в которой 3'нуклеиновое основание сидмера образует в основном 3'-нуклеиновое основание непрерывной нуклеотидной последовательности, при этом непрерывная нуклеотидная последовательность может необязательно содержать одно или два дополнительных 5'-нуклеиновых оснований.
7. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-6, в которой указанная непрерывная нуклеотидная последовательность не содержит нуклеотид, который соответствует первому нуклеотиду, находящемуся в последовательности микро-РНК, считая от 5'-конца.
8. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-7, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей нуклеотидной последовательности, находящейся в миРНК, которую выбирают из указанных в табл. 3, или 4, или 5.
9. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 8, в которой указанную миРНК выбирают из группы, состоящей из тЖ-1, тЖ-10Ь, тЖ-17-3р, тЖ-18, тЖ-19а, тЖ-19Ь, тЖ-20, ιηιΚ21, тЖ-34а, тЖ-93, тЖ-106а, тЖ-106Ь, тЖ.-122, тЖ-133, тЖ-134, тЖ-138, тЖ.-155, тЖ.-192, тЖ194, тЖ-221, тЖ-222 и тЖ-375.
10. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-9, в которой по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или все из единиц нуклеиновых оснований из непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой единицы нуклеотидных аналогов.
11. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 10, в которой единицы нуклеотидных аналогов выбирают из группы, состоящей из единицы 2'-О-алкил-РНК, единицы 2'-ОМе-РНК, единицы 2'-амино-ДНК, единицы 2'-фтор-ДНК, единицы ЗНК, единицы ПНК, единицы ГНК, единицы ИНК и единицы 2'-МОЕ-РНК.
12. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 10 или 11, в которой по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или все из единиц нуклеиновых оснований из непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой единицы нуклеиновых оснований замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК).
13. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 12, в которой все из единиц нуклеиновых оснований из непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой единицы нуклеиновых оснований ЗНК.
14. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-13, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 7, 8, 9 или 10 предпочтительно непрерывных единиц нуклеиновых оснований ЗНК.
15. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-14, в которой олигомер состоит из 7, 8, 9 или 10 непрерывных единиц нуклеиновых оснований и в которой по меньшей мере 7 единиц нуклеиновых оснований являются единицами нуклеотидного аналога.
16. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 15, в которой единицами нуклеотидных аналогов являются единицы нуклеиновых оснований замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК).
17. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 15, в которой единицы нуклеотидных аналогов в молекуле состоят из смеси по меньшей мере 50% единиц ЗНК и до 50% других
- 28 019939 единиц нуклеотидных аналогов.
18. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-17, в которой по меньшей мере 75%, например 80, или 85, или 90, или 95%, или все из межнуклеозидных связей, расположенных между единицами нуклеиновых оснований непрерывной нуклеотидной последовательности, представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
19. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-18, в которой указанный олигомер конъюгирован с одним или более соединениями, не являющимися нуклеиновыми основаниями.
20. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-19, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей последовательности по меньшей мере из двух последовательностей миРНК, например 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или из 10 последовательностей миРНК.
21. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-20, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна последовательности по меньшей мере из двух последовательностей исходной области миРНК, например, 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или из 10 последовательностей исходной области миРНК.
22. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 20 или 21, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области и ιηίΚ221, и т1 К-222.
23. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 22, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, которая комплементарна 5'6СиАСАиЗ'.
24. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-2З, в состав которой олигомер входит в качестве пролекарства.
25. Фармацевтическая композиция согласно любому из вариантов осуществления 1-24, в которой непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна соответствующей области 1ι;·ΐ5-ιηίΚ-122.
26. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 25 для использования в лечении клинического нарушения или заболевания, выбираемого из группы, состоящей из вирусной инфекции гепатита С и гиперхолестеринемии и связанных с ними нарушений.
27. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 25 или 26, в которой композиция дополнительно содержит второй независимый активный компонент, который является ингибитором пути сборки УЪОЬ, например ингибитором АроВ или ингибитором МТР.
28. Набор, содержащий фармацевтическую композицию согласно варианту осуществления 25 или 26 и второй независимый активный компонент, который является ингибитором пути сборки УЪОЬ, например ингибитором АроВ или ингибитором МТР.
29. Способ лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК, включающий стадию введения пациенту, у которого диагностировано или предполагается указанное заболевание или клиническое нарушение, фармацевтической композиции согласно любому из вариантов осуществления 1-28.
30. Олигомер согласно описанию в любом из вариантов осуществления 1-25.
31. Конъюгат, содержащий олигомер по варианту осуществления З0 и по меньшей мере одно соединение, которое не является нуклеиновым основанием.
32. Применение олигомера или конъюгата, определенных в любом из вариантов осуществления З0З1, для производства лекарственного средства для лечения заболевания или клинического нарушения, связанного с присутствием или сверхэкспрессией микроРНК.
33. Способ уменьшения количества или эффективного количества миРНК в клетке, экспрессирующей указанную миРНК, который включает введение в указанную клетку олигомера, конъюгата или фармацевтической композиции по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, для уменьшения количества или эффективного количества миРНК в клетке.
34. Способ дерепрессии мРНК, экспрессия которой репрессируется миРНК, в клетке, экспрессирующей и указанную мРНК, и указанную миРНК, который включает введение в указанную клетку олигомера, конъюгата или фармацевтической композиции по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, для дерепрессии экспрессии мРНК.
Ссылки: подробности ссылок представлены в приоритетных документах.
Примеры
Синтез мономеров ЗНК и олигонуклеотидов осуществляли с использованием методик, упомянутых в примерах 1 и 2 из патента \¥0 2007/112754. Стабильность олигонуклеотидов ЗНК в плазме человека или крысы достигалась с помощью методики, упомянутой в примере 4 из \¥0 2007/112754. Обработку клеток ίη νίίτο антисмысловым олигонуклеотидом ЗНК анти-ιηίΚ (нацеленным на т1К-122) осуществляли по методике, упомянутой в примере 6 из \¥0 2007/112754. Анализ олигонуклеотидного ингибирования экспрессии ттК-специфичной микроРНК путем количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в условиях модели как ίη νίίτο, так и ίη νίνο проводили по методике, упомянутой в примере 7 из \¥0
- 29 019939
2007/112754. Оценку специфичности нокдауна ЗНК анти-т1В с определением профиля экспрессии микроматрицы миРНК проводили с использованием методики, упомянутой в примере 8 из У0 2007/112754. Обнаружение микроРНК с помощью гибридизации ίη δίΐιι проводили по методике, упомянутой в примере 9 из У0 2007/112754. Выделение и анализ экспрессии мРНК (полное выделение РНК и синтез кДНК для анализа мРНК) в условиях моделей ίη νίίτο и ίη νίνο выполняли по методике, упомянутой в примере 10 из У0 2007/112754. Эксперименты ίη νίνο с использованием олигомеров по изобретению, нацеленных на микроРНК-122, и последующий анализ проводили согласно способам, раскрытым в примерах 11-27 из У0 2007/112754. Вышеупомянутые примеры из У0 2007/112754 конкретно включены посредством ссылки в настоящее изобретение.
Пример 1. Конструирование олигонуклеотидов ЗНК анти-т1В и значения температуры плавления.
Таблица 2
Олигомеры, используемые в примерах и чертежах. Номер последовательности 8ЕЦ ΙΌ служит для идентификации во всех примерах и чертежах, также указаны номера 8ЕЦ ΙΌ, использованные в списке последовательностей
Пример/цифра 8ЕО № 8ЕОЮ ΝΟ Последовательность соединения Комментарий
#3204 1 ТсАОЮТОаТаАдСТ
#3205 2 6АТАА6СТ
#3206 3 ТсАсААТ1аССАПА
#3207 4 ТАССАТТА
#4 5 СсАПОТсаСаСЮС
#3208 6 САСАСТСС
#3209 7 ТААССТ
#3210 8 АТАА6СТ
#3211 9 Т6АТАА6СТ
#3212 10 СТСАТААССТ
#3213 11 СТСТСАТААОСТ
#2114 12 СА6ТСТ0АТАА0СТ
#3215 13 ГТСТСАТАА
#3216 14 АТСА6ТСТ
#3217 15 ТСААСАТС
#3218/#3230 16 ССТАААСТ Подчеркнуто = несовпадение
#3219 17 С6ТААТСА Подчеркнуто = несовпадение
#3220 18 ТСАд1с!да1ааССТа 5' флуоресцентная метка (РАМ)
#3221 19 А6САСТТТ
#3222 20 АТТТ6САС
#3223 21 АдСадАСааТдТаСС 5' флуоресцентная метка (РАМ)
#3224 22 С1АдсСАдаТдТаОС 5' флуоресцентная метка (РАМ)
#3225 23 АТ6ТА6С
#3226 24 АСаАсСТасТаСсТС
#3227 25 АСТАССТС
#3228 26 СаС(дТСадСаС1ТТ
#3229 27 ТдСа1АСа(Т1СсАС
#3231 28 СТАСАСТ
#3232 29 ТАССТС
#3233 30 СТАССТС
#3234 31 ТМСТАССТС N = универсальное основание
#3235 32 ΤΝСТАССТС N = универсальное основание
#3236 33 ССаАсСТасТаСсТС
#3237 34 АСаАсСТссТаСсТС
#3238 35 АСаАаСТасТаСсТС
#3239 36 СТАССТС
#3240 37 СТААСТС
#3241 38 ТТАССАТТА
#3242 39 ССАТТАССАТТА
#3243 977 САС6АТТА6САТТА
#3244 978 6САТТА
#3245 979 АССАТТА
#3246 980 АТТАССАТТА
Заглавные и строчные буквы обозначают ЗНК и ДНК соответственно. Цитозинами в ЗНК предпочтительно являются метилцитозин/5'-метилцитозин*. Все межнуклеозидные связи предпочтительно являются фосфоротиоатными*. Все ЗНК могут быть, например, β-Ό-окси-ЗНК*.
* Используют в конкретных примерах.
Пример 2. Модель ίη νίίτο. Клеточная культура.
Действие ЗНК олигонуклеотидов на экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени (количество) можно
- 30 019939 тестировать на любом из многих типов клеток при условии, что нуклеиновая кислота-мишень присутствует в измеримых количествах. Мишень может экспрессироваться эндогенно или путем транзиторной или устойчивой трансфекцией нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную нуклеиновую кислоту.
Уровень экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени обычно можно определять путем, например, анализа нозерн-блоттинга (включающего нозерн-блоттинг микроРНК), количественной ПЦР (включающей микроРНК с.|ПЦР), анализа с защитой от рибонуклеазы.
В иллюстративных целях указаны следующие типы клеток, но обычно могут использоваться другие типы клеток при условии, что в выбранном типе клетки экспрессируется мишень.
Клетки культивировали в подходящей среде, как описано ниже, и сохраняли при 37°С, влажности 95-98% и 5% СО2. Клетки обычно пересевали 2-3 раза еженедельно.
15РС3: линия человеческих клеток рака предстательной железы. Линия 15РС3 была любезно предоставлена д-ром Р. Ваак, №иго7т1шдеи ЬаЬогаЮгу, АМС, Нидерланды, и культивирована в среде ЬМЕМ (81дта) + 10% эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС) + глутамакс I + гентамицин.
РС3: линия человеческих клеток рака предстательной железы РС3 была куплена в АТСС и культивирована в среде Соои Р12 с глутамином (С1Ьсо) + 10% ЭБС + гентамицин.
518А2: линия человеческих раковых клеток меланомы 518А2 была любезно предоставлена д-ром В. •Гаикеи (Секция экспериментальной онкологии, молекулярной фармакологии, отдел клинической фармакологии, Венский университет) и была культивирована в среде ЬМЕМ (81дта) + 10% эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС) + глутамакс I + гентамицин.
НеЬа: линию клеток цервикальной карциномы НеЬа культивировали в среде МЕМ (81дта), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку + гентамицин при 37°С, 95% влажности и 5% СО2.
МРС-11: клеточная линия крысиной множественной миеломы МРС-11 была куплена в АТСС и сохранилась в среде в ЬМЕМ с 4 мМ глутамакса + 10% лошадиной сыворотки.
Όυ-145: линия человеческих клеток рака предстательной железы Ии-145 была куплена в АТСС и сохранялась в среде КРМ1 с глутамаксом + 10% ЭБС.
КСС-4 +/-УНЬ: линию человеческих клеток рака почки КСС4, устойчиво трансфицированную плазмидой, экспрессирующей УНЬ, или пустой плазмидой, приобретали в ЕСАСС и сохраняли согласно инструкциям изготовителей.
786-0: клеточная линия человеческой карциномы почки 786-0 была куплена в АТСС и сохранялась согласно инструкциям изготовителей.
НиУЕС: линия эндотелиальной клетки пупочной вены человека НиУЕС приобретена в Сатсгех и сохранялась в среде ЕСМ-2.
К562: линия клеток человеческого хронического миелогенного лейкоза К562 была приобретена в ЕСАСС и сохранялась в среде КРМ1 с глутамаксом + 10% ЭБС.
и87МС: клеточная линия человеческой глиобластомы и87МР была приобретена в АТСС и сохранялась согласно инструкциям изготовителей.
В16: клеточная линия крысиной меланомы В16 была приобретена в АТСС и сохранялась согласно инструкциям изготовителей.
ЬЖ'ар: линия человеческих клеток рака предстательной железы ^NСар была куплена в АТСС и сохранялась в среде КРМ1 с глутамаксом + 10% ЭБС.
Ний-7: эпителиоподобные клетки человеческой печени культивировали в среде Игла МЕМ с 10% ЭБС, 2 мМ глутамакса I, 1х основной, но заменимой аминокислотой (ЗАК), с гентамицином 25 мкг/мл.
Ь428: (Оеи1ксйе 8атт1иид Гиг М1кгоогдашктеи (И8М, ВгаииксйМед, Германия)): клетки человеческой В-лимфомы сохраняли в среде 1640 КРМ1 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (РС8), Ь-глутамина и антибиотиков.
Ь1236: (Оеи1ксйе 8атт1иид Гиг М1кгоогдаи1ктеи (И8М, Вгаииксйте1ед, Германия)): клетки человеческой В-лимфомы сохраняли в среде 1640 КРМ1 с добавлением 10% РС8, Ь-глутамина и антибиотиков.
Пример 3. Конструирование библиотеки ЗНК анти-тЖ для всех человеческих последовательностей микроРНК в базе данных микроРНК тЖВаке.
Использовали 12 версию тЖВаке, как сообщается авторами СпЕГИйкЛоиек, 8., Сгососк, К.Ь, уаи Иоидеи, 8., Ва!етаи, А., Еилдй!, А.1 в издании 2006. тЖВаке: тюго№А кециеисек, 1агде(к аиб деие иотеис1а!иге. Шс1ею Ас1бк Кек. 34:Ό140-4, доступном на сайте ййр://т1сгогиа.каидег.ас.ик/кедиеисек/1ибех.кй1т1.
Табл. 1 показывает 7-, 8- и 9-мерные нуклеотидные последовательности, содержащие сидмерную последовательность микроРНК согласно базе данных микроРНК тЖВаке. Сидмерная последовательность содержит обратно комплементарную исходную область микроРНК. В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению имеет непрерывную нуклеотидную последовательность, выбираемую из 7-мерных, 8-мерных или 9-мерных последовательностей. В указанных 7-мерных, 8-мерных и 9мерных последовательностях в некоторых вариантах осуществления все межнуклеозидные связи являются фосфоротиоатными. Указанные 7-мерные, 8-мерные и 9-мерные нуклеотидные последовательности могут состоять из последовательностей нуклеотидных аналогов, согласно описанию в изобретении, например, из аналогов нуклеотидов ЗНК. Цитозины ЗНК могут представлять собой метилцитозин
- 31 019939 (5'метилцитозин). В некоторых вариантах осуществления ЗНК представляет собой β-Ό-окси-ЗНК.
Табл. 3 показывает список микроРНК, сгруппированных по их возможности быть мишенью для тех же самых сидмерных олигомеров, как 7-, 8- или 9-мерные последовательности по изобретению (см. табл. 1).
Таблица 3
Ьза-1е|-7э*, Ьза-1е1-7Г-1 ’
Ьза-1е1-7а, Иза-!е1-7Ь, 118а4е(-7с, |1эа-1е1-7с1, паа4е1-7!, кза-ггпК-ЭЙ, Ьза-1е1-7д, Ьаа4еЬ71
Ьза-гтРМ, Ьза-т1К-206
Иза-т|Р-103, Ьза-гтК-107
Ьза-т|К-10а, Ьза-гп|Н-10Ь
1теа-т!К-125Ь, Нза-гтиК-125а-5р
Ьза-гп|К-129*, Ьза-т1К-129-Зр
Ьза-т1К-130а, Иза-пМН-301 а, 113а-тп|Ц-130Ь, Ьза-т|Р-454, Ьза-т|К-301Ь
Ьза-т|К-133а, Нза-т!К-133Ь
Ьза-тШ-! 35а, 5за-т|К-135Ь
Ьва-тК-Ш, Ьза-т1Р-200а
Ьза-гтК-146а, Ьза-тК-146Ь-5р
Ьйа-ηιίΕΜ 52, Ьза-пп|'К-148Ь
Ьза-гп|К-154*, Ьза-гп1К-487а
Нза-т|Н-15а, ίΐ8β-σιϊΚ-16, Ьза-тгК-15Ь, Нзачп|Н-195, Ьза-тИЧ-497
(1за-т|Н-17, Ьза-т!Г4-20а, ЬзачтНК-93, Нза-т|К-106а, Ьза-тК-106Ь, Пза-т1К-20Ь, Ьза-тК-526Ь*
Ьза-тК-181а, Нза-т1Й-181с
Ьза-Щ|К-181Ь, Ьза-т|К-181с!
!>за-тК-18а, Нза-т1К-18Ь
Ьза-т|К-190, Иза-т!П-190Ь
Ьза-т1Р-192, Н$а-т1К-215
Ьза-тгР-196а, Ьза-т>К-196Ь
Ьза-т|Н-199а-Зр, Ьза-тй-199Ь-Зр
Ьза-т1К-199а-5р, Иза-т(Р-199Ь-5р
Ьза-т|К-19а*, пза-т|К-19Ь-Г, Ьза-т|К-19Ь-2*
йза-т1К-19а, Мза-т1Р-19Ь
Г|ЗачП|К-200Ь, Нза-тШ-200с
к8а-л11Н-204, Ιί&8“ΠίϊΡ·211
Ьза-тК-208а, Ьза-т|Н-208Ь
!зза-т|К-212,115а-т1Н-132
11за-пгиК-23а*, Иза-т1К-23Ь*
Ьза-тК-23а, Ьза-т|Е-23Ь, Нза-т|К-130а*
Ьза-тК-24-1 *, Нза-т1К-24-2*
Иза-тй-гэ, Ьза*т!К-92а, Ьза-тЖ-367, Нза-т|К-92Ь
Г|за-т|Н-26аг Мза-т|К-26Ь
11за-пп|Н-26а-1 *, Иза-т|К-26а-2*
Ьза-тК-27а, Иза~т(К-27Ь
Ьза-тй-29а, Ьза-тК-29Ь, пза-т1К-29с
пза-тК-302а, Нза-тК-302Ь, Мза-т|К-302с, Нза-т|К-302с1, Ьза-тК-373, |-гза-т1К-520е, Ьза-тгК520а-Зр, Иза-т1К-520Ь, Нза-т|К-520с-Зр, Нза-т1К-52СИ-Зр
пза-т|'А-302Ь*, Нза-т1К-302й*
Ьза-тК-30а*, Нза-гтК-ЗОсГ, Иза-птК-ЗОе*
!|за-т|К-30а, Иза-тК-ЗОс, Иза-тШ-ЗОс!, Нза-пМК-ЗОЬ, Ьза-тК-ЗОе
Ьза-щ|К-330-5р, Ьза-тй-326
Ьза-т1К-34а, Нза-т|К-34с-5р, Иза-|П|К-449а, Ъза-т1К-449Ь
Ьза-т|Н-382-Зр, Ьза-т К-329
11ба-т|К-374а, пза-тК-374Ь
Ьза-т|К-376а, пза-тК-376Ь
Ьза-тп1К-378, Ь8а-па!Н-422а
11за-т|К-379*, Ьза-т1К-411*
Ьза-т|К-381, пба-тК-ЗОО
Ьза-л1|Р-509-5р, Нза-1ТпЙ-509-3-5р
1тза-т1К-515-5р, ква-т|В-519е*
Ьза-тК-516Ь*, Кэа-т1К-516а-Зр
Кза-тК-517а, пза-т|К-517с
|пза-тК-518а-5р, !за-тК-527
Ьза-тК-518ί, Пза-тК-518Ь, пза-тК-518с, пза-т|К-518а-3р, Кза-тК-518д-3р
Ь5а’4п1Р*’519с-Зр, |15а>т'|К-519Ь-Зр, Нза-гтНК-519а
Ъза-т!К-519с-5р, Нза-т1К-519Ь-5р, Иза-тК-523*. Ьза-ппК-518Г, пза-т|К-526а, пза-пл|К-520с-
- 32 019939
Авторы создали 8-мерную ЗНК-анти-шЖ, нацеленную на Ш1Я-21, тЖ-155 и Ш1Е-122 (обозначенные в изобретении как микро-шЖ), которая является полностью ЗНК-модифицированной и фосфоротиолированной (см. фиг. 1 и табл. 6). Полученные результаты повторных экспериментов с клетками МСЕ-7, НеЬа, Κ.Λ\ν и Ний-7 с использованием люцифераза-чувствительной плазмиды для шЖ-21, тЖ-155 и тЖ-122 показывают, что полностью ЗНК-модифицированные короткие ЗНК-анти-шЖ являются высокоэффективными антагонистами микроРНК.
Таблица 4
Последовательности ЗНК апй-шЖ и пйего-тЖ и предсказанные Тт
5Е0Ю# микроРНК последовательность Тф Гс>
3204 ΓΠΪΒ-21 ТсА61СТ0аТаАдСТ 73
3205 ΘΑΤΑΑΘΟΤ 33
3206 ΓΠΪΙ4-155 ТсАсААНа Θ СА1Т А 63
3207 ТА6САТТА 45
4 т!Е-122 СсАНбТсаСаСЮС 73
3208 САСАСТСС 62
Заглавными буквами обозначены единицы ЗНК, такие как β-Ό-окси-ЗНК. Прописными буквами обозначены единицы ДНК. Межнуклеозидные связи являются предпочтительно фосфоротиоатными. Все цитозины ЗНК предпочтительно представляют собой метилированный/5-метилцитозин.
Температуру плавления Тт для зрелой последовательности микроРНК можно оценить, используя синтетический олигонуклеотид микроРНК (обычно состоящий из РНК-нуклеотидов с фосфодиэфирным скелетом). Обычно измеренные показатели Тт выше, чем предполагаемые Тт, при использовании ЗНКолигомеров против РНК-мишени.
Пример 4. Оценка антагонизма шЖ-21 с помощью 8Е0 ГО N0: 3205 ЗНК-анти-ш1Е в клетках МСЕ7 с использованием люцифераза-сенсорного анализа.
Чтобы оценить эффективность полностью ЗНК-модифицированного 8-мерного олигонуклеотида ЗНК-анти-тЖ (8Е0 ГО N0: 3205) в нацеливании и антагонизме к шЖ-21, создавали люциферазасенсорные конструкции, содержащие абсолютно соответствующий сайт-мишень для зрелой шЖ-21 и для контроля сайт-мишень с двумя мутациями в исходной области (фиг. 6). Для мониторинга ингибирования микроРНК-21 линии клеток МСЕ-7 карциномы молочной железы трансфицировали варьирующими концентрациями разных конструкций люцифераз вместе с шЖ-21 антагонистом 8Е0 ГО N0: 3205 по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-шЖ 8Е0 ГО N0: 3204 против Ш1Е-21. Через 24 ч измеряли активность люциферазы.
Результаты.
Как показано на фиг. 2, эффективность действия новой полностью ЗНК-модифицированной 8мерной ЗНК-анти-шЖ. (8Е0 ГО N0: 3205) в два раза выше по сравнению с 8Е0 ГО N0: 3204, что показано с помощью дерепрессии активности люциферазы. В отличие от этого, контрольная сенсорная конструкция шЖ-2 1 с двумя несоответствиями в исходной шЖ-2 1 не показывала дерепрессии активности люциферазы светлячка, что, таким образом, демонстрирует специфичность абсолютного соответствия шЖ21-сенсора в мониторинге активности шЖ-21 в клетках. Дерепрессия активности люциферазы с помощью 8-мерной ЗНК-анти-шЖ имеет явный дозозависимый характер, который не отмечен с 8Е0 ГО N0: 3204. Кроме того, эффективность действия нового 8-мера также намного выше при более низких дозах, чем 8ЕО ГО N0: 3204.
Заключение.
8-мерная ЗНК-анти-шЖ (8Е0 ГО N0: 3205) проявляет значительно улучшенный потенциал в ингибировании шЖ-21 ίη уйго по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-шЖ. 8Е0 ГО N0: 3204, нацеленной на ШЖ.-21.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линии клеток МСЕ-7 карциномы молочной железы приобретали в АТСС (#НТВ22™). Клетки МСЕ-7 культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х основной, но заменимой аминокислоты (ЗАК) и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 400000 клеток на лунку высевали в 6-луночные планшеты за 1 день перед трансфекцией, чтобы на следующий день получить конфлуэнтность 50-70%. В день трансфекции клетки МСЕ-7 были трансфицированы 0,8 мкг абсолютно соответствующей шЖ.-21/рыСНЕСК2, шЖ21.шш2/р§1СНЕСК2 или пустым вектором рыСНЕСК2 (додецилсульфат натрия 8Ό8 Ргошеда) вместе с 1
- 33 019939 мкл липофектамина 2000 (ΙηνίΐΓο^βη) согласно инструкциям изготовителя. Через 24 ч клетки собирали для люцифераза-сенсорного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали фосфатно-буферным раствором (ФБР) и собирали клеточным скребком, после чего клетки центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин. Удаляли супернатант и в клеточный дебрис добавляли 50 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда), после чего клетки оставляли на льду на 30 мин. Лизированные клетки центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 20 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили измерения с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 5. Оценка антагонизма т1.-21 с помощью 8ЕО ΙΌ N0: 3205 ЗНК-анти-тЖ в клетках НеЬа с использованием люцифераза-сенсорного анализа.
Чтобы дополнительно оценить эффективность полностью ЗНК-модифицированной 8-мерной ЗНКанти-тЖ (8ЕО ΙΌ N0: 3205) в нацеливании на тЖ-21, клетки линии НеЬа цервикальной карциномы также трансфицировали описанными выше конструкциями люциферазных сенсоров тЖ-21 вместе с 8ЕО ΙΌ N0: 3205 при варьирующих концентрациях, как описано в разделе выше (фиг. 3).
Результаты.
8Е0 ΙΌ N0: 3205 показывает полную дерепрессию конструкции люциферазного сенсора тЖ-21 в клетках НеЬа уже при 5 нМ по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 3204, которая не демонстрировала полной дерепрессии до наивысшей дозы (50 нМ). Дополнительно антагонизм к тЖ-21 у 8-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3205 ЗНК-анти-тЖ является дозозависимым. Чтобы показать специфичность тЖ-21 люцифераза-сенсорного анализа, несоответствующий сайт-мишень тЖ-21 (2 несоответствия в исходной области) также трансфицировали в клетки НеЬа, но дерепрессия активности люциферазы светлячка не выявлена.
Заключение.
Полностью ЗНК-модифицированная 8Е0 ΙΌ N0: 3205 проявляет значительно улучшенный потенциал в ингибировании тЖ-21 ίη νίΐτο и в клетках МСР-7, и в клетках НеЬа по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-тЖ 8ЕО ΙΌ N0: 3204.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НеЬа была куплена в ЕСАСС (№ 93021013). Клетки НеЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 60000 клеток на лунку высевали в 24-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НеЬа были трансфицированы 0,2 мкг абсолютно соответствующей тЖ-21/рыСНЕСК2, тЖ-21.тт2/р81СНЕСК2 или пустым вектором рк1СНЕСК2 вместе с 0,7 мкл липофектамина 2000 (ΙηνίΤτο^η) согласно инструкциям изготовителя. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и 100 мкл 1 х пассивного лизирующего буфера (Рготеда) добавляли в каждую лунку, после чего 24-луночные чашки помещали в орбитальный шейкер на 30 мин. Клетки собирали и переносили в микропробирку эппендорф, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 10 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили анализы с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 6. Оценка тЖ-155 антагонизма с помощью 8Е0 ΙΌ N0: 3207 ЗНК-анти-тЖ в мышиных клетках .Αν с использованием люцифераза-сенсорного анализа.
Чтобы ответить, способна ли полностью ЗНК-модифицированная 8-мерная ЗНК-анти-тЖ быть активным антагонистом для тЖ-155, абсолютно соответствующий сайт-мишень для тЖ-155 клонировали в такой же люциферазный вектор (р81СНЕСК2) и трансфицировали в мышиные лейкемические клетки моноцитарно-макрофагальной клеточной линии .Αν. Поскольку эндогенный уровень тЖ-155 в линии клеток .Αν является низким, клетки обрабатывали липополисахаридом (ЛПС) в дозе 100 нг/мл в течение 24 ч, чтобы индуцировать накопление тЖ-155.
Результаты.
Люциферазный анализ показал, что полностью ЗНК-модифицированная 8-мерная ЗНК-анти-тгК. 8Е0 ΙΌ N0: 3207, нацеленная на тЖ-155, обладала таким же антагонистическим эффектом к ш1В-155 по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-тЖ. 8Е0 ΙΌ N0: 3206 (фиг. 4). Также ЗНК-анти-тЖ проявляли дерепрессию люциферазного сенсора тЖ-155 >50% в концентрации 0,25 нМ и ингибировали тЖ-155 в зависимости от дозы.
Заключение.
Эти данные дополнительно подтверждают результаты по антагонизму тЖ-21, как показано в примерах 1 и 2, показывая, что полностью тиолированные 8-мерные ЗНК-анти-тЖ обладают высокоэффективным действием в нацеливании на микроРНК.
Материалы и способы.
Клеточная линия: клетки мышиного лейкоза .Αν макрофаги моноциты 264.7 были приобретены в АТСС (ΤΙΒ-71). Клетки .Αν культивировали в среде ΌΜΕΜ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 4 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
- 34 019939
Трансфекция: 500000 клеток на лунку высевали в 6-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день получить 50% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки КАА 264.7 были трансфицированы 0,3 мкг т1К-155 или пустым вектором р5|СИЕСК2 вместе с 10 мкл липофектамина 2000 (1пуЦгодеп) согласно инструкциям изготовителя. Для индукции накопления т1К-155 в клетки КАА добавляли ЛПС (100 нг/мл) после 4-часовой инкубации с трансфицирующими комплексами. Еще через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и собирали клеточным скребком, после чего клетки центрифугировали в течение 5 мин при 2500 об/мин. Удаляли супернатант и 50 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда) добавляли к клеточному дебрису, после чего клетки оставляли на льду на 30 мин. Лизированные клетки центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 20 мкл переносили в 96-луночный планшет и люциферазный тест проводили согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 7. Оценка т1К-122 антагонизма с помощью 8ЕО ΙΌ NО: 3208 ЗНК-анти-т1К в клетках Ηιιΐι7 с использованием люцифераза-сенсорного анализа.
Эффективность действия полностью модифицированной 8-мерной ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ NО: 3208 против т1К-122 оценивали в клетках Ηι.ι1ι-7 клеточной линии человеческой гепатомы. Клетки Ηι.ι1ι-7 были трансфицированы люциферазной сенсорной конструкцией, содержащей полностью совпадающий сайт-мишень т1К-122. Через 24 ч проводили люциферазный тест (фиг. 5).
Результаты.
Полностью ЗНК-модифицированная 8-мерная ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ NО: 3208 обладает более эффективным действием, чем 15-мерная ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ NО: 4, при низкой концентрации, что проявляется в дерепрессии люциферазного сенсора т1К-122. Обе ЗНК-анти-т1К ингибируют т1К-122 дозозависимым образом (фиг. 5).
Заключение.
Полностью ЗНК-модифицированная 8-мерная ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ NО: 3208, нацеленная на т1К122, показывает улучшенный потенциал в ингибировании т1К-122 ίη νίΙΐΌ.
Материалы и способы.
Клеточная линия: клеточная линия Ηι.ι1ι-7 человеческой гепатомы была любезно предоставлена К. ВаПещсЫадег, ^ίώ/^Γβ. Клетки Ηι.ι1ι-7 культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1 х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 8000 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь конфлуэнтности 50-70%. В день трансфекции клетки Ηι.ι1ι-7 были трансфицированы 57 нг т1К-122 или пустым вектором рбСИЕСК® вместе с 1 мкл липофектамина 2000 (ΙηνίϋΌ^η). Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: 50 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда) добавляли в каждую лунку, после чего 96-луночный планшет помещали в орбитальный шейкер на 30 мин. В каждую лунку добавляли тестовую систему для двойного люциферазного репортерного анализа (Рготеда) и проводили люциферазный анализ согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 8. Оценка т1К-21 антагонизма путем сравнения 8-мерной (8ЕО ΙΌ NО: 3205) и 15-мерной (8ЕО ΙΌ NО: 3204) ЗНК-анти-т1К в клетках человеческой карциномы предстательной железы (РС3).
Ранее авторы показали (патентная заявка 1051), что 8-мерная ЗНК-анти-т1К, полностью ЗНКмодифицированная и фосфоротиолированная, обладает способностью к полной дерепрессии уровня люциферазного репортера т1К-21 в клеточной линии человеческой цервикальной карциномы ИеКа и к частичной дерепрессии уровня люциферазного репортера т1К-21 в клеточной линии человеческой карциномы молочной железы МСГ-7. Позже авторы распространили такой скрининговый подход на клеточную линию человеческого рака предстательной железы РС3. Для оценки эффективности разных олигонуклеотидов ЗНК-анти-т1К против т1К-21 были созданы люциферазные репортерные конструкции, в которых абсолютно соответствующий сайт-мишень для зрелой т1К-21 и сайт-мишень с двумя несоответствиями в исходной области были клонированы в ген люциферазы Кеш11а 3'ИТК (фиг. 7). Для контроля ингибирования т1К-21 клетки РС3 подвергали трансфекции разными люциферазными конструкциями вместе с антагонистом тгК-21 (8-мерной) 8ЕО ΙΌ NО: 3205 и для сравнения с 15-мерной полностью совпадающей ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ NО: 3204 при варьирующих концентрациях. Через 24 ч измеряли активность люциферазы.
Результаты.
Исследования с люциферазным репортером показали зависимую от дозы дерепрессию активности люциферазного репортера т1К-21 с 15-мерной ЗНК-анти-т1К против т1К-21 (8ЕО ΙΌ NО: 3204). Вместе с тем, полная дерепрессия люциферазного репортера не была достигнута даже при самых высоких концентрациях (фиг. 7). Напротив, в клетках, которые были трансфицированы 8-мерной полностью ЗНКзамещенной ЗНК-анти-тгК, показана полная дерепрессия уже при 1 нМ, что указывает на значительно улучшенный потенциал по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-т1К. Контрольный люциферазный репортер, в котором скрывается ошибочный сайт-мишень для т1К-21, не подвергался воздействию ни одной
- 35 019939
ЗНК-анти-ш1В, что демонстрирует высокую специфичность обеих ЗНК-анти-ш1В.
Заключение.
Микромер обладает значительно более эффективным действием, чем 15-мерная ЗНК-анти-ш1В, в нацеливании на ш1К-21 и, таким образом, показывает наиболее мощный потенциал в клетках карциномы простаты.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток РС3 человеческой карциномы простаты была куплена в ЕСАСС (№ 90112714). Клетки РС3 культивировали в среде ΌΜΕΜ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 100000 клеток на лунку высевали в 12-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь 50% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки РС3 были трансфицированы 0,3 мкг ш1В-21 или пустым вектором р§1СНЕСК2 вместе с 1,2 мкл липофектамина 2000 (ЧпуЦгодеп) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-ш1В в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и добавляли в лунки 250 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Ргошеда). Планшеты помещали в шейкер на 30 мин, после чего клеточные лизаты переносили в микропробирку эппендорф. Клеточный лизат центрифугировали в течение 10 мин при 2500 об/мин, после чего 20 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили люциферазный анализ согласно инструкциям изготовителя (Ргошеда).
Пример 9. Оценка специфичности антагонизма ιηίΚ-21 с помощью 8-мерной ЗНК-анти-ш1В.
Для изучения специфичности короткой ЗНК-анти-ш1В настоящего изобретения, нацеленной на ш1В-21, авторы сконструировали 8-мерную несоответствующую контрольную ЗНК-анти-ш1В (8ЕО ΙΌ N0: 3218), содержащую 2 несоответствия в исходной последовательности распознавания (см. фиг. 8). Люциферазные репортерные конструкции, описанные в примере 1, трансфицировали в клетки линии человеческой цервикальной карциномы НеЬа вместе с ЗНК-несоответствующими контрольными олиго 8ЕО ΙΌ N0: 3218 и их эффективность сравнивали с 8-мерной ЗНК-анти-ш1В (8Е0 ΙΌ N0: 3205), которая нацелена на ш1В-21. Через 24 ч измеряли активность люциферазы.
Результаты.
Как показано на фиг. 8, трансфекция полностью ЗНК-модифицированной 8-мерной ЗНК-анти-шЖ. в клетках НеЬа приводила к полной дерепрессии люциферазного репортера ш1В-21 уже при 5 нМ. Напротив, при трансфекции клеток 8-мерным контрольным ЗНК-несоответствующим олиго, в сочетании с результатами, полученными с контрольным люциферазным репортером ш1В-21, имеющим два несоответствия в исходной ш1В-21, эти данные показывают высокую специфичность полностью ЗНК-замещенных 8-мерных ЗНК-анти-ш1В в нацеливании на ш1В-21 в клетках НеЬа. Анализ базы данных последовательностей микроРНК шЖВаке показал, что распознающая ш1В-21 последовательность ЗНК-анти-шЖ. 8Е0 ΙΌ N0: 3205 является уникальной для микроРНК-21. Вместе с тем, при уменьшении длины микромера до 7 нуклеотидов она теряет специфичность только для ш1В-21, поскольку а!й-ш1В-844, шши-ш1В-590-3р и йа8-ш1В-590-3р также являются мишенями.
Заключение.
Замена двух нуклеотидных позиций в пределах 8-мерной ЗНК-анти-ш1В на два несовпадающих нуклеотида полностью устраняет антагонизм ЗНК-анти-ш1В к ιηίΚ-21.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НеЬа была куплена в ЕСАСС (№ 93021013). Клетки НеЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 60000 клеток на лунку высевали в 24-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день получить 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НеЬа были трансфицированы 0,2 мкг абсолютно соответствующей ш1В-21/р81СНЕСК2, ш1В-21.шш2/р81СНЕСК2 или пустым вектором р§1СНЕСК2 вместе с 0,7 мкл липофектамина 2000 (ЗпуЦгодеп) согласно инструкциям изготовителя. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и в каждую лунку добавляли 100 мкл 1 х пассивного лизирующего буфера (Ргошеда), после чего 24-луночные чашки помещали в орбитальный шейкер на 30 мин. Клетки собирали и переносили в микропробирку эппендорф, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 10 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили анализы с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Ргошеда).
Пример 10. Оценка наиболее короткой возможной длины полностью ЗНК-модифицированной ЗНКанти-ш1В, которая содействует эффективному антагонизму ш1В-21.
Для дополнительного изучения требований к длине ЗНК-анти-шШ авторы сконструировали 7мерные и 6-мерные ЗНК-анти-ш1В, нацеленные на ш1В-21, а также полностью ЗНК-модифицированные и фосфоротиолированные олигонуклеотиды. Люциферазные репортерные конструкции ш1В-21 были трансфицировали в клетки НеЬа вместе с ЗНК-анти-ш1В при варьирующих концентрациях. Через 24 ч
- 36 019939 проводили люциферазные анализы.
Результаты.
Как показано на фиг. 9, указанная 7-мерная ЗНК-анти-т1К содействует дерепрессии люциферазной репортерной плазмиды Ш1К-21, но в меньшей степени, по сравнению с 8-мерной ЗНК-анти-т1К (8Е0 ГО N0: 3205). Тем не менее, еще сохраняется тенденция зависимости от дозы. В отличие от этого, 6-мерная ЗНК-анти-т1К не проявляет ингибирующее действие.
Заключение.
Самая короткая длина ЗНК-анти-т1К, способная содействовать ингибированию Ш1К-21, составляет 7 нуклеотидов. Вместе с тем, 7-мерная ЗНК-анти-т1К обладает меньшей активностью для Ш1К-21 по сравнению с 8-мерной ЗНК-анти-т1К.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НеЬа была куплена в ЕСАСС (№ 93021013). Клетки НеЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 60000 клеток на лунку высевали в 24-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день получить 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НеЬа были трансфицированы 0,2 мкг абсолютно соответствующей т1К-21/рз1СНЕСК2, т1К-21.тш2/р51СНЕСК2 или пустым вектором рз1СНЕСК2 вместе с 0,7 мкл липофектамина 2000 (1иуйгодеи) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-т1К в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и 100 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Ргошеда) добавляли в каждую лунку, после чего 24-луночные чашки помещали в орбитальный шейкер на 30 мин. Клетки собирали и переносили в микропробирку эппендорф, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 10 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили анализы с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Ргошеда).
Пример 11. Оценка длины полностью ЗНК-замещенных ЗНК-анти-т1К, являющихся антагонистами для Ш1К-21.
Далее авторы изучали эффект увеличения длины в полностью ЗНК-замещенных ЗНК-анти-т1К от 9-мерных до 14-мерных на антагонизм к Ш1К-21 в клетках НеЬа. Полученные ЗНК-анти-т1К были трансфицированы в клетки НеЬа вместе с Ш1К-21 люциферазными репортерными конструкциями (фиг. 10). Через 24 ч проводили люциферазный анализ.
Результаты.
У 9-мерной ЗНК-анти-т1К 8ЕО ГО N0: 3211 (9-мер) выявлена дозозависимая дерепрессия люциферазного репортера Ш1К-21, который не достигал полной дерепрессии, как показано для 7-мерной ЗНКанти-т1К (8ЕО ГО N0: 3210). Увеличение длины к 10-мерным к 14-мерным (8Е0 ГО N0: 3212, 8Е0 ГО N0: 3213 и 8Е0 ГО N0: 3214) приводило к уменьшению активности, что проявлялось в менее эффективной дерепрессии репортера Ш1К-21.
Заключение.
Как показано на фиг. 10, наиболее длинной, полностью ЗНК-модифицированной и фосфоротиолированной ЗНК-анти-т1К, у которой сохраняется способность к ингибированию Ш1К-21, является 9мерная ЗНК-анти-ш1К 8Е0 ГО N0: 3211. Вместе с тем, она явно менее эффективна, чем 7-мерные и 8мерные ЗНК-анти-т1К.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НеЬа была куплена в ЕСАСС (№ 93021013). Клетки НеЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1 х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 60000 клеток на лунку высевали в 24-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день получить 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НеЬа были трансфицированы 0,2 мкг абсолютно соответствующей ш1К-21/рз1СНЕСК2, ш1К-21.тш2/р51СНЕСК2 или пустым вектором рз1СНЕСК2 без сайта-мишени, вместе с 0,7 мкл липофектамина 2000 (1иуйгодеи) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-т1К в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и 100 мкл 1 х пассивного лизирующего буфера (Ргошеда) добавляли в каждую лунку, после чего 24-луночные чашки помещали в орбитальный шейкер на 30 мин. Клетки собирали и переносили в микропробирку эппендорф, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 10 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили анализы с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Ргошеда).
Пример 12. Определение наиболее оптимального положения 8-мерной ЗНК-анти-т1К в последовательности-мишени распознавания Ш1К.
Эксперименты настоящего изобретения показали, что наиболее эффективная полностью ЗНКмодифицированная фосфоротиолированная ЗНК-анти-т1К имеет длину 8 нуклеотидов. Для оценки наи
- 37 019939 более оптимального положения 8-мерной ЗНК-анти-шЖ в последовательности-мишени распознавания тЖ авторы сконструировали четыре разные полностью ЗНК-модифицированные 8-мерные ЗНК-антитЖ, поперечно накрытые зрелой последовательностью тЖ-21, как показано на фиг. 11. Разные ЗНКанти-тЖ были совместно котрансфицированы люциферазными репортерными конструкциями тЖ-21 в клетки НсЬа. Через 24 ч проводили анализы с люциферазой.
Результаты.
Единственной ЗНК-анти-тЖ, которая содействовала эффективному сайленсингу тЖ-21, что выявлено с люциферазным репортером, была 8Е0 ΙΌ N0: 3205, которая нацелена на исходную область тЖ21. Отсутствие эффекта показали все 8Ε0 ΙΌ N0: 3215, сконструированные для покрытия 3'-конца исходной области (50% нацеливание на исходную область), и также другие две ЗНК-анти-тЖ, 8Ε0 ΙΌ N0: 3216 или 8Ε0 ΙΌ N0: 3217, которые размещали с нацеливанием на области центра и 3'-конец зрелой тЖ-21 соответственно.
Заключение.
Только 8-мерная ЗНК-анти-тЖ, содействующая мощному сайленсингу тЖ-21, является нуклеиновой кислотой, нацеленной на исходную тЖ-21.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НсЬа была куплена в ЕСАСС (№ 93021013). Клетки НсЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 60000 клеток на лунку высевали в 24-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НсЬа были трансфицированы 0,2 мкг абсолютно соответствующей тЖ-21/р81СНЕСК2, тЖ,-21.тт2/р81СНЕСК2 или пустым вектором р§1СНЕСК2 вместе с 0,7 мкл липофектамина 2000 (1пу1!годсп) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-тЖ, в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и 100 мкл 1 х пассивного лизирующего буфера (Рготсда) добавляли в каждую лунку, после чего 24-луночные чашки помещали в орбитальный шейкер на 30 мин. Клетки собирали и переносили в микропробирку эппендорф, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 10 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили анализы с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Рготсда).
Пример 13. Подтверждение взаимодействия сайта-мишени тЖ-21 в Рйсй4-3'-иТВ и тЖ-21 с использованием 8-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3205 ЗНК-анти-тЖ.
Белок опухолевой супрессии Рйсй4 ингибирует индуцированную тканевым активатором плазминогена (ТРА) неопластическую трансформацию, распространение и развитие опухоли. Было также показано, что Рйсй4 подвергается ап-регуляции в апоптоз в ответ на разные индукторы. Кроме того, даунрегуляция Рйсй4 при раке легкого и раке ободочной и прямой кишки также связана с неблагоприятным прогнозом для больного. Недавно авторы Акапдаш с! а1. и Ргапкс1 с! а1. показали, что Рйсй4-3'-иТВ содержит консервативный сайт-мишень для тЖ.-21, и трансфекция клеток анти-тЖ-21 приводит к увеличению белка Рйсй4. Поэтому авторы сконструировали люциферазную репортерную плазмиду с находящимися в ней 313 нуклеотидами в 3'иТ.-области Рйсй4, охватывающей вышеупомянутый сайт-мишень тЖ-21, который был котрансфицирован вместе с разными ЗНК-анти-тЖ в клетки НсЬа. Разными ЗНК-анти-тЖ были: 8Е0 ΙΌ N0: 3205 (8-мерная, абсолютное соответствие) или 8Е0 ΙΌ N0: 3218 (8-мерная, несоответствующая). Через 24 ч проводили люциферазный анализ.
Результаты.
Как показано на фиг. 12, в клетках, трансфицированных люциферазным репортером Рйсй4-3'иТ. и 8Е0 ΙΌ N0: 3205, наблюдалось повышение активности люциферазы, что указывает на взаимодействие между Рйсй4-3'иТВ и тЖ-21. При этом не наблюдалось какого-либо ожидаемого изменения активности люциферазы при трансфекции клетки ошибочным соединением 8Е0 ΙΌ N0: 3218, поскольку это соединение не является антагонистом для тЖ.-21. При сравнении 8-мерных ЗНК-анти-тЖ с двумя более длинными сконструированными ЗНК-анти-тЖ, было выявлено значительно более эффективное действие у короткой, полностью ЗНК-модифицированной и фосфоротиолированной ЗНК-анти-тЖ, что подтверждает предыдущие данные анализов с люциферазой.
Заключение.
Из этих данных следует, что 8Е0 ΙΌ N0: 3205, являющаяся антагонистом для тЖ-21, может регулировать взаимодействие между Рйсй4-3'иТВ и тЖ-21.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НсЬа была куплена в ЕСАСС (№ 93021013). Клетки НсЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1 х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 60000 клеток на лунку высевали в 24-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день получить 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НсЬа были
- 38 019939 трансфицированы 0,2 мкг абсолютно соответствующей т1К-21/рк1СНЕСК2, т1Я-21.тт2/рк1СНЕСК2 или пустым вектором рк1СНЕСК2 вместе с 0,7 мкл липофектамина 2000 (Ιηνίΐτο^η) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-т1Я в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и 100 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда) добавляли в каждую лунку, после чего 24-луночные чашки помещали в орбитальный шейкер на 30 мин. Клетки собирали и переносили в микропробирку эппендорф, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 10 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили анализы с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 14. Сравнение 8-мерной ЗНК-анти-т1Я (8ЕО ГО N0: 3207) с 15-мерной ЗНК-анти-т1Я (8ЕО ГО N0: 3206) по антагонистическому действию на т1Я-155 в мышиных клетках ЯАУ.
Для изучения возможности адаптации подхода с использованием коротких ЗНК-анти-т1Я для нацеливания на другие миРНК авторы сконструировали полностью ЗНК-модифицированную 8-мерную ЗНКанти-т1Я против микроРНК-155. Абсолютно соответствующий сайт-мишень для т1Я-155 клонировали в 3'иТЯ гена люциферазы в репортерной плазмиде рк1СНЕСК2 и трансфицировали в мышиную клетку макрофаг линии ЯАУ вместе с 8-мерной или 15-мерной ЗНК-анти-т1Я. Учитывая низкий эндогенный уровень т1Я-155 в клеточной линии КАХУ, клетки обрабатывали ЛПС в дозе 100 нг/мл в течение 24 ч, чтобы индуцировать накопление т1Я-155. Через 24 ч проводили анализ с люциферазой.
Результаты.
Люциферазный анализ показал, что полностью ЗНК-модифицированная 8-мерная ЗНК-анти-т1Я 8Е0 ГО N0: 3207, нацеленная на т1Я-155, обладала таким же антагонистическим эффектом для т1Я-155 по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-тЖ. 8Е0 ГО N0: 3206 (фиг. 13). Обе ЗНК-анти-тЖ. демонстрировали >50% дерепрессию люциферазного сенсора т1Я-155 в концентрации 0,25 нМ и ингибировали т1Я155 в зависимости от дозы. По анализу базы данных последовательностей микроРНК тЖВаке выявлено, что последовательность распознавания тЖ.-155 из ЗНК-анти-т1Я 8Е0 ГО N0: 3207 является уникальной для микроРНК-155. Вместе с тем, с уменьшением длины ЗНК-анти-т1Я до 7 нуклеотидов она теряет специфичность только для т1Я-155, и тбу1-т|Я-М4 и ккйу-т1Я-К12-11 также становятся мишениями.
Заключение.
Полностью ЗНК-модифицированная и фосфоротиолированная 8-мерная ЗНК-анти-т1Я обладает одинаково эффективным антагонистическим действием для т1Я-155 по сравнению с 15-мерной ЗНКанти-т1Я со смешанной конструкцией ЗНК/ДНК. Таким образом, методика по настоящему изобретению с использованием короткой ЗНК-анти-т1Я может быть легко адаптирована для нацеливания на другие миРНК.
Материалы и способы.
Клеточная линия: клетки макрофаги мышиной клеточной линии ЯАУ 264.7 были приобретены в АТСС (Т1В-71). Клетки ЯАУ культивировали в среде ЭМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 4 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 500000 клеток на лунку высевали в 6-луночные планшеты за день перед трансфекцией, чтобы достичь 50% конфлуэнтности на следующий день. В день трансфекции клетки ЯАУ 264.7 трансфицировали 0,3 мкг абсолютно соответствующей тЖ.-155/рк1СНЕСК2 или пустым вектором рк1СНЕСК2 вместе с 10 мкл липофектамина 2000 (ЧпуЦгодеп) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-т1Я в разных концентрациях. Для индукции накопления ιηίΡ-155 к клеткам ЯАУ добавляли ЛПС (100 нг/мл) после 4 ч инкубации с трансфицирующими комплексами. Еще через 24 ч клетки собирали для анализов с люциферазой.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и собирали клеточным скребком, после чего клетки центрифугировали в течение 5 мин при 2500 об/мин. Удаляли супернатант и 50 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда) добавляли к клеточному дебрису, после этого клетки оставляли на льду на 30 мин. Лизированные клетки центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 20 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили тесты с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 15. Оценка уровней белка с/ЕВРВ как функционального показателя антагонизма т1Я-155 с помощью короткой ЗНК-анти-т1Я (8Е0 ГО N0: 3207).
Авторы определяли уровни новой мишени т1Я-155, белка с/ЕВРВ в качестве функционального показателя антагонизма тЖ.-155 с помощью короткой ЗНК-анти-т1Я (8Е0 ГО N0: 3207). Клетки макрофаги мышиной клеточной линии ЯАУ трансфицировали вместе с какой-либо из 8-мерных (8Е0 ГО N0: 3207) или 15-мерных (8Е0 ГО N0: 3206) ЗНК-анти-т1Я при отсутствии или наличии рге-т1Я-155. В качестве контроля несоответствия для 15-мерных последовательностей использовали 8Е0 ГО N0: 4, которая нацелена на т1Я-122, и для 8-мерной использовали 8Е0 ГО N0: 3205, нацеленную на т1Я-21. Указанные две контрольные миРНК не регулируют уровни экспрессии с/ЕВР[Б Для индукции накопления т1Я-155 добавляли ЛПС и через 16 ч с ЛПС клетки собирали. Белок с/ЕВРВ имеет три изоформы: ингибитор транскрипции БГР, активаторы транскрипции БАР и БАР*, которые обнаруживали с помощью вес
- 39 019939 терн-блоттинга, и эти же мембраны повторно исследовали с β-тубулином в качестве контроля введения. Результаты.
Вычисляли соотношения с/ЕВРВ ЫР и β-тубулина, как обозначено на фиг. 14. Во всех клетках Κ.Λ\ν. трансфицированных 15-мерной ЗНК-анти-т1К и не трансфицированных рге-т1К-155, были выявлены равные уровни с/ЕВРВ ЫР/β-тубулина, благодаря ингибированию ιηίΡ-155 повышались уровни с/ЕВРВ ЫР (фиг. 14, слева). Для сравнения, трансфекция рге-т1К-155 в клетки ΚΑν приводила к ожидаемому уменьшению уровня с/ЕВРВ ЫР, если мишенью для т1К-155 был с/ЕВРВ, как показано в строках с белковыми экстрактами из клеток ΚΑν, которые не обрабатывались ЗНК или несоответствующей последовательностью. Вместе с тем, в белковых экстрактах из клеток ΚΑν, трансфицированных ЗНКанти-т1К против т1К-155, выявлено повышение уровня с/ЕВРВ ЫР. Аналогичные эксперименты проводили с 8-мерной ЗНК-анти-т1К-155 (БЕР ГО N0: 3207), и согласно фигуре 14 (справа) были получены результаты, сопоставимые с результатами 15-мерной ЗНК-анти-т1К БЕР ГО N0: 3206.
Заключение. Антагонизм к т1К-155 с использованием или 8-мерной, или 15-мерной ЗНК-анти-т1К приводит к дерепрессии прямой мишени с/ЕВРВ.
Материалы и способы.
Клеточная линия: клетки макрофаги мышиной клеточной линии ΚΑν 264.7 были приобретены в АТСС (ΤΙΒ-71). Клетки ΚΑν культивировали в среде ΌΜΕΜ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 4 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 500000 клеток на лунку высевали в 6-луночные планшеты за день перед трансфекцией, чтобы достичь 50% конфлуэнтности на следующий день. В день трансфекции клетки ΚΑν 264.7 трансфицировали 5 нмоль рге-тЖ.-ЫЗ (ЛтЫоп) и/или 5 нМ ЗНК-анти-тЖ. вместе с 10 мкл липофектамина 2000 (ЗпуЦгодеп) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-тЖ. в разных концентрациях. Для индукции накопления ιηίΚ-155 к клеткам ΚΑν добавляли ЛПС (100 нг/мл) после 4 ч инкубации с трансфицирующими комплексами. Через 16 ч клетки собирали для экстракции белка и анализа вестерн-блотттинг.
Анализ вестерн-блотттинг: клетки промывали ФБР, трипсинизировали, переносили в микропробирку эппендорф и добавляли 250 мкл лизирующего буфера (ΙχΚΙΕΑ). Клеточный лизат оставляли на льду в течение 20 мин, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Концентрацию белка измеряли с помощью Соотакае Р1н5 согласно инструкциям изготовителя, и 80 мкг вводили в 4-12% В1Б-ТР1Б гель. Мембрану инкубировали в течение ночи при 4°С с первичным моноклональным мышиным антителом С/ЕВРВ (Бан1а-Сгнх) в концентрации 1:100. Иммунореактивные полосы визуализировали с помощью ЕСЬ Р1н5 (АтегеНат).
Пример 16. Антагонизм к пнР-106Ь у полностью ЗНК-модифицированной 8-мерной (БЕР ГО N0: 3221) ЗНК-анти-т|Р.
Для подтверждения возможности адаптации методики по изобретению с использованием короткой ЗНК-анти-тгР. для нацеливания на другую миРНК авторы сконструировали полностью ЗНКмодифицированную 8-мерную ЗНК-анти-ιηίΚ против микроРНК-106Ь. Абсолютно соответствующий сайт-мишень для т|Р-106Ь клонировали в ген люциферазы 3'υΤΚ в векторе (р§1СНЕСК2) и трансфицировали в клетки линии НеЬа человеческой цервикальной карциномы вместе с короткой ЗНК-анти-шЖ. (БЕР ГО N0: 3221) или с 15-мерной ЗНК-анти-тЖ. (БЕР ГО N0: 3228) в разных концентрациях. Через 24 ч проводили анализы с люциферазой.
Результаты.
Трансфекция 8-мерных ЗНК-анти-тЖ. БЕР ГО N0: 3221, нацеленных на ш1В-106Ь, приводила к дозозависимому ингибированию ιηίΚ-106Κ что демонстрируется дерепрессией люциферазного репортера, который подвергался полной дерепрессии при концентрации ЗНК-анти-тЖ. 1 нМ (фиг. 15). Сопоставимые результаты были получены с использованием 15-мерной ЗН^а^и-ттИ БЕР ГО N0: 3228, что показывает сходную эффективность 8-мерной и 15-мерной ЗНК-анти-ιηίΚ.
Заключение.
Нацеливание на ниР-106Ь в клетках НеЬа демонстрирует одинаковую эффективность 8-мерной полностью ЗНК-модифицированной и фосфоротиолированной ЗНК-анти-ιηίΚ и 15-мерной ЗНК-антиιηιΚ со смесью ЗНК/ДНК нуклеотидов.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НеЬа была куплена в ЕСАСС (№ 93021013). Клетки НеЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 5200 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НеЬа были трансфицированы 57 нг абсолютно соответствующей ш^Κ-21/р8^СНΕСК2, ш|Р-21.шш2/р5|СНЕСК2 или пустым вектором р§1СНЕСК2 вместе с 0,14 мкл липофектамина 2000 (1пуйгодеп) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-ш^Κ в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
- 40 019939
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и в каждую лунку добавляли З0 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда), после чего 24-луночные планшеты помещали в орбитальный шейкер на З0 мин. Клетки собирали и переносили в микропробирку эппендорф, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение З0 мин, после чего 10 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили анализы с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 17. Антагонизм к т1К-19а у полностью ЗНК-модифицированной 8-мерной (8ЕО ΙΌ ΝΟ: З222) ЗНК-анти-т1К.
Для подтверждения возможности адаптации методики по изобретению с использованием короткой ЗНК-анти-т1К для нацеливания на другие миРНК авторы сконструировали полностью ЗНКмодифицированную 8-мерную ЗНК-анти-т1К против микроРНК-19а. Абсолютно соответствующий сайтмишень для т1К-19а клонировали в ген люциферазы З'ИТК в векторе (рыСНЕСК2). Репортерная плазмида была трансфицирована в клетки линии НеЬа человеческой цервикальной карциномы вместе с разными концентрациями короткой ЗНК-анти-т1К (8ЕО ΙΌ ΝΟ: З222) или 15-мерной ЗНК-анти-т1К (8ЕО ΙΌ ΝΟ: З229), которые нацелены на т1К-19а. Через 24 ч проводили анализы с люциферазой.
Результаты.
Согласно фиг. 16, трансфекция 15-мерных ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ ΝΟ: З229 в клетки НеЬа обладает антагонистическим эффектом на т1К-19а, что проявляется в полной дерепрессии при концентрации ЗНК-анти-т1К 1 нМ. Для сравнения, трансфекция 8-мерной ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ ΝΟ: З222 приводила к эффективному антагонизму к т1К-19а уже в концентрации 0,5 нМ, что указывает, по меньшей мере, на одинаково эффективное действие указанной 8-мерной ЗНК-анти-т1К по сравнению с 15-мерной ЗНКанти-т1К в клетках НеЬа.
Заключение.
Нацеливание на т1К-19а в клетках НеЬа демонстрирует одинаковую эффективность 8-мерной полностью ЗНК-модифицированной и фосфоротиолированной ЗНК-анти-т1К и 15-мерной ЗНК-анти-т1К со смесью ЗНК/ДНК нуклеотидов.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НеЬа была куплена в ЕСАСС (№ 9З02101З). Клетки НеЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1 х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 5200 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НеЬа трансфицировали 57 нг абсолютно соответствующей т1К-21/р81СНЕСК2, т1К-21.тт2/р81СНЕСК2 или пустым вектором р§1СНЕСК2 вместе с 0,14 мкл липофектамина 2000 (ЧпуЦгодеп) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-т1К в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и в каждую лунку добавляли З0 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда), после чего 24-луночные планшеты помещали в орбитальный шейкер на З0 мин. Клетки собирали и переносили в микропробирку эппендорф, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение З0 мин, после чего 10 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили анализы с люциферазой согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 18. Нацеливание на семейство микроРНК с использованием короткой полностью ЗНКзамещенной ЗНК-анти-т1К.
В дальнейшем авторы изучали возможность нацеливания на семейство микроРНК, используя единственную короткую 7-мерную ЗНК-анти-т1К, комплементарную для исходной последовательности, которая является общей для всех членов семейства (см. фиг. 17). В этом эксперименте авторы изучали т1К221 и т1К-222, которые сверхэкспрессируются в солидных опухолях ободочной кишки, поджелудочной железы, предстательной железы и желудка. Также было показано, что наиболее выраженная апрегуляция микроРНК в мультиформной глиобластоме осуществляется т1К-221 и т1К-222. Кроме того, сверхэкспрессия т1К-221 и т1К-222 может способствовать росту и прогрессированию карциномы предстательной железы, по меньшей мере частично, посредством блокады белка опухолевой супрессии р27. Абсолютно соответствующий сайт-мишень и для т1К-221, и для т1К-222, соответственно, был клонирован в ген люциферазы З'ИТК, при этом получали две репортерные конструкции. Затем указанные конструкции трансфицировали или отдельно, или совместно в клетки линии РСЗ карциномы предстательной железы. В дополнение к 7-мерной ЗНК-анти-т1К, мишенью для которой является и т1К-221, и т1К-222, авторы также котрансфицировали 15-мерную ЗНК-анти-т1К (15-мерную), нацеленную как на т1К-221 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: З22З), так и на т1К-222 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: З224), каждая из которых трансфицировалась отдельно или совместно (см. фиг. 18, слева).
Результаты.
Как показано на фиг. 18, трансфекция РСЗ-клеток ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ ΝΟ: З22З, нацеленных на т1К-221, приводила к эффективному ингибированию т1К-221 в концентрации ЗНК-анти-т1К 1 нМ. Ингибирующий эффект также наблюдался при использовании люциферазной репортерной плазмиды для
- 41 019939 ιηίΚ-222, а также при одновременной котрансфекции в клетки РСЗ обоих люциферазных репортеров для ιηίΚ-221 и ιηίΚ-222. Такой ингибирующий эффект наиболее вероятно обусловлен общей исходной последовательностью у ιηίΚ-221 и ιηίΚ-222. Аналогично, трансфекция РСЗ-клеток ЗНК-анти-ιηίΚ ЗЕЦ ΙΌ N0: З22 4, нацеленных на ιηίΚ-222, приводила к эффективному ингибированию ιηίΚ-222 в концентрации ЗНК-анти-ιηίΚ 1 нМ, что проявлялось в полной дерепрессии люциферазного репортера для ιηίΚ-222. Ингибирующий эффект также наблюдался при использовании люциферазной репортерной плазмиды для ιηίΚ-222, а также при одновременной котрансфекции в клетки РСЗ обоих люциферазных репортеров для ιηίΚ-221 и ιηίΚ-222. Котрансфекция обоих соединений ЗНК-анти-ιηίΚ: ЗЕЦ ΙΌ N0: З22З и ЗЕЦ ΙΌ N0: З224, нацеленных на ηίΚ-221 и ιηίΚ-222, соответственно (см. фиг. 18, слева), приводила к эффективному ингибированию обеих миРНК, что проявлялось в полной дерепрессии люциферазных репортерных плазмид, как при раздельной трансфекции, так и при котрансфекции в клетки РСЗ. Интересно, что трансфекция в клетки РСЗ единственной полностью ЗНК-модифицированной 7-мерной ЗНК-анти-ιηίΚ (ЗЕЦ ΙΌ N0: З225), нацеленной на исходную последовательность ιηίΚ-221 и ιηίΚ-222, приводила к антагонистическому дозозависимому действию на ιηίΚ-221 и ιηίΚ-222 одновременно, что проявляется в полной дерепрессии люциферазных репортерных плазмид, как при раздельной трансфекции, так и при котрансфекции в клетки РСЗ. Этим показано, что единственная, короткая ЗНК-замещенная ЗНК-анти-ιηίΚ может эффективно воздействовать на исходные последовательности-мишени, таким образом, являясь антагонистом одновременно для всех семейств микроРНК. Анализ базы данных последовательности микроРНК ιηίΚΒαδο показал, что исходная последовательность распознавания ιηίΚ-221/222 из ЗНК-анти-ιηίΚ ЗЕЦ ΙΌ N0: З225 является уникальной для обеих миРНК.
Заключение.
Полученные результаты показывают, что ЗНК дает возможность конструировать и синтезировать короткие полностью ЗНК-замещенные олигонуклеотиды ЗНК-анти-ιηίΚ, которые могут эффективно воздействовать на исходные последовательности микроРНК-мишени, таким образом проявляя антагонистический эффект одновременно для всех семейств микроРНК.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток РСЗ человеческой карциномы предстательной железы была куплена в ЕСАСС (№ 90112714). Клетки РСЗ культивировали в среде ΌΜΕΜ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 100000 клеток на лунку высевали в 12-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь 50% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки РСЗ были трансфицированы 0,З мкг люциферазной репортерной плазмидой для ιηίΚ-221 или ιηίΚ-222, или пустым вектором р81СНЕСК2 без контрольного сайта-мишени ιηίΡΗΚ, вместе с 1,2 мкл липофектамина 2000 (Ιηνίΐτο^βη) согласно инструкциям изготовителя. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и добавляли в лунки 250 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рюшс^а). Планшеты помещали в шейкер на З0 мин, после чего клеточные лизаты переносили в микропробирку эппендорф. Клеточный лизат центрифугировали в течение 10 мин при 2500 об/мин, после чего 20 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили люциферазный анализ согласно инструкциям изготовителя (Рюшс^а).
Пример 19. Оценка уровня белка р27 как функционального показателя антагонизма к семейству ιηίΚ-221/222 у 7-мерной ЗЕЦ ΙΌ N0: З225 ЗНК-анти-ιηίΚ.
По данным предшествующих работ (Ье Заде с1 а1. 2007, Са1атб1 с1 а1. 2007) ιηίΚ-221 и ιηίΚ-222 являются посттранскрипционными регуляторами экспрессии гена опухолевой супрессии р27, который вовлечен в регуляцию клеточного цикла. В этих исследованиях было показано, что понижающая регуляция ιηίΚ-221 и ιηίΚ-222 повышает уровень экспрессии р27. В этой связи авторы определяли уровни белка р27 после трансфекции ЗНК-анти-ιηίΚ ЗЕЦ ΙΌ N0: З225 в клетки РСЗ в качестве функционального показателя антагонизма к семейству ιηίΚ-221/222 у 7-мерной ЗЕЦ ΙΌ N0: З225 ЗНК-анти-ιηίΚ и проводили сравнение с 8-мерной контрольной несоответствующей ЗНК. Через 24 ч клетки собирали для анализа вестерн-блоттинг (фиг. 19).
Результаты.
Как показано на фиг. 19, трансфекция 7-мерной ЗНК-анти-ιηίΚ ЗЕЦ ΙΌ N0: З225, нацеленной на исходную последовательность в ιηίΚ-221 и ιηίΚ-222, приводила к дозозависимому повышению уровня белка р27, по сравнению несоответствующей ЗНК как с нетрансфицированными, так и с трансфицированными контрольными клетками РСЗ. Эти результаты отчетливо демонстрируют, что 7-мерная ЗНК-антиιηίΚ способна быть эффективным антагонистом для семейства ιηίΚ-221/222, что приводит к дерепрессии прямой мишени р27 по содержанию белка.
Заключение.
Полностью ЗНК-модифицированная 7-мерная ЗНК-анти-ιηίΚ, нацеленная на исходную последовательность в семействе ιηίΚ-221/222, является эффективным антагонистом для обеих миРНК, что приводит к дерепрессии прямой мишени р27 по содержанию белка.
- 42 019939
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток РС3 человеческой карциномы простаты была куплена в ЕСАСС (№ 90112714). Клетки РС3 культивировали в среде ΌΜΕΜ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: высевали 250000 клеток на лунку в 6-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы достичь 50% конфлуэнтности на следующий день. В день трансфекции клетки РС3 трансфицировали ЗНК-анти-т1Я в разных концентрациях с липофектамином 2000. Клетки собирали через 24 ч для экстракции белка и анализа вестерн-блоттинг.
Вестерн-блоттинг: клетки промывали ФБР, трипсинизировали, переносили в микропробирку эппендорф и добавляли 250 мкл лизирующего буфера (ΙχΚΙΡΑ). Клеточный лизат оставляли на льду в течение 20 мин, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Концентрацию белка измеряли с помощью ί'οοιηαδδίο Ρ1ιΐ5 согласно инструкциям изготовителя и 100 мкг вводили в 4-12% гель В18-ТЯ18. Мембрану инкубировали в течение ночи при 4°С с первичным моноклональным мышиным антителом р27 (ΒΌ Βίοδοίοηοοδ) в разведении 1:1000. Иммунореактивные полосы визуализировали с помощью ЕСЬ Ρ1η5 (Атегкйат).
Пример 20. Показатели температуры плавления (Тт) дуплекса ЗНК-анти-тгЯ
В табл. 5 показан рост показателей Тт с увеличением длины коротких полностью модифицированных ЗНК-анти-пнЯ (см. показатели Тт для 8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 3205, 8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 3209-3214 в табл. 7). Самый оптимальный ингибирующий эффект достигался с 8-мерной ЗНК-анти-тгЯ 8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 3205, нацеленной на т|Я-21, при этом наиболее вероятно, что очень низкая Тт 6-мерной 8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 3209 не была достаточной для достижения антагонизма к т|Я-21-мишени. С другой стороны, наращивание длины больше 10-меров (8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 3212) значительно повышает Тт с одновременным уменьшением ингибирующей активности, что определяется с использованием люциферазного репортера т|Я-21, что наиболее вероятно благодаря большой предрасположенности полностью модифицированных 12- и 14-мерных ЗИК-анти-ипЯ к образованию гомодимеров. В экспериментах с полностью ЗНК-модифицированными 8мерными ЗНК-анти-11иЯ с использованием скользящего окна через последовательность распознавания 11иЯ-21 ясно показано, что, в дополнение к адекватным показателям Тт ЗНК-анти-т|Я, исходная область является наиболее важной для функции миРНК и, таким образом, самой оптимальной областью, которая будет мишенью для ЗНК-анти-т1Я.
Таблица 5 Значения Тт для т|Я-21 ЗНК-анти-т|Я, измеряемые против комплементарного олигонуклеотида РНК
2ЕО Ю № микроРНК длина (η ο пар оснований} Π оследовател ьность Показатели Тт (РНК) °с
3205 ΓΠΪΡ-21 8 5'- ОАТААССТ -3’ 64,0
3209 ιτήΡ-21 6 5’-ТААОСТ -3’ 32,0
3210 т/Р-21 7 5'- АТААОСТ -3’ 45,0
3211 πίιΡ-21 9 5’- ТСАТААСЗСТ -3’ 65,0
3212 γπιΡ-21 10 5'- СТСАТААОСТ -3’ 63,0
3213 ΓΠίΡ-21 12 5'- 6ТСТСАТАА6СТ -3’ 86,8
3214 ΓΠίΡ-21 14 5’- САСТСТбАТААОСТ -3' 89,9
3215 γπΙΡ-21 8 5'-ТСТСАТАА - 3' 56,0
3216 ΓΠίΡ-21 8 5' АТСАОТСТ - 3 72,0
3217 ΦίΡ-21 8 5'-ТСААСАТС - 3 48,0
Заключение.
Показатели Тт наряду с экспериментальными данными, полученными с люциферазными репортерами, показывают, что эффективное антагонистическое действие ЗНК-анти-т1Я зависит не только от Тт, но также зависит от расположения ЗНК-анти-т1Я в последовательности распознавания микроРНК.
Материалы и способы.
Измерения Тт: олигонуклеотиды: дуплексы пнЯ-21 РНК разводили до 3 мкМ в 500 мкл безводной РНКазы и смешивали с 500 мкл 2хТт буфер (200 мМ КаС1, 0,2 мМ ЭДТА, 20 мМ ^-фосфата, уровень рН 7,0). Раствор нагревали до 95°С в течение 3 мин и затем оставляли остывать до комнатной температуры (КТ) в течение 30 мин. Температуру плавления (Тт) дуплекса измеряли с помощью спектрофотометра ЬатЬба 40 иУ/У!8, оборудованного температурным программатором БеШет ΡТΡ6, и использовали программное обеспечение РЕ Тетр1аЬ (Гегкт Е1тег). Температура колебалась в диапазоне от 20 до 95°С и затем снижалась до 25°С, с регистрацией абсорбции при 260 нм. Для оценки температуры плавления дуплекса использовали первую производную и локальные максимумы таяния и отжига.
Пример 21. Оценка антагонизма пнЯ-21 посредством сравнения 8-мерной (8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 3205) и 15мерной (8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 3204) ЗНК-анти-т|Я в клеточной линии человеческих гепатоцитов НерС2.
Выше в настоящем описании авторы показали, что 8-мерная ЗНК-анти-тШ, которая представляет собой полностью модифицированную и фосфоротиолированную ЗНК, является эффективным антагонистом к пнЯ-21 в клеточной линии НеЬа человеческой цервикальной карциномы, клеточной линии МСР-7
- 43 019939 человеческой карциномы молочной железы и клеточной линии РС3 человеческого рака предстательной железы. Авторы распространили такой скрининговый подход на клеточную линию НерС2 человеческого гепатоцеллюлярного рака. Для оценки эффективности антагонизма 8-мерного олигонуклеотида ЗНКанти-тЖ к тЖ-21 создавали люциферазные репортерные конструкции, в которых абсолютно соответствующий сайт-мишень для зрелой тЖ-21 был клонирован в ген люциферазы ВеиШа 3'ИТВ. Для контроля ингибирования тЖ-21 клетки НерС2 трансфицировали люциферазными конструкциями вместе с антагонистом тЖ-21 (8-мерной) 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205 и для сравнения специфичности с 8-мерной несоответствующей ЗНК-анти-тЖ (8Е0 ΙΌ N0: 3218), и для сравнения активности вместе с 15-мерной (8Е0 ΙΌ N0: 3204), при разных концентрациях. Через 24 ч измеряли активность люциферазы.
Результаты.
Эксперименты с люциферазным репортером выявили дозозависимую дерепрессию активности люциферазного репортера тЖ-21 у 15-мерной ЗНК-анти-тЖ, нацеленной на тЖ-21 (8ЕЭ ΙΌ N0: 3204). Вместе с тем, полная дерепрессия люциферазного репортера не была достигнута даже при более высоких концентрациях (фиг. 20). Напротив, в клетках, трансфицированных 8-мерной полностью ЗНКмодифицированной ЗНК-анти-тЖ (8ЕЭ ΙΌ N0: 3205), обнаружена полная дерепрессия уже при 5 нМ, что указывает на значительно улучшенный потенциал по сравнению с 15-мерной ЗНК-анти-тЖ. Сравнение специфичности 8-мерной абсолютно соответствующей и 8-мерной несоответствующей последовательности показало полное отсутствие дерепрессии у несоответствующей ЗНК-анти-тЖ (8ЕЭ ΙΌ N0: 3218), что демонстрирует высокую специфичность композиции ЗНК-анти-тЖ, нацеленной на тЖ-21.
Заключение.
8-Мерная ЗНК-анти-тЖ (8ЕЭ ΙΌ N0: 3205) является более эффективным антагонистом, чем 15мерная ЗНК-анти-тЖ, к тЖ-21, и антагонистическое действие 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205 на тЖ-21 является специфичным.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток НерС2 человеческого гепатоцеллюлярного рака была куплена в ЕСАСС (№ 85011430). Клетки НерС2 культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 650000 клеток на лунку высевали в 6-луночный планшет для проведения обратной трансфекции. Клетки НерС2 трансфицировали 0,6 мкг тЖ-21 или пустым вектором рк1СНЕСК2 вместе с 2,55 мкл липофектамина 2000 Циуйгодеи) согласно инструкциям изготовителя. Трансфицировали также ЗНК-анти-тЖ в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и добавляли в лунки 300 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда). Планшеты помещали в шейкер на 30 мин, после чего клеточные лизаты переносили в микропробирку эппендорф. Клеточный лизат центрифугировали в течение 10 мин при 2500 об/мин, после чего 50 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили люциферазный анализ согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 22. Подтверждение взаимодействия сайта-мишени тЖ-21 в Рбсб4-3'-ИТВ и тЖ-21 с использованием 8-мерной 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205 ЗНК-анти-тЖ в клетках Ний-7 человеческой гепатоцилюлярной клеточной линии.
Белок опухолевой супрессии Рбсб4 ингибирует распространение и развитие опухоли. Кроме того, даунрегуляция Рбсб4 при раке легкого и раке ободочной и прямой кишки также связана с неблагоприятным прогнозом для больного. Недавно авторы Акаидаш е! а1. и Ргаике1 е! а1. показали, что Рбсб4-3'-ИТВ содержит консервативный сайт-мишень для тЖ-21, и трансфекция клеток анти-тЖ-21 приводит к увеличению белка Рбсб4. Поэтому авторы сконструировали люциферазную репортерную плазмиду с находящимися в ней 313 нуклеотидами в 3'ИТВ-области Рбсб4, охватывающей вышеупомянутый сайтмишень шЖ-21, который котрансфицировали вместе с разными ЗНК-анти-тЖ в клетки НеЬа. Разные ЗНК-анти-тЖ представляли собой: 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205 (8-мерная, абсолютное соответствие), 8ЕЭ ΙΌ N0: 3218 (8-мерная, несоответствующая) и 8ЕЭ ΙΌ N0: 3204 (15-мерная, миксмер ДНК/ЗНК). Через 24 ч проводили люциферазный анализ.
Результаты.
Как показано на фиг. 21, в клетках, трансфицированных люциферазным репортером Рбсб43'ИТВ и 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205, наблюдалось повышение активности люциферазы, что указывает на взаимодействие между Рбсб4 3'ИТВ и тЖ-21. При этом не наблюдалось какого-либо ожидаемого изменения активности люциферазы при трансфекции клетки ошибочным соединением 8ЕЭ ΙΌ N0: 3218, поскольку это соединение не является антагонистом для тЖ-21. При сравнении 8-мерной ЗНК-анти-тЖ с 15-мерной ЗНКанти-тЖ (8ЕЭ ΙΌ N0: 3204) выявляли начительно более эффективное действие у короткой, полностью ЗНК-модифицированой и фосфоротиолированной ЗНК-анти-тЖ, что подтверждало предыдущие данные.
Материалы и способы.
Клеточная линия: клеточная линия Ний-7 человеческой гепатомы была любезно предоставлена В. Вайеи8сй1адег (ЭерЕ Мо1. У1го1оду, Ишуегкйу о£ НеИе1Ьегд). Клетки Ний-7 культивировали в среде
- 44 019939
ЭМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 11000 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь конфлуэнтности 50-70%. В день трансфекции клетки Ний-7 были трансфицированы 20 нг Рбсб4 3'иТК/рк|СНЕСК2 или пустым вектором рк1СНЕСК2 вместе с 10 нМ ргеШ1К-21 (АтЬюи) и 0,14 мкл липофектамина 2000 Диуйгодеи). Трансфицировали также олигонуклеотиды ЗНК-анти-т1К в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали и добавляли 30 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда) в каждую лунку, после чего 96-луночный планшет помещали в орбитальный шейкер. Через 30 мин в каждую лунку добавляли люциферазный субстрат, разведенный в люциферазном тестовом буфере II (двойная тестовая система с люциферазным репортером от фирмы Рготеда, № в каталоге Е1910), и проводили люциферазный анализ согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 23. Оценка уровней белка Рбсб4 как функционального показателя антагонизма к тЖ-21 у 8-мерной ЗНК-анти-т1К (8ЕО ГО N0: 3205).
Дополнительно авторы также трансфицировали клетки НеЬа с 8ЕО ГО N0: 3205 (абсолютно соответствующая), 8Е0 ГО N0: 3218 (несоответствующая), 8Е0 ГО N0: 3219 (скремблированная) и через 24 ч анализировали уровни белка Рбсб4 в анализе вестерн-блоттинг (фиг. 22). Показано, что в белковых экстрактах из клеток, куда добавляли 8Е0 ГО N0: 3205, выявлено повышение содержания белка Рбсб4 в силу антагонизма к тЖ-21 у 8Е0 ГО N0: 3205, в отличие от двух контрольных олигонуклеотидов ЗНК.
Заключение.
Антагонистическое действие на тгк-21 с использованием 8-мерной (8Е0 ГО N0: 3205) приводит к дерепрессии прямой мишени Рбсб4.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой цервикальной карциномы НеЬа была куплена в ЕСАСС (№ 93021013). Клетки НеЬа культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1 х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 200000 клеток на лунку высевали в 6-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день получить 50-70% конфлуэнтности. В день трансфекции клетки НеЬа были трансфицированы олигонуклеотидами ЗНК 5 нМ и 2,5 мкг/мл липофектамина 2000 Диуйгодеи) согласно инструкциям изготовителя. Через 24 ч клетки собирали для анализа вестерн-блоттинг.
Анализ вестерн-блотттинг: клетки промывали ФБР, трипсинизировали, переносили в микропробирку эппендорф и добавляли 50 мкл лизирующего буфера ДхШРА). Клеточный лизат оставляли на льду в течение 20 мин и затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Равные количества (15 мкл клеточного лизата) вводили в 4-12% ВЖ-ТКЖ гель. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием 1В1о1 Диуйпдеи). Мембрану инкубировали в течение ночи при 4°С с первичным аффинно-очищенным кроличьим сывороточным антителом Рбсб4 (Коск1аиб) в концентрации 1:2000. Для контроля использовали антитела к анти-В-тубулину (Тйегто 8с1еи1гйс) в разведении 1:5000. Иммунореактивные полосы визуализировали с помощью ЕСЬ Р1ик (Атегкйат).
Пример 24. Оценка потенциальной гепатотоксичности 8-мерной абсолютно соответствующей ЗНКанти-т1К 8Е0 ГО N0: 3205 и ЗНК-несоответствующей контрольной 8Е0 ГО N0: 3218.
Каждую композицию вводили самкам мышей NМКI в дозах 25, 5 и 1 мг/кг через день в течение 2 недель.
Животных умерщвляли и собирали сыворотку из цельной крови для анализов АЛТ (аланинаминотрансферазы) и АСТ (аспартатаминотрансферазы). Как отмечено в фиг. 23, уровни АЛТ и АСТ не повышались с 8Е0 ГО N0: 3205 по сравнению с солевым раствором или 8Е0 ГО N0: 3218 (контрольной несоответствующей). Вместе с тем, у одной мыши выявлены повышенные уровни (отмеченные красным), поскольку в образцах сыворотки была примесь эритроцитов, имеющих в 6-8 раз более высокое содержание АЛТ и АСТ по сравнению с плазмой. Мышей, которым вводили 5 и 1 мг/кг, также исследовали на содержание АЛТ и АСТ, и было показано отсутствие каких-либо изменений по сравнению с показателями у контрольных животных с введением солевого раствора (данные не показаны).
- 45 019939
Материалы и способы.
Схема эксперимента
Гр. по. Идентифика’ ционный № ЖИВОТНОГО № мыши Соединенно, уровень ежедневной дозы Концентрация при объеме дозы 10 мл/кг Путь введения Дозы I
1 1 - 10 10 №С! 0.9% - ί.ν 0, 2, 4, 7, 9
2 11-15 5 ЗЕОЮ#3205 25 мг/кг 2.5 мг/мл ϊ.ν 0, 2, 4, 7, 9
3 16-20 5 8Е€НО#3205 5 мг/кг 0.5 мг/мл ί.ν 0, 2, 4, 7, 9
4 21-25 5 ЗЕСНО#3205 1 мг/кг 0.1 мг/мл ϊ.ν 0, 2, 4, 7, 9
5 26-30 5 ЗЕО Ю#3230 25 мг/кг 2.5 мг/мл ί.ν 0, 2, 4, 7, 9
6 31-35 5 ЗЕО Ю#3230 5 мг/кг 0.5 мг/мл ί.ν 0,2,4,7,9
Умерщвление: животных умерщвляли смещением шейных позвонков.
Забор образцов сыворотки для АЛТ/АСТ: животные получали анестезию 70% СО2-30% 02 перед забором крови из ретроорбитальной пазухи. Кровь собирали в пробирки для сыворотки с гелем 8шопоуейе. Образцы сыворотки собирали и сохраняли от каждой отдельной мыши. Образцы крови сохраняли при комнатной температуре в течение 2 ч и после этого центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре. Фракции сыворотки собирали в микропробирки эппендорф на влажном льду.
Определение АЛТ и АСТ: определение АЛТ и АСТ проводили в 96-луночных планшетах с использованием реактивов к АЛТ и АСТ от фирмы АВХ Рейга (А11А01627 - АЛТ, А11А01629 - АСТ) согласно инструкциям изготовителя. Коротко, образцы сыворотки разводили в 2,5 раза Н2О и каждый образец анализировали дважды. После добавления в каждую лунку 50 мкл разведенного образца или стандарта (шиЙ1са1 от АВХ Рейга - А11А01652), при 37°С в каждую лунку добавляли 200 мкл смеси реактивов к АСТ или АЛТ. Кинетические измерения проводили в течение 5 мин с интервалом 30 с при концентрации 340 нМ при 37°С.
Пример 25. Оценка уровней белка РИ.1 как функционального показателя антагонизма к шЖ-155 у короткой ЗНК-анти-шЖ (8ЕО ΙΌ N0: 3207).
Авторы ранее показали, что 8-мерная (8Е0 ΙΌ N0: 3207), являющаяся антагонистом к шЖ-155, приводит к дерепрессии с/ЕВР-β-мишени шЖ-155 в мышиных клетках-макрофагах КАА. Для дополнительного тестирования эффективности 8Е0 ΙΌ N0: 3207 авторы определяли уровни белка другой мишени 1111.-155, Ри.1 Анализ вестерн-блоттинг проводили с короткой ЗНК-анти-шЖ (8Е0 ΙΌ N0: 3207) в качестве функционального показателя антагонистического действия к шгЕ-155. Антагонистическое действие анализировали на клеточной линии ТНР-1 человеческих моноцитов, которые трансфицировали вместе с какой-либо из 8-мерной полностью совпадающей (8Е0 ΙΌ N0: 3207) или 8-мерной контрольной ЗНК при отсутствии или наличии рге-шгК,-155. Для индукции накопления шЖ-155 использовали ЛПС, и клетки собирали после 24 ч.
Результаты.
Клетки ТНР-1, трансфицированные с рге-шЖ-155, показывают уменьшение содержания РИ.1 (фиг. 24). Трансфекция клеток полностью ЗНК-модифицированной и фосфоротиолированной 8Е0 ΙΌ N0: 3207 представляет собой эффективный антагонизм к Ш1К-155, что приводит к сохранению уровней белка РИ.1. Для сравнения, при трансфекции клеток 8-мерной контрольной ЗНК уровень РИ.1 снижался, что указывает на специфичность антагонистического действия 8Е0 ΙΌ N0: 3207 ЗНК-анти-шЖ на шЖ-155.
Заключение.
Антагонистическое действие 8-меров на тгК,-155 приводит к дерепрессии прямой мишени РИ.1 в человеческих клетках ТНР-1.
Материалы и способы.
Клеточная линия: клетки ТНР-1 человеческой моноцитарной линии приобретали в ЕСАСС (№ 88081201). Клетки ТНР-1 культивировали в среде КРМI с Ь-глутамином с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки.
Трансфекция: за один день до трансфекции клетки в количестве 200000 клеток на лунку высевали в 12-луночный планшет. В день трансфекции клетки ТНР-1 трансфицировали 5 нмоль рге-шЖ-155 (АшЬюп) и/или ЗНК-анти-ш1К 5 нМ вместе с липофектамином 2000 (Зпуйгодеп) согласно инструкциям изготовителя. ЛПС (100 нг/мл) добавляли к клеткам после 4 ч инкубации с трансфицирующими комплексами. Через 24 ч клетки собирали для экстракции белка и анализа вестерн-блоттинг.
Анализ вестерн-блоттинг: клетки промывали ФБР, трипсинизировали, переносили в микропробирку эппендорф и добавляли 50 мкл лизирующего буфера (ТхКГРА). Клеточный лизат оставляли на льду в те
- 46 019939 чение 20 мин и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Равные количества (15 мкл клеточных лизатов) вводили в 4-12% ВГОТВ^ гель. Белки переносили в нитроцеллюлозную мембрану с помощью 1В1о! (Iην^ΐ^одеη) согласно инструкциям изготовителя. Мембрану инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьим моноклональным антителом РИ.1 (Се11 81дпаШпд) в концентрации 1:2000. Для равного введения использовали тубулин (Тйетшо 8аепййс) в разведении 1:5000. Иммунореактивные полосы визуализировали с помощью ЕСЬ Р1и§ (Ашегайаш).
Пример 26. Оценка уровней белка р27 как функционального показателя антагонизма к семейству ш1В-221/222 у 7-мерной 8ЕО ΙΌ N0: 3225 ЗНК-анти-ш1В.
По данным предшествующих работ (Ье 8аде е! а1. 2007, 6а1атб1 е! а1. 2007) ш1В-221 и ш1В-222 являются посттранскрипционными регуляторами экспрессии гена опухолевой супрессии р27, который вовлечен в регуляцию клеточного цикла. В этих исследованиях было показано, что понижающая регуляция ш1В-221 и ш1В-222 повышает уровень экспрессии р27. В этой связи авторы определяли уровни белка р27 после трансфекции ЗНК-анти-ш1В 8ЕО ΙΌ N0: 3225 в клетки РС3 в качестве функционального показателя антагонизма к семейству ш1В-221/222 у 7-мерной 8ЕО ΙΌ N0: 3225 ЗНК-анти-ш1В.
Результаты.
Как показано на фиг. 25, трансфекция 7-мерной ЗНК-анти-ш1В 8Е0 ΙΌ N0: 3225, нацеленной на исходную последовательность в ш1В-221 и ш1В-222, приводила к дозозависимому повышению уровня белка р27, по сравнению как с нетрансфицированными, так и со скремблированной контрольной ЗНК, трансфицированной клетками РС3. Эти результаты отчетливо демонстрируют, что 7-мерная ЗНК-антиш1В способна быть эффективным антагонистом для семейства ш1В-221/222, что приводит к дерепрессии прямой мишени р27 по содержанию белка, при концентрации уже 5 нМ.
Заключение.
Полностью ЗНК-модифицированная 7-мерная ЗНК-анти-ш1В, нацеленная на исходную последовательность в семействе ιηίΚ,-221/222, является эффективным антагонистом для обеих миРНК, что приводит к дерепрессии прямой мишени р27 по содержанию белка.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток РС3 человеческой карциномы предстательной железы была куплена в ЕСАСС (№ 90112714). Клетки РС3 культивировали в среде ЭМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: высевали 250000 клеток на лунку в 6-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы достичь 50% конфлуэнтности на следующий день. В день трансфекции клетки РС3 трансфицировали ЗНК-олигонуклеотидами в разных концентрациях (см. фиг. 25) с липофектамином 2000. Клетки собирали через 24 ч для экстракции белка и анализа вестерн-блоттинг.
Вестерн-блоттинг: клетки промывали ФБР, трипсинизировали, переносили в микропробирку эппендорф и добавляли 50 мкл лизирующего буфера ЦхВГРА). Клеточный лизат оставляли на льду на 20 мин, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Равные количества (15 мкл клеточных лизатов) вводили в 4-12% ΒΙδ-ΊΒΙδ гель. Белки переносили в нитроцеллюлозную мембрану с помощью 1В1о! (ЧпуЦгодеп) согласно инструкциям изготовителя. Мембрану инкубировали в течение ночи при 4°С с первичным моноклональным мышиным антителом р27 (ΒΌ Вюкшепсек) в концентрации 1:1000. Для контроля введения использовали тубулин (Тйетшо 8с1епййс) в разведении 1:5000. Иммунореактивные полосы визуализировали с помощью ЕСЬ Р1и§ (Ашегайаш).
Пример 27. Нокдаун ш1В-221/222 с 7-мерными 8ЕО ΙΌ N0: 3225 ЗНК-анти-ш1В уменьшает образование колоний клеток РС3.
Критерием клеточной трансформации является способность опухолевых клеток к безъякорному росту в полутвердой среде. В этой связи авторы проводили анализ на мягком агаре, который является фенотипическим тестом, имеющим значение при раке, с условием определения уменьшения опухолевых клеток. Авторы трансфицировали 8ЕО ΙΌ N0: 3225 (полностью соответствующую) и 8Е0 ΙΌ N0: 3231 (скремблированную) в клетки РС3, и через 24 ч высевали клетки в мягкий агар. Через 12 дней производили подсчет колоний. На фиг. 26 авторы показывают, что ингибирование ш1В-221 и ш1В-222 последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3225 способно уменьшать количество колоний, растущих в мягком агаре, по сравнению со скремблированной контрольной ЗНК-анти-ш1В, на что указывает уменьшение количества опухолевых клеток.
Заключение.
7-Мерная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 3225), мишенью для которой является семейство ш1В221/222, сокращает количество колоний в мягком агаре, что указывает на прекращение пролиферации клеток РС3.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток РС3 человеческой карциномы предстательной железы была куплена в ЕСАСС (№ 90112714). Клетки РС3 культивировали в среде ЭМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: высевали 250000 клеток на лунку в 6-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы достичь 50% конфлуэнтности на следующий день. В день трансфекции клетки РС3 трансфициро
- 47 019939 вали разными олигонуклеотидами ЗНК в количестве 25 нМ с липофектамином 2000.
Клональный рост в мягком агаре: клетки РС3 в количестве 2,5х103 высевали в 0,35% агаре поверх основного слоя, содержащего 0,5% агара. Клетки высевали через 24 ч после трансфекции. Планшеты инкубировали при 37°С, с 5% СО2 в увлажненном инкубаторе в течение 12 дней и окрашивали 0,005% кристалл-фиолетовым красителем в течение 1 ч, после чего подсчитывали клетки. Анализ проводили три раза.
Пример 28. Оценка антагонистического действия 6-9-мерных ЗНК-анти-т1К на 1е1-7 в клетках Ний7, трансфицированных 1е1-7а предшественником миРНК, в люциферазно-сенсорном анализе.
Для оценки полностью ЗНК-модифицированных 6-9-мерных олигонуклеотидов по эффекту нацеливания и антагонистического действия миРНК на семейства 1е1-7 создавали люциферазную сенсорную конструкцию, содержащую около 800 п.о. НМСА2 3'ИТК. Последовательность, клонированная в вектор, содержала четыре из семи функциональных связывающих сайтов 1е1-7 (участки 2-5), о чем ранее изложено Мауг е1 а1. (8с1еисе, 2007) и Ьее и ЭнИа (Сеиез Эеу., 2007). Для контроля ингибирования 1е1-7 линию клеток Ний-7 гепатоцеллюлярной карциномы (с уровнем эндогенного 1е1-7 от низкого до полного отсутствия) трансфицировали люциферазной сенсорной конструкцией, с 1е1-7а предшественником миРНК и с 69-мерными антагонистами 1е1-7 8ЕО ΙΌ N0: 3232, 3233, 3227, 3234, 3235; см. фиг. 27) при росте показателей концентрации. Проводили сравнение 6-9-мерных ЗНК-анти-ш1К с 8ЕО ΙΌ N0: 3226, 15-мерной, нацеленных на 1е1-7а, в качестве положительного контроля. Через 24 ч измеряли активность люциферазы.
Результаты.
Как показано на фиг. 28, полностью ЗНК-модифицированные 8- и 9-мерные ЗНК-анти-ш1К (8ЕО ΙΌ N0: 3227, 8Е0 ΙΌ N0: 3234 и 8Е0 ΙΌ N0: 3235) проявляют сходную эффективность в дерепрессии 1е1-7мишеней в анализе с люциферазным сенсором, при положительном контроле с 15-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3226. Полная направленная дерепрессия для этих высокоэффективных соединений достигалась уже при концентрации в 1-5 нМ, тогда как немного более высокие концентрации (10 нМ) 7-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3233 были необходимы для аналогичного эффекта. Вместе с тем, 6-мерная 8Е0 ΙΌ N0: 3232 не проявляет эффекта даже в таких высоких концентрациях, как 50 нМ. Дерепрессия активности люциферазы у 7-9и 15-мерных ЗНК-анти-т1К является дозозависимой, что особенно очевидно в случае немного менее эффективной 8Е0 ΙΌ N0: 3233.
Заключение.
Таким образом, 8-9-мерные ЗНК-анти-т1К (8ЕО ΙΌ N0: 3227, 8ЕО ΙΌ N0: 3234 и 8ЕО ΙΌ N0: 3235) проявляют одинаковое антагонистическое действие ингибирования 1е1-7а ίη уйго по сравнению с антагонизмом 15-мерной ЗНК-анти-т1К 8Е0 ΙΌ N0: 3226 к 1е1-7а. Отмечается эффективное действие также у 7мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3233, но при концентрации немного более высокой, тогда как 6-мерная не имеет какой-либо эффективности в тестированных концентрациях.
Материалы и способы.
Клеточная линия: клеточная линия Ний-7 гепатоцеллюлярной карциномы была любезно предоставлена К. Вайеизсй1адег (Эер1 Мо1 У1го1оду, Ишуегзйу о£ Не1бе1Ьегд). Клетки Ний-7 культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 8000 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь конфлуэнтности 60-80%. В день трансфекции клетки Ний-7 трансфицировали 20 нг НМСА2 3'ИТК/рз1СНЕСК2 плазмидой, 1е1-7а предшественником миРНК (ЭНагтасоп; конечная концентрация 10 нМ) и с ЗНК-анти-т1К 8Е0 ΙΌ N0: 3232, 3233, 3227, 3234, 3235, 3226 (в конечной концентрации 0-50 нМ) вместе с 0,17 мкл липофектамина 2000 Диуйгодеи) по инструкциям изготовителя. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: удаляли ростовую среду и в каждую лунку добавляли 30 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Ргошеда). Через 15-30 мин инкубации на орбитальном шейкере проводили люциферазные анализы с генами КеиШа и светлячка согласно инструкциям изготовителя (Ргошеда).
Пример 29. Оценка антагонистического действия 8- и 15-мерных ЗНК-анти-т1К на все семейство 1е1-7 в трансфицированных клетках Ний-7 в люциферазно-сенсорном анализе.
Для оценки полностью ЗНК-модифицированных 8-мерных олигонуклеотидов по эффекту нацеливания и антагонистического действия миРНК на все семейство 1е1-7 использовали аналогичную люциферазную сенсорную конструкцию, как описано в предыдущем примере. Клетки Ний-7 (с уровнем эндогенного 1е1-7 от низкого до полного отсутствия) трансфицировали люциферазной сенсорной конструкцией одним из представителей семейства предшественников 1е1-7а, 1е1-7б, 1е1-7е или 1е1-71 и антагонистом 8Е0 ΙΌ N0: 3227 с повышением концентрации. Проводили сравнение 8-мерных ЗНК-анти-т1К с 8Е0 ΙΌ N0: 3226, 15-мерной, нацеленных на 1е1-7а в качестве положительного контроля. Через 24 ч измеряли активность люциферазы.
Результаты.
Как указано на фиг. 29, полностью ЗНК-модифицированные 8-мерные ЗНК-анти-т1К (8Е0 ΙΌ N0: 3227) проявляют сходную эффективность в дерепрессии разных 1е1-7-мишеней в анализе с люцифераз
- 48 019939 ным сенсором, при положительном контроле с 15-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3226. Почти полная направленная дерепрессия для указанных 8-меров достигалась уже при концентрации в 0,5-1 нМ, кроме теста с предшественником 1е!-7е (фиг. 29С), в котором только 7 из 8 нуклеотидов 8Е0 ΙΌ N0: 3227 гибридизовались с мишенью. Вместе с тем, несмотря на концевое несоответствие в указанном тесте, 8Е0 ΙΌ N0: 3227 вызывает полную направленную дерепрессию при 5 нМ. Положительный контроль с 15-мерами демонстрирует эффективное антагонистическое действие всех предшественников и вызывает почти полную дерепрессию при 0,5 нМ. Дерепрессия активности люциферазы и 8- и 15-мерных ЗНК-анти-тЖ является дозозависимой, что показано на всех четырех частях фиг. 29 (Α-Ό).
Заключение.
Таким образом, 8-мерная ЗНК-анти-тЖ (8Е0 ΙΌ N0: 3227) обладает эффективным антагонистическим действием против четырех представителей семейства 1е1-7 ίη νίίτο, и таким образом, вероятно, против всего семейства. По сравнению с 15-мерным антагонистом в качестве положительного контроля 8мерная 8Е0 ΙΌ N0: 3226 обладает одинаковой эффективностью для трех из четырех мишеней и немного меньшим эффектом для четвертой мишени, 1е!-7е, что обусловлено в этом случае концевым несоответствием.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток Ний-7 гепатоцеллюлярной карциномы была любезно предоставлена .. Βа^ιеη8сй1аде^ (Ьер1 Мо1 Уйо1о§у, ЬтмегШу о£ Не1бе1йегд). Клетки Ний-7 культивировали в среде ΌΜΕΜ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 8000 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день достичь конфлуэнтности 60-80%. В день трансфекции клетки Ний-7 были трансфицированы 20 нг НΜ6Α2 3'иТ./р81СНЕСК2 плазмидой, 1е1-7а, -76, -7е или 1е1-71 предшественниками миРНК (Ийаттасощ конечная концентрация 10 нМ) и с ЗНК-анти-тЖ 8Е0 ΙΌ N0: 3227 и 8Е0 ΙΌ N0: 3226 (в конечной концентрации 0-50 нМ) вместе с 0,17 мкл липофектамина 2000 (ΙηνίϋΌ^η). Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: удаляли ростовую среду и в каждую лунку добавляли 30 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда). Через 15-30 мин инкубации на орбитальном шейкере проводили люциферазные анализы с генами ИетИа и светлячка согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 30. Оценка антагонистического действия 8Е0 ΙΌ N0: 3227, 8-мерных ЗНК-анти-тЖ на эндогенные 1е1-7 в трансфицированных клетках НеЬа в люциферазно-сенсорном анализе.
Для определения эффективности полностью ЗНК-модифицированного 8-мерного олигонуклеотида по эффекту нацеливания и антагонистического действия на эндогенные 1е1-7 использовали аналогичную люциферазную сенсорную конструкцию, описанную в двух предыдущих примерах, которую котрансфицировали 8Е0 ΙΌ N0: 3227 в клетках НеЬа клеточной линии цервикального рака (с уровнем экспрессии 1е1-7 от умеренного до высокого, что определяется количественной О-ПЦР: данные не показаны). Пустой вектор р§1СНЕСК-2 включали в анализ в качестве отрицательного контроля.
Результаты.
Как показано на фиг. 30, полностью ЗНК-модифицированная 8-мерная ЗНК-анти-тЖ 8Е0 ΙΌ N0: 3227 обладает эффективным антагонистическим действием на эндогенные 1е1-7 и вызывает полную направленную дерепрессию в концентрации 5-10 нМ. Дерепрессия активности люциферазы является дозозависимой, начиная от концентрации около 1 нМ и достигая плато при около 10 нМ.
Заключение.
Таким образом, 8-мерная ЗНК-анти-тЖ (8Е0 ΙΌ N0: 3227) является эффективным антагонистом против также эндогенных 1е1-7 ίη уйго и, в этой связи, отчетливо свидетельствует о возможности всех членов семейства миРНК быть мишенями для успешного нацеливания коротких и полностью ЗНКмодифицированных антагонистов.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток НеЬа человеческого цервикального рака была куплена в АТСС (№ ССЬ-2™). Клетки НеЬа культивировали в среде Игла МЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса, 1 х ЗАК и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 8000 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы достичь 50-70% конфлуэнтности на следующий день. В день трансфекции клетки НеЬа из каждой лунки котрансфицировали 20 нг НΜ6Α2 3'иТН/р81СНЕСК2 плазмиды или рыСНЕСК-2 (пустым вектором) и ЗНК-анти-тЖ 8Е0 ΙΌ N0: 3227 (в конечной концентрации 0-50 нМ) вместе с 0,17 мкл липофектамина 2000 (ΙηνίΟΌ^η) согласно инструкциям изготовителя. Через 24 ч клетки собирали для анализа с люциферазой.
Люциферазный анализ: удаляли ростовую среду и в каждую лунку добавляли 30 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда). Через 15-30 мин инкубации на орбитальном шейкере проводили люциферазные анализы с генами ИетИа и светлячка согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 31. Оценка антагонистического действия 8-мерной ЗНК-анти-тЖ-21 (8Е0 ΙΌ N0: 3205) на
- 49 019939 тЖ-21 по сравнению с действием 8-мерной (8ЕО ΙΌ N0: 3219) скремблированной контрольной ЗНК в клеточной линии человеческой карциномы ободочной кишки НСТ116.
Выше в настоящей заявке авторы указали, что 8-мерная ЗНК-анти-тЖ, которая представляет собой полностью модифицированную и фосфоротиолированную ЗНК, является эффективным антагонистом к тЖ-21 в клеточной линии человеческой цервикальной карциномы НсЬа, клеточной линии человеческой карциномы молочной железы МСР-7, клеточной линии человеческого рака предстательной железы РС3 и клеточной линии человеческой гепатоцеллюлярной карциномы НсрС2. Авторы распространили такой скрининговый подход в отношении клеточной линии человеческой карциномы ободочной кишки НСТ116. Для оценки эффективности 8-мерного олигонуклеотида ЗНК-анти-тЖ против тЖ-21 создавали люциферазные репортерные конструкции, в которых абсолютно соответствующий сайт-мишень для зрелой тЖ-21 клонировали в ген люциферазы 3'иТ. КспШа. Для контроля ингибирования тЖ-21 осуществляли трансфекцию клеток НСТ116 люциферазными конструкциями вместе с антагонистом к тЖ21 8Е0 ΙΌ N0: 3205 (8-мерной), и для сравнения специфичности, с 8-мерной скремблированной контрольной ЗНК (8Е0 ΙΌ N0: 3219). Через 24 ч измеряли активность люциферазы.
Результаты.
Анализы с люциферазным репортером показали дозозависимую дерепрессию люциферазной активности тЖ-21 репортера у 8-мерной ЗНК-анти-тЖ против тЖ-21 (8Е0 ΙΌ N0: 3205), и полная дерепрессия была достигнута в концентрации 5 нМ (фиг. 31). При сравнении специфичности 8-мерных абсолютно соответствующих и 8-мерных скремблированных контрольных ЗНК-анти-тЖ было выявлено полное отсутствие дерепрессии у скремблированной контрольной ЗНК-анти-тЖ (8Е0 ΙΌ N0: 3219), что указывает на высокую специфичность композиции ЗНК-анти-тЖ, нацеленную на тЖ-21.
Заключение.
8-Мерная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 3205) обладает действием нацеливания на тЖ-21, и антагонизм тЖ-21 8Е0 ΙΌ N0: 3205 является специфичным.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток человеческой карцинома ободочной кишки НСТ116 была приобретена в АТСС (ССЬ-247). Клетки НСТ116 культивировали в среде ΚРМI с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 110000 клеток на лунку высевали в 12-луночный планшет и осуществляли трансфекцию. Клетки НСТ116 трансфицировали 0,3 мкг люциферазной сенсорной плазмидой тЖ-21 или пустым вектором р81СНЕСК2 вместе с 1,2 мкл липофектамина 2000 НпуЦгодсп) согласно инструкциям изготовителя.
Трансфицировались также контрольные олигонуклеотиды и ЗНК-анти-тЖ в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для анализа с люциферазой.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и в лунки добавляли 250 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготсда). Планшеты помещали в шейкер на 30 мин, после чего клеточные лизаты переносили в микропробирку эппендорф. Клеточный лизат центрифугировали в течение 10 мин при 2500 об/мин, после чего 50 мкл переносили в 96-луночный планшет и проводили люциферазный анализ согласно инструкциям изготовителя (Рготсда).
Пример 32. Нокдаун тЖ-21 с 8-мерной 8Е0 ΙΌ N0: 3205 ЗНК-анти-тЖ уменьшает образование колоний клеток РС3.
Критерием клеточной трансформации является способность опухолевых клеток к безъякорному росту в полутвердой среде. В этой связи авторы проводили анализ на мягком агаре, который является фенотипическим тестом, имеющим значение при раке, с условием определения уменьшения опухолевых клеток. Авторы трансфицировали 8Е0 ΙΌ N0: 3205 (полностью соответствующую) и 8Е0 ΙΌ N0: 3219 (скремблированную) в клетки РС3 и через 24 ч высевали клетки в мягкий агар. Через 12 дней производили подсчет колоний. На фиг. 32 авторы показывают, что ингибирование тЖ-21 последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3205 способно уменьшать количество колоний, растущих в мягком агаре, по сравнению со скремблированной контрольной ЗНК-модифицированной или контрольной немодифицированной (трансфицированной, но не ЗНК) последовательностью, на что указывает уменьшение количества опухолевых клеток.
Заключение.
8-Мерная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 3205), мишенью для которой является семейство тЖ21, сокращает количество колоний в мягком агаре, что указывает на прекращение пролиферации клеток РС3.
Материалы и способы.
Клеточная линия: линия клеток РС3 человеческой карциномы предстательной железы была куплена в ЕСАСС (№ 90112714). Клетки РС3 культивировали в среде ЬМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: высевали 250000 клеток на лунку в 6-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы достичь 50% конфлуэнтности на следующий день. В день трансфекции клетки РС3 трансфицировали разными олигонуклеотидами ЗНК в количестве 25 нМ с липофектамином 2000.
- 50 019939
Клональный рост в мягком агаре: клетки РС3 в количестве 2,5х103 высевали в 0,35% агаре поверх основного слоя, содержащего 0,5% агара. Клетки высевали через 24 ч после трансфекции. Планшеты инкубировали при 37°С с 5% СО2 в увлажненном инкубаторе в течение 12 дней и окрашивали 0,005% кристалл-фиолетовым красителем в течение 1 ч, после чего подсчитывали клетки. Анализ проводили три раза.
Пример 33. Сайленсинг т1В-21 с 8-мерной 8ЕЦ ΙΌ N0: 3205 ЗНК-анти-т1В уменьшает образование колоний клеток НерС2.
В клетках линии человеческой гепатоцеллюлярной карциномы НерС2 существует сверхэкспрессия ш1В-21, и ранее авторы показали возможность регуляции активности люциферазы из сенсорной плазмиды т1В-21 с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 3205 в указанных клетках. Клетки НерС2 трансфицировали 8Е0 ΙΌ N0: 3205 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 3219 (скремблированной 8-мерной) и через 24 ч высевали в мягкий агар. Колонии подсчитывали под микроскопом через 17 дней.
Результаты.
Авторы показывают на фиг. 33, что при ингибировании т1В-21 8ЕЦ ΙΌ N0: 3205 может уменьшаться количество колоний, растущих в мягком агаре, что указывает на прекращение пролиферации. Дополнительно скремблированная 8-мерная контрольная последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 3219 согласно изобретению не проявляла какого-либо значительного действия на число колоний.
Заключение.
8-Мерная последовательность (ЪЕЦ ΙΌ N0: 3205), нацеленная на ш1В-21, сокращает количество колоний в мягком агаре, что указывает на прекращение пролиферции клеток НерС2.
Материалы и способы.
Клеточная линия; клетки НерС2 человеческой линии гепатоцитов приобретали в ЕСАСС (№ 85011430). Клетки Нер62 культивировали в среде ЕМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 650000 клеток на лунку высевали в 6-луночный планшет для проведения обратной трансфекции. Клетки НерС2 трансфицировали 0,6 мкг люциферазной сенсорной плазмиды т1В-21 или пустым вектором р§1СНЕСК2 вместе с 2,55 мкл липофектамина 2000 (Ιηνίΐτο^η) согласно инструкциям изготовителя.
Трансфицировали также ЗНК-анти-т1В и контрольными олигонуклеотидами в разных концентрациях. Через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Клональный рост в мягком агаре: клетки НерС2 в количестве 2,5х103 высевали в 0,35% агаре поверх основного слоя, содержащего 0,5% агара. Клетки высевали через 24 ч после трансфекции. Планшеты инкубировали при 37°С с 5% СО2 в увлажненном инкубаторе в течение 17 дней и окрашивали 0,005% кристалл-фиолетовым красителем в течение 1 ч, после чего подсчитывали клетки. Анализ проводили три раза.
Пример 34. Сайленсинг т1В-21 с 8-мерной 8ЕЦ ΙΌ N0: 3205 ЗНК-анти-т1В ингибирует клеточную миграцию в клетках РС3.
Клеточную миграцию можно отслеживать путем теста заживления раны (тест экскориации), в котором наносили экскориацию в монослое клеток и фиксировали изображения в начале теста и с регулярными промежутками во время клеточной миграции. Количественный анализ скорости миграции клеток можно провести при сравнении изображений. Такой анализ проводили с раковыми клетками линии РС3 человеческой простаты. Клетки высевали, на 3 день клетки трансфицировали, после чего на следующий день при достижении 100% конфлуэнтности наносили экскориации (= рану). После нанесения раны делали снимки для регистрации исходной раны. После этого зону закрытия раны измеряли в разных точках времени с помощью бесплатного программного обеспечения Ийаде I. Как показано на фиг. 34А, в клетки РС3 вводили 25 нМ 8Е0 ΙΌ N0: 3205 (полностью соответствующей, т1В-21), контрольную 8ЕЦ ΙΌ N0: 3219 или оставляли нетрансфицированными. Снимки делали через 24 ч и рассчитывали зону закрытия раны в соответствующей точке времени. Закрытие раны с нетрансфицированными клетками и контрольными № 3219 происходило быстрее по сравнению с ЗНК-анти-ιηίΡ по изобретению, нацеленной на т1В21, 8Е0 ΙΌ N0: 3205, что указывало на ингибирующее действие 8ЕЦ ΙΌ N0: 3205 на т1В-21 и противодействие к ленточной миграции (фиг. 34В).
Заключение.
8-Мерная последовательность (8ЕЦ ΙΌ N0: 3205), нацеленная на т1В-21, ингибирует клеточную миграцию клеток РС3 по сравнению с нетрансфицированными и контрольными трансфицированными клетками.
Материалы и способы.
Клеточная линия: клетки линии РС3 человеческой карциномы простаты приобретали в ЕСАСС (№ 90112714). Клетки РС3 культивировали в среде ΌΜΕΜ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Тест экскориации: 150000 клеток на лунку высевали в 6-луночный планшет за три дня до трансфекции, чтобы достичь 100% конфлуэнтности на следующий день. В точке времени 24 ч после трансфекции
- 51 019939 наносили экскориацию в монослое клеток с помощью наконечника 200 мкл. Снимки делали в точках времени 0 ч и через 24 ч с помощью цифровой камеры, соединенной с микроскопом. Использовали программное обеспечение Инаде 1, чтобы определить закрытие раны.
Пример 35. Определение длины полностью ЗНК-замещенной ЗНК-анти-тгК, являющейся антагонистом т1К-155.
Ранее авторы описали определение длины для т1К-21 в отношении полностью ЗНК-замещенной ЗНК-анти-тгК и показали, что наибольшую активность имеют ЗНК-анти-тгК длиной в 7-, 8- или 9 нуклеотидов. Тот же эксперимент повторяли с т1К-155. Абсолютно соответствующий сайт-мишень для т1К155 был клонирован в ген люциферазы 3'ИТК в репортерной плазмиде раСЧЕСКЗ и трансфицирован в мышиные клетки макрофаги линии КАА вместе с полностью ЗНК-замещенными ЗНК-анти-тгК разной длины. Учитывая низкое эндогенное содержание т1К-155 в клеточной линии КАА, клетки обрабатывали ЛПС в дозе 100 нг/мл в течение 24 ч для индукции накопления т1К-155. Через 24 ч проводили люциферазный анализ.
Результаты: как показано на фиг. 35, наибольшая активность выявлена у ЗНК-анти-т1К 8ЕО ΙΌ NО: 3207 (8 нуклеотидов) и 8ЕО ΙΌ NО: 3241 (9 нуклеотидов), достигая почти 80% дерепрессии в концентрации ЗНК только 0,25 нМ. Не обнаружено какой-либо значительной дерепрессии у 6-мерных последовательностей (8ЕО ΙΌ NО: 3244). При увеличении длины до 12-мерных и до 14-мерных последовательностей (8ЕО ΙΌ NО: 3242 и 8ЕО ΙΌ NО: 3243) снижалась активность, на что указывает менее эффективная дерепрессия т1К-155 репортера.
Заключение.
Наибольшей эффективностью из полностью ЗНК-замещенных ЗНК-анти-т1К, нацеленных на т1К155, обладали 8- и 9-мерные последовательности (8ЕО ΙΌ NО: 3207 и 8ЕО ΙΌ NО: 3241).
Материалы и способы.
Клеточная линия: мышиные клетки макрофаги линии КАА 264.7 были приобретены в АТСС (ΤΙΒ71). Клетки КАА культивировали в среде ΌΜΕΜ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 4 мМ глутамакса и 25 мкг/мл гентамицина.
Трансфекция: 500000 клеток на лунку высевали в 6-луночный планшет за день перед трансфекцией, чтобы на следующий день получить 50% конфлуэнтность. В день трансфекции клетки КАА 264.7 были трансфицированы 0,3 мкг т1К-155 или пустым вектором рбСИЕСЮ вместе с 10 мкл липофектамина 2000 ([пу|1годеп) согласно инструкциям изготовителя. Также трансфицировали ЗНК-анти-т1К в разных концентрациях. Для индукции накопления т1К-155 в клетки КАА добавляли ЛПС (100 нг/мл) после 4часовой инкубации с трансфицирующим комплексами. Еще через 24 ч клетки собирали для люциферазного анализа.
Люциферазный анализ: клетки промывали ФБР и собирали клеточным скребком, после чего клетки центрифугировали в течение 5 мин при 2500 об/мин. Удаляли супернатант и 50 мкл 1х пассивного лизирующего буфера (Рготеда) добавляли к клеточному дебрису, после чего клетки оставляли на льду на 30 мин. Лизированные клетки центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, после чего 20 мкл переносили в 96-луночный планшет и люциферазный тест проводили согласно инструкциям изготовителя (Рготеда).
Пример 36. Связывание белков плазмы с полностью ЗНК-замещенными 8-мерными 8ЕО ΙΌ NО: 3205, нацеленными на тШ-21 (ЗНК-анти-т1К-21).
Плазменные белки не насыщаются последовательностью 8ЕО ΙΌ NО: 3205 при концентрациях плазмы в эксперименте, показанном на фиг. 36А. В широком диапазоне концентраций 8ЕО ΙΌ NО: 3205 в плазме связывание белка составляет около 95% у 8ЕО ΙΌ NО: 3205 ЗНК-анти-тШ-21, показано в фиг. 36В. При концентрациях 8ЕО ΙΌ NО: 3205 50,1 мкМ (174 мкг/мл) связывающая способность белков плазмы с ГАМ-меченной 8ЕО ΙΌ NО: 3205 не была предельной.
Материалы и способы.
В образец мышиной плазмы (100 мкл) вводили ГАМ-меченую 8ЕО ΙΌ NО: 3205 в концентрации 0,167, 1,67, 5,01, 10,02, 16,7, 25,05 и 50,1 мкМ. Растворы инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Растворы переносили на фильтр Мютосоп и1!тасе1 УМ-30 (с восстановленной целлюлозой 30000 МАСО). Фильтры скручивали в микроцентрифуге в течение 20 мин при 2000д и при комнатной температуре. Фильтрат разводили в 5, 10 и 20 раз и образцы по 100 мкл переносили на микротитровальную чашку (из черного полистирола ΝυΝΟ-237108). Обнаружение флюоресценции осуществляли с помощью ридера ГЬиО81аг ОрИша ЕЫ8А с возбуждением волной 458 нм и эмиссией 520 нм. Количество несвязанной ГАМ-меченной 8ЕО ΙΌ NО: 3205 вычисляли по калибровочной кривой, полученной в анализе с фильтрованной плазмой с введением ГАМ-меченной 8ЕО ΙΌ NО: 3205 в 12 разных концентрациях (от 0,45 до 1000 нМ). Значения корректировали по показателям восстановления, установленным в фильтрационных экспериментах при концентрации 8ЕО ΙΌ NО: 3205 0,167, 1,67, 5,01, 10,02, 16,7, 25,05 и 50,1 мкМ в фильтрованной плазме. Восстановление ГАМ-меченной 8ЕО ΙΌ NО: 3205 составляло 86%.
Пример 37. Количественное тотальное ауторадиографическое исследование у самок пигментированных мышей после единственного внутривенного введения 358-меченных 8ЕО ΙΌ NО: 3205 ЗНК-антит1К-21.
- 52 019939
Для определения биораспределения коротких полностью ЗНК-модифицированных ЗНК-анти-т1К (8ЕО ΙΌ ΝΟ: З205, 8-мерных) у мышей проводили количественное тотальное ауторадиографическое исследование тканей с радиоактивно меченым соединением. Мышам вводили З58-меченные последовательности 8Е0 ΙΌ ΝΟ: З205 путем единственного внутривенного введения и мышей умерщвляли в разные точки времени в интервале от 5 мин до 21 дня.
Таблица 6(1)
Конкретные показатели концентрации в тканях (мкг 8Е0 ΙΌ ΝΟ: З205/г ткани) после единственного внутривенного введения З58-меченных 8Е0 ΙΌ ΝΟ: З205 самкам пигментированных мышей.
Приведенные цифры представляют собой средние значения трех измерений для каждой ткани и соотношения. Коэффициент вариабельности (КВ) обычно составлял около 10%
Ткань Максимальная концентрация олиго мкг № 3205/г ткани Время максимальной концентрации час ТА часов
адреналовые железы 13,6 0,083 374
желчь 4 1
костный мозг 7.2 0,083 411
головной мозг .Μ . . 0,083
коричневый жир 8,8 0.083
слизистая желудка 106 0.083
кровь из сердца 26,2 0,083 10,3
корковое вещество почки 58,7 24 104
печень 11,8 0,083 588
Ю.7 24
легкое 13,2 0,083 289
лимфатический узел 5 0,083 262
2.4 48
лимфа 18,8 4
20,8 168
миокард 8,1 0,083 662
яичник 13 0,083 198
поджелудочная железа 5 0,083
гипофиз 6,7 0,083
слюнная железа 8,6 0.083 405
5.5 168
скелетная мышца 4,8 0,083
пигментированная кожа 5.4 0,25
селезенка 9,8 0,083 564
тимус 3,8 0,083 185
щитовидная железа 10,9 0.083 592
моча 328,9 0,033
матка 8,6 0,25 177
сосудистая оболочка глаза 13,6 0,083
уровень чувствительности ЬСЮ 0,045 0,083
0.033 24
0,03 168
Таблица 6(п) Отношения показателей ткань/печень после единственного внутривенного введения З58-меченных
8>ЕО ΙΌ ΝΟ: З205 самкам пигментированных мышей
“5-#32О5
ЬК животного 10 11 12 13 14 15 16 17 18
^а^я выживания 0,083 0,25 1 час 4 часа 24часа 48 часов 96 часов 168 504
Орган
адреналовые железы печень печень печень печень печень печень печень печень печень
желчь 1,15 1,08 0,52 0,27 0,24 0,26 0,23 0,18 0,17
КОСТНЫЙ МОЗГ 0,03 0,11 0,55 0,10 0,03 0,07 0,04 0,03 0,04
- 5З 019939
головной мозг 0,01 0,81 0,55 0,45 0,40 0,48 0,43 0.42 0,34
коричневый жир 0,03 0,03 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
слизистая желудка 0,75 0,57 0,29 0,12 0.07 0.12 0,08 0,10 0,07
кровь из сердца 0,86 0,71 0,31 022 0,10 0,21 0,15 0,16 0.12
корковое вещество почки 2,23 1,91 0,74 0,11 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
печень 2,87 3.04 6,43 6,85 5,51 6,68 3,92 2.24 0,40
легкое 1,00 1,00 1,00 1.00 1,00 1,00 1,00 1.00 1,00
лимфатический узег 1,12 0,97 0,63 0,09 0,04 0,04 0,03 0,02 0,02
лимфа 0,43 0,30 0,25 0,19 0,11 0.32 0,20 0Л7 0,12
миокард 0,82 1,09 1,78 2,78 1.03 2,05 1,02 3,17 1,89
яичник 0,09 0,63 0,30 0,13 0.10 0,15 0,09 0,11 0,12
поджелудочная железа 1,10 1,40 0,61 0,31 0.27 0,28 0,21 0,21 0,08
гипофиз 0.42 0,37 0,22 0,18 0,12 0,17 0,12 0,15 0,11
слюнная железа 0,57 0,54 0.28 0.11 0,15 0,16 0.12 0,10 0,08
скелетная мышце 0,73 0,81 0,3В 0,25 0,25 0,42 0,23 0,85 0.24
пигментированная 0,40 0,28 0,14 0,04 0,02 0,04 0.03 0,03 0,03
селезенка 0,34 0,69 0.65 0,36 0,20 0,26 0.20 0,19 0,13
тимус 0,83 0,86 0,44 0,32 0,24 0,34 0,35 0,29 0,31
щитовидная железа 0,32 0,31 0,14 0,07 0,09 0,08 0,05 0,04 0,02
моча 0,9 1,2 0,43 0,28 0.25 0,34 0,19 0,26 0,25
матка 27,96 39,48 9,90 5,44 0,24 0,39 0,12 0,15 0,03
сосудистая оболочка глаза 0,56 1,23 0,65 0,30 0,30 0,07 0,27 0,16 0,08
Выводы.
Последовательность 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205 показывает кровяной клиренс радиоактивности с периодом полувыведения 8-10 ч. Высокие уровни радиоактивности были зарегистрированы в корковом веществе почки, лимфе, печени, костном мозге, селезенке, яичнике и в матке. Самый высокий уровень радиоактивности был отмечен в корковом веществе почки, при этом показатели были в пять раз выше, чем показатели в печени для 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205. Большое удержание радиоактивности для 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205 ЗНКанти-т1Я-21 отмечено в корковом веществе почки, лимфе, печени, костном мозге и селезенке.
Материалы и способы.
Введение дозы: всех мышей взвешивали перед введением. Девяти самкам мышей вводили 10 мг/кг 358 8Е0 ΙΌ N0: 3205 внутривенно в хвостовую вену. Объем, вводимый каждому животному, составлял 10 мл/кг тестового препарата. Активность препарата составляла 75,7 мкКюри/мг. Мышей по отдельности забивали через 5, 15 мин, 1, 4, 24 ч, 2, 4, 7 дней и через 21 день после введения 8ЕЭ ΙΌ N0: 3205. Тотальная ауторадиография: мышей анестезировали севофлураном и затем немедленно погружали в гептан с охлаждением сухим льдом до -80°С, АВЯ-80Р-0130. Замороженные туловища помещали в гель водной карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), замораживали в этаноле, охлаждали сухим льдом (-80°С), делали сагиттальные срезы для тотальной ауторадиографии, согласно стандартному способу, АВЯ-80Р-0131. Срезы толщиной в 20 мкм от каждого животного на разных уровнях отделяли с помощью криомикротома (Ье1са СМ 3600) при температуре около -20°С. Полученные срезы прикрепляли на пленку (М1ппеко1а М1п1пд апб Мапи£ас1игтд Со., № 810) и последовательно нумеровали радиоактивными чернилами. После сублимационной сушки при -20°С в течение около 24 ч выбранные срезы покрывали тонким слоем майларовой пленки и помещали в планшеты для отображения (Еир, Япония). Экспозицию осуществляли в легких плотных кассетах в коробках со свинцовой защитой при -20°С, для защиты планшетов отображения от окружающего излучения. После экспозиции планшеты отображения сканировали с размерами пиксела 50 мкм и проводили радиоиммунографический анализ с использованием системы анализа биологических изображений (Вак 2500, Еир, Япония), описанный в АВЯ-80Р-0214. Водорастворимый стандартный тестовый радиоактивный 358-раствор смешивали с цельной кровью и использовали для получения калибровочной шкалы АВЯ-80Р-0251. При этом разные стандартные образцы крови растворяли в 500 мкл раствора 8о1иепе-35. Затем 4,5 мл раствора ИШта Со1б добавляли к растворенным образцам. Поскольку 358 и 14С имеют очень сходные энергетические спектры, применяли стандартную 14Спрограмму (Раскагб 2200СА) при установлении показателей радиоактивности в разных образцах крови.
Фармакокинетические вычисления: радиоактивность 358, измеряемая в цельной крови и тканях, выражали в виде нКюри/г ткани и для фармакокинетической оценки пересчитывали в нмоль экв/г ткани. Фармакокинетические параметры максимальной концентрации Стах, времени полувыведения 11/2 и области под кривой АИС определяли для цельной крови и тканей анализом без компартментализации, используя оборудование \Ут№п1т Рго£еккюпа1 (РНагк1дЫ Согрогайоп, Моийаш У|е\у, Са, И8А). После внутривенного введения концентрацию экстраполировали обратно к нолю и выражали как (Со). Скорость выве
- 54 019939 дения константа А определяли анализом линейной регрессии предельного наклона логарифмической кривой концентрация в плазме-время. Период полувыведения ΐ1/2 рассчитывали по уравнению ί1/2 = 1η2/Λ. Если не указано иначе, для вычисления периода полувыведения использовали последние три точки времени выше Ь00.
Пример З8. Оценка ингибирования 7-1е1 ίη νίνο 8-мерной ЗНК-анти-ιηίΚ, которое определяли посредством количественного анализа белка Яак в легких и почке мыши.
Для изучения ίη νίνο возможного антагонистического действия на избыточно экспрессируемое семейство 1е(-7 мышам внутривенно (в/в) вводили антагонист 8-мерной ЗНК-анти-т^Я или солевой раствор. Для измерения эффекта введения белки выделяли из легких и почек. Авторами ίοΐιηκοη е1 а1. (Се11, 2005) ранее было показано, что семейство белков Κικ (N-Яак, Κ-Κικ и Η-Κηκ), в частности N-^18 и Κ-Κικ, регулируется (подавляется) семейством 1е(-7_ поэтому цель настоящего изобретения состояла в анализе возможности дерепрессии указанных 1е(-7 мишеней ίη νίνο.
Результаты.
Как показано на фиг. З7, 8-мерная ЗНК-анти-ιηίΚ обладает эффектом дерепрессии содержания белка Κη8 в почках тестируемых мышей, стандартизированных по контрольному введению солевого раствора. В указанных почках ап-регуляция возрастала более чем в З раза, демонстрируя отчетливый эффект ίη νίνο. При этом в легких наблюдалась только минимальная (1,2-кратная) дерепрессия Κικ (фиг. 1В), что предполагает поступление в указанный орган недостаточного количества ЗНК-анти-ιηίΚ для ингибирования в нем массивного количества 1е(-7_ как ранее описано ίοΐιηκοη е1 а1. (Саисег Яекеа^сЬ, 2007).
Заключение.
8-Мерная ЗНК-анти-ιηίΚ проявляет отчетливый эффект в регуляции 1е(-7 миРНК мишени ίη νίνο, что оценивали по содержанию белка Κικ у тестируемых мышей по сравнению с контрольными. Принимая во внимание возможно меньшую активность в легком, уровни Κικ в почке показывают значительную ап-регуляцию после введения антн-ιηίΚ.
Материалы и способы.
Животные и дозы: самкам мышей С57ВБ/6 вводили ЗНК-анти-т^Я в дозе 10 мг/кг или солевой раствор в течение трех последовательных дней (0, 1 и 2) и их умерщвляли на 4 день. Образцы ткани из легких и почек подвергали быстрой заморозке и сохраняли при -80°С до дальнейшей обработки.
Анализ вестерн-блоттинг: белки легкого и почки из солевого раствора и от мышей после введения ЗНК-анти-ιηίΚ выделяли с помощью NиРАСЕ Βίκ Ττίκ 4-12% (ΙηνίΙιτ^η), используя 100 мкг на образец. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя ϊΒ1οΐ (Iην^ί^οдеη) согласно инструкциям изготовителя. Блокирование, разведение антител и обнаружение осуществляли согласно инструкциям изготовителя. Для обнаружения Вак использовали первичное кроличье анти-Вак антитело (ЗС-ЗЗЗ9, 3ηη1а Сгнх Β^οΐесЬηο1οду) и вторичное ΗΚΡ-конъюгированное свиное анти-кроличье антитело (Р0З99, ΌηΚο), и для обнаружения тубулина использовали первичное тубулин альфа (МЗ-581-Р1, Nеοта^ке^к) и вторичное ΗЯР-конъюгированное козье анти-мышиное антитело (Р0447, ΌηΚο).
Пример 40. Оценка эффективности ίη νίνο 8-мерной ЗНК-анти-ιηίΚ (ЗЕЦ ΙΌ N0: З205) в нацеливании на ιηίΚ-21, определяемой ап-регуляцией белка Рбсб4 в почке мыши.
Авторы показали, что 8-мерная ЗНК-анти-ιηίΚ, которая является полностью ЗНКмодифицированной, обладает антагонистическим действием на ιηίΚ-21 и способностью регулировать уровень ιηίΚ-21 мишени Рбсб4 ίη νίίτο. В этой связи авторы вводили ЗНК-анти-т^Я мышам для определения активности ЗНК-анти-ιηίΚ ίη νίνο. Мышам вводили 25 мг/кг из ЗЕЦ ΙΌ N0: З205 путем в/в инъекции через день в течение 14 дней (в общей сложности 5 доз). Мышей умерщвляли на 14 день, удаляли почку и выделяли белок. Для определения направленной регуляции проводили анализ вестерн-блоттинг.
Результаты.
Как показано на фиг. З7, при введении мышам ЗЕЦ ΙΌ N0: З205 выявлено значительное повышение уровня белка Рбсб4 по сравнению с контрольным солевым раствором. Поскольку уровень стандартизированного Рбсб4 по сравнению с соотношением Сарбб был постоянным в обоих образцах с солевым раствором, определяли повышение ап-регуляции белка у двух мышей, которым вводили ЗНК-анти-т^Я (ЗЕЦ ΙΌ N0: З2059) в З,З раза и в 6,З раза, соответственно, что указывает на фармакологический эффект ίη νίνο ЗЕЦ ΙΌ N0: З205 8-мерной ЗНК-анти-ιηίΚ.
Заключение.
Полностью ЗНК-модифицированная 8-мерная ЗНК-анти-ιηίΚ ЗЕЦ ΙΌ N0: З205 обладает антагонистическим действием на ιηίΚ-21 ίη νίνο, что проявляется в ее способности к дерепрессии (ап-регуляции) содержания в мышиной почке Рбсб4-мишени, на которую нацелена ιηίΚ-21.
Материалы и способы.
Животные и дозы: самки мышей С57ВБ/6 со средним весом тела при первом введении 20 г использовались во всех экспериментах и получали регулярное кормление (Α1(Γοιηίη № 1З24, Вгодаагбеи, СспΐοίΊ®, Дания). Вещества были в рецептуре с физиологическим раствором (0,9% ШО). Животным вводили ЗНК-анти-ιηίΚ или солевой раствор (0,9% ШО) путем инъекции 25 мг/кг через день в течение 14 дней, в общей сложности в 5 доз. Животных забивали на 14 день.
Анализ вестерн-блоттинг: 80 мкг почечной ткани из солевого раствора и от мышей после введения
- 55 019939
ЗНК отделяли с помощью NиРΑ6Ε Βίδ Тп5 4-12% (1пуйгодеп). Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя 1В1о1 (1пу|1годеп) согласно инструкциям изготовителя. Блокирование, разведение антител и обнаружение осуществляли согласно инструкциям изготовителя. Мембрану инкубировали с антителом Рйсб4 (Ве11гу1 ЬаЬогаФпек), затем с ННР-конъюгированным свиным антикроличьим антителом (Пако). Для контроля за равномерной нагрузкой использовали ΟΑΓΩΜ ^Ьеат) и затем ННРконъюгированное свиное антимышиное антитело. Мембраны визуализировали с помощью хемолюминисценции (ЕСЬ, Αше^δйаш).

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Олигомер непрерывной последовательности длиной 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных единиц, используемый для уменьшения эффективного количества микроРНК-мишени в клетке или организме, где олигомер является комплементарным последовательности микроРНК, выбранной из группы, состоящей из
    - 72 019939 микроРНК с 8Ε^ ΙΙ) ΝΌ: 40-976, где по меньшей мере 70% нуклеотидных единиц олигомера выбраны из группы, состоящей из единиц ЗНК (замкнутой нуклеиновой кислоты) и 2'-замещенных нуклеотидных аналогов, и где по меньшей мере 50% нуклеотидных единиц олигомера представляют собой единицы ЗНК, и где по меньшей мере одной из имеющихся межнуклеозидных связей между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности является фосфоротиоатная межнуклеозидная связь.
  2. 2. Олигомер по п.1, в котором все межнуклеозидные связи, расположенные между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности, являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.
  3. 3. Олигомер по п.2, где длина олигомера составляет 7, 8 или 9 непрерывных нуклеотидов, где все непрерывные нуклеотидные единицы независимо выбраны из группы, состоящей из единиц ЗНК и 2'замещенных нуклеотидных аналогов.
  4. 4. Олигомер по любому из пп.1-3, где по меньшей мере 70% нуклеотидных единиц олигомера представляют собой единицы ЗНК.
  5. 5. Олигомер по любому из пп.1-3, в котором все нуклеотидные единицы представляют собой единицы нуклеотидных аналогов.
  6. 6. Олигомер по любому из пп.1-3, который имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Ε^ ΙΙ) ΝΌ: 977-3787, в котором все межнуклеозидные связи, расположенные между нуклеотидными единицами непрерывной нуклеотидной последовательности, являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.
  7. 7. Олигомер по любому из пп.1-6, где единицы нуклеотидных аналогов выбраны из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК, 2'-ОМе-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, ЗНК и 2'-МОЕ-РНК.
  8. 8. Олигомер по любому из пп.1-7, в котором все нуклеотидные единицы представляют собой единицы ЗНК.
  9. 9. Олигомер по любому из пп.1-8, где непрерывная нуклеотидная последовательность олигомера комплементарна соответствующей области Ь8а-ш1К-122 с 8Ε^ ΙΙ) ЫО: 150.
  10. 10. Применение олигомера по любому из пп.1-9 для изготовления лекарственного средства для лечения клинического нарушения или заболевания, выбранного из группы, состоящей из гепатита С и гиперхолестеринемии и связанных с ними нарушений.
  11. 11. Способ ΐη νίΐΐΌ уменьшения количества миРНК в клетке, включающий введение в клетку, которая экспрессирует указанную миРНК, олигомера по любому из пп.1-9.
EA201070421A 2007-10-04 2008-10-03 МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОЛИГОМЕР ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА микроРНК В КЛЕТКЕ EA019939B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US97749707P 2007-10-04 2007-10-04
US97921707P 2007-10-11 2007-10-11
US2806208P 2008-02-12 2008-02-12
EP08104780 2008-07-17
PCT/DK2008/000344 WO2009043353A2 (en) 2007-10-04 2008-10-03 Micromirs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201070421A1 EA201070421A1 (ru) 2010-10-29
EA019939B1 true EA019939B1 (ru) 2014-07-30

Family

ID=40526747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201070421A EA019939B1 (ru) 2007-10-04 2008-10-03 МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОЛИГОМЕР ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА микроРНК В КЛЕТКЕ

Country Status (17)

Country Link
US (5) US8440637B2 (ru)
EP (5) EP2205737B1 (ru)
JP (2) JP6035010B2 (ru)
KR (1) KR101889518B1 (ru)
CN (1) CN101821391B (ru)
AU (1) AU2008306327B2 (ru)
CA (1) CA2701547C (ru)
DK (2) DK2205737T3 (ru)
EA (1) EA019939B1 (ru)
ES (3) ES2406686T3 (ru)
IL (2) IL204254A (ru)
MX (1) MX2010003299A (ru)
MY (1) MY156951A (ru)
NZ (1) NZ583677A (ru)
PL (1) PL2623598T3 (ru)
WO (2) WO2009043354A2 (ru)
ZA (1) ZA201002040B (ru)

Families Citing this family (242)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
PL1747023T5 (pl) 2004-05-04 2017-05-31 Univ Leland Stanford Junior Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych
EP2487253B1 (en) 2006-01-05 2015-06-24 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
EP1996731A2 (en) 2006-03-20 2008-12-03 The Ohio State University Research Foundation Microrna fingerprints during human megakaryocytopoiesis
KR101407707B1 (ko) 2006-04-03 2014-06-19 산타리스 팔마 에이/에스 Ａｎｔｉ-ｍｉｒｎａ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물
EA201100811A1 (ru) * 2006-04-03 2012-06-29 Сантарис Фарма А/С Фармацевтическая композиция
US20100021914A1 (en) * 2006-11-23 2010-01-28 Querdenker Aps Oligonucleotides for modulating target rna activity
US8697672B2 (en) * 2007-05-16 2014-04-15 California Institute Of Technology Microrna inhibition for the treatment of inflammation and myeloproliferative disorders
US8691965B2 (en) * 2007-06-14 2014-04-08 Mirx Therapeutics Aps Oligonucleotides for modulating target RNA activity
NZ583025A (en) 2007-07-31 2012-06-29 Univ Texas Micro-rnas that control myosin expression and myofiber identity
AU2008283795B2 (en) 2007-07-31 2013-11-21 Board Of Regents, The University Of Texas System A micro-RNA family that modulates fibrosis and uses thereof
ES2627059T3 (es) 2007-08-03 2017-07-26 The Ohio State University Research Foundation Regiones ultraconservadas que codifican ARNnc
WO2009043354A2 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Santaris Pharma A/S Combination treatment for the treatment of hepatitis c virus infection
CA2704043C (en) 2007-10-29 2018-09-18 Rosetta Genomics Ltd. Targeting micrornas for the treatment of liver cancer
US8513209B2 (en) 2007-11-09 2013-08-20 The Board Of Regents, The University Of Texas System Micro-RNAS of the MIR-15 family modulate cardiomyocyte survival and cardiac repair
US20110257244A1 (en) * 2008-01-18 2011-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides and small molecules for use in reducing micro rna activity levels and uses thereof
JP5662166B2 (ja) * 2008-02-28 2015-01-28 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイションＴｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 胃癌の診断、予後診断及び治療のためのマイクロｒｎａに基づいた方法及び組成物
EP2260109A4 (en) * 2008-02-28 2011-06-08 Univ Ohio State Res Found METHODS AND COMPOSITIONS BASED ON MICRO-RNA FOR DIAGNOSING, PROGNOSING AND TREATING PROSTATE-RELATED DISORDERS
WO2009109665A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
CA2718520C (en) * 2008-03-17 2020-01-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Identification of micro-rnas involved in neuromuscular synapse maintenance and regeneration
WO2009124295A2 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and having reduced toxicity
US8492357B2 (en) 2008-08-01 2013-07-23 Santaris Pharma A/S Micro-RNA mediated modulation of colony stimulating factors
US9068232B2 (en) * 2008-08-06 2015-06-30 Rosetta Genomics Ltd. Gene expression signature for classification of kidney tumors
EP2340309A2 (en) 2008-09-22 2011-07-06 Rxi Pharmaceuticals Corporation Neutral nanotransporters
US9132147B2 (en) * 2008-12-31 2015-09-15 Roche Innovation Center Copenhagen Use of LNA ApoB antisense oligomers for the treatment of acute coronary syndromes
CA2751489A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual targeting of mir-208 and mir-499 in the treatment of cardiac disorders
EP2401406A4 (en) * 2009-02-25 2012-09-19 Cepheid METHODS OF DETECTING LUNG CANCER
US9034837B2 (en) * 2009-04-24 2015-05-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical compositions for treatment of HCV patients that are poor-responders to interferon
WO2010133970A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Eth Zurich Targeting micrornas for metabolic disorders
WO2010135714A2 (en) * 2009-05-22 2010-11-25 The Methodist Hospital Research Institute Methods for modulating adipocyte expression using microrna compositions
WO2010144485A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Miragen Therapeutics CHEMICAL MODIFICATION MOTIFS FOR miRNA INHIBITORS AND MIMETICS
WO2011017089A1 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Mirna inhibition of six1 expression
WO2011016714A1 (en) * 2009-08-06 2011-02-10 Umc Utrecht Holding B.V. Means and methods for counteracting, delaying and/or preventing adverse energy metabolism switches in heart disease
US8822144B2 (en) 2009-08-19 2014-09-02 Rosetta Genomics Ltd. Compositions and methods for prognosis and treatment of prostate cancer
FR2953220B1 (fr) * 2009-12-01 2012-11-23 Oreal Signature microarn de la differenciation epidermique et utilisations
EP2476758A4 (en) * 2009-09-07 2013-04-03 Yoshiki Murakami METHOD FOR PREDICTING THE THERAPEUTIC EFFECT ON CHRONIC HEPATITIS C
US20120231970A1 (en) * 2009-09-30 2012-09-13 Japan Health Sciences Foundation Colon cancer marker and method for testing for colon cancer
US9364495B2 (en) 2009-10-20 2016-06-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oral delivery of therapeutically effective LNA oligonucleotides
WO2011060100A1 (en) * 2009-11-11 2011-05-19 Sanford-Burnham Medical Research Institute Method for generation and regulation of ips cells and compositions thereof
CN101798594A (zh) * 2009-11-13 2010-08-11 北京命码生科科技有限公司 检测牛乳质量的标志物、检测方法、生物芯片和试验盒
US8916533B2 (en) 2009-11-23 2014-12-23 The Ohio State University Materials and methods useful for affecting tumor cell growth, migration and invasion
WO2011069100A2 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Duke University Microrna and use thereof in identification of b cell malignancies
US20110171323A1 (en) * 2010-01-09 2011-07-14 The Translational Genomics Research Institute Methods and kits to predict prognostic and therapeutic outcome in small cell lung cancer
US8841269B2 (en) * 2010-02-23 2014-09-23 Creighton University Polynucleotides for use in treating and diagnosing cancers
AU2011219029B2 (en) * 2010-02-26 2017-02-02 Columbia University Methods and compositions for the detection and treatment of cancer involving miRNAs and miRNA inhibitors and targets
EP2544703A4 (en) 2010-03-12 2013-09-18 Brigham & Womens Hospital METHODS OF TREATING VASCULAR INFLAMMATORY DISORDERS
EP2865765B1 (en) * 2010-04-20 2016-08-17 Hummingbird Diagnostics GmbH Complex miRNA sets as novel biomarkers for an acute coronary syndrome
CN102140462B (zh) * 2010-04-29 2013-06-12 苏州吉玛基因股份有限公司 人miR-1260反义核酸及其应用
WO2011146937A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-24 The Translational Genomics Research Institute Methods and kits useful in diagnosing nsclc
WO2011153542A2 (en) * 2010-06-04 2011-12-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Regulation of metabolism by mir-378
US20120015830A1 (en) * 2010-06-21 2012-01-19 Diogenix, Inc. Microrna profiles for evaluating multiple sclerosis
NZ719520A (en) 2010-07-06 2017-07-28 Int Tech Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
CN102002494B (zh) * 2010-07-08 2012-12-12 浙江理工大学 microRNA生物标志物及其用途
WO2012012716A2 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Regulus Therapeutics, Inc. Targeting micrornas for the treatment of fibrosis
GB201012418D0 (en) 2010-07-23 2010-09-08 Santaris Pharma As Process
WO2012027601A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 The General Hospital Corporation Methods targeting mir-33 micrornas for regulating lipid metabolism
CN102399852A (zh) * 2010-09-08 2012-04-04 上海市公共卫生临床中心 用于预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱及检测试剂盒
EP2625292B1 (en) 2010-10-07 2018-12-05 The General Hospital Corporation Biomarkers of cancer
CN103648505B (zh) 2010-11-12 2016-09-28 俄亥俄州立大学研究基金会 与微rna-21、错配修复和结肠直肠癌相关的材料和方法
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
JP6336755B2 (ja) 2010-11-12 2018-06-06 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ポリコームに関連する非コードｒｎａ
BR112013011942A2 (pt) 2010-11-15 2016-11-01 Univ Michigan formulação, forma de dosagem de droga para administração transmucosa oral, sistema transmucoso de fornecimento de droga, método de tratamento e profilaxia de uma doença ou distúrbio, método de tratamento, formulação, método para tratamento ou prevenção de carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (hnscc), método para quimioprevenção de um câncer oral ou condição pré-cancerosa, método para aumentar a concentração de uma composição de retinida, método de tratamento e profilaxia de uma doença ou condição, método de ratamento de um sujeito apresentando uma condição médica sintomática, método de tratamento de um câncer oral ou condição pré-cancerosa num paciente, método para fazer um sistema de fornecimento de droga bucal, método para aumentar a liberação e permeação de uma composição de retinida.
JP2014504857A (ja) 2010-12-15 2014-02-27 ミラゲン セラピューティクス ロックドヌクレオチドを含むｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
EP2663323B1 (en) 2011-01-14 2017-08-16 The General Hospital Corporation Methods targeting mir-128 for regulating cholesterol/lipid metabolism
US20120244530A1 (en) * 2011-01-26 2012-09-27 Cepheid Methods of detecting lung cancer
CN102643810B (zh) * 2011-02-18 2015-12-16 中国科学院上海药物研究所 人miR-299-5p的反义寡聚核苷酸及其应用
CN102643811B (zh) * 2011-02-18 2015-12-09 中国科学院上海药物研究所 人miR-1229的反义寡聚核苷酸及其应用
CN102643808B (zh) * 2011-02-18 2016-01-20 中国科学院上海药物研究所 人miR-1539的反义寡聚核苷酸及其应用
CN102643813B (zh) * 2011-02-18 2015-07-29 中国科学院上海药物研究所 人miR-504的反义寡聚核苷酸及其应用
CN102643814B (zh) * 2011-02-18 2015-06-17 中国科学院上海药物研究所 人miR-431的反义寡聚核苷酸及其应用
CN102643806B (zh) * 2011-02-18 2016-08-03 中国科学院上海药物研究所 人miR-1913的反义寡聚核苷酸及其应用
CN102643809B (zh) * 2011-02-18 2016-01-20 中国科学院上海药物研究所 人miR-1274b的反义寡聚核苷酸及其应用
CA2832818A1 (en) * 2011-04-06 2012-10-11 The Trustees Of Princeton University Anti-viral combination therapy
WO2012145374A1 (en) 2011-04-19 2012-10-26 Regulus Therapeutics Inc. TARGETING miR-378 FAMILY MEMBERS FOR THE TREATMENT OF METABOLIC DISORDERS
LT3211082T (lt) * 2011-04-25 2021-05-10 Sanofi Mikro rnr junginiai ir būdai mir-21 aktyvumui moduliuoti
WO2012149557A1 (en) * 2011-04-28 2012-11-01 New York University miR-33 INHIBITORS AND USES THEREOF TO DECREASE INFLAMMATION
KR101800243B1 (ko) 2011-06-22 2017-12-20 (주)아모레퍼시픽 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 색소형성유전자 발현조절용 조성물
JP2014522814A (ja) * 2011-06-23 2014-09-08 ステラ・アンパルトセルスカブ Ｈｃｖ併用療法
US20140194491A1 (en) * 2011-06-24 2014-07-10 Syddansk Universitet Modulation of microrna-138 for the treatment of bone loss
KR20140064765A (ko) * 2011-06-30 2014-05-28 스텔라 에이피에스 Hcv 조합 치료
CN102851282B (zh) * 2011-06-30 2014-10-08 上海市肿瘤研究所 用于区分原发性肺癌与癌旁组织的microRNA标志物
EP2726611A1 (en) * 2011-06-30 2014-05-07 Stella ApS Hcv combination therapy
WO2013013165A2 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of lna compounds for therapeutic inhibition of mir-21 in systemic lupus erythematosus
JP5995849B2 (ja) * 2011-08-29 2016-09-21 学校法人 新潟科学技術学園 新潟薬科大学 ヒト白血病細胞のアポトーシスを誘導するヘプタマー型スモールガイド核酸
US9018188B2 (en) * 2011-09-13 2015-04-28 Ottawa Hospital Research Institute MicroRNA inhibitors
EP2756080B1 (en) 2011-09-14 2019-02-20 Translate Bio MA, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
US9428749B2 (en) 2011-10-06 2016-08-30 The Board Of Regents, The University Of Texas System Control of whole body energy homeostasis by microRNA regulation
CA2851280C (en) 2011-10-11 2021-05-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Micrornas in neurodegenerative disorders
CA2852066A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 The Ohio State University Methods and materials related to ovarian cancer
AU2012334214A1 (en) 2011-11-07 2014-05-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Prognostic method for checking efficacy of micro RNA-122 inhibitors in HCV+ patients
WO2013068348A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Santaris Pharma A/S Lna oligomers for improvement in hepatic function
JP2015504847A (ja) * 2011-11-30 2015-02-16 シーダーズ−サイナイ メディカル センター 前立腺癌骨転移および薬剤耐性肺癌を治療するためのマイクロｒｎａｍｉｒ−４０９−５ｐ、ｍｉｒ−３７９、およびｍｉｒ−１５４＊の標的化
US9745578B2 (en) 2011-11-30 2017-08-29 Cedars-Sinai Medical Center Targeting microRNA miR-409-3P to treat prostate cancer
US20140351963A1 (en) * 2011-12-10 2014-11-27 Ohio State Innovation Foundation MiRNAs Useful to Reduce Lung Cancer Tumorigenesis and Chemotherapy Resistance and Related Compositions and Methods
JP2015501843A (ja) 2011-12-13 2015-01-19 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ、エキソソーム阻害、およびがん転移に関する方法および組成物
EP2791337A1 (en) * 2011-12-15 2014-10-22 Oncostamen S.r.l. Micrornas and uses therof
US10519506B2 (en) * 2011-12-22 2019-12-31 Baylor Research Institute Identification of metastasis-specific miRNA and hypomethylation signatures in human colorectal cancer
CN104685065B (zh) 2012-01-20 2017-02-22 俄亥俄州立大学 浸润性和预后的乳腺癌生物标志物标签
WO2013134403A1 (en) * 2012-03-06 2013-09-12 The Washington University Method of treating neurodegenerative diseases with microrna regulators
AU2013251696B2 (en) * 2012-04-25 2018-11-15 Sanofi MicroRNA compounds and methods for modulating miR-21 activity
WO2013170146A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Uab Research Foundation Methods and compositions for modulating mir-204 activity
WO2013173645A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating utrn expression
EP2850189B8 (en) 2012-05-16 2019-01-23 Translate Bio MA, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
JP2015523853A (ja) 2012-05-16 2015-08-20 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ａｔｐ２ａ２発現を調節するための組成物及び方法
WO2013173608A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
JP2015518710A (ja) 2012-05-16 2015-07-06 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド ヘモグロビン遺伝子ファミリー発現を調節するための組成物及び方法
KR20150030205A (ko) 2012-05-16 2015-03-19 라나 테라퓨틱스, 인크. Smn 유전자 패밀리 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
US9163235B2 (en) * 2012-06-21 2015-10-20 MiRagen Therapeutics, Inc. Inhibitors of the miR-15 family of micro-RNAs
WO2013192576A2 (en) * 2012-06-21 2013-12-27 Miragen Therapeutics Oligonucleotide-based inhibitors comprising locked nucleic acid motif
EP2882496B1 (en) 2012-08-13 2019-10-09 The Rockefeller University Treatment and diagnosis of melanoma
CN103627704A (zh) * 2012-08-30 2014-03-12 苏州博泰安生物科技有限公司 前列腺癌分子标志物miR-19a及其应用
JP2015529469A (ja) 2012-09-14 2015-10-08 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 多量体オリゴヌクレオチド化合物
UA116639C2 (uk) 2012-10-09 2018-04-25 Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк. Способи лікування синдрому альпорта
US9493838B2 (en) 2012-10-10 2016-11-15 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Biomarkers and treatments for heart failure
US9267139B2 (en) 2012-10-11 2016-02-23 Georgia Regents Research Institute, Inc. Compositions and methods for treating musculoskeletal diseases and disorders
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
WO2014071205A1 (en) * 2012-11-02 2014-05-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for diagnosis, prognosis and treatment of hematological malignancies
WO2014078749A1 (en) * 2012-11-15 2014-05-22 The Regents Of The University Of California Splice modulating oligonucleotides that inhibit cancer
US10077443B2 (en) 2012-11-15 2018-09-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
EP2733220B1 (en) * 2012-11-16 2017-10-18 Siemens Aktiengesellschaft Novel miRNA as a diagnostic marker for Alzheimer's Disease
EP2733219B1 (en) 2012-11-16 2017-09-20 Siemens Aktiengesellschaft Diagnostic miRNA markers for Alzheimer
US10011873B2 (en) 2012-11-16 2018-07-03 Universitat Des Saarlandes Diagnostic miRNA markers for Parkinson disease
WO2014108759A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Pierfrancesco Tassone INHIBITORS OF miRNAs 221 AND 222 FOR ANTI-TUMOR ACTIVITY IN MULTIPLE MYELOMA
PL2759595T3 (pl) * 2013-01-24 2017-09-29 Pierre Fabre Médicament S.A.S. Kompozycja zawierająca kapsułkowany antagomir
DK2951305T3 (en) * 2013-01-30 2018-10-29 Hoffmann La Roche LNA oligonucleotide KULHYDRATKONJUGATER
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
US20160145612A1 (en) * 2013-03-06 2016-05-26 Royal College Of Surgeons In Ireland Diagnosis and treatment of metabolic disorders
KR101465319B1 (ko) * 2013-03-08 2014-11-28 서울대학교산학협력단 마이크로 rna 분해 엘리먼트 및 그 용도
WO2014145142A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Miles Gregory Method of improving survival in cancer
WO2014151835A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Miragen Therapeutics, Inc Locked nucleic acid inhibitor of mir-145 and uses thereof
TW201446791A (zh) 2013-05-01 2014-12-16 Regulus Therapeutics Inc 用於調節mir-122之微小rna化合物及方法
CN105164261B (zh) 2013-05-01 2022-03-18 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
CN103290010B (zh) * 2013-05-16 2015-09-16 南京市妇幼保健院 与胎儿先天性心脏病相关的母体血清/血浆miRNA标志物mir-375及其应用
EP3007706A4 (en) 2013-06-12 2017-05-17 New York University Anti-mir-27b and anti-mir-148a oligonucleotides as therapeutic tools for treating dyslipidemias and cardiovascular diseases
WO2014201314A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Joslin Diabetes Center, Inc. Microrna and uses in brown fat differentiation
EP3013958B1 (en) * 2013-06-25 2019-12-25 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Glucan-encapsulated sirna for treating type 2 diabetes mellitus
CN112263682A (zh) 2013-06-27 2021-01-26 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物
JP2016523966A (ja) * 2013-07-08 2016-08-12 インターナショナル ディハイドレーティッド フーズ， インコーポレイテッド 家禽から調製した組成物およびその使用方法
US11478504B2 (en) 2013-07-08 2022-10-25 International Dehydrated Foods, Inc. Compositions and methods for preventing/treating metabolic syndrome
CN104342439B (zh) * 2013-07-23 2017-06-23 中国科学院遗传与发育生物学研究所 miR‑7及其应用
WO2015051283A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
US9994846B2 (en) 2013-10-25 2018-06-12 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compounds and methods for modulating miR-21 activity
WO2015104706A1 (en) * 2014-01-08 2015-07-16 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Mir-122* as an active micro-rna, compositions comprising the same and uses thereof
CN104774914B (zh) * 2014-01-09 2018-01-09 复旦大学附属儿科医院 胆道闭锁及淤胆型婴儿肝炎综合征的microRNA血清标志物检测及其应用
AU2015204572B2 (en) 2014-01-10 2020-07-30 Inspirna, Inc. LXR agonists and uses thereof
CN104974987B (zh) * 2014-04-04 2018-06-19 宁夏医科大学 微小分子RNA-1247-5p作为新型肿瘤治疗分子靶标的用途
CN103937888B (zh) * 2014-04-14 2016-08-17 上海交通大学 鉴别胃癌的血浆microRNA标志物的筛选与应用
CN103940998B (zh) * 2014-05-04 2016-04-20 山东大学 血清microRNA作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物的应用
DK3155120T5 (en) * 2014-06-13 2019-01-28 Univ Wien Bodenkultur Procedures for diagnosing bone fractures and disorders
WO2015200697A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 The General Hospital Corporation Targeting human satellite ii (hsatii)
JP6819907B2 (ja) * 2014-07-31 2021-01-27 エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ 修飾抗ｍｉｒ−１３８オリゴヌクレオチド
EP3177327A4 (en) 2014-08-04 2018-03-14 Miragen Therapeutics, Inc. Inhibitors of myh7b and uses thereof
SG11201610877PA (en) 2014-08-07 2017-02-27 Regulus Therapeutics Inc Targeting micrornas for metabolic disorders
CA2966044A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
US10206955B2 (en) * 2014-11-05 2019-02-19 Emory University Compositions of ascorbic acid and bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) for cell growth and uses related thereo
WO2016077574A1 (en) * 2014-11-12 2016-05-19 The General Hospital Corporation INHIBITORS OF MICRORNAs miR-155, miR-103, miR-105 and miR-107 THAT REGULATE PRODUCTION OF ATRIAL NATRIURETIC PEPTIDE (ANP) AS THERAPEUTICS AND USES THEREOF
AU2015349638A1 (en) * 2014-11-21 2017-06-15 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probes and uses thereof
EP3234141A4 (en) * 2014-12-18 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir tm compounds
SG10201906716QA (en) 2015-01-20 2019-08-27 Miragen Therapeutics Inc Mir-92 inhibitors and uses thereof
US10758558B2 (en) 2015-02-13 2020-09-01 Translate Bio Ma, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
WO2016138287A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 Washington University METHODS TO DETECT MOTOR NEURON DISEASE COMPRISING MICRO-RNAs
WO2016145008A2 (en) * 2015-03-09 2016-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Mirna for treatment of breast cancer
WO2016149455A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The General Hospital Corporation The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1)
WO2016160882A1 (en) * 2015-04-01 2016-10-06 Baylor Research Institute Methods for diagnosing and treating colorectal cancer using mirna549a
WO2016164463A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 The General Hospital Corporation Methods for reactivating genes on the inactive x chromosome
JP2018517704A (ja) * 2015-06-05 2018-07-05 ミラゲン セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するためのｍｉＲ−１５５阻害剤
RU2718534C2 (ru) 2015-06-05 2020-04-08 Мираджен Терапьютикс, Инк. Ингибиторы mir-155 для лечения кожной t-клеточной лимфомы (ctcl)
AU2016282986A1 (en) 2015-06-26 2018-02-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Cancer therapy targeting tetraspanin 33 (tspan33) in myeloid derived suppressor cells
US10541482B2 (en) 2015-07-07 2020-01-21 Amphenol Fci Asia Pte. Ltd. Electrical connector with cavity between terminals
US10457941B2 (en) 2015-08-20 2019-10-29 ASOCIACION CENTRO DE INVESTIGACION COOPERATIVA EN BIOCIENCIAS-CIC bioGUNE Methods and compositions to treat liver diseases and conditions
CN107922945A (zh) 2015-08-24 2018-04-17 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 Lna‑g 方法
WO2017055423A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process
WO2017066712A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 The Children's Medical Center Corporation Modulators of telomere disease
EP3394258B1 (en) 2015-10-22 2021-09-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S In vitro toxicity screening assay
CA3005878A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
EP3419665A4 (en) 2016-02-25 2019-10-16 The Brigham and Women's Hospital, Inc. METHODS OF TREATING FIBROSIS BY TARGETING SMOC2
CN108779139A (zh) 2016-03-18 2018-11-09 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 酰基保护的l-lna-鸟嘌呤核苷单体
WO2017192959A2 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 The Research Foundation For The State University Of New York Therapeutically modulating apob and apoai
EP3455232B1 (en) * 2016-05-12 2020-05-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Enhanced coupling of stereodefined oxazaphospholidine phosphoramidite monomers to nucleoside or oligonucleotide
EP3254683A1 (en) 2016-06-06 2017-12-13 Medizinische Hochschule Hannover Medicament for the treatment of acute liver failure
WO2017216325A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag In vitro nephrotoxicity screening assay
WO2017216340A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag In vitro nephrotoxicity screening assay
WO2018013525A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
EP3532638A4 (en) 2016-10-31 2020-07-29 University of Massachusetts TARGETING MICROARN-101-3 P IN CARCINOTHERAPY
WO2018106566A1 (en) * 2016-12-05 2018-06-14 Regulus Therapeutics Inc. Modified oligonucleotides for treatment of polycystic kidney disease
WO2018165532A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 Baylor Research Institute Methods for diagnosing and treating gastric cancer using mirna expression
KR20190133173A (ko) 2017-03-29 2019-12-02 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스 유니링커 신속 절단
WO2018177825A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Orthogonal protecting groups for the preparation of stereodefined phosphorothioate oligonucleotides
US20200384115A1 (en) 2017-04-21 2020-12-10 The Broad Institute , Inc. Targeted delivery to beta cells
WO2019002237A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S METHOD OF MULTIPLE COUPLING AND OXIDATION
KR101871920B1 (ko) 2017-08-04 2018-07-02 (주)아모레퍼시픽 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물
JP2021502059A (ja) 2017-10-13 2021-01-28 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス 部分的に立体定義されたオリゴヌクレオチドのサブライブラリーを使用することによる、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、改良された立体定義されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変異体を同定するための方法
WO2019084717A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Amphenol Fci Asia Pte Ltd Low crosstalk card edge connector
WO2019089216A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating cancers
US11214536B2 (en) 2017-11-21 2022-01-04 Inspirna, Inc. Polymorphs and uses thereof
US10601181B2 (en) 2017-12-01 2020-03-24 Amphenol East Asia Ltd. Compact electrical connector
AU2018386527A1 (en) 2017-12-22 2020-04-30 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Gapmer oligonucleotides comprising a phosphorodithioate internucleoside linkage
JP7476102B2 (ja) 2017-12-22 2024-04-30 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド
EP4092118A1 (en) 2017-12-22 2022-11-23 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel thiophosphoramidites
CN109985243B (zh) * 2017-12-29 2021-06-29 中国科学院上海药物研究所 靶向PCSK9的microRNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用
WO2019140231A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
JP2021518841A (ja) * 2018-03-14 2021-08-05 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター マイクロｒｎａと肥満症
WO2019209704A1 (en) * 2018-04-23 2019-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Microrna 584-5p compositions and methods for treating cancer
CN109321655B (zh) * 2018-05-17 2022-07-05 福建省肿瘤医院（福建省肿瘤研究所、福建省癌症防治中心） Nkiras2基因调控区序列、调控序列及其在鼻咽癌中的应用
EP3793685A1 (en) 2018-05-18 2021-03-24 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
TW202020155A (zh) 2018-07-31 2020-06-01 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 含有三硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸
CN112236439A (zh) 2018-07-31 2021-01-15 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 包含三硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸
JP2021534759A (ja) 2018-08-23 2021-12-16 ロシュ・イノベーション・センター・コペンハーゲン・アクティーゼルスカブRoche Innovation Center Copenhagen A/S Ｍｉｃｒｏｒｎａ−１３４バイオマーカー
CA3110661A1 (en) 2018-08-29 2020-03-05 University Of Massachusetts Inhibition of protein kinases to treat friedreich ataxia
EP3620519A1 (en) 2018-09-04 2020-03-11 F. Hoffmann-La Roche AG Use of isolated milk extracellular vesicles for delivering oligonucleotides orally
WO2020051398A1 (en) * 2018-09-06 2020-03-12 Aptamir Therapeutics, Inc. Metabolic benefits of short mir-22 mirna antagomir therapies
WO2020073460A1 (en) 2018-10-09 2020-04-16 Amphenol Commercial Products (Chengdu) Co. Ltd. High-density edge connector
TWM576774U (zh) 2018-11-15 2019-04-11 香港商安費諾（東亞）有限公司 具有防位移結構之金屬殼體及其連接器
EP3914232A1 (en) 2019-01-25 2021-12-01 F. Hoffmann-La Roche AG Lipid vesicle for oral drug delivery
CA3130431A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Phosphonoacetate gapmer oligonucleotides
CA3129646A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel phosphoramidites
TWM582251U (zh) 2019-04-22 2019-08-11 香港商安費諾（東亞）有限公司 Connector set with built-in locking mechanism and socket connector thereof
WO2020223362A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-05 The Trustees Of The University Ofpennsylvania Compositions useful for treatment of pompe disease
CN110283794B (zh) * 2019-05-30 2021-04-23 伍泽堂 重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物
PE20220902A1 (es) 2019-06-26 2022-05-30 Biorchestra Co Ltd Nanoparticulas micelares y sus usos
US10844383B1 (en) 2019-09-18 2020-11-24 Dasman Diabetes Institute Microrna dyslipidemia inhibitor
US11588277B2 (en) 2019-11-06 2023-02-21 Amphenol East Asia Ltd. High-frequency electrical connector with lossy member
US11799230B2 (en) 2019-11-06 2023-10-24 Amphenol East Asia Ltd. High-frequency electrical connector with in interlocking segments
CA3161274A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Stephen Wald Metal salts and uses thereof
US11058710B1 (en) 2020-02-14 2021-07-13 Dasman Diabetes Institute MicroRNA ANGPTL3 inhibitor
CA3174443A1 (en) * 2020-03-04 2021-09-10 The Trustees Of Indiana University Methods to re-engage a fetal wound healing pathway for adult skin repair
CA3179768A1 (en) * 2020-04-09 2021-10-14 Biovista, Inc. Compositions and methods for treating viral infections
WO2021226663A1 (en) * 2020-05-11 2021-11-18 The Florey Institute Of Neuroscience And Mental Health Compositions and methods for treating disorders associated with loss-of-function mutations in syngap1
US11652307B2 (en) 2020-08-20 2023-05-16 Amphenol East Asia Electronic Technology (Shenzhen) Co., Ltd. High speed connector
CN212874843U (zh) 2020-08-31 2021-04-02 安费诺商用电子产品(成都)有限公司 电连接器
WO2022245981A2 (en) * 2021-05-18 2022-11-24 Cornell University Use of microrna mimics to inhibit or treat liver disease
WO2023067038A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Process for oligonucleotide purification
WO2023122805A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vestaron Corporation Sorbitol driven selection pressure method
WO2023170659A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Conicet) Breast cancer diagnostic and treatment
US20230399644A1 (en) * 2022-04-29 2023-12-14 University Of Massachusetts Selective rna-modulating agents
CN114990159A (zh) * 2022-05-18 2022-09-02 昆明理工大学 一种micorRNA206抑制HCV增殖的建立方法
WO2024033441A1 (en) * 2022-08-09 2024-02-15 Geg Tech Transient expression system for rna
WO2024033444A1 (en) * 2022-08-09 2024-02-15 Geg Tech Transient expression system for rna, for cosmetic uses
WO2024033448A1 (en) * 2022-08-09 2024-02-15 Geg Tech Transient expression system for rna, for vaccination
WO2024033446A1 (en) * 2022-08-09 2024-02-15 Geg Tech Transient expression system for rna, for gene editing

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007112753A2 (en) * 2006-04-03 2007-10-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2806208A (en) 1951-09-29 1957-09-10 Columbia Broadcasting Syst Inc Vacuum tube voltmeter
US4962029A (en) * 1987-10-02 1990-10-09 Cetus Corporation Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US4920115A (en) * 1988-12-28 1990-04-24 Virginia Commonwealth University Method of lowering LDL cholesterol in blood
JPH06311885A (ja) 1992-08-25 1994-11-08 Mitsubishi Kasei Corp Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
NZ286209A (en) 1992-09-10 2000-09-29 Isis Pharmaceuticals Inc Use of HCV RNA anti-sense nucleotide sequences for treating Hepatitis C virus related disease
US6433159B1 (en) * 1992-09-10 2002-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus associated diseases
US6423489B1 (en) 1992-09-10 2002-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
WO1995030746A1 (en) 1994-05-10 1995-11-16 The General Hospital Corporation Antisense inhibition of hepatitis c virus
DE69529849T2 (de) 1995-06-07 2003-09-04 Pfizer Biphenyl-2-carbonsäure-tetrahydro-isochinolin-6-yl amid derivate, deren hestellung und deren verwendung als inhibitoren des mikrosomalen triglycerid-transfer-proteins und/oder der apolipoprotein b (apo b) sekretion
AU716151B2 (en) * 1996-11-27 2000-02-17 Pfizer Inc. Apo B-secretion/MTP inhibitory amides
JP2001514508A (ja) * 1997-03-05 2001-09-11 ユニバーシティー オブ ワシントン Ｃ型肝炎ウイルスの複製を選択的に抑制する薬剤を同定するための新規なスクリーニング法
CA2303299C (en) 1997-09-12 2016-02-23 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
CA2285613C (en) * 1998-02-20 2008-03-25 Decoma International Corp. Mold clamp
WO2000056748A1 (en) 1999-03-18 2000-09-28 Exiqon A/S Xylo-lna analogues
AU3418800A (en) 1999-03-24 2000-10-09 Exiqon A/S Improved synthesis of (2.2.1)bicyclo nucleosides
CA2372085C (en) 1999-05-04 2009-10-27 Exiqon A/S L-ribo-lna analogues
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
EP1224280A2 (en) 1999-10-04 2002-07-24 Exiqon A/S Design of high affinity rnase h recruiting oligonucleotide
IL139450A0 (en) 1999-11-10 2001-11-25 Pfizer Prod Inc Methods of administering apo b-secretion/mtp inhibitors
AU2001277170A1 (en) 2000-07-25 2002-02-05 Authentisure, Inc. Unified trust model providing secure identification, authentication and validation of physical products and entities, and processing, storage, and exchange of information
ATE325806T1 (de) 2000-10-04 2006-06-15 Santaris Pharma As Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga
US20030068320A1 (en) * 2001-03-02 2003-04-10 Christine Dingivan Methods of administering/dosing CD2 antagonists for the prevention and treatment of autoimmune disorders or inflammatory disorders
CA2442092A1 (en) 2001-03-26 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
WO2003070750A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc Rna interference mediated inhibition of hepatitis c virus
US20030125241A1 (en) 2001-05-18 2003-07-03 Margit Wissenbach Therapeutic uses of LNA-modified oligonucleotides in infectious diseases
AU2002328792A1 (en) 2001-07-12 2003-01-29 Santaris Pharma A/S Method for preparation of lna phosphoramidites
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
IL161100A0 (en) 2001-09-28 2004-08-31 Max Planck Gesellschaft Identification of novel genes coding for small temporal rnas
US7459461B2 (en) * 2001-10-19 2008-12-02 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Phosphonic acid compounds as inhibitors of serine proteases
JP4476802B2 (ja) 2002-05-08 2010-06-09 サンタリス ファーマ アー／エス ロックト核酸誘導体の製造
UA79300C2 (en) * 2002-08-12 2007-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b secretion
US7183302B2 (en) * 2002-08-12 2007-02-27 Bristol-Myers Squibb Company Iminothiazolidinones as inhibitors of HCV replication
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
WO2004044181A2 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US7687617B2 (en) 2002-11-18 2010-03-30 Santaris Pharma A/S Oligonucleotides with alternating segments of locked and non-locked nucleotides
US8124582B2 (en) 2002-12-06 2012-02-28 Fibrogen, Inc. Treatment of diabetes
FR2848572B1 (fr) * 2002-12-12 2005-12-09 Univ Joseph Fourier Molecules inhibitrices de la synthese proteique du virus de l'hepatite c et procede de criblage desdites molecules inhibitrices
MXPA05008319A (es) 2003-02-10 2006-02-28 Santaris Pharma As Compuestos oligomericos para la modulacion de la expresion de survivina.
KR20050115231A (ko) 2003-02-10 2005-12-07 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 포유동물 세포의 조절
US7683036B2 (en) * 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
EP1668145A4 (en) 2003-08-07 2010-03-10 Avi Biopharma Inc SENSE ANTIVIRUS COMPOUND AND METHOD FOR TREATING SSRNA VIRUS INFECTION
US20050142581A1 (en) 2003-09-04 2005-06-30 Griffey Richard H. Microrna as ligands and target molecules
AU2004294567A1 (en) 2003-11-26 2005-06-16 University Of Massachusetts Sequence-specific inhibition of small RNA function
UA83510C2 (en) 2003-12-09 2008-07-25 Янссен Фармацевтика Н.В. N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b
BRPI0418104A (pt) 2003-12-23 2007-04-17 Santaris Pharma As compostos oligoméricos para a modulação de bcl-2
EP1713938A2 (en) 2004-02-09 2006-10-25 Thomas Jefferson University DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCERS WITH MicroRNA LOCATED IN OR NEAR CANCER-ASSOCIATED CHROMOSOMAL FEATURES
EP1723162A4 (en) 2004-02-13 2010-05-05 Univ Rockefeller ANTI-microRNA oligonucleotide molecules
US20050182005A1 (en) * 2004-02-13 2005-08-18 Tuschl Thomas H. Anti-microRNA oligonucleotide molecules
DE102004015101B4 (de) 2004-03-27 2012-04-26 Eastman Kodak Co. Verfahren und Sensoreinrichtung zum Steuern eines endlosen, eine Naht aufweisenden Transportmediums für eine Druckmaschine
ES2380923T3 (es) 2004-04-07 2012-05-21 Exiqon A/S Procedimientos de cuantificación de microARN y ARN interferentes pequeños
US7365058B2 (en) * 2004-04-13 2008-04-29 The Rockefeller University MicroRNA and methods for inhibiting same
CA2585525A1 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genaco Biomedical Products, Inc. Method for detecting ncrna
PL1747023T5 (pl) 2004-05-04 2017-05-31 Univ Leland Stanford Junior Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych
EP1828215A2 (en) 2004-07-21 2007-09-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
US20080213891A1 (en) 2004-07-21 2008-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi Agents Comprising Universal Nucleobases
FR2873694B1 (fr) 2004-07-27 2006-12-08 Merck Sante Soc Par Actions Si Nouveaux aza-indoles inhibiteurs de la mtp et apob
WO2006112872A2 (en) 2004-08-04 2006-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
ES2663810T3 (es) 2004-08-10 2018-04-17 Kastle Therapeutics, Llc Métodos para modular los niveles de lipoproteínas y colesterol en humanos
US7582744B2 (en) 2004-08-10 2009-09-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides
WO2006027776A1 (en) 2004-09-07 2006-03-16 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Agents, compositions and methods for treating pathologies in which regulating an ache-associated biological pathway is beneficial
NZ572403A (en) 2004-09-24 2010-03-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Rnai modulation of apob and uses thereof
CA2850323A1 (en) 2004-11-12 2006-12-28 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
EP2199298A1 (en) 2004-11-17 2010-06-23 Protiva Biotherapeutics Inc. Sirna silencing of Apolipoprotein B
US20060185027A1 (en) 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
WO2006069584A2 (en) 2004-12-29 2006-07-06 Exiqon A/S NOVEL OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND PROBE SEQUENCES USEFUL FOR DETECTION AND ANALYSIS OF microRNAs AND THEIR TARGET mRNAs
US20070065840A1 (en) * 2005-03-23 2007-03-22 Irena Naguibneva Novel oligonucleotide compositions and probe sequences useful for detection and analysis of microRNAS and their target mRNAS
NZ563009A (en) 2005-04-19 2011-05-27 Surface Logix Inc Inhibitors of microsomal triglyceride transfer protein and Apo-B secretion
US20060265771A1 (en) * 2005-05-17 2006-11-23 Lewis David L Monitoring microrna expression and function
US20090209621A1 (en) 2005-06-03 2009-08-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for decreasing microrna expression for the treatment of neoplasia
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
US20070123482A1 (en) 2005-08-10 2007-05-31 Markus Stoffel Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
EP2338992A3 (en) 2005-08-29 2011-10-12 Regulus Therapeutics, Inc Antisense compounds having enhanced anti-microRNA activity
CA2620856C (en) 2005-08-29 2017-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for use in modulating mir-122a
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
JP2009507499A (ja) 2005-09-15 2009-02-26 サンタリス ファーマ アー／エス Ａｐｏ−ｂ１００発現の抑制のためのｒｎａアンタゴニスト化合物
WO2007090073A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of micrornas
EA201100811A1 (ru) * 2006-04-03 2012-06-29 Сантарис Фарма А/С Фармацевтическая композиция
DK2015758T3 (da) 2006-05-05 2014-06-23 Isis Pharmaceuticals Inc Forbindelser og fremgangsmåder til modulering af ekspression af apob
US7547684B2 (en) 2006-05-11 2009-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7694029B2 (en) 2006-08-02 2010-04-06 International Business Machines Corporation Detecting miscabling in a storage area network
US20080199961A1 (en) 2006-08-25 2008-08-21 Avi Biopharma, Inc. ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS
WO2008034122A2 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Hindered ester-based biodegradable linkers for oligonucleotide delivery
AU2007296055A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric conjugates containing positively-charged moieties
EP2090665A2 (en) 2006-10-20 2009-08-19 Exiqon A/S Novel human microRNAs associated with cancer
EP2086590A4 (en) 2006-10-24 2011-04-06 Univ Leland Stanford Junior MODULATION OF A T-CELL SIGNALING THRESHOLD AND THE SENSITIVITY OF T-CELLS AGAINST ANTIGENE
EP2090127A2 (en) 2006-10-30 2009-08-19 Nokia Corporation Method, apparatus and system providing operator controlled mobility for user equipment
US20100021914A1 (en) * 2006-11-23 2010-01-28 Querdenker Aps Oligonucleotides for modulating target rna activity
WO2008074328A2 (en) 2006-12-21 2008-06-26 Exiqon A/S Microrna target site blocking oligos and uses thereof
DK2149605T3 (da) 2007-03-22 2013-09-30 Santaris Pharma As Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA
WO2008124384A2 (en) 2007-04-03 2008-10-16 Aegerion Pharmaceuticals, Inc. Combinations of mtp inhibitors with cholesterol absorption inhibitors or interferon for treating hepatitis c
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
WO2008154401A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
US8691965B2 (en) 2007-06-14 2014-04-08 Mirx Therapeutics Aps Oligonucleotides for modulating target RNA activity
US20090082297A1 (en) 2007-06-25 2009-03-26 Lioy Daniel T Compositions and Methods for Regulating Gene Expression
US20110009466A1 (en) 2007-08-29 2011-01-13 President And Fellows Of Harvard College Methods of increasing gene expression through rna protection
WO2009043354A2 (en) * 2007-10-04 2009-04-09 Santaris Pharma A/S Combination treatment for the treatment of hepatitis c virus infection
WO2009109665A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
WO2010000665A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Santaris Pharma A/S Antidote oligomers
US8398734B2 (en) 2008-08-01 2013-03-19 Twister B.V. Cyclonic separator with a volute outlet duct
US8492357B2 (en) 2008-08-01 2013-07-23 Santaris Pharma A/S Micro-RNA mediated modulation of colony stimulating factors
US9034837B2 (en) * 2009-04-24 2015-05-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical compositions for treatment of HCV patients that are poor-responders to interferon
US8942209B2 (en) 2009-08-12 2015-01-27 Qualcomm Incorporated Systems and methods for supporting an enhanced serving cell change when moving among different cell types
US9364495B2 (en) 2009-10-20 2016-06-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oral delivery of therapeutically effective LNA oligonucleotides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007112753A2 (en) * 2006-04-03 2007-10-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELMÉN J. ET AL.: "Antagonism of microRNA-122.in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 36, no. 4, 23 December 2007 (2007-12-23), pages 1153-1162, XP002533568 the whole document *
ELMÉN J. ET AL.: "LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates" NATURE, vol. 452, 17 April 2008 (2008-04-17), pages 896-900, XP002533567 the whole document *
FABANI M.M. AND GAIT M.J.: "miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates" RNA, vol. 14, February 2008 (2008-02), pages 336-346, ХР002533356 page 344, left-hand column the whole document *
OBAD S. ET AL.: "Targeting of cancer-associated microRNAs using short LNA-antimiR oligonucleotides" EUROPEAN JOURNAL OF CANCER SUPPLEMENTS, vol. 6, no. 9, July 2008 (2008-07), page 142, XP002533357, 20th Meeting of the European Association for Cancer Research; Lyon, FRANCE; July 05-08 2008, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
DK2205737T3 (da) 2013-05-21
CN101821391A (zh) 2010-09-01
CA2701547C (en) 2020-03-10
KR101889518B1 (ko) 2018-08-17
US20100280099A1 (en) 2010-11-04
ES2689508T3 (es) 2018-11-14
IL244498A0 (en) 2016-04-21
AU2008306327A1 (en) 2009-04-09
PL2623598T3 (pl) 2018-12-31
MX2010003299A (es) 2010-04-14
EP3492594A1 (en) 2019-06-05
WO2009043353A2 (en) 2009-04-09
MY156951A (en) 2016-04-15
US20100298410A1 (en) 2010-11-25
NZ583677A (en) 2012-06-29
JP6231029B2 (ja) 2017-11-15
ES2463665T3 (es) 2014-05-28
WO2009043353A3 (en) 2009-08-20
US8906871B2 (en) 2014-12-09
EP2203559B1 (en) 2014-02-26
EA201070421A1 (ru) 2010-10-29
CN101821391B (zh) 2016-04-27
US20090143326A1 (en) 2009-06-04
JP2010539959A (ja) 2010-12-24
CA2701547A1 (en) 2009-04-09
EP2623598B1 (en) 2018-08-01
EP2203559A2 (en) 2010-07-07
EP2623599A1 (en) 2013-08-07
US9790493B2 (en) 2017-10-17
EP2623599B1 (en) 2019-01-02
KR20100100774A (ko) 2010-09-15
EP2205737A2 (en) 2010-07-14
WO2009043354A3 (en) 2009-08-20
US20150299699A1 (en) 2015-10-22
ZA201002040B (en) 2012-01-25
DK2623599T3 (en) 2019-04-08
US8440637B2 (en) 2013-05-14
US8288356B2 (en) 2012-10-16
JP6035010B2 (ja) 2016-11-30
IL204254A (en) 2016-03-31
EP2623598A1 (en) 2013-08-07
US20180201928A1 (en) 2018-07-19
ES2406686T3 (es) 2013-06-07
WO2009043354A2 (en) 2009-04-09
EP2205737B1 (en) 2013-02-13
US10450564B2 (en) 2019-10-22
JP2015130862A (ja) 2015-07-23
AU2008306327B2 (en) 2014-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA019939B1 (ru) МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОЛИГОМЕР ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА микроРНК В КЛЕТКЕ
AU2017200365B2 (en) Compositions and methods for modulating apolipoprotein c-iii expression
RU2377301C2 (ru) ОЛИГОМЕРНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ПОНИЖАЮЩЕЕ ЭКСПРЕССИЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕНА Bcl-2, КОНЪЮГАТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОМЕРНОГО СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
CN102851291B (zh) 包含抗微小rna反义寡核苷酸的药物组合物
EA015570B1 (ru) Фармацевтическая композиция
CN104955952A (zh) Lna寡核苷酸碳水化合物缀合物
TW200848077A (en) Compounds for the modulation of beta-cantenin expression
CN110592083A (zh) 呼吸疾病相关基因特异性siRNA、含有siRNA的双螺旋寡RNA结构及其用途
JP6722586B2 (ja) アンチセンス抗悪性腫瘍剤
Unger et al. Mechanism and Efficacy of Sub–50-nm Tenfibgen Nanocapsules for Cancer Cell–Directed Delivery of Anti-CK2 RNAi to Primary and Metastatic Squamous Cell Carcinoma
CN102159712A (zh) 靶向gli2的rna拮抗剂
KR20120048613A (ko) Ｓｐａｒｃ 안티센스 조성물과 이들의 용도
CN101437942A (zh) 包含抗微小rna反义寡核苷酸的药物组合物
JP2024026274A (ja) マイクロｒｎａ関連疾患の処置のための薬学的組成物
CN102802637A (zh) 新的有力的抗apob反义化合物
CN114716518A (zh) 一种能够抑制pcsk9表达的分子构造及药物组合物
US8440809B2 (en) RNA antagonists targeting Hsp27
JP2022513111A (ja) Ａｎｇｐｔｌ８を阻害するための新規のｒｎａ組成物および方法
CN101292034A (zh) 抑制apo-b100表达的rna拮抗化合物
WO2022196668A1 (ja) Ｉｔｇａｖを標的とする核酸医薬
WO2012020839A1 (ja) 癌治療用医薬組成物
KR101247725B1 (ko) Ｓｏｄｉｕｍ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ-２ｂ유전자의 신규한 용도

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM