CN101798594A - 检测牛乳质量的标志物、检测方法、生物芯片和试验盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测牛乳质量的标志物、检测方法、生物芯片和试验盒，以牛乳中稳定存在且可检测的109种成熟体微小核糖核酸中的一种或任意一种以上的组合作为检测标志物。本发明通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸来建立唯一指向原始牛乳含量的标准，其意义在于从根本上杜绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的可能。

Description

检测牛乳质量的标志物、检测方法、生物芯片和试验盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测牛乳质量的标志物、检测方法、相关生物芯片和试验盒，它是一种通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸来建立唯一指向原始牛乳含量的标准，其意义在于从根本上杜绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的可能。
技术背景
近来年，相当数量的不法商贩通过向牛乳中掺水的方法来牟取不正当利益。由于牛乳中加水后会导致除水以外的各项指标降低。为了提高各项检测指标，不法商家在牛乳中掺水后又通过采用向牛乳里加入各种添加剂、并反复勾兑的办法来使牛乳达标。不法商贩最常用的有以下5种添加剂：脂肪油(提高脂肪指数)、蛋白(提高蛋白指数)、糊精(音)和乳清粉(提高各项指数)、二合一(也可相应提高各项指数，对蛋白指数最有效)。前述‘二合一’就是三聚氰胺，而在牛乳中添加三聚氰氨会导致小儿肾结石，三鹿奶粉事件就是不法商贩在牛乳中兑水后又添加三聚氰胺的典型案例。
现有的检测蛋白的方法主要是检测含氮量，由于三聚氰胺是一种含氮化合物，所以在现有的检测方法下，添加后可冒充蛋白含量。此外，如果不法分子添加豆粉，动物毛发等物品，现有的任何方法在上述违法添加物导致严重后果之前，都无法检测出。
因此，最根本的牛乳质量检测方法是能够检测一种在牛乳中稳定存在，稀释后其成分就降低或变化，且不受添加剂影响的物质。
微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中，目前已在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸。
微小核糖核酸在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用，其序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使之成为信使RNA强有力的调控因子。微小核糖核酸的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在RNA水平对分子进行更迅速更有效调节的新方式，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。微小核糖核酸的发现也是对中心法则中RNA次要的中介角色的重要补充，它将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其生长发育等方面的重要问题。
微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，如生长发育、细胞调亡以及脂肪代谢等等。申请人经过研究发现，微小核糖核酸在血清中稳定存在，能够对抗RNA酶的切割，并对高温、高压、强酸、强碱及反复冻融有抵抗。因此，基于微小核糖核酸的生物学特性，完成有可能通过微小核糖核酸来检测牛乳质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测牛乳乳液质量的标志物及其检测方法、相关生物芯片和试验盒。
申请人经过研究发现，微小核糖核酸存在于原乳，商品的液态乳及奶粉中，牛乳中的特异性微小核糖核酸图谱不受任何添加剂的影响，且与牛血清、牛尿的成分有区别，并与其它动物中的微小核糖核酸图谱也不相同。所以牛乳中的特异性微小核糖核酸图谱是一种完美的生物标志物，可以用来检测牛乳质量。
基于上述研究，申请人首先提出一种牛乳质量检测标记物，该检测标记物是在牛乳中稳定存在且可检测的109种成熟体微小核糖核酸任意一种或一种以上：
hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-30a、hsa-miR-31、hsa-miR-33a、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-101、hsa-miR-29b、hsa-miR-103、hsa-miR-106a、hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-200b、hsa-let-7g、hsa-let-7i、hsa-miR-15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、hsa-miR-125b、hsa-miR-128、hsa-miR-138、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-191、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-150、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-194、hsa-miR-320a、hsa-miR-200c、hsa-miR-155、hsa-miR-106b、hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-148b、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-5323p、hsa-miR-92b、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307
本发明还提供一种检测牛乳中的上述109种微小核糖核酸的方法，通过该方法可以确定原乳含量和质量。
上述测定牛乳中稳定存在且可检测109种微小核糖核酸的方法包括：RT-PCR方法、Real-time PCR方法、Northern blotting方法、RNase protection assay方法、Solexasequencing technology方法以及生物芯片方法。
所述RT-PCR方法包括以下步骤：
(1)提取牛乳总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的牛乳样本，以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
(2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
(3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
(4)EB染色后在紫外灯下观察结果。
RT-PCR方法。收集牛乳样本；将牛乳浆进行逆转录反应制备cDNA样品或使用Trizol试剂提取牛乳总RNA再进行逆转录反应制备cDNA样品；通过成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；EB染色后在紫外灯下观察结果并拍照。
所述Real-time PCR方法包括以下步骤：
(1)提取受试的牛乳总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试的牛乳样本，以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
(2)用微小核糖核酸设计引物；
(3)加入荧光探针进行PCR反应；
(4)检测并比较牛乳样本相对于正常牛乳中微小核糖核酸的量的变化。
Real-time PCR方法。收集牛乳样本；将牛乳进行逆转录反应制备cDNA样品或使用Trizol试剂提取牛乳总RNA再进行逆转录反应制备cDNA样品；通过成熟体微小核糖核酸设计PCR的引物并加入荧光探针EVA GREEN进行PCR反应；分析处理数据并比较结果。
所述Northern blotting方法包括以下步骤：
1、收集牛乳样本；
2、通过Trizol试剂提取牛乳总RNA；
3、进行变性PAGE电泳和膜转移实验；
4、制备同位素标记微小核糖核酸探针；
5、进行膜杂交反应；
6、同位素信号检测，如磷屏扫描检测结果。
上述RNase protection assay方法包括如下步骤：
1、进行反义RNA探针的合成，同位素标记与纯化；
2、收集牛乳样本并提取RNA；
3、将提取后的RNA溶解在杂交缓冲液中并加入反义RNA探针进行杂交反应；
4、加入RNase消化液进行反应；
5、进行电泳与放射自显影；
6、分析结果。
上述Solexa sequencing technology方法包括如下步骤：
1、收集牛乳样本；
2、通过Trizol试剂提取牛乳总RNA；
3、进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；
4、将adaptor prime酶联在小RNA分子的3’与5’端；
5、进行RT-PCR反应后并进行测序；
6、数据分析与处理。
所述生物芯片方法包括如下步骤：
1、将全部五百多个成熟体微小核糖核酸库点阵并制备生物芯片；
2、收集牛乳样本；
3、提取牛乳总RNA；
4、通过柱分离来分离微小核糖核酸；
5、利用T4 RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记；
6、与生物芯片进行杂交反应；
7、数据检测与分析。
本发明通过上述的RT-PCR，Real-time PCR，Northern blotting，RNase protectionassay，Solexa sequencing technology或生物芯片等方法分析在牛乳微小核糖核酸的变化趋势及变化量，以及它们与原乳含量的相关性。其中，首先检测分析hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-30a、hsa-miR-31、hsa-miR-33a、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-101、hsa-miR-29b、hsa-miR-103、hsa-miR-106a、hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-200b、hsa-let-7g、hsa-let-7i、hsa-miR-15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、hsa-miR-125b、hsa-miR-128、hsa-miR-138、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-191、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-150、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-194、hsa-miR-320a、hsa-miR-200c、hsa-miR-155、hsa-miR-106b、hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-148b、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-4235p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92b、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307在牛乳中的变化，制备牛乳微小核糖核酸生物芯片测定不同样本中牛乳微小核糖核酸的变化，同时对不同牛乳样本中微小核糖核酸进行Solexa测序分析。
本发明还提供一种用于检测原乳含量与质量的试剂盒，该试剂盒包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的工具。所述试剂盒可以包含牛乳中的109种成熟体微小核糖核酸中任意一种或一种以上的引物，具体包括hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-30a、hsa-miR-31、hsa-miR-33a、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-101、hsa-miR-29b、hsa-miR-103、hsa-miR-106a、hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-200b、hsa-let-7g、hsa-let-7i、hsa-miR-15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、hsa-miR-125b、hsa-miR-128、hsa-miR-138、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-191、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-150、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-194、hsa-miR-320a、hsa-miR-200c、hsa-miR-155、hsa-miR-106b、hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-148b、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-4233p、hsa-miR-425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-5325p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92b、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-8853p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307的引物。
将上述在牛乳中稳定存在的微小核糖核酸筛选出来，将它们的引物收集到PCR试剂盒(RT-PCR或Real-time PCR)中即可制备检测牛乳质量的试剂盒。
本发明还提供一种评价受试者的牛乳质量的生物芯片，该生物芯片包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的元件。所述生物芯片可以包含牛乳中的109种成熟体微小核糖核酸中的任意一种或一种以上的探针，所述探针具体包括表1所示的探针：
表1：
  探针   对应microRNA   探针序列
  probe-let-7a   let-7a   AACTATACAACCTACTACCTCA
  probe-let-7b   let-7b   AACCACACAACCTACTACCTCA
  probe-let-7c   let-7c   AACCATACAACCTACTACCTCA
  probe-let-7d   let-7d   ACTATGCAACCTACTACCTCT
  probe-let-7e   let-7e   ACTATACAACCTCCTACCTCA
  probe-let-4f   let-7f   AACTATACAATCTACTACCTCA
  probe-let-7g   let-7g   ACTGTACAAACTACTACCTCA
  probe-let-7i   let-7i   ACAGCACAAACTACTACCTCA
  probe-miR-101   miR-101   CTTCAGTTATCACAGTACTGTA
  probe-miR-103   miR-103   TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT
  probe-miR-106a   miR-106a   GCTACCTGCACTGTAAGCACTTTT
  probe-miR-106b   miR-106b   ATCTGCACTGTCAGCACTTTA
  探针   对应microRNA   探针序列
  probe-miR-107   miR-107   TGATAGCCCTGTACAATGCTGCT
  probe-miR-125a   miR-125a   CACAGGTTAAAGGGTCTCAGGGA
  probe-miR-125b   miR-125b   TCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA
  probe-miR-128a   miR-128a   AAAAGAGACCGGTTCACTGTGA
  probe-miR-128b   miR-128b   GAAAGAGACCGGTTCACTGTGA
  probe-miR-130b   miR-130b   ATGCCCTTTCATCATTGCACTG
  probe-miR-138   miR-138   GATTCACAACACCAGCT
  probe-miR-140   miR-140   CTACCATAGGGTAAAACCACT
  probe-miR-141   miR-141   CCATCTTTACCAGACAGTGTTA
  probe-miR-142-3p   miR-142-3p   TCCATAAAGTAGGAAACACTACA
  probe-miR-142-5p   miR-142-5p   GTAGTGCTTTCTACTTTATG
  probe-miR-146b   miR-146b   AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA
  probe-miR-148a   miR-148a   ACAAAGTTCTGTAGTGCACTGA
  probe-miR-148b   miR-148b   ACAAAGTTCTGTGATGCACTGA
  probe-miR-150   miR-150   CACTGGTACAAGGGTTGGGAGA
  probe-miR-151   miR-151   CCTCAAGGAGCTTCAGTCTAGT
  probe-miR-152   miR-152   CCCAAGTTCTGTCATGCACTGA
  probe-miR-155   miR-155   CCCCTATCACGATTAGCATTAA
  probe-miR-15a   miR-15a   CACAAACCATTATGTGCTGCTA
  probe-miR-15b   miR-15b   TGTAAACCATGATGTGCTGCTA
  probe-miR-16   miR-16   CGCCAATATTTACGTGCTGCTA
  probe-miR-17-3p   miR-17-3p   ACAAGTGCCTTCACTGCAGT
  探针   对应microRNA   探针序列
  probe-miR-17-5p   miR-17-5p   ACTACCTGCACTGTAAGCACTTTG
  probe-miR-181a   miR-181a   ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT
  probe-miR-181b   miR-181b   CCCACCGACAGCAATGAATGTT
  probe-miR-181d   miR-181d   AACCCACCGACAACAATGAATGTT
  probe-miR-185     miR-185     GAACTGCCTTTCTCTCCA
  probe-miR-186     miR-186     AAGCCCAAAAGGAGAATTCTTTG
  probe-miR-191     miR-191     AGCTGCTTTTGGGATTCCGTTG
  probe-miR-192     miR-192     GGCTGTCAATTCATAGGTCAG
  probe-miR-193a     miR-193a     CTGGGACTTTGTAGGCCAGTT
  probe-miR-193b     miR-193b     AAAGCGGACTTTGAGGGCCAGTT
  probe-miR-194     miR-194     TCCACATGGAGTTGCTGTTACA
  probe-miR-196a     miR-196a     CCAACAACATGAAAACTACCTA
  probe-miR-197     miR-197     GCTGGGTGGAGAAGGTGGTGAA
  probe-miR-19b     miR-19b     TCAGTTTTGCATGGATTTGCACA
  probe-miR-200a     miR-200a     ACATCGTTACCAGACAGTGTTA
  probe-miR-200a*     miR-200a*     TCCAGCACTGTCCGGTAAGATG
  probe-miR-200b     miR-200b     GTCATCATTACCAGGCAGTATTA
  probe-miR-200c     miR-200c     CCATCATTACCCGGCAGTATTA
  probe-miR-203     miR-203     CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC
  probe-miR-20a     miR-20a     CTACCTGCACTATAAGCACTTTA
  probe-miR-21     miR-21     TCAACATCAGTCTGATAAGCTA
  probe-miR-210     miR-210     TCAGCCGCTGTCACACGCACAG
  探针   对应microRNA   探针序列
  probe-miR-22     miR-22     ACAGTTCTTCAACTCGCAGCTT
  probe-miR-221     miR-221     GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT
  probe-miR-222     miR-222     GAGACCCAGTAGCCAGATGTAGCT
  probe-miR-223     miR-223     GGGGTATTTGACAAACTGACA
  probe-miR-23a     miR-23a     GGAAATCCCTGGCAATGTGAT
  probe-miR-23b     miR-23b     GGTAATCCCTGGCAATGTGAT
  probe-miR-24     miR-24     CTGTTCCTGCTGAACTGAGCCA
  probe-miR-25     miR-25     TCAGACCGAGACAAGTGCAATG
  probe-miR-26a     miR-26a     GCCTATCCTGGATTACTTGAA
  probe-miR-26b     miR-26b     AACCTATCCTGAATTACTTGAA
  probe-miR-27a     miR-27a     GCGGAACTTAGCCACTGTGAA
  probe-miR-27b     miR-27b     GCAGAACTTAGCCACTGTGAA
  probe-miR-29a     miR-29a     AACCGATTTCAGATGGTGCTA
  probe-miR-29b     miR-29b     AACACTGATTTCAAATGGTGCTA
  probe-miR-29c     miR-29c     ACCGATTTCAAATGGTGCTA
  probe-miR-30b     miR-30b     AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA
  probe-miR-30c     miR-30c     GCTGAGAGTGTAGGATGTTTACA
  probe-miR-30d     miR-30d     CTTCCAGTCGGGGATGTTTACA
  probe-miR-30e-3p     miR-30e-3p     GCTGTAAACATCCGACTGAAAG
  probe-miR-30e-5p     miR-30e-5p     TCCAGTCAAGGATGTTTACA
  probe-miR-31     miR-31     CAGCTATGCCAGCATCTTGCC
  probe-miR-320     miR-320     TTCGCCCTCTCAACCCAGCTTTT
  探针   对应microRNA   探针序列
  probe-miR-33     miR-33     CAATGCAACTACAATGCAC
  probe-miR-331   miR-331   TTCTAGGATAGGCCCAGGGGC
  probe-miR-339   miR-339   TGAGCTCCTGGAGGACAGGGA
  probe-miR-361   miR-361   GTACCCCTGGAGATTCTGATAA
  probe-miR-374   miR-374   CACTTATCAGGTTGTATTATAA
  probe-miR-375   miR-375   TCACGCGAGCCGAACGAACAAA
  probe-miR-378   miR-378   ACACAGGACCTGGAGTCAGGAG
  probe-miR-423   miR-423   CTGAGGGGCCTCAGACCGAGCT
  probe-miR-425   miR-425   GGCGGACACGACATTCCCGAT
  probe-miR-484   miR-484   ATCGGGAGGGGACTGAGCCTGA
  probe-miR-532   miR-532   ACGGTCCTACACTCAAGGCATG
  probe-miR-574   miR-574   GTGGGTGTGTGCATGAGCGTG
  probe-miR-652   miR-652   TGCACAACCCTAGTGGCGCCATT
  probe-miR-7   miR-7   CAACAAAATCACTAGTCTTCCA
  probe-miR-92   miR-92   CAGGCCGGGACAAGTGCAATA
  probe-miR-93   miR-93   CTACCTGCACGAACAGCACCTTT
  probe-miR-98   miR-98   AACAATACAACTTACTACCTCA
  probe-miR-99a   miR-99a   CACAAGATCGGATCTACGGGTT
  probe-miR-99b   miR-99b   CGCAAGGTCGGTTCTACGGGTG
将上述在牛乳中稳定存在的微小核糖核酸筛选出来，将其反向互补序列作为探针点在芯片，就制成了专门针对牛乳微小核糖核酸检测生物芯片。
本发明所使用的牛乳来源于待测的原乳，商品化的液态奶及各种配方的奶粉。
具体而言，在上述组合(组合是指任何含有以上1种到109种的微小核糖核酸标志物变化的集合)、方法、试剂盒或生物芯片中，所述评价受试的原乳，商品化的液态奶及各种配方的奶粉为测定受试样本给予待测物后的原乳含量，具体用于检测待测物的质量；所述评价受试样本的原乳含量为测试标准；所述评价受试样本的原乳含量为评价对受试样本的质量标准。
本发明具有如下优点：
本发明利用通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸可以建立唯一指向原始牛乳含量的标准，简单易行，成本低廉，特别适用于原乳含量的检测(如果有稀释的情况下)，输出的结果简单明了。
本发明的意义在于可以从根本上断绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的可能，同时推动这一科学的评价方法，也有利于采用这一方法的企业尽快在公众心中建立新的质控形象，安定消费者的担心.帮助企业尽快走出目前的困境。
附图说明
附图1为高温高压处理后的牛乳中部分微小核糖核酸的表达谱
附图2为七种微小核糖核酸在原乳中的特性研究
附图3为七种微小核糖核酸在商品化液态奶中的特性研究
附图4为七种微小核糖核酸在商品化奶粉中的特性研究
具体实施方式
1、牛乳中的微小核糖核酸的RT-PCR
首先必须确定微小核糖核酸在牛乳中能检测到，我们使用了RT-PCR技术证明牛乳中不仅能检测到微小核糖核酸，而且其表达量相当丰富。具体步骤为：收集正常原始牛乳；之后的操作有两种方案，一种方案为将10μl牛乳作为buffer直接逆转录，另一种为提取牛乳的总RNA，使用的试剂是TRIzol reagent(invitrogen)，10ml牛乳通常能富集约10μg左右的RNA；之后为逆转录，加入4μl 5×AMV buffer，2μl 10mM each dNTP mixture(Takara)，0.5μl RNase Inhibitor(Takara)，2μl AMV(Takara)以及1.5μl基因特异性反向引物混和物，将混合液16℃孵育15min，42℃反应60min以进行逆转录，85℃孵育5min使AMV酶失活；最后为PCR及电泳：将cDNA按1/50稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μl Taq酶(Takara)，0.2μl 10μM正向引物，0.2μl 10μM通用反向引物，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM each dNTP mixture(Takara)，2μl 10×PCR buffer，13.5μlH2O，20μl体系进行PCR。PCR的反应条件是：95℃5min进行1个循环→95℃15sec，60℃1min进行40个循环。PCR产物取10μl在3％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，UV下观察。
具体实验结果见附图1。
2、牛乳中的微小核糖核酸的real-time PCR
微小核糖核酸的定量PCR实验原理及实验步骤同RT-PCR一样，唯一不同是在PCR的时候加入了荧光染料EVA GREEN。仪器使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪(AppiedBiosystems)，反应条件为95℃5min进行1个循环→95℃15sec，60℃1min进行40个循环。数据处理方法为ΔΔCT法，CT设为反应达到域值时的循环数，则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT＝CT样品-CT内参。所以微小核糖核酸可以作为一种新牛乳质量控制的标志物。
3、专门用于牛乳质量监控的微小核糖核酸试剂盒的制作
专门用于牛乳质量监控的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量PCR技术的，试剂包括常用的Taq酶、dNTP等。此试剂盒的价值在于，用最精简的探针库检测在牛乳中微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势监控牛乳质量，所以，将此芯片投入实践，可以建立唯一指向原始牛乳含量的标准，其意义在于从根本上断绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的动机，同时推动这一科学的评价方法。

Claims (11)

1.一种用于检测牛乳质量的标志物，其特征在于该检测标记物是以下在牛乳中稳定存在且可检测的109种成熟体微小核糖核酸中的一种或任意一种以上的组合：
hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-30a、hsa-miR-31、hsa-miR-33a、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-101、hsa-miR-29b、hsa-miR-103、hsa-miR-106a、hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-200b、hsa-let-7g、hsa-let-7i、hsa-miR-15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、hsa-miR-125b、hsa-miR-128、hsa-miR-138、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-191、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-150、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-194、hsa-miR-320a、hsa-miR-200c、hsa-miR-155、hsa-miR-106b、hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-148b、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92b、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307。
2.一种用于检测牛乳质量的方法，其特征在于检测以下在牛乳中稳定存在且可检测的109种成熟体微小核糖核酸：
hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-30a、hsa-miR-31、hsa-miR-33a、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-101、hsa-miR-29b、hsa-miR-103、
hsa-miR-106a、hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-200b、hsa-let-7g、hsa-let-7i、hsa-miR-15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、hsa-miR-125b、hsa-miR-128、hsa-miR-138、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-191、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-150、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-194、hsa-miR-320a、hsa-miR-200c、hsa-miR-155、hsa-miR-106b、hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-148b、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-5323p、hsa-miR-92b、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307。
3.如权利要求2所述检测牛乳质量的方法，其特征在于测定牛乳中稳定存在且可检测109种微小核糖核酸的方法选自：RT-PCR方法、Real-time PCR方法、Northern blotting方法、RNase protection assay方法、Solexa sequencing technology方法或生物芯片方法。
4.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于所述RT-PCR方法包括以下步骤：
1)提取牛乳总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的牛乳样本，以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
4)EB染色后在紫外灯下观察结果。
5.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于所述Real-time PCR方法包括以下步骤：
1)提取受试的牛乳总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试的牛乳样本，以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
2)用微小核糖核酸设计引物；
3)加入荧光探针进行PCR反应；
4)检测并比较牛乳样本相对于正常牛乳中微小核糖核酸的量的变化。
6.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于所述Northernblotting方法包括以下步骤：
1)收集牛乳样本；
2)通过Trizol试剂提取牛乳总RNA；
3)进行变性PAGE电泳和膜转移实验；
4)制备同位素标记微小核糖核酸探针；
5)进行膜杂交反应；
6)同位素信号检测，如磷屏扫描检测结果。
7.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于上述RNaseprotection assay方法包括如下步骤：
1)进行反义RNA探针的合成，同位素标记与纯化；
2)收集牛乳样本并提取RNA；
3)将提取后的RNA溶解在杂交缓冲液中并加入反义RNA探针进行杂交反应；
4)加入RNase消化液进行反应；
5)进行电泳与放射自显影；
6)分析结果。
8.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于上述Solexasequencing technology方法包括如下步骤：
1)收集牛乳样本；
2)通过Trizol试剂提取牛乳总RNA；
3)进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；
4)将adaptor prime酶联在小RNA分子的3’与5’端；
5)进行RT-PCR反应后并进行测序；
6)数据分析与处理。
9.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于所述生物芯片方法包括如下步骤：
1)将全部五百多个成熟体微小核糖核酸库点阵并制备生物芯片；
2)收集牛乳样本；
3)提取牛乳总RNA；
4)通过柱分离来分离微小核糖核酸；
5)利用T4 RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记；
6)与生物芯片进行杂交反应；
7)数据检测与分析。
10.一种用于检测原乳含量与质量的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的工具，前述工具可以是以下在牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的一种或任意一种以上的引物：
hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-30a、hsa-miR-31、hsa-miR-33a、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-101、hsa-miR-29b、hsa-miR-103、hsa-miR-106a、hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-200b、hsa-let-7g、hsa-let-7i、hsa-miR-15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、hsa-miR-125b、hsa-miR-128、hsa-miR-138、hsa-miR-1403p、hsa-miR-141、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-191、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-150、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-194、hsa-miR-320a、hsa-miR-200c、hsa-miR-155、hsa-miR-106b、hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-148b、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92b、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307的引物。
11.一种评价牛乳质量的生物芯片，其特征在于该生物芯片包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的元件，即可以包含牛乳中的109种成熟体微小核糖核酸的探针中的任意一种或一种以上，前述述探针具体如下探针：
    探针     对应microRNA     探针序列     probe-let-7a     let-7a     AACTATACAACCTACTACCTCA     probe-let-7b     let-7b     AACCACACAACCTACTACCTCA     probe-let-7c     let-7c     AACCATACAACCTACTACCTCA     probe-let-7d     let-7d     ACTATGCAACCTACTACCTCT     probe-let-7e     let-7e     ACTATACAACCTCCTACCTCA     probe-let-7f     let-7f     AACTATACAATCTACTACCTCA     probe-let-7g     let-7g     ACTGTACAAACTACTACCTCA     probe-let-7i     let-7i     ACAGCACAAACTACTACCTCA     probe-miR-101     miR-101     CTTCAGTTATCACAGTACTGTA     probe-miR-103     miR-103     TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT     probe-miR-106a     miR-106a     GCTACCTGCACTGTAAGCACTTTT     probe-miR-106b     miR-106b     ATCTGCACTGTCAGCACTTTA     probe-miR-107     miR-107     TGATAGCCCTGTACAATGCTGCT     probe-miR-125a     miR-125a     CACAGGTTAAAGGGTCTCAGGGA     probe-miR-125b     miR-125b     TCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA     probe-miR-128a     miR-128a     AAAAGAGACCGGTTCACTGTGA     probe-miR-128b     miR-128b     GAAAGAGACCGGTTCACTGTGA     probe-miR-130b     miR-130b     ATGCCCTTTCATCATTGCACTG     probe-miR-138     miR-138     GATTCACAACACCAGCT     probe-miR-140     miR-140     CTACCATAGGGTAAAACCACT     probe-miR-141     miR-141     CCATCTTTACCAGACAGTGTTA     probe-miR-142-3p     miR-142-3p     TCCATAAAGTAGGAAACACTACA
    探针     对应microRNA     探针序列     probe-miR-142-5p     miR-142-5p     GTAGTGCTTTCTACTTTATG     probe-miR-146b     miR-146b     AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA     probe-miR-143a     miR-148a     ACAAAGTTCTGTAGTGCACTGA     probe-miR-148b     miR-148b     ACAAAGTTCTGTGATGCACTGA     probe-miR-150     miR-150     CACTGGTACAAGGGTTGGGAGA     probe-miR-151     miR-151     CCTCAAGGAGCTTCAGTCTAGT     probe-miR-152     miR-152     CCCAAGTTCTGTCATGCACTGA     probe-miR-155     miR-155     CCCCTATCACGATTAGCATTAA     probe-miR-15a     miR-15a     CACAAACCATTATGTGCTGCTA     probe-miR-15b     miR-15b     TGTAAACCATGATGTGCTGCTA     probe-miR-16     miR-16     CGCCAATATTTAOGTGCTGCTA     probe-miR-17-3p     miR-17-3p     ACAAGTGCCTTCACTGCAGT     probe-miR-17-5p     miR-17-5p     ACTACCTGCACTGTAAGCACTTTG     probe-miR-181a     miR-181a     ACTCACOGACAGCGTTGAATGTT     probe-miR-181b     miR-181b     CCCACCGACAGCAATGAATGTT     probe-miR-181d     miR-181d     AACCCACCGACAACAATGAATGTT   probe-miR-185   miR-185   GAACTGCCTTTCTCTCCA   probe-miR-186   miR-186   AAGCCCAAAAGGAGAATTCTTTG   probe-miR-191   miR-191   AGCTGCTTTTGGGATTCCGTTG   probe-miR-192   miR-192   GGCTGTCAATTCATAGGTCAG   probe-niR-193a   miR-193a   CTGGGACTTTGTAGGCCAGTT   probe-miR-193b   miR-193b   AAAGCGGGACTTTGAGGGCCAGTT   probe-miR-194   miR-194   TCCACATGGAGTTGCTGTTACA   probe-miR-196a   miR-196a   CCAACAACATGAAACTACCTA
    探针     对应microRNA     探针序列   probe-miR-197   miR-197   GCTGGGTGGAGAAGGTGGTGAA   probe-miR-19b   miR-19b   TCAGTTTTGCATGGAl7TGCACA   probe-miR-200a   miR-200a   ACATCGTTACCAGACAGTGTTA   probe-miR-200a*   miR-200a*   TCCAGCACTGTCCGGTAAGATG   probe-miR-200b   miR-200b   GTCATCATTACCAGGCAGTATTA   probe-miR-200c   miR-200c   CCATCATTACCCGGCAGTATTA   probe-miR-203   miR-203   CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC   probe-miR-20a   miR-20a   CTACCTGCACTATAAGCACTTTA   probe-miR-21   miR-21   TCAACATCAGTCTGATAAGCTA   probe-miR-210   miR-210   TCAGCCGCTGTCACACGCACAG   probe-miR-22   miR-22   ACAGTTCTTCAACTGGCAGCTT   probe-miR-221   miR-221   GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT   probe-miR-222   miR-222   GAGACCCAGTAGCCAGATGTAGCT   probe-miR-223   miR-223   GGGGTATTTGACAAACTGACA   probe-miR-23a   miR-23a   GGAAATCCCTGGCAATGTGAT   probe-miR-23b   miR-23b   GGTAATCCCTGGCAATGTGAT   probe-miR-24   miR-24   CTGTTCCTGCTGAACTGAGCCA   probe-miR-25   miR-25   TCAGACCGAGACAAGTGCAATG   probe-RiR-26a   miR-26a   GCCTATCCTGGATTACTTGAA   probe-miR-26b   miR-26b   AACCTATCCTGAATTACTTGAA   probe-miR-27a   miR-27a   GCGGAACTTAGCCACTGTGAA   probe-miR-27b   miR-27b   GCAGAACTTAGCCACTGTGAA   probe-miR-29a   miR-29a   AACCGATTTCAGATGGTGCTA   probe-miR-29b   miR-29b   AACACTGATTTCAAATGGTGCTA
    探针     对应microRNA     探针序列   probe-miR-29c   miR-29c   ACCGATTTCAAATGGTGCTA   probe-miR-30b   miR-30b   AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA   probe-miR-30c   miR-30c   GCTGAGAGTGTAGGATGTTTACA   probe-miR-30d   miR-30d   CTTCCAGTCGGGGATGTTTACA   probe-miR-30e-3p   miR-30e-3p   GCTGTAAACATCCGACTGAAAG   probe-miR-30e-5p   miR-30e-5p   TCCAGCMGGATGTTTACA   probe-miR-31   miR-31   CAGCTATGCCAGCATCTTGCC   probe-miR-320   miR-320   TTOGCCCTCTCAACCCAGCTTTT   probe-miR-33   miR-33   CAATGCAACTACAATGCAC   probe-miR-331   miR-331   TTCTAGGATAGGCCCAGGGGC   probe-miR-339   miR-339   TGAGCTCCTGGAGGACAGGGA   probe-miR-361   miR-361   GTACCCCTGGAGATTCTGATAA   probe-miR-374   miR-374   CACTTATCAGGTTGTATTATAA   probe-miR-375   miR-375   TCACGCGAGCCGAACGAACAAA   probe-miR-378   miR-378   ACACAGGACCTGGAGTCAGGAG   probe-miR-423   miR-423   CTGAGGGGCCTCAGACCGAGCT   probe-miR-425   miR-425   GGCGGACACGACATTCCCGAT   probe-miR-484   miR-484   ATCGGGAGGGGACTGAGCCTGA   probe-miR-532   miR-532   ACGGTCCTACACTCAAGGCATG   probe-miR-574   miR-574   GTGGGTGTGTGCATGAGCGTG   probe-miR-652   miR-652   TGCACAACCCTAGTGGCGCCATT   probe-miR-7   miR-7   CAACAAAATCACTAGTCTTCCA   probe-miR-92   miR-92   CAGGCCGGGACAAGTGCAATA   probe-miR-93   miR-93   CTACCTGCACGAACAGCACTTT
    探针     对应microRNA     探针序列   probe-miR-98   miR-98   AACAATACAACTTACTACCTCA   probe-miR-99a   miR-99a   CACAAGATCGGATCTACGGGTT   probe-miR-99b   miR-99b   CGCAAGGTCGGTTCTACGGGTG
将上述在牛乳中稳定存在的微小核糖核酸筛选出来，将其反向互补序列作为探针点在芯片，就制成了专门针对牛乳微小核糖核酸检测生物芯片。
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