CN102666878A - 用于牛乳质量检测的标志物，方法，生物芯片和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于牛乳质量检测的标志物，方法，生物芯片和试剂盒。本发明具体地提供了一种检测牛乳质量的方法，通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸可以建立原始牛乳含量的标准。

Description

用干牛乳质量检测的标志物， 方法， 生物芯片和试剂盒 技术领域
本发明涉及食品检测领域， 更具体地涉及一种利用乳液中微小核糖核酸检测 牛乳质量的方法， 本发明通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸来建立唯一指向原 始牛乳含量的标准。 本发明还涉及用于该方法的相关标志物、 检测试剂、 生物芯 片和试剂盒。 技术背景
近来年， 有人通过向牛乳中掺水的方法来牟取不正当利益。 由于牛乳中加水 后会导致除水以外的各项指标降低。 为了提高各项检测指标， 不法商家在牛乳中 掺水后又通过采用向牛乳里加入各种添加剂、 并反复勾兑的办法来使牛乳达标。 不法商贩最常用的有以下 5种添加剂： 脂肪油 (提高脂肪指数)、 蛋白 (提高蛋白指 数)、 糊精 (音)和乳清粉 (提高各项指数)、 三聚氰胺 (也可相应提高各项指数， 对蛋 白指数最有效)。 在牛乳中添加三聚氰氨会导致小儿肾结石等严重后果。
现有的检测蛋白的方法主要是检测含氮量，由于三聚氰胺是一种含氮化合物， 所以在现有的检测方法下， 添加后可冒充蛋白含量。 此外， 如果添加豆粉， 动物 毛发等物品， 现有的任何方法在违法添加物导致严重后果之前， 都难以检测出。
因此， 理想的牛乳质量检测方法是能够检测一种在牛乳中稳定存在， 稀释后 其成分就降低或变化， 且不受添加剂影响的物质。
综上所述， 本领域迫切需要开发更可靠的检测牛乳乳液以及相关产品的质量 的方法。 发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测牛乳乳液质量的标志物及其检测方法、 相 关生物芯片和试验盒。 在本发明的第一方面， 提供了一种用于检测牛乳乳液质量的标志物， 该检 测标记物是在牛乳中稳定存在且可检测的 109种成熟体微小核糖核酸：
hsa - let - 7a、hsa - l et - 7b、hsa - l et - 7c、hsa - let - 7d、hsa - l et - 7e、hsa - l et - 7f、 hsa - miR - 15a、 hsa - miR - 16、 hsa - miR - 17、 hsa - miR - 19b、 hsa - miR - 20a、 hsa - miR - 21、 hsa - miR - 22、 hsa - miR - 23a、 hsa - miR - 24、 hsa - miR - 25、 hsa - miR - 26a、 hsa - miR - 26b、 hsa- - miR- -27a 、 hsa-miR-29a 、 hsa - miR - 30a 、 hsa - miR - 31 、 hsa - miR - 33a 、 hsa- - miR- •92a、hsa - miR - 93、hsa - miR - 98、hsa - miR - 99a、hsa - miR - 101、hsa - miR - 29b、 hsa- - miR- 103、 hsa - miR - 106a、 hsa - miR - 107、 hsa - miR - 192、 hsa - miR - 196a、 hsa- - miR- -197 、 hsa - miR - 148a 、 hsa - miR - 30c 、 hsa - miR - 30d 、 hsa-miR-7 、 hsa- - miR- -181a、 hsa- miR- 181b、 hsa- miR- 203、 hsa- miR- 210、 hsa- miR- 221、 hsa- - miR- ■222 、 hsa-miR-223 、 hsa - miR - 200b 、 hsa - let - 7g 、 hsa - let - 7 i 、 hsa- - miR- -15b、 hsa - miR - 23b、 hsa - miR - 27b、 hsa - miR - 30b、 hsa - miR - 125b、 hsa- - miR- -128、 hsa- miR- 138、 hsa- miR- 140- 3p、 hsa- miR- 141、 hsa- miR- 142- 5p、 hsa- - miR- •142 - 3p、 hsa - miR - 152、 hsa - miR - 191、 hsa - miR - 125a - 5p、 hsa - miR - 150、 hsa- - miR- 185、 hsa - miR - 186、 hsa - miR - 193a - 5p、 hsa - miR - 193a - 3p、 hsa - miR - 194、 hsa- - miR- -320a、 hsa - miR - 200c、 hsa - miR - 155、 hsa - miR - 106b、 hsa - miR - 29c、 hsa- - miR- -200a ^ hsa - miR - 99b、 hsa - miR - 130b、 hsa - miR - 30e、 hsa - miR - 361 - 5p、 hsa- - miR- -374a ^ hsa - miR - 375、 hsa - miR - 378、 hsa - miR - 151 - 5p、 hsa - miR - 151 - 3p、 hsa- - miR- -148b 、 hsa - miR - 331 - 3p 、 hsa - miR - 339 - 5p 、 hsa - miR - 423 - 5p 、 hsa- - miR- -423 - 3p、 hsa - miR - 425、 hsa - miR - 484、 hsa - miR - 146b - 5p、 hsa - miR - 181 d、 hsa- - miR- -532-5p 、 hsa - miR - 532 - 3p 、 hsa - miR - 92b 、 hsa - miR - 574 - 5p 、 hsa- - miR- -574- 3p、 hsa- miR- 652、 hsa- miR- 320b、 hsa- miR- 320c、 hsa- miR- 874、 hsa- - miR- -744、 hsa- miR- 885- 3p、 hsa- miR- 760、 hsa- miR- 935、 hsa- miR- 1308、 hsa- - miR- -1306、 hsa-miR-1307 ;
或以上 109种成熟体微小核糖核酸中 n种所构成的组合， 其中 n = 2- 109的整 数。
在另一优选例中， 所述的组合包括选自下组的至少 2-7种成熟体微小核糖核 酸： miRNA-26a、 miR-26b、 miR-200c、 miRNA-21、 miR-30d、 miR-99a、 miR- 148。
在本发明的第二方面， 提供了一种检测奶制品的牛乳质量的方法， 其中， 所 述的奶制品包括： 原乳、 液态奶和奶粉， 该方法包括步骤：
(a) 检测在牛乳中稳定存在且可检测的 109种成熟体微小核糖核酸或其组合 的存在与否以及含量：
hsa - let - 7a、hsa - let - 7b、hsa - let - 7c、hsa - let - 7d、hsa - let - 7e、hsa - let - 7f、 hsa - miR - 15a、 hsa - miR - 16、 hsa - miR - 17、 hsa - miR - 19b、 hsa - miR - 20a、 hsa - miR - 21、 hsa - miR - 22、 hsa - miR - 23a、 hsa - miR - 24、 hsa - miR - 25、 hsa - miR - 26a、 hsa - miR - 26b、 hsa-miR-27a 、 hsa-miR-29a 、 hsa - miR - 30a 、 hsa - miR - 31 、 hsa - miR - 33a 、 hsa - miR - 92a、hsa - miR - 93、hsa - miR - 98、hsa - miR - 99a、hsa - miR - 101、hsa - miR - 29b、 hsa- - miR- -103、 hsa- miR- 106a、 hsa - miR - 107、 hsa-miR-192、 hsa - miR - 196a、 hsa- - miR- -197 、 hsa- - miR- -148a 、 hsa - miR - 30c 、 hsa-miR-30d 、 hsa-miR-7 、 hsa- - miR- -181a、 hsa -miR -181b 、 hsa - miR - 203 、 hsa-miR-210、 hsa-miR-221、 hsa- - miR- -222 、 hsa- -miR- -223 、 hsa-miR-200b 、 hsa - let - 7g 、 hsa - let - 7 i 、 hsa- - miR- -15b、 hsa- miR- 23b、 hsa - miR - 27b、 hsa - miR - 30b、 hsa - miR - 125b、 hsa- miR- 128、 hsa- miR- 138、 hsa- miR- 140- 3p、 hsa- miR- 141、 hsa- miR- 142- 5p、 hsa - miR - 142 - 3p、 hsa - miR - 152、 hsa - miR - 191、 hsa - miR - 125a - 5p、 hsa - miR - 150、 hsa - miR - 185、 hsa - miR - 186、 hsa - miR - 193a - 5p、 hsa - miR - 193a - 3p、 hsa - miR - 194、 hsa - miR - 320a、 hsa - miR - 200c、 hsa - miR - 155、 hsa - miR - 106b、 hsa - miR - 29c、 hsa - miR - 200a、 hsa - miR - 99b、 hsa - miR - 130b、 hsa - miR - 30e、 hsa - miR - 361 - 5p、 hsa - miR - 374a、 hsa - miR - 375、 hsa - miR - 378、 hsa - miR - 151 - 5p、 hsa - miR - 151 - 3p、 hsa - miR - 148b 、 hsa - miR - 331 - 3p 、 hsa - miR - 339 - 5p 、 hsa - miR - 423 - 5p 、 hsa - miR - 423 - 3p、 hsa - miR - 425、 hsa - miR - 484、 hsa - miR - 146b - 5p、 hsa - miR - 181 d、 hsa - miR - 532 - 5p 、 hsa - miR - 532 - 3p 、 hsa - miR - 92b 、 hsa - miR - 574 - 5p 、 hsa- miR- 574- 3p、 hsa- miR- 652、 hsa- miR- 320b、 hsa- miR- 320c、 hsa- miR- 874、 hsa- miR- 744、 hsa- miR- 885- 3p、 hsa- miR- 760、 hsa- miR- 935、 hsa- miR- 1308、 hsa- miR- 1306、 hsa- miR- 1307 ;
(b) 根据将步骤（a)的检测结果与牛乳标准品的结果进行比较， 从而确定牛乳 质量。
在另一优选例中， 步骤 (b)包括将步骤（a)的检测结果与牛乳标准品的结果进 行比较， 从而确定牛乳质量； 或者， 将步骤（a)的检测结果进行换算， 从而确定牛 乳质量。
在另一优选例中， 步骤 ( )中测定牛乳中稳定存在且可检测 109种微小核糖核 酸的方法选自： RT-PCR方法、 实时 PCR方法、 Northern 印迹法、 RNase 保护分 析法、 Solexa测序法或生物芯片方法。
在另一优选例中， 所述 RT-PCR方法包括以下步骤：
1) 提取牛乳总 RNA， 通过 RNA逆转录反应得到 cDNA样品； 或者收集受试 者的牛乳样本， 以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备 cDNA样品；
2) 用微小核糖核酸的特异性引物进行 PCR反应， 获得 PCR产物；
3) 进行所述的 PCR产物进行检测， 从而获得定性和 /或定量检测结果。
在另一优选例中， 所述的检测步骤 3)是通过琼脂糖凝胶电泳， 并经 EB染色 后在紫外灯下观察结果。 在另一优选例中， 所述实时 (；荧光;) PCR方法包括以下步骤：
1) 提取受试的牛乳总 RNA， 通过 RNA逆转录反应得到 cDNA样品； 或者收 集受试的牛乳样本， 以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备 cDNA样品；
2) 在微小核糖核酸特异性引物和特异性荧光探针存在下， 进行 PCR反应； 3) 在 PCR过程中进行实时检测， 并将检测结果与牛乳样本进行比较， 从而 确定受试样品中所述微小核糖核酸的存在与否和 /数量。
在另一优选例中， 所述 Northern印迹法包括以下步骤：
1) 从受试的牛乳样本中抽提牛乳总 RNA;
2) 对抽提的牛乳总 RNA进行变性 PAGE电泳和膜转移；
3) 用带有可检测信号的微小核糖核酸特异性探针进行膜杂交， 并检测可检测 信号的存在与否和 /或数量。
在另一优选例中， 所述的可检测信号是同位素标记或荧光标记。
在另一优选例中， 对于同位素信号， 通过例如磷屏扫描检测结果。
在另一优选例中， 所述 Rnase保护分析法包括如下步骤：
1) 从受试的牛乳样本中提取 RNA;
2) 在适合杂交的条件下， 将步骤 1)中提取的 RNA与微小核糖核酸特异性 RNA探针进行杂交， 形成杂交的双链复合物， 其中所述的 RNA探针带有可检测 信号；
3) 用 Rnase酶处理杂交溶液，从而去除未形成双链复合物的 RNA或 RNA探 针；
4) 检测步骤 3)的杂交溶液中双链复合物的存在与否以及数量。
在另一优选例中， 所述的可检测信号是同位素。
在另一优选例中， 步骤 4)的检测是进行电泳和并进行放射自显影。
在另一优选例中， 所述的 Solexa测序法包括如下步骤：
1) 从受试牛乳样本中提取牛乳总 RNA;
2) 从总 RNA中回收 17-27nt的 RNA分子；
3) 在所述 RNA分子的 3'与 5'端添加 Solexa衔接头；
4) 用衔接头引物对所述的 RNA分子进行 RT-PCR反应， 获得扩增产物；
5) 分离扩增产物并进行测序；
6) 对测序结果进行数据分析与处理。
在另一优选例中， 所述生物芯片方法包括如下步骤：
1) 从受试牛乳样本中提取牛乳总 RNA， 并分离微小核糖核酸； 2) 对微小核糖核酸进行标记， 从而使其携带可检测信号；
3) 步骤 2)的微小核糖核酸与一生物 (核酸)芯片进行杂交反应， 其中所述的芯 片具有针对权利要求 1中所述的成熟体微小核糖核酸中 2-109种的检测点；
4) 对杂交结果进行数据检测与分析。
在另一优选例中， 在步骤 2)中， 利用 T4 RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光 标记。
在本发明的第三方面， 提供了一种用于检测原乳含量与质量的试剂盒， 该试 剂盒包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的 109种微小核糖核酸的试剂或芯 片，
其中， 所述的试剂选自下组：
(a) 特异性扩增本发明第一方面所述的成熟体微小核糖核酸的引物或引物 对；
(b) 特异性与本发明第一方面所述的成熟体微小核糖核酸杂交的探针； 其中， 所述的芯片是具有特异性检测本发明第一方面所述的成熟体微小核糖 核酸的检测点的核酸芯片。
在本发明第四方面， 提供了一种可评价牛乳质量的生物芯片， 所述的芯片是 具有特异性检测本发明第一方面所述的成熟体微小核糖核酸的检测点的核酸芯 片。
在另一优选例中， 所述的检测点针对 2-109种所述的成熟体微小核糖核酸。 在另一优选例中， 所述的检测点点样有与所述的成熟体微小核糖核酸特异性 杂交的探针。
在另一优选例中， 包含牛乳中的 109种成熟体微小核糖核酸的探针。
在另一优选例中， 所述的探针选自表 1所示的探针：
对应 SEQ ID 探针 microRNA 探针序列 NO : probe - let - 7a let - 7a AACTATACAACCTACTACCTCA 21 probe - let - 7b let- 7b AACCACACAACCTACTACCTCA 22 probe - let - 7c let - 7c AACCATACAACCTACTACCTCA 23 probe - let - 7d let - 7d ACTATGCAACCTACTACCTCT 24 probe - let - 7e let - 7e ACTATACAACCTCCTACCTCA 25 probe - let - 7f let- 7f AACTATACAATCTACTACCTCA 26 probe - let - 7g let- 7g ACTGTACAAACTACTACCTCA 27 probe - let - 7i let - 7i ACAGCACAAACTACTACCTCA 28 probe - miR - 101 miR- 101 CTTCAGTTATCACAGTACTGTA 29 probe - miR - 103 miR- 103 TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT 30 probe - miR - 106a miR- 106a GCTACCTGCACTGTAAGCACTTTT 31 probe - miR - 106b miR- 106b ATCTGCACTGTCAGCACTTTA 32 probe - miR - 107 miR- 107 TGATAGCCCTGTACAATGCTGCT 33 probe - miR - 125a miR- 125a CACAGGTTAAAGGGTCTCAGGGA 34 probe - miR - 125b miR- 125b TCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA 35 probe - miR - 128a miR- 128a AAAAGAGACCGGTTCACTGTGA 36 probe - miR - 128b miR- 128b GAAAGAGACCGGTTCACTGTGA 37 probe - miR - 130b miR- 130b ATGCCCTTTCATCATTGCACTG 38 probe - miR - 138 miR- 138 GATTCACAACACCAGCT 39 probe - miR - 140 miR- 140 CTACCATAGGGTAAAACCACT 40 probe - miR - 141 miR- 141 CCATCTTTACCAGACAGTGTTA 41 probe - miR - 142 - 3p miR- 142- 3p TCCATAAAGTAGGAAACACTACA 42 probe - miR - 142 - 5p miR- 142- 5p GTAGTGCTTTCTACTTTATG 43 probe - miR - 146b miR- 146b AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA 44 probe - miR - 148a miR- 148a ACAAAGTTCTGTAGTGCACTGA 45 probe - miR - 148b miR- 148b ACAAAGTTCTGTGATGCACTGA 46 probe - miR - 150 miR- 150 CACTGGTACAAGGGTTGGGAGA 47 probe - miR - 151 miR- 151 CCTCAAGGAGCTTCAGTCTAGT 48 probe - miR - 152 miR- 152 CCCAAGTTCTGTCATGCACTGA 49 probe - miR - 155 miR - 155 CCCCTATCACGATTAGCATTAA 50 probe - miR - 15a miR - 15a CACAAACCATTATGTGCTGCTA 51 probe - miR - 15b miR - 15b TGTAAACCATGATGTGCTGCTA 52 probe - miR - 16 miR- 16 CGCCAATATTTACGTGCTGCTA 53 probe - miR - 17 - 3p miR- 17- 3p ACAAGTGCCTTCACTGCAGT 54 probe - miR - 17 - 5p miR - 17 - 5p ACTACCTGCACTGTAAGCACTTTG 55 probe - miR - 181a miR- 181a ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT 56 probe - miR - 181b miR- 181b CCCACCGACAGCAATGAATGTT 57 probe - miR - 181d miR- 181d AACCCACCGACAACAATGAATGTT 58 probe - miR - 185 miR- 185 GAACTGCCTTTCTCTCCA 59 probe - miR - 186 miR- 186 AAGCCCAAAAGGAGAATTCTTTG 60 probe - miR - 191 miR- 191 AGCTGCTTTTGGGATTCCGTTG 61 probe - miR - 192 miR- 192 GGCTGTCAATTCATAGGTCAG 62 probe - miR - 193a miR- 193a CTGGGACTTTGTAGGCCAGTT 63 probe - miR - 193b miR- 193b AAAGCGGGACTTTGAGGGCCAGTT 64 probe - miR - 194 miR- 194 TCCACATGGAGTTGCTGTTACA 65 probe - miR - 196a miR- 196a CCAACAACATGAAACTACCTA 66 probe - miR - 197 miR- 197 GCTGGGTGGAGAAGGTGGTGAA 67 probe - miR - 19b miR- 19b TCAGTTTTGCATGGATTTGCACA 68 probe - miR - 200a miR-200a ACATCGTTACCAGACAGTGTTA 69 probe-miR-200a* miR-200a* TCCAGCACTGTCCGGTAAGATG 70 probe - miR - 200b miR-200b GTCATCATTACCAGGCAGTATTA 71 probe - miR - 200c miR-200c CCATCATTACCCGGCAGTATTA 72 probe - miR - 203 miR-203 CTAGTGGTC CTAAAC ATTTCAC 73 probe - miR - 20a miR-20a CTACCTGCACTATAAGCACTTTA 74 probe - miR - 21 miR - 21 TCAACATCAGTCTGATAAGCTA 75 probe - miR - 210 miR- 210 TCAGCCGCTGTCACACGCACAG 76 probe - miR - 22 miR- 22 ACAGTTCTTCAACTGGCAGCTT 77 probe - miR - 221 miR- 221 GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT 78 probe-miR-222 miR- 222 GAGACCCAGTAGCCAGATGTAGCT 79 probe - miR - 223 miR- 223 GGGGTATTTGACAAACTGACA 80 probe - miR - 23a miR - 23a GGAAATCCCTGGCAATGTGAT 81 probe - miR - 23b miR- 23b GGTAATCCCTGGCAATGTGAT 82 probe - miR - 24 miR - 24 CTGTTCCTGCTGAACTGAGCCA 83 probe - miR - 25 miR - 25 TCAGACCGAGACAAGTGCAATG 84 probe - miR - 26a miR - 26a GCCTATCCTGGATTACTTGAA 85 probe - miR - 26b miR- 26b AACCTATCCTGAATTACTTGAA 86 probe - miR - 27a miR-27a GCGGAACTTAGCCACTGTGAA 87 probe - miR - 27b miR- 27b GCAGAACTTAGCCACTGTGAA 88 probe - miR - 29a miR-29a AACCGATTTCAGATGGTGCTA 89 probe - miR - 29b miR-29b AACACTGATTTCAAATGGTGCTA 90 probe - miR - 29c miR-29c ACCGATTTCAAATGGTGCTA 91 probe - miR - 30b miR-30b AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA 92 probe - miR - 30c miR-30c GCTGAGAGTGTAGGATGTTTACA 93 probe - miR - 30d miR-30d CTTCCAGTCGGGGATGTTTACA 94 probe - miR - 30e - 3p miR - 30e - 3p GCTGTAAACATCCGACTGAAAG 95 probe - miR - 30e - 5p miR - 30e - 5p TCCAGTCAAGGATGTTTACA 96 probe - miR - 31 miR -31 CAGCTATGCCAGCATCTTGCC 97 probe - miR - 320 miR- 320 TTCGCCCTCTCAACCCAGCTTTT 98 probe - miR - 33 miR -33 CAATGCAACTACAATGCAC 99 probe - miR - 331 miR- 331 TTCTAGGATAGGCCCAGGGGC 100 probe - miR - 339 miR- 339 TGAGCTCCTGGAGGACAGGGA 101 probe - miR - 361 miR- 361 GTACCCCTGGAGATTCTGATAA 102 probe - miR - 374 miR- 374 CACTTATCAGGTTGTATTATAA 103 probe - miR - 375 miR- 375 TCACGCGAGCCGAACGAACAAA 104 probe - miR - 378 miR- 378 ACACAGGAC CTGGAGTCAGGAG 105 probe - miR - 423 miR- 423 CTGAGGGGCCTCAGACCGAGCT 106 probe - miR - 425 miR- 425 GGCGGACACGACATTCCCGAT 107 probe - miR - 484 miR- 484 ATCGGGAGGGGACTGAGCCTGA 108 probe - miR - 532 miR- 532 ACGGTCCTACACTCAAGGCATG 109 probe - miR - 574 miR- 574 GTGGGTGTGTGCATGAGCGTG 110 probe - miR - 652 miR- 652 TGCACAACCCTAGTGGCGCCATT 111 probe - miR - 7 miK - 7 CAACAAAATCACTAGTCTTCCA 112 probe - miR - 92 miR -92 CAGGCCGGGACAAGTGCAATA 113 probe - miR - 93 miR -93 CTACCTGCACGAACAGCACTTT 114 probe - miR - 98 miR -98 AACAATACAACTTACTACCTCA 115 probe - miR - 99a miR- 99a CACAAGATCGGATCTACGGGTT 116 probe - miR - 99b miR- 99b CGCAAGGTCGGTTCTACGGGTG 117 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例;)中具 体描述的各技术特征可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在 此不再—累述。 附图说明
图 1为高温高压处理后的牛乳中部分微小核糖核酸的表达谱。
图 2A-2F为七种微小核糖核酸在原乳中的特性研究。
其中图 2-A显示了不同产奶期的奶牛产出的牛乳中蛋白含量基本一致。
图 2B显示了， 对于从 Solexa结果中选取的在不同产奶期均高表达且含量接 近的 7种 miRNA, 用实时荧光定量 PCR检测 miRNA的含量的结果。
图 2C显示了实时荧光定量 PCR中标准曲线图 (n=64)，其中将所检测的 miRNA 对应的 CT数转化为 miRNA浓度。
图 2D显示了在产奶期 7天， 一个月， 6个月， 9个月中， 7种 miRNA含量相 对稳定。
图 2E显示了 7种 miRNA在原乳中平均含量。
图 2F显示了 7种 miRNA在原乳和牛血清中含量之比。 结果表明， 这 7种 miRNA在牛原乳中含量高于在牛血清中的含量。
图 3A-3C为七种微小核糖核酸在商品化液态奶中的特性研究。
其中， 图 3A显示了在原乳， 液态奶， 配方液态奶中蛋白含量： 采用 BSA蛋 白定量法检测， 发现原乳， 液态奶， 配方液态奶中蛋白含量一致。
图 3B显示了在原乳和液态奶中 7种 miRNA含量。
图 3C显示了 7种 miRNA在液态奶和配方液态奶中含量。
图 4A— 4F为七种微小核糖核酸在商品化奶粉中的特性研究。
其中， 图 4A显示了 BSA蛋白定量法检测牛原乳， 一岁以上儿童奶粉， 一岁 以下婴儿奶粉， 检验合格奶粉和三鹿奶粉中蛋白含量时， 蛋白含量相近。
图 4B显示了原乳和一岁以上婴儿奶粉中 7种 miRNA含量。
图 4C显示了一岁以上儿童奶粉和 5种一岁以下婴儿奶粉中 7种 miRNA含量。 ( 1.2.3.4.5.6.7.8. 分别为 miR-26a， 26b, 200c, 21， 30d， 99a, 148a)
图 4D显示了利用 7种 miRNA作为标记物检测的可信度 (； ROC曲线；)。其中的 曲线分别代表检测的问题奶粉和对照奶粉中 7种 miRNA含量存在差异。
图 4E显示了一岁以上婴儿奶粉和 4种问题奶粉中 7种 miRNA表达水平
( 1.2.3.4.5.6.7.8. 分别为 miR-26a， 26b, 200c, 21， 30d， 99a, 148a) 。
图 4F显示了一岁以上儿童奶粉和 10种三鹿奶粉中 7种 miRNA的含量。 发明详述
申请人经过广泛而深入的研究， 意外地发现： 在原乳、 商品的液态乳及奶粉 中广泛存在着来源于牛乳的微小核糖核酸， 并且牛乳中的特异性微小核糖核酸图 谱不受任何添加剂的影响， 且与牛血清、 牛尿的成分有区别， 并与其它动物中的 微小核糖核酸图谱也不相同。
此外， 牛乳微小核糖核酸也可以通过摄食方式进入摄食者的 （人， 动物等） 的血液或组织中， 调节相关组织与细胞的生物学或生理学功能。 不同的微小核糖 核酸在人体中针对不同的靶基因发挥作用。 针对不同疾病， 调节牛乳微小核糖核 酸的种类和数量， 制造含有不同种类和浓度牛乳微小核糖核酸的牛乳， 通过摄食 方式可以治疗不同疾病。
因此牛乳中的特异性微小核糖核酸是一种理想的生物标志物， 可以用来检测 牛乳质量。 并且牛乳微小核糖核酸有某些特定的生物学功能， 通过调节和增减牛 乳微小核糖核酸的种类和数量， 可以增加牛乳的营养并有助于对疾病进行治疗。 微小核糖核酸
微小核糖核酸， 英文名为 microRNA, 是一类长约 19至 23个核苷酸的非编 码单链小核糖核酸分子， 它们在进化上高度保守， 广泛存在于动植物细胞中， 目 前已在人类、 小鼠、 大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸。
微小核糖核酸在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用， 其序列、 结 构、 丰度和表达方式的多样性， 使之成为信使 RNA强有力的调控因子。微小核糖 核酸的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在 RNA水平对分子进行 更迅速更有效调节的新方式， 展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系 统。微小核糖核酸的发现也是对中心法则中 RNA次要的中介角色的重要补充， 它 将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其生长发育等方面的重要问题。
微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关， 如生长发育、 细胞调亡 以及脂肪代谢等等。 申请人经过研究发现， 微小核糖核酸在牛乳中稳定存在， 能 够对抗 RNA酶的切割， 并对高温、 高压、 强酸、 强碱及反复冻融有抵抗。 因此， 基于微小核糖核酸的生物学特性，完成有可能通过微小核糖核酸来检测牛乳质量。
如本文所用，术语"本发明的 miRNA"或"用于检测牛乳乳液质量的 miRNA" 指在牛乳中稳定存在且可检测的 109种成熟体微小核糖核酸： hsa-let-7a、 hsa-let-7b、 hsa-let-7c、 hsa-let-7d、 hsa-let-7e、 hsa-let-7f、 hsa-miR- 15a、 hsa-miR-16、 hsa-miR-17、 hsa-miR- 19b、 hsa-miR-20a、 hsa-miR-21、 hsa-miR-22、 hsa-miR-23a、 hsa-miR-24、 hsa-miR-25、 hsa-miR-26a、 hsa-miR-26b、 hsa-miR-27a、 hsa-miR-29a、 hsa-miR-30a、 hsa-miR-3 1、 hsa-miR-33a、 hsa-miR-92a、 hsa-miR-93、 hsa-miR-98、 hsa-miR-99a、 hsa-miR- 101、 hsa-miR-29b、 hsa-miR- 103、 hsa-miR- 106a、 hsa-miR- 107、 hsa-miR-192、 hsa-miR- 196a ^ hsa-miR- 197 ^ hsa-miR-148a、 hsa-miR-30c、 hsa-miR-30d、 hsa-miR-7、 hsa-miR- 18 la^ hsa-miR- 18 lb ^ hsa-miR-203、 hsa-miR-210、 hsa-miR-221、 hsa-miR-222、 hsa-miR-223、 hsa-miR-200b、 hsa-let-7g、 hsa-let-7i、 hsa-miR- 15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、 hsa-miR- 125b、 hsa-miR- 128、 hsa-miR- 138, hsa-miR- 140-3p, hsa-miR- 14 hsa-miR- 142-5p, hsa-miR- 142-3p、 hsa-miR-152、 hsa-miR- 19 hsa-miR- 125 a-5p ^ hsa-miR- 150 ^ hsa-miR- 185 ^ hsa-miR-186、 hsa-miR-193a-5p、 hsa-miR- 193a-3p、 hsa-miR- 194、 hsa-miR-320a、 hsa-miR-200c、 hsa-miR-155、 hsa-miR- 106b、 hsa-miR-29c、 hsa-miR-200a、 hsa-miR-99b、 hsa-miR-130b、 hsa-miR-30e、 hsa-miR-361-5p、 hsa-miR-374a、 hsa-miR-375、 hsa-miR-378、 hsa-miR-151-5p、 hsa-miR-151-3p、 hsa-miR-148b、 hsa-miR-33 l-3p、 hsa-miR-339-5p、 hsa-miR-423-5p、 hsa-miR-423-3p、 hsa-miR-425、 hsa-miR-484、 hsa-miR- 146b-5p、 hsa-miR- 181d、 hsa-miR-532-5p、 hsa-miR-532-3p、 hsa-miR-92b、 hsa-miR-574-5p、 hsa-miR-574-3p、 hsa-miR-652、 hsa-miR-320b、 hsa-miR-320c、 hsa-miR-874、 hsa-miR-744、 hsa-miR-885-3p、 hsa-miR-760、 hsa-miR-935、 hsa-miR-1308、 hsa-miR- 1306、 hsa-miR-1307。 该术语还包括以上 109种成熟体微小核糖核酸中 n种所构成的组合， 其中 n = 2-109的整数。
在上述组合 （组合是指任何含有以上 1种到 109种的微小核糖核酸标志物变 化的集合） 、 方法、 试剂盒或生物芯片中， 所述评价受试的原乳， 商品化的液态 奶及各种配方的奶粉为测定受试样本给予待测物后的原乳含量， 具体用于检测待 测物的质量； 所述评价受试样本的原乳含量为测试标准； 所述评价受试样本的原 乳含量为评价对受试样本的质量标准。 检测方法
鉴于本发明的 miRNA是牛乳中稳定存在且可检测的 109种成熟体微小核糖 核酸， 因此本发明提供了一种检测奶制品的乳质量的方法， 包括步骤： 检测奶制 品中所述的一种或多种 miRNA微小核糖核酸存在与否以及含量， 从而确定乳质 如本文所用， 奶制品包括： 原乳、 液态奶和奶粉。 如本文所用， 术语 "牛乳" 包括牛原乳、 液态牛乳或液态牛奶， 以及奶粉加水后形成的复原乳。 因此， 本发 明方法中的待测样品可以原乳， 商品化的液态奶及各种配方的奶粉。
在另一优选例中， 所述方法包括： （a) 检测在牛乳中稳定存在且可检测的 109 种成熟体微小核糖核酸或其组合的存在与否以及含量：
(b) 根据将步骤 (a)的检测结果与牛乳标准品的结果进行比较， 从而确定牛乳 质量。
在另一优选例中， 步骤 (b)包括将步骤 (a)的检测结果与牛乳标准品的结果进行 比较， 从而确定牛乳质量； 或者， 将步骤 (a)的检测结果进行换算， 从而确定牛乳 质量。
在本发明中， 检测微小核糖核酸的方法没有特别限制， 代表性来自包括 (但并 不限于）： RT-PCR方法、 实时 PCR方法、 Northern 印迹法、 RNase 保护分析法、
Solexa测序法或生物芯片方法。
在本发明的一个优选例中， 优选的 RT-PCR方法包括： 收集牛乳样本； 将牛 乳浆进行逆转录反应制备 cDNA样品或使用 Trizol试剂提取牛乳总 RNA再进行 逆转录反应制备 cDNA样品； 通过成熟体微小核糖核酸设计引物进行 PCR反应； 进行 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳； EB染色后在紫外灯下观察结果并拍照。
在本发明的一个优选例中， 优选的 Real-time PCR方法包括： 收集牛乳样本； 将牛乳进行逆转录反应制备 cDNA样品或使用 Trizol试剂提取牛乳总 RNA再进 行逆转录反应制备 cDNA样品；通过成熟体微小核糖核酸设计 PCR的引物并加入 荧光探针 EVA GREEN进行 PCR反应； 分析处理数据并比较结果。
应理解， 本发明方法不仅适用检测牛乳的质量， 也适用于检测羊乳、 马乳等 其他乳产品的质量。 不同点在于应选用羊乳、 马乳中存在的 miRNA。 芯片
将上述在牛乳中稳定存在的微小核糖核酸筛选出来， 将其反向互补序列作为 探针点在芯片， 就制成了专门针对牛乳微小核糖核酸检测生物芯片。 因此本发明 还提供一种用于检测牛乳乳液质量 miRNA表达谱的芯片， 所述的 miRNA芯片包 括：
固相载体； 以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针， 所述的寡核苷酸 探针特异性地本发明的的 miRNA序列。
本发明的牛乳质量检测芯片可以含有一种或多种， 较佳地含有 5种， 更佳 地 10种， 最佳地 20种本发明的 miRNA的检测点。 例如， 含有至少 5、 10、 15、 20、 25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100种， 直至全部（109种或更多）本 发明 miRNA的检测点。
如上所述， 本发明的蛋白质芯片优选含有相对独立的检测区。 当含有一个或 多个这些的检测区时，每个检测区宜含有至少 2种，较佳地至少 5种本发明 miRNA 的检测点。
代表性的寡核苷酸探针包括 (但并不限于)： SEQ ID NO: 21- SEQ ID NO: 117所 示的探针。 更佳的， 所述的寡核苷酸探针是生物素化或带荧光标记的探针。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料， 例如但不限于尼龙膜， 经 活性基团 （如醛基、 氨基等） 修饰的玻片或硅片、 未修饰的玻片、 塑料片等。
所述的 miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。 例 如， 如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片， 探针的 5'端含有氨基修饰的聚 dT串， 可将寡核苷酸探针配制成溶液， 然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上， 排列 成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的 miRNA芯片。 本发明具有如下主要优点：
本发明利用通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸可以建立唯一指向原始牛乳 含量的标准， 简单易行，成本低廉，特别适用于原乳含量的检测 (包括稀释的样品；)， 输出的结果简单明了。
本发明的意义在于可以从根本上断绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的可 能， 同时推动这一科学的评价方法,也有利于采用这一方法的企业尽快在公众心中 建立新的质控形象， 安定消费者的担心， 帮助企业尽快走出目前的困境。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如 Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条 件。 实施例 1
牛乳中的微小核糖核酸的 RT-PCR
首先必须确定微小核糖核酸在牛乳中能检测到， 本实施例使用了 RT-PCR技 术证明牛乳中不仅能检测到微小核糖核酸， 而且其表达量相当丰富。
实验步骤为：收集正常原始牛乳；之后的操作有两种方案，一种方案为将 ΙΟμΙ 牛乳作为 buffer直接逆转录， 另一种为提取牛乳的总 RNA， 使用的试剂是 TRIzol 试剂 (Invitrogen) , 10ml牛乳通常能富集约 l(^g左右的 RNA; 之后为逆转录， 加 入 4μ1 5 xAMV缓冲液， 2μ1 10mM 每种 dNTP(Takara) , 0.5μ1 RNase抑制剂 (Takara) , 2μ1 AMV(Takara)以及 1.5 μ1 基因特异性反向引物混合物， 将混合液 16 °C孵育 15min， 42 反应 60min以进行逆转录， 85 °C孵育 5min使 AMV酶失活； 最后为 PCR及电泳： 将 cDNA按 1/50稀释， 取 Ι μΐ稀释后的 cDNA， 加入 0.3 μ1 Taq酶 (Takara) , 0.2μ1 10μΜ正向引物， 0.2μ1 10μΜ 通用反向引物， 1.2μ1 25mM MgCl2， 1.6μ1 2.5mM 每种 dNTP(Takara) , 2μ1 lO xPCR缓冲液， 13.5 μ1 Η2Ο， 20μ1体系进 行 PCR。PCR的反应条件是： 95 °C 5min 进行 1个循环→ 95 °C 15sec， 60 °C lmin 进行 40个循环。 PCR产物取 ΙΟμΙ在 3%琼脂糖凝胶上电泳， ΕΒ染色， UV下观 察。
结果表明， 在高温高压处理后的牛乳中也存在微小核糖核酸 (图 1)。 实施例 2
牛乳中的 109种微小核糖核酸的检测
采用 Solexa测序方法， 方法如下：
1) 从受试牛乳样本中， 用 Trizol试剂提取牛乳总 RNA;
2) 从总 RNA中， 通过 PAGE电泳回收 17-27nt的 RNA分子；
3) 在所述 RNA分子的 3'与 5'端添加 Solexa衔接头；
4) 用衔接头引物对所述的 RNA分子进行 RT-PCR反应， 获得扩增产物;
5) 分离扩增产物并进行测序；
6) 将测序结果与公共的 miRN A datab se(miRN A数据库：
http://www.mirbase.org/)中的数据进行比对， 从而确定微小核糖核酸的种类。 结果表明， 在牛乳中稳定存在且可检测的以下 109种成熟体微小核糖核酸： hsa-let-7a、 hsa-let-7b、 hsa-let-7c、 hsa-let-7d、 hsa-let-7e、 hsa-let-7f、 hsa-miR-15a、 hsa-miR-16、 hsa-miR- 17、 hsa-miR- 19b、 hsa-miR-20a、 hsa-miR-21、 hsa-miR-22、 hsa-miR-23a、 hsa-miR-24、 hsa-miR-25、 hsa-miR-26a、 hsa-miR-26b、 hsa-miR-27a、 hsa-miR-29a、 hsa-miR-30a、 hsa-miR-31、 hsa-miR-33a、 hsa-miR-92a、 hsa-miR-93、 hsa-miR-98、 hsa-miR-99a、 hsa-miR- lO hsa-miR-29b、 hsa-miR-103、 hsa-miR-106a、 hsa-miR-107、 hsa-miR-192 、 hsa-miR-196a、 hsa-miR- 197、 hsa-miR-148a、 hsa-miR-30c、 hsa-miR-30d、 hsa-miR-7、 hsa-miR-181a、 hsa-miR-181b、 hsa-miR-203、 hsa-miR-210、 hsa-miR-221、 hsa-miR-222、 hsa-miR-223、 hsa-miR-200b、 hsa-let-7g、 hsa-let-7i、 hsa-miR-15b、 hsa-miR-23b、 hsa-miR-27b、 hsa-miR-30b、 hsa-miR-125b、 hsa-miR-128 , hsa-miR-138、 hsa-miR-140-3p、 hsa-miR- 141、 hsa-miR- 142-5p、 hsa-miR-142-3p、 hsa-miR-152、 hsa-miR- 191、 hsa-miR- 125a-5p、 hsa-miR-150、 hsa-miR-185、 hsa-miR- 186、 hsa-miR-193a-5p、 hsa-miR-193a-3p、 hsa-miR-194、 hsa-miR-320a、 hsa-miR-200c、 hsa-miR-155、 hsa-miR-106b、 hsa-miR-29c、 hsa-miR-200a、 hsa-miR-99b、 hsa-miR-130b、 hsa-miR-30e、 hsa-miR-361-5p、 hsa-miR-374a、 hsa-miR-375、 hsa-miR-378、 hsa-miR-15 l-5p、 hsa-miR-151-3p、 hsa-miR-148b、 hsa-miR-33 l-3p、 hsa-miR-339-5p、 hsa-miR-423-5p、 hsa-miR-423-3p、 hsa-miR-425、 hsa-miR-484、 hsa-miR- 146b-5p、 hsa-miR-181d、 hsa-miR-532-5p、 hsa-miR-532-3p、 hsa-miR-92b、 hsa-miR-574-5p、 hsa-miR-574-3p、 hsa-miR-652、 hsa-miR-320b、 hsa-miR-320c、 hsa-miR-874、 hsa-miR-744、 hsa-miR-885-3p、 hsa-miR-760、 hsa-miR-935、 hsa-miR-1308, hsa-miR-1306、 hsa-miR-1307。 实施例 3
牛乳中的微小核糖核酸的实时荧光 PCR
微小核糖核酸的定量 PCR实验原理及实验步骤同 RT-PCR—样， 唯一不同是 在 PCR的时候加入了荧光染料 EVA GREEN。 仪器使用的是 ABI Prism 7300荧光 定量 PCR仪 (Appied Biosystems) , 反应条件为 95 °C 5min 进行 1个循环→95 °C 15sec， 60 °C lmin进行 40个循环。 数据处理方法为 Δ A CT 法， CT设为反应达 到域值时的循环数， 则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程 2- A CT表示， 其中 A CT = CT样品 - CT 内参。 所以微小核糖核酸可以作为一种新 牛乳质量控制的标志物。 实施例 4
对液态奶的检测
采用实施例 3所述的方法，选用 miRNA-26a、miR-26b、miR-200c、miRNA-21、 miR-30d、 miR-99a、 miR-148等 7种 miRNA作为标志物， 对市场上购买的多种液 态奶和牛原乳进行检测。
结果如图 3A至 3C所示。 结果表明， 7种 microRNA联合检验加强了检测精 确度， 结果表明虽然市售液态奶与原乳中蛋白质含量相近， 但这些蛋白质并不全 部来源于原乳。
其中图 3A显示， 在总蛋白水平， 市售液态纯牛奶， 液态配方奶与原乳中蛋白 质含量几乎没有差异。
图 3B显示， miRNA- 26a， 26b , 200c , 21， 30d， 99a , 148a在原乳和液态纯 牛奶中含量的对比。表明在 microRNA水平， 原乳与液态纯牛奶中 mi croRNA表达 量有显著的差异，表明 mi croRNA的检验精确度要远远高于经典的总蛋白检验法。 而且 7种 mi croRNA联合检验进一步加强了检验的精确度和可信度。
图 3C表明在 mi croRNA水平，液态配方奶中 mi croRNA表达量低于其在原乳中 的表达量。 实施例 5
检测商品化奶粉
采用实施例 3所述的方法，选用 miRNA-26a、miR-26b、miR-200c、miRNA-21、 miR-30d、 miR-99a、 miR-148等 7种 miRNA作为标志物， 通过实时荧光定量 PCR 检测了多种奶粉产品中的 7种 miRNA含量。
结果如图 4A-4F所示。
图 4A表示， 用常规的 BSA蛋白定量法检测牛原乳， 一岁以上儿童奶粉， 一 岁以下婴儿奶粉，检验合格奶粉和三鹿奶粉中蛋白含量时， 蛋白含量相近 (图 4A；)。
图 4B显示 miRNA-26a， 26b , 200c , 21， 30d， 99a, 148a在原乳和合格配方 奶粉中含量的对比。 microRNA浓度可以有效地判断出原乳和奶粉的差别， 提示 奶粉在加工过程添加了添加剂而降低了原乳的比例。
图 4A-4F的结果表明：以原乳中 7种 miRNA含量最高。此外， 7种 microRNA 联合检验可以有效检测出不同市售配方奶粉中的原乳含量差异， 问题奶粉中 7种 microRNA表达量低于合格奶粉中相对应 microRNA的平均表达量。 实施例 6
专门用于牛乳质量监控的微小核糖核酸试剂盒的制作
专门用于牛乳质量监控的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于 定量 PCR技术的， 试剂包括常用的 Taq酶、 dNTP等。 此试剂盒的价值在于， 用 最精简的探针库检测在牛乳中微小核糖核酸的变化趋势， 再通过该变化趋势监控 牛乳质量， 所以， 将此芯片投入实践， 可以建立唯一指向原始牛乳含量的标准， 其 意义在于从根本上断绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的动机，同时推动这一科 学的评价方法。
实施例 7
miRNA芯片的制备
1. 探针的设计与合成
人工合成 miRNA序列探针 (SEQ ID NO: 21- SEQ ID NO: 117)。为使合成的探 针稳定地结合在玻片上， 采用常规的方法在合成后探针的 5 ' 端进行糖基修饰。 2. miRNA芯片的点制
先将玻片的表面进行烷基化修饰， 以提高结合能力。 采用常规的芯片点样方 法进行点样， 从而制得 miRNA 芯片。 为了检测杂交试验的可重复性， 每个探针 在玻片上点 3-6个杂交点。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

  1. 权 利 要 求
    中稳定存在且可检测的 109种成熟体微小核糖核酸:
    hsa - let - 7a、hsa - let - 7b、hsa - let - 7c、hsa - let - 7d、hsa - let - 7e、hsa - let - 7f、
    -miR - 15a、 hsa - miR - 16、 hsa - miR - 17、 hsa - miR - 19b、 hsa - miR - 20a、 hsa - miR - 21、
    -miR - 22、 hsa - miR - 23a、 hsa - miR - 24、 hsa - miR - 25、 hsa - miR - 26a、 hsa - miR - 26b、 -miR - 27a、 hsa - miR - 29a、 hsa - miR - 30a、 hsa - miR - 31、 hsa - miR - 33a、
    -miR - 92a、hsa - miR - 93、hsa - miR - 98、hsa - miR - 99a、hsa - miR - 101、hsa - miR - 29b、 -miR - 103、 hsa - miR - 106a、 hsa - miR - 107、 hsa - miR - 192、 hsa - miR - 196a、 -miR - 197、 hsa - miR - 148a、 hsa - miR - 30c、 hsa - miR - 30d、 hsa - miR - 7、
    -miR- 181a、 hsa- miR- 181b、 hsa- miR- 203、 hsa- miR- 210、 hsa- miR- 221、 -miR- 222、 hsa- miR- 223、 hsa- miR- 200b、 hsa- let- 7g、 hsa- let- 7 i、
    -miR - 15b、 hsa - miR - 23b、 hsa - miR - 27b、 hsa - miR - 30b、 hsa - miR - 125b、 -miR- 128、 hsa- miR- 138、 hsa- miR- 140- 3p、 hsa- miR- 141、 hsa- miR- 142- 5p、 -miR- 142- 3p、 hsa- miR- 152、 hsa- miR- 191、 hsa- miR- 125a- 5p、 hsa- miR- 150、 -miR - 185、 hsa - miR - 186、 hsa - miR - 193a - 5p、 hsa - miR - 193a - 3p、 hsa - miR - 194、 -miR - 320a、 hsa - miR - 200c、 hsa - miR - 155、 hsa - miR - 106b、 hsa - miR - 29c、 -miR - 200a、 hsa - miR - 99b、 hsa - miR - 130b、 hsa - miR - 30e、 hsa - miR - 361 - 5p、 -miR - 374a、 hsa - miR - 375、 hsa - miR - 378、 hsa - miR - 151 - 5p、 hsa - miR - 151 - 3p、 -miR - 148b、 hsa - miR - 331 - 3p、 hsa - miR - 339 - 5p、 hsa - miR - 423 - 5p、
    -miR - 423 - 3p、 hsa - miR - 425、 hsa - miR - 484、 hsa - miR - 146b - 5p、 hsa - miR - 181 d、 -miR - 532 - 5p、 hsa - miR - 532 - 3p、 hsa - miR - 92b、 hsa - miR - 574 - 5p、
    -miR- 574- 3p、 hsa- miR- 652、 hsa- miR- 320b、 hsa- miR- 320c、 hsa- miR- 874、 -miR - 744、 hsa - miR - 885 - 3p、 hsa - miR - 760、 hsa - miR - 935、 hsa - miR - 1308、 -miR- 1306、 hsa- miR- 1307 ;
    或以上 109种成熟体微小核糖核酸中 n种所构成的组合， 其中 n = 2- 109的整 hsa- -le t - 7a、 hsa - let - 7b、 hsa - let - 7c、 hsa - let - 7d、 hsa - let - 7e、 hsa - let - 7f、 hsa- - miR- - 15a、 hsa - miR - 16、 hsa - miR - 17、 hsa - miR - 19b、 hsa - miR - 20a、 hsa - miR - 21、 hsa- - miR- -22、 hsa - miR - 23a、 hsa - miR - 24、 hsa - miR - 25、 hsa - miR - 26a、 hsa - miR - 26b、 hsa- - miR- -27a 、 hsa - miR - 29a 、 hsa - miR - 30a 、 hsa - miR - 31 、 hsa - miR - 33a 、 hsa- - miR- -92a、 hsa - miR - 93、 hsa - miR - 98、 hsa - miR - 99a、 hsa - miR - 101、 hsa - miR - 29b、 hsa- - miR- -103、 hsa - miR - 106a、 hsa - miR - 107、 hsa - miR - 192、 hsa - miR - 196a、 hsa- - miR- -197 、 hsa - miR - 148a 、 hsa - miR - 30c 、 hsa - miR - 30d 、 hsa - miR - 7 、 hsa- - miR- -181a . hsa- miR- 181b、 hsa- miR- 203、 hsa- miR- 210、 hsa- miR- 221、 hsa- - miR- -222 、 hsa - miR - 223 、 hsa - miR - 200b 、 hsa - let - 7g 、 hsa - let - 7 i 、 hsa- - miR- -15b、 hsa - miR - 23b、 hsa - miR - 27b、 hsa - miR - 30b、 hsa - miR - 125b、 hsa- - miR- -128、 hsa- miR- 138、 hsa- miR- 140- 3p、 hsa- miR- 141、 hsa- miR- 142- 5p、 hsa- - miR- - 142 - 3p、 hsa - miR - 152、 hsa - miR - 191、 hsa - miR - 125a - 5p、 hsa - miR - 150、 hsa- - miR- -185、 hsa - miR - 186、 hsa - miR - 193a - 5p、 hsa - miR - 193a - 3p、 hsa - miR - 194、 hsa- - miR- -320a、 hsa - miR - 200c、 hsa - miR - 155、 hsa - miR - 106b、 hsa - miR - 29c、 hsa- - miR- -200a ^ hsa - miR - 99b、 hsa - miR - 130b、 hsa - miR - 30e、 hsa - miR - 361 - 5p、 hsa- - miR- -374a ^ hsa - miR - 375、 hsa - miR - 378、 hsa - miR - 151 - 5p、 hsa - miR - 151 - 3p、 hsa- - miR- -148b 、 hsa - miR - 331 - 3p 、 hsa - miR - 339 - 5p 、 hsa - miR - 423 - 5p 、 hsa- - miR- - 423 - 3p、 hsa - miR - 425、 hsa - miR - 484、 hsa - miR - 146b - 5p、 hsa - miR - 181 d、 hsa- - miR- - 532 - 5p 、 hsa - miR - 532 - 3p 、 hsa - miR - 92b 、 hsa - miR - 574 - 5p 、 hsa- - miR- - 574- 3p、 hsa- miR- 652、 hsa- miR- 320b、 hsa- miR- 320c、 hsa- miR- 874、 hsa- - miR- -744、 hsa - miR - 885 - 3p、 hsa - miR - 760、 hsa - miR - 935、 hsa - miR - 1308、 hsa- - miR- -1306、 hsa— miR— 1307 ;
    (b) 根据将步骤（a)的检测结果与牛乳标准品的结果进行比较， 从而确定牛乳 质量。
  2. 3、 如权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 步骤 (a)中测定牛乳中稳定存在 且可检测 109种微小核糖核酸的方法选自： RT-PCR方法、实时 PCR方法、 Northern 印迹法、 RNase 保护分析法、 Solexa测序法或生物芯片方法。
  3. 4、 如权利要求 3所述检测牛乳质量的方法， 其特征在于， 所述 RT-PCR方法 包括以下步骤：
    1) 提取牛乳总 RNA， 通过 RNA逆转录反应得到 cDNA样品； 或者收集受试 者的牛乳样本， 以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备 cDNA样品；
    2) 用微小核糖核酸的特异性引物进行 PCR反应， 获得 PCR产物； 3) 进行所述的 PCR产物进行检测， 从而获得定性和 /或定量检测结果。
  4. 5、如权利要求 3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于，所述实时 (；荧光;) PCR 方法包括以下步骤：
    1) 提取受试的牛乳总 RNA， 通过 RNA逆转录反应得到 cDNA样品； 或者收 集受试的牛乳样本， 以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备 cDNA样品；
    2) 在微小核糖核酸特异性引物和特异性荧光探针存在下， 进行 PCR反应；
    3) 在 PCR过程中进行实时检测， 并将检测结果与牛乳样本进行比较， 从而 确定受试样品中所述微小核糖核酸的存在与否和 /数量。
  5. 6、 如权利要求 3所述检测牛乳质量的方法， 其特征在于， 所述 Northern印 迹法包括以下步骤：
    1) 从受试的牛乳样本中抽提牛乳总 RNA;
    2) 对抽提的牛乳总 RNA进行变性 PAGE电泳和膜转移；
    3) 用带有可检测信号的微小核糖核酸特异性探针进行膜杂交， 并检测可检测 信号的存在与否和 /或数量。
  6. 7、 如权利要求 3所述检测牛乳质量的方法， 其特征在于上述 Rnase保护分 析法包括如下步骤：
    1) 从受试的牛乳样本中提取 RNA;
    2) 在适合杂交的条件下， 将步骤 1)中提取的 RNA与微小核糖核酸特异性 RNA探针进行杂交， 形成杂交的双链复合物， 其中所述的 RNA探针带有可检测 信号；
    3) 用 Rnase酶处理杂交溶液，从而去除未形成双链复合物的 RNA或 RNA探 针；
    4) 检测步骤 3)的杂交溶液中双链复合物的存在与否以及数量。
  7. 8、 如权利要求 3所述检测牛乳质量的方法， 其特征在于， 所述的 Solexa测 序法包括如下步骤：
    1) 从受试牛乳样本中提取牛乳总 RNA;
    2) 从总 RNA中回收 17-27nt的 RNA分子；
    3) 在所述 RNA分子的 3'与 5'端添加 Solexa衔接头；
    4) 用衔接头引物对所述的 RNA分子进行 RT-PCR反应， 获得扩增产物； 5) 分离扩增产物并进行测序；
    6) 对测序结果进行数据分析与处理。
  8. 9、 如权利要求 3所述检测牛乳质量的方法， 其特征在于， 所述生物芯片方法 包括如下步骤：
    1) 从受试牛乳样本中提取牛乳总 RNA， 并分离微小核糖核酸；
    2) 对微小核糖核酸进行标记， 从而使其携带可检测信号；
    3) 步骤 2)的微小核糖核酸与一生物 (核酸)芯片进行杂交反应， 其中所述的芯 片具有针对权利要求 1中所述的成熟体微小核糖核酸中 2-109种的检测点；
    4) 对杂交结果进行数据检测与分析。
  9. 10、 一种用于检测原乳含量与质量的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒包含测 定受试牛乳中稳定存在且可检测的 109种微小核糖核酸的试剂或芯片，
    其中， 所述的试剂选自下组：
    (a) 特异性扩增权利要求 1所述的成熟体微小核糖核酸的引物或引物对；
    (b) 特异性与权利要求 1所述的成熟体微小核糖核酸杂交的探针；
    其中， 所述的芯片是具有特异性检测权利要求 1中所述的成熟体微小核糖核 酸的检测点的核酸芯片。
  10. 11、 一种可评价牛乳质量的生物芯片， 其特征在于， 所述的芯片是具有特异 性检测权利要求 1中所述的成熟体微小核糖核酸的检测点的核酸芯片。
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