CN105132525B - miRNA分子在精神分裂症的诊断和预后中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miRNA分子在精神分裂症的诊断和预后中的用途。特别地，本发明涉及miR‑130b和miR‑193a‑3p在精神分裂症的诊断和预后中的用途。本发明还涉及一种或多种特异地检测血浆中miR‑130b或miR‑193a‑3p含量的引物和/或探针在制备用于诊断或预后精神分裂症患者的试剂中的用途。

Description

miRNA分子在精神分裂症的诊断和预后中的用途

技术领域

本发明涉及miRNA分子在精神分裂症的诊断和预后中的用途。特别地，本发明涉及miR-130b和miR-193a-3p在精神分裂症的诊断和预后中的用途。

背景技术

精神分裂症(Schizophrenia,MIM181500)是临床最常见的重性精神疾患之一。它是一种对内在与外在现实感带来严重影响的综合征，主要表现为知觉、思维、情感、言语与活动方面的障碍和精神活动与环境不协调。一般无智力障碍，部分患者在疾病过程中可以出现认知功能损害。该病人群终生患病率约为1％。多为青春后期和成年早期发病，男女发病率相当，男性的平均发病年龄较女性早。

在全球范围内，精神分裂症占15-44岁人群疾病负担的2.6％，是世界上导致残疾的第四大原因。目前，我国各类精神障碍患者已超过8300万人，以精神分裂症为代表的重性精神疾病患者达1600万人。精神疾病已成为社会和家庭的沉重负担。WHO资料显示，与精神疾病和行为障碍相关的疾病负担占全部疾病负担的20％，超过了心脑血管、呼吸系统及恶性肿瘤等疾病，在我国疾病总负担中排名首位。

精神分裂症症状复杂多样，包括特征性的精神症状和非特异性的躯体、神经系统变化。特征性症状包括思维联想障碍、情感障碍、意志行为障碍、幻觉和感知综合障碍、妄想、紧张综合症等等。患者一般没有意识障碍。通常可分为急性综合征和慢性综合征。

精神分裂症在临床上通常分为五种类型，分别为单纯型(simple type)、青春型(hebephrenic type)、紧张型(catatonic type)、偏执型(paranoid type)和未分化型(undifferentiated type)。

家系调查发现，精神分裂症具有家族聚集性。精神分裂症患者一级亲属精神分裂症的患病率是一般人群的10倍，约为4％～14％；二级亲属患病危险约高于一般人群3倍；当双亲均罹患精神分裂症时，子女遗传本病的风险接近50％。

寄养子研究可以帮助了解遗传因素和生活环境对精神分裂症的影响。发现由寄养长大成年后发生精神分裂症患者的血缘亲属中该病的发生率比对照组高，而寄养家庭亲属中的发病情况则与对照组相接近。研究结果支持遗传因素在精神分裂症发病中起相当的作用。

双生子研究的假设认为，同卵双生子之间的差异是由环境所决定，而异卵双生子之间的差异是由基因间的差异所决定的。不同的研究均显示同卵双生子的发病率(48％)显著高于异卵双生子(17％)，提示遗传因素在精神分裂症的发生过程中起重要作用。

在过去30年中，精神分裂症研究的主旋律之一是易感基因的寻找。从单位点的单核苷酸多态性(SNP)分析研究到全基因组关联研究(GWAS)，科学家们到目前为止已经找到了1008个易感基因，8788个SNP位点，遍布在除Y染色体外的所有基因组区域。但遗憾的是，没有任何基因或位点足以解释精神分裂症的发病原因。造成这种困境的原因可能有两个：样本的异质性和遗传理论模型的局限性。由于精神分裂症的诊断是基于症状学的量表评估，很难保证研究中样本的一致性。此外，目前大多数的遗传学研究使用的是“常见疾病-常见变异”假说。该假说认为常见疾病是由多个相互作用的常见变异引起的，单个变异只发挥很小的作用。而在这个模型下，像精神分裂症这种异质性很高的多基因疾病，要想得到足够可信的结果，需要对数十万计的患者进行筛查，而这在研究实践中是难以实现的。

除传统意义上的遗传信息外，近年来，科学家们发现了大量隐藏在DNA序列之中或之外更高层次的遗传信息，使多年来分子生物学领域公认的中心法则受到前所未有的挑战。目前认为，这些高层次的基因组信息主要包括非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)、DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学信息。表观遗传学是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的信息变化，这种变化可通过减数分裂或有丝分裂进行遗传，并最终导致了表型的改变。因此，这类变异被称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致遗传物质一致的孪生子出现个体差异的主要原因。

越来越多的证据表明表观遗传机制参与了精神分裂症的发病机制。Petronis等的研究发现双生子中未患病个体的淋巴细胞中多巴胺D2受体(dopamine D2receptors,DAD2R)基因的DNA甲基化程度较高。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase1,DNMT1)基因在精神分裂症患者脑组织γ-氨基丁酸(gamma amino butyric acid,GABA)能中间神经元中过表达，通过表观修饰机制进而下调谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase67,GAD67)和Reelin基因。GAD67是γ-氨基丁酸的合成酶，而Reelin蛋白是神经元迁移、神经信号传导、大脑信息存储和突触可塑性所必需的蛋白，在精神分裂症患者脑组织中，GAD67和Reelin蛋白表达水平异常偏低。

随着这几年RNA干扰(RNA interference,RNAi)和微小RNA(microRNA,miRNA)领域研究的不断深入，已经发现了大量miRNAs与精神分裂症相关联的证据。

与高血压、糖尿病等其它疾病不同，精神疾病的诊断缺乏客观的生理、生化和病理指标。迄今为止，单纯依赖症状学的诊断体系仍然是精神分裂症诊断的金标准，即：医生对病人的诊断和疗效判断主要依靠人为划分的一组症状集合，并基本采用面谈的方式进行相关资料的采集。目前精神分裂症的诊断标准是根据美国的《精神障碍诊断与统计手册第四版》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders IV,DSM-IV)和世界卫生组织编写的《国际疾病分类第10版》(International Classification of Disease10,ICD-10)制订的[34,35]。

DSM-IV对精神分裂症的诊断标准包括：(1)特征性症状：妄想、幻觉、语言紊乱、阴性症状(情感淡漠、语言贫乏或意志、意向减退)，至少两项上述症状在一月内有明显表现；(2)社交或职业功能不良：自起病以来在很长时间内，一个以上重要方面的功能水平较起病前明显较低；(3)病情至少持续6个月，这6个月应包括至少1个月符合(1)标准，即急性期症状，可包括前驱或残留期症状；(4)排除心境障碍及分裂情感性精神障碍：分裂情感性精神障碍及伴有精神病性表现的心境障碍均已排除：A)急性症状期无重性抑郁、躁狂或混合发作同时出现，B)在急性症状期出现情感发作，其持续时期与急性期或残留期相比均明显较短；(5)排除物质或一般躯体情况：此病情并非由于某种物质或一般躯体情况所致的直接生理效应；(6)与普遍性发育障碍的关系，如婴幼儿孤独症或其它普遍性发育障碍的病史，除非出现至少一个月(如经有效成功的治疗，期限可较短)的明显妄想或幻觉，否则不作精神分裂症的附加诊断。

ICD-10对精神分裂症的诊断标准包括：(1)思维鸣响、思维插入、思维被撤走及思维广播；(2)明确涉及躯体或四肢运动，或特殊思维、行动或感觉的被影响、被控制或被动妄想、妄想性知觉；(3)对患者的行为进行跟踪性评论，或彼此对患者加以讨论的幻听，或来源于身体某一部分的其它类型的幻听；(4)与文化不相称且根本不可能的其它类型的持续性妄想，如具有某种宗教或政治身份，或超人的力量和能力；(5)伴转瞬即逝或未充分形成的无明显情感内容的妄想，或伴有持久的超价观念，或连续数周或数月每日均出现的任何感官的幻觉；(6)思潮断裂或无关的插入语，导致言语不连贯，或不中肯或语词新作；(7)紧张性行为，如兴奋、摆姿势，或蜡样屈曲、违拗、缄默及木僵；(8)阴性症状，如显著情感淡漠、言语贫乏、情感迟钝或不协调，常导致社会退缩及社会功能下降，但需澄清这些症状并非由抑郁症或神经阻滞剂治疗所致；(9)个人行为的某些方面发生显著而持久的总体性质的改变，表现为丧失兴趣、缺乏目的、懒散、自我专注及社会退缩。需具备(1)～(4)任何一组或(5)～(9)至少两组症状群中的十分明确的症状，并且持续时间至少在1个月以上。

上述标准的出现为临床医生提供了一个标准化的执行工具，极大地提高了精神分裂症诊断的可靠性。但是，需要指出的是，这些量表的制订依据的是临床医师的观察和患者自身的反馈，具有很强的主观性。而且，现行标准为了提高其统一性、可辨认性和可操作性，对那些有争议的、辨认模糊的临床现象或操作困难的诊断条目都只能舍弃。因此，这种诊断标准只是对部分信息进行了评估，其信度的提高是以牺牲效度为代价的。尽管如此，现行标准诊断的准确性仍然差强人意，不同的精神疾病诊断标准间有重叠区域，也是其倍受诟病的主要原因。面对严重的样本“异质性”问题，现在大多数精神科医生和研究者们都赞同的一个观点是精神分裂症是一组不同发病机制疾病的集合，只不过恰好具有相同的临床表现。就像人体发烧一样，可能是由病毒感染、外伤甚至药物使用引起的，应对方式也应该有所区别。Mesholam GR等对43个报道中的2204名首发精神分裂症患者的10项神经认知功能进行了荟萃分析，发现不同研究组中的患者表现差异很大(平均效应量-0.64～1.20)。同样是神经认知功能的检测，Kuswanto CN等对一组精神分裂症和双向情感障碍患者的研究发现，这两种疾病的患者的神经认知功能缺陷没有显著差异。Cheniaux E等通过让两队精神科医生对100例包含精神分裂症、双向情感障碍和单向情感障碍的住院精神病患者分别使用ICD-10和DSM-IV进行诊断，发现ICD-10更容易将患者诊断为精神分裂症(κ＝0.37)。现行标准的另一个严重问题是无法自证，其执行完全依赖临床医生的素质。Strakowski SM等的研究发现非洲裔美国公民在面谈的情况下会被过度诊断为精神分裂症，而采用录音、转述等方法避免面谈，这种诊断偏见就会消失。

综上所述，现行的精神分裂症诊断指标是一类基于描述和观察的指标，而不是基于实验室的客观检测，在临床实践中产生了大量的问题，还对精神分裂症发病机制的研究造成了很大的阻碍。要改变这种困境，我们需要一套可以量化的客观诊断指标来辅助精神分裂症的临床诊断。

微小RNA(microRNA，miRNA)，是一类由内源基因编码的长度在19-23个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中主要参与了基因表达调控中转录后水平的调节，调控近30％蛋白基因的表达。1993年Lee R等在对秀丽线虫(C.elegans)的lin-14突变体进行遗传分析时，发现一种长约为22个核苷酸的RNA—lin-4RNA，可以控制细胞的发育,参见Lee,R.C.,R.L.Feinbaum,and V.Ambros,The C.elegans heterochronic gene lin-4encodes smallRNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell,1993.75(5):p.843-54，这是人类发现的第一个miRNA分子。但是，在随后的几年中，miRNA并没有引起人们的重视。直到2000年，Reinhart B等在线虫中发现另一种重要的miRNA分子——let-7，参见Reinhart,B.J.,et al.,The21-nucleotide let-7RNA regulates developmental timing inCaenorhabditis elegans.Nature,2000.403(6772):p.901-6，这一类小分子RNA的重要性才得到人们的重视。let-7在线虫发育中是作为一个开关分子，直接调控线虫发育的关键基因lin-14/28/41/42和daf-12的表达，决定了幼虫向成虫的转变。随后几年，大量miRNA分子相继在人、鼠、果蝇、斑马鱼、拟南芥等物种中被发现，人们开始意识到这些广泛存在的miRNA分子在真核基因的表达调控中起着重要的作用。

miRNA的特征之一是其前体常形成分子内茎环结构(sterm-loop)。动物miRNA前体(pre-miRNA)长约60～90个核苷酸，含有大量的U/G配对，前体经过核酸酶Drosha和Dicer的加工形成成熟的miRNA，成熟的miRNA往往进化上保守。几乎所有的miRNA都是来自前体的一条臂，这与siRNA明显不同，后者是来自前体的两条臂。

特征之二是大部分miRNA位于基因间隔区(intergenic region，IGR)，是独立的转录单位。但也有相当一部分miRNA来源于mRNA的内含子，称之为内含子miRNA(intronicmiRNA)，它们与mRNA方向一致，受到同一启动子的调控。

特征之三是miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在。大部分miRNA基因是独立分布和不成簇的，但有一些miRNA基因在基因组是成簇排列的，统计表明，60％的miRNAs单独表达，15％的miRNAs以基因簇的形式表达，而25％的miRNAs位于基因的内含子中，与基因同时被转录。

miRNA-RISC复合物对靶基因的调控机制有两种：对靶基因mRNA的切割降解或翻译抑制。如果mRNA与miRNA完美互补，就介导mRNA切割降解；如果互补性不足，就介导翻译抑制。

Hansen T等发现miR-206中rs17578796位点和miR-198中rs1700位点在丹麦和挪威人群中与精神分裂症相关(P＝0.0021；P＝0.038)，且只有rs17578796位点在丹麦、瑞典和挪威总的人群中具显著性(420/163/257例患者v.s.1006/177/293例对照)，参见Hansen,T.,et al.,Brain expressed microRNAs implicated in schizophrenia etiology.PLoSOne,2007.2(9):p.e873。

Xu Y等首次在中国人群的外周血中发现pre-miR-30e的一个新的突变位点ss17807748与精神分裂症显著相关(等位基因P＝0.00017；基因型P＝0.00015)，OR值为4.952(95％CI:1.887–12.998)，且这一位点与miR-30e的rs755608和mir-24-MAPK14的rs3804452间有较弱的基因联合作用(P＝0.001)，参见Xu,Y.,et al.,MicroRNAs andtarget site screening reveals a pre-microRNA-30e variant associated withschizophrenia.Schizophr Res,2010.119(1-3):p.219-27。Perkins DO等发现mir-30e在精神分裂症患者的前额叶皮质中表达量升高，参见Perkins,D.O.,et al.,microRNAexpression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia andschizoaffective disorder.Genome Biol,2007.8(2):p.R27。二者的研究结果共同提示miR-30e可能与精神分裂症密切相关。Zou M等同样以中国人群为研究对象，在268例患者和232例对照中研究了另外两个报道过的与免疫相关的miRNAs(pre-miR-146ars2910164、miR-499rs3746444)的基因多态性，但未发现有阳性结果，Zou,M.,et al.,Associationbetween two single nucleotide polymorphisms at corresponding microRNA andschizophrenia in a Chinese population.Mol Biol RepIF1.8,2011。最近，GWAS中发现的与精神分裂症相关的miR-137(rs1625579位点G/T多态性)受到较多的关注。在后续的研究中发现它与精神分裂症的许多内表型相关：包括阴性症状和认知缺陷，完成句子任务时的脑激活功能，疾病发病年龄和脑白质结构完整性等，参见，Green,M.J.,etal.,Genome-wide supported variant MIR137and severe negative symptoms predict membershipof an impaired cognitive subtype of schizophrenia.Mol Psychiatry,2012；Lett,T.A.,et al.,The genome-wide supported microRNA-137variant predicts phenotypicheterogeneity within schizophrenia.Mol Psychiatry,2013.18(4):p.443-450；Whalley,H.C.,et al.,Impact of a microRNA MIR137susceptibility variant onbrain function in people at high genetic risk of schizophrenia or bipolardisorder.Neuropsychopharmacology,2012.37(12):p.2720-9。同时发现其靶基因中数个也是精神分裂症既往报道的易感基因，如CACNA1C,TCF4,CSMD1,C10orf26和ZNF804A，参见Kim,A.H.,et al.,Experimental validation of candidate schizophrenia geneZNF804A as target for hsa-miR-137.Schizophr Res,2012.141(1):p.60-4；Kwon,E.,W.Wang,and L.H.Tsai,Validation of schizophrenia-associated genes CSMD1,C10orf26,CACNA1C and TCF4as miR-137targets.Mol Psychiatry,2013.18(1):p.11-2。有研究推测，精神分裂症的易感基因可能是由于其3’UTR多态性不同而“调节”与其结合的miRNAs来影响疾病的发生。

但目前为止，在精神疾病特别是精神分裂症中，尚未针对这些循环系统中的miRNA进行系统的研究。

本发明人发现miR-130b和miR-193a-3p在精神分裂症血浆中显著上升，并确认了miR-130b和miR-193a-3p的表达具有精神分裂症疾病状态的特异性，并且，在治疗达缓解的患者血浆中，miR-130b和miR-193a-3p的表达明显回落，但在治疗未缓解的患者血浆中则没有明显改变。

发明内容

为了证明精神分裂症血浆中miRNA的表达模式是否出现异常。本发明人在初筛阶段，通过Solexa sequencing和TLDA芯片对精神分裂症和健康对照的血浆miRNA表达谱进行筛查，找到了8个候选miRNA分子。验证阶段，在测试组中对164名精神分裂症患者和187名健康对照进行qRT-PCR验证，发现miR-130b和miR-193a-3p在精神分裂症血浆中显著上升。独立样本验证阶段，针对这两个miRNA，我们在验证组中对400名精神分裂症患者和231名对照通过qRT-PCR进行独立样本验证，并取得一致结果。为证实miR-130b与miR-193a-3p的上调是否具有精神分裂症的疾病类型特异性，我们对162名其它精神疾病的患者进行了相应检测，并未发现miR-130b和miR-193a-3p的表达异常。为确认miR-130b和miR-193a-3p的表达具有精神分裂症疾病状态的特异性，我们对验证组中的400名精神分裂症患者进行了为期一年的治疗随访，在107名完成随访的患者中，79名治疗达缓解，28名治疗未缓解。在治疗达缓解的患者血浆中，miR-130b和miR-193a-3p的表达明显回落，但在治疗未缓解的患者血浆中则没有明显改变。

一方面，本发明提供了miRNA分子作为分子标记物在制备用于诊断或预后精神分裂症患者的试剂中的用途，其中所述miRNA分子选自miR-130b或miR-193a-3p。

特别地，根据本发明所述的用途，其中所述试剂用于检测血浆中miR-130b或miR-193a-3p含量的方法中。

更特别地，根据本发明所述的用途，其中检测血浆中miR-130b或miR-193a-3p含量的方法选自southern印迹、northern印迹、聚合酶链式反应、逆转录酶PCR、定量实时PCR、纳米阵列、宏阵列、放射自显影、Solexa测序、TLDA芯片检测或原位杂交。

另一方面，本发明提供了一种或多种特异地检测血浆中miR-130b或miR-193a-3p含量的引物和/或探针在制备用于诊断或预后精神分裂症患者的试剂中的用途。

优选地，根据本发明所述的用途，其中所述引物和/或探针包含与miR-130b或miR-193a-3p互补的核苷酸序列，或由与miR-130b或miR-193a-3p互补的核苷酸序列组成。

另一方面，本发明提供了一种用于诊断或预后精神分裂症患者的试剂盒，其包括一种或多种特异地检测血浆中miR-130b或miR-193a-3p含量的引物和/或探针。

优选地，根据本发明所述的试剂盒，其中所述引物和/或探针包含与miR-130b或miR-193a-3p互补的核苷酸序列，或由与miR-130b或miR-193a-3p互补的核苷酸序列组成。

附图说明

图1A至图1C：标准miRNA的标准曲线。

图2：RNA提取的线性回归分析。

图3A-3D：ROC曲线分析；图3A，测试组miRNA-130b的ROC曲线；图3B,测试组miRNA-193a-3p的ROC曲线；图3C，验证组miRNA-130b的ROC曲线；图3D,验证组miRNA-193a-3p的ROC曲线。

具体实施方式

1、临床资料收集及评定

本研究纳入的研究对象分为两个部分：来自山西医科大学第一医院精神卫生科2000年3月～2008年8月期间的住院患者；“十一五”精神分裂症早期诊断和规范化治疗课题(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT01057849)患者，收集于2006年3月～2009年12月，来自中国五所精神卫生中心，分别是北京大学第六医院，北京回龙观医院，上海市精神卫生中心，四川大学附属华西医院心理卫生中心，中南大学湘雅二院精神卫生研究所。

偏执型精神分裂症患者的纳入标准：

(1)由本人或监护人签署知情同意书；

(2)汉族；

(3)经过诊断工具DSM-Ⅳ-TR轴I障碍临床定式检查(病人版)(Structuredclinical interview for DSM-Ⅳ-TR Axis I disorders(patients edition)，SCID-I/P)[207]评估，据DSM-IV诊断标准确诊精神分裂症，同时不符合DSM-IV轴I其它精神障碍的诊断标准；

(4)16岁≤年龄≤45岁；

(5)首次发作，病程不超过3年；

(6)未经系统抗精神病药物治疗，连续规律用药不超过1个月或连续不规律用药不超过3个月；

(7)受教育程度大于等于3年；

偏执型精神分裂症患者的排除标准：

(1)脑器质性疾病或其它有临床意义的并发躯体疾病；

(2)头部外伤史，意识丧失超过30分钟；

(3)酒或其它物质依赖或滥用；

(4)本研究中涉及到的抗精神病药物的禁忌症；

(5)30天内参加过其它药物临床试验；

(6)有明显智力低下；

(7)癫痫发作史；

(8)有基线/筛选实验室检查结果异常(除肝肾功能外，实验室检查结果＞正常值1.5倍)

(9)妊娠期、哺乳期女性；

(10)合并使用除利培酮外的其它抗精神病药物、抗癫痫药、抗抑郁药、情感稳定剂及其它具有中枢神经系统作用的药物。

经上述纳入和排除标准的筛检，共有564例患者入组，具体人口学统计信息见结果部分。

对照组纳入标准：

对照组采集来自健康献血者，性别不限；

(1)汉族；

(2)16岁≤年龄≤45岁；

(3)受教育程度大于等于3年。

对照组排除标准：

(1)符合患者组其余纳入或排除标准的；

(2)有精神或神经系统疾病家族史的；

(3)受过严重头部外伤或有过产伤的；

(4)童年或婴幼儿期出现过高热惊厥的；

(5)儿时被收养或生活于单亲家庭中。

经上述纳入和排除标准的筛检，共有400例健康对照入组，具体人口学统计信息见结果部分。

其它精神疾病组：

(1)由本人或监护人签署知情同意书；

(2)汉族；

(3)被诊断为除精神分裂症外的所有精神神经疾病；

(4)16岁≤年龄≤45岁；

(5)受教育程度大于等于3年。

经上述纳入和排除标准的筛检，共有162例患者入组，具体人口学统计信息见结果部分。

2、临床症状的评估

采用SCID-I/P(11/2002revision)[207](DSM-IV轴I精神障碍定式临床检查表病人版)进行诊断筛查，所有研究者经过理论培训-现场示教-角色扮演练习-督导以确保诊断准确性，培训后3位研究者间经一致性评估检验，kappa值≥0.7。

3、临床治疗方案

用药方案

对患者组单一运用首发精神分裂症一线非典型抗精神病药利培酮片(1mg/片)和阿立哌唑片(5mg/片)进行治疗。利培酮初始剂量为1mg/日，约2～3周内逐渐增至治疗量(约2～6mg/日)；阿立哌唑初始剂量为5mg/日，约2-3周内逐渐增至治疗量(约25～35mg/日)。可酌情短期合并小剂量苯二氮卓类药，但不合并使用其它抗精神病药。

随访方案

对患者定期进行跟踪随访一年。从入组日期(基线期)开始，在用药的第1、2、3、6、9和12个月末进行临床量表等评定。同时在基线期和一年随访结束期留取患者血标本。

缓解评价标准

治疗达缓解的定义选用精神分裂症工作组织2005年提出的“863”缓解标准[211]，即按照PANSS中8个核心症状≤3分，持续时间≥6个月的标准。8个核心症状：P1-妄想，P2-联想散漫，P3-幻觉行为，G9-不寻常思维内容，G5-装相和作态，N1-情感迟钝，N4-被动/淡漠社交退缩，N6-交谈缺乏自发性和流畅性。严重程度：1.无2.很轻3.轻度4.中度5.偏重6.重度7.极重度。

4、血浆miRNA表达谱分析

所有受试者均取10mL晨空腹血，EDTA抗凝管收集，800g离心10min。将上层血浆分装到1.5mL EP管中，12000g离心5min去除细胞碎片，将上层血浆分装到0.6mL EP管中，-80℃保存。

根据本领域公知常识提取总RNA，富集血浆RNA，进行Solexa测序。Solexa是基于单分子阵列测试技术(genotyping)的一种测序方法。此种测序法首先是将DNA打断到约100～200bp大小，再将接头连接到片段上，经PCR扩增后制成Library。随后在含有接头的芯片(flow cell)上将已加入接头的DNA片段绑定在芯片上，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序(Sequencing by Synthesis)的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链DNA分子通过碱基互补配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被CCD采集，CCD快速扫描整个阵列检测特定结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。

随后进行Taqman Low Density Array(TLDA)分析。TLDA是基于Taqman-probereal-time quantitative PCR技术的一种检测手段。实时荧光定量PCR(real-timequantitative PCR，qRT-PCR)技术。

结果

各取测试组(Test cohort)中的150例患者和对照的血浆总RNA分别混合建库，进行miRNA表达谱的检测。为了排除假阳性的干扰，采取了使用Solexa sequencing和TLDA芯片两种不同原理的检测手段，对血浆的全miRNA表达谱进行检测。

1、Solexa测序

通过质检，得知血浆总RNA中miRNA占主要部分，符合之前的预测。将测序结果与miRNA database(v16.0)进行比对后，健康对照的血浆中共检出了255个miRNA，在精神分裂症血浆中检出了215个miRNA。

2、TLDA芯片检测结果

TLDA芯片在健康对照血浆中检出了247个miRNA，在精神分裂症血浆中检出了235个miRNA。共有57个miRNA的Ct值低于30，并且表达改变大于10倍。

5、候选miRNA的选择

通过对Solexa sequencing和TLDA芯片数据的分析，我们共找到了8个候选miRNA分子：miR-122、miR-130a、miR-130b、miR-193a-3p、miR-193b、miR-502-3p、miR-652、miR-886-5p。我们将对这8个miRNA进行qRT-PCR的验证。

6、候选miRNA的验证

(1)qRT-PCR定量方法的确立

由于U6RNA在血浆中极易降解，因此不能采用传统的△Ct法来对血浆中miRNA的进行定量。在此，我们采用了绝对定量法对qRT-PCR结果进行定量。在第一阶段，采用人工合成的hsa-miR-16标准品，按10fmol/L-107foml/L的浓度梯度加到每块96孔板中，以其浓度的Lg值为横轴，Ct值为纵轴作出标准曲线(图1A)，测试组所有样品所有候选miRNA的Ct值根据该标准曲线换算成表达量(fmol/L)。

在第二阶段，对筛选出来的miR-130b和miR-193a-3p，我们同样合成相应的标准品RNA，按上述方法作出标准曲线(图1B和1C)。再据此重新检测测试组中miR-130b和miR-193a-3p的表达水平。后续阶段对miR-130b和miR-193a-3p的检测均使用各自的标准曲线进行定量。

(2)实验的可重复性

由于没有可靠的内参进行相对定量分析，这对血浆miRNA检测的可重复提出了很大的挑战。为了确保实验的可信度，我们进行了以下验证：将10个健康人的血浆(100μL/人)混合后分成两等分，分别提取RNA，对包含8个候选miRNA在内的共18个miRNA进行检测。根据两次检测的结果做线性回归分析，结果显示miRNA的检测在不同批次的处理中是高度可重复的(图2)。

(3)候选miRNA的验证

对上述8个候选miRNA，我们对测试组(Test cohort)中164名精神分裂症患者和187名健康对照进行单个样本的qRT-PCR验证。结果显示，miR-130b和miR-193a-3p在精神分裂症患者血浆中表达显著上升，miR-130b的表达升高了33倍(P<0.0001)，而miR-193a-3p的表达升高了95.7倍(P<0.0001)(表1)。

(4)在独立样本群中的再验证

为了进一步验证上述结果，我们需要在一个独立样本群中进行再验证。验证组(Validation cohort)包含400名首发精神分裂症患者和231名健康对照，为排除地域影响，这些样本收集自北京、上海、四川和湖南的6家精神卫生中心。qRT-PCR结果显示，在验证组精神分裂症患者血浆中，miR-130b的表达上升了62.3倍(P<0.0001)，miR-193a-3p的表达上升了17倍(P<0.0001)(表1)。

(5)在其它精神疾病中的验证

为了确定miR-130b和miR-193a-3p的表达改变具有精神分裂症特异，我们在162例其它精神疾病患者血浆中检测了这两个miRNA的含量，但并没有观察到显著的表达变化(表1)。这表明血浆miR-130b和miR-193a-3p的改变很可能是精神分裂症特异的。

表1：各组样本血浆中miR-130b和miR-193a-3p的表达水平(fmol/L)

(6)在治疗后精神分裂症患者中的验证

我们对验证组中的400例精神分裂症患者进行了为期1年的治疗随访，总共有107人完成。在这107人中，共有79人满足治疗达缓解标准，28人未达标准。对这107的血浆miRNA检测后发现，miR-130b和miR-93a-3p在治疗达缓解的患者中表达明显下降，但在未达缓解的患者中则没有显著变化(表2)。以上结果证明血浆miR-130b和miR-193a-3p的表达变化具有精神分裂症疾病状态特异。

表2：治疗1年后miR-130b和miR-193a-3p的表达水平(fmol/L)

7、miR-130b和miR-193a-3p的诊断效力评估

为评估miR-130b和miR-193a-3p的诊断效力，我们对测试组和验证组样本进行了ROC曲线分析。在测试组中，miR-130b的曲线下面积(AUC)为0.978(95％CI0.966-0.990)，miR-193a-3p的AUC为0.994(95％CI0.989-0.998)。在验证组中，二者的AUC均为1.000(95％CI:0.999-1.000)。以各组中健康对照表达量的97.5％百分位数为截取值(cutoff value)进行效力评估。在测试组中，miR-130b的敏感度为68.9％，特异性为98.4％；miR-193a-3p的敏感度为93.9％，特异性为97.9％。在验证组中，miR-130b的敏感度为100％，特异性为96.2％；miR-193a-3p的敏感度为99.2％，特异性为96.7％(图3A-3D)。miR-130b的诊断准确率达到94％，miR-193a的诊断准确率则是97.6％。

综上所述，血浆中的miR-130b和miR-193a-3p的表达水平能够特异反应精神分裂症疾病状态，可以作为精神分裂症诊断用的分子标志物。

Claims (5)

1.miRNA分子作为分子标记物在制备用于诊断或预后精神分裂症患者的试剂中的用途，其中所述miRNA分子选自miR-130b或miR-193a-3p，其中所述试剂用于检测血浆中miR-130b或miR-193a-3p含量的方法中，其中miR-130b或miR-193a-3p表达水平在精神分裂症患者的血浆中显著上升，并且所述miR-130b或miR-193a-3p表达水平在治疗缓解的患者血浆中明显回落。

2.根据权利要求1所述的用途，其中检测血浆中miR-130b或miR-193a-3p含量的方法选自southern印迹、northern印迹、聚合酶链式反应、纳米阵列、宏阵列、放射自显影、Solexa测序、TLDA芯片检测或原位杂交。

3.根据权利要求1所述的用途，其中检测血浆中miR-130b或miR-193a-3p含量的方法选自逆转录酶PCR或定量实时PCR。

4.一种或多种特异地检测血浆中miR-130b或miR-193a-3p含量的引物和/或探针在制备用于诊断或预后精神分裂症患者的试剂中的用途，其中miR-130b或miR-193a-3p表达水平在精神分裂症患者中显著上升，并且所述miR-130b或miR-193a-3p表达水平在治疗缓解的患者中明显回落。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述引物和/或探针包含与miR-130b或miR-193a-3p互补的核苷酸序列，或由与miR-130b或miR-193a-3p互补的核苷酸序列组成。