CN112175062B - Sft2b蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途 - Google Patents

Sft2b蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及SFT2B蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途。具体地，本发明涉及一种与抗人SFT2B抗体特异性结合的分离的多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。另一方面，本发明涉及本发明的抗人SFT2B抗体特异性结合的分离的多肽在制备用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒中的用途。

Description

SFT2B蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途
技术领域
本发明涉及精神分裂症诊断的技术领域。具体地，本发明涉及新的SFT2B蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途。
背景技术
世界卫生组织的数据显示，精神分裂症的全球人口疾病负担约为0.7％，是当前10大致残疾病之一。临床表现上，精神分裂症的表型异质性很强，包含了一系列的阳性症状、阴性症状和认知障碍。病因学上，精神分裂症的发病机制至今不明。但是，多年来的遗传学研究显示，精神分裂症的遗传度高达81％，具有较强的遗传学基础。
随着近十年全基因组学技术的发展，全基因组关联研究(Genome-wideAssociation Study，GWAS)为多基因复杂疾病遗传学基础的揭示提供了强有力平台。在精神分裂症中，国际精神疾病基因组研究联合体通过联合全球范围内的研究力量，进行了总计超过15万人次的GWA队列研究，并锁定了108个精神分裂症的GWA高风险位点1。其中与疾病关联最为显著的位点集中在了6号染色体的人主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex,MHC)区域(p＝3.48×10-31)，而功能富集分析显示这些风险位点所指示的风险基因均在大脑或B淋巴细胞中高表达，提示免疫系统功能的异常与精神分裂症发病间的密切联系。
另一方面，现有的流行病学研究成果显示，在胚胎大脑发育时期的感染事件与个体出生后全生命周期精神分裂症的患病风险有极大关系。尽管不同的研究结果存在出入，但是研究者已经在精神分裂症患者血浆中发现多种病毒的抗体。最新的研究也发现，约20％首次发作的精神分裂症患者血清中存在神经元表面分子的自身免疫抗体。类似的研究也在精神分裂症患者的血浆和脑脊液中观察到了免疫球蛋白水平的异常。
结合遗传学和免疫学上的研究成果，我们推测，精神分裂症中的遗传改变极有可能影响其所在基因的表达状态。若该基因与免疫系统功能相关或者在免疫细胞中高表达，这种改变极有可能影响针对该基因的自身免疫反应。然而，在现有技术中这并未得到证实。
目前，仍然需要为精神分裂症提供可靠临床诊断的生物学指标，同时，也迫切需要寻找治疗此类疾病的靶点。
本团队在前期工作中，对Schizophrenia Working Group of the PsychiatricGenomics,C.Biological insights from 108schizophrenia-associated geneticloci.Nature 511,421-427,doi:10.1038/nature13595(2014)中报道的108个精神风险位点涵盖的三百多个编码基因进行了评估，并对具有细胞膜定位的编码基因进行血浆天然抗体检测。基于在线预测数据库IEDB(http://www.iedb.org/)筛选可能的HLAII抗原序列，采用酶联免疫检测方式对受试者血浆中的靶天然抗体水平。研究鉴定到SFT2B蛋白的天然抗体在精神分裂症患者血浆中显著性改变，具有用于辅助该疾病的临床诊断。
发明内容
为了寻找为精神分裂症提供可靠临床诊断的生物学指标，以及寻找治疗此类疾病的靶点，本发明人对精神分裂症患者血浆中的自身免疫抗体水平进行了研究。
本发明成功地鉴定了两种SFT2B蛋白的HLA-II特异性表位，其氨基酸序列分别如KLKKVLSGQDTEDRSGLSEVVEASCH(SEQ ID NO：1)和DQSLALTWYSLSFIPFARDAVKKCH(SEQ ID NO：2)所示。
进一步地，本发明人意想不到地发现，在患有精神分裂症的患者血浆中，针对上述SFT2B蛋白的HLA-II特异性表位的自体抗体含量显著高于正常对照。
因而，第一方面，本发明提供了一种与抗人SFT2B抗体特异性结合的分离的多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
根据本发明所述的与抗人SFT2B抗体特异性结合的分离的多肽，所述多肽由SEQID NO：1所示的氨基酸序列组成或所述多肽由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。
第二方面，本发明提供了与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽在制备用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒中的用途；优选地，所述与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
进一步地，本发明提供了SEQ ID NO：1所示的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽和/或SEQ ID NO：2所示的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽在制备用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒中的用途。
优选地，根据本发明的用途，其中所述与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽用于基于ELISA的方法中，用于检测患者血浆中的抗人SFT2B抗体的量。
第三方面，本发明提供了一种用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒，其中所述试剂盒包含与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽；优选地，所述与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒，其中所述试剂盒包含SEQ ID NO：1所示的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽和/或SEQ ID NO：2所示的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽。
进一步优选地，根据本发明所述的用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒，其中所述试剂盒是用于基于ELISA检测的试剂盒。
第四方面，本发明提供了用于检测受试者血浆中抗人SFT2B抗体的量的ELISA方法，所述方法包括：
1)用根据本发明的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽包被96孔板；
2)向上述包被的96孔板中加入待测受试者血浆，以及
3)检测受试者血浆中人SFT2B抗体的量。
附图说明
图1显示SDT2B-1的ROC曲线分析结果；
图2显示SDT2B-2的ROC曲线分析结果。
具体实施方式
基于之前的研究成果，本发明人在SFT2B蛋白上选取了两段B细胞识别的特异性表位SFT2B-1和SFT2B-2，并研发了一套基于酶联免疫吸附测定(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)原理的外周血浆自身免疫抗体检测方式，在精神分裂症患者队列中检测外周血浆相应自身免疫抗体的水平。
实施例1.SFT2B蛋白表面自身抗原表位的设计以及表位多肽的制备
利用人类疾病现行抗原表位在线预测平台Immune Epitope Database(http://www.iedb.org/)预测SFT2B蛋白的HLA-II特异性表位。本研究共设计了两条SFT2B蛋白的线性抗原表位，其氨基酸序列从N端至C端分别是：SFT2B-1:KLKKVLSGQDTEDRSGLSEVVEASCH(SEQ ID NO：1)和SFT2B-2:DQSLALTWYSLSFIPFARDAVKKCH(SEQ ID NO：2)
采用固相化学合成法生产SFT2B-1和SFT2B-2线性多肽，纯度要求达到95％以上(委托上海生工公司合成)。合成的多肽分别用67％的冰醋酸溶解成5mg/mL的储存液。使用前用包被液稀释至工作浓度(250倍，20μg/mL)。
实施例2.基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的血浆抗体的检测
受试者外周血浆中的SFT2B自身免疫抗体水平采用本实验室自行开发的一套基于酶联免疫法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测方法进行。具体检测流程如下：
材料与试剂
(1)1M磷酸缓冲液(p3619,Sigma-Aldrich)pH7.4。
(2)盐酸光氨酸(C1276-10G,Sigma-Aldrich)。
(3)Maleimide活化的96孔分析板(15150,Thermo Scientific)。
(4)封板膜(PlateMax AxySeal,Corning Axygen)。
(5)过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，2～8℃保存12个月。
(6)阳性标准品(10μL/管)：20mg/mL,-20℃保存1-2年。
(7)Tween 20(P1379,Sigma-Aldrich),室温保存。
(8)牛清白蛋白(V900933，Sigma-Aldrich),可在2～8℃保存12个月。
(9)磷酸盐缓冲液片(P4417,Sigma-Aldrich):2～8℃长期保存
(10)显色剂1000ml(SB02,Life Technologies)内含四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢，且呈无色状态，可在2～8℃保存6个月。
(11)终止液1000ml(SS04,Life Technologies)，可在2～8℃保存6个月；也可用12％硫酸替代。
(12)
Figure BDA0002120690360000052
低蛋白吸附管(0030 108.116,Eppendorff)，用于稀释血浆和阳性标准品。
试剂配制
(1)包被液配制(100mL:0.1M磷酸盐缓冲液，内含0.15M氯化钠和10mM EDTA):10mL1M磷酸缓冲液+0.85g氯化钠+292mg EDTA (ED-100G,Sigma-Aldrich)+90mL去离子水。
(2)洗液配制(200mL:0.1M磷酸盐缓冲液，内含0.15M氯化钠和0.05％Tween 20):20mL 1M磷酸缓冲液+1.7g氯化钠+100μL Tween 20(P1379,Sigma-Aldrich)+180mL去离子水。
(3)磷酸盐缓冲液:每片磷酸盐缓冲液片剂加200mL去离子水，充分溶解后用于配制分析液和洗液。
(4)分析液:磷酸盐缓冲液含0.5％牛清白蛋白(0.5％BSA)，BSA充分溶解后可在4℃保存2-3天。
待测样品准备
(1)96孔板的待测样品排列方式
Figure BDA0002120690360000051
Figure BDA0002120690360000061
(2)待测样品的准备
阴性对照(NC):每孔加入50μL的分析液，双复孔NC的OD平均值用于计算阳性样品比值(PSR)。
样品组(S1-S21):用分析液稀释血浆100倍后,每孔加入50μL。
质控样品(QC):取20-30份人血浆1-2mL混合，用0.5mL管分装成30-50μL,放置-20℃。
阳性标准品(PC):使用抗人SFT2B抗体(Sigma,SAB1305111)。母液配置浓度为1.5mL
Figure BDA0002120690360000062
低蛋白吸附管分装(10μL/管)，放置-20℃保存12个月，使用前用990μL分析液稀释,室温或4℃下放置不超过30分钟,用后弃掉，避免二次冻融。
实验流程
(1)抗原包被(第一天)
i)包被抗原前用200μL洗液洗板3次。
ii)用包被液将抗原稀释至20μg/mL，每孔加入100μL。
iii)经4℃过夜孵育后，用200μL洗液洗板3次。
iv)用包被液制备10μg/mL盐酸光氨酸溶液，每孔加入200μL后室温孵育1小时。
v)用200μL洗液洗板2次，然后放置40℃烤箱内干燥2-3小时。
vi)用封板膜将干燥后的抗原包被板密封，放置2-8℃冰箱中保存6个月。
(2)样品检测(第二天)
i)微量反应板在使用之前从4℃拿到室温(18～25℃)稳定约30分钟后,去除抗原包被的96孔盘箔纸，用200μL洗液洗盘两次。
ii)用分析液和
Figure BDA0002120690360000071
低蛋白吸附管将待测血浆样品稀释100倍，充分混合后,每孔加入50μL，并在室温下孵育1.5小时。
iii)弃空孔中液体，用200μL洗液洗盘三次。每次洗涤保证洗涤缓冲液在每孔内停留1分钟，然后弃空孔中液体之后将开口的板面倒扣在吸水纸上轻拍以去处残余的洗涤缓冲液，以便彻底地从微量反应板中去除所有的液体。
iv)用分析液将过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体稀释50,000倍，每孔加入50μL，在室温下孵育1小时。
v)弃去孔中液体，用200μL洗液洗盘三次后，每孔加入50μL显色剂(在使用前两小时取所需量显色剂放置室温下回温)。
vi)在室温下避光孵育显色20分钟后，每孔加入25μL终止液。
vii)加完终止液后15分钟之内,用自动酶标仪以450nm标准波长和620nm参考波长测定96孔盘的吸光值(OD)。
数据计算
所有待测样品均二复孔检测，以阳性样品比值(PSR)表示检测结果。
PSR计算方法如下:PSR＝(OD-样品-OD-NC)/(OD-PC-OD-NC)。
统计方法
本研究所有统计运算均在SPSS(Version 20.0,IBM Corp.,Armonk,NY,USA)软件或GraphPad Prism(Version 6.01，GraphPad Software，San Diego,CA，USA)软件上进行。
i)数据分布检验：采用Shapiro-Wilk检验各组样本检测数据的正态分布情况。
ii)均值比较：采用非参数Mann-Whitney检验各组样本检测数据的均值差异。
iii)诊断效力检验：采用受试者工作特征曲线(Receiver OperatingCharacteristic，ROC)评价线性表位对精神分裂症的辨别能力。以特异性(Specificity)≥95％时的PSR值作为截断值(Cutoff)来计算各个线性多肽表位的阳性预测值(PositivePredictive Value，PPV)＝真阳性/(真阳性+假阳性)和阴性预测值(Negative PredictiveValue，NPV)＝真阴性/(真阴性+假阴性)。
iv)一致性检验：采用变异系数(Coefficient of Variation，CV)来评价不同批次检测的一致性，要求批间CV＜20％。
实施例3.受试者募集
研究共纳入202名首次发作的精神分裂症患者和185名正常对照，所有受试者本人或监护人均签署了知情同意书。精神分裂症患者募集于延边脑科医院精神科，由两名副主任及以上精神科医生根据《国际疾病分类第十版》(International Classification ofDisease 10，ICD-10)分别独立确诊为偏执型精神分裂症(F20.9)。正常对照募集于吉林省第一医院体检中心，经自评和面谈无精神疾病倾向，同时受试个体及其直系亲属无精神病史及其他脑病史。
(1)精神分裂症患者排除标准
i)脑器质性疾病或其它有临床意义的并发躯体疾病所致精神障碍；
ii)罹患严重的躯体疾病或神经系统疾病；
iii)酒或其他物质依赖或滥用；
iv)头部外伤史，意识丧失超过30分钟；
v)有明显智力低下；
vi)体格检查或实验室检查发现有异常生化指标或脑电图、心电图异常者；
vii)严重的兴奋、冲动不合作的患者；
viii)有严重自杀自伤倾向的患者；
vx)妊娠或哺乳期妇女；
x)一个月内参加过其它科研治疗的患者。
(2)对照组纳入标准：
i)健康对照者的全血采集来自健康献血者，其年龄、性别、籍贯和受教育程度与患者组匹配；
ii)所有健康对照者均经家族史调查、流行病学问卷、自评抑郁量表、简明健康状况调查表、艾森克人格问卷等评定，选取正常值范围内个体；
iii)采血前1周内未吸烟、饮酒、熬夜、摄入刺激性食物等。
(3)对照组排除标准：
i)符合“入组病人”纳入或排除标准的；
ii)有明确精神或神经系统疾病家族史的；
iii)受过严重头部外伤或有过产伤的；
iv)童年或婴幼儿期出现过高热惊厥的；
v)18岁前被收养或生活于单亲家庭中的。
(4)基本人口学数据
Figure BDA0002120690360000091
实施例5.血浆样本的获得
所有受试者均采集5mL晨空腹静脉外周血，于上午10点前完成采集。所有采集的外周血采用EDTA抗凝真空采血管收集，离体后立即进入4℃暂存，当天完成处理。外周血浆处理流程为：
i)800g，4℃，离心10min，分离血浆和血细胞。
ii)将上层血浆转移至新离心管中，12000g，4℃，离心10min，分离血浆中的细胞碎片。
iii)将血浆按300μL/管进行分装，于-80℃中进行保存。
结果：
表1、SDT2B-1和SFT2B-2线性多肽表位在外周血浆自身免疫抗体Elisa检测中的数据分布
Figure BDA0002120690360000092
经Shapiro-Wilk检验，SDT2B-1和SFT2B-2在正常对照和精神分裂症受试者中的检测数据均是偏态分布，后续分析需采用非参数检验。
表2、SDT2B-1和SFT2B-2线性多肽表位在外周血浆自身免疫抗体Elisa检测中的均值比较
Figure BDA0002120690360000101
结果显示，与正常对照相比，SDT2B-1和SFT2B-2线性多肽表位的自身免疫抗体在精神分裂症外周血浆中均显著升高，表明这两个位点具有作为精神分裂症诊断靶点的潜力。
SDT2B-1和SFT2B-2线性多肽表位在外周血浆自身免疫抗体Elisa检测中的诊断效力检验
ROC曲线分析结果见图1和图2，以及下表3。
表3
ROC曲线下面积 SFT2B-1 SFT2B-2
面积 0.8415 0.8018
标准误 0.01999 0.0222
95％置信区间 0.8023-0.8807 0.7583-0.8453
P值 <0.0001 <0.0001
截断PSR(95％特异性) 0.9379 1.007
敏感度 26.73％ 25.74％
PPV 0.86 0.85
NPV 0.61 0.54
ROC曲线分析结果显示，SFT2B-1和SFT2B-2两条线性多肽表位都呈现了对精神分裂症良好的鉴别潜力。SFT2B-1的曲线下面积为0.8415(95％CI：0.8023-0.8807)，SFT2B-2的为0.8018(95CI：0.7583-0.8453)。我们以保证95％特异性的情况下考量它们的鉴别能力：SFT2B-1的敏感度为26.73％，PPV为0.86，NPV为0.61；SFT2B-2的敏感度为25.74％，PPV为0.85，NPV为0.54。
表4、检测的可重复性验证
PSR均值 标准偏差SD 变异系数CV(％)
SFT2B-1 0.89 0.08 9.28％
SFT2B-2 0.90 0.05 5.14％
本研究所使用的检测手段为基于ELISA原理的抗原-抗体免疫反应检测，技术流程为本研究团队原创研发。为保证其可应用性，团队在实验过程中对检测平台的可重复性进行了验证。实验检测中每一块96孔板都加入了同一个质控样本QC，通过计算所有板间的QC的变异系数CV，即可得知实验检测的重复性。每条线性多肽表位各进行了11块96孔板的实验检测，结果显示，SFT2B-1的批件变异系数为9.28％，而SFT2B-2的为5.14％。远低于一般检测试剂盒要求的CV不高于20％。表明该检测技术可重复性高，可用于相应检测试剂盒的研发。
上述结果显示，两条线性多肽表位在精神分裂症患者血浆中的自身免疫抗体均显著升高：相比正常对照，SFT2B-1的自身免疫抗体水平升高了1.51倍(p＝1.22×10-31)，SFT2B-2的水平升高了1.43倍(p＝3.00×10-25)。在受试者工作特征曲线(ReceiverOperating Characteristic，ROC)分析中，二者均显示了对精神分裂症较强的鉴别能力：i)曲线下面积(Area Under Curve，AUC)SFT2B-1为0.8415，SFT2B-2为0.8018；ii)在保证95％特异性(Specificity)前提下，SFT2B-1的敏感度(Sensitivity)为26.73％，SFT2B-2为25.74％；iii)阳性预测值(Positive Predictive Value，PPV)SFT2B-1为0.86，SFT2B-2为0.85；iv)阴性预测值(Negative Predictive Value，NPV)SFT2B-1为0.61，SFT2B-2为0.54。利用变异系数(Coefficient of Variation，CV)对实验检测方法的可重复性进行了评价：在总计11批次的检测中，SFT2B-1的CV值为9.28％，SFT2B-2的CV值为5.14％，远低于检测试剂盒不高于20％的批间CV要求。综上，本研究所鉴定的两条线性多肽表位及所建立的实验检测方法可有效检测精神分裂症患者外周血浆中的自身免疫抗体，可用于该疾病临床检测试剂盒的研发。
序列表
<110> 中国医学科学院基础医学研究所
<120> SFT2B蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途
<130> 390068CG
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> BINDING
<222> (1)..(26)
<223> SFT2B蛋白表位-1
<400> 1
Lys Leu Lys Lys Val Leu Ser Gly Gln Asp Thr Glu Asp Arg Ser Gly
1 5 10 15
Leu Ser Glu Val Val Glu Ala Ser Cys His
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> BINDING
<222> (1)..(25)
<223> SFT2B蛋白表位-2
<400> 2
Asp Gln Ser Leu Ala Leu Thr Trp Tyr Ser Leu Ser Phe Ile Pro Phe
1 5 10 15
Ala Arg Asp Ala Val Lys Lys Cys His
20 25

Claims (5)

1.一种与抗人SFT2B抗体特异性结合的分离的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，或者所述多肽由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。
2.SEQ ID NO：1所示的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽和/或SEQ ID NO：2所示的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽在制备用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述试剂盒是用于基于ELISA检测的试剂盒。
4.一种用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒，其中所述试剂盒包含SEQ ID NO：1所示的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽和/或SEQ ID NO：2所示的与抗人SFT2B抗体特异性结合的多肽。
5.根据权利要求4所述的用于诊断患有精神分裂症的患者的试剂盒，其中所述试剂盒是用于基于ELISA检测的试剂盒。
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