KR102120794B1

KR102120794B1 - 파킨슨병 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 파킨슨병 진단 방법

Info

Publication number: KR102120794B1
Application number: KR1020200011455A
Authority: KR
Inventors: 박치후; 박일홍; 소병택
Original assignee: 옙바이오 주식회사
Priority date: 2020-01-31
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2020-06-09
Also published as: CN115398239A; WO2021154002A1

Abstract

본 발명은 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 ATG4B 단백질을 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물, 파킨슨병 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 파킨슨병 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 파킨슨병 환자군에서 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질의 자가항체 수준이 높게 나타남을 확인하여 이에 대한 파킨슨병 진단용 바이오마커를 제공함으로써, 향후 파킨슨병으로 발병할 가능성이 높은 고위험군 및 발병 환자를 미리 선별하여, 파킨슨병을 조기에 진단하고 치료할 기반을 제공하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 파킨슨병 진단을 위한 정보제공 방법은 ATG4B 단백질의 자가항체를 검출함으로써 파킨슨병을 보다 정확하고 조기에 진단할 수 있다.

Description

파킨슨병 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 파킨슨병 진단 방법 {Biomarkers for diagnosis of Parkinson's Disease, and method for diagnosis of Parkinson's disease}

본 발명은 파킨슨병 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 파킨슨병 진단 방법에 관한 것이다.

파킨슨병은 진전(떨림), 경직, 서동증(행동이 느려짐), 불안정한 자세 유지 등을 주증상으로 하는 병으로 뇌에서 도파민이라는 신경전달물질이 부족하게 되어 생기는 만성질환이고, 중추신경계 퇴행성질환의 하나이며, 중뇌의 흑색질 밀집부(Substantia nigra pars compacta)의 변형을 시작으로 뇌의 부피의 감소, 알파-시누클레인(α-synuclein, αSyn)의 응집 등을 병태생리적 증상으로 갖는 질환으로 보행의 불완전, 손떨림, 강직된 행동 등을 보인다.

이러한 파킨슨병의 진단과 관련하여 수행되는 검사로는 PET 검사, MRI 검사, 내과적 질환에 대한 검사 등이 있다.

뇌 도파민 운반체 양전자 단층 촬영(dopamine transporter PET, positron emission tomography) 검사는 도파민성 세포의 손상 여부를 알 수 있는 검사로서, 뇌 도파민 운반체 양전자 단층 촬영을 하게 되면 파킨슨병 때문이 아닌 다른 원인들에 의한 파킨슨증상을 확인할 수 있다. 약물 유발성 파킨슨증후군, 혈관성 파킨슨증후군, 알츠하이머병에서 동반되는 파킨슨증상, 본태성 진전에서 동반되는 파킨슨증상의 경우 일견 파킨슨증상과 유사한 떨림 등을 보이는 경우가 있으나, 도파민성 신경세포는 정상임을 확인할 수 있다.

파킨슨 증상을 보이는 경우에 파킨슨병과 유사한 질환들과 구분하는 것이 중요하고, 이차성 파킨슨증후군 및 비전형성 파킨슨증후군 등과 구분하기 위해서는 먼저 뇌 자기공명영상(MRI) 검사가 필요하다. 파킨슨병의 경우에는 MRI가 정상소견인 반면에 다른 질환들은 특징적인 MRI 소견을 보인다.

파킨슨병 진단 방법 중 내과적 질환에 대한 검사(혈액검사, 소변 검사, 심전도, 가슴 엑스선 검사)방법은 내과적 질환이 전신 위약감을 일으키면서, 파킨슨 증상으로 오인하는 경우가 있는데 이를 확인하기 위해서는 다른 내과적인 질환이 없는지 확인하기 위한 검사가 필요하다.

상기 파킨슨병 진단 방법들은 고가이고 진단 절차가 복잡한 문제가 있다. 또한, 파킨슨병을 앓고 있는 환자는 해마다 크게 증가하고 치료제 시장도 이에 비례하여 크게 성장하고 있지만, 정작 파킨슨병 진단 시장의 발전은 미진한 실정이다.

따라서, 파킨슨병을 그 유사질환과 구분하여 신속하고 경제적으로 진단할 수 있는 기술 및 이와 동시에 치료를 병행할 수 있는 기술에 대한 개발이 시급한 상황이다.

한편, 자가항체(autoantibody)는 모든 인간의 혈액에서 보편적으로 존재하며, 나이가 들어감에 따라 자가항체의 양이 증가하는 것으로 알려져 있다. 자가항체는 자기 자신에 대항하는(self-reactive) 항체로서 adaptive debrisclearance mechanism에 관여한다고 알려져 있다. 예를 들어, 자가면역질환의 경우 자기 자신의 특정 세포나 조직 구성물에 대항하는 자가항체에 의해서 질환이 발생하거나 악화된다고 알려져 있다.

최근 자가항체와 파킨슨병이 밀접하게 연관되어 있음이 알려졌다. 이에 자가항체가 알츠하이머 질환의 진단과 발병예측을 위한 바이오마커로 주목을 받고 있다.

이에, 본 발명자들은 환자의 혈액으로부터 파킨슨병의 진단 및 발병 예측이 가능한 자가항체를 발굴하고자 하였으며, 파킨슨병 환자의 혈액으로부터 자가항체를 프로파일링하고 파킨슨병 특이적인 자가항체를 선별하여 검증하였다.

대한민국등록특허 10-1860566

본 발명은 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 ATG4B 단백질을 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물, 파킨슨병 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 파킨슨병 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따른 파킨슨병 진단용 조성물은, ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여, 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 ATG4B 단백질을 포함한다.

그리고, 상기 ATG4B 단백질은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면 상기 파킨슨병 진단용 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단용 키트가 제공된다.

그리고, 상기 키트는 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체(autoantibody)를 검출할 수 있다.

또한, 상기 자가항체의 검출은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay), 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따른 파킨슨병 진단을 위한 정보제공 방법은, 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 자가항체 수준을 정상인 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 ATG4B 단백질에 대한 자가항체 수준과 비교하는 단계: 및 상기 피검체의 자가항체 수준이 상기 정상인 개체의 자가항체 수준보다 높은 경우 파킨슨병 양성으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

그리고, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 ATG4B 단백질에 대한 자가항체 수준은 상기 자가항체와의 항원-항체 반응을 이용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따른 파킨슨병 진단 정보를 제공하기 위해 자가 항체를 검출하는 방법은, ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질이 코팅된 고정체에 피검체로부터 분리된 생물학적 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계; 상기 단계를 통해 생성된 항원-항체 반응물을 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및 상기 검출량이 정상인 개체에 비해 증가된 피검체를 파킨슨병에 걸렸거나 걸릴 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

그리고, 상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 자가항체 수준을 정상인 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 ATG4B 단백질에 대한 자가항체 수준과 비교하는 단계: 및 상기 피검체의 자가항체 수준이 상기 정상인 개체의 자가항체 수준보다 높은 경우 파킨슨병 양성으로 판정하는 단계를 포함하는 파킨슨병 진단방법이 제공된다.

본 발명은, 파킨슨병 환자군에서 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질의 자가항체 수준이 높게 나타남을 확인하여 이에 대한 파킨슨병 진단용 바이오마커를 제공함으로써, 향후 파킨슨병으로 발병할 가능성이 높은 고위험군 및 발병 환자를 미리 선별하여, 파킨슨병을 조기에 진단하고 치료할 기반을 제공하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 파킨슨병 진단을 위한 정보제공 방법은 ATG4B 단백질의 자가항체를 검출함으로써 파킨슨병을 보다 정확하고 조기에 진단할 수 있다.

도 1은 6000개 단백질 칩을 이용한 파킨슨병 환자 및 정상군 Autoantibody 반응 방법을 나타낸 것이다 (실시예 1).
도 2는 파킨슨병 환자군에서 증가하는 단백질을 나타낸 그래프이다 (실시예 1).
도 3은 파킨슨병 환자군에서 감소하는 단백질을 나타낸 그래프이다 (실시예 1).
도 4는 Advanced, Early 환자군에서 서로 다른 양상이 나타난 단백질을 나타낸 그래프이다 (실시예 1).
도 5는 실시예 2에서 제작된 Mini-Chip의 모식도이다.
도 6은 실시예 2에서 도포된 단백질명을 나타낸 표이다.
도 7은 실시예 2의 파일럿 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 3의 2차 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 파킨슨병 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 파킨슨병 진단 방법에 관하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.

종래 파킨슨병 진단 방법들은 고가이고 진단 절차가 복잡한 문제점이 있었고, 환자는 해마다 크게 증가하고 치료제 시장도 이에 비례하여 크게 성장하고 있지만, 파킨슨병 진단 시장의 발전은 미진한 실정이었다.

이에 본 발명자들은 환자의 혈액으로부터 파킨슨병의 진단 및 발병 예측이 가능한 자가항체를 발굴하고자 하였으며, 파킨슨병 환자의 혈액으로부터 자가항체를 프로파일링하고 파킨슨병 특이적인 자가항체를 선별하여 검증하였다.

본 발명의 용어 “자가항체(autoantibodies)”는 항체의 일종으로 개체가 가지고 있는 개체 자신의 단백질에 대한 면역 반응에 의해 생성된 항체를 말한다. 많은 자가면역질환의 경우 이러한 자가항체를 생성하는 것으로 알려져 있다. 단일한 종류의 자가항체 검사는 그 자체로 진단적이지는 않으나 특정 질환이 존재할 가능성이 있는지 또는 없는지에 대한 단서를 제공할 수 있다. 각 자가항체 결과는 개별적으로 또는 전체 병력의 일부로서 고려되어야 한다.

본 발명의 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다. 본 발명의 목적상 진단은 파킨슨병의 발병 여부 또는 파킨슨병의 발병 단계를 확인하는 것이다.

본 발명의 파킨슨병 진단용 조성물은 파킨슨병 환자에서 정상 개체와 비교하여 상기 ATG4B 단백질에 대한 자가항체의 유의적인 발현 차이가 나타남을 이용하여 파킨슨병의 진단 또는 예후 예측을 위한 유용한 정보를 획득할 수 있는 것이다. 이는 지금까지 알려진 바 없으며, 본 발명에 의해 최초로 밝혀진 것으로, 높은 민감도 및 특이도로 파킨슨병 진단 또는 예후 예측이 가능한 점에서 그 의의가 크다.

본 발명에서 ATG4B 단백질은 NCBI Reference Sequence: NP_037457.3 인 cysteine protease ATG4B isoform 을 의미한다. 상기 ATG4B 단백질은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 파킨슨병 진단용 키트는 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체(autoantibody)를 검출할 수 있다.

본 발명의 파킨슨병 진단용 키트는 ATG4B 단백질의 자가항체를 타겟 항원으로 하여, 상기 ATG4B 단백질의 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상기 항원-항체 반응은 본 발명의 ATG4B 단백질의 자가항체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 항원은 ATG4B 단백질로서 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 진단용 키트에서 상기 자가항체의 검출은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay), 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수행될 수 있다.

상기 키트는 상기 ATG4B 단백질 또는 이의 단편 등을 고정하기 위한 고정체; 상기 ATG4B에 대한 자가항체와 특이적으로 결합하는 발색표지체가 컨쥬게이션된 2차 항체 접합체(Conjugate); 상기 표지체와 발색반응할 발색기질 용액, 세척액, 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.

상기 항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 (Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass) 등이 사용될 수 있다.

상기 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (Fluorescein) 및 색소 (Dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.

상기 발색을 유도하는 기질(발색기질)은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(ophenylenediamine) 등을 사용할 수 있다.

보편적으로 화학발광법 (Chemiluminescence)이 주로 사용되며, 이때 Luminol과 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 3-aminophthalate를 생성하고 그 발광체의 정도를 425nm 파장의 빛으로 확인함으로써 ATG4B 단백질의 자가항체 존재 유무를 검출한다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20(Tween 20)으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척할 수 있다.

본 발명에 따른 파킨슨병 진단을 위한 정보제공 방법은, 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 자가항체 수준을 정상인 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 ATG4B 단백질에 대한 자가항체 수준과 비교하는 단계: 및 상기 피검체의 자가항체 수준이 상기 정상인 개체의 자가항체 수준보다 높은 경우 파킨슨병 양성으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, "개체" 또는 "피검체"는 파킨슨병을 진단하거나 파킨슨병의 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미한다. 이때, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼, 닭, 오리, 거위 등의 파킨슨병이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, "생물학적 시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 파킨슨병 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 외에도, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에서 바람직하게는 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 용어, "정상인 개체"란 파킨슨병으로 진단되지 않은 개체를 의미하며, 정상인 개체로부터 분리된 시료와 파킨슨병의 진단 또는 예후를 예측하고자 하는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 단백질의 자가항체 수준을 측정하고, 비교함으로써, 파킨슨병 발병이 의심되는 개체의 파킨슨병 발병 여부 또는 파킨슨병의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.

또한, 상기 ATG4B 단백질에 대한 자가항체 수준은 상기 자가항체와의 항원-항체 반응을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 항원-항체 반응은 효소면역측정법(ELISA), 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체응집법 등을 들 수 있다.

본 발명의 파킨슨병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, 파킨슨병 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 ATG4B 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정한 결과, 정상인 개체로부터 분리된 시료에서 측정되는 수준 보다 유의적으로 높거나 낮은 경우, 파킨슨병의 발병 위험이 높거나, 그 예후가 나쁘다고 판정될 수 있다.

보편적으로 화학발광법 (Chemiluminescence)이 주로 사용되며 이때, Luminol과 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 3-aminophthalate를 생성하고 그 발광체의 정도를 425nm 파장의 빛으로 확인함으로써 ATG4B 단백질의 자가항체 존재 유무를 검출한다.

상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실험예 1 : 단백질칩을 이용한 마이크로 어레이 (1차 스크리닝)

유전자 전사 조절인자들을 포함하는 약 6000 여종의 유전자 확보 후 GST tag이 부착된 재조합단백질을 유리 플레이트에 심어 단백질칩을 제작하였다. 그 후 정상군, Early stage 환자, Advanced stage 환자 중 각 두 명씩의 혈청을 1:2000의 비율로 PBST buffer (PBS, 0.5% tween 20, pH 7.4)에 추가 후 단백질칩과 실온에서 2시간 동안 반응하여 항원과 결합하도록 하였다.

이후 PBST를 이용하여 10분간 3번의 세척 과정을 진행한 후 1 : 5000 의 비율로 hIgG-488 (녹색 형광) 이차 항체 (Invitrogen, A-10530)를 반응시켜, 환자 혈청 내 autoantibody 존재를 확인하였다. 혈청 내 자가항체 반응 정도를 정량화 하기 위해 심겨진 단백질의 GST tag을 이용하였다. GST 항체 (Santa cruz, sc-33613)를 실온에서 2시간 동안 반응하고 동일한 wash 과정 후 rlgG-594 (적색 형광)의 이차항체 (Invitrogen, A-32740)을 통해 단백질 칩에 심겨진 단백질량을 측정하였다.

이 때 녹색 및 적색 형광을 통한 단백질 칩의 항원 항체 반응 측정에는 모두 Microarray 리더기가 사용되었다.

1차 스크리닝의 환자정보는 하기 표 1과 같다.

실험예 2 : 재조합단백질 정제

재조합단백질 정제 벡터(pDEST15)를 BL21 대장균주로 이동(transformation)시켰다. 벡터를 포함한 BL21 대장균주 100ml을 Optical density(O.D.)가 0.6에 도달하도록 37℃ shaker에서 키운 뒤 최종 농도가 0.4 mM이 되도록 IPTG를 넣어주었다. 37℃에서 3시간의 induction 이후 BL21을 수확하여, Cell lytic B buffer (0.5% cell lytic B, 0.1% TritonX-100, 0.07% β-ME, 1X Dnase1, protease inhibitor, lysozyme in PBST)로 상온에서 10분간 반응시켜 lysis 하였다. 이 후 GST 표지된 재조합 단백질을 GST 항체가 부착된 bead 100 μl (GE, 17075601)를 이용하여, 4℃에서 3시간 동안 반응 후 원하는 단백질을pull-down 하였다.

Chromatography 칼럼 (Biorad, 731-1550)과 원심분리기를 이용하여 200g, 4℃, 5분으로 GST bead를 수확하고, Wash buffer 1 (50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 0.07% tor, 로 3번 세척 후 Wash buffer 2 (50 mM Hepes pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% glycerol)로 3번 세척을 진행하였다.

이 후 원하는 단백질만을 추출하기 위하여, 100 μl Elution buffer (50 mM HEPES, 100mM NaCl, 30% glycerol, 40mM reduced glutathione, 0.03% triton X-100)을 활용 bead와 4℃ 1시간 반응을 통해 3번 탈착 후 Protein concentrator (Amicon, UFC5003)를 통해 정제하였다. Coomassie staining 기법을 이용하여 정제해 낸 양을 측정하였고, 정제된 단백질의 양은 BSA standard를 기준하여 판별하였다.

실험예 3 : 파일럿 스크리닝

기 확보된 27개의 클론을 대상으로 Gateway cloning 기법을 사용하여 단백질 정제 벡터를 제작하였다. 27개의 Entry clone은 LR clonase (Invitrogen, 11791020)를 이용하여 pDEST15 vector로 옮겨졌으며, Cell lytic B 방법을 이용하여 단백질을 정제하였다.

Dot-blot 기법을 활용하여 0.1 μg 동량의 단백질을 나이트로셀룰로즈막에 도포한 뒤, 환자 혈청은 1 : 2000의 비율로 2시간 동안 상온에서 반응하여 혈청 내 자가항체가 항원 단백질과 결합시켰다.

이 후 secondary hIgG-HRP를 부착한 뒤 HRP 반응을 통해 나타난 Chemiluminescence intensity를 통하여 자가 항원 항체 반응을 수치화 하였다. 전체 실험의 정규화를 위하여 양성대조군 및 항원 단백질 양이 사용되었는데, i) 양성 대조군으로는 hlgG를 동량으로 도포하여 그 양을 정량화하였고, ii) 도포된 단백질량은 GST tag 및 항체 반응으로 확인하였으며, 이 값은 수치를 정량화 할 때 사용하였다.

파일럿 스크리닝의 환자정보는 하기 표 2와 같다.

환자	번호	성별	나이
정상	1	남	40
	2	남	43
	3	남	62
	4	남	54
	5	남	59
	1	여	48
	2	여	55
	3	여	58
	4	여	49
	5	여	46
파킨슨병	1	남	48
	2	남	43
	3	남	60
	4	남	64
	5	남	46
	1	여	51
	2	여	45
	3	여	49
	4	여	48
	5	여	44

실험예 4 : 2차 스크리닝

1차 단백질 칩 마이크로 어레이 및 파일럿 스크리닝을 대상으로 환자군에서 유의미한 변화를 도출했던 ATG4B 단백질의 자가항체를 30명 이상의 실험군에서 스크리닝을 진행하였다.

동량의 GST 단백질과, GST-ATG4B 단백질을 나이트로셀룰로즈막에 도포하고, 정상군 및 환자군 혈청을 1:2000의 비율로 2시간 동안 상온에서 반응시키고, 이후 hIgG-HRP를 이용한 Chemiluminescence 반응으로, 그 결과를 확인하였으며, 동량의 GST, 및 GST-ATG4B의 도포는 GST 안티바디를 사용하여 확인하였다.

총 31명의 정상군과 42명의 환자군이 사용되었으며, 개인별 ATG4B 자가항체 보유량이 측정되었고, GST 단백질을 음성대조군으로 사용하여, 불필요한 시그널이 나오는 것을 방지하고, 정확한 결과를 확인할 수 있도록 하였다.

2차 스크리닝의 환자정보는 하기 표 3과 같다.

실시예 1 : 단백질칩을 이용한 마이크로 어레이 사용 1차 스크리닝 결과

정상군 및 Early stage 와 Advanced stage PD(파킨슨병) 환자군을 각 2명씩 선정하여, 6000개 단백질이 심겨진 protein chip과 반응시켰다.

도 1은 6000개 단백질 칩을 이용한 파킨슨병 환자 및 정상군 Autoantibody 반응 방법을 나타낸 것이다

그 결과, Early stage PD 환자에서만 변하는 단백질을 포함하여 총 44개의 단백질이 환자군에서 변하는 것을 확인할 수 있었다.

첫 번째로 환자군에서 증가하는 18개 단백질은, RAD23B, VAMP4, VAMP3, PKNOX1, CSAG2, VAMP2, C6orf106, MUTYH, PMF1, LARP7, SNPR70, RAB10, C14orf106, TIMM44, ZNF503, HSF1, ATF6, POLR1A 로 확인되었고, 대부분의 경우 Early stage보다 Advanced PD환자군에서 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 2).

환자군에서 감소한 것으로 드러난 단백질은 14개로, STK24, NDUFV2, FLJ37087, ANXA2, LACTTB2, CLIC1, MSRA, YWHAE, ACOX1, G6PD, MRPS36, ATP5L, HSPA8, ZNF516 로 나타났으며, 두 환자군에서 모두 감소하는 경향으로 확인되었다 (도 3).

세번째로 12개의 단백질은 Early stage와 Advanced stage PD 환자에서 서로 다른 양상이 나타났다.

Early stage에서 그 양이 감소하였으나 Advanced stage에서 증가하는 단백질은, SF3B4, SOD1, MPP1, DHODH, PECI, ZYX, ATG4B, OGG1, CBX1, GRHPR, FHL3 로 나타났다. SMARCA1의 경우는 Early stage에서 그 양이 증가하였으나, Advanced PD환자에서 감소하는 패턴을 나타냈다 (도 4).

실시예 2 : 파일럿 스크리닝 결과

1차 Microarray 스크리닝을 대상으로 확인한 44개 단백질 중 기 확보된 27개의 단백질을 단백질 정제 벡터로 옮겨 그 단백질을 추출하였고, 이 후 GST 단백질을 음성대조군으로, hIgG를 양성대조군으로 확립하여, 27개 단백질을 활용한 Mini-chip을 제작하였다 (도 5 및 도 6). 각 20개의 Mini-chip을 제작하여, 정상군 및 환자군 각 10명을 대상으로 그 결과를 확인하였다.

이 때 환자군의 성별에 의한 변화를 확인하기 위하여, 남, 여 각 5명씩을 대상으로 한 결과를 비교하였다.

이 때, 환자군에서 증가하는 단백질은 8 개로, PECI, ATG4B, RAB10, ATP5L, GRHRP, LACTTB2, G6PD, OGG1으로 나타났으며, 감소하는 19개 단백질은 MPP1, C6orf106, FHL3, SNRP70, MRPS36, ATF6, RAD23B, VAMP2, ANXA2, ACOX1, ZNF503, HSPA8, LARP7, NDUFV2, CLIC1, CSAG2, VAMP3, YHWAE, STK24 이며 성별에 따른 뚜렷한 차이는 보이지 않았다.

파일럿 스크리닝 결과, ATG4B 단백질이 환자군에서 유의미한 증가한 것을 확인할 수 있었고, ATG4B 단백질은 1차 스크리닝에서도 환자군에서 증가하는 것으로 나타난 단백질로써, 환자군에서 공통적으로 증가하는 양상을 보였다 (도 7).

ATG4B 단백질의 경우, 세포의 Autophagy에 관여하는 단백질로써, 파킨슨병을 비롯한 많은 퇴행성 뇌질환에서 그 기능이 변화되어 있는 것으로 알려져 있고, 본 연구진은 1차 및 파일럿 스크리닝을 거쳐 발굴된 ATG4B 단백질을 중심으로 30명 이상의 환자군에 검증 절차를 진행하였다.

실시예 3 : 2차 스크리닝 결과

ATG4B 단백질을 대상으로 정상군 31명, 환자군 42명을 대상으로 2차 스크리닝을 진행하였다. 상기 2차 스크리닝 실험은 Blind로 진행하여 실험자의 개입을 최소한으로 하였다.

또한, 실험 이후 환자 정보 확인을 통해 ATG4B에 반응하는 다양한 요인을 확인하였다.

2차 스크리닝 결과 90% 이상의 PD 환자에서 높은 ATG4B autoantibody의 양이 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, 성별 및 나이 분포에서도 모두 고르게 높은 반응을 나타내었다 (도 8).

도 8에 나타낸 바와 같이 ATG4B 씨그널을 cut-off value로 설정시 정상군에서 31명 중 2명이 양성으로 검출되었고, 파킨슨 환자군에서 42명 중 38명이 양성으로 검출되었다. 따라서, 정상군에 대한 특이도 93.5%, 민감도 90.5%로 측정되었다 (표 4, 정상군과 환자군에서의 자가항체 테스트 결과).

	질병 양성	질병 음성	전체
테스트 양성	38	2	40
테스트 음성	4	29	33
전체	42	31	73

본 연구를 통하여, Early 및 Advanced PD 환자 특이적으로 변하는 Autoantibody를 확인할 수 있었으며, 환자의 질병 진행 정보 및 환자정보를 바탕으로 한 연구를 통해 환자 맞춤 진단을 가능케 할 것으로 사료된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> YepBio Corporation <120> Biomarkers for diagnosis of Parkinson's Disease, and method for diagnosis of Parkinson's disease <130> biomarker <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(393) <400> 1 Met Asp Ala Ala Thr Leu Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Phe Ala Glu Phe 1 5 10 15 Glu Asp Phe Pro Glu Thr Ser Glu Pro Val Trp Ile Leu Gly Arg Lys 20 25 30 Tyr Ser Ile Phe Thr Glu Lys Asp Glu Ile Leu Ser Asp Val Ala Ser 35 40 45 Arg Leu Trp Phe Thr Tyr Arg Lys Asn Phe Pro Ala Ile Gly Gly Thr 50 55 60 Gly Pro Thr Ser Asp Thr Gly Trp Gly Cys Met Leu Arg Cys Gly Gln 65 70 75 80 Met Ile Phe Ala Gln Ala Leu Val Cys Arg His Leu Gly Arg Asp Trp 85 90 95 Arg Trp Thr Gln Arg Lys Arg Gln Pro Asp Ser Tyr Phe Ser Val Leu 100 105 110 Asn Ala Phe Ile Asp Arg Lys Asp Ser Tyr Tyr Ser Ile His Gln Ile 115 120 125 Ala Gln Met Gly Val Gly Glu Gly Lys Ser Ile Gly Gln Trp Tyr Gly 130 135 140 Pro Asn Thr Val Ala Gln Val Leu Lys Lys Leu Ala Val Phe Asp Thr 145 150 155 160 Trp Ser Ser Leu Ala Val His Ile Ala Met Asp Asn Thr Val Val Met 165 170 175 Glu Glu Ile Arg Arg Leu Cys Arg Thr Ser Val Pro Cys Ala Gly Ala 180 185 190 Thr Ala Phe Pro Ala Asp Ser Asp Arg His Cys Asn Gly Phe Pro Ala 195 200 205 Gly Ala Glu Val Thr Asn Arg Pro Ser Pro Trp Arg Pro Leu Val Leu 210 215 220 Leu Ile Pro Leu Arg Leu Gly Leu Thr Asp Ile Asn Glu Ala Tyr Val 225 230 235 240 Glu Thr Leu Lys His Cys Phe Met Met Pro Gln Ser Leu Gly Val Ile 245 250 255 Gly Gly Lys Pro Asn Ser Ala His Tyr Phe Ile Gly Tyr Val Gly Glu 260 265 270 Glu Leu Ile Tyr Leu Asp Pro His Thr Thr Gln Pro Ala Val Glu Pro 275 280 285 Thr Asp Gly Cys Phe Ile Pro Asp Glu Ser Phe His Cys Gln His Pro 290 295 300 Pro Cys Arg Met Ser Ile Ala Glu Leu Asp Pro Ser Ile Ala Val Gly 305 310 315 320 Phe Phe Cys Lys Thr Glu Asp Asp Phe Asn Asp Trp Cys Gln Gln Val 325 330 335 Lys Lys Leu Ser Leu Leu Gly Gly Ala Leu Pro Met Phe Glu Leu Val 340 345 350 Glu Leu Gln Pro Ser His Leu Ala Cys Pro Asp Val Leu Asn Leu Ser 355 360 365 Leu Asp Ser Ser Asp Val Glu Arg Leu Glu Arg Phe Phe Asp Ser Glu 370 375 380 Asp Glu Asp Phe Glu Ile Leu Ser Leu 385 390

Claims

◈청구항 1은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여, 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 ATG4B 단백질을 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물.
◈청구항 2은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제1항에 있어서,
상기 ATG4B 단백질은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물.
◈청구항 3은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단용 키트.
◈청구항 4은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제3항에 있어서,
상기 키트는 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체(autoantibody)를 검출하는 파킨슨병 진단용 키트.
◈청구항 5은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제4항에 있어서,
상기 자가항체의 검출은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay), 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수행되는 파킨슨병 진단용 키트.
피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계;
상기 측정된 자가항체 수준을 정상인 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 ATG4B 단백질에 대한 자가항체 수준과 비교하는 단계: 및
상기 피검체의 자가항체 수준이 상기 정상인 개체의 자가항체 수준보다 높은 경우 파킨슨병 양성으로 판정하는 단계;
를 포함하는 파킨슨병 진단을 위한 정보제공 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 파킨슨병 진단을 위한 정보제공 방법.
제6항에 있어서,
상기 ATG4B 단백질에 대한 자가항체 수준은 상기 자가항체와의 항원-항체 반응을 이용하여 측정되는 파킨슨병 진단을 위한 정보제공 방법.
제6항에 있어서,
상기 ATG4B 단백질은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 파킨슨병 진단을 위한 정보제공 방법.
ATG4B(cysteine protease ATG4B) 단백질이 코팅된 고정체에 피검체로부터 분리된 생물학적 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;
상기 단계를 통해 생성된 항원-항체 반응물을 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
상기 검출량이 정상인 개체에 비해 증가된 피검체를 파킨슨병에 걸렸거나 걸릴 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계;
를 포함하는 파킨슨병 진단 정보를 제공하기 위해 자가 항체를 검출하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 파킨슨병 진단 정보를 제공하기 위해 자가 항체를 검출하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 ATG4B 단백질은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 파킨슨병 진단 정보를 제공하기 위해 자가 항체를 검출하는 방법.