KR20180051243A - 혈액기반 유전자 발현패턴을 이용한 치매 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈액기반 유전자 발현패턴을 이용한 치매 진단 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 치매 또는 경도인지장애 의심 환자로부터 채취한 소량의 혈액을 배양 세포에 처리한 다음, 배양 세포 내의 SPC25 유전자를 포함하는 특정 유전자들의 발현패턴을 측정함으로써 치매를 진단할 수 있는 혈액기반 치매진단용 유전자발현 검사법에 관한 것이다. 임상에 적용할 경우, 비교적 간편하고 적은 비용으로 치매를 진단할 수 있는 검사법의 기초원리 또는 원천기술로 활용될 수 있을 것이다. 또한 이러한 혈액기반 치매진단용 유전자발현검사법의 기초원리는 환자로부터 채취한 소량의 혈액을 이용하여 해당 질병의 유무 또는 건강상태를 검사할 수 있기 때문에, 신경퇴행성질환은 물론 암, 만성질환 등을 진단하는 데에도 활용될 수 있으므로, 다양한 임상증상의 진단에 응용이 가능할 것이다.
Description
본 발명은 혈액기반 유전자 발현패턴을 이용한 치매 또는 경도인지장애 진단 방법에 관한 것이다.
우리나라의 경우, 65세 이상 노인 인구 중 약 9.5%인 29만명 정도가 노인성 치매로 고생하고 있으며, 이 중 73%인 18만명은 습관적으로 거리를 배회하는 등 중증 환자이다. 이는 앞으로 인구의 노령화가 가속화됨에 따라 지속적으로 증가하여, 2020년에는 치매 환자가 현재보다 2.4배까지 증가한 70만명에 달할 것으로 예상된다.
치매는 아직까지 효과적인 치료제가 개발되어 있지 않으므로, 치매조기발견에 따른 예방관리가 무엇보다도 중요한 질환이다. 그러나 현재까지 치매진단은 주로 신경심리검사에 의존하고 있으며, 보조적 수단으로써 MRI(뇌위축 등 뇌변형 검사) 또는 PET(아밀로이드 침착수준 검사) 등이 사용되고 있으나 검사비용이 비싼 단점이 있으며, 뇌척수액 검사법(아밀로이드 혹은 타우 단백질의 양을 측정)은 침습적인 방법으로써 환자들이 꺼려하는 단점이 있다.
미국 시애틀에 있는 시스템 생물학 연구소의 리로이 후드(Hood) 박사는 10년 내에, 연간 두세 차례 혈액 검사만으로 인체 각 기관의 건강 상태를 체크할 수 있게 될 것이라고 예상했으며, 이 기술은 신체 각 기관들이 지속적으로 수백 가지의 단백질을 혈액 속에 쏟아낸다는 사실을 이용하였다. 이 중 각 기관이 배출하는 기관 고유의 단백질은 50가지인데, 이를 일컬어 단백질 지문(protein fingerprint)이라고 한다. 뇌와 간, 신장 등 신체 기관에 이상이 생기면 이 단백질 지문이 변화를 일으키게 되고, 혈액 검사로 이 변화를 파악하면 질병을 조기에 발견할 수 있다는 것이다.
위와 같이, 비교적 간단한 방법인 혈액 검사만으로도 조기 질병 진단이 가능하므로, 혈액을 이용한 정확한 결과를 얻기 위해 질병 특이적인 정확한 진단마커의 확보가 더 중요해지고 있다. 따라서 혈액 시료를 이용한 치매조기진단법 및 이를 위한 바이오마커가 개발된다면, 간편하고 저렴하게 치매를 조기진단할 수 있을 것이다.
한편, 한국공개특허 제2009-0009579호에는 '알츠하이머병 진단용 마커 및 이를 이용한 진단키트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1138343호에는 '알츠하이머 질병의 진단을 위한 신속한 시험법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 혈액기반 유전자 발현패턴을 이용한 치매 또는 경도인지장애 진단 방법에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 혈액 시료(혈청, 혈장 등)를 배양 세포에 처리한 다음, 배양 세포 내의 SPC25 유전자를 포함하는 특정 유전자들의 발현패턴을 측정함으로써 정상인 유래 혈액 시료로부터 치매 환자 또는 경도인지장애 환자 유래 혈액 시료를 구분할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 검체로부터 채취한 혈액 시료를 신경 세포에 처리하고 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 배양한 신경 세포로부터 SPC25(SPC25, NDC80 kinetochore complex component), FAM55C(family with sequence similarity 55, member C), WSB1(WD repeat and SOCS box containing 1), NSUN5C(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 5 pseudogene 2), GJA1(gap junction protein alpha 1), MCTS1(malignant T cell amplified sequence 1), WASF1(WAS protein family member 1), PTMA(prothymosin, alpha), TRMT2B(tRNA methyltransferase 2 homolog B), LOC644131, NEK2(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2), SLC12A2(solute carrier family 12 member 2), TPRKB(TP53RK binding protein), FCF1(FCF1 rRNA-processing protein), HMGB2(high-mobility group box 2), GRIK2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2), LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정한 유전자의 발현 수준을 정상 개체로부터 채취한 혈액 시료를 신경 세포에 처리한 대조군의 상기 동일 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용하여 치매 또는 경도인지장애 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 SPC25, FAM55C, WSB1, NSUN5C, GJA1, MCTS1, WASF1, PTMA, TRMT2B, LOC644131, NEK2, SLC12A2, TPRKB, FCF1, HMGB2, GRIK2, LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 함유하는 혈액 시료를 이용한 치매 또는 경도인지장애 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명은 치매 또는 경도인지장애 의심 환자로부터 채취한 소량의 혈액을 이용하여 치매를 진단할 수 있는 혈액기반 치매진단용 유전자발현 검사법에 관한 것으로서, 임상에 적용할 경우, 비교적 간편하고 적은 비용으로 치매를 진단할 수 있는 검사법의 기초원리 또는 원천기술로 활용될 수 있을 것이다. 또한 이러한 혈액기반 치매진단용 유전자발현검사법의 기초원리는 환자로부터 채취한 소량의 혈액을 이용하여 해당 질병의 유무 또는 건강상태를 검사할 수 있기 때문에, 신경퇴행성질환은 물론 암, 만성질환 등을 진단하는데에도 활용될 수 있으므로, 다양한 임상증상의 진단에 응용이 가능할 것이다.
도 1은 치매군 혈청/혈장 반응 유전자 선정을 위한 간략 모식도이다.
도 2는 각각의 정상 인간(H_N02~H_NO6), 치매에 걸린 인간(H_D01~H_D05), 정상 마우스(H_pW), APPPS1dE9 Tg 마우스(H_pT) 혈청을 처리한 SH-SY5Y 세포주에서 차별적으로 발현하는 유전자들을 찾기 위해 Illumina Human HT-12 v4.0 Beadchip microarray을 통해 유전자들의 발현 프로파일을 조사한 결과를 토대로 DEGs(differentially expressed genes)의 계층적 클러스터링을 나타낸 결과이다.
도 3은 SPC25 및 FAM55C 유전자의 정상군 및 치매군 혈청-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. SPC25 및 FAM55C의 발현은 안산노인코호트 대상군에서 선정된 정상(Normal, n=5) 및 치매(Dementia, n=5) 혈청에서 유의차가 있었다(*: p < 0.05, **: p < 0.001). 데이터는 3 반복체로부터 평균±SD로 표시하였다.
도 4는 SPC25 유전자의 정상군 및 치매군 혈장-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. SPC25의 발현은 안산노인코호트 대상군에서 선정된 정상(Normal, n=5) 및 치매(Dementia, n=5) 혈장에서 유의차가 있었다(p < 0.005).
도 5는 SPC25 유전자의 정상군 및 치매군 혈청-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. SPC25의 발현은 안산노인코호트 대상군에서 연령 성별 매칭하여 선정된 정상(Normal, n=10) 및 치매(Dementia, n=10) 혈청에서 유의차가 있었다(p < 0.002).
도 6은 SPC25 유전자의 정상군 및 경도인지장애군 혈청-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. SPC25의 발현은 안산노인코호트 대상군에서 연령 성별 매칭하여 선정된 정상(Normal, n=10) 및 경도인지장애(MCI, n=10) 혈청에서 유의차가 있었다(p=0.00002).
도 7은 Spc25 유전자의 마우스 대조군(wild type) 및 치매동물모델(APP/PS1 Tg) 혈청-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. Spc25의 발현은 마우스 대조군(wild type, n=6) 및 치매동물모델(APP/PS1 Tg, n=6) 혈청에서 유의차가 있었다(p < 0.001).
도 2는 각각의 정상 인간(H_N02~H_NO6), 치매에 걸린 인간(H_D01~H_D05), 정상 마우스(H_pW), APPPS1dE9 Tg 마우스(H_pT) 혈청을 처리한 SH-SY5Y 세포주에서 차별적으로 발현하는 유전자들을 찾기 위해 Illumina Human HT-12 v4.0 Beadchip microarray을 통해 유전자들의 발현 프로파일을 조사한 결과를 토대로 DEGs(differentially expressed genes)의 계층적 클러스터링을 나타낸 결과이다.
도 3은 SPC25 및 FAM55C 유전자의 정상군 및 치매군 혈청-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. SPC25 및 FAM55C의 발현은 안산노인코호트 대상군에서 선정된 정상(Normal, n=5) 및 치매(Dementia, n=5) 혈청에서 유의차가 있었다(*: p < 0.05, **: p < 0.001). 데이터는 3 반복체로부터 평균±SD로 표시하였다.
도 4는 SPC25 유전자의 정상군 및 치매군 혈장-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. SPC25의 발현은 안산노인코호트 대상군에서 선정된 정상(Normal, n=5) 및 치매(Dementia, n=5) 혈장에서 유의차가 있었다(p < 0.005).
도 5는 SPC25 유전자의 정상군 및 치매군 혈청-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. SPC25의 발현은 안산노인코호트 대상군에서 연령 성별 매칭하여 선정된 정상(Normal, n=10) 및 치매(Dementia, n=10) 혈청에서 유의차가 있었다(p < 0.002).
도 6은 SPC25 유전자의 정상군 및 경도인지장애군 혈청-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. SPC25의 발현은 안산노인코호트 대상군에서 연령 성별 매칭하여 선정된 정상(Normal, n=10) 및 경도인지장애(MCI, n=10) 혈청에서 유의차가 있었다(p=0.00002).
도 7은 Spc25 유전자의 마우스 대조군(wild type) 및 치매동물모델(APP/PS1 Tg) 혈청-처리 세포주에서의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. Spc25의 발현은 마우스 대조군(wild type, n=6) 및 치매동물모델(APP/PS1 Tg, n=6) 혈청에서 유의차가 있었다(p < 0.001).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 검체로부터 채취한 혈액 시료를 신경 세포에 처리하고 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 배양한 신경 세포로부터 SPC25(SPC25, NDC80 kinetochore complex component), FAM55C(family with sequence similarity 55, member C), WSB1(WD repeat and SOCS box containing 1), NSUN5C(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 5 pseudogene 2), GJA1(gap junction protein alpha 1), MCTS1(malignant T cell amplified sequence 1), WASF1(WAS protein family member 1), PTMA(prothymosin, alpha), TRMT2B(tRNA methyltransferase 2 homolog B), LOC644131, NEK2(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2), SLC12A2(solute carrier family 12 member 2), TPRKB(TP53RK binding protein), FCF1(FCF1 rRNA-processing protein), HMGB2(high-mobility group box 2), GRIK2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2), LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정한 유전자의 발현 수준을 정상 개체로부터 채취한 혈액 시료를 신경 세포에 처리한 대조군의 상기 동일 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용하여 치매 또는 경도인지장애 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 SPC25(SPC25, NDC80 kinetochore complex component), WSB1(WD repeat and SOCS box containing 1), GJA1(gap junction protein alpha 1), MCTS1(malignant T cell amplified sequence 1), WASF1(WAS protein family member 1), PTMA(prothymosin, alpha), LOC644131, NEK2(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2), SLC12A2(solute carrier family 12 member 2), TPRKB(TP53RK binding protein), HMGB2(high-mobility group box 2), GRIK2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2), LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자 중 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 상기 대조군에 비해 증가하고, 상기 FAM55C(family with sequence similarity 55, member C), NSUN5C(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 5 pseudogene 2), TRMT2B(tRNA methyltransferase 2 homolog B) 및 FCF1(FCF1 rRNA-processing protein) 유전자 중 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 상기 대조군에 비해 감소하면 치매 또는 경도인지장애로 판단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 SPC25, FAM55C, WSB1, NSUN5C, GJA1, MCTS1, WASF1, PTMA, TRMT2B, LOC644131, NEK2, SLC12A2, TPRKB, FCF1, HMGB2, GRIK2, LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1 내지 19로 각각 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 내지 19의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 "치매"는 기억, 언어, 판단력 등의 여러 영역에 걸쳐 후천적으로 인지 기능이 퇴화하는 신경퇴행성 뇌질환을 의미한다. 치매(dementia)는 다양한 원인에 의해 뇌기능이 손상되면서 기억력, 시공간 능력, 판단 및 사고력 등의 전박적인 지적 능력과 인지기능이 지속적으로 저항되어 사회생활 및 일상생활에 장애를 주는 상태를 나타낸다. 치매를 일으키는 대표적인 원인 질환은 알츠하이머성 치매 (Alzheimer's disease)로 전체 치매의 약 70% 정도를 차지한다. 알츠하이머성 치매는 뇌조직에 베타 아밀로이드반(-amyloid plaque), 신경섬유다발(neurofibrillary tangle), 신경염 (neuritis) 등의 병변 현상이 나타나지만, 아직까지 정확한 발병기전 및 원인에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않다.
본 발명의 치매는 바람직하게는 알츠하이머병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI)"는 정상 노인에 비해 인지기능은 저하되었으나 독립적인 일상생활을 수행하는 능력은 유지한 상태로, 정상에서 치매로 이행되는 중간단계를 말한다. 경도인지장애 노인환자 중 연간 5~20%가 치매로 진행되는 것으로 보고되고 있어, 경도인지장애는 치매로 이행될 가능성이 높은 위험군으로 인식되고 있다. 따라서 경도인지장애는 치매 발병의 예측 및 조기진단을 위하여 임상적으로 중요한 단계이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 신경 세포는 상기 SPC25, FAM55C, WSB1, NSUN5C, GJA1, MCTS1, WASF1, PTMA, TRMT2B, LOC644131, NEK2, SLC12A2, TPRKB, FCF1, HMGB2, GRIK2, LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자를 발현하는 신경 세포일 수 있고, 바람직하게는 인간 신경모세포종(Human neuroblastoma) 또는 마우스 신경세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 SH-SY5Y 세포 또는 마우스 T4 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 혈액 시료는 동물 유래의 혈액 시료일 수 있고, 바람직하게는 인간 혈액 시료일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간 혈액으로부터 분리한 혈장 또는 혈청일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS), 단백질 칩 방법 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 SPC25, FAM55C, WSB1, NSUN5C, GJA1, MCTS1, WASF1, PTMA, TRMT2B, LOC644131, NEK2, SLC12A2, TPRKB, FCF1, HMGB2, GRIK2, LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 함유하는 혈액 시료를 이용한 치매 또는 경도인지장애 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자와 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 상기 유전자의 발현 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "유전자의 발현 수준을 측정하는 제제"란 상기와 같이 치매 의심 검체의 혈액 시료를 배양 세포주에 처리하였을 때, 배양 세포주에서 발현이 증가 또는 감소하는 마커인 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 유전자와 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 상기 유전자의 발현 단백질에 특이적으로 인식하는 항체를 말한다. 더 바람직하게는 상기 유전자의 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 표적 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 본 발명의 프라이머는 표적 유전자의 mRNA(즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 표적 유전자의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다.
용어 "프로브"란 mRNA 또는 cDNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현 양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 검체로부터 채취한 혈액 시료를 신경 세포에 처리하고 배양한 신경 세포에서 발현이 증가 또는 감소하는 마커인 SPC25, FAM55C, WSB1, NSUN5C, GJA1, MCTS1, WASF1, PTMA, TRMT2B, LOC644131, NEK2, SLC12A2, TPRKB, FCF1, HMGB2, GRIK2, LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, SPC25, FAM55C, WSB1, NSUN5C, GJA1, MCTS1, WASF1, PTMA, TRMT2B, LOC644131, NEK2, SLC12A2, TPRKB, FCF1, HMGB2, GRIK2, LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
또한, 본 발명은 SPC25, FAM55C, WSB1, NSUN5C, GJA1, MCTS1, WASF1, PTMA, TRMT2B, LOC644131, NEK2, SLC12A2, TPRKB, FCF1, HMGB2, GRIK2, LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 함유하는 혈액 시료를 이용한 치매 또는 경도인지장애 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 키트에서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자와 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 상기 유전자의 발현 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 프라이머, 프로브 또는 항체는 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 인간 혈청 및 혈장 샘플 준비
본 발명은 도시지역(경기도 안산) 대상으로 집단기반 노인 코호트 연구(population-based geriatric cohort study)를 위해 2009년부터 2010년 사이에 수집된 60세 이상의 정상인, 경도인지장애 및 치매 환자의 혈청과 혈장 샘플을 사용하였다. 샘플은 발굴용 샘플(discovery set)과 검증용 샘플(validation set)으로 구성하였으며, 발굴용 샘플은 인간 마이크로어레이(human microarray) 분석을 위하여 성별과 나이(±2)를 매칭한 정상군(NC)과 치매군(AD) 각각 5명을 포함하였다. 검증용 샘플은 유의적으로 차이나는 유전자들에 대한 검증(validation)을 위하여 성별과 나이(±2)를 매칭한 정상군(NC), 경도인지장애군(mild cognitive impairment, aMCI) 및 치매군(AD)으로 구성하여 각 그룹별로 10명씩 추가시켰다. 각 샘플 세트에 대한 demographic characteristics는 표 1과 같다. 본 발명에서 치매 진단은 Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders, fourth edition(DSM-IV) 제시한 기준을 따랐으며, 경도인지장애는 Petersen/Winblad criteria를 따랐다. 신경정신과적 검사로 간이정신상태검사(Mini-Mental State Examination, MMSE)를 실시하였고, 이는 MMSE-KC(Korean version of MMSE in the Korean version of CERAD Assessment Packet)로 시행되었다. 치매임상평가척도(Clinical Dementia Rating Scale, CDR)는 최성혜 등(2001)에 의하여 번안된 한국판 expanded Clinical Dementia Rating 척도를 사용하였다.
2. 형질전환 마우스(transgenic mouse) 혈청 샘플 준비
알츠하이머 치매 형질전환 마우스(AD(Alzheimer's disease) transgenic mice)는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, 미국)에서 구입한 APP Swedish/PS1E9 마우스를 사용하였으며, C57BL/6J background strain의 대조군(wild type)과 교배하여 이중 반접합체(double hemizygotes)로 유지하였다. 마우스의 유전형(genotype)은 하기 표 2의 프라이머를 이용한 PCR로 확인하였다.
유전자 | 프라이머(5'->3') | 서열번호 |
mouse prion protein(PrP) | 정방향: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG | 20 |
역방향: GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACC | 21 | |
human APP |
정방향: GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG | 22 |
역방향: CTTGTAAGTTGGAT TCTCATATCCG | 23 |
본 발명에서는 16개월령 대조군(n=5)과 APP 형질전환 마우스(n=5)의 꼬리에서 채취한 혈액으로부터 분리한 혈청을 사용하였다.
3. 세포 배양
본 발명에서는 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포(human neuroblastoma SH-SY5Y cell)와 마우스 신경성 T4 세포(mouse neuronal T4 cell)를 사용하였으며, 이 세포들은 10% FBS(fetal bovine serum)(Gibco, Grand Island, NY, USA)와 항생제(100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 사용하여, SH-SY5Y 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서, T4 세포는 33℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. SH-SY5Y 세포에는 인간 혈청 및 혈장을, T4 세포에는 마우스 혈청을 처리하였으며, 그 절차는 다음과 같다. 각 세포를 10㎖ PBS로 세척한 후 TrypLE Express(Gibco, Grand Island, NY, USA)로 해리시키고 10% FBS가 첨가된 DMEM을 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 해리된 세포는 15㎖ 튜브로 옮기고 1000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 FBS를 첨가하지 않은 DMEM으로 2회 세척하였다. 혈청 혹은 혈장은 DMEM 배지에 10%로 첨가하고 0.45um 필터(Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA)로 여과하여 준비하였다. SH-SY5Y 세포는 인간 혈장/혈청 첨가 배지에 2×106 세포/㎖로 부유시킨 후, 6-웰 플레이트에 웰 당 2×106 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였고, T4 세포는 마우스 혈청 첨가 배지에 1×106 세포/㎖로 부유시킨 후, 12-웰 플레이트에 웰 당 5×105 세포를 접종하여 33℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 위의 방법과 동일하게 각 세포에 10% FBS를 처리 후 배양한 세포를 레퍼런스(reference)로 사용하였다.
4.
마이크로어레이
실험
10% 인간 혈청을 처리하여 24시간 동안 배양한 세포는 PBS로 세척한 후, RNeasy plus kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA로부터 바이오틴(biotin)이 라벨된 cDNA를 합성한 후 Illumina Human HT-12 v4.0 Beadchip에 혼성화시켰다. Illumina Image BeadArray Reader로 스캔 후 Illumina BeadStudio 프로그램을 통하여 각 유전자의 원시 강도(intensity) 값을 추출하였다. 모든 전사체들의 발현 수준은 quantile normalization을 통해 보정하였다. DEGs(Differentially expressed genes)는 폴드 변화(fold change)≥|1.2|이고 p<0.05 기준으로 선별하였다.
5.
qRT
-PCR(
Quantitative
real
time
RT
-
PCR
)
마이크로어레이 검증을 위해 4㎍의 총 RNA로부터 RNA to cDNA EcoDryTM Premix(Oligo dT)(Clontech, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qPCR 반응액은 50ng(총 RNA량 기준) cDNA, 10㎕ 2X SYBR Green mixture(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 1uM 프라이머를 첨가하여 총 20㎕로 구성하였다. 사용한 프라이머 염기서열은 표 3과 같다. qPCR은 ABI HT 7900을 사용하여 95℃, 10분간 변성한 후 95℃, 15초, 60℃, 1분간 40회가 반응조건으로 시행하였다.
종 | 유전자 | 프라이머(5'->3') | 서열번호 |
인간 | GAPDH | 정방향: CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA | 24 |
역방향: GTGGAATCATATTGGAACATGTAAACC | 25 | ||
FAM55C | 정방향: CCCCCGGAGAGCGAAG | 26 | |
역방향: CGTCTAACTTTCCTTCCAGCA | 27 | ||
SPC25 | 정방향: GCAGAGAGGTTGAAAAGGCTG | 28 | |
역방향: GGGCACTATCTGACACTTCAT | 29 | ||
마우스 | Gapdh | 정방향: GCAGTGGCAAAGTGGAGATTG | 30 |
역방향: AGATGGTGATGGGCTTCCCG | 31 | ||
Spc25 | 정방향: GAGTCGGAAGAGCTGACTGC | 32 | |
역방향: CGCTGATTTCTGCAGTCCTT | 33 |
각 그룹별 유전자 발현정도는 각 유전자들의 발현정도를 GAPDH(마우스의 경우 Gapdh)로 보정(Ct)한 후, FBS-처리된세포에서의 유전자별 발현정도에 대한 폴드(fold) 값을 구하여 비교하였다.
실시예
1. 치매 환자의 혈청을 처리한
SH
-
SY5Y
세포의 유전자 발현
프로파일
치매환자의 혈청을 처리한 SH-SY5Y 세포주에서 차별적으로 발현하는 유전자들을 찾기 위해 Illumina Human HT-12 v4.0 Beadchip microarray을 통해 유전자들의 발현 프로파일을 조사하였다. 정상인지기능군의 혈청을 처리한 세포(NC)와 치매환자의 혈청을 처리한 세포(AD)사이에 총 22개 프로브(probe)가 발현의 차이를 보였으며(fold change≥1.2, p<0.05), 이 중 15개의 프로브는 치매환자의 혈청을 처리하였을 때 발현이 증가하는 패턴을 보였고, 7개의 프로브는 감소하는 것으로 분석되었다(도 2, 표 4).
실시예
2.
qRT
-
PCR
분석
마이크로어레이 결과에 대한 확인을 위해 15개 상향 조절된 유전자와 4개 하향 조절된 유전자를 선택하여 qRT-PCR을 통해 발현 패턴을 조사하였다. 그 결과, SPC25와 FAM55C 유전자의 발현 정도가 마이크로어레이 결과와 동일하게 정상군과 치매군 간에 유의적으로 차이가 나는 것을 확인하였다(도 3).
실시예
3. 혈장-처리 신경세포에서의 혈청-반응 유전자의 검증
정상군과 치매군의 혈청(serum)을 처리하여 나타난 SPC25와 FAM55C 유전자의 발현 차이가 혈장(plasma)을 처리하였을 시에도 재현이 되는지를 확인하기 위해 마이크로어레이에서 사용된 동일 정상군(n=5)과 치매군(n=5)의 혈장을 SH-SY5Y에 처리하여 이들 유전자의 발현패턴을 조사하였다. 그 결과, SPC25 유전자 발현은 혈청처리 결과와 동일하게 혈장 처리 시에도 치매군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 4). 따라서, SPC25 유전자는 치매군의 혈청과 혈장 모두에 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 인간 치매군 및 경도인지장애군 혈청-처리 세포에서 SPC25 유전자의 발현 증가
치매군에서 SPC25 유전자의 발현이 증가되는 것을 재현하고, 이 유전자의 발현이 경도인지장애군에서도 차이가 나는지를 확인하기 위해 정상군, 경도인지군 및 치매군 각각 10명의 혈청을 SH-SY5Y 세포에 처리하여 이 유전자의 발현정도를 비교하였다. 그 결과, SPC25 유전자 발현은 정상군에 비해 치매군과 경도인지장애군에서 각각 1.23배, 1.31배씩 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 5, 6). 따라서 SPC25 유전자는 치매와 경도인지장애의 혈액 시료에 모두 반응하는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 치매동물모델 혈청-처리 세포에서 Spc25 유전자의 발현 증가
인간 치매군의 혈액에 특이적으로 반응하는 SPC25 유전자의 발현패턴이 치매동물모델에서도 재현되는지를 확인하기 위해 치매동물모델(APP/PS1dE9 transgenic mouse)과 대조군(wild type)의 혈청을 마우스 T4 세포에 처리하여 마우스 Spc25 유전자의 발현정도를 조사하였다. 그 결과, 대조군에 비해 치매동물모델에서 Spc25 유전자가 유의적으로 높게 발현됨을 확인하였다(도 7).
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expression pattern
<130> PN16328
<160> 33
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1375
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gtttgaaatc ggaaagttgg cggggctgcg ggagctgagc ctagagtccg gctgttggct 60
agagtgggcg cggatctggt gtggggaagg cggcgggact caggcctgcc tgcgaagcat 120
tgtcctacat aatggtagag gacgaactgg cacttttcga taaaagcata aatgaatttt 180
ggaataaatt caaaagtacg gacacctcct gtcagatggc gggactaaga gatacctaca 240
aggattccat caaagcattt gcagaaaagc tgtctgtgaa attaaaggaa gaagaacgaa 300
tggttgagat gtttctggaa tatcaaaatc agatcagcag gcaaaataag ctcattcaag 360
aaaaaaagga taacttgtta aaattgattg ctgaagtaaa aggcaaaaag caggaattgg 420
aagtactgac tgcaaatatc caggatctta aggaagaata ttctaggaag aaggaaacta 480
tttctactgc taataaagcg aatgcagaga ggttgaaaag gctgcagaaa tctgcagact 540
tgtataaaga tcgacttgga ctagaaattc gaaaaattta tggtgagaaa ttgcagttta 600
ttttcactaa tattgaccct aagaatcctg agagcccatt tatgttttcc ttacatctca 660
atgaagcaag ggactatgaa gtgtcagata gtgcccctca tcttgagggc ctagcagaat 720
ttcaagagaa tgtaaggaag accaacaatt tttcagcttt tcttgccaat gttcggaaag 780
cttttactgc cacggtttat aattaacata caaatagtgt atataaaaac ggtttatttt 840
tcttctctat tacatatctc tttttttctt gtttttatta ttattatact ttaagtttta 900
gggtacatgt gcacaatgtg caggtttgtt acatatgtat acatgtgcca tattggtgtg 960
ctgcacccat taactcgtca tttcattagg tatatctcct aatgctatcc ctcccccctc 1020
ccccaaccca caacagtccc cgttgtgtga tgttcccctt cctgtgtcca tgtgttctca 1080
ttgttcaatt cccacctagg agtgagaata tgtggtgttt ggttttttgt cctttcgata 1140
gtttgctgag aatgatggtt tccagcttca tccatgttcc tacaaaggac atgaactcat 1200
ccttttttat ggctgcatag tattccatgg tgtatatgtg ccacattttc ttaatccagt 1260
ctatcattgt tggacatttg ggttggttcc aagtctttgc tattgtgaat agtgccgaaa 1320
taaacatacg tgtgcatgtg tctttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1375
<210> 2
<211> 3949
<212> DNA
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gcccccggag agcgaagggc gggcgggtcc cggagcaaga agaattgtat agaaatgtaa 120
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ccctgacaac attacagagt gcttacaaag aaaagtggtg catttatttg gtgactcaac 1680
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aaaataggag ggccccagat cttactttcc tgtccttgag gaacaccttc aagtttttaa 3660
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<211> 6891
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
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caaaagaaaa caaggaagta tgcgaccatg aagcgaatgc ttagtctcag agatcagagg 120
cttaaagaaa aggatagatt aaaacctaaa aagaaagaaa agaaggatcc cagcgcatta 180
aaggaaagag aagttcccca acacccttcc tgcttatttt tccaatataa tacacagctg 240
ggcccacctt accacatcct cgttgatacc aactttatca acttttccat aaaagccaaa 300
ctggacttag tgcagtcaat gatggactgt ctgtatgcca agtgtatccc atgtataacc 360
gattgtgtaa tggctgaaat tgagaaattg gggcagaagt atcgagtggc tctaaggatt 420
gccaaggatc caagatttga acgattacca tgtacacaca aaggaaccta tgcagatgac 480
tgcttagtac agagagtaac tcagcataag tgttacattg tggccacagt tgaccgggac 540
ctgaaaagaa gaatccgtaa gattcctgga gttcctatca tgtacatttc taaccataga 600
tacaacattg aacggatgcc agatgattat ggagcccctc gattctaatt cttacaagac 660
acagttcctc tgcctttctt cgaccaactt tctcttgttg ccagttcatt acacaaaatg 720
tagcgggatt tttaaggaat cagagagact gatggagttc agggagatat ttattattta 780
ggtgcaccag cccagtcaga ttaacatcca aaggactgaa ccctgaacag agttaagtta 840
ccttttaagc attttgtggg gccgcggggg ttggggggaa tctgtgcagg gggaagcata 900
ttacagaagc aagaaagaca gttattcaat taactgagac atgcattaca tcatttctta 960
cttttcaagg aaaatcatgt tttacgactt gagtttatct gtctagttac cttgcagctg 1020
cacagctaga gaaacagggt atttacaatg cctgggaaag gaggagagat aaggctcact 1080
agccacagaa aaacaggcag ttaattttta aaggactcca gctctttctc tttctcacgg 1140
ggaattggat tttcttacat gcaactgaat ttctgcttac acatttttaa atttctttta 1200
attgcttttc caatgcaata gcatgaatta ttattctgtt gacctatttg ccttactatg 1260
agctgagggt agttcaatat gctcactctt tttttttttt ttcttgagat gaagttttgc 1320
tctgtcacca ggctggagtg cagtggcgtg atctgggctc actgcaaccc ctgcctccca 1380
tccttcaagt gattctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggattacag gtacacacca 1440
ccatgctcaa ctaatttttc ttttttgggc ggggggggtg gatattttta gtagagacaa 1500
atacttttgt atttttaata cagaaaagta tgcctcggcc tcccaaagtg ctggaattac 1560
agacatgagc cactgtgcct ggcctgctca ctttctgatg ctgctttttt gttgtttgtt 1620
tgtttatttg tttgttttga gacggagtct cgctctgtca ccaggctgga gtgcagtggc 1680
gcaatctcgg ctcattgcaa cctccgcctc ccaggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc 1740
tgcggagtag ctgggactat aggtgcgtgc caccacgtcc agccactgat gctgttttgc 1800
cactgatgct gttttgaaat tgatattttg tctcataaaa actaggccag gcatggtggc 1860
tcattcctgt aatcccagca ctttgggagg ccaaggtggg tggatcacct gaggtcagga 1920
gttggagatg agcctggaca acatggcaaa accccacctc tactaaaaat acaaaaaaaa 1980
ttagctgggt atggtgtcac gtgcctgtaa tcccagccac tggggaggct gaggcaggag 2040
aacctcttga acccaggagg tggaggttgc agtgagctga gattgcgcca ctgcattcca 2100
gcctgggtga cagagtgaga ctgtctcaaa aaaaaaaaaa aattaatgat ggtcaaaggg 2160
tataaaatct cagacaggaa gaatatgttt tatgcttttt ttgagttctg ttgtacagtg 2220
tggtgcctat acttaataat ggggtattat acatttcaaa attgatgttc tcatcacaga 2280
aatgtatttg aagtattgca tatgttaact agcttgattt aactattcca tattgtatcc 2340
acaatttatg atatcacttt gtaacccata catttataca attataaatt gtcaatttac 2400
aataaaaaa 2409
<210> 15
<211> 1277
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
gatgtggccc gtggcctagc tcgtcaagtt gccgtggcgc ggagaactct gcaaaacaag 60
aggctgagga ttgcgttaga gataaaccag ttcacgccgg agccccgtga gggaagcgtc 120
tccgttgggt ccggccgctc tgcgggactc tgaggaaaag ctcgcaccag gtggacgcgg 180
atctgtcaac atgggtaaag gagaccccaa caagccgcgg ggcaaaatgt cctcgtacgc 240
cttcttcgtg cagacctgcc gggaagagca caagaagaaa cacccggact cttccgtcaa 300
tttcgcggaa ttctccaaga agtgttcgga gagatggaag accatgtctg caaaggagaa 360
gtcgaagttt gaagatatgg caaaaagtga caaagctcgc tatgacaggg agatgaaaaa 420
ttacgttcct cccaaaggtg ataagaaggg gaagaaaaag gaccccaatg ctcctaaaag 480
gccaccatct gccttcttcc tgttttgctc tgaacatcgc ccaaagatca aaagtgaaca 540
ccctggccta tccattgggg atactgcaaa gaaattgggt gaaatgtggt ctgagcagtc 600
agccaaagat aaacaaccat atgaacagaa agcagctaag ctaaaggaga aatatgaaaa 660
ggatattgct gcatatcgtg ccaagggcaa aagtgaagca ggaaagaagg gccctggcag 720
gccaacaggc tcaaagaaga agaacgaacc agaagatgag gaggaggagg aggaagaaga 780
agatgaagat gaggaggaag aggatgaaga tgaagaataa atggctatcc tttaatgatg 840
cgtgtggaat gtgtgtgtgt gctcaggcaa ttattttgct aagaatgtga attcaagtgc 900
agctcaatac tagcttcagt ataaaaactg tacagatttt tgtatagctg ataagattct 960
ctgtagagaa aatactttta aaaaatgcag gttgtagctt tttgatgggc tactcataca 1020
gttagatttt acagcttctg atgttgaatg ttcctaaata tttaatggtt tttttaattt 1080
ctgtgtgtat ggtagcacag caaacttgta ggaattagta tcaatagtaa attttgggtt 1140
ttttaggatg ttgcatttcg tttttttaaa aaaaattttg taataaaatt atgtatatta 1200
tttctattgt ctttgtctta atatgctaag ttaattttca ctttaaaaaa gccatttgaa 1260
gaccaaaaaa aaaaaaa 1277
<210> 16
<211> 3322
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
ggttgttcct tggcgcagtg agtgaagaac atgcagcgat tgctaatggg tttgggaagc 60
ggagactcct tcctctctct atgaccatgc cgtgatcgtg tctgcggtca ccactcgacg 120
catcctcatt tctacccgaa cccaggagcc gaacgctaga tcggggaagt gggtgccgtg 180
cgtgtgggca cagaaacacc atgaagatta ttttcccgat tctaagtaat ccagtcttca 240
ggcgcaccgt taaactcctg ctctgtttac tgtggattgg atattctcaa ggaaccacac 300
atgtattaag atttggtggt atttttgaat atgtggaatc tggcccaatg ggagctgagg 360
aacttgcatt cagatttgct gtgaacacaa ttaacagaaa cagaacattg ctacccaata 420
ctacccttac ctatgatacc cagaagataa acctttatga tagttttgaa gcatccaaga 480
aagcctgtga tcagctgtct cttggggtgg ctgccatctt cgggccttca cacagctcat 540
cagcaaacgc agtgcagtcc atctgcaatg ctctgggagt tccccacata cagacccgct 600
ggaagcacca ggtgtcagac aacaaagatt ccttctatgt cagtctctac ccagacttct 660
cttcactcag ccgtgccatt ttagacctgg tgcagttttt caagtggaaa accgtcacgg 720
ttgtgtatga tgacagcact ggtctcattc gtttgcaaga gctcatcaaa gctccatcaa 780
ggtataatct tcgactcaaa attcgtcagt tacctgctga tacaaaggat gcaaaaccct 840
tactaaaaga aatgaaaaga ggcaaggagt ttcatgtaat ctttgattgt agccatgaaa 900
tggcagcagg cattttaaaa caggcattag ctatgggaat gatgacagaa tactatcatt 960
atatctttac cactctggac ctctttgctc ttgatgttga gccctaccga tacagtggtg 1020
ttaacatgac agggttcaga atattaaata cagaaaatac ccaagtctcc tccatcattg 1080
aaaagtggtc gatggaacga ttgcaggcac ctccgaaacc cgattcaggt ttgctggatg 1140
gatttatgac gactgatgct gctctaatgt atgatgctgt gcatgtggtg tctgtggccg 1200
ttcaacagtt tccccagatg acagtcagtt ccttgcagtg taatcgacat aaaccctggc 1260
gcttcgggac ccgctttatg agtctaatta aagaggcaca ttgggaaggc ctcacaggca 1320
gaataacttt caacaaaacc aatggcttga gaacagattt tgatttggat gtgatcagtc 1380
tgaaggaaga aggtctagaa aagattggaa cgtgggatcc agccagtggc ctgaatatga 1440
cagaaagtca aaagggaaag ccagcgaaca tcacagattc cttatccaat cgttctttga 1500
ttgttaccac cattttggaa gagccttatg tcctttttaa gaagtctgac aaacctctct 1560
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ttggctttac atatgaaatt agacttgtgg aagatgggaa atatggagcc caggatgatg 1680
ccaatggaca atggaatgga atggttcgtg aactaattga tcataaagct gaccttgcag 1740
ttgctccact ggctattacc tatgttcgag agaaggtcat cgacttttcc aagcccttta 1800
tgacacttgg aataagtatt ttgtaccgca agcccaatgg tacaaaccca ggcgtcttct 1860
ccttcctgaa tcctctctcc cctgatatct ggatgtatat tctgctggct tacttgggtg 1920
tcagttgtgt gctctttgtc atagccaggt ttagtcctta tgagtggtat aatccacacc 1980
cttgcaaccc tgactcagac gtggtggaaa acaattttac cttgctaaat agtttctggt 2040
ttggagttgg agctctcatg cagcaaggtt ctgagctcat gcccaaagca ctgtccacca 2100
ggatagtggg aggcatttgg tggtttttca cacttatcat catttcttcg tatactgcta 2160
acttagccgc ctttctgaca gtggaacgca tggaatcccc tattgactct gctgatgatt 2220
tagctaaaca aaccaagata gaatatggag cagtagagga tggtgcaacc atgacttttt 2280
tcaagaaatc aaaaatctcc acgtatgaca aaatgtgggc ctttatgagt agcagaaggc 2340
agtcagtgct ggtcaaaagt aatgaagaag gaatccagcg agtcctcacc tctgattatg 2400
ctttcctaat ggagtcaaca accatcgagt ttgttaccca gcggaactgt aacctgacac 2460
agattggcgg ccttatagac tctaaaggtt atggcgttgg cactcccatg ggttctccat 2520
atcgagacaa aattaccata gcaattcttc agctgcaaga ggaaggcaaa ctgcatatga 2580
tgaaggagaa atggtggagg ggcaatggtt gcccagaaga ggagagcaaa gaggccagtg 2640
ccctgggggt tcagaatatt ggtggcatct tcattgttct ggcagccggc ttggtgcttt 2700
cagtttttgt ggcagtggga gaatttttat acaaatccaa aaaaaacgct caattggaaa 2760
agaggtcctt ctgtagtgcc atggtagaag aattgaggat gtccctgaag tgccagcgtc 2820
ggttaaaaca taagccacag gccccagtta ttgtgaaaac agaagaagtt atcaacatgc 2880
acacatttaa cgacagaagg ttgccaggta aagaaaccat ggcataaagc tgggaggcca 2940
aacacccaag cacaaactgt cgtctttttc caaacaattt agccagaatg tttcctgtgg 3000
aaatatgcaa cctgtgcaaa ataaaatgag ttacctcatg ccgctgtgtc tatgaactag 3060
agactctgtg atctaagcag ttgcaatgat cagacttgat ttacaagcat catggatcaa 3120
ccaagttaca cggggttaca ctgttaatca tgggttcctc ccttcttctg agtgaatgtt 3180
aacatgcgca ttttgtggct gatttcaaat gcagtccagt gagaaattac aggttccttt 3240
tgaagctcaa ctgttgccag gagatggaat atcaatgccc aacagggcaa ccaataaaag 3300
tgtcactaag aatataaata tt 3322
<210> 17
<211> 708
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
atggtcaacc ccactgtgtt cttcgacatc gcctttgacg gctagccctt ggggtgcatc 60
tccttcaagc tgtttgcaga caagtttcca aagacagaag aaaactttca tgctccgagc 120
actggagaga aaagatttgg ttataaggct tcctgctttc acagaaatat tccagggttt 180
atgtgtcagg gtagtgactt cacacgccat aatggcactg gtggcaagtc catctacggg 240
gagaaatttg aagatgagaa cttcatccta aagcatacag gtcctggcgt cttgcccatg 300
gcaaatgctg gacccaacac aaatggttcc cagtttttca tctgcactgc caagactgag 360
tggttggatg gcaagcatgt ggtctttggc aaggtgaaag aaggcgtgaa tattgtggag 420
gccatggagc actttgggtc caggaatggc aagaccagca agaagatcat cagcattgct 480
gactgtggac aactctaata agtttgactt gtgttttatc ttaaccacca gaccatttct 540
tctgtatctc aggagagcac tcctccaccc cgtttgctca cagtatccta tcatctttgt 600
gctctcgctg cagttccctt tgggttccat gttttccttg ttcccttcca tgcctagctg 660
gattggagag ttaagtttat gattatgaaa tcaaaactaa ataaaaat 708
<210> 18
<211> 833
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
agccctccgt cacctcttca cggcgccctg ggactgcccc aaggctcccg ccgctgctcc 60
agcgcggcgc agccactgcc gccgccgccg cctctcctta gtcgccgcaa tgacgaccgc 120
gtccacctcg caggtgcgcc agaactacca ccagtactca gaggccgcca tcaaccgcca 180
gatcaacctg gagcactacg cctcctaagt ttacctgtcc ctgtcttact actttgaccg 240
cgatgatgtg gctttgaaga actttgccaa atactttctt caccaatctc atgaggagag 300
gggacatgct gagaaactga tgaagctgca gaaccaatga ggtggccgaa tcttccttca 360
ggatatcaag aaaccagact gtgatgactg ggagagcggg ctgaatgcga tggagtgtgc 420
attacatttg gaaaaaaatg tgaatcagtc actactggaa ctgcacaaac tggccactga 480
caaaaatgac ccccatttgt gtgacttgag atacattacc tgaatgagca ggtgaaagcc 540
atcaaagaat tgggtgacca cgtgaccaac ttgcgcaaga tgggagcgcc cgaatctggc 600
gtgggagaat atctctttga caagcacact ctgggagaca gtgataatga aagctaagcc 660
tcaggctaat ttccccatag ccatggggtg acttccctgg tcaccaaggc agtgcatgca 720
tgttggggtt tcctttacct tttctataag ttgtaccaaa acatccactt aagttctttg 780
atttgtacca ttccttcaaa taaagaaatt tggtacccaa aaaaaaaaga gtc 833
<210> 19
<211> 546
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
cccttccgcc atgactgtaa gtttcctggg acctctccag ccatgctgaa ccgattcggg 60
agtgagaatg acgaggagag cccttcacga gaaggggctg aagacagagc ccctcaggag 120
gctcctgccc aggaggggcc tccggacaaa tgtccggccc agttccatgg cggtgccgga 180
caccagagct cccgggggag gcagcaaggc cccgagggca cccagaacaa tcccccaggg 240
taaggggagg tgagtgggct ccccaagcaa gccaagaccc ctaaagcctc ccttggctgc 300
cccaagatcc agccactacc tgtgccccga gggcggaaag agcttcccag ctcacccacc 360
gcggtaacat cggagggcga gcggccccac acctgcccga acctaaggcc acagcaccca 420
tctggctcgc cactggcgcc cgaatgcatg ggaagggctt agggcagaac tcggaccaca 480
tccagtgcct gaggccgcct tgctagaggc ctaggggagg ggtgcactgg gctgcctcgc 540
ccacct 546
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
cctctttgtg actatgtgga ctgatgtcgg 30
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
gtggataacc cctcccccag cctagacc 28
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
gactgaccac tcgaccaggt tctg 24
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
cttgtaagtt ggattctcat atccg 25
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
cagggctgct tttaactctg gtaa 24
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
gtggaatcat attggaacat gtaaacc 27
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
cccccggaga gcgaag 16
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
cgtctaactt tccttccagc a 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
gcagagaggt tgaaaaggct g 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
gggcactatc tgacacttca t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
gcagtggcaa agtggagatt g 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
agatggtgat gggcttcccg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
gagtcggaag agctgactgc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
cgctgatttc tgcagtcctt 20
Claims (9)
- (a) 검체로부터 채취한 혈액 시료를 신경 세포에 처리하고 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 배양한 신경 세포로부터 SPC25(SPC25, NDC80 kinetochore complex component), FAM55C(family with sequence similarity 55, member C), WSB1(WD repeat and SOCS box containing 1), NSUN5C(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 5 pseudogene 2), GJA1(gap junction protein alpha 1), MCTS1(malignant T cell amplified sequence 1), WASF1(WAS protein family member 1), PTMA(prothymosin, alpha), TRMT2B(tRNA methyltransferase 2 homolog B), LOC644131, NEK2(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2), SLC12A2(solute carrier family 12 member 2), TPRKB(TP53RK binding protein), FCF1(FCF1 rRNA-processing protein), HMGB2(high-mobility group box 2), GRIK2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2), LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정한 유전자의 발현 수준을 정상 개체로부터 채취한 혈액 시료를 신경 세포에 처리한 대조군의 상기 동일 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용하여 치매 또는 경도인지장애 진단에 정보를 제공하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 SPC25(SPC25, NDC80 kinetochore complex component), WSB1(WD repeat and SOCS box containing 1), GJA1(gap junction protein alpha 1), MCTS1(malignant T cell amplified sequence 1), WASF1(WAS protein family member 1), PTMA(prothymosin, alpha), LOC644131, NEK2(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2), SLC12A2(solute carrier family 12 member 2), TPRKB(TP53RK binding protein), HMGB2(high-mobility group box 2), GRIK2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2), LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자 중 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 상기 대조군에 비해 증가하고, 상기 FAM55C(family with sequence similarity 55, member C), NSUN5C(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 5 pseudogene 2), TRMT2B(tRNA methyltransferase 2 homolog B) 및 FCF1(FCF1 rRNA-processing protein) 유전자 중 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 상기 대조군에 비해 감소하면 치매 또는 경도인지장애로 판단하는 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용하여 치매 또는 경도인지장애 진단에 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 SPC25(SPC25, NDC80 kinetochore complex component), FAM55C(family with sequence similarity 55, member C), WSB1(WD repeat and SOCS box containing 1), NSUN5C(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 5 pseudogene 2), GJA1(gap junction protein alpha 1), MCTS1(malignant T cell amplified sequence 1), WASF1(WAS protein family member 1), PTMA(prothymosin, alpha), TRMT2B(tRNA methyltransferase 2 homolog B), LOC644131, NEK2(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2), SLC12A2(solute carrier family 12 member 2), TPRKB(TP53RK binding protein), FCF1(FCF1 rRNA-processing protein), HMGB2(high-mobility group box 2), GRIK2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2), LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용하여 치매 또는 경도인지장애 진단에 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머병인 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용하여 치매 또는 경도인지장애 진단에 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 혈액은 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용하여 치매 또는 경도인지장애 진단에 정보를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군에서 선택된 방법인 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용하여 치매 또는 경도인지장애 진단에 정보를 제공하는 방법.
- SPC25(SPC25, NDC80 kinetochore complex component), FAM55C(family with sequence similarity 55, member C), WSB1(WD repeat and SOCS box containing 1), NSUN5C(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 5 pseudogene 2), GJA1(gap junction protein alpha 1), MCTS1(malignant T cell amplified sequence 1), WASF1(WAS protein family member 1), PTMA(prothymosin, alpha), TRMT2B(tRNA methyltransferase 2 homolog B), LOC644131, NEK2(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2), SLC12A2(solute carrier family 12 member 2), TPRKB(TP53RK binding protein), FCF1(FCF1 rRNA-processing protein), HMGB2(high-mobility group box 2), GRIK2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2), LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 함유하는 혈액 시료를 이용한 치매 또는 경도인지장애 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자와 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 상기 유전자의 발현 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 시료를 이용한 치매 또는 경도인지장애 진단용 조성물.
- SPC25(SPC25, NDC80 kinetochore complex component), FAM55C(family with sequence similarity 55, member C), WSB1(WD repeat and SOCS box containing 1), NSUN5C(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 5 pseudogene 2), GJA1(gap junction protein alpha 1), MCTS1(malignant T cell amplified sequence 1), WASF1(WAS protein family member 1), PTMA(prothymosin, alpha), TRMT2B(tRNA methyltransferase 2 homolog B), LOC644131, NEK2(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2), SLC12A2(solute carrier family 12 member 2), TPRKB(TP53RK binding protein), FCF1(FCF1 rRNA-processing protein), HMGB2(high-mobility group box 2), GRIK2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2), LOC440063, LOC729009 및 LOC100129191 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 함유하는 혈액 시료를 이용한 치매 또는 경도인지장애 진단용 키트.
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