CN101687050A - 用于鉴别原发起源不明的癌的起源的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供鉴别起源不明转移灶的起源的方法：获得含有转移细胞的样品；测量与至少2种不同癌有关的生物标记；将来自生物标记的数据组合进线性判别分析中，其中所述线性判别分析相对于参比标准化所述生物标记；和施加优化每种生物标记的灵敏度和特异性的截止值，对癌的患病率加权和选择起源组织；基于通过线性判别分析测定的最高概率来确定起源，或确定该癌不是源自特定癌集合；和任选地测量一种或多种其它不同癌的特异性生物标记，并为其它生物标记重复所述步骤。

Description

用于鉴别原发起源不明的癌的起源的方法和材料
关于联邦资助的研发的声明
本发明未使用政府基金。
发明背景
原发不明癌(CUP)是一组异质的、活组织检查证实的恶性肿瘤，其中转移性疾病存在，但没有可鉴别的原发肿瘤部位或起源组织(ToO)。该问题代表所有癌症的约3-5％，使它成为第七种最常见的恶性肿瘤。Ghosh等(2005)；和Mintzer等(2004)。患者的预后和治疗方案依赖于原发肿瘤的起源，从而更加需要鉴别原发肿瘤部位。Greco等(2004)；Lembersky等(1996)；和Schlag等(1994)。
目前，许多方法用于解决该问题。下面的几种方法图示在图1-2中。血清肿瘤标记可以用于区分性诊断。尽管它们缺少足够的特异性，但它们可以与病理学和临床信息联用。Ghosh等(2005)。免疫组织化学(IHC)方法可以用于鉴别肿瘤谱系，但是非常少的IHC标记是100％特异性的。因此，病理学家经常使用一组IHC标记。几项研究已经证明使用4-14种IHC标记有66-88％的准确度。Brown等(1997)；DeYoung等(2000)；和Dennis等(2005a)。更昂贵的诊断检查包括成像方法，例如胸部x-射线，计算机断层摄影(CT)扫描，和正电子发射断层摄影(PET)扫描。每种这样的方法可以鉴别30-50％病例中的原发。Ghosh等(2005)；和Pavlidis等(2003)。尽管有这些复杂的技术，在死前(ante mortem)分辨CUP病例的能力仅仅是20-30％。Pavlidis等(2003)；和Varadhachary等(2004)。
一种有前途的新方法在于分析全基因组的基因表达概况来鉴别肿瘤起源的能力。Ma等(2006)；Dennis等(2005b)；Su等(2001)；Ramaswamy等(2001)；Bloom等(2004)；Giordano等(2001)；和20060094035。这些研究证实了基于基因表达概况来鉴别起源组织的可行性。为了将这些表达概况分析技术用于临床场合，必须克服2大障碍。首先，由于基因表达概况分析完全在原发组织上进行，所以必须在转移组织上验证候选基因标记，以证实它们的组织特异性表达能在转移灶中维持。其次，基因表达概况分析技术必须能利用福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织，因为固定化的组织样品是当前实践中的标准材料。福尔马林固定导致RNA的降解(Lewis等(2001)；和Masuda等(1999))，所以现有的微阵列规程不能可靠地进行。Bibikova等(2004)。另外，所述概况分析技术必须是有力的、可再现的和易得的。
已经表明，定量RT-PCR(qRT-PCR)能从FFPE组织产生可靠的结果。Abrahamsen等(2003)；Specht等(2001)；Godfrey等(2000)；和Cronin等(2004)。因此，一项更实用的方法是使用全基因组的方法作为发现工具，并开发基于更有力的技术的诊断测定。Ramaswamy(2004)。但是，该范例需要开发更小的基因集合。Oien及其同事使用基因表达的系列分析(SAGE)来鉴别61种肿瘤标记，他们从中开发了基于5个肿瘤类型的11个基因的RT-PCR方法。Dennis等(2002)。将SAGE和qRT-PCR结合到一起的另一项研究，开发了4个肿瘤类型的5个基因的组，并达到81％的准确度。Buckhaults等(2003)。最近的研究将微阵列概况分析与qRT-PCR结合，但是使用了79种标记。Tothill等(2005)。
发明概述
本发明提供了如下鉴别起源不明转移灶的起源的方法：获得含有转移细胞的样品；  测量与至少2种不同癌有关的生物标记(Biomarkers)；将来自生物标记的数据组合进分类树中，其中所述分类树采用相对于参比标准化的生物标记；和施加优化每种生物标记的灵敏度和特异性的截止值，对癌的患病率加权并选择起源组织；基于通过分类树确定的最高概率来确定起源，或确定该癌不是源自特定癌集合；和任选地测量一种或多种其它不同癌的特异性生物标记，视需要为其它生物标记重复所述步骤。
附图简述
图1-2描述了鉴别起源不明转移灶的起源的现有技术方法。
图3描述了本发明的CUP分类树。
图4描述了显示一组组织中的2个基因的强度的微阵列数据。(A)前列腺干细胞抗原(PSCA)。(B)凝血因子V(F5)。柱状图在y-轴显示强度，在x-轴上显示组织。Panc Ca，胰腺癌；Panc N，正常胰腺。
图5描述了从Agilent生物分析仪得到的电泳图谱。使用3小时(A)或16小时(B)蛋白酶K消化，从FFPE组织分离RNA。样品C22(红色)是1年龄块，而样品C23(蓝色)是5年龄块。大小梯(size ladder)显示为绿色。
图6描述了从3种不同qRT-PCR方法得到的Ct值的对比：在逆转录中的随机六聚体引发，随后用得到的cDNA进行qPCR(RH 2步骤)，在逆转录中基因-特异性的(反向引物)引发，随后用得到的cDNA进行qPCR(GSP 2步骤)，或在单步反应中基因-特异性的引发和qRT-PCR(GSP 1步骤)。将来自11个样品的RNA分入3种方法中，并测量3个基因的RNA水平：β-肌动蛋白(A)，HUMSPB(B)，和TTF(C)。用实线指示用每种方法得到的中值Ct值。
图7描述了CUP测定板图。
图8描述了单变量分析树。
图9中的一系列图描述了一定RNA浓度范围的测定性能。
图10是一幅实验工作流程图：显示候选标记指定和验证(10A)。
图11描述了10种选择的组织特异性的候选基因标记在FFPE转移癌和前列腺原发腺癌中的表达。对于每幅图，X轴代表标准化的标记表达值。
图12描述了测定最优化。(A和B)从Agilent生物分析仪得到的电泳图谱。使用3小时(A)或16小时(B)蛋白酶K消化，从FFPE组织分离RNA。样品C22(红色)是1年龄块，而样品C23(蓝色)是5年龄块。大小梯显示为绿色。(C和D)从3种不同qRT-PCR方法得到的Ct值的对比：在逆转录中的随机六聚体引发，随后用得到的cDNA进行qPCR(RH 2步骤)，在逆转录中基因-特异性的(反向引物)引发，随后用得到的cDNA进行qPCR(GSP 2步骤)，或在单步反应中基因-特异性的引发和qRT-PCR(GSP 1步骤)。将来自11个样品的RNA分入3种方法中，且测量2个基因的RNA水平：β-肌动蛋白(C)，HUMSPB(D)。用实线指示用每种方法得到的中值Ct值。
图13是显示10个标记组在239个样品之间的相对表达水平的热图(heatmap)。红色指示更高的表达。
详细描述
鉴别原发起源不明(CUP)转移癌患者中的原发部位，可以实现特定治疗方案的应用，并可以延长存活。因此，通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，在源自这6种组织的205个FFPE转移癌上以及源自其它癌症类型的转移灶上验证候选标记以测定特异性。选择10-基因标签(ten-gene signature)，其可以预测这6种癌症类型的转移癌起源组织。接着，为这10个标记(Marker)最优化RNA分离和qRT-PCR方法，并将qRT-PCR测定应用于一组260个转移肿瘤，从而产生78％的总准确度。最后，测试了独立的一组48个转移样品。重要的是，该组中的37个样品具有已知的原发癌，或最初表现为CUP、但是随后被辨别(resolved)，该测定表现出78％的准确度。
生物标记(Biomarker)是所示标记(Marker)基因的表达水平的任何征象(indicia)。该征象可以是直接的或间接的，且可以测量在给定生理参数下、与内部对照、正常组织或另一种癌相比，该基因的过度表达或表达不足。生物标记包括但不限于，核酸(过度表达和表达不足，直接的和间接的)。使用核酸作为生物标记，可以包括本领域已知的任何方法，包括但不限于，测量DNA扩增、RNA、微RNA(microRNA)、杂合性丢失(LOH)、单核苷酸多态性(SNPs，Brookes(1999))、微卫星DNA、DNA甲基化不足或过度甲基化。使用蛋白作为生物标记包括本领域已知的任何方法，包括但不限于，测量含量，活性，修饰如糖基化、磷酸化、ADP-核糖基化、泛素化等，或免疫组织化学(IHC)。其它生物标记包括成像、细胞计数和细胞凋亡标记。
本文提供的所示(indicated)基因是与特定肿瘤或组织类型相关的那些基因。标记基因可以与许多癌症类型相关，但是前提是，该基因的表达与使用本文所述分类树鉴定为对特定起源是特异性的一种肿瘤或组织类型足够相关，该基因可以用于本发明中，以确定原发起源不明癌(CUP)的起源组织。本领域已知许多与一种或多种癌症相关的基因。本发明提供了优选的标记基因和甚至更优选的标记基因组合。它们在本文中予以详述。
在“起源组织”中提及的“起源”是指组织类型(肺、结肠等)或组织学类型(腺癌、鳞状细胞癌等)，这取决于特定医学环境，且将被本领域技术人员所理解。
当标记基因含有SEQ ID NO指定的序列时，它与该序列相对应。当基因区段或片段含有足以辨别它是该基因的序列的参比序列或其互补序列的部分时，它与这样的基因的序列相对应。当基因表达产物的RNA、mRNA或cDNA与具有某序列(例如探针)的组合物杂交时，或者，在肽或蛋白的情况下，它由某mRNA编码时，基因表达产物与这样的序列相对应。当基因表达产物的区段或片段含有足以辨别它是该基因或基因表达产物的序列的参比基因表达产物或其互补序列的部分时，基因表达产物的区段或片段与这样的基因或基因表达产物的序列相对应。
本说明书中所述的和要求保护的本发明的方法、组合物、制品和试剂盒，包括一种或多种标记基因。“标记(Marker)”或“标记基因(Markergene)”在整个说明书中用于指与任何基因相对应的基因和基因表达产物，该基因的过度表达或表达不足与肿瘤或组织类型相关。在表1中更详细地描述了优选的标记基因。本文讨论的所有序列都在本文中有描述并且提供在序列表中。
表1
CUP组
SEQ ID NO：  基因名称  Affymetrix芯片指定
1  SP-B  209810_at
2  TTF1  211024_s_at
3  DSG3  205595_at
4  HPT1  209847_at
5  PSCA  205319_at
6  F5  204713_s_at
7  MGB1  206378_at
8  PDEF  220192_x_at
9  PSA  204582_s_at
10  WT1  206067_s_at
本发明提供了如下鉴别起源不明转移灶的起源的方法：测量含有转移细胞的样品中与至少2种不同癌有关的生物标记；将来自生物标记的数据组合进分类树中，其中所述分类树使用相对于参比标准化的生物标记；和施加优化每种生物标记的灵敏度和特异性的截止值，对癌的患病率加权和选择起源组织；基于通过分类树确定的最高概率确定起源，或确定该癌不是源自特定癌集合；和任选地测量一种或多种其它不同癌的特异性生物标记，视需要为其它生物标记重复所述步骤。
本发明提供了如下鉴别起源不明转移灶的起源的方法：获得含有转移细胞的样品；测量与至少2种不同癌有关的生物标记；将来自生物标记的数据组合进分类树中，其中所述分类树i)分类树使用相对于参比标准化的生物标记；和ii)施加优化每种生物标记的灵敏度和特异性的截止值，对癌的患病率加权和选择起源组织；基于通过分类树确定的最高概率确定起源，或确定该癌不是源自特定癌集合；和任选地测量一种或多种其它不同癌的特异性生物标记，和为其它生物标记重复步骤c)和d)。
在一个实施方案中，所述标记基因选自：i)SP-B、TTF、DSG3、KRT6F、p73H或SFTPC；ii)F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10或FKBP10；和/或iii)CDH17、CDX1或FABP1。优选地，所述标记基因是SP-B、TTF、DSG3、KRT6F、p73H和/或SFTPC。更优选地，所述标记基因是SP-B、TTF和/或DSG3。所述标记基因还可以包括或替换为KRT6F、p73H和/或SFTPC。
在一个实施方案中，所述标记基因是F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10和/或FKBP10。更优选地，所述标记基因是F5和/或PSCA。优选地，所述标记基因可以包括或替换为ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10和/或FKBP10。
在另一个实施方案中，所述标记基因是CDH17、CDX1和/或FABP1，优选CDH17。所述标记基因还可以包括或替换为CDX1和/或FABP1。
在一个实施方案中，使用SEQ ID NO：11-58中的至少一种，测量基因表达。
本发明也包括如下测量基因表达的方法：得到和测量扩增子SEQID NO：14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54和/或58中的至少一种的形成。
在一个实施方案中，所述标记基因可以选自从下述至少一种中选择的性别特异性标记：i)在男性患者情况下，KLK3、KLK2、NGEP或NPY；或ii)在女性患者情况下，PDEF、MGB、PIP、B305D、B726或GABA-Pi；和/或WT1、PAX8、STAR或EMX2。优选地，所述标记基因是KLK2或KLK3。在该实施方案中，所述标记基因可以包括或替换为NGEP和/或NPY。在一个实施方案中，所述标记基因是PDEF、MGB、PIP、B305D、B726或GABA-Pi，优选PDEF和MGB。在该实施方案中，所述标记基因可以包括或替换为PIP、B305D、B726或GABA-Pi。在一个实施方案中，所述标记基因是WT1、PAX8、STAR或EMX2，优选WT1。在该实施方案中，所述标记基因可以包括或替换为PAX8、STAR或EMX2。
本发明提供了下述方法：获取附加临床信息，包括转移部位，以确定癌的起源；得到对于癌最佳的生物标记集合，其包含下述步骤：使用已知起源的转移灶，测定其生物标记，并对比该生物标记与起源不明转移灶的生物标记；通过确定起源不明转移灶的起源和鉴别其适当治疗，提供治疗方向；通过确定起源不明转移灶的起源和鉴别其相应预后，提供预后。
本发明另外提供了下述发现生物标记的方法：测定特定转移灶中标记基因的表达水平，测量标记基因的生物标记以确定其表达，根据本文提供的任意方法或本领域已知的方法分析标记基因的表达并确定所述标记基因是否对起源肿瘤是有效特异性的。
本发明另外提供了组合物，其含有选自SEQ ID NO：11-58的至少一种分离的序列。本发明另外提供了试剂盒，其用于进行根据本文提供的方法的测定，且另外含有生物标记检测试剂。
本发明另外提供了用于进行本文所述方法的微阵列或基因芯片。
本发明另外提供了诊断/预后组合(portfolio)，其包含本文所述基因的组合(combination)的分离核酸序列、  它们的互补序列(complement)、或其部分，其中所述基因的组合足以测量或表征相比于不同癌或正常组织的细胞，含转移细胞的生物样品中的基因表达。
本发明所述的任意方法还可以包括，测量在样品中组成型表达的至少一种基因的表达。
优选地，胰腺癌的标记是凝血因子V(F5)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、整联蛋白、β6(ITGB6)、激肽释放酶10(KLK10)、密蛋白(claudin)18(CLDN18)、三件套蛋白同工型(trio isoform)(TR10)和类似于FK506结合蛋白的推定蛋白FLJ22041(FKBP10)。优选地，一起测量F5和PSCA的生物标记。除了F5和/或PSCA之外，或作为替代，可以测量ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10和FKBP10的生物标记。F5描述在例如20040076955；20040005563；和WO2004031412中。PSCA描述在例如WO1998040403；20030232350；和WO2004063355中。ITGB6描述在例如WO2004018999；和6339148中。KLK10描述在例如WO2004077060；和20030235820中。CLDN18描述在例如WO2004063355；和WO2005005601中。TR10描述在例如20020055627中。FKBP10描述在例如WO2000055320中。
优选地，结肠癌的标记基因是肠肽-相关转运蛋白HPT-1(CDH17)、尾型同源框转录因子1(CDX1)和脂肪酸结合蛋白1(FABP1)。优选地，单独测量CDH17的生物标记。除了CDH17的生物标记之外，或作为替代，可以测量CDX1和FABP1的生物标记。CDH17描述在例如Takamura等(2004)；和WO2004063355中。CDX1描述在例如Pilozzi等(2004)；20050059008；和20010029020中。FABP1描述在例如Borchers等(1997)；Chan等(1985)；Chen等(1986)；和Lowe等(1985)中。
优选地，肺癌的标记基因是表面活性剂蛋白-B(SP-B)、甲状腺转录因子(TTF)、桥粒芯糖蛋白3(DSG3)、角蛋白6同种型6F(KRT6F)、p53-相关基因(p73H)和表面活性剂蛋白C(SFTPC)。优选地，一起测量SP-B、TTF和DSG3的生物标记。除了SP-B、TTF和/或DSG3的生物标记中的任一种之外，或作为替代，可以测量KRT6F、p73H和SFTPC的生物标记。SP-B描述在例如Pilot-Mathias等(1989)；20030219760；和20030232350中。TTF描述在例如Jones等(2005)；20040219575；WO1998056953；WO2002073204；20030138793；和WO2004063355中。DSG3描述在例如Wan等(2003)；20030232350；WO2004030615；和WO2002101357中。KRT6F描述在例如Takahashi等(1995)；20040146862；和20040219572中。p73H描述在例如Senoo等(1998)；和20030138793中。SFTPC描述在例如Glasser等(1988)中。
所述标记基因可以进一步选自性别特异性标记，例如，在男性患者的情况下，KLK3、KLK2、NGEP或NPY；或在女性患者的情况下，PDEF、MGB、PIP、B305D、B726或GABA-Pi；和/或WT1、PAX8、STAR或EMX2。
优选地，乳腺癌的标记基因是前列腺衍生的上皮因子(PDEF)、乳腺珠蛋白(mammaglobin)(MG)、催乳素-诱导型蛋白(PIP)、B305D、B726和GABA-π。优选地，一起测量PDEF和MG的生物标记。除了PDEF和/或MG的生物标记之外，或作为替代，可以测量PIP、B305D、B726和GABA-Pi的生物标记。PDEF描述在例如WO2004030615；WO2000006589；WO2001073032；Wallace等(2005)；Feldman等(2003)；和Oettgen等(2000)中。MG描述在例如WO2004030615；20030124128；Fleming等(2000)；Watson等(1996和1998)；和5668267中。PIP描述在例如Autiero等(2002)；Clark等(1999)；Myal等(1991)和Murphy等(1987)中。B305D、B726和GABA-Pi描述在Reinholz等(2005)中。NGEP描述在例如Bera等(2004)中。
优选地，卵巢癌的标记是Wilm氏瘤1(WT1)、PAX8、类固醇生成急性调节蛋白(STAR)和EMX2。优选地，测量WT1的生物标记。除了WT1的生物标记之外，或作为替代，可以测量STAR和EMX2的生物标记。WT1描述在例如5350840；6232073；6225051；20040005563；和Bentov等(2003)中。PAX8描述在例如20050037010；Poleev等(1992)；Di Palma等(2003)；Marques等(2002)；Cheung等(2003)；Goldstein等(2002)；Oji等(2003)；Rauscher等(1993)；Zapata-Benavides等(2002)；和Dwight等(2003)中。STAR描述在例如Gradi等(1995)；和Kim等(2003)中。EMX2描述在例如Noonan等(2001)中。
优选地，前列腺癌的标记是KLK3、KLK2、NGEP和NPY。优选地，测量KLK3的生物标记。除了KLK3之外，或作为替代，可以测量KLK2、NGEP和NPY的生物标记。KLK2和KLK3描述在例如Magklara等(2002)中。KLK2描述在例如20030215835；和5786148中。KLK3描述在例如6261766中。
所述方法也可以包括，获取附加临床信息，包括转移部位，以确定癌的起源。在图3中提供了流程图。
本发明另外提供了如下得到对于癌最佳的生物标记集合的方法：使用已知起源的转移灶，测定其生物标记，并对比所述生物标记与起源不明转移灶的生物标记。
本发明另外提供了如下提供治疗方向的方法：根据本文所述方法确定起源不明转移灶的起源，和鉴别其适当治疗。
本发明另外提供了如下提供预后的方法：根据本文所述方法测定起源不明转移灶的起源，和鉴别其相应的预后。
本发明另外提供了发现生物标记的方法，其包括，测定特定转移灶中标记基因的表达水平，测量标记基因的生物标记以确定其表达，根据本文所述方法分析标记基因的表达，并确定所述标记基因是否对起源肿瘤是有效特异性的。
本发明另外提供了组合物，其包含选自SEQ ID NO：11-58的至少一种分离的序列。
本发明另外提供了用于进行本文所述测定的试剂盒、制品、微阵列或基因芯片、诊断/预后组合，和报告通过本发明方法得到的结果的患者报告。
很少发现，仅仅特定核酸序列在组织样品中的存在或不存在会有诊断或预后价值。另一方面，关于各种蛋白、肽或mRNA的表达的信息，日益显得重要。仅仅具有表达蛋白、肽或mRNA的潜力的核酸序列(这样的序列称作“基因”)本身在基因组中的存在，不能确定蛋白、肽或mRNA是否在给定细胞中表达。能表达蛋白、肽或mRNA的给定基因是否表达，这样的表达发生到什么程度，如果发生的话，由许多复杂因素决定。不考虑理解和评价这些因素的困难，测定基因表达可以提供关于重要事件的发生的有用信息，例如肿瘤发生、转移、细胞凋亡和其它临床相关的现象。在基因表达概况中，可以发现关于基因有活性或无活性程度的相关指示。本发明的基因表达概况用于为CUP提供诊断和治疗患者。
样品制备需要收集患者样品。在本发明的方法中使用的患者样品是怀疑含有患病细胞的样品，例如在组织细针抽吸(FNA)中从小结获得的细胞。从活组织检查或外科手术样品和激光捕获显微解剖得到的大组织制品也适用。激光捕获显微解剖(LCM)技术是一种选择要研究的细胞的方式，它使由细胞类型不均匀性造成的变异性最小化。因此，不难检测出正常或良性和癌性细胞之间的标记基因表达的中等或小变化。样品也可以包含从外周血提取的循环上皮细胞。这些可以根据许多方法得到，但是最优选的方法是6136182所述的磁分离技术。一旦已得到含有目标细胞的样品，使用适当组合中的基因的生物标记获取基因表达概况。
确立基因表达概况的优选方法包括，测定由可以编码蛋白或肽的基因产生的RNA量。这可以通过下述方法实现：逆转录酶PCR(RT-PCR)、竞争RT-PCR、实时RT-PCR、差示RT-PCR、RNA叩迹分析和其它相关试验。尽管可能使用单个PCR反应进行这些技术，但最好扩增从mRNA产生的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)，并通过微阵列分析它。许多不同的阵列构型和它们的生产方法是本领域技术人员已知的，记载在例如5445934；5532128；5556752；5242974；5384261；5405783；5412087；5424186；5429807；5436327；5472672；5527681；5529756；5545531；5554501；5561071；5571639；5593839；5599695；5624711；5658734；和5700637中。
微阵列技术允许同时测量数千个基因的稳态mRNA水平，从而为鉴定如不受控制的细胞增殖的开始、停滞或调节的作用提供强有力的工具。目前广泛使用两种微阵列技术，cDNA阵列和寡核苷酸阵列。虽然这些芯片存在构造差异，但是基本上所有的下游数据分析和输出是相同的。这些分析的结果一般是从用于检测与微阵列中已知位置的核酸序列杂交的样品中cDNA序列的标记探针接收的信号强度的测量值。通常，信号强度与在样品细胞中表达的cDNA以及因此mRNA的量成比例。大量的这种技术是可得和有用的。确定基因表达的优选的方法可参见，6271002；6218122；6218114；和6004755。
可以通过比较所述信号强度来分析表达水平。这最好通过生成试验样品与对照样品中基因表达强度的比率矩阵来进行。例如，可以把患病组织的基因表达强度与从相同类型的良性或正常组织中产生的表达强度进行比较。这些表达强度的比率显示了试验样品与对照样品之间在基因表达中的倍数改变。
选择可以基于统计学检验，所述统计学检验产生与肿瘤原始起源部位相关因子之间各基因差别表达的显著性证据有关的排序表。这样的检验的实例包括ANOVA和Kruskal-Wallis。排序可以用作模型中的权重，所述模型设计用于将这些加权的总和(最高达截止值)解释为有利于一类胜过另一类的优势证据。文献所述的以前证据也可以用于调节权重。
在本发明中，选择了10个标记，它们在6个肿瘤类型中表现出显著的差别表达证据。选择过程包括，统计学检验的特别收集，均值方差最优化，和专家知识。在一个替代实施方案中，可以使特征提取方法自动化，以通过监督学习方法选择和测试标记。随着数据库的产生，可以重复标记的选择以在任意给定数据库状态产生可能的最高诊断准确度。
优选实施方案是，通过鉴别稳定的对照集合和将该集合换算至所有样品间零方差来标准化每个测量值。该对照集合定义为任意单个内源转录物，或内源转录物的集合，其受测定中的系统误差影响，且不清楚其独立于该误差而变化。用样品特异性的因子调节所有标记，所述因子对于对照集合(例如平均值或中值)的任意描述性统计或对于直接测量产生零方差。或者，如果对照变化仅与系统误差有关的前提不成立，然而进行标准化时产生的分类误差更小，对照集合将仍然按照所述使用。非内源掺加(spike)对照也是有用的，但不是优选的。
用可从The Mathworks购得的Matlab函数‘treefit’构建分类树。该函数基于Breiman，L.，Classification and Regression Trees，Chapman &Hall，Boca Raton(1993)所描述的工作。
所述代码按照下述次序执行下述步骤，使用安装了StatisticalToolbox的Matlab版本7.3.0(http://www.mathworks.com)。术语treefit指在Statistical Toolbox名字空间(name space)的treefit函数中产生的树。
1)对于所有可用的训练集合样品将10个标记基因和2个对照的CT值保存在硬驱动器上。
2)对于每个样品，从每个标记减去对照的样品特异性的平均值，标准化10个标记基因值。
3)训练数据集由已知起源部位的转移灶组成，其中每个样品具有至少一个标记的起源组织的特异性靶标记，其具有舍入到小于5的最近整数值的标准化CT值。
4)用Treefit从(3)的训练数据构建7个树。为了分裂，含有2个或更多类别的各节点必须具有10个或更多个观察结果。选择分裂的标准是Gini多样性指数。先验概率对于任何特定树中所用的各类别都是相同的。将各树修剪至低于100个10倍交叉验证所确定的最小代价的一个水平。用Matlab Statistical Toolbox函数‘treetest’确定各修剪水平的代价。一组3个树是男性特异性的，其中一个树对应于肺背景组织，另一个树对应于结肠背景，一个普通树对应于非结肠、肺、胰或前列腺的任何其他背景。有4个特异性女性树：结肠背景树、肺背景树、卵巢背景树和用于对应非乳腺、结肠、肺、胰或卵巢的任何其他背景的普通树。各男性特异性树不使用WT1、MG和PDEF，因为男性特异性树不试图分类乳腺或卵巢样品。同样，女性特异性树不使用KLK3，因为前列腺不在女性树中用作一个类别。结肠背景特异性树不使用HPT1。肺背景特异性树不使用HUMP、TTF1或DSG3。卵巢背景的特异性树不使用WT1。
为了测试样品：
1)读入试验数据集。
2)产生2个对照的样品特异性的平均值。
3)对于每个样品，从每个标记减去样品特异性的平均值。
4)用40替换从40个原始CT产生的任何标准化的CT。
5)对于试验集合中的每个样品，测试下述内容。
a.如果2个对照的平均值大于34，则将该样品标记为‘CTR_FAILURE’，其中后验概率为0。
b.检查结肠、卵巢或肺的背景。如果发现匹配，则还检查性别。随后用背景和性别特异性树评价样品。
c.如果发现乳腺、胰、肺SCC或前列腺作为背景标记，则给予该样品‘FAILURE_ineligible_样品’的标记，且后验概率都设定为0。
d.男性或女性的普通树用于所有其它样品。
基于各遇到的节点的截断值，可从指定的树根节点开始，沿着路径直至终点树叶，从而产生步骤5b-d所确定的分类结果。或者，可用功能与Matlab Statistical Toolbox函数‘treeval’类似的程序来产生结果并写入文件。
本发明包括通过该方法得到的基因表达组合。
基因表达概况也可用很多方式展示。最常用的是将原始荧光强度或比率矩阵排列为树形图，其中的列表示试验样品，行表示基因。这样排列数据，以便具有相似表达概况的基因彼此接近。每个基因的表达比用颜色显示。例如，小于1的比率(下调)出现在谱的蓝色部分，而大于1的比率(上调)出现在谱的红色部分。商业化可得的计算机软件程序可用于展示这种数据，包括“GeneSpring”(Silicon Genetics，Inc.)和“Discovery”以及“Infer”(Partek，Inc.)。
从原发性肿瘤或已知起源的原发肿瘤的转移性肿瘤收集独特RNA种类的丰度的测量。利用这些读数以及临床记录，包括但不限于，患者的年龄、性别、原发性肿瘤的起始部位、和转移部位(如果适用)来产生关系数据库。所述数据库用于选择RNA转录物和临床因子，它们可以用作预测转移肿瘤的原发起源的标记变量。
在测量蛋白水平以确定基因表达的情况下，本领域已知的任何方法都是适用的，前提是它导致充分的特异性和灵敏性。例如，通过结合蛋白的特异性抗体或抗体片段，并测量抗体-结合的蛋白的量，可以测量蛋白水平。可以用放射性的、荧光的或其它可检测的试剂标记抗体，以促进检测。检测的方法包括但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹技术。
在实施例中描述了在本发明的方法中使用的受调节的基因。与具有不同起源癌的那些患者相比，差别表达的基因在具有特定起源癌的患者中受到上调或下调。上调和下调是相对的术语，指发现的基因表达量相对于一些基线的可检测的差异(超过用于测量它的系统中的噪音的影响)。在该情况下，基于分类树来确定基线。然后，使用相同的测量方法，相对于基线水平上调或下调患病细胞中的目标基因。在本上下文中，患病的指身体状态的改变，其中断或扰乱，或可能扰乱身体功能的正确性能，如细胞的不受控制的增殖所发生的。当一个人的基因型或表型的一些方面与疾病的存在相一致时，即可诊断他患有疾病。但是，进行诊断或预后的行为可以包括确定疾病/状态问题，例如确定复发的可能性，治疗的类型和治疗监控。在治疗监控中，通过对比随时间推移的基因表达，来确定基因表达概况是否已经变化，或正在变化成与正常组织更相一致的模式，来作出关于给定治疗过程效果的临床判断。
可以将基因分组，从而使得关于组中基因集合的所得信息能提供临床上作出相关判断(例如诊断、预后或治疗选择)的可靠基础。这些基因集合构成本发明的组合。与大多数诊断标记一样，经常需要使用足以作出正确的医学判断的最少数目的标记。这可以防止未决分析造成治疗延迟，以及无效地利用时间和资源。
确立基因表达组合的一个方法是通过使用最优化算法，如广泛用于确立股票组合的均值方差算法。这种方法详细描述于20030194734。实质上，这种方法要求确立一组输入值(金融应用中的股票，这里指通过强度测量的表达)，该输入值将最优化人们使用其接受的返回值(例如形成的信号)，同时使返回值的变异性最小化。很多商业软件程序可以用来进行这种操作。在整个说明书中称为“Wagner软件”的“Wagner联合均值-方差最优化应用(Wagner Associates Mean-VarianceOptimization Application)”是优选的。这个软件使用“Wagner联合均值-方差最优化文库(Wagner Associates Mean-Variance OptimizationLibrary)”的功能来测定有效的边界，且在Markowitz意义上的最佳组合是优选的。Markowitz(1952)。使用这种类型的软件要求转换微阵列数据，以便当该软件用于其打算的金融分析目的时，数据能以使用股票返回值和风险测量值的方式作为输入值而处理。
选择组合的方法也包括启发式规则的应用。优选地，这些规则是基于生物学和用于产生临床结果的技术的理解而制定的。更优选地，它们可用于从最优化方法中输出。例如，组合选择的均值方差方法可用于癌症受试者中大量差异表达的基因的微阵列数据。从该方法中得到的输出值将是一组最优化的基因，其可包括一些在外周血液中和患病组织中表达的基因。如果用于测试方法中的样品是获自外周血液的，而且在癌中差异表达的某些基因也能在外周血中差异表达，那么就可以应用启发式规则，其中从排除了在外周血中差异表达的那些的有效边界中选择组合。当然，通过例如在数据预选择过程中运用该规则，可以在形成有效边界前应用该规则。
也可以应用与所讨论的生物学不必然相关的其它启发式规则。例如，人们可以应用只有规定百分比的组合可被特定的基因或基因的组所代表的规则。商业化可得的软件，如Wagner软件，容易提供这些类型的启发式法。这也是有用的，例如，当准确度和精确度以外的因素(如预期的许可费)，对包括一个或多个基因的希求有影响时。
本发明的基因表达概况也可以与在癌症诊断、预后或治疗监控中有用的其它非遗传诊断方法联用。例如，在一些情况下，把上述的基于基因表达的方法的诊断能力与来自常规标记如血清蛋白标记(例如，癌抗原27.29(“CA 27.29”))的数据结合起来是有益的。存在一系列这种标记，包括分析物，如CA 27.29。在一种这样的方法中，从被治疗的患者中周期性采血，然后对上述血清标记之一进行酶免疫测定。当标记的浓度提示肿瘤复发或治疗失败时，取得可进行基因表达分析的样品源。当存在可疑肿块时，可以进行细针抽吸(FNA)，然后如上所述对从肿块采集的细胞的基因表达概况进行分析。或者，可以从与先前取出肿瘤的组织相邻的区域采集组织样品。当其它测试所得结果不明确时，这种方法特别有用。
根据本发明制备的试剂盒包括用于确定基因表达概况的格式化测定用品。这些可以包括进行测定所需的所有或一些材料，如试剂和说明书和测定生物标记的介质。
本发明的制品包括用于治疗、诊断、预后或者评价疾病的基因表达概况的表示方式(representation)。这些概况表示方式复原成可被机器自动读取的介质，如计算机可读介质(磁性的、光学的等)。制品也可包括在这种介质中评价基因表达概况的说明书。例如，制品可包括CD ROM，它具有用于对比上述基因组合的基因表达概况的计算机说明书。制品也可包括数字化地记录在其中的基因表达概况，以便其可以用于与患者样品的基因表达数据进行比较。或者，概况可以不同的表示形式记录。图形记录就是这样一种格式。例如上面提到的整合在Partek，Inc.的“DISCOVERY”和“INFER”软件中的聚类算法能最好地协助目测这些数据。
本发明制品的不同类型是用于揭示基因表达概况的介质或格式化测定。这些可以包括，例如，微阵列，其中序列互补体或探针固定于基质上，指示目标基因的序列与之结合从而产生关于其存在的可读测定。或者，本发明的制品可被制作成试剂盒，以用于进行指示用于检测癌症的目标基因表达水平的杂交、扩增和信号产生。
提供下面的实施例用于解释而不是限制本发明。本文引用的所有参考文献都在本文中引作参考。
实施例1
材料和方法
胰腺癌标记基因发现。
使用Trizol，从胰腺肿瘤、正常胰腺、肺、结肠、乳腺和卵巢组织分离RNA。然后，将RNA用于产生扩增的、标记的RNA(Lipshutz等(1999))，其随后在Affymetrix U133A阵列上杂交。然后以2种方式分析数据。
组织样品
在第一种方法中，过滤该数据集，以仅保留在整个数据集间具有至少2次存在信号(present calls)的那些基因。该过滤剩下14,547个基因。与正常胰腺相比，测得2,736个基因在胰腺癌中过度表达，p值小于0.05。与肺和结肠组织中发现的最大强度相比，2,736个基因中的45个基因也过度表达至少2倍。最后，与肺、结肠、乳腺和卵巢组织中发现的最大强度相比，发现了6个探针集合过度表达至少2倍。
在第二种方法中，过滤该数据集，以仅保留在乳腺、结肠、肺、和卵巢组织中具有不超过2次存在信号的那些基因。该过滤剩下4,654个基因。发现4,654个基因中的160个基因在胰腺组织(正常和癌症)中具有至少2次存在信号。最后，选择了8个探针集合，它们在胰腺癌和正常组织之间表现出最大差别表达。
从许多商业卖主，获取共260个FFPE转移和原发组织。测试的样品包括：30个乳腺转移、30个结肠直肠转移、56个肺转移、49个卵巢转移、43个胰转移、18个前列腺原发和2个前列腺转移、和32个其它起源(6个胃、6个肾、3个喉、2个肝、1个食管、1个咽、1个胆管、1个胸膜、3个膀胱、5个黑素瘤、3个淋巴瘤)。
RNA提取。
根据高纯RNA石蜡试剂盒手册(Roche)所述的方法和试剂，经下述改进，从石蜡组织切片分离RNA。根据包埋的转移灶的大小(2-5mm＝9×10μm，6-8mm＝6×10μm，8-≥10mm＝3×10μm)，将石蜡包埋的组织样品切片，置于RNA酶/DNA酶1.5ml Eppendorf管中。如下将切片脱蜡：涡旋震荡10-20秒后，室温下在1ml二甲苯中温育2-5分钟。然后离心管，取出上清液，重复脱蜡步骤。取出上清液后，加入1ml乙醇，将样品涡旋震荡1分钟，离心，取出上清液。将该过程再重复一次。取出剩余的乙醇，在55℃烘箱中干燥沉淀5-10分钟，重悬于100μl组织裂解缓冲液、16μl 10％SDS和80μl蛋白酶K。涡旋震荡样品，55℃在设定为400rpm的热混合仪(thermomixer)中温育2小时。向每个样品加入325μl结合缓冲液和325μl乙醇，然后混合，离心，且将上清液加到过滤器柱上。将过滤器柱连同收集管以8000rpm离心1分钟，弃去流出物。进行一系列连续洗涤(500μl洗涤缓冲液I→500μl洗涤缓冲液II→300μl洗涤缓冲液II)，其中将每种溶液加到柱中，离心并弃去流出物。然后将柱以最大速度离心2分钟，置于新鲜的1.5ml管中，且加入90μl洗脱缓冲液。室温温育1分钟，随后以8000rpm离心1分钟后得到RNA。通过加入10μl DNA酶温育缓冲液、2μl DNA酶I，并在37℃温育30分钟对样品进行DNA酶处理。在加入20μl组织裂解缓冲液、18μl 10％SDS和40μl蛋白酶K后，灭活DNA酶。再次，将325μl结合缓冲液和325μl乙醇加入每个样品中，然后混合，离心，将上清液加到过滤器柱上。如上所述进行RNA的连续洗涤和洗脱，例外是，使用50μl洗脱缓冲液洗脱RNA。为了消除从柱携带的玻璃纤维污染，将RNA全速离心2分钟，且将上清液移入新鲜的1.5mlEppendorf管。通过分光光度计得到的OD 260/280读数来定量样品，将样品稀释至50ng/μl。将分离的RNA在-80℃保藏在无RNA酶的水中备用。
Figure A20088001053600221
引物和探针设计。
适当mRNA参比序列登录号以及Oligo 6.0用于开发
Figure A20088001053600222
CUP测定(肺标记：人表面活性剂、肺-相关蛋白B(SP-B)、甲状腺转录因子1(TTF1)、桥粒芯糖蛋白3(DSG3)，结肠直肠标记：钙粘着蛋白17(CDH17)，乳房标记：乳腺珠蛋白(MG)、前列腺-衍生的ets转录因子(PDEF)，卵巢标记：wilms瘤1(WT1)，胰标记：前列腺干细胞抗原(PSCA)、凝血因子V(F5)，前列腺标记激肽释放酶3(KLK3))和持家测定β肌动蛋白(β-Actin)，羟甲基胆色烷合酶(PBGD)。在表2中列出了各测定的引物和水解探针。通过设计外显子-内含子剪接位点周围的测定，排除基因组DNA扩增。在5′核苷酸处用FAM作为报道染料、且在3′核苷酸处用BHQ1-TT作为内部猝灭染料，标记水解探针。
定量实时聚合酶链反应。
在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)上，在384孔板中定量基因-特异性RNA。对于每个热循环仪运行，放大校准器和标准曲线。每个标记的校准器由在大鼠肾的载体RNA中以1×105拷贝稀释的靶基因体外转录物组成。持家标记的标准曲线由在大鼠肾的载体RNA中以1×107、1×105和1×103拷贝系列稀释的靶基因体外转录物组成。在每个测定运行中也包括无靶对照，以确保没有环境污染。所有样品和对照都一式两份运行。使用实验室通用试剂，在10μl反应物中进行qRT-PCR，所述反应物含有：RT-PCR缓冲液(50nM N-二(羟乙基)甘氨酸/KOH pH8.2，115nM KAc，8％甘油，2.5mM MgCl2，3.5mMMnSO4，0.5mM每种dCTP、dATP、dGTP和dTTP)，添加物(2mM Tris-ClpH8，0.2mM牛清蛋白，150mM海藻糖，0.002％Tween20)，酶混合物(2U Tth(Roche)，0.4mg/μl Ab TP6-25)，引物和探针混合物(0.2μM探针，0.5μM引物)。遵从下述循环参数：95℃，1分钟，1轮；55℃，2分钟，1轮；斜升(Ramp)5％；70℃，2分钟，1轮；和95℃，15秒，58℃，30秒，40轮。完成PCR反应后，在ABI 7900HT Prism软件中设定基线和阈值，且将计算的Ct值输出到Microsoft Excel中。
一步与两步反应。
各反应使用100ng随机六聚体或基因特异性的引物，进行第一链合成。在第一步中，将11.5μl混合物-1(引物和1ug总RNA)加热至65℃，5分钟，然后在冰上冷却。将8.5μl混合物-2(1x缓冲液，0.01mMDTT，0.5mM每种dNTP’s，0.25U/μl
Figure A20088001053600231
10U/μl Superscript III)加入混合物-1，在50℃温育60分钟，然后在95℃温育5分钟。将cDNA保藏在-20℃备用。如上所述进行两步反应的第二步的qRT-PCR，循环参数如下：95℃，1分钟，1轮；95℃，15秒，58℃，30秒，40轮。精确如前段所述，进行一步反应的qRT-PCR。一步和两步反应都在100ng模板(RNA/cDNA)上进行。完成PCR反应后，在ABI 7900HTPrism软件中设定基线和阈值，且将计算的Ct值输出到Microsoft Excel中。
热图的产生。
对于各样品，通过取各CUP标记的平均Ct，减去持家标记平均值的平均Ct来计算ΔCt(ΔCt＝Ct(CUP标记)-Ct(Ave.HK标记))。测定各样品的各起源组织标记集合(肺、乳房、前列腺、结肠、卵巢和胰)的最小ΔCt。将具有总最小ΔCt的起源组织评分为1，且所有其它起源组织评分为0。根据病理学诊断，分选数据。用修饰的可行性数据计算Partek Pro，且产生强度图。
结果。
新胰腺起源肿瘤和癌症状态标记的发现。
首先，分析了5个候选胰腺标记物：前列腺干细胞抗原(PSCA)、丝氨酸蛋白酶抑制剂，进化枝A成员1(SERPINA1)、细胞角蛋白7(KRT7)、基质金属蛋白酶11(MMP11)和粘蛋白4(MUC4)(Varadhachary等(2004)；Fukushima等(2004)；Argani等(2001)；Jones等(2004)；Prasad等(2005)；和Moniaux等(2004))，其中使用DNA微阵列和一组13个胰管腺癌，5个正常胰腺组织，和98个乳腺、结肠直肠、肺和卵巢肿瘤的样品。仅PSCA表现出高特异性(91/98或93％被正确地鉴别为非胰腺起源)的中等灵敏度(检测了6/13或46％的胰腺肿瘤)(图4A)。相反，KRT7、SERPINA1、MMP11和MUC4分别表现出在特异性分别为66％、91％、82％和81％的38％、31％、85％和31％的灵敏度。这些数据与在27个胰腺起源转移和39个非胰腺起源转移上为所有标记进行的qRT-PCR十分一致，例外是MMP11，它在qRT-PCR和转移中表现出更差的灵敏度和特异性。总之，在骤冻的、原发组织上的微阵列数据可以用作标记能力的良好指示物，从而能采用qRT-PCR将FFPE转移鉴别为胰腺起源，但是其它标记可能对最佳性能有用。
因为胰管腺癌从管上皮细胞发展而来，所述管上皮细胞仅占所有胰腺细胞的少量百分比(其中腺泡细胞和胰岛细胞占大多数)，且因为胰腺癌组织含有显著量的邻近正常组织(Prasad等(2005)；和Ishikawa等(2005))，所以已经难以鉴别还能将该器官从器官中区分开的胰腺癌标记(即，在癌症中上调的)。对于在CUP组中的用途，这样的区分是必需的。第一种查询方法(见材料和方法)返回6个探针集合：凝血因子V(F5)、类似于FK506结合蛋白的推定蛋白FLJ22041(FKBP10)、β6整联蛋白(ITGB6)、转谷氨酰胺酶2(TGM2)、异质核内核糖核蛋白A0(HNRPA0)和BAXδ(BAX)。第二种查询方法(见材料和方法)返回8个探针集合：F5、TGM2、配对-样同源域转录因子1(PITX1)、三件套蛋白同工型mRNA(TRIO)、p73H的mRNA(p73)、MGC：10264的一种未知蛋白(SCD)和密蛋白18的2个探针集合。F5和TGM2存在于2种查询结果中，且在二者中，F5似乎最有前途(图4B)。
使用FFPE组织最优化样品制备和qRT-PCR。
接着，在检查标记组性能之前，使用固定的组织最优化RNA分离和qRT-PCR方法。首先，分析了将蛋白酶K温育时间从16小时减小至3小时的作用。对产量没有作用。但是，当使用更短的蛋白酶K步骤时，有些样品表现出更长的RNA片段(图5)。例如，当RNA是从1年龄块(C22)中分离时，在电泳图谱中没有观察到差异。但是，当RNA是从5年龄块(C23)中分离并使用更短的蛋白酶K消化时，观察到更大部分的更高分子量RNA，如肩峰评估的。当加工其它样品时，该趋势通常会保持，无论FFPE转移的起源器官。总之，缩短蛋白酶K消化时间不牺牲RNA产量，且可能有助于分离更长的、更少降解的RNA。
接着，对比了3种不同的逆转录方法：使用随机六聚体的逆转录、随后用qPCR(2步)，使用基因-特异性的引物的逆转录、随后用qPCR(2步)，和使用基因-特异性的引物的一步qRT-PCR。从11个转移灶分离RNA，并横过3种方法对比β-肌动蛋白、人表面活性剂蛋白B(HUMSPB)、和甲状腺转录因子(TTF)的Ct值(图6)。所有对比都存在统计学显著的差异(p＜0.001)。对于所有3个基因，使用随机六聚体的逆转录、随后用qPCR(2步反应)产生最高的Ct值，而使用基因-特异性引物的逆转录、随后用qPCR(2步反应)产生比相应的1步骤反应略微(但是统计学显著的)更低的Ct值。但是，使用基因-特异性的引物的2步骤RT-PCR具有更长的逆转录步骤。当将每个样品的HUMSPB和TTF Ct值对相应的β-肌动蛋白值标准化时，3种方法之间的标准化的Ct值没有差异。总之，最优化RT-PCR反应条件可以产生更低的Ct值，这可以辅助分析更老的石蜡块(Cronin等(2004))，且使用基因-特异性引物的一步RT-PCR反应可以产生与在相应的2步反应中产生的Ct值相当的Ct值。
CUP qRT-PCR测定的诊断性能。
接着，在239 FFPE转移灶上进行12次qRT-PCR反应(10标记和2个持家基因)。在表2中显示了测定所用的标记。肺标记是人表面活性剂肺-相关蛋白B(HUMPSPB)、甲状腺转录因子1(TTF1)和桥粒芯糖蛋白3(DSG3)。结肠直肠标记是钙粘着蛋白17(CDH17)。乳腺标记是乳腺珠蛋白(MG)和前列腺-衍生的Ets转录因子(PDEF)。卵巢标记是Wilms瘤1(WT1)。胰腺标记是前列腺干细胞抗原(PSCA)和凝血因子V(F5)，前列腺标记是激肽释放酶3(KLK3)。关于基因描述，见表28。
表2.引物和探针序列、登录号和扩增子长度。
靶   SEQIDNO 序列(5′-3′) 描述   SEQIDNO
  SP-B   59   cacagccccgacctttgatga   正向引物   11
  ggtcccagagcccgtctca   反向引物   12
  agctgtccagctgcaaaggaaaagcc   探针*   13
  cacagccccgacctttgatgagaactcagctgtccagctgcaaaggaaaagccaagtgagacgggctctgggacc 扩增子 14
  TTF1   60   ccaacccagacccgcgc   正向引物   15
  cgcccatgccgctcatgttca   反向引物   16
  cccgccatctcccgcttcatg   探针*   17
  ccaacccagacccgcgcttccccgccatctcccgcttcatgggcccggcgagcggcatgaacatgagcggcatgggcg 扩增子 18
  DSG3   61   gcagagaaggagaagataactcaa   正向引物   19
  actccagagattcggtaggtga   反向引物   20
  attgccaagattacttcagattacca   探针*   21
  gcagagaaggagaagataactcaaaaagaaacccaattgccaagattacttcagattaccaagcaacccagaaaatcacctaccgaatctctggagt   扩增子   22
  CDH17   62   tccctcggcagtggaagctta   正向引物   23
  tcctcaaactctgtgtgcctggta   反向引物   24
  ccaaaatcaatggtactcatgcccgactg   探针*   25
  tccctcggcagtggaagcttacaaaacgactgggaagtttccaaaatcaatggtactcatgcccgactgtctaccaggcacacagagtttgagga   扩增子   26
  MG   63   agttgctgatggtcctcatgc   正向引物   27
  cacttgtggattgattgtcttgga   反向引物   28
  ccctctcccagcactgctacgca   探针*   29
  agttgctgatggtcctcatgctggcggccctctcccagcactgctacgcaggctctggctgccccttattggagaatgtgatttccaagacaatcaatccacaagtg   扩增子   30
  PDEF   64   cgcccacctggacatctgga   正向引物   31
  cactggtcgaggcacagtagtga   反向引物   32
  gtcagcggcctggatgaaagagcgg   探针*   33
  cgcccacctggacatctggaagtcagcggcctggatgaaagagcggacttcacctggggcgattcactactgtgcctcgaccagtg 扩增子 34
WT1 65 gcggagcccaatacagaatacac   正向引物   35
  cggggctactccaggcaca   反向引物   36
  tcagaggcattcaggatgtgcgacg   探针*   37
  gcggagcccaatacagaatacacacgcacggtgtcttcagaggcattcaggatgtgcgacgtgtgcctggagtagccccg   扩增子   38
  PSCA   66   ctgttgatggcaggcttggc   正向引物   39
  ttgctcacctgggctttgca   反向引物   40
  gcagccaggcactgccctgct   探针*   41
  ctgttgatggcaggcttggccctgcagccaggcactgccctgctgtgctactcctgcaaagcccaggtgagcaa 扩增子 42
  F5   67   tgaagaaatatcctgggattattca   正向引物   43
  tatgtggtatcttctggaatatcatca   反向引物   44
  acaaagggaaacagatattgaagactc   探针*   45
  tgaagaaatatcctgggattattcagaatttgtacaaagggaaacagatattgaagactctgatgatattccagaagataccacata 扩增子 46
  KLK3   68   cccccagtgggtcctcaca   正向引物   47
  aggatgaaacaagctgtgccga   反向引物   48
  caggaacaaaagcgtgatcttgctgg   探针*   49
  cccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcttgtttcatcct 扩增子 50
  β肌动蛋白 69 gccctgaggcactcttcca 正向引物 51
  cggatgtccacgtcacacttca   反向引物   52
  cttccttcctgggcatggagtcctg   探针*   53
  gccctgaggcactcttccagccttccttcctgggcatggagtcctgtggcatccacgaaactaccttcaactccatcatgaagtgtgacgtggacatccg 扩增子 54
  PBGD   70   ccacacacagcctactttccaa   正向引物   55
  tacccacgcgaatcactctca   反向引物   56
  aacggcaatgcggctgcaacggcggaa   探针*   57
  ccacacacagcctactttccaagcggagccatgtctggtaacggcaatgcggctgcaacggcggaagaaaacagcccaaagatgagagtgattcgcgtgggta 扩增子 58
*探针是5′FAM-3′BHQ1-TT
分析热图中的标准化的Ct值，揭示了乳腺和前列腺标记的高特异性，结肠、肺和卵巢的中等特异性，和胰腺标记略低的特异性。组合标准化的qRT-PCR数据和计算精制，提高了标记组的性能。从标准化的qRT-PCR数据与线性判别分析的组合得到结果，并确定qRT-PCR测定的准确度。
讨论
在该实施例中，在原发性肿瘤上使用基于微阵列的表达概况分析，以鉴别用于转移的候选标记。原发性肿瘤可以用于发现转移的起源肿瘤标记的事实，与最近的几项发现相一致。例如，Weigelt及同事已经表明，原发乳腺肿瘤的基因表达概况在远距离转移中保持。Weigelt等(2003)。Italiano及同事发现，通过IHC评估的EGFR状态在80个原发结肠直肠肿瘤和80相关转移中类似。Italiano等(2005)。80个中仅5个表现出EGFR状态不一致。Italiano等(2005)。Backus及同事鉴别出了用于检测乳腺癌转移的推定标记，其中使用乳腺和其它组织的全基因组的基因表达分析，并证实乳腺珠蛋白和CK19检测乳腺警戒淋巴结中临床上起作用的转移有90％灵敏度和94％特异性。Backus等(2005)。
使用原发组织进行的基于微阵列的研究证实了已知标记的特异性和灵敏度。结果，除了F5以外，使用的所有标记都对这里研究的组织具有高特异性。Argani等(2001)；Backus等(2005)；Cunha等(2005)；Borgono等(2004)；McCarthy等(2003)；Hwang等(2004)；Fleming等(2000)；Nakamura等(2002)；和Khoor等(1997)。最近的研究使用IHC确定，PSCA在前列腺癌转移中过度表达。Lam等(2005)。Dennis等(2002)也证实，PSCA可以用作胰腺和前列腺的肿瘤起源标记。如本文所显示的，在RNA水平发现有些前列腺组织中PSCA的强表达，但是由于在测定中包含PSA，所以现在可以分离前列腺和胰腺癌。该研究的一项新发现是，使用F5作为胰腺起源组织的互补(与PSCA互补)标记。在微阵列数据集(含原发组织)和qRT-PCR数据集(含FFPE转移)中，发现F5与PSCA互补(图4和表3)。
表3可行性数据
          乳腺    结肠   肺     其它   卵巢   胰腺   前列腺  总数
试验的
          30      30     56     32     49     43     20      260
总数
#正确     22      27     45     16     43     31     20      204
#其它/
          1       1      3      n/a    1      4      0       10
未测试
#错误     7       2      8      16     5      8      0       46
％测试的  96.67   96.67  94.64  100    97.96  90.70  100     96.15
％测试的
          75.86   93.10  84.91  0      89.58  79.49  100     81.60
正确的
总的正确
          73.33   90.00  80.36  50.00  87.76  72.09  100     78.46
的(％)
以前的研究人员已经使用IHC或微阵列生成了CUP测定。Su等(2001)；Ramaswamy等(2001)；和Bloom等(2004)。最近，已经将SAGE与小qRT-PCR标记组相结合。Dennis(2002)；和Buckhaults等(2003)。该研究首次组合了基于微阵列的表达概况分析和小组qRT-PCR测定。使用原发组织的微阵列研究鉴别出了一些、但不是所有与以前通过SAGE研究鉴别出的标记相同的起源组织标记。一些研究已经证实，基于SAGE和DNA微阵列的概况分析数据之间存在中等一致性，且该相关性对于具有更高表达水平的基因提高。van Ruissen等(2005)；和Kim(2003)。例如，Dennis及同事鉴别出了PSA、MG、PSCA和HUMSPB，而Buckhaults及同事(Dennis等(2002))鉴别出了PDEF。使用qRT-PCR执行CUP测定是优选的，因为它是有力的技术，且可能具有胜过IHC的性能优点。Al-Mulla等(2005)；和Haas等(2005)。如本文所示，通过在一步反应中使用基因-特异性的引物，改进了qRT-PCR方案。这首次证实了基因-特异性的引物在含有FFPE组织的一步qRT-PCR反应中的应用。其它研究人员已经进行了2步qRT-PCR(在一个反应中合成cDNA，随后qPCR)，或已经使用随机六聚体或截短的基因-特异性的引物。Abrahamsen等(2003)；Specht等(2001)；Godfrey等(2000)；Cronin等(2004)；和Mikhitarian等(2004)。
实施例2
CUP FFPE总RNA分离方案
(高纯试剂盒目录号3270289)
目的：
从FFPE组织分离总RNA
程序：
工作溶液的制备
1.试剂盒中的蛋白酶K(PK)
将冻干物溶于4.5ml洗脱缓冲液。等分试样且保藏于-20℃，稳定12个月。
PK-4×250mg(目录号3115852)
将冻干物溶于12.5ml洗脱缓冲液(1x TE缓冲液(pH7.4-7)。等分试样且保藏于-20℃。
2.洗涤缓冲液I
将60ml无水乙醇加入洗涤缓冲液I，在室温保藏。
3.洗涤缓冲液II
将200ml无水乙醇加入洗涤缓冲液II，在室温保藏。
4.DNA酶I
将冻干物溶于400μl洗脱缓冲液。等分试样且保藏于-20℃，稳定12个月。
将石蜡块切片约30-45分钟，12块(12块×2管＝24管)
从块上切下的切片应当立即为RNA提取进行处理
1.在切片机上使用干净的锋利刀片从修剪过的组织块切割6×10微米厚切片(大小3-4×5-10mm)。
注：新块-抛弃蜡切片，直到得到组织切片。使用的块-抛弃前3个组织切片
2.立即将切割的组织置于1.5mL微量离心管(microfuge tube)中，且盖紧盖子，以使水分最小化。
3.基于肿瘤大小推荐的切片数目示于表4。
表4
MET的大小  切片/管
8-10mm  6
6-8mm  12
2-4mm  18
脱蜡约30-45分钟
1.将1.0ml二甲苯加入每个样品中，剧烈涡旋震荡10-20秒，且在室温温育2-5分钟。全速离心2分钟。小心地取出上清液。
注：如果组织表现得漂浮，则额外离心2分钟。
2.重复步骤1。
3.全速离心2分钟。取出上清液。
4.加入1ml无水乙醇，且剧烈涡旋震荡1分钟。全速离心2分钟。取出上清液。
5.重复步骤4。
6.在纸巾上简短地吸干管，以去除乙醇残余物。
7.在55℃烘箱中干燥组织沉淀5-10分钟。
注：关键的是，完全去除乙醇，并彻底干燥沉淀，残余的乙醇会抑制PK消化。
注：如果PK是在-20C，则在室温加温20-30分钟。
RNA提取约2.5-3小时
1.向一个组织沉淀中加入100μl组织裂解缓冲液、16μl 10％SDS和80ul蛋白酶K工作溶液，简短地涡旋震荡几次，且在400rpm摇动下，在55℃温育2小时。
2.加入325μl结合缓冲液和325μl无水乙醇。通过上下移液，轻轻混合。
3.将裂解物全速离心2分钟。
4.组合过滤器管和收集管(12个管)，将裂解物上清液移进过滤器中。
5.在8000rpm离心30秒，并抛弃流出物。
注：如果RNA需要与另外2种组织沉淀制品合并，则可以重复步骤4-5。
6.重复在8000rpm离心30秒，以干燥过滤器。
7.向柱加入500μl洗涤缓冲液I工作溶液，且在8000rpm离心15-30秒，抛弃流出物。
8.加入500μl洗涤缓冲液II工作溶液。在8000rpm离心15-30秒，抛弃流出物。
9.加入300μl洗涤缓冲液II工作溶液，在8000rpm离心15-30秒，抛弃流出物。
10.在最大速度离心高纯过滤器2分钟。
11.将高纯过滤器管置于新鲜的1.5ml管中，且加入90μl洗脱缓冲液。在室温温育1-2分钟。在8000rpm离心1分钟。
DNA酶I处理约1.5小时
12.向洗脱物中加入10μl 10x DNA酶温育缓冲液和1.0μl DNA酶I工作溶液，且混合。在37℃温育45分钟(或2.0μl DNA酶I 30分钟)。
1 3.加入20μl组织裂解缓冲液，18μl 10％SDS和40μl蛋白酶K工作溶液。简短涡旋震荡。在55℃温育30分钟(30-60分钟.)。
14.加入325μl结合缓冲液和325μl无水乙醇。混合，并移液入新鲜的带有收集管的高纯过滤器管(12个管)。
15.在8000rpm离心30秒，并抛弃流出物。
16.重复在8000rpm离心30秒，以干燥过滤器。
17.向柱加入500μl洗涤缓冲液I工作溶液，在8000rpm离心15秒，抛弃流出物。
18.加入500μl洗涤缓冲液II工作溶液。在8000rpm离心15秒，抛弃流出物。
19.加入300μl洗涤缓冲液II工作溶液，在8000rpm离心15秒，抛弃流出物。
20.在最大速度离心高纯过滤器2分钟。
21.将高纯过滤器管置于新鲜的1.5ml管中，加入50μl洗脱缓冲液；在室温温育1-2分钟。在8000rpm离心1分钟，以收集洗脱的RNA。
22.全速离心洗脱物2分钟，并将上清液转移至新管，不扰动在底部的玻璃纤维。
23.取260/280 OD读数，稀释至50ng/μl。保藏在-80℃。
CUP ASR测定方案(ABI 7900)
目的：使用qRT-PCR来确定CUP样品的起源组织
对照设置：
1.阳性对照(参考表5和图7板设置中的板C)
表5 IVT的系列稀释-将5μl 1×108稀释入470μl水和25μl10000rRNA＝
 IVT对照  CE/μl     样品     水     BkgdrRNA
 β-肌动蛋白  100E+05     50     425     25
 CDH17  100E+05     50     425     25
 DSG3  100E+05     50     425     25
 F5  100E+05     50     425     25
 Hump  100E+05     50     425     25
 MG  100E+05     50     425     25
 PBGD  100E+05     50     425     25
 PDEF  100E+05     50     425     25
 PSCA  100E+05     50     425     25
 TTF1  100E+05     50     425     25
 WT1  100E+05     50     425     25
1E6.表5.将50,000 CE/μl rRNA稀释至500CE/μl-5μl 50,000CE/μl+495μl H2O
每个strip管等分试样10μl(2个板)；将混合物置于-80℃备用。
2.标准曲线(参考表6和图7板设置中的板C)
步骤1：标准曲线完全如表6所示设置。
 IVT对照  CE/μl   样品  水  Bkgd rRNA
 β-肌动蛋白-1  100E+07   50  425  25
 β-肌动蛋白-2  100E+06   50  425  25
 β-肌动蛋白-3  100E+05   50  425  25
 β-肌动蛋白-4  100E+04   50  425  25
 β-肌动蛋白-5  100E+03   50  425  25
 PBGD-1  100E+07   50  425  25
 PBGD-2  100E+06   50  425  25
 PBGD-3  100E+05   50  425  25
 PBGD-4  100E+04   50  425  25
 PBGD-5  100E+03   50  425  25
表7.储备溶液-1×108IVT。将50,000 CE/μl rRNA稀释至500CE/μl-5μl 50,000 CE/μl+495μl H2O
每个strip管等分试样10μl(2个板)；将混合物置于-80℃备用。
酶混合物：
1.主混合物：酶(Tth)/抗体(TP6-25)，见表7。
表7
试剂 2x
酶Tth(5U/μl) 600.00
抗体：TP6-25(1mg/ml) 600.00
水 300.00
总计 1500.00
等分试样500μl/管，且在-20℃冷冻。
CUP主混合物：
1.2.5X CUP主混合物(表8-11)：
表8
  ml  5x添加物   2.5x浓度
  0.50  1M Tris-Cl pH8   5mM
  1.25  40mg/ml牛清蛋白   500μg/ml
  37.50  1M海藻糖原液   375mM
  2.5  20％v Tween 20   0.50％
  7.00  ddH2O
  48.75
允许试剂完全混合＞15分钟
表9
ml  5x添加物 2.5x浓度
12.50  1M N-二(羟乙基)甘氨酸/氢氧化钾pH8.2 125mM
5.75  5M乙酸钾 287.5mM
20.00  甘油(V×D＝M-＞19.6×1.26＝24.6g) 20％
1.25  500mM氯化镁 6.25mM
1.75  500mM氯化锰 8.75mM
5.00  ddH2O
46.25
允许试剂完全混合＞15分钟；上述混合物合并至无菌容器中-加入下述(表10)
表10
ml  5x添加物  2.5x浓度
1.25  100mM dATP  1.25mM
1.25  100mM dCTP  1.25mM
1.25  100mM dTTP  1.25mM
1.25  100mM dGTP  1.25mM
100.00
允许试剂完全混合＞15分钟；等分试样1.8ml/管，且在-20℃冷冻
表11
引物/探针 原液(μM) FC(μM) μl
正向引物 100 10 100.0
反向引物 100 10 100.0
探针(5′FAM/3′BHQ1-TT) 100 4 40.0
DI水 760.0
总计 1000.0
引物和探针混合物：
等分试样250μl/管，且在-20℃冷冻
反应混合物：
1.CUP主混合物(CMM)：(参考表12-14和图7板设置中的板A)
表12
试剂 FC X1(10μl)  450
2.5x CUP主混合物 1X 4.00  1800
ROX 1x 0.20  90
2x TthAb混合物 2U 1.00  450
水 2.3  1035
总计 7.50  3375
优选地，每个板每次运行具有不超过356个反应：12个样品使用12个标记(288个反应，每个标记一式两份)+10标准曲线对照一式两份(20)+每个标记的2个阳性和2个阴性对照(4×12＝48)
用水调节样品体积-4.3μl样品MAX；充分混合
表13
试剂 FC X1(10μl)  34
引物10μM/探针4μM 0.5μM/0.2μM 0.50  17
CMM 1x 7.50  255
总计 8.00  272
2.ToO标记：充分混合
表14
试剂 FC  X1(10μl)  44
引物10μM/探针4μM 0.5μM/0.2μM  0.50  22
CMM 1x  7.50  330
总计  8.00  352
3.β-肌动蛋白和PBGD标记：充分混合
样品方案：
表15
样品 样品ID 浓度 加入的水＝50ng/μl
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
1.CUP样品：12个样品在96孔板中：A1-A12(参考表16和图7板设置中的板B)；等分试样50μl 50ng/μl(2μl/rxn)
加样板：
1.384孔板设置：(参考图7板设置中的板D)
将2μl样品和8μl CMM加载上板(样品＝50ng/μl)
将4μl样品和6μl CMM加载上板(样品＝25ng/μl)
密封板，并标记。在2000rpm离心1分钟。
ABI 7900HT设置：置于ABI 7900中。选择程序“CUP 384”，点击开始。
表16
热循环条件
95℃×60s
55℃×2m
斜升5％
70℃×2m
40个下述循环
95℃×15s
58℃×30s
ROX开启
分析数据，提取Ct，并插入分类树。
实施例3
分类树
分类树示于图8。
实施例5
CUP测定界限
图9描述了使用实施例1-3所述方法得到的结果，以确定CUP测定的界限。测试了一定RNA浓度范围的测定性能，发现CUP测定在100-12.5ng RNA范围内是有效的。
实施例6
qRT-PCR测定
材料和方法。
用于微阵列分析的冷冻组织样品。
共700个冷冻的原发人组织用于基因表达微阵列概况分析。从许多学术机构得到样品，包括华盛顿大学(St.Louis，MO)，Erasmus医学中心(Rotterdam，荷兰)，和商业组织库公司，包括GenomicsCollaborative，Inc(Cambridge，MA)，Asterand(Detroit，MI)，Oncomatrix(La Jolla，CA)和Clinomics Biosciences(Pittsfield，MA)。对于每个样品，还收集患者人口统计、临床和病理学信息。评论每个样品的组织病理学特征以证实诊断，和估计样品保藏和肿瘤含量。
RNA提取和Affymetrix GeneChip杂交。
将含有70％以上肿瘤细胞的冷冻癌样品、良性和正常样品解剖，且用机械匀浆器(UltraTurrex T8，德国)在Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)中匀浆。根据从冷冻组织分离RNA的标准Trizol方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)，在Trizol试剂中匀浆化组织。离心后，收集顶层液相，且用-20℃的异丙醇沉淀总RNA。用75％乙醇洗涤RNA沉淀，溶于水，且保藏在-80℃备用。
用Agilent 2100生物分析仪RNA 6000 Nano Assay(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)，检查RNA的质量。根据标准的生产商方案，制备标记的cRNA，且与含有共计22,000探针集合的高密度寡核苷酸阵列Hu133A基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交。使用Affymetrix方案和扫描仪扫描阵列。对于随后的分析，每个探针集合视作分开的基因。使用Affymetrix基因芯片分析软件MAS 5.0计算每个基因的表达值。所有芯片满足3个质量控制标准：阵列的百分比“存在”信号大于35％，当换算到600的总靶强度时换算因子小于12，且平均背景水平小于150。
标记候选物选择。
对于肺、结肠、乳腺、卵巢和前列腺组织的起源组织(ToO)候选标记的选择，在覆盖共682个乳腺、结肠、肺、卵巢、前列腺的正常、良性和癌性组织的RNA样品中测量探针集合的表达水平。基于统计学查询的数目，选择组织特异性的候选标记。
为了产生胰腺候选物，使用13个原发胰管腺癌、5个正常胰腺和98个肺、结肠、乳腺和卵巢癌样品的基因表达概况来选择胰腺癌标记。进行2种查询。在第一种查询中，生成含有14547个基因的数据集，所述基因在胰腺样品中有至少2次“存在”信号。鉴别出通过T-检验(p＜0.05)鉴定为与正常相比在胰腺癌中过度表达的共2736个基因。选择在11％的胰腺癌中的最低表达是在结肠和肺癌中的最高值的至少2倍的基因，从而产生45个探针集合。作为最后一步，选择最高表达是在结肠、肺、乳腺和卵巢癌中的最高表达的至少2倍的6个基因。在第二种查询中，生成含有4654个探针集合的数据集，所述探针集合在所有乳腺、结肠、肺和卵巢样品中有最多2次“存在”信号。选择在胰腺正常和癌样品中具有至少2次“存在”信号的共160个基因。在160个基因中，在对比它们在胰腺和正常组织之间的表达水平后，选择10个基因。合并2次胰腺查询的结果。
除了基因表达概况分析外，从文献中选择少数标记。合并所有查询的结果，以产生每种组织类型的ToO候选标记物的短列表。估计每种标记的灵敏度和特异性。根据标记冗余和互补性，将表现出通过它们的起源区分组织的能力最好的标记推荐用于RT-PCR检验。
已知起源和CUP组织的FFPE转移癌。
从许多商业卖主获得已知起源的共386 FFPE转移癌(III-IV期)和24 FFPE前列腺原发腺癌，包括Proteogenex(Los Angeles，CA)，Genomics Collaborative，Inc.(Cambridge，MA)，Asterand(Detroit，MI)，Ardais(Lexington，MA)和Oncomatrix(La Jolla，CA)。从Albany医学院(Albany，NY)得到已知原发和CUP组织的48个转移癌的独立集合。对于每个样品，还收集患者人口统计、临床和病理学信息。评论每个样品的组织病理学特征以证实诊断，和估计样品保存和肿瘤含量。就转移样品而言，根据患者的临床历史和与相应原发癌相比转移癌的组织学评价，明确地确立转移癌的诊断和起源组织。
从FFPE样品分离RNA。
从石蜡组织切片分离RNA如高纯RNA石蜡试剂盒手册(Roche)中所述，具有下述改进。根据包埋的转移灶的大小，将石蜡包埋的组织样品切片(2-5mm＝9×10μm，6-8mm＝6×10μm，8-≥10mm＝3×10μm)。如试剂盒手册所述，将切片脱蜡，在55℃烘箱中干燥组织沉淀5-10分钟，且重悬于100μl组织裂解缓冲液，16μl 10％SDS和80μl蛋白酶K。涡旋震荡样品，55℃在设定为400rpm的热混合仪中温育2小时。根据高纯RNA石蜡试剂盒手册，进行随后的样品加工。通过分光光度计得到的OD 260/280读数来定量样品，并将样品稀释至50ng/μl。将分离的RNA在-80℃保藏在无RNA酶的水中备用。
用于标记候选物预筛选的qRT-PCR。
根据生产商的说明书(Invitrogen，Carlsbad，CA)，使用SuperscriptII逆转录酶，以随机六聚体逆转录每个样品的1μg总RNA。使用Primer Express软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)，设计测试的候选基因标记和对照基因ACTB的引物和MGB-探针，或者使用ABIAssay-on-Demand(Applied Biosystems，Foster City，CA)。测试所有内部(in house)设计的引物和探针，最佳扩增效率大于90％。在20ml反应混合物中进行RT-PCR扩增，所述反应混合物含有200ng模板cDNA，2x
Figure A20088001053600421
通用PCR主混合物(10ml)(Applied Biosystems，Foster City，CA)，500nM正向和反向引物，和250nM探针。在ABIPRISM 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行反应。循环条件是：50℃，AmpErase UNG激活2分钟；95℃，聚合酶激活10分钟和50个在95℃，15秒和退火温度(60℃)60秒，50轮。在每个测定中，目标基因和对照基因一式两份地包括“无模板”对照和模板cDNA。各靶基因的相对表达表示为ΔCt，它等于靶基因Ct减去对照基因(ACTB)的Ct。
最优化的一步qRT-PCR。
适当mRNA参比序列登录号结合Oligo 6.0用于开发
Figure A20088001053600422
CUP测定(肺标记：人表面活性剂、肺-相关蛋白B(SP-B)、甲状腺转录因子1(TTF1)、桥粒芯糖蛋白3(DSG3)，结肠直肠标记：钙粘着蛋白17(CDH17)，乳腺标记：乳腺珠蛋白(MG)、前列腺-衍生的ets转录因子(PDEF)，卵巢标记：wilms瘤1(WT1)，胰腺标记：前列腺干细胞抗原(PSCA)、凝血因子V(F5)、前列腺标记激肽释放酶3(KLK3))和持家测定β肌动蛋白(β-肌动蛋白)，羟甲基胆色烷合酶(PBGD)。在表2中列出了最优化的一步qRT-PCR测定的基因特异性引物和水解探针(SEQID NO：11-58)。通过设计外显子-内含子剪接位点周围的测定来排除基因组DNA扩增。在5′核苷酸处用FAM作为报道染料、在3′核苷酸处用BHQ1-TT作为内部猝灭染料来标记水解探针。
用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)，在384孔板中定量基因-特异性的RNA。对于每个热循环仪运行，放大校准器和标准曲线。每个标记的校准器由在大鼠肾的载体RNA中以1×105拷贝稀释的靶基因体外转录物组成。持家标记的标准曲线由在大鼠肾的载体RNA中以1×107、1×105和1×103拷贝系列稀释的靶基因体外转录物组成。在每个测定运行中还包括无靶对照，以确保没有环境污染。所有样品和对照都一式两份运行。使用通用实验室试剂，在10μl反应物中进行qRT-PCR，所述反应物含有：RT-PCR缓冲液(50nM N-二(羟乙基)甘氨酸/KOH pH8.2，115nM KAc，8％甘油，2.5mM MgCl2，3.5mMMnSO4，0.5mM每种dCTP、dATP、dGTP和dTTP)，添加物(2mM Tris-ClpH8，0.2mM牛清蛋白，150mM海藻糖，0.002％Tween 20)，酶混合物(2U Tth(Roche)，0.4mg/μl Ab TP6-25)，引物和探针混合物(0.2μM探针，0.5μM引物)。遵从下述循环参数：95℃，1分钟，1轮；55℃，2分钟，1轮；斜升5％；70℃，2分钟，1轮；和95℃，15秒，58℃，30秒，40轮。完成PCR反应后，在ABI 7900HT Prism软件中设定基线和阈值，且将计算的Ct值输出到Microsoft Excel中。
一步与两步反应。
为了对比两步和一步RT-PCR反应，每个反应使用100ng随机六聚体或基因特异性的引物，进行两步反应的第一链合成。在第一步中，将11.5μl混合物-1(引物和1ug总RNA)加热至65℃，5分钟，然后在冰上冷却。将8.5μl混合物-2(1x缓冲液，0.01mM DTT，0.5mM每种dNTP’s，0.25U/μl
Figure A20088001053600431
10U/μl Superscript III)加入混合物-1，在50℃温育60分钟，然后在95℃温育5分钟。将cDNA保藏在-20℃备用。如上所述进行两步反应的第二步的qRT-PCR，循环参数如下：95℃，1分钟，1轮；95℃，15秒，58℃，30秒，40轮。完全如前段所述，进行一步反应的qRT-PCR。一步和两步反应都在100ng模板(RNA/cDNA)上进行。完成PCR反应后，在ABI 7900HT Prism软件中设定基线和阈值，且将计算的Ct值输出到Microsoft Excel中。
结果。
这个研究的目的是，开发用于预测转移癌起源组织的qRT-PCR测定。实验工作由两个主要部分组成。第一个部分包括组织-特异性的候选标记指定，它们在FFPE转移癌组织上的验证，和选择10个标记用于测定(图10A)。第二个部分包括qRT-PCR测定最优化，随后在另一组FFPE转移癌上进行测定，建立分类树和在独立样品集合上的验证(图10B)。
样品特征。
来自共700个冷冻原发组织样品的RNA用于基因表达概况分析和组织类型特异性基因鉴别。样品包括545个原发癌(29个肺、13个胰腺、315个乳腺、128个结肠直肠、38个前列腺、22个卵巢)、37个良性病变(1个肺、4个结肠直肠、6个乳腺、26个前列腺)和118个(36个肺、5个胰腺、36个结肠直肠、14个乳腺、3个前列腺、24个卵巢)正常组织。
在研究中共使用了375个已知起源转移癌(III-IV期)和26个前列腺原发腺癌样品。转移癌源自肺、胰腺、结肠直肠、卵巢、前列腺以及其它癌症。“其它”样品类别由源自肺、胰腺、结肠、乳腺、卵巢和前列腺以外的组织的转移灶组成。患者的特征总结在表17中。
表17
                             转移CUP      样品集合
总数                         401          48
平均年龄                     57.8±11*    62.13±11.7
性别      女性               241          20
          男性               160          28
起源组织
    肺                       65           9
    胰腺                     63           2
    结肠直肠                 61           4
    乳腺                     63           5
    卵巢                     82           2
    前列腺                   27           2
    肾                       8            8
    胃                       7            0
    其它**                   25           5
    未知原发癌                            11
组织病理学诊断
    腺癌，中等/良好分化      306          27
    腺癌，不良分化           49           4
    鳞状细胞癌                                 16        5
    不良分化的癌                               16        10
    小细胞癌                                   3
    黑素瘤                                     5
    淋巴瘤                                     3
    肝细胞癌                                   2
    间皮瘤                                     1
    其它***                                    14        2
转移部位
    淋巴结                                     73        1
    脑                                         17        14
    肺                                         20        7
    肝                                         75        11
    骨盆区(卵巢、膀胱、输卵管)                 53        2
    腹部(网膜(网膜、肠系膜、结肠、腹膜)        91        5
    其它(皮肤、甲状腺、胸壁、脐)               44        8
    未知                                       2
    原发(前列腺)                               26
*26位患者的年龄未知
**食管、膀胱、胸膜、肝胆囊、胆管、喉、咽、非何杰金淋巴瘤
***小细胞、间皮瘤、肝细胞、黑素瘤、淋巴瘤
将样品分成2个集合：用于验证候选标记的组织-特异性差别表达的验证集合(205样品)，和用于检验最优化的一步qRT-PCR程序和训练分类树的训练集合(260样品)。205个样品的第一集合包括25个肺、41个胰腺、31个结肠直肠、33个乳腺、33个卵巢、1个前列腺、23个其它癌转移和18个前列腺原发癌。第二集合由260个样品组成，包括56个肺、43个胰腺、30个结肠直肠、30个乳腺、49个卵巢、32个其它癌转移和20个原发前列腺癌。2个集合中的64个样品，包括16个肺、21个胰腺、15个其它转移和12个前列腺原发癌来自相同患者。
从Albany医学院得到的独立样品集合包含33个CUP样品，其中的22个提示是原发的，且15个是已知起源转移癌。对于提示原发的CUP，根据形态特征和/或用一组IHC标记检验的结果给出诊断。在表17中显示了患者人口统计、临床和病理学特征。
候选标记选择。
分析5种原发组织类型(肺、结肠、乳腺、卵巢、前列腺)的基因表达概况指定了用于qRT-PCR检验的13个组织特异性候选标记。在以前的原位癌研究中已鉴别最好的候选物。Argani等(2001)；Backus等(2005)；Cunha等(2005)；Borgono等(2004)；McCarthy等(2003)；Hwang等(2004)；Fleming等(2000)；Nakamura等(2002)；和Khoor等(1997)。除了分析微阵列数据外，从文献中选择2个标记，包括互补的肺鳞状细胞癌标记DSG3和乳腺标记PDEF。Backus等(2005)。微阵列数据证实了这些标记的高灵敏度和特异性。
一个特殊的方法用于鉴别胰腺特异性的标记。首先，分析了5个胰腺候选标记：前列腺干细胞抗原(PSCA)、丝氨酸蛋白酶抑制剂，进化枝A成员1(SERPINA1)、细胞角蛋白7(KRT7)、基质金属蛋白酶11(MMP11)和粘蛋白4(MUC4)(Varadhachary等(2004)；Argani等(2001)；Jones等(2004)；Prasad等(2005)；和Moniaux等(2004))，其中使用DNA微阵列和一组13个胰管腺癌，5个正常胰腺组织，和98个乳腺、结肠直肠、肺和卵巢肿瘤的样品。仅PSCA表现出在高特异性(91/98或93％被正确地鉴别为非胰腺起源)的中等灵敏度(检测了6/13或46％的胰腺肿瘤)。相反，KRT7、SERPINA1、MMP11和MUC4分别表现出特异性分别为66％、91％、82％和81％的38％、31％、85％和31％的灵敏度。这些数据与在27个胰腺起源转移和39个非胰腺起源转移上对所有标记进行的qRT-PCR十分一致，除了MMP11，它在qRT-PCR和转移中表现出较差的灵敏度和特异性。总之，在骤冻的、原发组织上的微阵列数据可以用作标记能力良好的指示物，从而能采用qRT-PCR将FFPE转移鉴别为胰腺起源，但是其它标记可能对最佳性能有用。
胰管腺癌从管上皮细胞发展而来，所述管上皮细胞在正常胰腺中仅占所有胰腺细胞的少量百分比(其中腺泡细胞和胰岛细胞占大多数)。此外，胰腺癌组织含有显著量的邻近正常组织。Prasad等(2005)；和Ishikawa等(2005)。因此，对于在胰腺癌中比在正常胰腺细胞中升高的基因，富集候选胰腺标记。第一种查询方法返回6个探针集合：凝血因子V(F5)、类似于FK506结合蛋白的推定蛋白FLJ22041(FKBP10)、β6整联蛋白(ITGB6)、转谷氨酰胺酶2(TGM2)、异质核内核糖核蛋白A0(HNRPA0)和BAXδ(BAX)。第二种查询方法(细节见材料和方法部分)返回8个探针集合：F5、TGM2、配对-样同源域转录因子1(PITX1)、三件套蛋白同工型mRNA(TRIO)、p73H的mRNA(p73)、MGC：10264的一种未知蛋白(SCD)和密蛋白18的2个探针集合。
选择共23个组织特异性的候选标记，用于进一步通过qRT-PCR在转移癌FFPE组织上进行RT-PCR验证。候选标记在肺、胰腺、结肠、乳腺、卵巢、前列腺和前列腺原发癌的205个FFPE转移癌上测试。表18提供了选择用于RT-PCR验证的组织特异性标记的基因符号，也总结了用这些标记进行的检验的结果。
表18
Figure A20088001053600471
Figure A20088001053600481
根据它们的交叉反应性、在相应转移组织中的低表达水平或冗余，在23个测试的标记中排除13个。选择10个标记用于最后的测定形式。肺标记是人表面活性剂肺-相关蛋白B(HUMPSPB)、甲状腺转录因子1(TTF1)和桥粒芯糖蛋白3(DSG3)。胰腺标记是前列腺干细胞抗原(PSCA)和凝血因子V(F5)，前列腺标记是激肽释放酶3(KLK3)。结肠直肠标记是钙粘着蛋白17(CDH17)。乳腺标记是乳腺珠蛋白(MG)和前列腺-衍生的Ets转录因子(PDEF)。卵巢标记是Wilms瘤1(WT1)。图11中显示了选择的标记在不同转移组织中的平均标准化相对表达值。
使用FFPE组织最优化样品制备和qRT-PCR。
接着，在检查标记组性能之前，使用固定的组织最优化RNA分离和qRT-PCR方法。首先，分析了将蛋白酶K温育时间从16小时减小至3小时的作用。对产量没有作用。但是，当使用更短的蛋白酶K步骤时，有些样品表现出更长的RNA片段(图12A，B)。例如，当RNA是从1年龄块(C22)中分离时，在电泳图谱中没有观察到差异。但是，当RNA是从5年龄块(C23)中分离，当使用更短的蛋白酶K消化时，观察到更大部分的更高分子量RNA，如通过肩峰评估的。当加工其它样品时，该趋势通常会保持，无论FFPE转移的起源器官。总之，缩短蛋白酶K消化时间不牺牲RNA产量，且可能有助于分离更长的、更少降解的RNA。
接着，对比了3种不同的逆转录方法：使用随机六聚体的逆转录、随后用qPCR(2步)，使用基因-特异性的引物的逆转录、随后用qPCR(2步)，和使用基因-特异性的引物的一步qRT-PCR。从11个转移分离RNA，并横跨3种方法对比β-肌动蛋白、HUMSPB(图12C，D)和TTF的Ct值。所有对比的结果都显示统计学显著的差异(p＜0.001)。对于2个基因，使用随机六聚体的逆转录、随后用qPCR(2步反应)产生最高的Ct值，而使用基因-特异性的引物的逆转录、随后用qPCR(2步反应)产生比相应的1步骤反应略(但是统计学显著的)低的Ct值。但是，使用基因-特异性的引物的2步骤RT-PCR具有更长的逆转录步骤。当将每个样品的HUMSPB Ct值对相应的β-肌动蛋白值标准化时，3种方法之间的标准化的Ct值没有差异。总之，最优化RT-PCR反应条件可以产生更低的Ct值，这有助于分析更老的石蜡块(Cronin等(2004))，且使用基因-特异性引物的一步RT-PCR反应可以产生与在相应的2步反应中产生的Ct值相当的Ct值。
最优化的qRT-PCR测定的诊断性能。
在260 FFPE转移灶的新集合上进行12个qRT-PCR反应(10个标记和2个持家基因)。21个样品产生持家基因的高Ct值，所以在热图分析中仅使用239个样品。分析热图中的标准化的Ct值，揭示了乳腺和前列腺标记的高特异性，结肠、肺和卵巢的中等特异性，和胰腺标记的略低的特异性(图13)。组合标准化的qRT-PCR数据和计算精制提高了标记组的性能。
使用对2个持家基因的表达平均值标准化的表达值，通过组合标准化的qRT-PCR数据和分类树开发了线性判别分析以预测转移起源组织，并确定qRT-PCR测定的准确度为74％。
                   肺
      乳腺   结肠         卵巢  胰腺  前列腺 其他
                   (SSC)
正确  4      2     9      1     0      2     11
总数  5      5     12     2     1      2     12
讨论。
在该研究中，原发性肿瘤上的基于微阵列的表达概况分析用于鉴别为转移灶使用的候选标记。原发性肿瘤可以用于发现转移的起源肿瘤标记的事实与最近的几项发现相一致。例如，Weigelt及同事已经表明，原发乳腺肿瘤的基因表达概况在远距离转移中保持。Weigelt等(2003)。Backus及同事鉴别出了用于检测乳腺癌转移的推定标记，其中使用乳腺和其它组织的全基因组的基因表达分析，并证实乳腺珠蛋白和CK19检测乳腺警戒淋巴结中临床上起作用的转移有90％灵敏度和94％特异性。Backus等(2005)。
在测定开发过程中，选择集中于6个癌症类型，包括在CUP中最普遍的肺、胰腺和结肠(Ghosh等(2005)；和Pavlidis等(2005))和治疗可能对患者最有益的乳腺、卵巢和前列腺。Ghosh等(2005)。但是，其它组织类型和标记也可以加入组中，只要不损害测定的总准确度即可，且如果适用，不妨碍RT-PCR反应的逻辑性(logistics)。
基于微阵列的使用原发组织的研究证实了已知标记的特异性和灵敏度。结果，大多数组织特异性的标记对这里研究的组织具有高度特异性。最近的使用IHC的研究发现，PSCA在前列腺癌转移中过度表达。Lam等(2005)。Dennis等(2002)也证实，PSCA可以用作胰腺和前列腺的起源肿瘤标记。在RNA水平，在有些前列腺组织中存在PSCA的强表达，但是由于在测定中包括PSA，现在可以分离前列腺和胰腺癌。该研究的新发现是，使用F5作为胰腺起源组织的互补(与PSCA互补)标记。在微阵列数据集(含有原发组织)和qRT-PCR数据集(含有FFPE转移)中，发现F5与PSCA互补。
以前的研究人员已经使用IHC(Brown等(1997)；DeYoung等(2000)；和Dennis等(2005a))或微阵列产生了CUP测定。Su等(2001)；Ramaswamy等(2001)；和Bloom等(2004)。最近，已经将SAGE与小qRT-PCR标记组相结合。Dennis(2002)；和Buckhaults等(2003)。该研究首次组合了基于微阵列的表达概况分析和小组qRT-PCR测定。使用原发组织的微阵列研究鉴别出了一些、但不是所有与以前通过SAGE研究鉴别出的标记相同的起源组织标记。该发现不令人奇怪，因为研究已经证实，基于SAGE和DNA微阵列的概况分析数据之间存在中等一致性，且该相关性对于具有更高表达水平的基因提高。van Ruissen等(2005)；和Kim(2003)。例如，Dennis及同事鉴别出了PSA、MG、PSCA和HUMSPB，而Buckhaults及同事(Buckhaults等(2003))鉴别出了PDEF。优选使用qRT-PCR执行CUP测定，因为它是有力的技术，且可能性能优于IHC。Al-Mulla等(2005)；和Haas等(2005)。此外，如本文所示，已通过在一步反应中使用基因-特异性引物改进了qRT-PCR方案。这首次证实了基因-特异性引物在含有FFPE组织的一步qRT-PCR反应中的应用。其它研究人员已经进行了2步qRT-PCR(在一个反应中合成eDNA，随后qPCR)，或已经使用随机六聚体或截短的基因-特异性引物。Abrahamsen等(2003)；Specht等(2001)；Godfrey等(2000)；Cronin等(2004)；和Mikhitarian等(2004)。
总之，与其它研究相比。6个组织类型的测定中78％的总准确度更有利。Brown等(1997)；DeYoung等(2000)；Dennis等(2005a)；Su等(2001)；Ramaswamy等(2001)；和Bloom等(2004)。
实施例7
在该研究中，通过从MVO中选择，并使用分类器来预测5种主要癌症类型(包括乳腺、结肠、肺、卵巢和前列腺)的组织起源和癌症状态，建立了使用基因标记组合的分类器。使用Affymetrix人U133AGeneChip分析了378原发癌、23良性增生性上皮病变和103正常骤冻人组织样品。还分析了白细胞样品以减去可能被白细胞背景细胞中的共表达遮盖的基因表达。开发了新的基于MVO的生物信息学方法来选择起源组织和癌症状态的基因标记组合。数据证实26基因的组可以用作在5种癌症类型中准确预测起源组织和癌症状态的分类器。因而，通过测定适度小数目的基因标记的基因表达概况，可以得到多癌症分类方法。
表19显示了为指定的组织起源鉴别的标记。基因描述见表28。
表19
组织  SEQ IDNO：  名称
肺  59  SP-B
 60  TTF1
 61  DSG3
胰腺  66  PSCA
 67  F5
 71  ITGB6
 72  TGM2
 80  HNRPA0
结肠  81  HPT1
 73  FABP1
 74  CDX1
 75  GUCY2C
前列腺  82  PSA
 76  hKLK2
乳腺  63  MGB1
 77  PIP
 64  PDEF
卵巢  78  HE4
 79  PAX8
 65  WT1
样品集合包括共计299个转移结肠、乳腺、胰腺、卵巢、前列腺、肺和其它癌和原发前列腺癌样品。执行基于组织学评价、RNA得率和对照基因β-肌动蛋白的表达的QC。其它样品类别包括源自胃(5)、肾(6)、胆管/胆囊(4)、肝(2)、头和颈(4)、回肠(1)癌和一种间皮瘤的转移灶。表20总结了结果。
表20
组织类型 收集的  组织学QC  RNA分离QC  ACTB截止QC
肺 41  37  36  25
胰腺 63  57  49  41
结肠 45  42  42  31
乳腺 40  35  35  34
卵巢 37  36  35  33
前列腺 27  27  25  19
其它 46  34  29  23
总计 299  268  251  205
测试上述样品，导致将标记集合缩小至表21中的那些，结果见表22。
表21
Figure A20088001053600531
表22
癌症 样品#  标记  正确   灵敏度％   错误   特异性％
肺 25/180  SP-B  13/25   52   0/180   100
 TTF  12/25   48   1/180   99
 DSG3  5/25   20   0/180   100
胰腺 41/164  PSCA  24/41   59   6/164   96
 F5  6/41   15   4/164   98
结肠 31/174  HPT1  22/31   71   2/174   99
乳腺 33/172  MGB  23/33   70   3/172   98
 PDEF  16/33   48   1/172   99
前列腺 19/186  PSA  19/19   100   0/186   100
 PDEF  19/19   100   2/186   99
卵巢 33/172  WT1  24/33   71   1/172   99
总计 205
结果表明，在205个石蜡包埋的转移肿瘤中，166个样品(81％)具有决定性的测定结果，表23。
表23
  候选物   正确   错误   未测试(No)   准确度(％)
  肺   SP-B+TFF+DSG3   19   0   6   76
  胰腺   PSCA+F5   27   1   13   66
  结肠   HPT1   24   2   5   78
  前列腺   PSA   19   0   0   100
  乳腺   MGB+PDEF   23   3   7   70
  卵巢   WT1   23   2   8   70
  其它   20   3   87
  总计   155   11   39   76
在假阳性结果中，许多错误源自组织学和胚胎学类似的组织，表24。
表24
样品ID 诊断 预测的
OV_26 卵巢 乳腺
Br_24 乳腺 结肠
Br_37 乳腺 结肠
CRC_25 结肠 卵巢
Pn_59 胰腺 结肠
Cont_27 胃 胰腺
Cont_34 胃 结肠
Cont_35 胃 结肠
Cont_43 胆管 胰腺
Cont_44 胆管 胰腺
Cong_25 肝 胰腺
模型开发考虑下述参数：
分离女性和男性集合的标记，并分别为男性和女性患者计算CUP概率。男性集合包括：SP_B、TTF1、DSG3、PSCA、F5、PSA、HPT1；女性集合包括：SP_B、TTF1、DSG3、PSCA、F5、HPT1、MGB、PDEF、WT1。从测定结果排除背景表达：肺：SP_B、TTF1、DSG3；卵巢：WT1；和结肠：HPT1。
将CUP模型调节至CUP患病率(％)：肺23、胰腺16、结肠直肠9、乳腺3、卵巢4、前列腺2、其它43。将男性患者的乳腺和卵巢患病率调节至0％，且将女性患者的前列腺患病率调节至0％。
采取下述步骤：
将标记置于类似的标尺上；
通过从每个组织特异性集合选择最小值，将变量的数目从12减至8；
省去(leave out)1个样品；从剩余的样品建立模型；测试省去的样品；重复直至测试了100％样品。
随机省去约50％的样品(每个组织约50％)；从剩余的样品建立模型；测试约50％的样品；和对3个不同随机分离进行重复。
将分类准确度调节至癌症类型患病率，以产生表25总结的结果，原始数据如表26所示。
表25
乳腺  结肠   肺   其它   卵巢   胰腺   前列腺   总计   调节的
正确 23  29   22   19   24   35   19   171
未测试 3  2   2   2   3   0   12
错误 7  0   1   4   7   3   0   22
患病率 0.03  0.09   0.23   0.43   0.04   0.16   0.02
测试的/总计％ 91  94   92   100   94   93   100   94   95
正确/总计％ 70  94   88   83   73   85   100   89   89
未测试％ 9  6   8   n/a   6   7   0   6   5
正确 23  25   19   20   20   24   19   150
未测试％ 7  6   5   10   15   0   43
错误 3  0   1   3   3   2   0   12
患病率 0.03  0/09   0.23   0.43   0.04   0.16   0.02
测试的/总计％ 79  81   80   100   70   63   100   79   83
正确/总计％ 70  81   76   87   61   59   100   73   76
正确/测试的％ 88  100   95   87   87   92   100   93   91
未测试％ 21  19   20   n/a   30   37   0   21   17
表26
患者                             转移部位Lite
(Pt)  #    性别         类别2    (Met.Site.Lite)        b            预测
      101  男    肺            不明              ′不明′    ′其他′    错误
      106  男    肺            不明              ′不明′    ′肺′      正确
      110  男    肺            不明              ′不明′    ′肺′      正确
      112  男    肺            不明              ′不明′    ′其他′    错误
      114  女    肝            肺                ′肺′      ′胰腺′    错误
      128  女    乳腺          肺                ′肺′      ′胰腺′    错误
      129  男    CUP(肾)       肺                ′肺′      ′其他′    正确
      134  女    乳腺          不明              ′不明′    ′乳腺′    正确
      136  男    前列腺        肺                ′肺′      ′前列腺′  正确
      148  女    卵巢          不明              ′不明′    ′胰腺′    错误
      163  女    结肠直肠      不明              ′不明′    ′胰腺′    错误
      166  女    乳腺          不明              ′不明′    ′乳腺′    正确
179 女    肾            不明    ′不明′    ′其他′    正确
184 男    结肠直肠      不明    ′不明′    ′结肠′    正确
194 男    头/颈         不明    ′不明′    ′其他′    正确
199 女    CUP SSC       不明    ′不明′    ′肺SCC′   正确
200 男    CUP SSC       不明    ′不明′    ′肺SCC′   正确
302 女    肾            结肠    ′结肠′    ′乳腺′    正确
305 男    肾            不明    ′不明′    ′其他′    正确
313 男    肺            不明    ′不明′    ′其他′    错误
317 男    GI            不明    ′不明′    ′胰腺′    正确
325 男    肺            不明    ′不明′    ′肺SCC′   正确
331 女    乳腺          卵巢    ′卵巢′    ′乳腺′    正确
333 女    肾            不明    ′不明′    ′其他′    正确
334 男    肾            不明    ′不明′    ′其他′    正确
335 男    肺            不明    ′不明′    ′肺′      正确
339 女    结肠          不明    ′不明′    ′其他′    错误
342 女    十二指肠      不明    ′不明′    ′其他′    正确
346 男    结肠          肺      ′肺′      ′胰腺′    错误
347 男    SCC 肺，H+    不明    ′不明′    ′肺sCC′   正确
354 女    卵巢          不明    ′不明′    ′卵巢′    正确
356 女    乳腺          不明    ′不明′    ′乳腺′    正确
363 男    结肠          不明    ′不明′    ′结肠′    正确
374 男    肺            不明    ′不明′    ′肺′      正确
382 男    肾            不明    ′不明′    ′其他′    正确
385 女    SCC 肺，H+    不明    ′不明′    ′肺′      正确
404 男    肾            不明    ′不明′    ′其他′    正确
407 男    前列腺        肺      ′肺′      ′前列腺′  正确
417 女    胰腺          不明    ′不明′    ′结肠′    错误
实施例8
用于预测起源组织的原发部位不明转移癌CUP的有前途的基因标 记研究
本研究的具体目的是测定10-基因标签预测原发不明癌(CUP)患者中转移癌的起源组织的能力。
第一目的：证实对CUP连续患者的核心活组织检查样品进行基因分析的可行性。
第二目的：将10-基因标签RT-PCR测定的结果与在M.D.Anderson癌症中心(MDACC)进行的诊断检查相关联。
第三目的：将通过测定预测的6种癌症类型的患病率与从文献和MDACC经验衍生的患病率相关联。
本文所述方法用于进行700个冷冻原发癌和良性和正常样品的微阵列基因表达分析，鉴别出肺、胰腺、结肠、乳腺、前列腺和卵巢癌的特异性候选基因标记。在源自肺、胰腺、结肠、乳腺、卵巢和前列腺的转移癌(III-IV期)以及源自特异性对照的其它癌症类型的转移灶的205个福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)样品上，通过RT-PCR测试候选基因标记。其它转移癌类型包括胃、肾细胞、肝细胞、胆管/胆囊和头颈癌。结果允许选择10-基因标签，其预测转移癌的起源组织，并产生76％的总准确度。RT-PCR实验的重复测量的平均CV是1.5％，这基于4个重复数据点计算而得。将β-肌动蛋白(ACTB)用作持家基因，它的中值表达与不同起源的转移样品中的表达类似(CV＝5.6％)。
本研究的具体目的是验证与全面诊断检查相比，10-基因标签预测CUP患者中转移癌起源组织的能力。
患者适格性
患者必须至少18岁，ECOG表现状态为0-2。接受诊断出腺癌或不良分化癌的患者。腺癌患者组包括良好、中等和不良分化的肿瘤。
患者已经满足CUP的标准：完全评价后没有检测出原发，所述完全评价定义为完全的病史和体检、详细的实验室检查、成像研究和症状或病征指导的侵入研究。仅允许未经治疗的患者用于研究。
如果患者已经用化疗或放射治疗过，则若可得到10年期间内的以前(治疗前)组织作为记录块，则允许参与研究。
患者提供参与本研究的书面知情同意书/授权书。
研究设计
研究允许已经诊断出CUP的患者，他们已经经历最易接近的转移病灶的芯针或切除活组织检查。仅进行FNA活组织检查的患者是不合适的。登记满足包含标准和同意研究的前60个连续出现的患者。如果为了诊断他们的治疗需要在MDACC重复活组织检查，如果患者同意，则得到其它组织用于研究。所有参与者都根据研究方案数据管理系统(institutional Protocol Data Management System)(PDMS)的方案而登记。
根据MDACC标准，对所有登记的患者进行完全诊断检查，包括临床和病理学评估。诊断检查的病理学部分可能已经包括使用标记的免疫组织化学(IHC)测定，所述标记包括CK-7、CK-20、TTF-1和病理学家所认为的其它指定标记。这是呈现CUP的所有患者的常规检查的部分。
组织样品收集
研究包括从CUP患者收集的福尔马林固定、石蜡包埋的转移癌样品。
6个10μm切片用于RNA分离，更小的组织样品将需要9个10μm切片。在用苏木精和伊红(HE)染色的另一个切片上，证实用于RNA分离的每个样品的组织病理学诊断和肿瘤含量。肿瘤样品应当在HE切片中具有大于30％的肿瘤含量。
将临床数据匿名地提供给Veridex，包括患者年龄、性别、通过光学显微镜术检查的肿瘤组织学、肿瘤等级(分化)、转移部位、样品收集日期、为单个患者进行的诊断检查的描述。
组织加工和RT-PCR试验
使用上述方案，从每个组织样品提取总RNA。仅将在标准量的组织中产生超过1μm总RNA的样品用于随后的RT-PCR试验。具有较低RNA得率的样品视作降解的，在随后的实验中排除。根据标准的Veridex程序，执行基于持家表达的RNA完整性对照，以排除具有降解的RNA的样品。
包括10个基因和1-2个对照基因的组的RT-PCR测定用于分析RNA样品。使用上述方案完成逆转录和PCR测定。
计算表示为ΔCt的每个测试基因的相对表达值，并用于起源组织预测，所述ΔCt等于靶基因的Ct减去对照基因的Ct。
样品大小和数据解释
由于探索研究的探察性质，研究了有限样品大小的60位患者。迄今为止，已经测试了22位患者。1个患者样品没有产生足够RT-PCR试验的RNA，且3个没有通过使用对照基因的RT-PCR评估的QC对照。共18位患者用于测定患者的转移病变的概率。
将统计学模型用于测定下述7类转移癌起源组织的概率：肺、胰腺、结肠、乳腺、前列腺、卵巢和未测试(其它)。对于每个样品，从线性分类模型计算每类的概率。在表27中总结了测定结果。
这6个部位(结肠、胰腺、肺、前列腺、卵巢、乳腺)中的一个的患者转移病变(具有已知原发)的概率是约76％。该数字源自给出各种癌症的发病率和传播潜力的文献和肿瘤登记的M.D.Anderson的未公开数据。对于测试的样品，6个部位的患病率是67％(12/18的试验样品)，这与以前的观察非常一致。
表27
Figure A20088001053600601
尽管出于清晰理解的目的通过说明和实施例比较详细地描述了前述发明，但所述描述和实施例不应当理解为对本发明范围的限制。
表28
  名称  SEQ ID NO   登录号  描述
  CDH17  62   NM_004063  钙粘着蛋白17
  CDX1  74   NM_001804  同源框转录因子1
  DSG3  61/3   NM_001944  桥粒芯糖蛋白3
  F5  67/6   NM_000130  凝血因子V
  FABP1  73   NM_001443  脂肪酸结合蛋白1，肝
  GUCY2C  75   NM_004963  鸟苷酸环化酶2C
  HE4  78   NM_006103  推定的卵巢癌标记
  KLK2  76   BC005196  激肽释放酶2，前列腺的
  HNRPA0  80   NM_006805  异质核内核糖核蛋白A0
  HPT1  81/4   U07969  肠肽-相关转运蛋白
  ITGB6  71   NM_000888  整联蛋白，β6
  KLK3  68   NM_001648  激肽释放酶3
  MGB1  63/7   NM_002411  乳腺珠蛋白1
  PAX8  79   BC001060  配对框基因8
  PBGD  70   NM_000190  羟甲基胆色烷合酶
  PDEF  64/8   NM_012391  含有Ets转录因子的结构域
  PIP  77   NM_002652  催乳素-诱导的蛋白
  PSA  82/9   U17040  前列腺特异性的抗原前体
  PSCA  66/5   NM_005672  前列腺干细胞抗原
  SP-B  59/1   NM_198843  肺表面活性剂-相关蛋白B
  TGM2  72   NM_004613  转谷氨酰胺酶2
  TTF1  60/2   NM_003317  类似于甲状腺转录因子1
  WT1  65/10   NM_024426  Wilms瘤1
  β-肌动蛋白  69   NM_001101  β-肌动蛋白
  KRT6F  83   L42612  角蛋白6同工型K6f
  p73H   84   AB010153   p53-相关蛋白
  SFTPC   85   NM_003018   表面活性剂，肺-相关蛋白C
  KLK10   86   NM_002776   激肽释放酶10
  CLDN18   87   NM_016369   密蛋白18
  TR10   88   BD280579   肿瘤坏死因子受体
B305D 89 AC018804   得自2的BAC克隆RP11-397H17(BAC clone RP11-397H17 from 2)
  B726   90   AL357148
  GABA-pi   91   BC109105   γ-氨基丁酸A受体，pi
  StAR   92   NM_01007243   类固醇生成急性调节蛋白
  EMX2   93   NM_004098   empty spiracle同源物2(果蝇(Drosophila))
  NGEP   94   AY617079   NGEP长变体
  NPY   95   NM_000905   神经肽Y
SERPINA1 96 NM_000295   丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂，进化枝A成员1
  KRT7   97   NM_005556   角蛋白7
  MMP11   98   NM_005940   基质金属肽酶11(溶基质蛋白酶3)
  MUC4   99   NM_018406   粘蛋白4细胞-表面相关的
  FLJ22041   100   AK025694
  BAX   101   NM_138763   BCL2-相关的X蛋白转录物变体Δ
PITX1 102 NM_002653   配对-样同源域转录因子1(paired-like homeodomain trans factor 1)
  MGC：10264   103   BC005807   硬脂酰辅酶A去饱和酶(Δ-9-去饱和酶)
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Y.王(WANG，Yixin)
A.马朱姆达(MAZUMDER，Abhijit)
D.塔兰托夫(TALANTOV，Dmitri)
T.亚特克(JATKOE，Timothy)
J.F.贝登(BADEN，Jonathan F.)
<120>用于鉴别原发起源不明的癌的起源的方法和材料
<130>VDX5042
<150>60/887,625
<151>2007-02-01
<160>104
<170>PatentIn version 3.4
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<212>DNA
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tttgttaaga tataaaaagg ggtttctttt tgtctttctg taaggtggac ttccagattt    360
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gcagagaagg agaagataac tcaaaaagaa acccaattgc caagattact tcagattacc    60
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cttaacaaga tggccaagga ggccattttc caggacacga tgaggaagtt cctggagcag    300
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cagcaattcc ccattcctct cgcctattgc tggctctgca gggctctgat caagcggatc    660
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cctctggtgg cgggcggcat ctgccagtgc ctggctgagc gctactccgt catcctgctc     780
gacacgctgc tgggccgcat gctgccccag ctggtctgcc gcctcgtcct ccggtgctcc     840
atggatgaca gcgctggccc aaggtcgccg acaggagaat ggctgccgcg agactctgag     900
tgccacctct gcatgtccgt gaccacccag gccgggaaca gcagcgagca ggccatacca     960
caggcaatgc tccaggcctg tgttggctcc tggctggaca gggaaaagtg caagcaattt    1020
gtggagcagc acacgcccca gctgctgacc ctggtgccca ggggctggga tgcccacacc    1080
acctgccagg ccctcggggt gtgtgggacc atgtccagcc ctctccagtg tatccacagc    1140
cccgaccttt gatgagaact cagctgtcca gaaaaagaca ccgtccttta aagtgctgca    1200
gtatggccag acgtggtggc tcacacctgc aatcccagca ccttaggagg ccgaggcagg    1260
aggatccttg aggtcaggag ttcgagacca gcctcgccaa catggtgaaa ccccatttct    1320
actaaaaata caaaaaatta gccaagtgtg gtggcatatg cctgtaatcc caactactca    1380
gaaggccgag gcaggagaat tacttgaacg caggagaatc actgcagccc aggaggcaga    1440
ggttgcagtg agccgagatt gcaccactgc actccagcct gggtgacaga gcaagactcc    1500
atctcagtaa ataaataaat aaataaaaag cgctgcagta gctgtggcct caccctgaag    1560
tcagcgggcc caggcctacc tcactctctc ccttggcaga gaagcagacg tccatagctc    1620
ctctccctca caagcgctcc cagcctgccc tccagctgct gctctcccct cccagtctct    1680
actcactggg atgaggttag gtcatgagga caccaaaaac ctaaaaataa acaaaaagcc    1740
aaacaagcct tagcttttct taaagactga aatgcctgga agtgtccctt tatttataaa    1800
ataacttttg tcatatttct tatacatgtt tcttgtaaga aattcagaaa ctacagacaa    1860
agagagtgga aattacccac tgtcaggcct ctgagcccaa gctaagccat catatcccct    1920
gtgccctgca cgtatacacc cagatggcct gaagcaactg aagatccaca aaagaagtga    1980
aaatagccag ttcctgcctt aactgatgac attccaccat tgtgatttgt tcctgcccca    2040
ccctaactga tcaattgacc ttgtgacaat acaccttccc cacccttgag aaggtgcttt    2100
gtaatattct ccccacccac cccacgcccg cacccccgca cccttaagaa ggtattttgt    2160
aatattctct ccgccattga gaatgtgctt tgtaagatcc accccctgcc cacaaaaaat    2220
tgctcctaac tccaccgcct atcccaaacc tacaagaact aatgataatc ccaccaccct    2280
ttgctgactc tttttggact cagcccacct gcacccaggt gattaaaaag ctttattgtt    2340
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aagtagacat ttgtaaatct atagctaact actgtcctta aagccattgt ttccattaca    2640
aaatccaact ctctgagaga aaagggtgtt ttaaatttaa aaaaataaaa acaaaaaagt    2700
ttgattgaga aaaaaaaaaa aaaa                                           2724
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<212>DNA
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gaatatttgg caaagggaga aaaaaaaagc agcgaggctt cgccttcccc ctctcccttt    300
tttttcctcc tcttccttcc tcctccagcc gccgccgaat catgtcgatg agtccaaagc    360
acacgactcc gttctcagtg tctgacatct tgagtcccct ggaggaaagc tacaagaaag    420
tgggcatgga gggcggcggc ctcggggctc cgctggcggc gtacaggcag ggccaggcgg    480
caccgccaac agcggccatg cagcagcacg ccgtggggca ccacggcgcc gtcaccgccg    540
cctaccacat gacggcggcg ggggtgcccc agctctcgca ctccgccgtg gggggctact    600
gcaacggcaa cctgggcaac atgagcgagc tgccgccgta ccaggacacc atgaggaaca    660
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gcttcatggg cccggcgagc ggcatgaaca tgagcggcat gggcggcctg ggctcgctgg    780
gggacgtgag caagaacatg gccccgctgc caagcgcgcc gcgcaggaag cgccgggtgc    840
tcttctcgca ggcgcaggtg tacgagctgg agcgacgctt caagcaacag aagtacctgt    900
cggcgccgga gcgcgagcac ctggccagca tgatccacct gacgcccacg caggtcaaga    960
tctggttcca gaaccaccgc tacaaaatga agcgccaggc caaggacaag gcggcgcagc   1020
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tgtcccacct gaactcctcg ggctcggact acggcaccat gtcctgctcc accttgctat    1440
acggtcggac ctggtgagag gacgccgggc cggccctagc ccagcgctct gcctcaccgc    1500
ttccctcctg cccgccacac agaccaccat ccaccgctgc tccacgcgct tcgacttttc    1560
ttaacaacct ggccgcgttt agaccaagga acaaaaaaac cacaaaggcc aaactgctgg    1620
acgtctttct ttttttcccc ccctaaaatt tgtgggtttt tttttttaaa aaaagaaaat    1680
gaaaaacaac caagcgcatc caatctcaag gaatctttaa gcagagaagg gcataaaaca    1740
gctttggggt gtcttttttt ggtgattcaa atgggttttc cacgctaggg cggggcacag    1800
attggagagg gctctgtgct gacatggctc tggactctaa agaccaaact tcactctggg    1860
cacactctgc cagcaaagag gactcgcttg taaataccag gatttttttt tttttttgaa    1920
gggaggacgg gagctgggga gaggaaagag tcttcaacat aacccacttg tcactgacac    1980
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cgcgaaaata gtttgtttaa tgtgaacttg tagctgtaaa acgctgtcaa aagttggact    2100
aaatgcctag tttttagtaa tctgtacatt ttgttgtaaa aagaaaaacc actcccagtc    2160
cccagccctt cacatttttt atgggcattg acaaatctgt gtatattatt tggcagtttg    2220
gtatttgcgg cgtcagtctt tttctgttgt aacttatgta gatatttggc ttaaatatag    2280
ttcctaagaa gcttctaata aattatacaa attaaaaaga ttctttttct gattaaaaaa    2340
aaaaaaaaaa aa                                                        2352
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<212>DNA
<213>人
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cttccccaga actacagggg ctctggccat cttcgtggtg gtcatattgg ttcatggaga    180
attgcgaata gagactaaag gtcaatatga tgaagaagag atgactatgc aacaagctaa    240
aagaaggcaa aaacgtgaat gggtgaaatt tgccaaaccc tgcagagaag gagaagataa    300
ctcaaaaaga aacccaattg ccaagattac ttcagattac caagcaaccc agaaaatcac     360
ctaccgaatc tctggagtgg gaatcgatca gccgcctttt ggaatctttg ttgttgacaa     420
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gatcacatgt cgggctctaa atgcccaagg actagatgta gagaaaccac ttatactaac     540
ggttaaaatt ttggatatta atgataatcc tccagtattt tcacaacaaa ttttcatggg     600
tgaaattgaa gaaaatagtg cctcaaactc actggtgatg atactaaatg ccacagatgc     660
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attacttcga tttcaagtaa cagatttgga tgaagagtac acagataatt ggcttgcagt    1020
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<213>人
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acatttaagg cgccattgct tttgggagac tggaaaaggg aaggtgactg aaggctgtca    7080
ggattcttca aggagaatga atactgggaa tcaagacaag actatacctt atccataggc    7140
gcaggtgcac agggggaggc cataaagatc aaacatgcat ggatgggtcc tcacgcagac    7200
acacccacag aaggacacta gcctgtgcac gcgcgcgtgc acacacacac acacacacac    7260
gagttcataa tgtggtgatg gccctaagtt aagcaaaatg cttctgcaca caaaactctc    7320
tggtttactt caaattaact ctatttaaat aaagtctctc tgactttttg tgtctccaaa    7380
a                                                                    7381
<210>99
<211>2323
<212>DNA
<213>人
<400>99
agctatgatc gcaacacctt ggtggccatc gtggtgggtg tggggcgcct catcactggc     60
atggaccgag gcctcatggg catgtgtgtc aacgagcggc gacgcctcat tgtgcctccc    120
cacctgggct atgggagcat cggcctggcg gggctcattc caccggatgc caccctctac    180
ttcgatgtgg ttctgctgga tgtgtggaac aaggaagaca ccgtgcaggt gagcacattg    240
ctgcgcccgc cccactgccc ccgcatggtc caggacggcg actttgtccg ctaccactac    300
aatggcaccc tgctggacgg cacctccttc gacaccagct acagtaaggg cggcacttat    360
gacacctacg tcggctctgg ttggctgatc aagggcatgg accaggggct gctgggcatg    420
tgtcctggag agagaaggaa gattatcatc cctccattcc tggcctatgg cgagaaaggc    480
tatgggacag tgatcccccc acaggcctcg ctggtctttc acgtcctcct gattgacgtg    540
cacaacccga aggacgctgt ccagctagag acgctggagc tcccccccgg ctgtgtccgc    600
agagccgggg ccggggactt catgcgctac cactacaatg gctccttgat ggacggcacc     660
ctcttcgatt ccagctactc ccgcaaccac acctacaata cctatatcgg gcagggttac     720
atcatccccg ggatggacca ggggctgcag ggtgcctgca tgggggaacg ccggagaatt     780
accatccccc cgcacctcgc ctatggggag aatggaactg gagacaagat ccctggctct     840
gccgtgctaa tcttcaacgt ccatgtcatt gacttccaca accctgcgga tgtggtggaa     900
atcaggacac tgtcccggcc atccgagacc tgcaatgaga ccaccaagct tggggacttt     960
gttcgatacc attacaactg ttctttgctg gacggcaccc agctgttcac ctcgcatgac    1020
tacggggccc cccaggaggc gactctcggg gccaacaagg tgatcgaagg cctggacacg    1080
ggcctgcagg gcatgtgtgt gggagagagg cggcagctca tcgtgccccc gcacctggcc    1140
cacggggaga gtggagcccg gggagtccca ggcagtgctg tgctgctgtt tgaggtggag    1200
ctggtgtccc gggaggatgg gctgcccaca ggctacctgt ttgtgtggca caaggaccct    1260
cctgccaacc tgtttgaaga catggacctc aacaaggatg gcgaggtccc tccggaggag    1320
ttctccacct tcatcaaggc tcaagtgagt gagggcaaag gacgcctcat gcctgggcag    1380
gaccctgaga aaaccatagg agacatgttc cagaaccagg accgcaacca ggacggcaag    1440
atcacagtcg acgagctcaa gctgaagtca gatgaggacg aggagcgggt ccacgaggag    1500
ctctgagggg cagggagcct ggccaggcct gagacacaga ggcccactgc gagggggaca    1560
gtggcggtgg gactgacctg ctgacagtca ccctccctct gctgggatga ggtccaggag    1620
ccaactaaaa caatggcaga ggagacatct ctggtgttcc caccacccta gatgaaaatc    1680
cacagcacag acctctaccg tgtttctctt ccatccctaa accacttcct taaaatgttt    1740
ggatttgcaa agccaatttg gggcctgtgg agcctggggt tggatagggc catggctggt    1800
cccccaccat acctcccctc cacatcactg acacagctga gcttgttatc catctcccca    1860
aactttctct ttctttgtac ttcttgtcat ccccactccc agcccctatt cctctatgtg    1920
acagctggct aggacccctc tgccttcctt cccaatcctg actggctcct agggaagggg    1980
aaggctcctg gagggcagcc ctacctctcc catgcccttt gccctcctcc ctcgcctcca    2040
gtggaggctg agctgaccct gggctgctgg aggccagact gggctgtagt tagcttttca    2100
tccctaaaga aggctttccc taaggaacca tagaagagag gaagaaaaca aagggcatgt    2160
gtgagggaag ctgcttgggt gggtgttagg gctatgaaat cttggatttg gggctgaggg    2220
gtgggaggga gggcagagct ctgcacactc aaaggctaaa ctggtgtcag tccttttttc    2280
ctttgttcca aataaaagat taaaccaaaa aaaaaaaaaa aaa                     2323
<210>100
<211>741
<212>DNA
<213>人
<400>100
tcacgtgacc cgggcgcgct gcggccgccc gcgcggaccc ggcgagaggc ggcggcggga     60
gcggcggtga tggacgggtc cggggagcag cccagaggcg gggggcccac cagctctgag    120
cagatcatga agacaggggc ccttttgctt caggggatga ttgccgccgt ggacacagac    180
tccccccgag aggtcttttt ccgagtggca gctgacatgt tttctgacgg caacttcaac    240
tggggccggg ttgtcgccct tttctacttt gccagcaaac tggtgctcaa ggccctgtgc    300
accaaggtgc cggaactgat cagaaccatc atgggctgga cattggactt cctccgggag    360
cggctgttgg gctggatcca agaccagggt ggttgggacg gcctcctctc ctactttggg    420
acgcccacgt ggcagaccgt gaccatcttt gtggcgggag tgctcaccgc ctcactcacc    480
atctggaaga agatgggctg aggcccccag ctgccttgga ctgtgttttt cctccataaa    540
ttatggcatt tttctgggag gggtggggat tgggggacgt gggcattttt cttacttttg    600
taattattgg ggggtgtggg gaagagtggt cttgaggggg taataaacct ccttcgggac    660
acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                                              741
<210>101
<211>2383
<212>DNA
<213>人
<400>101
cctggcgcag ggactgctgg aacctggctg tgcgcgctgt cgctttaaga cagactctgc     60
cggcgccgtc cggagcctta gaaaccggcc ccggatcgcg agccggagcc ggagccggag    120
ccggggccgg ccgggctgct gaggcccgag cggcaggagc gcagcgcgga gcgctgagcc    180
aggcgcccag tcgcgagaag ctgccgccgc ctctgcccgc ccggcgccgc agccccgggc    240
ggtccatggg gcgggcacgg cgtcgctgca ggcgccggca gccctggagg gcagccgctt    300
aggcgctgcg ctcttgtccc cgcaggtcgc agccagggcg gcggggcgcg cccagccccg    360
gcccctggag cgcccgccgc ggtccccacc tccatggacg ccttcaaggg gggcatgagc    420
ctggagcggc tgccggaggg gctccggccg ccgccgccgc caccccatga catggggccc     480
gccttccacc tggcccggcc cgccgacccc cgcgagccgc tcgagaactc cgccagcgag     540
tcgtctgaca cggagctgcc agagaaggag cgcggcgggg aacccaaggg gcccgaggac     600
agtggtgcgg gaggcacggg ctgcggcggc gcagacgacc cagccaagaa gaagaagcag     660
cggcggcaac gtacgcactt cacaagccag cagttgcaag agctagaggc cacgttccag     720
aggaaccgct accccgacat gagcatgagg gaggagatcg ccgtgtggac caacctcacc     780
gagccgcgcg tgcgggtctg gttcaagaac cggcgagcca agtggcgtaa gcgcgagcgt     840
aaccagcagc tggacctgtg caagggtggc tacgtgccgc agttcagcgg cctagtgcag     900
ccctacgagg acgtgtacgc cgccggctac tcctacaaca actgggccgc caagagcctg     960
gcgccagcgc cgctctccac caagagcttc accttcttca actccatgag cccgctgtcg    1020
tcgcagtcca tgttctcagc acccagctcc atctcctcca tgaccatgcc gtccagcatg    1080
ggcccaggcg ccgtgcctgg catgcccaac tcgggcctca acaacatcaa caacctcacc    1140
ggctcctcgc tcaactcggc catgtcgccg ggcgcttgcc cgtacggcac tcccgcctcg    1200
ccctacagcg tctaccggga cacgtgcaac tcgagcctag ccagcctgcg gctcaagtcc    1260
aaacagcact cgtcgtttgg ctacggcggc ctgcagggcc cggcctcggg cctcaacgcg    1320
tgccagtaca acagctgacc gccccgccgc accacgcggg ccggcggccg gagcggggaa    1380
gggcgcgggc gcgggcgcgg aggacgcacg cggggccccg gctcgcaagc cccagctcac    1440
cgcgccgcgg acctcacacc tgcgcagccc cctcctccca cttcccactc cgggttggtt    1500
ttgtgtttgc ttttccggac cccactctgc cctccaaaaa gacaaaaaaa aaaaaaaaaa    1560
aaaaaaagca aaaagacgtc ggagaaaagt gccgcgaaaa aatggatgag ttgcaatttc    1620
tctcgggatg gcgcgggtgg tgtgtgtgtt cccacgggcc ccggaggccc actccgcgga    1680
gggcacgcgg cgcggtaggc gagcgccgag gcccagcggc cgggggagga cgacctcgta    1740
tcccgcgtcc ccgccgcgct ggatccggac tgagtggccg ggcctgcgga ctggatgtgc    1800
ggggcctgga cttgcctagg atttcccgac cccgtacaaa ccaagttgcc ctctccgagc    1860
taggcccggc cgagagcgcc ttagctcgag tcggatccgt gttggggcgg gcgttgggtt    1920
tggggggacg gtgcccccag cccaggatcg ggcactcagt ggagccgcac acggccccgg    1980
cgcgcctggt agagcctcgc tggccccgcg ccccggagcc ctatattaag gccacggagc    2040
gacagcgggc agtgcgggcc tggcgggagg tgggggaggt ccatctcaga acaccccagc    2100
cttgagctta gctgcaggcc caggccctct gctctgctcc cgggctagga ggtggccctc    2160
tgtctgggcg aacagccccc tcctcaccgc ccgccgtgca agagtcgagc cggcagagca    2220
aggggcgcgg ccccagggcc ctgcgcccac tttgcacacc cgctctccgg cccgcgcccc    2280
tgtttacagc gtccctgtgt atgttggact gactgtaata aatctgtcta tatcgacttg    2340
tccatgtacg tctattaaaa ccatagtccg agcgtgctaa gca                      2383
<210>102
<211>1314
<212>DNA
<213>人
<400>102
aattcccggc tcggggacct ccacgcaccg cggctagcgc cgacaaccag ctagcgtgca     60
aggcgccgcg gctcagcgcg taccggcggg cttcgaaacc gcagtcctcc ggcgaccccg    120
aactccgctc cggagcctca gccccctgga aagtgatccc ggcatccgag agccaagatg    180
ccggcccact tgctgcagga cgatatctct agctcctata ccaccaccac caccattaca    240
gcgcctccct ccagggtcct gcagaatgga ggagataagt tggagacgat gcccctctac    300
ttggaagacg acattcgccc tgatataaaa gatgatatat atgaccccac ctacaaggat    360
aaggaaggcc caagccccaa ggttgaatat gtctggagaa acatcatcct tatgtctctg    420
ctacacttgg gagccctgta tgggatcact ttgattccta cctgcaagtt ctacacctgg    480
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaataaaa aaaaaaaaaa aaaa         1314
<210>103
<211>476
<212>DNA
<213>人
<400>103
gaaaaaccag ccactgcttt acaggacagg gggttgaagc tgagccccgc ctcacaccca     60
cccccatgca ctcaaagatt ggattttaca gctacttgca attcaaaatt cagaagaata    120
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ttcaaaaaat cagcaattcc ccagcgtagt caagggtgga cactgcacgc tctggcatga    240
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tttgttaaga tataaaaagg ggtttctttt tgtctttctg taaggtggac ttccagattt    360
tgattgaaag tcctagggtg attctatttc tgctgtgatt tatctgctga aagctcagct    420
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<210>104
<211>476
<212>DNA
<213>人
<400>104
gaaaaaccag ccactgcttt acaggacagg gggttgaagc tgagccccgc ctcacaccca     60
cccccatgca ctcaaagatt ggattttaca gctacttgca attcaaaatt cagaagaata    120
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ttcaaaaaat cagcaattcc ccagcgtagt caagggtgga cactgcacgc tctggcatga    240
tgggatggcg accgggcaag ctttcttcct cgagatgctc tgctgcttga gagctattgc    300
tttgttaaga tataaaaagg ggtttctttt tgtctttctg taaggtggac ttccagattt    360
tgattgaaag tcctagggtg attctatttc tgctgtgatt tatctgctga aagctcagct    420
ggggttgtgc aagctaggga cccattcctg tgtaatacaa tgtctgcacc aatgct        476

Claims (33)

1.鉴别起源不明转移灶的起源的方法，其包括下列步骤
a.获得含有转移细胞的样品；
b.测量与至少2种不同癌有关的生物标记；
c.将来自所述生物标记的数据组合进线性判别分析中，其中所述线性判别分析
i.相对于参比标准化所述生物标记；和
ii.施加优化各生物标记的灵敏度和特异性的截止值，对癌的患病率加权并选择起源组织；
d.根据通过线性判别分析确定的最高概率来确定起源，或确定该癌不是源自特定癌集合；和
e.任选地测量一种或多种其它不同癌的特异性生物标记，并为其它生物标记重复步骤c)和d)。
2.权利要求1的方法，其中所述标记基因选自与下述相对应的组中的至少一种：
i.SP-B、TTF、DSG3、KRT6F、p73H或SFTPC；
ii.F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10或FKBP10；或
iii.CDH17、CDX1或FABP1。
3.权利要求2的方法，其中所述标记基因是SP-B、TTF、DSG3、KRT6F、p73H或SFTPC。
4.权利要求3的方法，其中所述标记基因是SP-B、TTF和DSG3。
5.权利要求4的方法，其中所述标记基因还包括，或被替换为，KRT6F、p73H和/或SFTPC。
6.权利要求2的方法，其中所述标记基因是F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10或FKBP10。
7.权利要求6的方法，其中所述标记基因是F5和PSCA。
8.权利要求7的方法，其中所述标记基因还包括，或被替换为，ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10和/或FKBP10。
9.权利要求1的方法，其中所述标记基因是CDH17、CDX1或FABP1。
10.权利要求9的方法，其中所述标记基因是CDH17。
11.权利要求10的方法，其中所述标记基因还包括，或被替换为，CDX1和/或FABP1。
12.权利要求1-11之一的方法，其中使用SEQ ID NO：11-58中的至少一种测量基因表达。
13.权利要求2的方法，其中所述标记基因还选自性别特异性标记，所述性别特异性标记选自下述至少一种
i.在男性患者的情况下，KLK3、KLK2、NGEP或NPY；或
ii.在女性患者的情况下，PDEF、MGB、PIP、B305D、B726或GABA-Pi；和/或WT1、PAX8、STAR或EMX2。
14.权利要求13的方法，其中所述标记基因是KLK2。
15.权利要求14的方法，其中所述标记基因是KLK3。
16.权利要求15的方法，其中所述标记基因还包括，或被替换为，NGEP和/或NPY。
17.权利要求13的方法，其中所述标记基因是PDEF、MGB、PIP、B305D、B726或GABA-Pi。
18.权利要求17的方法，其中所述标记基因是PDEF和MGB。
19.权利要求18的方法，其中所述标记基因还包括，或被替换为，PIP、B305D、B726或GABA-Pi。
20.权利要求13的方法，其中所述标记基因是WT1、PAX8、STAR或EMX2。
21.权利要求20的方法，其中所述标记基因是WT1。
22.权利要求21的方法，其中所述标记基因还包括，或被替换为，PAX8、STAR或EMX2。
23.权利要求13-22之一的方法，其中使用SEQ ID NO：11-58中的至少一种测量基因表达。
24.权利要求1或2的方法，还包括获取附加临床信息，包括转移部位，以确定癌的起源。
25.得到癌的最佳生物标记集合的方法，包括下述步骤：使用已知起源的转移灶，测定其生物标记，并对比所述生物标记与起源不明转移灶的生物标记。
26.一种方法，该方法通过如权利要求1-3之一确定起源不明转移灶的起源、和鉴别其适当的治疗方法，来提供治疗指导。
27.一种方法，该方法通过如权利要求1-3之一确定起源不明转移灶的起源、和鉴别其相应的预后，来提供预后。
28.发现生物标记的方法，其包括，测定特定转移灶中标记基因的表达水平，测量该标记基因的生物标记以确定其表达，如权利要求1所述分析标记基因的表达，确定所述标记基因是否对起源肿瘤是有效特异性的。
29.组合物，其含有选自SEQ ID NO：11-58的至少一种分离的序列。
30.用于进行如权利要求1-3之一的测定的试剂盒，其含有生物标记检测试剂。
31.用于进行权利要求1-3之一的方法的微阵列或基因芯片。
32.诊断/预后组合，其包含权利要求2-11或13-22之一所述基因的组合的分离核酸序列、它们的互补序列、或其部分，其中所述基因的组合足以测量或表征相比于不同癌或正常组织的细胞，含转移细胞的生物样品中的基因表达。
33.根据权利要求2-11或13-22之一的方法，还包括测量在样品中组成型表达的至少一种基因的表达。
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