TWI725248B - 辨識轉移性腫瘤的原發位置之方法及系統 - Google Patents
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Abstract
本揭露為涉及一種方法用以產生候選探針和其使用方法。具體而言，
所述候選探針可以與特定基因結合，並且進一步鑑定有此需要的受試者中轉移性腫瘤的原發部位。簡而言之，所述方法包含以下步驟．：(a)使用晶片偵測具有已知原發位置之轉移性腫瘤樣本中的基因表現；(b)使用處理模組比較所述轉移性腫瘤樣本中的基因表現；(c)依據前述步驟之比較結果產生候選探針。而使用方法則包含以下步驟．：(a’)使用前述候選探針以偵測具有未知原發位置的測試樣本中相對應之基因表現；以及(b’)使用處理模組以預測測試樣本的原發位置。此外，本揭露還提供一個系統用以執行前述之方法，並且所述系統包含一個具有候選探針的矩陣之偵測晶片和一個處理模組。
Description
本專利申請說明涉及一種用以辨識轉移性腫瘤的方法及系統。更具體地說，一種用以辨識轉移性腫瘤的原發位置的方法及系統。
辨識出轉移性腫瘤的原發位置是急迫性的，並且對於醫生為患者開出適當的治療方法也是必要的。然而，鑑別一些低度分化的癌症或所謂的「原發位置未明癌症」(Cancer of Unknown Primary,CUP)的原發位置有時是具有挑戰性的。
對於難以根據現有技術確定原發部位的「原發位置未明癌症」，患者仍須透過額外的程序(例如：隨機活檢)以希望找到轉移腫瘤的原發部位。然而，透過前述的程序或方法之後而鑑定出轉移性腫瘤的原發部位之機會仍然是相當不樂觀的。
因此，本揭露希望提供一種方法以準確地和有效地鑑定出轉移性腫瘤的原發位置。
本揭露提供一種方法藉由產生複數候選探針來辨識一個哺乳動物中特定疾病、失調或基因症狀的至少一個原發位置。所述方法包含以下步
驟：步驟(a)為藉由偵測晶片從一個患有特定疾病、失調或基因病變的受試者的標準樣本中產生複數基因的表現；步驟(b)為比較所述複數基因的表現以產生比較結果；以及步驟(c)為轉化出一個包含所述複數候選探針的矩陣。而其中，所述標準樣本是一個被診斷為轉移性癌症且具有已知原發位置的樣本。所述偵測晶片與所述處理模組彼此電訊連接。並且，所述複數候選探針可以結合至任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID NO：1~695或SEQ ID NO：1~695的任一片段。
在本發明一實施例中，其中所述複數候選探針的數量為大約650個。
在本發明一實施例中，其中所述複數候選探針的數量為大約100個。
在本發明一實施例中，其中所述複數候選探針的數量為大約50個。
在本發明一實施例中，其中所述偵測晶片包含：微陣列生物晶片、次世代定序儀、即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative PCR)、磁珠系統。
在本發明較佳實施例中，其中所述處理模組是中央處理器(CPU)。
在本發明較佳實施例中，其中所述標準樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
在本發明較佳實施例中，其中所述特定疾病、失調或基因症狀包含血液科惡性腫瘤(hematologic malignancies)或實質固體瘤(solid tumors)。
在本發明較佳實施例中，其中所述複數候選探針的長度為至少20個核苷酸。
在本發明較佳實施例中，其中所述複數候選探針為來自於表一的大約695基因，更佳為50個基因或更少
本揭露還提供一種方法用以辨識一個哺乳動物中特定疾病、失調或基因症狀的至少一個原發位置。而所述方法包含以下步驟：步驟(a’)為分析：藉由一個包含複數候選探針的偵測晶片來分析一個患有特定疾病、失調或基因病變的受試者的測試樣本中晶片矩陣上基因的表現量；和步驟(b’)為預測：藉由處理模組並且依據所述矩陣的表現量來預測所述測試樣本的原發位置。其中，測試樣本是一個被診斷為轉移性癌症且具有至少一個未知原發位置，並且所述複數候選探針可以結合任何選自SEQ ID NO：1~695的複數多核苷酸序列或SEQ ID NO：1~695的任一片段。
在本發明較佳實施例中，其中所述測試樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
本揭露還提供一種系統用以辨識一個哺乳動物中特定疾病、失調或基因症狀的至少一個原發位置。而所述系統包含：具有複數候選探針的偵測晶片以及處理模組，並且偵測晶片和處理模組彼此以電訊連接。此外，複數候選探針可以結合至選自SEQ ID NO：1~695的任一複數多核苷酸序列或SEQ ID NO：1~695的任一片段。
在本發明較佳實施例中，所述組織或器官可以是任何組織或器官，例如：乳房、胃、結腸、胰腺、膀胱、甲狀腺、前列腺、腎、肝、卵巢、生殖細胞、軟組織、皮膚、淋巴結或肺。
以上本專利申請所揭露的相關內容和其他相關可透過以下較佳實施例的描述和附圖作進一步闡明。雖然可能會有變化或修改，但是其並不背離本專利申請所揭示的新穎性構想的精神和範圍。
附圖圖片中透過示例而非局限性方法展示出了一個或多個實施例，其中具有相同參考數位識別碼的元件始終表示類似元件。除非另有特別說明，本附圖並非等比例圖。
圖1主要揭示了一個透過微陣列基因表達資料集所獲得的具有不同原發部位的轉移性癌症的關聯階層式分群結果。
附圖僅為示意圖，並且無任何限制。本揭露中的所有參考標記不得解釋為對本專利申請中權利要求範圍的限制。舉例來說，在各個附圖中相同的附圖標記表示相同的元件。
除非另有定義，否則本文使用的所有術語(包括科技術語)的意義與本專利申請說明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。應當進一步理解，常用詞典中定義的術語的含義應當與相關領域和本專利申請說明的上下文中的含義一致，且不會解釋地過於理想化或過於正式，除非本文中明確定義。
本專利申請說明中，「一項實施例」或「某一實施例」的引用是指關於該實施例所描述的某一特定特徵、結構、或特性包括於至少一項實施例中。因此，本專利申請說明中不同位置出現的短語「在一項實施例中」或「在某一實施例中」不一定均指同一實施例。此外，上述特定特徵、結構或特性可通過任何適宜方式在一項或多項實施例中進行組合。
定義說明
應當理解，除非上下文另有明確指示，否則單數形式「一」、「某」、「該」、「所述」也包括複數形式。因此，舉例來說，當使用術語「一個元件」時，其包括多個所述組件以及在所屬領域中習知的同等物。
當本文在敘述一個可測量的數值時(例如：數量或週期等等)，本文所使用的「大約」是指數值±20%或是±10%，其較佳範圍為±5%，而更佳範圍為±1%。並且進一步更佳範圍為一個特定數值的±0.1%，因為所述數值範圍適合實施本發明所揭露之內容。
本文中所使用的「疾病」是用以形容動物的健康狀態呈現無法維持體內平衡(homeostasis)，並且其中如果疾病沒有改善，則所述動物的健康將繼續惡化。相對地，「失調」是用以形容動物的健康狀態是呈現可維持體內平衡，但是所述動物現階段的健康狀態不如沒有失調(disorder)時的狀態。然而，若繼續不治療則不一定會進一步導致動物的健康狀況下降。
本文中所使用的「癌症(cancer)」和「腫瘤(tumor)」是用以定義一種疾病，其特徵在於此異常細胞之快速且不受控制的生長。所以「癌症」和「腫瘤」在此是可以互換的名詞。癌症細胞可以在局部擴散或通過血液和淋巴系統擴散到身體的其他部位。癌症舉例來說(但不限制)包括：乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴癌、白血病、肺癌等等。
本文使用的「原發位置」或「原位」均是用以定義腫瘤/癌症發展的第一部位(即組織或器官)。因此，字詞「原發位置」或「原位」兩者之間是可以互換的。
本揭示之以下內文中之縮寫為此領域之通常知識者用以代表特定核苷酸之縮寫，其中「A」指的是腺嘌呤核苷酸、「C」指的是胞嘧啶核苷酸、「G」指的是鳥嘌呤核苷酸、「T」指的是胸腺嘧啶核苷酸、「U」指的是尿嘧啶核苷酸。
除非有特別說明，「一個用以編譯胺基酸之核苷酸序列」是包含彼此簡併(degenerate)形式並編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。而所述之「一個用以編譯蛋白質(protein)或核糖核酸(RNA)之核苷酸序列」其中也可能包含內含子(introns)以延長所述之苷酸序列。因此，在某些狀態之下用以表現某些蛋白質或核糖核酸之核苷酸序列包含內含子序列。
本文中的「多核苷酸(polynucleotide)」指的為前後相連如鏈狀之核苷酸。此外核酸(nucleic acids)為核苷酸之多聚體。因此，據上述本文中之多核苷酸與核酸為可互相替換之用詞。而此領域之通常知識者也可以理解所述核酸與所述多核苷酸為相等之用詞，且可以被水解成核苷酸。而本文所使用之多核苷酸指的是(但非限定)所屬領域藉由各種方式所獲得之核酸序列，其包含(但非限定)：基因重組手段(recombinant means)，舉例來說為從一個重組基因庫(recombinant library)或一個細胞之基因體(genome)利用習知之克隆技術(cloning technology)或是聚合酶連鎖反應技術(PCR)克隆出核酸序列，或是利用合成技術而合成出所述核酸序列。
詳細說明
本揭露提供一種方法用以產生複數候選探針用以辨識一個哺乳動物中特定疾病、失調或基因症狀的至少一個原發位置。所述方法包含以下步驟(a)至(c)。首先，在步驟(a)中為藉由一個偵測晶片從一個患有特定疾病、失調或基因病變的受試者的標準樣本中產生複數基因的表現，並且所述標準樣本是一個被診斷為轉移性癌症且至少一個具有已知原發位置。於步驟(b)中為利用一個處理模組進行比較分析所述複數基因的表現以產生一個比較結果分析。而於步驟(c)中為進一步藉由處理模組依據於步驟(b)中所產生的比較結果分析，而轉化出一個包含所述複數候選探針的矩陣。此外，所轉化出的複數候選探針可以結合至選自SEQ ID NO：1~695的任一複數多核苷酸序列或SEQ ID NO：1~695的任一片段。其中，上述之複數多核苷酸序列即為表一中所列之基因的序列。所述偵測晶片與所述處理模組彼此電訊連接。
在一實施例中，其中所述複數候選探針的數量為大約650個。在另一實施例中，其中所述複數候選探針的數量為大約100個。在另一較佳實施例中，其中所述複數候選探針的數量為大約50個。
在另一實施例中，其中所述複數候選探針的長度為至少20個核苷酸。
在一實施例中，其中用以辨識癌症原發位置的偵測晶片包含：微陣列生物晶片、次世代定序儀、即時聚合酶鏈鎖反應、磁珠系統。在另一實施例中，其中用以比較複數基因表現量或是產生具有複數候選探針的矩陣之處理模組為一個中央處理器。
在一實施例中，用以產生所述複數候選探針的標準樣本可以是血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。在另一實施例中，所述特定疾病、失調或基因症狀包含血液科惡性腫瘤或實質固體瘤。
本揭露還進一步提供一種方法用以辨識一個哺乳動物中特定疾病、失調或基因症狀的至少一個原發位置。更明確地，所述特定疾病、失調或基因症狀是指癌症。而上述之方法包含步驟(a’)至步驟(b’)。首先，在步驟(a’)中為藉由一個包含由前述之方法所產生出之複數候選探針的偵測晶片分析一個患有特定疾病、失調或基因病變的受試者的測試樣本中矩陣的表現量。而所述測試樣本是一個被診斷為轉移性癌症且具有至少一個未知原發位置。並且所述複數候選探針可以結合至如請求項1~4之任一項中任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID NO：1~695或SEQ ID NO：1~695的任一片段。於步驟(b’)中為藉由處理模組並且依據所述矩陣的表現量預測所述測試樣本的原發位置。
在一實施例中，用以產生所述複數候選探針的測試樣本可以是血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。在另一實施例中，所述特定疾病、失調或基因症狀包含血液科惡性腫瘤或實質固體瘤。
本揭露同時也提供一個系統用以辨識一個哺乳動物中特定疾病、失調或基因症狀的至少一個原發位置。而所述系統包含：具有複數候選探
針的偵測晶片以及處理模組，並且偵測晶片和處理模組彼此電訊連接。此外，所述偵測晶片中包含複數候選探針可以鑑別出原發位置，並且複數候選探針還可以結合至選自SEQ ID NO：1~695的任何複數多核苷酸序列或SEQ ID NO：1~695的任一片段。更明確地，上述之複數多核苷酸序列即為表一中所列之基因的序列。因此所述複數候選探針可以結合並且進一步辨認表一中之基因。
範例一
在下述內容中，所有統計結果均是透過中央處理單元之處理模組所進行運算的。而表一中的候選基因探針於下述內文中簡稱為「PH2」、「PH2探針」或「695個基因轉錄表達譜(profiles)」。
產生PH2探針
在本揭露的步驟(a)中，主要是產生癌症樣本的全部整體基因體表達譜。更明確地，主要是從GEO公共資料庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)收集原發自不同部位的轉移性癌症樣本的轉錄組微陣列資料集。如表二所示，其揭示用於探針研發和驗證的資料主要來自15個原發位置的超過五百個轉移癌樣本。
首先為了產生本揭露的候選探針，我們從GSE12630資料集中選擇了186個轉移樣本(源自15個不同組織起源的遠處)以建立訓練資料集。更明確地，建立所述訓練資料集的方式，為先從GEO中獲取CEL資料，然後透過AffyQualityReport進行資料品質評估，而進一步去除資料較差的陣列。然後，經過上述步驟將資料篩選過後則進一步使用Robust Multichip Average(RMA,Irizarry R et al.Biostatistics 2003,4(2)：249-264)進行資料標準化。其中，AffyQualityReport和RMA均是從Bioconductor package中的R package(http：//www.r-project.org/)所獲得。於標準預處理程序方式處理之後，對轉錄資料進一步進行統計以及生物資訊分析。
步驟(b)則是進行比較不同腫瘤樣本中每個基因的表現量。由步驟(a)中產生了不同腫瘤組織中每種基因的表現量。而為了進一步進行比較，則首先依據以下公式產生每個腫瘤樣本中表現量的變異係數(CV)值：變異係數(CV)的定義為標準偏差σ除以平均值μ的比值：Cv=σ/μ
因此，表三所揭示的示例性的基因表現矩陣被進一步產生以利後續程序的進行。於表三中，每一直行代表不同的腫瘤樣本(例如：肝臟樣本1、肝臟樣本2等等)中各特定基因的表現量，而每一橫列代表某一特定基因於各個腫瘤樣本中的表現量。
更明確地，基因篩選的程序為首先從步驟(a)中所獲得的訓練資料集中選出特定基因，其中所述基因的CV值是於所有不同組織類型中佔整個轉錄體的前5%。而上述所得到的高度變異表現的基因進一步形成組織特異性候選基因組(the set of candidate tissue-classifier genes)，其隨後則使用開放軟體MeV v4.8.1(https：//sourceforge.net)對15個組織樣本進行關聯階層式分群(Hierarchical Clustering)以消除重複性資料。其中皮爾生相關係數(Pearson's correlation coefficient)分析和平均關聯性(average linkage)分析則分別使用在Distance Metric和Linkage方法。
於隨後的關聯階層式分群分析中，選擇每個簇的代表性基因並去除具有高度相似表達譜的額外基因。而上述所產生的候選基因則如表一所揭示。
關聯階層式分群分析(使用皮爾生相關係數分析)
步驟(c)主要用於根據表一中所揭示的候選基因而進一步篩選和產生本發明的候選探針。換句話說，即探針序列是被設計成可與SEQ ID No.1~695的序列互補。此外，候選探針序列還可以是與SEQ ID No.1~695完整序列完全互補的長序列，或是僅與SEQ ID No.1~695的部分序列片段互補的短序列。
用寡核甘酸微陣列(oligonucleotide microarray)驗證以PH2探針檢測轉移性癌症樣本之效用
為了驗證PH2探針在鑑定轉移性癌症的原發部位中的作用，從公共數據庫GEO收集了更多具有轉移性癌症樣本的全基因組基因表達資料集。(如表二所揭示)
GSE20565資料集(Meyniel et al.BMC Cancer 2010 May 21；10：222)包含44個由乳房轉移的卵巢癌的樣本。於PH2表達譜的應用中，此44個樣本中有43個樣本被正確地預測其主要原發位置為乳房(達到97.7%的準確度)。GSE22541資料集(Wuttig et al.Int.J.Cancer,2009；125：474-482)包含30個從透明細胞腎細胞癌轉移至肺臟的樣本。而在這30個樣本中，有27個樣本被正確地預測其原發位置為腎臟(達到90%的準確度)。GSE15605資料集(Raskin L.et al.J Invest Dermatol 2013 Nov；133(11)：2585-92)中的12個轉移性黑素瘤樣本中有11個被正確地預測，其中這些樣本是藉由穿刺
活體細胞檢查(punch biopsy)從脾臟、小腸、淋巴結、皮下軟組織中取得。由GSE19949資料集(Beleut M.et al.BMC Cancer 2012 Jul 23；12：310)中所獲得的15個轉移性腎細胞癌則全部均透過PH2探針成功鑑定其原發位置為腎臟。由GSE14378資料集(Wuttig et al.Int.J.Cancer 2009；125：474-482)中所獲得轉移至肺臟的腎細胞癌，20個樣本中的19個也藉由600個基因之轉錄譜成功地證實其原發位置。
依據不同的實驗平台之需求而減少基因之數目
為了因應各種實驗平台，例如：使用磁珠系統鑑定轉移性癌症的原發位置，則可以透過消除具有相似表現譜的基因而減少695個基因轉錄譜的基因數目。更明確地，透過減少上述步驟(b)中的分群(clusters)數目則可進一步消除並產生較小(具有較少基因數量)的分類基因組。在利用原位組織預測的演算程序對測試資料集進行驗證之後，本發明能夠將所需基因數目降低到只需要53個基因，且在後續之結果中均證明這些基因均可在磁珠上有效地運作。如表五中之驗證測試結果所揭示，使用上述PH2探針的子集來預測轉移性癌症的原發位置是高度符合期待的。
舉例來說：由GSE20565資料集所獲取的44個樣本中有42個被正確地預測；由GSE19949資料集所獲取的15個樣本中有15個被正確地預測。
在某些實驗平台中，較少數量的基因是較佳的。在一個實施例中，可以使用一組僅具有約53個基因之PH2探針子集來鑑定癌症之原發位置。當使用如前述具有較多基因組的驗證方法進行驗證時，以GSE14108資料集作為說明範例，則其預測結果顯示使用PH2探針子集的預測準確性從86%(24/28)顯著下降至64%(18/28)。然而，如果將預測模型中使用的KNN的參數k由1更改至2，則對於所有測試資料集其準確度則增加至100%(28/28)。由此結果顯示，如果恰當地選擇，則使用PH2探針子集預測轉移性癌症之原發位置可以具有如使用全部PH2標誌(markers)一樣的準確率。
磁珠系統(QG)於預測轉移性腫瘤之原發位置的臨床驗證
病患與其檢體：
檢測中所使用之轉移性腫瘤檢體是取自癌症患者身上，且其腫瘤是經過台灣花蓮慈濟醫院的腫瘤醫師和病理醫師確診為轉移性癌症。所有腫瘤檢體捐贈者均在進行手術切除腫瘤前都簽署了同意書。而腫瘤組織(如表六所揭示)在經由手術切下之後隨即浸入液氮中，然後進行RNAlater處理以便用於之後的PH2-QuantiGene測定。
分析套件(Assay Kit)與訊號偵測
客製化PH2-QuantiGene分析套件則委託Affymetrix Inc.公司製作。Affymetrix Inc.公司依據我們的設計製造出PH2探針(載體為Panomics beads)，且進一步將這些探針共價鍵結至磁珠上和組裝必要的試劑並對最終產物進行品管測試。而在分析最終步驟時，則使用Luminex® 100/200TM檢測探針與基因雜交之訊號。
PH2於Quantigene中的分析則於兩個分開的實驗中進行。第一個實驗則是使用Luminex® 200TM偵測檢測雜交信號，而第二個實驗則是使用Luminex® 100TM。每個樣本均在兩個實驗中均重複測定以進行確認。而在每個測定中，樣本的使用量大約為米粒般大小。依照Panomics所提供的實驗操作流程以測量磁珠上每種探針的表現量。
分析和統計
將從Luminex螢光偵測儀所檢測到的PH2-Quantigene磁珠上每個基因的表現量資料進行預處理以及分析。更明確地，在使用k最近鄰居分類法模型(以下簡稱為「KNN」)，並且在條件k=1、k=2、k=3時分別計算15個候選組織中每一個成為主要原發位置的概率。其運算方式主要比較了測試組織和15個組織專一性表現基因譜(15 tissue-specific gene expression profiles)中每一個之間600個基因譜的皮爾生相關係數數值(coefficient of correlation by Pearson’s correlation)。而其中相關係數最高的組織則是為預測的原發位置。
k最近鄰居分類法(k-nearest neighbor method)：
根據本揭露之內容，如果癌症/腫瘤的原發位置是從乳房、胃臟、結腸、胰臟、膀胱、甲狀腺、前列腺、腎臟、肝臟、卵巢、生殖細胞、軟組織、皮膚、淋巴結、肺臟等等的組織/器官之一，則可以利用PH2探針進一步鑑定轉移性癌症/腫瘤的原發位置。元資料分析(meta-data analysis)結果顯示，部分的或是全部的PH2探針均可以非常精確地預測癌症/腫瘤的原發位置。因此，部分實驗進一步使用臨床檢體來驗證PH2探針辨識之基因標誌(gene markers)。
在使用帶有如前述各個PH2探針的寡核苷酸的磁珠的檢測實驗中，磁珠是從QuantiGene所購得，而磁珠是由Panomics所開發並由eBioscience(Affymetrix Inc.)進行銷售。在應用於臨床檢體之前，PH2探針已經藉由從NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的GEO公開資料庫所獲得的轉錄組資料集進行驗證。而上述表四與表五中的陽性分析結果顯示PH2探針是真的適合應用於臨床檢體的檢驗中。
總計使用了15個來自癌症患者的檢體。其中，所有的檢體和捐贈者的臨床資訊對分析者均是保密的，雖然每個檢體的病理特徵和診斷均已經被病理學家和外科醫生所驗證。15個檢體是在必要的手術期間從各種器官(包括肝臟、結腸、乳房、脾臟、胰臟、會陰等)切下的，其中14個為轉移性腫瘤，而1個為軟組織良性腫瘤。14個轉移性檢體中有3個具有除15個組織/器官之外的原發位置，因此所述檢體從本研究中捨棄。
為了對臨床檢體進行PH2/Quantigene分析，首先將冷凍組織切割、解凍，並用使用微杵手動將組織均質化。然後萃取出RNA並且將其與PH2/Quantigene磁珠進行雜交反應。依照製造商所提供的標準操作流程進行後續步驟直Luminex機器偵測到信號。然後，預測方法的最後一步為將
上述Luminex所輸出的資料用含有KNN方法的PH2探針進行計算機演算分析。
總計11個其原發位置符合前述15個候選原發位置的檢體被用於最終計算。對於這11個轉移性的檢體，則分別使用k=1、k=2、k=3來預測其原發部位(換句話說，以它們的正確原發部位是否符合最高評分組織之第一名(k=1)、前兩名(k=2)或前三名(k=3)。而在本研究中透過PH2探針預測癌症原發位置之整體準確度在k=3時為100%，參見表七和表八。
1：腫瘤樣本的原發位置。
2：腫瘤樣本被摘取時的所在器官。
PH2探針之效果則透過三種不同檢驗平台做進一步確認。而表九中揭示了三個平台之間的預測結果比較。
此領域之通常技術人員可以理解，任何依據上述實施例所揭示而進行之改變均不背離本發明之精神。據此，可以理解的是本揭露不限於前述所公開的特定實施例，而是希望涵蓋在後續專利申請範圍所限定的精神和範圍內的修改。
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<213> 人工序列(synthesized)
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<213> 人工序列(synthesized)
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<213> 人工序列(synthesized)
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<211> 528
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<213> 人工序列(synthesized)
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<210> 671
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<213> 人工序列(synthesized)
<400> 671
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<213> 人工序列(synthesized)
<400> 672
<210> 673
<211> 539
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<213> 人工序列(synthesized)
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<211> 533
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<213> 人工序列(synthesized)
<400> 674
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<211> 537
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<213> 人工序列(synthesized)
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<210> 676
<211> 303
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<213> 人工序列(synthesized)
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<210> 677
<211> 567
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 677
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<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 678
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<211> 371
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
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<211> 355
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
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<211> 484
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 681
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<211> 448
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 682
<210> 683
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 683
<210> 684
<211> 403
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 684
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<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 685
<210> 686
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 686
<210> 687
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 687
<210> 688
<211> 541
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<213> 人工序列(synthesized)
<400> 688
<210> 689
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 689
<210> 690
<211> 533
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 690
<210> 691
<211> 461
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 691
<210> 692
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 692
<210> 693
<211> 445
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 693
<210> 694
<211> 512
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 694
<210> 695
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列(synthesized)
<400> 695
Claims (17)
- 一種產生複數候選探針之方法，其中所述複數候選探針被用以辨識哺乳動物中腫瘤的原發位置，其包含：(a)取得複數標準樣本，其為已轉移癌症組織，並且其各具有已知且不同的原發位置，其中各所述複數標準樣本不具從各所述原發位置取得的原位癌症組織；(b)偵測各所述複數標準樣本中複數基因之表現，並產生表現陣列；(c)利用所述表現陣列產生各所述複數基因的變異係數值，並且利用分群分析從所述複數基因中篩選出可代表各所述原發位置之複數候選基因；以及(d)根據所述複數候選基因產生複數候選探針，其中所述複數候選探針包含可以與SEQ ID NO：1~695中的其中之一完整序列或其中之一部份序列互補的序列，其中所述複數候選探針的數量為至少50個，並且每個所述候選探針的長度為至少20個核苷酸。
- 如請求項1所述之方法，其中所述複數候選探針的數量為至少600個。
- 如請求項1所述之方法，其中所述複數候選探針的數量為至少100個。
- 如請求項1所述之方法，其中所述複數標準樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
- 一種辨識哺乳動物中腫瘤的原發位置之方法，其包含：(a)利用如請求項1所述之方法產生複數候選探針；(b)取得測試樣本，其原發位置未確定；(c)利用所述複數候選探針檢測所述測試樣本中所述複數候選基因之表現；(d)利用所述表現判定所述測試樣本之原發位置；以及 (e)對比所述測試樣本被判定的原發位置和所述測試樣本的取得位置是不同或相同以辨識所述測試樣本為轉移癌症或原位癌症。
- 如請求項5所述之方法，其中所述測試樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
- 如請求項1或5所述之方法，其中所述腫瘤包含血液科惡性腫瘤或實質固體瘤。
- 如請求項1所述之方法，其中所述分群分析包含：階層式分群分析。
- 一種產生複數候選探針之系統，其中所述複數候選探針被用以辨識哺乳動物中腫瘤的原發位置，其包含：偵測晶片，其用於檢測各複數標準樣本中複數基因之表現，並產生表現陣列，其中所述複數標準樣本為已轉移癌症組織且各具有已知且不同的原發位置，並且各所述複數標準樣本不具從各所述原發位置取得的原位癌症組織；以及處理模組，其利用所述表現陣列產生各所述複數基因的變異係數值，並且利用分群分析從所述複數基因中篩選出可代表各所述原發位置之複數候選基因，再根據所述複數候選基因產生複數候選探針；其中，所述處理模組與所述偵測晶片電訊連接；其中，所述複數候選探針包含可以與SEQ ID NO：1~695中的其中之一完整序列或其中之一部份序列互補的序列，其中所述複數候選探針的數量為至少50個，並且每個所述候選探針的長度為至少20個核苷酸。
- 如請求項9所述之系統，其中所述複數候選探針的數量為至少600個。
- 如請求項9所述之系統，其中所述複數候選探針的數量為至少100個。
- 如請求項9所述之系統，其中所述複數標準樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
- 一種用以辨識哺乳動物中腫瘤的原發位置之系統，其包含：檢測晶片，其包含利用如請求項9所述之系統所產生的複數候選探針，其中所述偵測晶片被用於檢測測試樣本中所述複數候選探針之表現，並且所述測試樣本之原發位置未確定；以及處理模組，其利用所述表現判定所述測試樣本之原發位置，並且對比所述測試樣本被判定的原發位置和所述測試樣本的取得位置是不同或相同以辨識所述測試樣本為轉移癌症或原位癌症；其中，所述處理模組與所述偵測晶片電訊連接。
- 如請求項9或13所述之系統，其中所述檢測晶片包含：微陣列生物晶片、次世代定序儀、即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative PCR)、磁珠系統。
- 如請求項13所述之系統，其中所述測試樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
- 如請求項9或13所述之系統，其中所述處理模組是中央處理器。
- 如請求項9或13所述之系統，其中所述腫瘤包含血液科惡性腫瘤或實質固體瘤。
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| Tothill RW et al., "An Expression-Based Site of Origin Diagnostic Method Designed for Clinical Application to Cancer of Unknown Origin", Cancer Research, vol.65, no.10, page:4031-4040, 2005/05/15 Tothill RW et al., "Development and validation of a gene expression tumour classifier for cancer of unknown primary", Pathology, vol.47, no.1, page:7-12, 2015/01 * |
| Tothill RW et al., "Development and validation of a gene expression tumour classifier for cancer of unknown primary", Pathology, vol.47, no.1, page:7-12, 2015/01 |
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