KR101695866B1 - 전립선 암 마커로서의 포스포디에스테라제 9ａ - Google Patents

전립선 암 마커로서의 포스포디에스테라제 9ａ Download PDF

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Abstract

본 발명은 전립선 암용 마커로서 사용하기 위한 포스포디에스테라제 9A (PDE9A), 및 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 마커로서 PDE9A의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 조성물, 상응하는 방법 및 면역분석, 호르몬-내성 전립선 암 대 호르몬-민감성 전립선 암을 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 방법, 상응하는 면역분석, 데이터 획득 방법, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 면역분석, 전립선 치료요법에 대한 적격성에 대해 개체를 동정하는 방법, 전립선 암 질환을 가진 개체 또는 개체의 집단을 등급화하기 위한 면역분석, 전립선 암을 가진 개체를 등급화하기 위한 면역분석에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전립선 암, 특히 호르몬-내성 전립선 암의 치료용 약제학적 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

전립선 암 마커로서의 포스포디에스테라제 9Ａ{PHOSPHODIESTERASE 9A AS PROSTATE CANCER MARKER}
본 발명은 전립선 암에 대한 마커로서 사용하기 위한 포스포디에스테라제 9A(PDE9A), 및 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단, 검출, 모니터링 또는 예측하기 위한 마커로서의 PDE9A의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 조성물, 상응하는 방법 및 면역분석, 호르몬-내성 전립선 암 대 호르몬-민감성 전립선 암을 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 방법, 상응하는 면역분석, 데이터 획득 방법, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 면역분석, 전립선 암 치료요법에 대한 적격성에 대해 개체를 동정하는 방법, 전립선 암 질환을 가진 개체 또는 개체들의 집단을 등급화하기 위한 면역 분석, 전립선 암을 지닌 개체를 등급화하기 위한 면역분석에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전립선 암, 특히 호르몬-내성 전립선 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 이들의 용도를 예측한다.
암은, 세포의 그룹이 조절되지 않은 성장, 침입 및 때때로 전이를 나타내는 질환의 부류이다. 암의 이들 3개의 악성 특성은 자체-제한되고, 침입하거나 전이되지 않는, 양성 종양으로부터 이들을 차별화한다. 선진국 남성들 중에서, 3개의 가장 흔하게 진단된 암은 전립선 암, 폐암 및 대장암이다. 특히 전립선 암은 유럽 남성들에서 가장 흔한 악성 암이다. 2002년 유럽에서는 225,000명의 남성이 전립선 암으로 새로이 진단되었고 약 83,000명이 당해 병으로 사망한 것으로 추정되었다.
특정의 포스포디에스테라제가 암 발생과 관련되어 왔다. 예를 들어, 포스포디에스테라제 PDE7은 만성 림프구성 백혈병과 연관된 것으로 밝혀졌다[참조: Zhang L et al., PNAS, 2008, 105(49): 19532-7]. 그러나, 많은 암 유형 또는 암 진행 형태에 대하여 이용가능한 적절한 마커 분자가 존재하지 않는다.
전립선 암은 종래 예를 들어, 전립선-특이적인 항원(PSA)의 혈청 수준을 통해 진단된다. 그러나, PSA는 전립선 암-특이적인 것은 아니고, 다른 상황에서도 상승하여 다수의 허위-양성을 초래할 수 있다(암은 생검을 실시한 상승된 PSA 수준을 갖는 남성의 대략 70%에서 발견되지 않는다). 또한, "정상" PSA 시험의 존재하에서도 전립선 암으로 나중에 발전하는 예측할 수 없는 수의 허위-음성이 존재할 것이다.
따라서, 전립선 암의 검출, 모니터링 및 예측에 대한 새롭고 효과적이며, 대안적인 진단 관점의 제공이 요구되고 있다.
본 발명은 당해 필요성에 촛점을 맞추고 있으며 전립선 암의 진단 및 검출을 허용하는 수단 및 방법을 제공한다.
상기 목적은 전립선 암 마커로서 사용하기 위한 포스포디에스테라제 9A(PDE9A)에 의해 달성된다.
본 발명자들에 의해 포스포디에스테라제 9A는 전립선 암 세포주 및 환자 유래의 전립선 조직에서 하향-조절되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, PDE9A는 전립선 암 예측을 위한 바이오마커 및 특정의 암 감시 요법의 등급화용 결정 도구 뿐만 아니라, 전립선 암 진행의 진단 및 모니터링으로서도 고려되고 있다. 특히, 본 발명자에 의해, PDE9A는 호르몬-내성 사람-유래의 전립선 세포주뿐만 아니라 상응하는 사람 조직 샘플에서도 하향-조절되는 것이 입증되었다. 따라서, 전립선 암 마커로서의 PDE9A를 기초로 하는 진단 방법 및 용도는 (i) 생명을 위협하는 전립선 암 형태를 검출하고 진단하며, (ii) 생명을 위협하는 전립선 암 형태를 예측하고, (iii) 생명을 위협하는 전립선 암 형태에 대해 암 진행을 모니터링하며, (iv) 무통성 암 형태와 생명을 위협하는 암 형태 사이를 구별하는데 유리하게 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대한 핵산 친화성 리간드 및/또는 펩타이드 친화성 리간드를 포함하는, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 조영제로서 기능하도록 변형된 핵산 친화성 리간드 또는 펩타이드 친화성 리간드를 포함한다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 상기 조성물은 PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 세트, PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브, PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대해 특이적인 압타머(aptamer), PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 및/또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 변이체를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 마커로서의 PDE9A의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 PDE9A의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) 샘플 중의 PDE9A의 수준을 측정하는 단계;
(b) 샘플 중의 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 측정된 PDE9A 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계; 및
(d) 정규화된 발현 수준을, 호르몬-민감성 전립선 암이 배제되도록 선택된 예비측정된 컷오프(cutoff) 값과 비교하는 단계(여기서, 컷오프 값 이하의 정규화된 발현 수준은 호르몬-내성 전립선 암의 지표이며, 여기서 상기 컷오프 값은 약 2 내지 15, 바람직하게는 약 5이다)를 포함하는, 호르몬-내성 전립선 암 또는 호르몬-내성 전립선 암으로의 진행을 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 방법은 호르몬-민감성 전립선 암과 호르몬-내성 전립선 암을 구별한다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) 개체에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 측정된 발현을 대조군 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 데이터 획득 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 진단, 검출, 모니터링, 예측 또는 데이터 획득은 개체로부터 수득된 샘플 상에서 수행된다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(b) 대조군 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(c) 단계 (a) 및 단계 (b)의 PDE9A 발현에 있어서의 차이를 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득된 결과를 바탕으로 하여 전립선 암의 존재 또는 단계 또는 전립선 암의 진행을 측정하는 단계를 적어도 포함하는, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 면역분석에 관한 것이며, 여기서, 상기 시험 단계는 PDE9A에 특이적으로 결합하는 항체의 용도를 기초로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) 샘플 중의 PDE9A의 수준을 측정하는 단계;
(b) 샘플 중의 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계; 및
(d) 상기 정규화된 발현 수준을 호르몬-민감성 전립선 암을 배제하기 위해 선택된 예비측정된 컷오프 값과 비교하는 단계(여기서, 컷오프 값 이하의 정규화된 발현 수준은 호르몬-내성 전립선 암의 지표이며, 여기서 상기 컷오프 값은 약 2 내지 15, 바람직하게는 약 5이다)를 포함하는, 호르몬-민감성 전립선 암과 호르몬-내성 전립선 암을 구별하기 위한 면역분석에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) 개체로부터 수득된 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(b) 상기 샘플에서 표준 유전자의 발현을 시험하고/하거나 대조군 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(c) 단계 (b)의 PDE9A의 대조군 샘플에서의 수준에 대해 단계 (a)의 발현의 수준을 분류하는 단계; 및
(d) 개체를 전립선 암 치료를 받기에 적격인 것으로 동정하는 단계(여기서, 개체의 샘플은 변경된 수준의 PDE9A 발현을 가진 것으로 분류된다)를 포함하는, 전립선 암 치료요법에 대한 적격성에 대해 개체를 동정하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
(a) 개체로부터 수득된 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(b) 상기 샘플에서 표준 유전자의 발현을 시험하고/하거나 대조군 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(c) 단계 (a)의 PDE9A의 발현 및 단계 (b)에서 PDE9A 및/또는 표준 유전자의 발현에 있어서의 차이를 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득한 결과를 바탕으로 하여 개체 또는 개체의 집단을 전립선 암 치료요법에 대해 등급화하는 단계(여기서, 개체의 샘플은 변경된 수준의 PDE9A 발현을 갖는다)를 포함하는, 전립선 암 질환을 가진 개체 또는 개체의 집단을 등급화하기 위한 면역분석에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 발현의 상기 시험 또는 측정은 핵산 또는 단백질 수준의 측정 또는 PDE9A, 또는 표준 유전자의 생물학적 활성의 측정에 의해 달성되거나, 추가로 달성된다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 상기 방법 또는 면역분석은 측정된 핵산 또는 단백질 수준 또는 측정된 생물학적 활성을 대조군 수준과 비교하는 추가의 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 상기 표준 유전자는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene), 특히 바람직하게는 GAPDH 또는 PBGD, 또는 상이한 포스포디에스테라제, 특히 바람직하게는 PDE4D5이다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 상기 방법 또는 면역분석은 전립선 특이적인 항원(PSA)의 수준을 측정하는 추가의 단계를 포함한다.
상기에서 정의한 바와 같은 상기 방법 또는 면역분석에서 본 발명의 추가의 바람직한 양태에 있어서, 증가된 수준의 PDE9A 발현 및 약 >2.5ng/ml 내지 약 10 ng/ml 이하의 증가된 수준의 PSA로 분류되거나 시험된 개체는 악성, 호르몬 민감성 전립선 암을 앓고 있는 것으로 확인되고, 감소된 수준의 PDE9A 발현 및 약 > 10 ng/ml 이상의 PSA의 증가된 수준을 갖는 것으로 분류되거나 시험된 개체는 호르몬 내성 전립선 암을 앓고 있는 것으로 확인된다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 상기에서 언급한 샘플은 조직 샘플, 뇨 샘플, 뇨 침강 샘플, 혈액 샘플, 타액 샘플, 정액 샘플, 순환성 종양 세포를 함유하는 샘플, 또는 전립선 분비된 엑소좀을 함유하는 샘플이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
(a) PDE9A의 활성을 직접 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제;
(b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물;
(c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물;
(d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산;
(e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제;
(f) 탈메틸화제(demethylation); 및
(g) 포스포디에스테라제 대체 인자의 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는, 자극성 약제학적 조성물에 관한 것이다.
포스포디에스테라제 9A는 질환-관련된 세포주에서 하향-조절되므로, PDE9A를 변형시키거나 자극하거나, PDE9A 발현을 변형시키거나 자극하거나, 또는 PDE9A 상호작용을 변형시키거나 자극하는 PDE9A 자체 및 제제가 약제로서 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 관측된 하향-조절 공정에 대응함으로써, PDE9A 및/또는 PDE9A 변형제를 의약, 예를 들면, 낮은 PDE9A 발현 또는 이의 하향-조절과 관련된 효과의 전부 또는 일부와 대응하는 의약으로서 사용할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은
(a) PDE9A의 활성을 직접 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제;
(b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물;
(c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물;
(d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산;
(e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제;
(f) 탈메틸화제; 및
(g) 포스포디에스테라제 대체 인자의 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는, 전립선 암의 치료 또는 예방용의 자극성 약제학적 조성물에 관한 것이다.
포스포디에스테라제 9A는 전립선 암 세포주에서 하향-조절되므로, PDE9A를 변형시키거나 자극하거나, PDE9A 발현을 변형시키거나 자극시키거나 또는 PDE9A 상호작용을 변형시키거나 자극시키는 PDE9A 자체 및 제제가 암의 치료용, 특히 전립선 암의 치료용 의약으로서 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 관측된 하향-조절 공정에 대응함으로써, PDE9A 및/또는 PDE9A 변형제를 암성 세포, 특히 전립선 암 세포에서 낮은 PDE9A 발현 및/또는 PDE9A 하향-조절에 대응하는 의약으로서 사용할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
(a) PDE9A의 활성을 직접 억제하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 길항제;
(b) PDE9A의 활성을 간접적으로 억제하는 화합물;
(c) 우성 음성 형태의 PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물;
(d) 우성 음성 형태의 PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산;
(e) PDE9A에 대해 특이적인 miRNA;
(f) PDE9A 안티센스 분자;
(g) PDE9A에 대해 특이적인 siRNA;
(h) PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머;
(i) PDE9A 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 소 분자 또는 펩타이드모사체(peptidomimetic); 및
(j) PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 및/또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 변이체의 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 억제성 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 억제성 또는 상기 자극성 약제학적 조성물은 PDE9A의 발현 수준에 의존하여 전립선 암의 치료에 사용되는 것이고, 여기서, 상기 발현 수준은
(a) 샘플에서 PDE9A의 수준을 측정하는 단계;
(b) 샘플에서 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계에 따라 측정 및/또는 모니터링된다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 양태에서, 증가된 수준 및/또는 증가하는 수준의 PDE9A에 대하여, 상기 억제성 약제학적 조성물이 투여되어야 하고, 감소된 수준 및/또는 감소하는 수준의 PDE9A에 대하여 상기 자극성 약제학적 조성물이 투여되어야 한다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) PDE9A의 활성을 직접 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제;
(b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물;
(c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물;
(d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산;
(e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제;
(f) 탈메틸화제; 및/또는
(g) 개체에 대한 포스포디에스테라제 대체 인자의 투여를 포함하는, 암, 특히 전립선 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기에서 언급된 바와 같은 상기 포스포디에스테라제 대체 인자는 펩타이드, 펩타이드모사체, 소 분자, 항체 또는 압타머이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 상기 전립선 암은 호르몬-내성 전립선 암이다.
본 발명의 이들 및 다른 특성, 특징 및 목적은 본 발명의 원리를 설명할 목적으로 증명하는 첨부되는 도면 및 실시예와 함께 관련된 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
이러한 설명은 본 발명의 영역을 제한하는 것이 아니라, 단지 예시하기 위한 목적으로 제공된다.
도 1은 발현 수준에 대해 시험한 샘플에 대한 개관을 제공한다. AD는 "안드로겐 의존성"을 의미하고, AS는 "안드로겐 민감성"을 나타내고, AI는 "안드로겐 독립성"을 의미한다. 샘플 "LNCaP" 내지 "DuCaP"는 세포주이고, 샘플 "PC-EW" 내지 "PC374"는 이종이식체이다.
도 2는 LNCap에 대해 비교한 전립선 암 세포주 및 이종이식체에서의 상대적인 PDE9A mRNA 발현을 나타낸다.
도 3은 LNCap와 비교하여 GAPDH에 대해 정규화된 전립선 암 이종이식체 세포주에서의 상대적인 PDE9A mRNA 발현을 나타낸다.
도 4는 LNCaP와 비교하여 GAPDH에 대해 정규화된 전립선 암 세포주에서의 상대적인 PDE9A mRNA 발현을 나타낸다.
도 5는 전립선 암 이종이식체 및 세포주에서의 상대적인 PDE9A mRNA 발현을 나타낸다.
도 6은 GAPDH에 대해 정규화된 전립선 암 이종이식체의 PDE9A mRNA 함량을 나타낸다.
도 7은 GAPDH에 대해 정규화된 전립선 암 세포주의 PDE9A 함량을 나타낸다.
도 8은 사람 환자 조직 샘플에서 사람 PDE9A의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 정보는 표 1에 나타낸 바와 같이 총 16개의 상이한 샘플로부터 기원한다. 샘플 그룹 "없음"은 호르몬-반응성 원발성 전립선 종양으로 정의되고, 샘플 그룹 "있음"은 호르몬-내성 전립선 종양으로 정의된다. 사람 전립선 조직에서 사람 PDE9A에 대한 개체의 상대적인 발현 값이다. 결과를 GAPDH 및 PBGD의 발현에 대해 정규화하였다. 데이터 측정에 대해 상대적인 데이터의 평균은 각각의 환자 그룹에 대해 나타낸다.
도 9는 사람 환자 조직 샘플에서 사람 PDE9A의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 정보는 표 1에 나타낸 바와 같이, 총 16개의 상이한 샘플로부터 기원한다(림프절 절제 조직 포함). 샘플 그룹 "없음"은 호르몬-반응성 원발성 전립선 종양으로 정의되며, 샘플 그룹 "있음"은 호르몬-내성 전립선 종양으로 정의된다. 결과들은 GAPDH 및 PBGD의 발현에 대해 정규화되었다. 당해 도면은 사람 PDE9A에 대한 개체의 데이터 상대적인 발현 측정의 박스 플롯(box plot)을 나타내며, 이에 의해, 박스는 모든 측정의 75%를 포함한다. 상대적인 발현 값의 중간값은 2개의 착색된 박스들 사이의 경계로 나타낸다.
도 10은 오리젠(Origene) HPRT 패널 I 및 II로부터 기원한 96개의 상이한 샘플에서의 PDE9A의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 사람 전립선 조직에서의 사람 PDE9A에 대한 개체의 상대적인 발현 값이 나타나 있으며 데이터 상대적인 데이터 측정의 중간값이 각각의 환자 그룹에 대해 나타나 있다.
도 11은 오리젠 HPRT 패널 I 및 II로부터 기원한 96개의 상이한 샘플에서 PDE9A의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 당해 도면은 사람 PDE9A에 대한 개체의 데이터 상대적인 발현 측정의 박스 플롯을 나타내며, 이에 의해 박스는 모든 측정의 75%를 포함한다. 상대적인 발현 값의 중간값은 2개의 회색 박스들 사이의 경계로 나타낸다.
도 12는 쌍-방식의 비교 정상(N) 대 종양에 대한 AUC를 나타내는 사람 전립선 조직 샘플에서의 PDE9A 유전자 발현의 ROC 곡선 묘사를 나타낸다.
도 13은 전립선 PDE-지표(PPI), 예를 들면, 델타(CT [사람 PDE4D5] - CT [사람 PDE9A])의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 사람 PDE9a의 CT 값은 시험한 각각의 개체 조직 샘플에 대한 사람 PDE4D5의 CT 값으로부터 감하였다. 정보는 오리젠 HPRT 패널 I 및 II에서 측정한, 총 96개의 상이한 샘플로부터 기원한다(참조: 실시예), 당해 도는 사람 전립선 조직상에서 사람 델타(CT [사람 PDE4D5 ] - CT [사람 PDE9A ])에 대한 개체의 상대적인 발현 값을 나타낸다. 데이터 상대적인 측정의 중간값은 각각의 환자 그룹에 대해 나타낸다.
도 14는 전립선 PDE-지표(PPI), 즉, 델타 (CT [사람 PDE4D5] - CT [사람 PDE9A])의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 사람 PDE9a의 CT 값은 시험한 각각의 개체 조직 샘플에 대해 사람 PDE4D5의 CT 값으로부터 감하였다. 정보는 오리젠 HPRT 패널 I 및 II에서 측정한, 총 96개의 상이한 샘플로부터 기원하였다(참조: 실시예). 당해 도는 사람 델타 (CT [사람 PDE4D5] - CT [사람 PDE9A])에 대한 개체의 데이터 상대적인 발현 측정의 박스 플롯을 나타내며, 이에 의해, 박스는 모든 측정의 75%를 포함한다. 상대적인 발현 값의 중간값은 2개의 회색 박스들 사이의 경계로 나타낸다.
도 15는 진단력을 평가하기 위한 델타 (CT [사람 PDE4D5] - CT [사람 PDE9A]) 유전자 발현의 수용체 작동 특성(ROC) 곡선을 도시한다. 사람 전립선 조직 샘플상에서 PDE9A 유전자 발현의 ROC 곡선 묘사를 나타내며 이는 쌍-방식의 비교 정상(N) 대 종양에 대한 AUC를 나타낸다.
본 발명자들은, PDE9A가 특정의 전립선 암-관련 세포 유형 및 사람 환자 조직에서 강력하게 하향-조절되므로, 전립선 암용 바이오마커로 사용될 수 있음을 발견하였다. PDE9A 뿐만 아니라 PDE9A를 변형시키거나 PDE9A 발현을 변형시키는 제제도 또한, 특히 전립선 암의 치료용 의약으로서 사용될 수 있다.
비록 본 발명을 특수 양태와 관련하여 기술한다고 해도, 당해 기술이 한정하는 의미로 고려되어서는 안된다.
본 발명의 예시적인 양태를 상세히 기술하기 전에, 본 발명을 이해하는데 중요한 정의를 제공한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 것으로서, 단수형태는 또한 내용에서 달리 명확히 언급하지 않는 한 각각의 복수를 포함한다.
본 발명의 내용에서, 용어 "약" 및 "대략"은, 당해 분야의 숙련가가 여전히 문제의 특징의 기술적 효과를 보장하도록 이해할 것이라는 정확도의 간격을 나타낸다. 당해 용어는 통상적으로 나타낸 수치로 부터 ±20%, 바람직하게는 ±15%, 보다 바람직하게는 ±10%, 및 훨씬 더 바람직하게는 ±5%의 편차를 나타낸다.
용어 "포함하는"은 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "로 이루어진"은 용어 "을 포함하는"의 바람직한 양태인 것으로 고려되어야 한다. 이후, 그룹이 적어도 특정 수의 양태를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 이들 양태만으로 바람직하게 이루어진 그룹을 포함함을 의미한다.
또한, 명세서 및 특허청구의 범위에서 용어 "제1", "제2", "제3" 또는 "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" 등은 유사한 성분들 사이를 구별하는데 사용되며 순서 또는 연대 순을 기술하기에 필수적인 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적절한 상황하에서 교환가능하며 본원에 기술된 본 발명의 양태는 본원에 기술되거나 나열된 다른 서열에서도 작동할 수 있음이 이해되어야 한다.
용어 "제1", "제2", "제3" 또는 "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" 등이 방법 또는 사용의 단계에 관한 것인 경우, 단계들 사이에 시간 또는 시간 간격 일관성은 존재하지 않는데, 즉, 상기 또는 하기 본원에 설정된 바와 같이, 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 단계들은 동시에 수행될 수 있거나, 초, 분, 시간, 일, 주, 월 또는 심지어 년의 시간 간격일 수 있다.
본 발명은 이들이 변할 수 있으므로, 본원에 기술된 특별한 방법, 프로토콜, 단백질, 세균, 벡터, 시약 등에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특별한 양태를 기술하기 위한 목적이며, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 본 발명의 영역을 한정하는 것을 의도하지 않음이 또한 이해되어야 한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 본 발명은 하나의 양태에서 전립선 암 마커로서 사용하기 위한 포스포디에스테라제 9A(PDE9A)에 관한 것이다. 용어 "포스포디에스테라제 9A" 또는 "PDE9A"는 사람 포스포디에스테라제 PDE9A, 즉, 사람 포스포디에스테라제 PDE9A 유전자의 모든 스플라이스(splice) 변이체, 바람직하게는 PDE9A의 전사 변이체 1을 나타내는 진뱅크(Genbank) 수탁 번호: NM_002606(버젼 NM_002606.2, 2009년 3월 9일자의 GI:48762716), PDE9A의 전사 변이체 2를 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001567(버젼 NM_001001567.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762717), PDE9A의 전사 변이체 3을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001568(버젼 NM_001001568.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762719), PDE9A의 전사 변이체 4를 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001569(버젼 NM_001001569.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762721), PDE9A의 전사 변이체 5를 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001570(버젼 NM_001001570.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762723), PDE9A의 전사 변이체 6을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001571(버젼 NM_001001571.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762725), PDE9A의 전사 변이체 7을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001572(버젼 NM_001001572.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762727), PDE9A의 전사 변이체 8을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001573(버젼 NM_001001573.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762729), PDE9A의 전사 변이체 9를 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001574(버젼 NM_001001574.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762731), PDE9A의 전사 변이체 10을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001575(버젼 NM_001001575.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762733), PDE9A의 전사 변이체 11을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001576(버젼 NM_001001576.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762735), PDE9A의 전사 변이체 12를 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001577(버젼 NM_001001577.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762737), PDE9A의 전사 변이체 13을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001578(버젼 NM_001001578.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762739), PDE9A의 전사 변이체 14를 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001579(버젼 NM_001001579.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762741), PDE9A의 전사 변이체 15를 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001580(버젼 NM_001001580.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762743), PDE9A의 전사 변이체 16을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001581(버젼 NM_001001581.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762745), PDE9A의 전사 변이체 17을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001582(버젼 NM_001001582.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762747), PDE9A의 전사 변이체 18을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001583(버젼 NM_001001583.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762749), PDE9A의 전사 변이체 19를 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001584(버젼 NM_001001584.2, 2009년 3월 26일자의 GI:209954812) 및 PDE9A의 전사 변이체 20을 나타내는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001585(버젼 NM_001001585.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762753)에 정의된 서열에 관한 것이다.
보다 바람직하게는 당해 용어는 PDE9A 전사체 변이체 1 내지 20의 상기 나타낸 진뱅크 수탁 번호의 서열에 상응하는 서열 번호 1 내지 20에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 및 전사체 변이체 1 내지 20에 의해 암호화된 PDE9A 폴리펩타이드의 상기 나타낸 진뱅크 수탁 번호의 서열에 상응하는, 서열 21 내지 40에 제시된 바와 같은 상응하는 아미노산 서열에 관한 것이다. 당해 용어는 또한 PDE9A에 대해 고도의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 서열번호 1 내지 20에 제시된 서열중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산, 또는 서열번호 21 내지 40중 어느 것에 제시된 바와 같은 서열 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열, 또는 서열번호 21 내지 40에 제시된 서열 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열번호 1 내지 20에 제시된 바와 같은 서열 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "사람 포스포디에스테라제 PDE9A 유전자", "PDE9A 유전자" 또는 "PDE9A 마커 유전자"는 포스포디에스테라제 9A를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 바람직하게는 당해 용어는 스플라이스 변이체 1 내지 20, 예를 들면, 진뱅크(Genbank) 수탁 번호: NM_002606(버젼 NM_002606.2, 2009년 3월 9일자의 GI:48762716)에 정의되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001567(버젼 NM_001001567.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762717)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001568(버젼 NM_001001568.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762719)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001569(버젼 NM_001001569.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762721)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001570(버젼 NM_001001570.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762723)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001571(버젼 NM_001001571.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762725)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001572(버젼 NM_001001572.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762727)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001573(버젼 NM_001001573.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762729)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001574(버젼 NM_001001574.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762731)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001575(버젼 NM_001001575.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762733)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001576(버젼 NM_001001576.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762735)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001577(버젼 NM_001001577.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762737)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001578(버젼 NM_001001578.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762739)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001579(버젼 NM_001001579.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762741)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001580(버젼 NM_001001580.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762743)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001581(버젼 NM_001001581.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762745)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001582(버젼 NM_001001582.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762747)에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001583(버젼 NM_001001583.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762749)에 제시되거나, 서열 번호 18에 제시되거나, 진뱅크 수탁 번호: NM_001001584(버젼 NM_001001584.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762751) 또는 서열 번호 19 및 진뱅크 수탁 번호: NM_001001585(버젼 NM_001001585.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762753)에 제시되거나 또는 서열 번호 20에 제시된 바와 같은 특이적인 엑손 조합으로서 포스포디에스테라제 9A를 발현하는 유전자에 관한 것이다.
당해 용어는 또한 변이체 1 내지 20으로서 스플라이싱된 포스포디에스테라제 9A를 암호화하는 mRNA 전사체로부터 기원한 DNA 분자, 바람직하게는 cDNA 분자에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "마커" 또는 "PDE9A 마커"는 본원에서 상기 정의된 바와 같이 유전자, 유전 단위 또는 서열(뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 또는 단백질 서열)에 관한 것이며, 이의 발현 수준은 암 세포 또는 암 조직 또는 이의 부분 또는 단편을 포함하는 특정 유형의 샘플내에서 대조군 수준 또는 상태와 비교하여, 변형되고, 바람직하게는 감소된다. 당해 용어는 또한 상기 유전 단위 또는 서열의 특정 발현 생성물, 특히 PDE9A mRNA 전사체, PDE9A 전사체 또는 변이체에 의해 암호화된 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 및 또한 본원에서 상기 기술된 바와 같은 이의 동종 유도체에 관한 것이다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "발현 수준"은 정의된 수의 세포 또는 정의된 조직 부분으로부터 기원가능한 PDE9A 전사체 및/또는 PDE9A 단백질 유도체의 양, 바람직하게는 표준 핵산(예: RNA) 또는 단백질 추출 과정에서 수득가능한 PDE9A 전사체 및/또는 PDE9A 단백질의 양을 말한다. 적합한 추출 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "대조군 수준"(또는 "대조군 상태")는 (a) 질환 상태, 예를 들면, 비-암성인 것이 공지되어 있는 대상체/대상체들로부터 이미 수집하여 저장한 샘플(들)을 사용하여 시험 샘플과 동일한 시간 및/또는 유사한 또는 비교가능한 조건하에서 측정될 수 있는 발현 수준에 관한 것이다. 용어 "질환 상태" 또는 "암성 질환 상태"는 비-암성 세포 상태 및 (포함하는) 말기 암성 세포 상태 사이의 세포 또는 분자 상태의 특정 유형 또는 상태에 관한 것이다. 바람직하게는, 당해 용어는 비-암성 세포 상태 및 (포함하는) 말기 암성 세포 상태 사이의 (및 배제하는) 유기체내 종양 발달의 상이한 암성 증식/발달 단계 또는 수준을 포함한다. 이러한 발달 단계는 UICC에 의해 정의된 악성 종양의 TNM(종양, 결절, 전이) 분류 시스템의 모든 단계, 예를 들면 단계 0 및 I 내지 IV를 포함할 수 있다. 당해 용어는 또한 TNM 단계 0 이전의 단계, 예를 들면, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 암 바이오마커가 변형된 발현 또는 발현 패턴을 나타내는 발달 단계를 포함한다.
위에 언급된 바와 같은 발현 수준은 바람직하게는 상기 본원에 정의된 PDE9A의 발현 수준일 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 발현 수준은 또한 바람직하게는 PDE9A와 관련하여, 세포내에서 발현된 다른 어떠한 적합한 유전자 또는 유전 성분의 발현 수준, 예를 들면, 다른 포스포디에스테라제의 발현 수준, 하우스키핑유전자, 예를 들면, GAPDH 또는 PBGD의 발현 수준일 수 있다.
용어 "암성"은 본 발명과 관련하여 상기 본원에 정의된 바와 같은 암성 질환 상태에 관한 것이다. 암 대조군과 관련하여 바람직한 대조군 수준은 악성의, 호르몬-민감성 전립선 종양에서 PDE9A의 발현이다.
용어 "비-암성"은 본 발명과 관련하여, 양성 또는 악성 증식이 검출될 수 있는 상태에 관한 것이다. 상기 검출을 위한 적합한 수단은 당해 분야에 공지되어 있다. 비-암성 대조군과 관련하여 바람직한 대조군 수준은 정상, 즉, 건강하거나 비-암성인 조직에서 PDE9A의 발현 또는 양성 전립선 종양 조직에서 PDE9A의 발현이다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "양성 전립선 종양"은 암의 악성 특성중 3개 모두가 결여된, 즉, 제한되지 않은 공격성 방식으로 성장하지 않고, 주변 조직으로 침입하지 않으며, 전이되지 않는 전립선 종양에 관한 것이다. 통상적으로, 양성 전립선 종양은 암의 침입성 특성을 결여한 온화하고 비-진행성인 전립선 신생물 질환 또는 종창 질환을 내포한다. 또한, 양성 전립선 종양은 통상적으로 봉입되어 있으므로, 이들의 능력에 있어 억제되어 악성 방식으로 행동한다. 양성 종양 또는 건강한 상태는 당해 분야의 숙련가에게 공지된, 어떠한 적합한, 독립적인 분자, 조직학적 또는 생리학적 방법으로도 측정할 수 있다.
또한, 대조군 수준은, 질환 상태가 공지된 대상체로부터의 샘플에서 본 발명의 PDE9A 마커 유전자의 이미 측정된 발현 수준(들)을 분석함으로써 수득된 결과를 기초로 하여 통계적 방법으로 측정할 수 있다. 또한, 대조군 수준은 이미 시험한 대상체 또는 세포로부터 발현 패턴의 데이터베이스로부터 기원할 수 있다. 또한, 시험할 생물학적 샘플에서 본 발명의 마커 유전자의 발현 수준은 다중 대조군 수준과 비교할 수 있으며, 이의 대조군 수준은 다중 참조 샘플로부터 측정된다. 환자-기원한 생물학적 샘플의 것과 유사한 조직 유형으로부터 기원한 참조 샘플로부터 측정된 대조군 수준을 사용하는 것이 바람직하다. 질환 상태가 상기 본원에 정의된 바와 같이 비-암성인, 즉 양성 또는 악성 증식이 검출될 수 없는 건강한 상태로 존재하는 대상체/대상체들로부터 기원한 샘플(들)을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 다른 양태에서, 대조군 수준은 전립선 암, 예를 들면, 호르몬-독립적이거나 호르몬-내성인 전립선 암을 앓고 있는 것으로 진단된 대상체로부터 기원한 참조 샘플로부터 측정될 수 있다.
또한, 참조 샘플은 세포주, 예를 들면, 무한증식 암 세포주로부터 기원하거나, 조직 이종이식체로부터 기원한 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 전립선 암 세포주로부터 기원한 물질 또는 사람 전립선 조직, 특히 양성 및 종양-기원의 사람 전립선 조직을 지닌 조직 이종이식체로부터 기원된 물질이 본 발명에 따른 참조 샘플에 포함될 수 있다. 바람직한 암 세포주의 예는 세포주 PC346P, PC346B, LNCaP, VCaP, DuCaP, PC346C, PC3, DU145, PC346CDD, PC346Flu1, PC346Flu2를 포함한다. 바람직한 이종이식체의 예는 PC295, PC310, PC-EW, PC82, PC133, PC135, PC324 및 PC374를 포함한다. 바람직하게는 세포주 및 이종이식체의 전체 패널, 예를 들면, 사람 PC346 패널을 사용할 수 있다. 문헌[참조: Marques et al., 2006, Eur. Urol., 49(2):245-57]에 기술된 바와 같은 이종이식체 및 세포주가 또한 바람직하다.
추가의 바람직한 대안에서, 참조 샘플은 환자 조직, 또는 임상 환경에서 수득된 조직 패널 또는 조직 수집물로부터 기원할 수 있다. 당해 샘플은 예를 들면, 수술한 남성 환자로부터 수득될 수 있다. 샘플은 어떠한 적합한 조직 유형으로부터도, 예를 들면, 전립선 조직 또는 림프절로부터 기원할 수 있다. 환자 조직 수집물의 바람직한 예는 외과 과정(예를 들면, 전립선절제술)으로부터 기원한다.
또한, 공지된 질환 상태를 갖는 집단에서 본 발명의 PDE9A 마커의 발현 수준의 표준 값을 사용하는 것이 바람직하다. 표준 값은 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 수득될 수 있다. 예를 들면, 평균 ± 2 SD(표준 편차) 또는 평균 ± 3 SD의 범위가 표준 값으로 사용될 수 있다.
또한, 대조군 수준도 동시에 및/또는 시험 샘플과 유사하거나 비교가능한 조건에서 (a) 질환 상태가 암성인 것으로 공지된, 즉, 특정 암 유형, 예를 들면, 전립선 암, 특히 호르몬-독립적인, 호르몬-민감성인 또는 호르몬-내성인 전립선 암을 앓고 있는 것으로 독립적으로 진단된 대상체/대상체들로부터 이미 수집하여 저장한 샘플(들)을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 암성이 아닌 것으로 공지된 생물학적 샘플로부터 측정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준"으로 일컬어진다. 대조군 수준은 암성 생물학적 샘플, 예를 들면, 전립선 암, 특히 호르몬-의존성, 호르몬-민감성 또는 호르몬-내성인 암이 독립적으로 진단된 대상체로부터의 샘플로부터 측정할 경우, 이는 "암성 대조군 수준"으로 지정될 수 있다.
용어 "전립선 암"은, 전립선의 세포가 돌연변이되어 대조군의 외부로 증식하기 시작하는 경우 발생하는 남성 생식 시스템내 전립선(prostate gland)의 암에 관한 것이다. 전형적으로, 전립선 암은 전립선-특이적인 항원(PSA)의 상승된 수준과 연관되어 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 용어 "전립선 암"은 4.0 초과의 PSA 수준을 나타내는 암에 관한 것이다. 다른 양태에서, 당해 용어는 2.0 초과의 PSA 수준을 나타내는 암에 관한 것이다. 용어 "PSA 수준"은 혈액 중의 PSA의 농도(ng/ml)에 관한 것이다.
용어 "호르몬-의존성 전립선 암"은, 전립선 암 또는 전립선 암 세포주의 성장 및/또는 증식이 남성 성 호르몬 자극에 의존성임을 의미한다.
용어 "호르몬-민감성 전립선 암"은, 전립선 암 또는 전립선 암 세포주가 남성 성 호르몬 자극에 있어 민감성임을 의미한다. 용어 "민감성"은, 전립선 암 또는 전립선 암 세포주가 남성 성 호르몬의 존재하에서 생화학 반응 또는 세포 반응 패턴을 나타내지만 성장 및/또는 증식을 위해 남성 성 호르몬을 필요로 하지 않는 상태에 관한 것이다.
용어 "호르몬-내성 전립선 암"은, 전립선 암 또는 전립선 암 세포주의 성장 및 증식이 남성 성 호르몬 자극에 대해 내성임을 의미한다. 당해 용어는 또한 상기 본원에 정의된 바와 같이 항-호르몬, 바람직하게는 항-안드로겐의 투여에 대해 더이상 차도가 없는 말기 전립선 암 발생 상태에 관한 것이다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "남성 성 호르몬"은 안드로겐, 바람직하게는 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 안드로스텐디올 또는 안드로스테론을 말한다.
추가의 측면에서 본 발명은 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 마커로서 PDE9A의 사용에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전립선 암의 진단"은, 본 발명의 PDE9A 마커의 발현 수준이 변형된, 바람직하게는 상기 본원에 정의된 대조군 수준과 비교하여, 바람직하게는 상기 본원에 정의된 정상 대조군 수준과 비교하는 경우, 감소되거나 하향-조절된 경우, 대상체 또는 개체가 전립선 암을 앓고 있는 것으로 고려될 수 있음을 의미한다. 용어 "진단하는"은 또한 비교 공정을 통해 도달된 결론에 관한 것이다.
따라서, 본 발명과 관련하여 용어 "변형된" 또는 "변형된 발현 수준"은 발현 수준에 있어서의 변화를 나타낸다. 발현 수준은 예를 들면, 분석될 유전자에서 PDE9A 유전자 발현이 대조군 수준으로부터, 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상 까지, 또는 대조군 수준과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상 상이한 경우, "변화된" 것으로 간주된다. 대조군 수준은 상기 본원에 정의된 바와 같은 정상 대조군 수준 또는 암성 대조군 수준일 수 있다. 암성 대조군 수준과의 비교를 수행하여야 하는 경우, 정상 대조군 수준과의 추가의 비교가 바람직하다. 이러한 추가의 비교는 변형의 경향성의 측정, 즉 발현 수준의 증가 또는 감소가 관측되는 것을 허용한다.
용어 "변형된"은, 바람직하게는 시험 샘플을 대조군 수준과 비교하는 경우 PDE9A 마커의 발현 수준의 감소 또는 하향-조절 또는 PDE9A 마커 발현의 완전한 억제에 관한 것이다. 대조군 수준은 상기 본원에 정의된 바와 같은 정상 대조군 수준 또는 암성 대조군 수준일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 대조군 수준은 호르몬-의존성 전립선 종양 또는 조직으로부터 기원하거나, 보다 바람직하게는 호르몬-민감성 전립선 종양 또는 조직으로부터 기원하거나 이와 관련된다. 따라서, 본 발명과 관련하여 용어 "감소된 발현 수준" 또는 "하향-조절된 발현 수준" 또는 "발현 수준의 감소"(이는 유사하게 사용될 수 있다)는 분석될 상황, 예를 들면, 환자의 샘플로부터 기원가능한 상황, 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 암 단계, 바람직하게는 호르몬-의존성 전립선 종양 단계, 보다 바람직하게는 호르몬-민감성 전립선 종양 단계로부터 기원할 수 있는 정상 대조군 수준 또는 암성 대조군 수준일 수 있는, 참조 시점 사이의 PDE9A의 발현 수준의 감소를 나타낸다. 발현 수준은, PDE9A 유전자 발현이 대조군 수준과 비교하여, 바람직하게는 호르몬-의존성 또는 호르몬-민감성 전립선 종양 대조군과 비교하여, 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상, 또는 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 이상 감소되는 경우 "감소된" 또는 "하향-조절된" 것으로 간주된다.
추가의 양태에서, 대상체로부터 수득된 샘플 및 상기 본원에 정의된 참조 사이의 전체 유전자 발현 패턴에 있어서 추가의 유사성은 대상체가 암을 앓고 있음을 나타낸다. 본 발명의 다른 양태에서, 진단은 추가의 암 바이오마커 발현 수준의 설명과 합해질 수 있다. 예를 들어, PSA와 같은 바이오마커의 발현이 시험될 수 있다.
암, 특히 전립선 암은, 본 발명의 PDE9A 마커의 발현 수준이 변형, 바람직하게는 상기 본원에 정의된 바와 같은 대조군 수준, 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 정상 대조군 수준과 비교하여, 감소되거나 하향-조절되는 경우, 진단되는 것으로 고려될 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 전립선 암은, 상기 본원에 정의된 것으로서, PDE9A 발현 수준이 대조군 수준과 비교하여, 바람직하게는 호르몬-의존성 종양 대조군, 보다 바람직하게는 호르몬-민감성 전립선 종양 대조군으로부터 기원한 대조군 발현 수준과 비교하여 시험 샘플에서 20% 내지 80%, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70%의 값까지 감소되는 경우, 진단된 것으로 고려될 수 있다. 추가의 바람직한 양태에서, 호르몬-내성 전립선 암은, 상기 본원에 정의된 바와 같이, PDE9A 발현 수준이 대조군 수준과 비교하여 시험 샘플에서 20% 내지 90%, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 값 까지 감소되는 경우 진단된 것으로 고려될 수 있다. 대조군 수준은 정상 대조군 수준 또는 바람직하게는, 호르몬-의존성 또는 호르몬-민감성 전립선 암으로부터 기원할 수 있는 암성 대조군 수준일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전립선 암을 검출하는"은 유기체내 암성 질환 또는 장애의 존재가 측정될 수 있거나, 암성 질환 또는 장애가 유기체내에서 확인될 수 있음을 의미한다. 암성 질환 또는 장애의 측정 또는 확인은 본 발명의 PDE9A 마커의 발현 수준 및 상기 본원에 정의한 바와 같은 정상 대조군 수준을 비교함으로써 달성할 수 있다. 암, 특히 전립선 암은, PDE9A 마커의 발현 수준이 상기 본원에 정의된 바와 같은 암성 대조군 수준과 유사한 경우 검출될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 전립선 암은, PDE9A 마커의 발현 수준이 확립된 전립선 암 세포 또는 세포주, 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 전립선 암 세포주와 유사한 경우 검출될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "전립선 암을 모니터링하는"은 예를 들면, 치료 과정 동안 또는 특정의 기간 동안, 통상적으로 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 5년, 10년, 또는 특정의 다른 기간 동안 진단되거나 검출된 암성 질환 또는 장애의 동반에 관한 것이다. 용어 "동반"은, 상기 본원에 정의된 바와 같은 질환의 상태 및, 특히, 질환의 이들 상태의 변화가 샘플중 본 발명의 PDE9A 마커의 발현 수준을 상기 본원에 정의된 바와 같은 정상의 또는 암성인 대조군 수준, 바람직하게는 호르몬-의존성 종양 대조군, 보다 바람직하게는 호르몬-민감성 전립선 종양 대조군으로부터 기원한 대조군 발현 수준과 특정의 기간 간격내에, 예를 들면, 매주, 매 2주, 매달, 매 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월, 매 1.5년, 매 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년마다, 특정의 기간 동안, 예를 들면, 각각 2주, 3주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20년 동안 비교함으로써 검출할 수 있다. 암성 대조군 수준은 암 발달의 상이한 단계, 예를 들면, TNM 분류 시스템의 0 단계 및 I 단계 내지 IV 단계에 상응하는 샘플로부터 기원할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 용어는 진단된 전립선 암, 보다 바람직하게는 호르몬-의존성 및 호르몬-민감성 전립선 암의 동반에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 모니터링은 또한 호르몬-내성 전립선 암의 동반 동안, 예를 들면, 치료 과정 동안 사용할 수 있다. 모니터링은 또한 추가의 유전자 또는 유전 성분, 예를 들면, GAPDH 또는 PBGD와 같은 하우스키핑 유전자, 또는 다른 포스포디에스테라제, 바람직하게는 PDE4D5의 발현의 검출을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전립선 암을 진단하는"은 예를 들면, 특정의 기간 동안, 치료 동안 또는 치료 후에 진단되거나 검출된 암성 질환의 과정 또는 결과의 예측을 의미한다. 당해 용어는 또한 질환으로부터의 생존 또는 회복의 기회의 측정, 및 또한 대상체의 예측된 생존 시간의 예측을 의미한다. 예측은 상세하게는 미래의 기간, 예를 들면, 6개월, 1년, 2년, 3년, 5년, 10년 또는 임의의 다른 기간 동안 대상체의 생존 가능성을 확립함을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "전립선 암의 진행"은 전립선 암 발달의 상이한 단계, 예를 들면, TNM 분류의 0 단계 및 I 단계 내지 IV 단계, 또는 건강한 상태로부터 출발하여 말기 암 시나리오에 이르는 특정의 다른 단계 또는 서브-단계 사이의 스위치에 관한 것이다. 통상적으로 이러한 스위치는 동일한 개체로부터 앞서의 시험 샘플과의 비교시, 예를 들면, 호르몬-의존성 전립선 종양 또는 종양 대조군 또는 호르몬-민감성 전립선 종양 또는 종양 대조군으로부터 기원한 샘플과의 비교시 PDE9A의 발현 수준의 변형, 바람직하게는 감소에 의해 동반된다. 전립선 암의 진행은, 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A의 발현 수준이 동일한 개체로부터의 앞서의 시험 샘플과 비교하여 시험 샘플에서 3% 내지 50%의 값까지, 바람직하게는 10%, 15%, 20% 또는 25%의 값까지 감소되는 경우 검출되거나 진단되는 것으로 고려될 수 있다. 변형은 특정 기간, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20년에 걸쳐 검출될 수 있는데, 즉, 상기 나타낸 값은 시간내 처음 시점에서 PDE9A의 발현 수준과 상기 나타낸 시점 이후 시간내 제2 시점을 비교함으로써 계산할 수 있다. 이러한 진행은, 특정 양태에서, 호르몬-내성 전립선 암에 대한 진행일 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 용어 "전립선 암의 진행"은 호르몬-의존성 전립선 암 상태로부터 호르몬-민감성 전립선 암 상태까지의 스위치, 호르몬-민감성 전립선 암 상태로부터 호르몬-내성 전립선 암 상태 또는 호르몬-의존성 또는 호르몬-민감성 전립선 암 상태로부터 호르몬-내성 전립선 암 상태까지의 스위치에 관한 것이다.
호르몬-의존성 또는 호르몬-민감성 전립선 암 상태로부터 호르몬-내성 전립선 암 상태까지의 진행은, 상기 본원에 정의된 바와 같은, PDE9A 발현 수준이 호르몬-민감성 또는 호르몬-의존성 전립선 암을 앓고 있는 것으로 진단된 동일한 개체로부터의 앞서의 시험 샘플과 비교하여 시험 샘플에서 3% 내지 50%의 값, 바람직하게는 10%, 15%, 20% 또는 25%의 값까지 감소되는 경우 검출되거나 진단되는 것으로 고려될 수 있다. 이러한 진행은 또한, 비교를 다른 개체로부터의 시험 샘플, 조직 수집으로부터의 시험 샘플, 데이터베이스로부터의 값 등을 사용하여 수행하는 경우, 검출된 것으로 고려될 수 있다.
변형은 특정의 기간, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20년의 기간에 걸쳐 검출될 수 있는데, 즉, 상기 나타낸 값은 시간내 처음 시점에서 PDE9A의 발현 수준과 상기 나타낸 기간 이후 시간내 제2 시점에서의 발현 수준을 비교함으로서 계산할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 전립선 암, 보다 바람직하게는 호르몬-내성 전립선 암으로 발달하기 위한 소인(predisposition)의 진단 및 검출에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여 "전립선 암으로 발달하기 위한 소인" 및 특히 "호르몬-내성 전립선 암으로 발달하기 위한 소인"은 전립선 암, 특히 호르몬-내성 전립선 암으로 발달하기 위한 위험 상태이다. 바람직하게는, 호르몬-내성 전립선 암으로 발달하기 위한 소인은, 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 발현 수준이 상기 본원에 정의된 바와 같은 암성 대조군 수준, 예를 들면, 호르몬-민감성 전립선 암을 명백하게 앓고 있는 대상체의 조직 또는 샘플로부터 기원한 참조 발현 수준 미만인 경우 존재할 수 있다. 본원에서 사용된 것으로서 용어 "미만"은, PDE9A의 발현 수준이 암성 대조군 수준과 비교하여 약 40% 내지 80%, 바람직하게는 약 50%까지 감소됨을 의미한다.
또한, 본 발명과 관련하여 전립선 암으로 발달하기 위한 소인은, 상기 제공된 본원에서 정의된 바와 같이 PDE9A 발현 수준 및 또한 대안의 암 마커, 예를 들면, PSA가 발현 수준 또는 발현 패턴의 변형을 나타내지 않는 상황에서 존재할 수 있다. 적합한 추가의 암 마커는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
따라서, 전립선 암, 특히 호르몬-내성 전립선 암에 대한 소인은, 상기 묘사된 상황 중 하나가 관측되는 경우 진단되거나 검출되는 것으로 고려될 수 있다.
시험 생물학적 샘플과 대조군 수준의 발현 수준 사이의 차이는 추가의 대조군 핵산, 예를 들면, 이의 발현 수준이 세포의 암성 또는 비-암성 상태에 따라 상이하지 않은 것으로 공지된 하우스키핑 유전자의 발현 수준으로 정규화될 수 있다. 예시적인 대조군 유전자는 특히 β-액틴, 글리세린알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 포르포빌리노겐 데아미나제(PBGD) 및 리보솜 단백질 P1을 포함한다. 정규화는 또한 다른 포스포디에스테라제, 바람직하게는 상이한 종양 단계에서 변경되지 않은 발현 패턴을 나타내는 사람 포스포디에스테라제를 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 포스포디에스테라제는 PDE4D5 또는 PDE4D 계열의 다른 동형, 예를 들면, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D6, PDE4D8 또는 PDE4D9이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "진단하는" 및 "예측하는"은 또한 예측 및 경향성 부석을 포함하는 것으로 의도된다. 마커로서 PDE9A는 따라서 질환에 대한 감시와 같은 치료학적 중재 또는 진단 범주를 포함하는, 치료 양상에 관한 결정을 이루는데 있어 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서, 대상체의 상태를 시험하기 위한 중간 결과가 제공될 수 있다. 이러한 중간 결과는 추가의 정보와 합하여 의사, 간병인 또는 다른 간호사를 보조하여 대상체가 질환을 앓고 있는지를 진단하도록 할 수 있다. 또한, 본 발명은 대상체-기원한 조직에서 암 세포를 검출하는데 사용될 수 있으며, 의사에게 대상체가 질환을 앓고 있는지를 진단하기 위한 유용한 정보를 제공한다.
진단되거나, 모니터링되거나, 또는 전립선 암, 전립선 암의 진행 또는 전립선 암에 대한 소인이 본 발명에 따라 검출되거나 예측되는 대상체 또는 개체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람이다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 것으로서 분자 영상 도구, 예를 들면, 전립선 암 및 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 마커로서 PDE9A를 사용하는 것과 관련하여 자기 공명 영상(MRI) 및/또는 자기 양성자 공명 영상(MPI) 기술을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 예를 들면, PDE9A는 사람 대상체내 진단 마커의 온라인 검출을 허용하는 MRI 또는 MPI와 같은 시도에서 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 마커로서 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 개체에서 전립선 암 또는 전립선 암의 진행 또는 전립선 암에 대한 예측을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대한 핵산 또는 펩타이드 친화성 리간드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "PDE9A 발현 생성물에 대한 핵산 친화성 리간드"는 PDE9A의 스플라이스 변이체 1 내지 20으로부터 기원한 PDE9A 전사체 또는 DNA 분자에 특이적으로 결합하거나, 심지어 보다 바람직하게는 서열 번호 1 내지 20에 나타낸 DNA 서열 또는 서열 번호 1 내지 20에 나타낸 서열의 상보성 DNA 서열 또는 상응하는 RNA 분자를 말한다. 핵산 친화성 리간드는 또한 서열 번호 1 내지 20에 제시된 특정 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열 또는 서열 번호 21 내지 40번에 제시된 특정의 서열 또는 당해 서열의 특정 단편에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "PDE9A 단백질에 대한 펩타이드 친화성 리간드"는 PDE9A 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드 분자를 말한다. 펩타이드 분자는 바람직하게는 서열 번호 21 내지 40에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 펩타이드 친화성 리간드는 또한 서열 번호 1 내지 20에 제시된 특정 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열 또는 서열 번호 21 내지 40번에 제시된 특정의 서열 또는 당해 서열의 특정 단편에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 용어 "펩타이드"는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 특정 유형의 아미노산 서열, 예를 들면, 이의 폴리펩타이드 구조, 단백질 구조 또는 기능성 유도체를 포함하는 특정 유형의 아미노산 서열을 말한다. 또한, 펩타이드는 추가의 화학적 잔기 또는 작용기와 결합될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "발현 생성물"은 PDE9A 전사 또는, PDE9A 유전자의 발현에 의해 생성된 mRNA 분자를 말한다. 보다 바람직하게는, 당해 용어는 상기 본원에 정의된 바와 같은, 예를 들면, 서열 번호 1 내지 20에 제시된 바와 같은 서열을 통해 프로세싱된 PDE9A 전사체에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드의 세트, PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브, PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머, PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 및 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 핵산 및 펩타이드 친화성 리간드를 포함한다.
본 발명의 조성물은 예를 들면, PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 세트 및/또는 PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드"는 PDE9A의 스플라이스 변이체 1 내지 20의 센스- 또는 안티센스-쇄에 대해 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1 내지 20에 나타낸 DNA 서열에 대해 상보성이거나 서열 번호 1 내지 20에 나타낸 상보성 DNA 서열에 대해 상보성이다. 올리고뉴클레오타이드 서열은 또한 서열 번호 1 내지 20에 제시된 특정 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열 또는 서열 번호 21 내지 40에 제시된 특정 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열에 대해 상보성일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1 내지 20 중 어느 하나의 서열, 또는 이의 상보체로부터 기원가능한 것으로서, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 적합한 길이 및 서열을 가질 수 있다. 통상적으로, 올리고뉴클레오타이드는 8 내지 60개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10 내지 35개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 또는 33개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 서열은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 소프트웨어 도구의 도움으로 정의될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 PDE9A의 보존된 영역, 바람직하게는 PDE9A 유전자의 엑손 10 내지 엑손 22, 보다 바람직하게는 PDE9A 유전자의 엑손 19 내지 20 사이의 경계에 위치한 서열 또는 PDE9A 유전자 단독의 엑손 19, 20 또는 21내에 위치하는 서열, 심지어 보다 바람직하게는 한쪽에서 엑손 20 및 다른 쪽에서 엑손 21 사이의 서열에 대해 상보성일 수 있다.
예를 들어, 정배향 프라이머로서 유용한 올리고뉴클레오타이드는 PDE9A 유전자의 엑손 19내에 위치할 수 있으며 역배향 프라이머로서 유용한 올리고뉴클레오타이드는 PDE9A 유전자의 엑손 20에 위치할 수 있다. 바람직한 양태에서, 정배향 프라이머로서 유용한 올리고뉴클레오타이드는 엑손 20에 위치한 서열에 대해 상보성일 수 있고, 역배향 프라이머로서 유용한 올리고뉴클레오타이드는 엑손 21 상에 위치한 서열에 대해 상보성일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오타이드의 세트는 서열 번호 41 및 서열 번호 42에 제시된 서열을 갖는다. 서열 번호 45 및/또는 서열 번호 46에 제시된 서열을 갖거나 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 또한 바람직하다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브"는 PDE9A의 스플라이스 변이체 1 내지 20의 센스- 또는 안티센스-쇄에 대해 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 바람직하게는, 당해 프로브는 서열 번호 1 내지 20 중 어느 하나에 나타낸 DNA 서열 또는 서열 번호 1 내지 20에 나타낸 서열의 상보성 DNA 서열에 대해 상보성이다. 프로브 서열은 또한 서열 번호 1 내지 20에 나타낸 서열중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열 또는 서열 번호 21 내지 40에 제시된 서열 중 어느 것에 대해 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열에 대해 상보성일 수 있다.
프로브는 서열 번호 1 내지 20의 서열 또는 이의 상보체의 서열로부터 기원가능한 것으로서, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 길이 및 서열을 가질 수 있다. 대표적으로, 프로브는 6 내지 300개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15 내지 60개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브 서열은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 소프트웨어 도구의 도움으로 정의할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 프로브 서열은 PDE9A의 보존된 영역, 바람직하게는 PDE9A 유전자의 엑손 10과 엑손 22 사이에 위치한 서열에 대해 상보성일 수 있다. 보다 바람직하게는 프로브 서열은 PDE9A 유전자의 엑손 19와 20번 사이의 경계에 위치한 서열 또는 PDE9A 유전자 단독의 엑손 19, 20 또는 21에 위치한 서열에 대해 상보성일 수 있으며, 심지어 보다 바람직하게는 프로브 서열은 한쪽에서 엑손 20과, 다른 쪽에서 엑손 21의 모든 뉴클레오타이드 사이의 서열에 대해 상보성일 수 있다. 바람직한 양태에서, 프로브로서 유용한 올리고뉴클레오타이드는 PDE9A 유전자의 엑손 20의 마지막 16개 염기와 엑손 21의 처음 5개 염기 사이에 위치한 서열에 대해 상보성일 수 있다.
프로브가 정량적 PCR 반응, 예를 들면, 실시간 PCR에 사용되어야 하는 경우, 당해 프로브는 전방 및 역배향 프라이머의 결합 위치들 사이의 위치에 위치하도록 설계될 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 한쪽에 근접하게 위치하도록 설계될 수 있다. 보다 바람직하게는, 이는 정배향 프라이머에 근접하도록 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 프로브는 서열 번호 43 또는 서열 번호 47에 제시된 서열을 갖는다.
본 발명의 조성물은 추가로 또는 대안으로 PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대해 특이적인 압타머를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 "PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 압타머"는 짧은 핵산 분자, 예를 들면. RNA, DNA, PNA, CNA, HNA, LNA 또는 ANA 또는 PDE9A의 스플라이스 변이체 1 내지 20에 특이적으로 결합할 수 있는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 다른 적합한 핵산 양식, 바람직하게는 PDE9A의 스플라이스 변이체 1 내지 20으로부터 기원한 DNA 분자를 말한다. 보다 바람직하게는, 핵산 압타머 분자는 서열 번호 1 내지 20에 나타낸 DNA 서열 또는 이의 이중쇄 유도체에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 압타머는 또한 PDE9A 전사체에 상응하는 RNA 분자, 바람직하게는 서열 번호 1 내지 20에 제시된 DNA 서열에 상응하는 RNA 분자에 결합할 수 있다.
핵산 압타머는 또한 서열 번호 1 내지 20에 제시된 특정의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열 또는 서열 번호 21 내지 40에 제시된 특정의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 또는 이들 서열에 상응하는 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
PDE9A의 스플라이스 변이체 1 내지 20에 대한 핵산 압타머의 특이성은 상기 스플라이스 변이체내에 단독으로 존재하는 서열에 대해 특이적인 결합에 의해 부여될 수 있다.
핵산 압타머는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 방법에 따라, 예를 들면, 시험관내 선택 또는 SELEX 방법에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 압타머는 문헌(참조: Ellington and Szostak, 1990, Nature, 346:818-822)에서 제공된 안내에 따라 생성되고/되거나 설계될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 압타머는 추가의 잔기, 예를 들면, 리보자임 성분과 유사한 효소 기능성 또는 비오틴과 유사한 상호작용 부분에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머"는 PDE9A 단백질에 상호작용하고 특이적으로 결합할 수 있는 짧은 펩타이드를 말한다. 당해 펩타이드 압타머는 바람직하게는 서열 번호 21 내지 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 펩타이드 압타머는 또한 서열 번호 1 내지 20 중의 어느 하나에 제시된 특정의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열 또는 서열 번호 21 내지 40 중의 어느 하나에 제시된 특정의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 통상적으로, 펩타이드 압타머는 예를 들면 10 내지 20개 아미노산을 포함하는 가변 펩타이드 루프이다. 본 발명과 관련하여, 펩타이드 압타머는 바람직하게는 스캐폴드 구조에 대해 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착될 수 있다. 스캐폴드 구조는 바람직하게는 우수한 가용성 특성을 갖는 특정 분자, 바람직하게는 단백질일 수 있다. 적합한 스캐폴드 단백질은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 것일 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 적합한 스캐폴드 분자는 세균 단백질 티오레독신-A이다. 압타머 펩타이드 루프는 바람직하게는 스캐폴드 분자의 감소하는 활성 부위내에 삽입될 수 있다. 또한, 스태필로코커스 단백질 A 및 이의 도메인 및 이들 도메인의 유도체, 예를 들어, 단백질 Z 또는 리포칼린은 본 발명과 관련하여 스캐폴드 구조로 사용될 수 있다.
펩타이드 압타머는 예를 들면, 효모 이중 하이브리드 시도를 통해, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 방법에 따라 생성될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 조성물은 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체, 바람직하게는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있거나, 추가로 포함할 수 있다. 또한, 모노클로날 PDE9A 특이적인 항체를 기초로 한 단일쇄 항체, 디아바디(diabody), 미니바디(minibody), 단일쇄 Fv 단편(sc(Fv)), sc(Fv)2 항체, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편 또는 변이체, 소형 모듈 면역약제(SMIP), 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질, 카멜화된 항체(camelized antibody), VHH 함유 항체 등이 바람직하다. 항체는 1가, 2가, 3가 또는 다가일 수 있다. 항체는 어떠한 기원, 예를 들면, 쥐, 사람 또는 키메라 또는 사람화된 쥐 항체일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서 H00005152-M01(제조원: Abnova Taiwan Corp) 또는 NBP1-00641(제조원: Novus Biologicals, Inc.)와 같은 상업적으로 이용가능한 항-PDE9A가 조성물 속에 포함될 수 있거나 진단적으로 사용될 수 있다.
항체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 방법에 따라 생산될 수 있다. 폴리클로날 항체는 동물을 선택한 항원으로 면역화시켜 생산할 수 있는 반면, 정의된 특이성의 모노클로날 항체는 예를 들면, 쾰러(Kohler) 및 밀슈타인(Milstein)(참조: Kohler and Milstein, 1976, Eur. J. Immunol., 6: 511-519)이 개발한 하이브리도마 기술을 사용하여 생산할 수 있다.
상기 본원에 기술된 바와 같은 친화성 리간드는 각종 마커로 표지시킬 수 있거나 또는 각종 마커로 표지된, 제2 친화성 리간드로 검출하여, 검출, 가시화 및/또는 정량화를 허용할 수 있다. 이는 PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질과 상호작용할 수 있는 친화성 리간드 또는 어떠한 제2 친화성 리간드에 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 기술 또는 방법을 사용하여 접합시킬 수 있는 어떠한 적합한 표지를 사용하여서도 달성할 수 있다. 용어 "제2 친화성 리간드"는 상기 본원에 정의된 바와 같은 친화성 리간드(즉, 2개의 상호작용하는 친화성 리간드를 지닌 시스템과 관련하여 사용되는 경우 "제1 친화성 리간드")에 결합할 수 있는 분자를 말한다. 결합 상호작용은 바람직하게는 특이적인 결합이다.
제1 및/또는 제2 친화성 리간드에 접합시킬 수 있는 표지의 예는 형광성 염료 또는 금속(예를 들면, 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 플루오레스카민), 발색단 염료(예를 들면, 로돕신), 화학발광성 화합물(예를 들면, 루미날, 이미다졸) 및 생물발광성 단백질(예를 들면, 루시페린, 루시퍼라제), 합텐(예를 들면, 비오틴)을 포함한다.
특히 바람직한 양태에서, 프로브, 특히 상기 본원에서 정의한 바와 같은 PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브로서 사용될 친화성 리간드는 6-FAM, HEX, TET, ROX, Cy3, Cy5, 텍사스 레드(Texas Red) 또는 로다민과 같은 형광성 표지로 및/또는 동시에 TAMRA, 답실(Dabcyl), 블랙 홀 켄쳐(Black Hole Quencher), BHQ-1 또는 BHQ-2로 표지시킬 수 있다. 다른 유용한 형광 물질 및 발색단은 문헌(참조: Stryer, 1968, Science, 162:526-533)에 기술되어 있다. 친화성 리간드는 또한 효소(예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 베타-락타마제), 방사성 동위원소(예를 들면, 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb, 68Ga 또는 18F) 또는 입자(예를 들면, 금)로 표지시킬 수 있다.
상이한 유형의 표지는 다양한 화학, 예를 들면, 아민 반응 또는 티올 반응을 사용하여 친화성 리간드에 접합시킬 수 있다. 그러나, 아민 및 티올 이외에 다른 반응성 그룹, 예를 들면, 알데하이드, 카복실산 및 글루타민을 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산 친화성 리간드 또는 펩타이드 친화성 리간드는 조영제(contrast agent)로서 기능하도록 변형시킬 수 있다.
본원에서 사용된 것으로서 용어 "조영제"는 PDE9A 마커와 특이적으로 상호작용할 수 있고 사람 또는 동물 신체 외부에 위치한 장치에 의해 검출할 수 있는 분자 화합물을 말한다. 바람직하게는, 이러한 조영제는 자기 공명 영상((MRI) 또는 자기 양성자 영상(MPI)에서 사용하기에 적합하다. 용어 "특이적으로 상호작용하는"은 이러한 세포에 의해 발현된 다른 단백질보다 사람 또는 동물 신체내에 존재하는 세포의 세포 표면상의 PDE9A 마커와 우선적으로 상호작용하는 분자 화합물의 특성을 말한다. 조영제 조성물로서 또한 지정될 수 있는 바람직한 조영제는 서열 번호 1 내지 20중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 21 내지 40 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 특이적으로 검출되는 분자 또는 상기 본원에 정의된 바와 같은 이의 유도체 또는 동종 변이체를 특이적으로 검출할 수 있을 것이다. 바람직한 조영제는 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머 뿐만 아니라 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체이다.
조영제는, PDE9A 마커를 특이적으로 인지할 수 있는 이들의 특성 외에, 또한 사용된 특이적인 검출 기술에 의해 검출가능한 추가의 분자를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서 용어 "기능하도록 변형된"은 분자 영상 방법, 특히 MRI 또는 MPI에서 조영제의 사용을 허용하도록 하는데 필수적일 수 있는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 변형을 말한다. 예를 들어, 형광성 분광법을 검출 수단으로서 사용하는 경우, 이러한 분자를 특이적인 파장에서 여기될 수 있는 검출가능한 마커 분자로서 형광단을 포함할 수 있다. 또한, 방사활성 표지, 예를 들면, 상기 본원에 기술된 바와 같은 방사성 동위원소를 사용할 수 있다. MRI에 적합한 본 발명에 따른 바람직한 조영제와 관련하여, 상기 기술된 항체와 같은 조영제는 MRI에 의해 검출가능한 마커 분자를 포함할 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 예를 들면, USPIOS 및 19Fluor를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에서, 조성물은 PCR 완충제, dNTP, 폴리머라제, 2가 양이온 또는 1가 양이온과 같은 이온, 하이브리드화 용액, 예를 들면, 제2 항체, 검출 염료 및 어떠한 다른 적합한 화합물과 같은 제2 친화성 리간드, 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된, 상기 본원에 기술된 바와 같은 친화성 리간드 또는 조영제중 어느 것을 기초로 한 검출의 수행능에 필수적인 액체와 같은 보조 성분을 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 본원에 기술된 바와 같이, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행 또는 개체에서 전립선 암에 대한 소인을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 조성물의 제조용의, 상기 본원에 기술된 바와 같은 PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대한 핵산 또는 펩타이드 친화성 리간드의 용도에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 당해 본원에서 기술된 바와 같이, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행 또는 개체에서 전립선 암에 대한 소인을 진단하거나, 모니터링하거나, 예측하기 위한 조성물 제조용의, 본원에 기술된 바와 같은, PDE9A 발현 생성물 또는 단백질의 세트의 용도에 관한 것이다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 상기 본원에 기술된 바와 같은, 전립선 암 또는 전립선 압의 진행 또는 개체에서 전립선 암에 대한 소인을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 조성물의 제조를 위한, 상기 본원에 기술된 바와 같은 PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대해 특이적인 압타머의 용도에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 발명은 상기 본원에 기술된 바와 같이, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행 또는 개체에서 전립선 암에 대한 소인을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 조성물의 제조를 위한, 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 변이체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 본원에 기술된 바와 같은 조성물은 진단 조성물이다.
다른 양태에서, 본 발명은 PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 세트, PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브 및/또는 PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대해 특이적인 압타머 및/또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 및 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 변이체를 포함하는, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행 또는 전립선 암에 대한 소인을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 진단 키트에 관한 것이다.
전형적으로, 본 발명의 진단 키트는 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A의 특이적인 검출을 허용하는 하나 이상의 제제를 함유한다. 진단 키트의 제제 또는 성분은, 본 발명에 따라서 하나 이상의 용기 또는 별도의 개체 속에 포함될 수 있다. 제제의 특성은, 키트가 의도되는 검출 방법에 의해 측정된다. PDE9A mRNA 발현 수준, 즉, PDE9A 발현 생성물을 통한 검출이 의도되는 경우, 포함될 제제는 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드의 세트 및/또는 PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브의 세트일 수 있으며, 이들은 당해 분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들면, 상기 본원에 기술된 표지로 임의로 표지될 수 있다. 추가로 또는 대안으로, PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 압타머가 포함될 수 있다. PDE9A 단백질 수준에서 검출이 의도되는 경우, 포함될 제제는 상기 본원에 기술된 바와 같은, PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 또는 항체 변이체의 항원-결합 단편을 함유하는 화합물 또는 항체일 수 있다. 추가로 또는 대안으로, PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머가 포함될 수 있다. 대안으로는 진단 키트는 상기 본원에 정의된 바와 같은 조영제를 포함할 수 있다.
특이적인 단백질의 존재는 또한 PDE9A와 특이적으로 상호작용하는 다른 화합물, 예를 들면, 특이적인 기질 또는 리간드를 사용하여 검출할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 진단 키트는 PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질에 대한 검출 시약을 함유한다. 이러한 검출 시약은 예를 들면, 완충제 용액, 표지 또는 세척액 등을 포함한다. 또한, 키트는 당해 키트의 교정 또는 내부 대조군으로서 사용될 수 있는, 공지된 핵산 분자 또는 단백질의 양을 포함할 수 있다. 통상적으로, PDE9A 발현 생성물의 검출을 위한 진단 키트는 PCR 완충제, dNTP, 폴리머라제, 2가 양이온 또는 1가 양이온과 같은 이온, 하이브리드화 용액 등과 같은 보조 성분을 포함할 수 있다. PDE9A 단백질의 검출을 위한 진단 키트는 또한 제2 친화성 리간드, 예를 들면, 제2 항체, 검출 염료 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 것을 기준으로 한 단백질 검출의 수행능에 필요한 어떠한 다른 적합한 화합물 또는 액체와 같은 보조 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 수행되는 검출 방법에 따라 변할 수 있다. 또한, 키트는 지시 전단을 포함할 수 있고/있거나 수득된 결과의 관련성에 대한 정보를 제공할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 샘플에서 PDE9A의 수준을 측정하는 단계를 적어도 포함하여 개체에서 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 방법에 관한 것이다. 용어 "PDE9A의 수준을 측정하는"은 PDE9A 발현 생성물, 예를 들면, PDE9A 전사체(들)의 존재 또는 양의 측정 및/또는 PDE9A 단백질(들)의 존재 및/또는 양의 측정을 말한다. 따라서, 용어 "PDE9A의 수준"은, PDE9A 발현 생성물, 예를 들어, PDE9A 전사체(들)의 존재 또는 양 및/또는 PDE9A 단백질(들)의 존재 또는 양의 측정을 의미한다. PDE9A 발현 생성물, 예를 들어, PDE9A 전사체(들) 또는 PDE9A 단백질(들)의 존재 또는 양의 측정은 당해 분야에 공지된 어떠한 수단에 의해서도 달성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, PDE9A 발현 생성물, 예를 들어, PDE9A 전사체(들) 및/또는 PDE9A 단백질(들)의 존재 또는 양의 측정은 핵산 또는 단백질 수준의 측정에 의해 또는 PDE9A의 생물학적 활성의 측정에 의해 달성된다. 따라서, PDE9A 발현 수준(들)은 PDE9A 유전자에 의해 암호화된 mRNA, PDE9A 전사체에 의해 암호화된 PDE9A 단백질의 검출 및/또는 PDE9A 단백질의 생물학적 활성의 검출을 포함하는 방법에 의해 측정될 수 있다.
예를 들어, PDE9A 발현의 핵산 수준의 측정은 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 겔에서 샘플로부터 수득된 핵산 분자(예를 들면, RNA 또는 cDNA)의 분리에 이은, 상기 본원에서 정의한 바와 같은 PDE9A 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브와의 하이브리드화에 의해 접근될 수 있다. 또한, 발현 수준은 샘플로부터 수득된 핵산의 표지화에 이는 서열분석 겔 상에서의 분리에 의해 측정될 수 있다. 핵산 샘플을 겔 위에 둠으로써 환자 및 대조군 또는 표준 핵산은 인접한 레인내에 존재한다. 발현 수준의 비교는 가시적으로 또는 농도계의 수단으로 달성할 수 있다. mRNA 또는 발현 생성물의 검출 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 통상적으로, 노던 블롯 분석(Northern blot analysis)을 이러한 목적으로 사용할 수 있다.
또한, PDE9A 발현의 핵산 수준은 DNA 어레이 또는 마이크로어레이 시도에서 검출할 수 있다. 통상적으로, 시험할 대상체로부터 기원한 샘플 핵산을 프로세싱하여 바람직하게는 형광성 표지로 표지한다. 후속적으로, 이러한 핵산 분자는 하이브리드화 시도에서 본 발명의 PDE9A 마커 유전자 또는 공지된 바이오마커 또는 암 마커 유전자에 상응하는 면역화된 포획 프로브와 함께 사용될 수 있다. 마이크로어레이 분석을 수행하기에 적합한 수단은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
표준 구조에 있어서 DNA 어레이 또는 마이크로어레이는 다수의 유전자를 검출하기 위한 고정화된 고밀도 프로브를 포함한다. 배열 상의 프로브는 마커 유전자의 서열 중 하나 이상의 부분에 대해, 또는 마커 유전자의 전체 암호화 영역에 대해 상보성이다. 본 발명에서, PDE9A 관련된 폴리뉴클레오타이드의 특정 유형은 폴리뉴클레오타이드가 PDE9A 발현 및 다른 유전자의 발현 사이에 구체적인 구별을 허용하는 한, DNA 어레이용 프로브로서 사용할 수 있다. 통상적으로, cDNA, PCR 생성물, 및 올리고뉴클레오타이드가 프로브로서 유용하다. 바람직하게는 PDE9A의 스플라이스 변이체 1 내지 20의 특정 부분을 포함하는 프로브를 하나의 프로브로 사용할 수 있다. PDE9A 발현의 측정 외에, 다른 유전자, 예를 들면, 추가의 바이오마커 또는 암 마커 유전자의 발현의 측정을 달성할 수 있다.
DNA 어레이- 또는 마이크로어레이-계 검출 방법은 통상적으로 다음 단계: (1) 샘플로부터 mRNA의 분리 및 임의로 mRNA의 cDNA로의 전환, 및 후속적으로 당해 RNA 또는 cDNA의 표지. RNA를 분리하여, 이를 cDNA로 전환시키고 핵산을 표지하는 방법은 미세 배열 기술용 매뉴얼에 기술되어 있다. (2) 단계 1로부터의 핵산을 마커 유전자용 프로브를 사용하여 하이브리드화함. 샘플로부터의 핵산은 형광성 염료 Cy3(적색) 또는 Cy5(청색)와 같은 염료로 표지시킬 수 있다. 일반적으로, 대조군 샘플은 상이한 염료로 표지한다. (3) 샘플로부터 프로브를 사용한 핵산의 하이브리드화를 검출하고 적어도 정성적으로, 및 보다 특별하게는 정량적으로 PDE9A용 샘플내 mRNA 및/또는 조사한 추가의 마커 유전자의 양을 측정함. 샘플과 대조군 사이의 발현 수준에 있어서의 차이는 시그날 강도에 있어서의 차이를 기초로 평가할 수 있다. 이는, 예를 들면, 아피메트릭스(Affymetrix)에 의해 제공된 소프트웨어와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 적절한 소프트웨어에 의해 측정하고 분석할 수 있다.
DNA 어레이에 스폿팅되는 사용된 마커 유전자에 상응하는 프로브의 수에 대한 제한은 없다. 또한, 마커 유전자는, 유전자의 상이한 부분에 하이브리드화하는 프로브인, 2개 이상의 프로브로 나타낼 수 있다. 프로브는 각각의 선택된 마커 유전자에 대해 설계된다. 이러한 프로브는 통상적으로 5 내지 50개 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이다. 보다 긴 DNA는 PCR에 의해 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 이들을 기질상에 적용하는 방법은 미세-배열 분야에 잘 공지되어 있다. 마커 유전자 이외의 유전자를 또한 DNA 어레이 상에 스폿팅할 수 있다. 예를 들면, 이의 발현 수준이 현저하게 변경되지 않는 유전자에 대한 프로브를 DNA 어레이 상에 스폿팅하여 분석 결과를 정규화하거나 다수의 배열 또는 상이한 분석의 분석 결과를 비교할 수 있다.
또한, PDE9A 발현의 핵산 수준은 정량적 RT-PCR 시도, 바람직하게는 실시간 PCR 시도에 이은 PDE9A mRNA 전사체의 역 전사에서 검출할 수 있다. 제1 단계로서, 전형적으로, 전사체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 방법에 따라 cDNA 분자내로 역전사된다. 정량적 또는 실시간 PCR 시도를 상기 기술한 바와 같이 수득한 제1 DNA 쇄를 기초로 하여 후속적으로 수행할 수 있다.
바람직하게는, 당해 유형의 주요한 FRET-계 프로브로서 태크만(Taqman) 또는 분자 비콘(Molecular Beacon) 프로브를 정량적 PCR 검출에 사용할 수 있다. 둘다의 경우에서, 프로브, 바람직하게는 상기 본원에서 정의한 바와 같은 PDE9A 프로브는 목적한 표적 영역, 바람직하게는 상기 본원에 정의한 바와 같은 PDE9A 올리고뉴클레오타이드의 세트를 플랭킹하는 반대쪽 프라이머의 쌍과 함께 사용되는 내부 프로브로서 제공된다. 표적 분절을 증폭시키는 경우, 프로브는 프라이머 부위들 사이내에서 확인하는 서열에서 생성물에 선택적으로 결합함으로써, 표적 빈도에 있어서 증가와 비교하여 FRET 시그날링에 있어서의 증가를 유발할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 정량적 PCR 시도에 사용될 태크만 프로브는 상기 정의된 바와 같이 양쪽 말단이 FRET 쌍으로 표지된 약 22 내지 30개 염기의 PDE9A 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 통상적으로, 5' 말단은 플루오레세인(예를 들면, FAM)과 같은 보다 짧은 파장의 형광단을 가질 것이고 3' 말단은 보다 긴 파장 형광성 켄쳐(예를 들면, TAMRA) 또는 비-형광성 켄쳐 화합물(예를 들면, Black Hole Quencher)로 일반적으로 표지된다. 정량적 PCR, 특히 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 프로브에 대해 사용될 프로브는, 프로브가 분해된 후 리포터 형광성의 켄칭을 피하기 위해 리포터 염료에 인접한 5' 말단에서 구아닌(G)을 갖지 않는다.
본 발명에 따른 정량적 PCR 시도에 사용될 Molecular Beacon 프로브는 바람직하게는 FRET 상호작용을 사용하여, 각각의 프로브가 5' 형광성-표지된 말단 및 3' 켄쳐-표지된 말단을 갖는 PCR 생성물을 검출하고 정량화한다. 프로브 구조의 당해 헤어핀 또는 스템-루프 구조는 바람직하게는 2개의 짧은 자가-결합 말단을 갖는 스템 및 약 20 내지 30개 염기의 긴 내부 표적-특이적인 영역을 지닌 루프를 포함한다.
본 발명과 관련하여 또한 사용될 수 있는 대안적인 검출 메카니즘은 루프 구조만을 지니고 짧은 상보성 스템 영역이 없도록 제작된 프로브에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여 또한 사용될 수 있는 정량적 PCR용의 대안적인 FRET-계 시도는 표적상에 인접한 부위에 결합한 2개의 하이브리드화 프로브의 사용을 기초로 하며, 여기서, 제1 프로브는 3' 말단에 형광성 공여자 표지를 가지며 제2 프로브는 이의 5' 말단에 형광성 수용체 표지를 갖는다.
PDE9A 단백질 또는 이의 특정 단편, 동족체 또는 기원한 유도체의 단백질 수준의 측정은 당해 분야에 공지된 어떠한 적합한 검출 기술을 통해 수행할 수 있다. 바람직하게는, PDE9A 및 이의 유도체의 단백질 수준은 면역학적으로, 예를 들면, PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체, 바람직하게는 상기 본원에 정의된 바와 같은 항체를 사용함으로서 측정할 수 있다. 또한, 상기 본원에 정의된 바와 같은 항체 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 본원에 정의된 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머와 같은 펩타이드 친화성 리간드의 사용을 개관한다.
PDE9A 단백질의 단백질 수준의 측정은 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 샘플로부터 단백질을 분리한 후, 웨스턴 블롯 분석에서 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 PDE9A 단백질을 확인함으로써 달성할 수 있다. 또한, 단백질은 2-차원 겔 전기영동 시스템에 의해 분리할 수 있다. 2-차원 겔 전기영동은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 통상적으로 제1 차원에 따른 등전 포커싱(iso-electric focusing)에 이어 제2 차원에 따른 SDS-PAGE 전기영동을 포함한다. 2D SDS-PAGE 겔의 분석은 겔 상에서 단백질 스폿의 강도를 측정함으로써 수행할 수 있거나, 면역 검출을 사용하여 수행할 수 있다. 다른 양태에서, 단백질 샘플은 질량 분광법으로 분석한다.
본 발명의 내용에서, PDE9A 특이적인 항체는 지지체 상에 위치시키고 면역화시킬 수 있다. 분석할 샘플 또는 조직으로부터 기원한 단백질을 후속적으로 항체와 혼합시킬 수 있다. 이어서, 검출 반응을 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 제2 친화성 리간드, 바람직하게는 특이적인 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 특히 본 발명의 진단 목적을 위해 사용될 수 있는 면역학적 시험은 예를 들면, 웨스턴 블롯, RIA(방사선-결합된 면역분석)와 같은 방사면역분석, ELISA(효소-결합된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집반응 분석, 예를 들면, 라텍스 응집반응, 상보체-고정 분석, 면역방사측정 분석, 형광성 면역분석, 예를 들면, FIA(형광성-결합된 면역분석), 화학발광성 면역분석, 전기화학발광성 면역분석(ECLIA) 및 단백질 A 면역분석과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템을 포함한다. 이러한 분석은 통상적으로 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
또한, 항원에 대한 항체의 결합 친화성 및 항체-항원 상호작용의 오프-속도는 경쟁적 결합 분석으로 측정할 수 있다. 경쟁적 결합 분석의 하나의 예는 표지된 항원(예를 들면, 3H 또는 125I)와 적합한 항체를 증가량의 표지되지 않은 항원과 함께 배양하고, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사면역분석이다. 특수한 항원에 대한 목적한 항체의 친화성 및 결합 오프-속도는 데이터로부터 어떠한 적합한 분석 시도에 의해, 예를 들면, 스캐챠드 플롯 분석(scatchard plot analysis)에 의해 측정할 수 있다. 제2 항체와의 경쟁은 또한 방사면역분석을 사용하여 측정할 수 있다. 당해 경우에, 항원은 증가량의 표지되지 않은 제2 항체의 존재하에서 표지된 화합물(예를 들면, 3H 또는 125I)에 접합시킨 적합한 항체와 함께 배양할 수 있다.
또한, 바람직하게는 상기 본원에 정의된 바와 같은, PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머를 PDE9A 단백질을 검출하는 방법에서 사용할 수 있다. 이러한 압타머는 바람직하게는 단백질-리간드 상호작용의 검출을 허용하기 위해 표지시킬 수 있다.
PDE9A의 생물학적 활성의 측정은 PDE9A의 상응하는 기능 또는 기능들에 대해 특이적인 분자 또는 효소 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 포스포디에스테라제에 의한 cGMP의 전환을 기준으로 하는 판독 시스템을 사용할 수 있다. 적합한 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 추가의 바람직한 양태에서, PDE9A의 생물학적 활성의 측정을 위한 분석은 다른 PDE9A 동형 및/또는 다른 PDE, 바람직학게는 cGMP의 전환을 수행할 수 있는 다른 PDE의 억제와 함께 수행할 수 있다. 이러한 활성의 억제는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 수단에 의해, 바람직하게는 적합한 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA 분자 또는 miRNA 분자를 통해, 보다 바람직하게는 특이적으로 하이브리드화하는 안티센스 뉴클레오타이드, 특이적인 siRNA 또는 miRNA 분자, 및 또한 BAY 73-6691, 자프리나스트, SCH51866, 실데나필 및 바르데나필과 같은 분자를 통해 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 수단에 의해서도 수행할 수 있다.
추가의 바람직한 양태에서, PDE9A의 생물학적 활성은 특이적인 PDE9A 억제제의 도움으로 시험할 수 있다. 이러한 억제제의 용도는 예를 들면, cGMP 기질의 전환을 기초로 한 판독 시스템과 결합시킬 수 있다. 사용될 대표적인 PDE9A 억제제는 안티센스 분자, siRNA 분자 또는 miRNA 분자를 포함한다.
PDE9A의 수준은 또한 조직학적 또는 세포-생물학적 과정을 포함하는 방법으로 검출할 수 있다. 전형적으로, 광 현미경 또는 면역형광성 현미경과 같은 가시적 기술, 및 또한 유동 세포분석법 또는 광도계를 사용할 수 있다. 세포내 PDE9A 단백질의 존재는 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 샘플로부터 시험할 세포를 제거하여 검출하거나 측정할 수 있다. 또한, 조직 단면 또는 생검 샘플을 이들 방법에 사용할 수 있다. 후속적으로, PDE9A에 대한 친화성 리간드, 바람직하게는 항체 또는 압타머를 적용할 수 있다. 통상적으로, 이러한 친화성 리간드는 바람직하게는 상기 본원에 정의된 바와 같은 형광성 표지로 표지된다. 이러한 과정은 이의 정량화를 위한 PDE9A의 검출을 허용하며, 또한, 이의 발현의 상대적인 수준 및 분포를 측정하도록 한다.
이러한 과정은 가시화 방법의 사용을 포함한다. 적합한 가시화 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용될 대표적인 방법은 형광, 발광 및/또는 효소 기술을 포함한다. 형광성은 일반적으로 형광성 표지를 특이적인 파장의 광에 노출시킨 후 특이적인 파장의 방사된 광을 검출하고/하거나 정량화함으로서 검출하고/하거나 정량화한다. 발광적으로 태그된 친화성 리간드의 존재는 화학 반응 동안 발현된 발광성에 의해 검출하고/하거나 정량화할 수 있다. 효소 반응의 검출은 화학 반응으로부터 유발되는 샘플 중의 색상 이동에 기인한다.
추가의 바람직한 양태에서, PDE9A의 수준은 적합한 분자 영상 기술, 예를 들면, 자기 공명 영상(MRI) 또는 자기 양성자 영상(MPI)에 의해 및/또는 적합한 조영제, 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 조영제를 사용함에 의해 측정될 수 있다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 방법은 측정된 핵산 또는 단백질 수준 또는 측정된 생물학적 활성을 대조군 수준과 비교하는 추가의 단계를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "대조준 수준"은 상기 본원에 정의된 바와 같은 암성 대조군 또는 비-암성 대조군 내에서 PDE9A 마커 또는 다른 적합한 마커의 발현을 말한다. 대조군 수준의 상태, 특성, 양 및 조건은 필요성에 따라 조절할 수 있다. 바람직하게는, 비-암성 대조군 수준을 사용할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "포함하는"은 데이터의 추정, 계산, 평가 또는 가공의 특정의 적합한 방법을 말한다.
추가의 단계로서 또 다른 양태에서, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행의 존재 또는 단계에 있어서의 결정은 비교 단계의 결과를 기초로 할 수 있다. 전립선 암은 진단되거나 예측될 수 있거나 전립선 암의 진행은 전립선 암 마커로서 PDE9A와 관련하여 상기 본원에 제공된 상응하는 정의에 따라 상기 방법에서 진단되거나 예측될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) 전립선 암을 앓고 있는 것으로 예측되는 적어도 1명의 개체로부터 수득된 적어도 하나의 샘플에서 PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질의 발현을 시험하는 단계;
(b) 암을 앓고 있지 않은 적어도 1명의 개체로부터 수득한 적어도 하나의 대조군 샘플에서 PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질의 발현을 시험하는 단계;
(c) 단계 (a) 및 (b)의 발현에 있어서의 차이를 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득한 결과를 기초로 하여 전립선 암 또는 전립선 암의 진행의 존재 또는 단계를 결정하는 단계를 적어도 포함하는, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 당해 진단 방법의 단계 a), b), c) 및/또는 d)는 사람 또는 동물 신체 외부, 예를 들면, 환자 또는 개체로부터 수득된 샘플에서 수행할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 호르몬-내성 전립선 암 또는 호르몬-내성 전립선 암에 대한 진행을 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 당해 방법은
(a) 샘플에서 PDE9A의 수준을 측정하는 단계;
(b) 샘플에서 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계; 및
(d) 정규화된 발현 수준을 선택한 예비측정된 컷오프 값과 비교하여 호르몬-민감성 전립선 암을 배제시키는 단계를 포함하며, 여기서, 컷오프 값 미만의 정규화된 발현 수준은 호르몬-내성 전립선 암의 지표이고, 여기서, 상기 컷오프 값은 약 2 내지 15, 바람직하게는 약 5인, 호르몬-민감성 전립선 암과 호르몬-내성 전립선 암을 구별하는 방법에 관한 것이다.
PDE9A의 수준은 상기 본원에 기술된 바와 같은 핵산, 단백질 또는 활성 수준에서 측정할 수 있다. PDE9A 전사체(들) 및/또는 단백질의 양을 측정하는 것이 바람직하다. 또한, 샘플내 표준 유전자의 수준을 측정할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "표준 유전자"는 예를 들면, 선택한 유기체내 특정의 꾸준하게 발현되고 지속적으로 검출가능한 유전자, 유전자 생성물, 발현 생성물, 단백질 또는 단백질 변이체를 말한다. 당해 용어는 또한 발현된 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 및 이의 변형된 변이체와 같은 유전자 생성물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 표준 유전자로부터 기원한 참조 단백질을 포함한다. 또한, 표준 유전자로부터 기원가능한 모든 종류의 전사체 뿐만 아니라 이의 변형 또는 이에 연결된 제2 매개변수도 포함된다. 추가로 또는 대안으로, 다른 참조 매개변수 또한 참조 목적, 예를 들면, 대사물질 농도, 세포 크기 등을 위해 사용될 수 있다.
발현은 바람직하게는 동일한 샘플에서 바람직하게 수행될 수 있는데, 즉, PDE9A 및 표준 유전자의 수준은 동일한 샘플에서 측정된다. 시험을 동일한 샘플 중에서 수행하는 경우, 본원에 기술된 바와 같은 단일 검출 또는 다중 검출 시도를 수행할 수 있다. 바람직하게는, 다중 검출을 위해, 서열 번호 7, 8 및 9의 서열 또는 서열 번호 45, 46 및 47의 서열을 가진 올리고뉴클레오타이드 및 프로브를 사용할 수 있다. 다중 검출의 수행을 위해 프라이머 및/또는 프로브 올리고뉴클레오타이드의 농도를 변형시킬 수 있다. 또한, 완충제, 이온 등과 같은 추가의 성분의 농도 및 존재는 변형시킬 수 있는데, 예를 들면, 제조업자의 지시와 비교하여 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 하나 이상의 표준 유전자 또는 꾸준히 발현된 유전자의 발현을 측정할 수 있다. 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30개 이상의 표준 유전자의 발현을 측정할 수 있다. 이러한 측정 결과는 별도로 계산하거나, 평균 발현 지수를 수득하기 위해 합할 수 있다. 또한, 표준 유전자 발현의 패턴은 후속적인 단계를 위한 기준으로 측정하고/하거나 사용할 수 있따. 이러한 패턴은 특정 암, 특히 전립선 암 단계 또는 상태에서 유전자의 공지된 발현 거동을 기초로 할 수 있다.
또한, 발현 결과는 참조 경우 또는 데이터베이스로부터의 이미 공지된 결과와 비교할 수 있다. 비교는 또한 결과의 통계적 관련성을 개선시키기 위해 정규화 과정을 포함할 수 있다.
본 발명의 대안적인 양태에서, 샘플 중의 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 것 대신에, 추가의 암 마커 또는 꾸준하게 발현되지 않는 유전자의 발현을 측정할 수 있다. 예를 들면, 호르몬-내성 전립선 암 동안 감소되는 것으로 공지되거나, 호르몬-민감 전립선 암 동안 증가되는 것으로 공지된 유전자의 발현을 측정할 수 있다.
추가의 양태에서, 발현 측정 둘다는 또한 수행할 수 있는데, 즉, 표준 유전자 및 추가의 암 또는 바이오마커 유전자의 발현의 측정을 수행할 수 있다.
발현 결과는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 적합한 방법, 예를 들면, 표준 점수, 스튜던츠 T-시험(Student's T-test), 스튜던츠화된 잔류 시험, 정규화된 순간 시험 또는 계수 변화 시험과 같은 정규화 통계적 방법에 따라 정규화할 수 있다. 통상적으로, 당해 분야의 숙련가에게 공지될 수 있는, 이러한 시험 또는 상응하는 식을 사용하여 측정 과정으로 인한 유전자 발현 수준 및 변화에 있어서의 실제 변화들 사이의 차별화를 가능하도록 할 수 있다.
단계 (a) 및 (b)에서 수득된 발현 결과 및/또는 단계 (c)에서 수득된 정규화된 결과를 바탕으로 하여, PDE9A 발현에 대한 컷오프 값과의 비교를 수행할 수 있다. PDE9A의 발현 수준 이하의 컷오프 값은 호르몬-내성 전립선 암의 지표이며, 이에 의해 호르몬-민감성 전립선 암 또는 종양 형태를 배제하면, 약 2 내지 15, 2 내지 14.5, 2 내지 14, 2 내지 13.5, 2 내지 13, 2 내지 12.5, 2 내지 12, 2 내지 11.5, 2 내지 11, 2 내지 10.5, 2 내지 10, 2 내지 9.5, 2 내지 9, 2 내지 8.5, 2 내지 8, 2 내지 7.5, 2 내지 7, 2 내지 6.5, 2 내지 6, 2 내지 5.5, 2 내지 5 또는 2.5 내지 15, 3 내지 15, 3.5 내지 15, 4 내지 15, 4.5 내지 15, 5 내지 15, 5 내지 15이다. 약 5, 예를 들면, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4. 4.3, 4.2, 4.1 또는 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4. 5.3, 5.2, 5.1의 컷오프 값이 보다 바람직하다.
특히 바람직한 양태에서, 상기 컷오프는 표준 유전자로서 하우스키핑 유전자와 함께 사용되어야 한다. 심지어 보다 바람직하게는, 상기 컷오프는 표준 유전자로서 GAPDH 및/또는 PBGD와 함께 사용되어야 한다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) PDE9A의 수준을 측정하는 단계;
(b) 샘플 중의 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계; 및
정규화된 발현 수준을 선택한 예비측정된 컷오프 값과 비교하여 양성 전립선 조양을 배제시킴을 포함하며, 여기서, 컷오프 값 초과의 정규화된 발현 수준은 악성의, 호르몬-민감성 전립선 암의 지표이고, 여기서, 상기 컷오프 값은 1.5 내지 3, 바람직하게는 약 2인, 악성의, 호르몬-민감성 전립선 암 또는 악성, 호르몬-민감성 전립선 암으로의 진행을 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 방법은 비-암성 단계, 바람직하게는 건강한 단계 및 악성의 호르몬-민감성 전립선 암을 구별한다. 당해 방법은 상기 본원에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 본 방법과 관련하여, 표준 유전자로서 PDE4D5의 사용이 바람직하다. 또한, 적합한 올리고뉴클레오타이드 및 프로브, 예를 들면, 서열 번호 45, 46 및 47(PDE9A)의 서열과 함께 서열 번호 48, 49 및 50(PDE4D5)의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 및 프로브와의 다중 검출 반응을 수행하는 것이 특히 바람직하다. 다중 검출의 수행을 위해, 프라이머 및/또는 프로브 올리고뉴클레오타이드의 농도를 변형시킬 수 있다. 또한, 완충제, 이온 등과 같은 추가의 성분의 농도 및 존재를 변형시킬 수 있는데, 예를 들면, 제조업자의 지시와 비교하여 증가되거나 감소될 수 있다.
단계 (a) 및 (b)에서 수득된 발현 결과 및/또는 단계 (c)에서 수득한 정규화된 결과를 기초로 하여, PDE9A 발현에 대한 컷오프와의 비교를 수행할 수 있다. PDE9A의 발현 수준 미만의 컷오프 값은 건강한 상태, 즉, 전립선 암의 부재의 지표이며, 이에 의해, 호르몬-민감성 전립선 암 또는 종양 형을 배재하는, 약 1.5 내지 3, 1.75 내지 3, 2 내지 3, 2.25 내지 3, 2.5 내지 3, 2.75 내지 3이다. 약 2, 예를 들면, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4. 2.3, 2.2, 2.1의 컷오프 값이 보다 바람직하다.
본원에 사용된 것으로서, "샘플"은 PDE9A 및 표준 유전자의 수준의 측정을 위해 사용된 동일한 샘플 또는 유사한 샘플일 수 있다. 동일한 샘플의 사용이 바람직하다.
동일한 샘플에서 표준 유전자의 측정 외에, 대조군 샘플을 또한 분석할 수 있다. 이와 관련하여, 분석은 대조군 샘플 중의 PDE9A의 발현의 검출을 포함한다. 대조군은 바람직하게는 건강한 조직 또는 양성 전립선 종양으로부터 기원한 조직이다.
컷오프 값은 상기 본원에 기술된 바와 같은, 혈액 샘플, 예를 들면, 혈청 또는 혈장 샘플, 뇨 샘플 또는 뇨 침강 샘플 등에 대한 컷오프 값일 수 있다.
측정되고/되거나 정규화된 PDE9A 발현이 나타낸 컷오프 값 초과인 경우, 이는, 개체가 전립선 암, 호르몬 의존성 또는 호르몬 민감성 전립선 암을 앓고 있는 지표로 인식될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 컷오프 값은 혈액 샘플, 예를 들면, 혈청 또는 혈장 샘플, 뇨 샘플 또는 뇨 침강 샘플에서 PDE9A에 대한 컷오프 값이다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 컷오프 값은 뇨 샘플에서 상기 본원에 정의한 바와 같은 PDE9A 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이의 특정 유도체에 대한 컷오프 값이다. 본 발명의 다른 특히 바람직한 양태에서, 컷오프 값은 뇨 속에 함유된 세포로부터 분비된 엑소좀 또는 뇨 속에 함유된 세포내 상기 본원에 정의한 바와 같은 PDE9A 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 특정의 이의 유도체에 대한 컷오프 값이다. 본 발명의 심지어 보다 바람직한 양태에서, 컷오프 값은 뇨 침강 샘플 및 뇨 침강 샘플 속에 함유된 세포에서 상기본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 단백질 또는 폴리펩타이드 또는, 특정의 이의 유도체 및 뇨 침강 샘플 속에 함유된 세포로부터 분비된 엑소좀에 대한 컷오프 값이다.
측정되고/되거나 정규화된 PDE9A 발현이 나타낸 컷오프 값을 초과하는 경우, 이는, 개체가 호르몬-내성 전립선 암을 앓고 있지 않는다는 것의 지표로 인식될 수 있다. 당해 값은 또한, 개체가 호르몬-내성 전립선 암, 특히 호르몬-의존성 전립선 암 또는 호르몬-민감성 전립선 암 이외의 전립선 암을 앓고 있다는 것을 나타낼 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) 개체에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 측정된 것으로서의 발현을 대조군 수준과 비교하는 단계를 적어도 포함하는, 데이터 획득 방법에 관한 것이다.
PDE9A의 발현을 위한 시험은 상기 본원에 정의된 바와 같은 단계에 따라 수행될 수 있다. 바람직하게는 시험은 PDE9A의 핵산 또는 단백질 수준의 측정으로서 또는 PDE9A의 생물학적 활성을, 보다 바람직하게는 이러한 측정을 위해 상기 본원에서 기술된 선택사항에 따라 측정함으로써 수행할 수 있다. 시험은 개체, 즉, 생체내, 또는 개체의 외부, 예를 들면, 생체외 또는 시험관내에서 수행할 수 있다. 데이터 획득 방법과 관련하여 사용된 것으로서 용어 "대조군 수준"은 상기 본원에 정의된 바와 같은, 암성 대조군 또는 비-암성 대조군에서 PDE9A 마커 또는 다른 적합한 마커의 발현을 말한다. 대조군 수준의 상태, 특성, 양 및 조건은 필수성에 따라 조절될 수 있다. 바람직하게는, 비-암성 대조군 수준을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 호르몬-민감성 전립선 암 단계로부터 기원한 대조군 수준을 사용할 수 있다. 대조군 수준에 대한 발현의 비교는 2개의 데이터를 추정하거나, 계산하거나, 평가하거나 가공하는 어떠한 적합한 방법에 따라 수행할 수 있으며, 특히 2개의 데이터 세트들 사이의 차이점의 검출을 목표로 한다. 이러한 차이점의 현저성의 통계적 평가를 또한 수행할 수 있다. 적합한 통계적 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 수득된 데이터 및 정보는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적합한 정보과학 또는 컴퓨터 방법 또는 도구에 의해 저장되거나, 축적되거나 가공될 수 있고/있거나 적절한 방식으로 표시되어 전문가가 하나 이상의 후속적인 추론 또는 결론 단계를 위해 데이터를 사용하도록 한다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) 개체로부터 수득한 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(b) 대조군 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(c) 단계 (a) 및 (b)의 PDE9A의 발현에 있어서의 차이점을 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득된 결과를 바탕으로 전립선 암 또는 암의 진행의 존재 또는 단계를 결정하는 단계를 적어도 포함하는, 전립선 암 또는 전립선 암의 진행을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 면역분석에 관한 것이다.
면역분석은 바람직하게는 PDE9A에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들면, 본원에 언급된 하나 이상의 PDE9A 항체의 용도를 기초로 한다. 또한, 면역분석은 다른 어떠한 적합한 제제를 사용하여 수행되거나 합해질 수 있다. 예를 들어, 분석은 본원에 기술된 바와 같은 핵산의 검출, 또는 효소 시험 방법과 합해질 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은
(a) 샘플에서 PDE9A의 수준을 측정하는 단계;
(b) 샘플에서 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계; 및
(d) 정규화된 발현 수준을 호르몬-민감성 전립선 암이 배제되도록 선택한 예비측정된 컷오프(cutoff) 값과 비교하는 단계(여기서, 컷오프 값 이하의 정규화된 발현 수준은 호르몬-내성 전립선 암의 지표이며, 여기서, 상기 컷오프는 약 2 내지 15이다. 바람직하게는 상기 컷오프는 약 5이다)를 포함하는, 호르몬-민감성 전립선 암 및 호르몬-내성 전립선 암을 구별하기 위한 면역분석에 관한 것이다.
PDE9A의 수준은 상기 본원에 기술된 바와 같은 단백질 또는 활성 수준에서 바람직하게 측정될 수 있다. PDE9A 특이적인 항체, 예를 들면, 본원에 언급된 하나 이상의 PDE9A 항체의 도움으로 PDE9A 단백질의 양을 측정하는 것이 바람직하다. 달리는, 면역분석은 특정의 다른 적합한 제제를 사용하여 수행될 수 있거나 다른 개체의 측정과 결합될 수 있다. 예를 들면, 분석은 핵산의 존재 또는 양의 검출, 또는 본원에 기술된 바와 같은 효소 시험 방법과 결합될 수 있다.
또한, 샘플에서 상기 본원에 정의된 바와 같은 표준 유전자의 수준을 측정할 수 있다. 표준 유전자의 검출을 위해, 유전자 발현 생성물(즉, 단백질)의 양을 바람직하게는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 하나 이상의 적합한 항체의 도움으로 측정할 수 있다. 또한, 표준 유전자의 측정은 어떠한 다른 적합한 제제로 수행될 수 있거나, 본원에 기술된 바와 같이 핵산의 존재 또는 양의 측정, 또는 효소 시험 방법과 합해질 수 있다.
단계 (a) 및 (b)에서 수득된 발현 결과 및/또는 단계 (c)에서 수득된 정규화된 결과를 기초로 하여, PDE9A 발현에 대한 컷오프 값과의 비교를 수행할 수 있다. PDE9A의 발현 수준 미만의 컷오프 값은 호르몬-내성 전립선 암의 지표이며, 이로써 면역분석에서 호르몬-민감성 전립선 암 또는 종양형을 배제하면, 약 2 내지 15, 2 내지 14.5, 2 내지 14, 2 내지 13.5, 2 내지 13, 2 내지 12.5, 2 내지 12, 2 내지 11.5, 2 내지 11, 2 내지 10.5, 2 내지 10, 2 내지 9.5, 2 내지 9, 2 내지 8.5, 2 내지 8, 2 내지 7.5, 2 내지 7, 2 내지 6.5, 2 내지 6, 2 내지 5.5, 2 내지 5 또는 2.5 내지 15, 3 내지 15, 3.5 내지 15, 4 내지 15, 4.5 내지 15, 5 내지 15, 5 내지 15이다. 약 5, 예를 들면, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1 또는 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 또는 5.1의 컷오프 값이 보다 바람직하다.
컷오프 값은 하기 본원에 기술된 바와 같이, 혈액 샘플, 예를 들면, 혈청 또는 혈장 샘플, 뇨 샘플 또는 뇨 침강 샘플 등에서 PDE9A에 대한 컷오프 값일 수 있다.
측정되고/되거나 정규화된 PDE9A 발현이 나타낸 컷오프 값 초과인 경우, 이는, 개체가 호르몬-내성 전립선 암을 앓고 있지 않은 것의 지표로 인식될 수 있다. 당해 값은 또한, 개체가 호르몬-내성 전립선 암, 특히 호르몬-의존성 전립선 암 또는 호르몬-민감성 전립선 암 이외의 전립선 암을 앓고 있음을 나타낼 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은
(a) PDE9A의 수준을 측정하는 단계,
(b) 샘플 중의 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계를 포함하며; 정규화된 발현 수준을 선택한 예비측정된 컷오프 값과 비교하여 양성 전립선 종양을 배제시키는, 비-암성 단계, 바람직하게는 건강한 단계 및 악성의, 호르몬-민감성 전립선 암을 구별하기 위한 면역분석에 관한 것이며, 여기서, 컷오프 값을 초과하는 정규화된 발현 수준은 악성의 호르몬-민감성 전립선 암의 지표이고, 여기서, 상기 컷오프 값은 1.5 내지 3, 바람직하게는 약 2이다. PDE9A의 수준은 바람직하게는 상기 본원에 기술된 바와 같이 단백질 또는 활성 수준에서 측정할 수 있다. PDE9A 단백질의 양을 PDE9A 특이적인 항체, 예를 들면, 본원에 언급된 하나 이상의 PDE9A 항체의 도움으로 측정하는 것이 바람직하다. 대안으로, 면역분석은 어떠한 다른 적합한 제제와 함께 수행될 수 있거나 다른 개체의 측정과 결합될 수 있다. 예를 들면, 분석은 본원에 기술된 바와 같은 핵산의 존재 또는 양의 검출, 또는 효소 시험 방법과 결합시킬 수 있다.
또한, 샘플에서 상기 본원에 정의한 바와 같은 표준 유전자의 수준을 측정할 수 있다. 표준 유전자의 검출을 위해, 유전자 발현 생성물(즉, 단백질)의 양을 바람직하게는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 하나 이상의 적합한 항체의 도움으로 측정할 수 있다. 대안으로, 표준 유전자의 측정은 다른 어떠한 적합한 제제로 수행하거나 본원에 기술된 바와 같은 핵산의 존재 또는 양의 검출, 또는 효소 시험 방법과 결합시킬 수 있다.
단계 (a) 및 (b)에서 수득된 발현 결과 및/또는 단계 (c)에서 수득된 정규화된 결과를 바탕으로 하여, PDE9A 발현에 대한 컷오프 값과의 비교를 수행할 수 있다. PDE9A의 발현 수준 이하의 컷오프 값은 건강한 상태, 즉, 전립선 암의 부재의 지표이며, 이에 의해 호르몬-민감성 전립선 암 또는 종양 형태를 배제하면, 약 1.5 내지 3, 1.75 내지 3, 2 내지 3, 2.25 내지 3, 2.5 내지 3, 2.75 내지 3이다. 약 2, 예를 들면, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 또는 2.1의 컷오프 값이 보다 바람직하다.
컷오프 값은 혈액 샘플, 예를 들면, 하기 본원에 기술된 바와 같이, 혈청 또는 혈장 샘플, 뇨 샘플 또는 뇨 침강 샘플 등에서 PDE9A에 대한 컷오프 값일 수 있다.
측정되고/되거나 정규화된 PDE9A 발현이, 나타낸 컷오프 값을 초과하는 경우, 이는, 개체가 전립선 암, 특히 호르몬 의존성 또는 호르몬 민감성 전립선 암을 앓고 있는 것의 지표로 인식될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은
(a) 개체로부터 수득된 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(b) 상기 샘플에서 표준 유전자의 발현을 시험하고/하거나 대조군 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(c) 단계 (b)의 발현 수준에 대해 단계 (a)의 발현 수준을 분류하는 단계; 및
(d) 개체를 전립선 암 치료요법을 제공받기에 적격인 것으로 동정하는 단계(여기서, 개체의 샘플은 변경된 수준의 PDE9A 발현을 가지는 것으로 분류된다)를 포함하는, 전립선 암 치료요법에 대한 적격성에 대해 개체를 동정하는 방법에 관한 것이다.
PDE9A의 수준은 상기 본원에 기술된 핵산, 단백질 또는 활성 수준으로 측정할 수 있다. PDE9A 전사체(들) 및/또는 단백질의 양을 측정하는 것이 바람직하다. 샘플에서 상기 본원에 기술된 표준 유전자의 수준을 측정할 수 있다. 표준 유전자의 발현에 대한 시험은 PDE9A의 측정에 사용된 동일한 샘플 중에서 수행할 수 있다. 시험을 동일한 샘플 중에서 수행하는 경우, 단일 검출 또는 다중 검출 시도를 수행할 수 있다. 바람직하게는, 다중 검출을 위해, 서열 번호 7, 8 및 9의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 및 프로브를 사용할 수 있다. 다중 검출의 수행을 위해, 프라이머 및/또는 프로브 올리고뉴클레오타이드의 농도를 변형시킬 수 있다. 또한, 완충제, 이온 등과 같은 추가의 성분의 농도 및 존재는 변형시킬 수 있는데, 예를 들면, 제조업자의 지시와 비교하여 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 또한, 표준 유전자의 발현에 대한 시험은 상이한 샘플, 바람직하게는 상기 본원에 정의된 바와 같은 대조군 샘플에서 수행할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 대조군 샘플은 시험 샘플과 동일한 개체로부터의 대조군 샘플, 또는 상이한 공급원 또는 개체로부터 기원한 대조군 샘플일 수 있다. 대조군 샘플은 또한 동일한 조직, 바람직하게는 전립선 조직으로부터 기원하거나, 상이한 조직 유형으로부터 기원한 샘플일 수 있다. 바람직한 대안적인 조직 유형의 예는 기질 전립선 조직, 방광 내피 조직 및 자궁 내피 조직이다. 또한, 표준 유전자의 발현을 위한 시험 샘플의 시험 및 PDE9A의 발현을 위한 대조군 샘플의 시험을 합할 수 있다.
추가의 양태에서, 대조군 샘플을 또한 표준 유전자의 발현에 대해 시험할 수 있다. 하나 이상의 샘플을 표준 유전자의 발현에 대해 시험한 경우, 수득된 발현 결과를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 통계적 방법에 따라 비교하고/하거나 평균내거나 정규화할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단계 (b)의 발현 수준에 대해 상대적인 단계 (a)의 발현 수준의 분류"는, 예를 들면, 적합한 정규화 참조물에 대해 정규화한 후, PDE9A에 대해 시험 샘플내 발현 및 PDE9A에 대해 대조군 샘플내 발현을 비교함을 의미한다. 비교 결과에 따라서, 시험 샘플은 대조군 샘플과 유사한 발현, 대조군 샘플과 비교하여 증가된 발현, 또는 대조군 샘플과 비교하여 감소된 발현으로 나타낸다. 당해 용어는 또한, 예를 들면, 정규화 참조로서 추가의 유전자에 대한 정규화 후, PDE9A에 대한 시험 샘플내 발현 및 표준 유전자에 대한 동일한 샘플 샘플내 발현을 비교함을 의미한다. 비교 결과에 따라서, 시험 샘플은 표준 유전자와 유사한 발현, 표준 유전자와 비교하여 증가된 발현, 또는 표준 유전자와 비교하여 감소된 발현으로 나타낸다.
발현 결과의 분류에 따라서, 개체는 PDE9A 발현 수준이 감소된 경우 전립선 암 치료요법에 대해 적격인 것으로 고려될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "변경된"은 감소되거나 증가된 PDE9A 발현 수준을 말한다. 발현 수준은, 시험 샘플내 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플내 PDE9A 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상까지 또는, 대조군 샘플내 PDE9A 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 이상 감소된 경우; 또는 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플내 표준 유전자의 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상, 또는 표준 유전자의 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 이상 감소한 경우 "감소된" 것으로 간주한다. 특수 양태에서, 표준 유전자의 발현은 또한 추가의 유전자 또는 마커, 예를 들면, 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 정규화하거나 조절할 수 있다. 유사하게, PDE9A 발현 수준은, 시험 샘플내 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플내 PDE9A 발현과 비교하여, 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상까지 또는, 대조군 샘플내 PDE9A 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 이상 상승한 경우; 또는 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플내 표준 유전자의 발현과 비교하여, 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상, 또는 표준 유전자의 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 이상 상승한 경우, "상승한" 것으로 취급한다. 특수 양태에서, 표준 유전자의 발현은 또한 추가의 유전자 또는 마커, 예를 들면, 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 정규화하거나 조절할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은
(a) 개체로부터 수득한 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(b) 상기 샘플에서 표준 유전자의 발현을 시험하고/하거나 대조군 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계;
(c) 단계 (a)의 PDE9A의 발현 및 단계 (b)에서 PDE9A 및/또는 표준 유전자의 발현에 있어서의 차이를 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득된 결과를 기준으로 하여 전립선 암 치료요법에 대해 개체 또는 개체의 집단을 등급화하는 단계(여기서, 개체의 샘플은 변경된 수준의 PDE9A 발현을 갖는다)를 포함하는, 전립선 암 질환을 가진 개체 또는 개체의 집단을 등급화하기 위한 면역분석에 관한 것이다.
PDE9A의 발현의 시험은 바람직하게는 상기 본원에 기술된 바와 같이 PDE9A 단백질의 양의 측정 또는 PDE9A 활성 수준의 측정을 통해 수행될 수 있다. PDE9A 특이적인 항체, 예를 들면, 본원에 언급된 PDE9A 항체 중 하나 이상의 도움으로 PDE9A 단백질의 양을 측정하는 것이 바람직하다. 또한, 면역분석은 어떠한 다른 적합한 제제를 사용하여 수행될 수 있거나 다른 개체의 측정과 결합될 수 있다. 예를 들어, 분석은 본원에 기술된 바와 같은 핵산의 존재 또는 양의 검출 또는 효소적 시험 방법과 결합될 수 있다. 또한, 샘플 속의 상기 본원에 기술된 바와 같은 표준 유전자의 수준을 측정할 수 있다. 표준 유전자의 발현을 위한 시험은 PDE9A의 측정에 대해 사용된 동일한 샘플 중에서 수행될 수 있다. 시험을 동일한 샘플 중에서 수행하는 경우, 단일 검출 또는 평행 또는 다중 검출 시도를 수행할 수 있다. 바람직하게는, 평행 또는 다중 검출을 위해, 상이하게 표지된 제1 또는 제2 항체를 사용할 수 있다.
또한, 표준 유전자의 발현을 위한 시험은 상이한 샘플, 바람직하게는 상기 본원에 정의된 바와 같은 대조군 샘플 중에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 이러한 대조군 샘플은 시험 샘플과 동일한 개체로부터의 대조군 샘플, 또는 상이한 공급원 또는 개체로부터 기원한 대조군 샘플일 수 있다. 대조군 샘플은 또한 동일한 조직, 바람직하게는 전립선 조직으로부터 기원한 샘플일 수 있거나, 상이한 조직 유형으로부터 기원할 수 있다. 바람직한 대안적 조직 유형의 예는 기질 전립선 조직, 방광 상피 조직 및 요도 상피 조직이다.
더욱이, 표준 유전자의 발현에 대한 시험 샘플의 시험 및 PDE9A의 발현에 대한 대조군 샘플의 시험을 합할 수 있다.
추가의 양태에서, 대조군 샘플을 또한 표준 유전자의 발현에 대해 시험할 수 있다. 하나 이상의 샘플을 표준 유전자의 발현에 대해 시험한 경우, 수득된 발현 결과는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 통계학적 방법에 따라 비교하고/하거나 평균을 내거나 정규화할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "단계 (a)의 PDE9A의 발현 및 단계 (b)에서 PDE9A 및/또는 표준 유전자의 발현 사이의 차이점의 측정"은, PDE9A에 대한 시험 샘플에 있어서의 발현 및 PDE9A에 대한 대조군 샘플에 있어서의 발현을, 예를 들면, 적합한 정규화 참조물질에 대한 정규화 후 비교하는 것을 의미한다. 비교 결과에 따라서, 시험 샘플은 대조군 샘플과 유사한 발현, 대조군 샘플과 비교하여 증가된 발현, 또는 대조군 샘플과 비교하여 감소된 발현을 제공하는 것으로 나타낸다. 당해 용어는 또한 대안으로 또는 추가로 PDE9A에 대한 시험 샘플에 있어서의 발현 및 표준 유전자에 대한 동일한 시험 샘플에 있어서의 발현을, 예를 들면, 정규화 참조물질로서 추가의 유전자에 대한 정규화 후 비교함을 의미한다. 비교 결과에 따라서, 시험 샘플은 표준 유전자와 유사한 발현, 또는 발현에 있어서의 차이를 제공하는 것으로 나타낸다. 당해 차이는 표준 유전자와 비교하여 증가된 발현, 또는 표준 유전자와 비교하여 감소된 발현일 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "전립선 암 치료요법에 대한 개체 또는 개체의 집단의 등급화"는, 이의 최적 치료요법 형태가 전립선 암 치료요법, 바람직하게는 상기 본원에 기술된 바와 같은 발현 시험의 결과에 따라서, 특히 PDE9A 발현 수준에 있어서의 직면한 차이 및 상이한 샘플 중에서 표준 유전자 또는 PDE9A 발현 수준에 따른 호르몬-내성 전립선 암에 대한 치료요법인 유사한 개체의 그룹에 관한 것으로 확인됨을 의미한다. 발현 차이의 측정에 따라서, 개체는, PDE9A 발현 수준이 변경되는, 즉, 가소되거나 증가되는 경우, 이의 최적 치료요법 형태가 전립선 암 치료요법인 유사한 개체의 그룹에 관한 것으로 확인될 수 있다. 발현 수준은, 시험 샘플에서 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플에서 PDE9A 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상, 또는 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 이상 감소되는 경우; 또는 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플에서 표준 유전자의 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 50% 이상, 또는 표준 유전자의 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상 감소되는 경우, "감소된"으로 간주된다. 특정 양태에서, 표준 유전자의 발현은 또한 추가의 유전자 또는 마커, 예를 들면, 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 정규화되거나 조절될 수 있다. 유사하게, PDE9A 발현 수준은, 시험 샘플에서 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플에서 PDE9A 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상, 또는 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 이상 상승되는 경우; 또는 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플에서 표준 유전자의 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 50% 이상, 또는 표준 유전자의 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상 상승되는 경우, "증가된"으로 간주된다. 특정 양태에서, 표준 유전자의 발현은 또한 추가의 유전자 또는 마커, 예를 들면, 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 정규화되거나 조절될 수 있다.
개체는 전립선 암 치료요법에 적격인 것으로 고려되거나 상기 본원에 기술된 바와 같은 전립선 암 치료요법에 대해 등급화되는 개체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 치료학적 전립선 암 치료를 제공받을 수 있다. 대표적으로, 전립선 암 치료요법에 적격이거나 감소된 PDE9A 발현으로 인하여 상응하는 치료 그룹으로 등급화되는 것으로 고려되는 개체는 호르몬-내성 전립선 암을 앓거나 미래에, 예를 들면, 다음 1 내지 24개월내에 호르몬-내성 전립선 암으로 진행되는 경향이 있는 것으로 고려될 수 있다. 상응하게 확인되거나 등급화된 개체는 예를 들면, 하기 본원에 정의된 바와 같이, 본 발명에 따른 약제학적 조성물로 치료될 수 있다. 추가의 양태에서, 상응하게 학인된 개체는 추가의 암 치료요법과 함께 본 발명에 따르는 약제학적 조성물로 치료할 수 있다. 용어 "추가의 암 치료요법"은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정 유형의 암 치료요법을 말한다. 호르몬-내성 전립선 암에 대해 공지된 암 치료요법 형태가 바람직하다. 당해 용어는 예를 들면, 화학치료요법, 방사선 치료요법, 수술, 항체 치료요법 등의 모든 적합한 형태를 포함한다.
또한, 상응하게 확인되거나 등급화된 개체를 또한 화학치료요법, 방사선 치료요법, 수술, 항체 치료요법 등과 같은 하나 이상의 암 치료요법을 사용하여 단독으로 치료할 수 있다. 전립선 암에 통상적으로 사용된 암 치료요법이 바람직하며, 호르몬-내성 전립선 암에 사용된 암 치료요법이 보다 바람직하다.
본 발명의 추가의 양태에서, 상기 본원에 기술된 바와 같은 등급화에 대한 면역분석 또는 적격성에 대한 분류 방법을 또한 개체, 예를 들면, 호르몬-내성 전립선 암을 앓고 있는 것으로 분류되는 개체의 치료를 모니터링하는데 사용할 수 있다. 모니터링 공정은 장기간에 걸쳐, 예를 들면, 치료 기간 동안 또는 치료 후, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개월, 또는 1, 2, 3년 이상 동안 발현 측정으로서 수행할 수 있다. 측정 단계는 적합한 간격, 예를 들면, 매주, 2주, 3주, 매월, 2개월, 3개월, 6개월, 12개월 등으로 수행할 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 본원에 언급된 바와 같은 특정 치료 계획 , 예를 들면, 모니터링 공정의 결과에 상응하는 특정의 적합한 방식으로 조절, 예를 들면, 보강하거나 약화시키거나, 또는 변경시킬 수 있다.
PDE9A의 발현을 위한 시험은 상기 본원에 정의된 바와 같은 단계에 따라 수행할 수 있다. 바람직하게는, 시험은 PDE9A의 단백질 수준의 측정으로서, 보다 바람직하게는 이러한 측정을 위한 상기 본원에 기술된 선택 사항에 따라 수행할 수 있다. 대조군 또는 대조군 샘플로서 상기 본원에 정의된 바와 같은 대조군을 사용할 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 시험 단계는 PDE9A에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들면, H00005152-M01 또는 NBP1-00641과 같은 상업적으로 이용가능한 항-PDE9A 항체의 사용을 기초로 할 수 있다 암은 진단되거나 예측될 수 있거나, 암의 진행은 상기 면역분석에서 진단되거나, 개체는 전립선 암에 대한 적경능에 대해 확인될 수 있거나, 개체 또는 개체 집단은 암 마커로서 PDE9A와 관련하여 상기 본원에 제공된 상응하는 정의에 따라서 면역분석에서 등급화될 수 있다. 따라서, PDE9A의 발현의 상기 시험 또는 측정이 달성되거나 핵산 또는 단백질 수준의 측정 또는 PDE9A의 생물학적 활성의 측정에 의해 추가로 달성될 수 있다. 유사한 측정을 표준 유전자와 관련하여 수행할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 표준 유전자는 하우스키핑 유전자 또는 상이한 포스포디에스테라제이다. 사람 유기체에서, "하우스키핑 유전자"의 예는 특히, β-액틴, 글리세린알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 포르포빌리노겐 데아니마제(PBGD), 및 리보솜 단백질 P1을 포함한다. 이들 유전자와는 달리, 어떠한 다른 적합한 유전자도, 당해 유전자가 꾸준한, 변형되지 않은 수준으로, 특히 암 발달의 상이한 단계 동안, 보다 바람직하게는 전립선 암 발달의 상이한 단계 동안, 보다 바람직하게는 호르몬-민감성 전립선 암의 호르몬-내성 전립선 암 상태로의 이전 동안 발현 또는 전사를 나타내는 한, 하우스키핑 유전자로서 사용될 수 있다. GAPDH의 유전자 또는 전사체 또는 발현 생성물 또는 단백질이 특히 바람직하다. 또한, PBGD의 유전자 또는 전사체 또는 발현 생성물 또는 단백질이 특히 바람직하다. 하우스키핑 유전자의 발현 데이터는 동일한 개체 또는 추가의 개체로부터의 하나 이상의 샘플, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 1000, 5,000, 10,000개 이상의 샘플로부터 수득될 수 있다. 발현 데이터는 또한 당해 분야의 숙련가에게 이용가능한 데이터베이스 또는 데이터 수집으로부터 수득될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "상이한 포스포디에스테라제"는 PDE9A가 아닌 다른 포스포디에스테라제를 말한다. 표준 유전자로서 적합할 이러한 포스포디에스테라제는 꾸준히 발현되어야 하며 선택한 유기체내에서 연속적으로 검출가능한 유전자 생성물, 발현 생성물, 단백질 또는 단백질 변이체를 제공한다. PDE4D 계열의 포스포디에스테라제, 예를 들면, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 및 PDE4D9가 특히 바람직하다. PDE4D5 포스포디에스테라제가 보다 바람직하다.
따라서, GAPDH, PBGD 및 특히 PDE4D5를 사용한 정규화 및/또는 비교는 진단 방법 및 면역분석, 개체를 동정하는 방법 또는 식별하거나 등급화하기 위한 면역분석을 기초로 한 상술한 컷오프에 사용될 수 있다. 상응하는 측정 단계는 독립된 반응으로 또는 특히 바람직하게는 다중 반응에서 수행할 수 있다. 다중 검출의 수행을 위해, 프라이머 및/또는 프로브 올리고뉴클레오타이드의 농도를 변형시킬 수 있다. 또한, 완충제, 이온 등과 같은 추가 성분의 농도 및 존재는 제조업자의 지시와 비교하여 변형, 예를 들면, 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 상기 본원에 기술된 바와 같은 PDE9A의 발현을 기초로 하여 전립선 암 치료요법에 대한 적격성에 대해 개체를 동정하는 방법은 또한 하나 이상의 상이한 바이오마커의 발현을 기초로 하여, 하나 이상의 유사한 확인 방법과 합할 수 있다. 전립선 특이적인 항원(PSA)의 수준의 측정이 바람직하다. 따라서, PSA의 수준이 약 2 내지 10 ng/ml, 예를 들면, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ng/ml에 직면한 경우, 개체는 악성, 호르몬 민감성 전립선 암을 앓거나, 가까운 미래, 예를 들면, 다음 1, 2, 3, 4, 5, 6개월내에 악성의, 호르몬 민감성 암으로 진행될 경향이 있는 것으로 고려될 수 있다. PSA의 수준이 약 10n/ml, 예를 들어, 11, 12, 15, 20 등에 직면한 경우, 개체는 호르몬 내성 전립선 암을 앓거나 가까운 미래에 호르몬 내성 전립선 암으로 진행될 경향이 있는 것으로 고려될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 언급한 진단, 검출, 모니터링 또는 예측은 개체로부터 수득된 샘플 상에서 수행되어야 한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "개체로부터 수득된 샘플"는 개체로부터 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적합한 방법을 통해 수득된 특정의 생물학적 물질을 말한다. 본 발명과 관련하여 사용된 샘플은 바람직하게는 임상적으로 허용되는 방식으로, 보다 바람직하게는 핵산(특히 RNA) 또는 단백질이 보존되는 방식으로 수집되어야 한다.
생물학적 샘플은 체 조직 및, 혈액, 땀, 가래 또는 타액과 같은 유액, 및 또한 배설물 또는 대변 샘플도 포함할 수 있다. 또한, 생물학적 샘플은 상피 세포, 바람직하게는 암성 상피 세포 또는, 암성인 것으로 예측되는 조직으로부터 기원한 상피 세포를 포함하는 세포 집단 또는 이로부터 기원한 세포 추출물을 함유할 수 있다. 심지어 보다 바람직하게는 생물학적 샘플은 선 조직으로부터 기원한 세포 집단을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 샘플은 남성 개체의 전립선으로부터 기원할 수 있다. 추가로, 세포를 수득된 체 조직 및 유액으로부터 경우에 따라 정제한 후, 생물학적 샘플로 사용할 수 있다.
특히 초기 프로세싱 후 샘플을 혼주(pooling)시킬 수 있다. 그러나, 또한 혼주되지 않은 샘플을 사용할 수 있다.
본 발명의 특수 양태에서, 생물학적 샘플의 성분을 또한 농축 단계에 적용시킬 수 있다. 예를 들면, 샘플을 세포막 또는 특정 세포 유형, 예를 들면, 전립선 세포의 기관에 대해 특이적인 리간드와 접촉시키고, 예를 들면, 자기 입자로 작용화시킬 수 있다. 자기 입자에 의해 농축된 물질은 상기 및 하기 본원에 기술된 바와 같은 검출 및 분석 단계에 후속적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 특수 양태에서, 생검 또는 절제 샘플을 수득하고/하거나 사용할 수 있다. 이러한 샘플은 세포 또는 세포 분해물을 포함할 수 있다.
또한, 세포, 예를 들어, 종양 세포를 유액 또는 액체 샘플, 예를 들면, 혈액, 뇨, 땀 등의 여과 공정을 통해 농축시킬 수 있다. 이러한 여과 공정은 또한 상기 본원에 기술된 바와 같은 리간드 특이적인 상호작용을 기초로 농축 단계와 합할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 샘플은 조직 샘플, 뇨 샘플, 뇨 침강 샘플, 혈액 샘플, 타액 샘플, 정액 샘플, 순환성 종양 세포를 포함하는 샘플, 또는 전립선 분비된 엑소좀을 함유하는 샘플일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) PDE9A의 활성을 직접 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제; (b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물; (c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물; (d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산; (e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 mRNA 억제제; (f) 탈메틸화제; 및 (g) 포스포디에스테라제 대체 인자, 바람직하게는 펩타이드, 펩타이드모사체, 소 분자, 항체 또는 압타머로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 자극성 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "PDE9A의 활성을 직접 자극하거나 조절하는 화합물"은 PDE9A와의 직접적인 상호작용에 의해 cGMP를 저하시키기 위해 PDE9A의 활성을 증가시킬 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 화합물은 PDE9A의 촉매 활성에 양성 영향을 갖는 PDE9A의 특정의 직접적인 상호작용인자(interactor)일 수 있다. 이러한 화합물은 바람직하게는 PDE9A의 촉매 활성의 알로스테릭 효능제, 예를 들면, 후천형질 알로스테릭 조절인자일 수 있다. PDE9A의 바람직한 알로스테릭 효능제는 cGMP 또는 cGMP 유사체이다. 본 발명에 의해 예상되는 다른 직접적인 자극 화합물은 이온, 바람직하게는 Ca 2+, Mg 2+와 같은 1가- 및 2가 양이온이다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물"은 PDE9A의 직접적인 상호인자와의 상호작용에 의해("간접적인 상호작용인자") 또는 PDE9A와의 상호작용을 포함하지 않은 간접적인 작업 경로를 통해 PDE9A의 활성을 증가시켜 cGMP를 저하시킬 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 화합물은 PDE9A의 상호작용인자의 어떠한 직접적인 상호작용인자일 수 있다. PDE9A의 상호작용인자의 직접적인 상호작용인자에 의해 전달된 효과는, PDE9A의 상호작용인자 자체가 PDE9A의 활성에 양성 효과를 가지는 경우 양성일 수 있거나, 또는 PDE9A의 상호작용인자가 PDE9A의 활성에 음성 효과를 가지는 경우, 음성일 수 있다. 통상적으로 양성으로 작용하는 간접적인 상호작용인자는 직접적인 상호작용인자의 효능제 효과를 자극할 수 있는데, 예를 들면, cGMP 생산 등을 상승시킴으로써 PDE9A에 의해 부여되지 않은 cGMP 저하 공정을 억제하여 cGMP 또는 이의 유사체와 같은 알로스테릭 작용 화합물의 농도의 증가를 유발할 수 있다.
또한, 이러한 양성적으로 작용하는 간접적인 인티그레이터(integrator)는 직접적으로 결합하는 단백질의 결합 거동의 변형을 유발하여 증가된 PDE9A 활성을 가져올 수 있다. 통상적으로 음성적으로 작업하는 간접적인 상호작용인자는 PDE9A의 억제제에서 억제 효과를 가질 수 있다. 이러한 상호작용인자의 예는 효소 활성 분해 PDE9A 억제제, 또는 PDE9A 억제제에 결합하여 켄칭시킬 수 있는 단백질이다. 또는, 이러한 상호작용인자는 PDE9A의 분해를 가져오는 활성을 억제할 수 있는, 예를 들면, 프로테이나제 억제제일 수 있다. 추가의 예 및 이들의 보충은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
또한, PDE9A 활성의 간접적인 자극은 내인성 PDE9A 유전자의 발현을 활성화시키거나, 보호하거나 지속시키는 화합물에 의해 전달될 수 있다. 이러한 화합물의 예는 PDE9A 특이적인 전사 인자, PDE9A 특이적인 mRNA 안정화 활성 또는 PDE9A 스플라이스 인자이다. 추가의 예 및 이들의 보충은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
"PDE9A 단백질"은 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 단백질일 수 있다. 특히, 이는 사람 포스포디에스테라제 9A의 스플라이스 변이체 1 내지 20에 의해 암호화된 단백질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 이는 진뱅크 수탁번호: NM_002606(버젼 NM_002606.2, 2009년 3월 9일자의 GI:48762716), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001567(버젼 NM_001001567.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762717), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001568(버젼 NM_001001568.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762719), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001569(버젼 NM_001001569.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762721), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001570(버젼 NM_001001570.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762723), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001571(버젼 NM_001001571.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762725), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001572(버젼 NM_001001572.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762727), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001573(버젼 NM_001001573.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762729), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001574(버젼 NM_001001574.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762731), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001575(버젼 NM_001001575.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762733), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001576(버젼 NM_001001576.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762735), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001577(버젼 NM_001001577.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762737), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001578(버젼 NM_001001578.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762739), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001579(버젼 NM_001001579.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762741), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001580(버젼 NM_001001580.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762743), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001581(버젼 NM_001001581.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762745), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001582(버젼 NM_001001582.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762747), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001583(버젼 NM_001001583.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762749), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001584(버젼 NM_001001584.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762751) 또는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001585(버젼 NM_001001585.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762753)로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있고, 심지어 보다 바람직하게는 이는 서열 번호 21 내지 40 중 어느 것에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다.
이와 관련하여 사용된 "PDE9A 단백질"은 서열 번호 21 내지 40번에 제시된 바와 같은 특정의 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 및 서열 번호 1 내지 20에 제시된 서열 중 어느 것과 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. PDE9A의 동종 변이체, 특히 상기 언급된 것들은 바람직하게는 PDE9A 기능성을 가지는데, 즉, cGMP를 저하시킬 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, PDE9A의 동종 변이체는 추가로 세포내에서 또는 조직 유형내에서 PDE9A와 유사하거나 동일한 국재화 패턴을 가질 수 있다.
추가의 바람직한 양태에서, PDE9A 및 PDE9A의 동종 변이체 사이의 영역 또는 상동성은 단백질의 C-말단 부분으로 국한될 수 있다. 예를 들어, 동종 변이체는 PDE9A내에 존재하는 N-말단 도메인 및 상기 본원에 나타낸 바와 같은 PDE9A에 대해 상동성 정도를 갖는 나머지 단백질을 포함할 수 있다. 동종 변이체의 N-말단 일부는 PDE9A로부터 기원한 아미노산 1 내지 120번, 1 내지 110번, 1 내지 100번, 1 내지 90번, 1 내지 80번, 1 내지 70, 1 내지 60번, 1 내지 50번, 1 내지 40번, 1 내지 30번, 1 내지 20번 또는 1 내지 10번을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "PDE9A의 생물학적 활성 등가물"는 PDE9A 기능의 대부분 또는 모두를 수행할 수 있는 PDE9A 단백질을 말한다. 바람직하게는, 이는 cGMP를 저하시킬 수 있는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 양태에서, PDE9A의 생물학적 활성 등가물은 추가로 또는 대안으로 세포내 또는 조직 유형내에서 PDE9A와 유사하거나 동일한 국재화 패턴을 가진다. PDE9A의 생물학적 활성 등가물은 또한 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 PDE9A 또는 PDE9A의 생물학적 활성 등가물은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 방법으로도 재조합적으로 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 PDE9A 또는 PDE9A의 생물학적 활성 등가물의 생산을 위한 방법을 포함한다.
따라서, 본 발명은 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 또는 PDE9A의 생물학적 활성 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의해 PDE9A 또는 PDE9A의 생물학적 활성 등가물의 생산을 고려한다.
적합한 벡터는 예를 들면, 파아지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 적격성 또는 복제 결핍성일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 적격성 숙주 세포에서만 발생할 것이다. PDE9A 또는 PDE9A의 생물학적 활성 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이트는 숙주내에서 증식용의 선택성 마커를 함유하는 벡터 또는 담체에 연결될 수 있다. 상응하는 폴리뉴클레오타이드 삽입체는 파아지 람다 PL 프로모터, 이. 콜라이 lac, trp, phoA 및 tac 프로모터, SV40 조기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 또는 PSA 프로모터와 같은 적절한 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 발현 작제물은 또한 전사 개시, 종결용 부위, 및 전사된 영역에서, 해독용 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 작제물에 의해 발현된 전사체의 암호화 부위는 바람직하게는 해독되는 폴리펩타이드의 말단에 적절하게 위치한 개시 및 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)에서 해독 개시 코돈을 포함한다.
폴리펩타이드 또는 단백질은 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있거나 달리는 변형될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 또는 단백질은 또한 일부 경우에 숙주-매개된 공정의 결과로서 초기 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드는 아세틸화, 페길화, 헤실화, 포르밀화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 특이적인 화학 분해, 단백분해적 분해, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 또는 하필레이션(hapylation), 즉 글리신이 풍부한 동종 아미노산 중합체(HAP)와의 융합 등에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적합한 기술에 의해 수행할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 변이체는 하나 이상의 비-전통적인 아미노산을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 PDE9A 또는 PDE9A의 생물학적 활성 등가물은 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들면, 펩타이드 합성기를 사용함으로써 화학적으로 합성할 수 있다.
상기 본원에 정의된 바와 같은 자극성 약제학적 조성물에 포함된 "PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산"은 발현가능한 PDE9A 유전자를 포함하는 특정의 적합한 담체 성분을 말한다. 바람직하게는, 이러한 담체 성분은 진뱅크 수탁 번호: NM_002606(버젼 NM_002606.2, 2009년 3월 9일자의 GI:48762716), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001567(버젼 NM_001001567.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762717), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001568(버젼 NM_001001568.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762719), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001569(버젼 NM_001001569.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762721), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001570(버젼 NM_001001570.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762723), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001571(버젼 NM_001001571.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762725), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001572(버젼 NM_001001572.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762727), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001573(버젼 NM_001001573.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762729), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001574(버젼 NM_001001574.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762731), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001575(버젼 NM_001001575.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762733), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001576(버젼 NM_001001576.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762735), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001577(버젼 NM_001001577.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762737), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001578(버젼 NM_001001578.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762739), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001579(버젼 NM_001001579.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762741), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001580(버젼 NM_001001580.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762743), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001581(버젼 NM_001001581.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762745), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001582(버젼 NM_001001582.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762747), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001583(버젼 NM_001001583.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762749), 진뱅크 수탁 번호: NM_001001584(버젼 NM_001001584.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762751) 또는 진뱅크 수탁 번호: NM_001001585(버젼 NM_001001585.1, 2009년 3월 9일자의 GI:48762753)로 정의된 서열, 보다 바람직하게는 서열 번호 1 내지 20에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 담체 성분은 또한 PDE9A에 대해 고도의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 서열 번호 1 내지 20에 제시된 바와 같은 서열 중의 어느 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열 또는, 서열 번호 21 내지 40에 제시된 바와 같은 서열 중의 어느 하나에 대해 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 담체는 PDE9A의 게놈 서열, 바람직하게는 서열 번호 44에 상응하는 진뱅크 수탁 번호: AB017602(버젼 AB017602.1, 2009년 3월 24일의 GI:6681700)로 정의된 서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 담체는 서열 번호 44로 정의된 PDE9A의 게노 서열을 포함할 수 있다.
더욱이, 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A의 생물학적 활성 등가물은 본 발명의 담체에 포함될 수 있다.
PDE9A를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 사람 세포에서 증식용의 선택가능한 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 삽입체는 PSA 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산은 살아있는 치료제를 통해 제공될 수 있다. 용어 "살아있는 치료제"는, 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 또는 PDE9A의 생물학적 활성 등가물이 특정의 적합한 살아있는 담체에서 발현됨을 의미한다. 따라서, 본 발명은 살아있는 세포내에서 발현에 적합한 상응하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 적절한 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포내에서 재조합 기술에 의한 폴리펩타이드의 생산에 관한 것이다.
용어 "생 담체"는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 적절한 살아있는 숙주 세포 또는 바이러스에 관한 것이다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 에스케리키아 콜라이 또는 락토바실러스와 같은 세균 세포, 효모 세포, 원생동물과 같은 진균 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 이 용어는 약독화된 세균, 약독화된 진균 세포 또는 약독화된 원생동물에 관한 것이다. 적절한 바이러스의 대표적인 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 그룹의 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 그룹의 약독화된 바이러스를 포함한다. 바람직한 양태에서, 생균성 세균 세포, 특히, 생균성 에스케리키아 콜라이 또는 락토바실러스 세포를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 에스케리키아 콜라이 Nissle 1973 및 심지어 보다 바람직하게는 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 또는 락토바실러스 지애(Lactobacillus zeae) 393의 세포를 사용할 수 있다.
상기 본원에 정의된 바와 같은 자극성 약제학적 조성물에 포함된 "PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제"는 PDE9A miRNA 또는 마이크로RNA 분자에 상보성인 핵산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 말한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "상보성"은 핵산이 miRNA 분자와 비교하여 어떠한 염기 미스매치 및/또는 추가의 또는 결실된 뉴클레오타이드를 함유하는 어떠한 미스매치, 및 치환이 없는 miRNA 억제제 핵산(센스 분자) 및 miRNA(안티센스 분자) 사이의 완전한 상보성을 말한다. 다른 양태에서, 2개의 분자는 하나 이상의 염기 미스매치를 포함하거나 이들의 뉴클레오타이드의 총 수(첨가 또는 결실에 기인하여)에 있어 상이하다. 추가의 양태에서, "상보성" miRNA 억제제 핵산 분자는 miRNA 분자내 포함된 서열과 완전한 상보성을 나타내는 적어도 10개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함한다.
통상적으로, miRNA 억제제 핵산 분자는 천연적으로 존재하는 DNA- 또는 RNA 분자 또는 이들의 서열내에 동일한 유형 또는 하나 이상의 상이한 유형일 수 있는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 합성 핵산 분자이다.
예를 들면, 본 발명에 의해, 이러한 miRNA 억제제 핵산 분자는 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드 골격 단위 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오타이드 골격 단위를 포함한다. 또한, miRNA 억제제 핵산 분자는 배양 배지에서 뉴클레아제 분해를 방지하고, 중요하게는, 또한 RNA-유도된 사일런싱 복합체 뉴클레아제에 의한 엔도뉴클레오라이틱 분해를 방지하여 miRNA의 비가역적인 억제를 초래하는, 2'-O-메틸 그룹 또는 2'-O-메톡시에틸 그룹내로 RNA 골격의 하나 이상의 변형(또한 "2'-O-메틸화"로 언급됨)을 함유할 수 있다. 2'-O-메틸화와 기능적으로 동등한 다른 가능한 변형은 상기 본원에 정의된 바와 같은, 하나 이상의 LNA 뉴클레오타이드 단량체를 함유하는 핵산 유사체를 나타내는 잠금 핵산(LNA)을 포함한다.
본 발명과 관련하여 사용될 miRNA 발현의 다른 부류의 사일런서(silencer)는 콜레스테롤에 접합된 단일쇄 RNA 분자를 나타내는, "안타고미르(antagomir)"로 명명된 화학적으로 가공된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 당해 분자는 19 내지 25개 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 당해 분자는 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 당해 분자는 23개의 뉴클레오타이드를 포함한다(추가의 세부사항은 문헌: Krutzfeldt et al., 2005, Nature, 438: 685-689로부터 기원할 수 있다).
본 발명의 다른 양태에서, 상기 본원에 정의된 바와 같은 miRNA 억제제는 조직 또는 세포내로 도입될 발현 벡터 형태로 제공될 수 있다. 달리는, 이러한 벡터는 또한 상기 본원에 정의된 바와 같이 생 치료제내로 도입될 수 있다.
전형적으로, RNA는 형질감염 또는 일시적인 발현 벡터 또는 담체의 형태로 제공된 제공된 이식유전자(transgene)로부터 생산될 수 있다. 예를 들어, 경쟁적 miRNA 억제제는 하나 이상, 바람직하게는 목적한 마이크로RNA에 대한 다중의 탠덤(tandem) 결합 부위를 함유하는, 강력한 프로모터로부터 발현된 전사체로서 제공될 수 있다. 문헌(참조: Ebert et al., 2007, Nat. Methods, 4: 721-726)에 기술된 바와 같은 "마이크로RNA 스폰지(microRNA sponge)"는 당해 기술의 예시적인, 비-제한적인 예이다.
상기 본원에 정의된 바와 같은 자극성 약제학적 조성물에 포함된 "탈메틸화제"는 크로마틴 구조, 바람직하게는 프로모터 영역, 보다 바람직하게는 PDE9A 프로모터를 탈메틸화할 수 있는 제제를 말한다. 본 발명과 관련하여 사용될 탈메틸화제의 예는 5-아자-2'-데옥시사이티딘 및 5-아자사이티딘이며, 이들은 DNA 메틸화를 포함하는 구조적 크로마틴 변화에 의해 부적절하게 사일런싱된 유전자를 재가동시키고 이들 변화를 역전시킴으로써, 근본적인 세포 경로를 회복시킬 수 있다. 이는 전형적으로 유전자 재-발현 및 형질전환된 상태의 일부 측면의 회복을 초래한다. 5-아자사이티딘 및 5-아자-2'-데옥시사이티딘은 전형적으로 DNA내 5-아자-2'-데옥시사이티딘 잔기와 효소 사이의 안정한 복합체 형성을 통해 DNA 사이토신 C5-메틸트랜스퍼라제를 불활성화시킴으로써, 메틸트랜스퍼라제 효소에 결합되는 경우 안정한 전이 상태 중간체를 모사한다.
자체로 또는 5-아자-2'-데옥시사이티딘 및/또는 5-아자사이티딘과 조합된, 본 발명에 따른 자극성 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 추가의 제제는 트리코스타틴 A(TSA)이다.
상기 본원에 정의된 바와 같은 자극성 약제학적 조성물에 포함된 "포스포디에스테라제 대체 인자"는 포스포디에스테라제, 특히, PDE9A와, 상호작용하는 파트너 또는 상호작용인자(interactor)의 상호작용을 방해하거나 교란할 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 공정은 궁극적으로 PDE, 특히 PDE9A와 앞서의 것 이외의 상이한 상호작용 파트너의 연합 및, 결과적으로, PDE의 재분포를 이끌 수 있다. 이러한 새로운 상호작용 파트너는 PDE, 특히, PDE9A를 봉쇄할 수 있고, 상응하게 세포 행위를 변형, 예를 들면, 수용체 결합 또는 다른 하부 활성에 있어 영향을 유발할 수 있다. 이러한 대체 반응에 포함될 수 있고/있거나 PDE, 특히 PDE9A를 봉쇄할 수 있는 단백질 파트너의 예는 AKAP와 같은 앵커링 단백질(anchoring protein), DISC1, 베타-아레스틴 또는 RACK1과 같은 스캐폴드 단백질(scaffold protein), XAP2/AIP/ARA9와 같은 조절 단백질, PKA-R 소단위 또는 EPAC와 같은 단백질, 또는 베타 1-아드레노셉터와 같은 수용체, 및 ERK와 같은 효소이다.
바람직한 포스포디에스테라제 대체 인자는 펩타이드, 펩타이드모사체, 소 분자, 항체 및 압타머이다.
포스포디에스테라제 대체 인자와 관련하여 "펩타이드"는 포스포디에스테라제 분자, 특히 PDE9A내에 존재하거나 이를 나타내는 아미노산의 길이, 또는, 상기 본원에 정의된 바와 같은 상호작용하거나 봉쇄하는 단백질을 말한다. 펩타이드내에 포함된 아미노산의 길이는 5 내지 100개 아미노산, 바람직하게는 10 내지 50개 아미노산, 보다 바람직하게는 20 내지 30개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 당해 길이는 전체적으로 PDE 또는 상호작용인자 단백질 또는 이의 부분과 동일할 수 있거나 서열 변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 서열은 모든 위치의 25%까지 변형된 아미노산 잔기, 바람직하게는 분자의 구조적 특성 또는 결합 특성을 변화시키지 않는 변형을 포함할 수 있다. 펩타이드내 존재하는 아미노산 서열은 달리는 PDE 또는 상호작용인자 단백질의 공간적 도메인을 나타낼 수 있으며 상응하게 분자의 주요 서열내 인접하지 않은 아미노산 길이의 근접부위(juxtaposition)를 포함한다.
포스포디에스테라제 대체 인자와 관련하여 "펩타이드모사체"는 펩타이드를 모사하도록 설계된 소 단백질-유사 쇄를 말한다. 이러한 펩타이드모사체는 분자의 특성을 변경하기 위해, 존재하는 펩타이드, 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드의 변형으로부터 발생할 수 있다. 펩타이드모사체는 분자의 안정성 또는 결합능을 변화시키는 변형으로부터 발생할 수 있다. 이들 변형은 통상적으로 천연적으로 존재하지 않을 펩타이드로의 변화를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 펩타이드모사체는 변경된 펩타이드 골격을 가질 수 있거나 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 펩타이드모사체는 상기 본원에 정의된 바와 같은, 포스포디에스테라제 분자, 특히, PDE9A, 또는 상호작용하거나 봉쇄하는 단백질을 나타낼 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 펩타이드모사체는 PDE, 특히 PDE9A 및 이의 상호작용인자 사이의 상호작용을 차단할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 펩타이드모사체는 PDE, 특히 PDE9A, 및 이의 상호작용인자 사이의 상호작용을 향상시킬 수 있다.
펩타이드모사체를 제조하는 방법과 기술 및 펩타이드모사체를 시험하기 위한 분석은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
포스포디에스테라제 대체 인자와 관련하여 "소분자"는 바람직하게는 생물학적 활성, 즉, 생물분자이지만, 바람직하게는 중합체가 아닌 소 유기 화합물을 말한다. 이러한 유기 화합물은 특정의 적합한 형태 또는 화학적 특성을 가질 수 있다. 화합물은 천연 화합물, 예를 들면, 새로이 설계되어 생성된, 2급 대사물질 또는 인공 화합물일 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 소분자는 PDE, 특히 PDE9A, 및 이의 상호작용인자 사이의 상호작용을 차단할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 소 분자는 PDE, 특히 PDE9A, 및 이의 상호작용인자 사이의 상호작용을 향상시킬 수 있다. 소 분자의 확인 및 제조 방법 및 기술, 및 소 분자의 시험을 위한 분석은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
포스포디에스테라제 대체 인자와 관련하여 "항체" 또는 "압타머"는 PDE, 특히 PDE9A, 및 하나 이상의 이의 상호작용인자 사이의 상호작용을 방해하거나 교란하는 능력을 가진, 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 특이적인 항체 또는 항체 변이체 또는 단편, 또는 PDE9A 특이적인 압타머를 말한다. 달리는, 당해 용어는 또한 PDE, 특히 PDE9A, 및 하나 이상의 이의 상호작용인자 사이의 상호작용을 방해하거나 교란하는 유사한 능력을 가진, 상기 본원에 기술된 바와 같은 특정의 하나 이상의 PDE9A 상호작용인자에 결합하는 항체 또는 압타머를 말할 수 있다. 항체 또는 압타머의 생산 또는 시험 방법은 상기 본원에 기술되어 있고/있거나 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명의 양태에서, 자극성 약제학적 조성물은 또한 암 세포에 대해 활성인 추가의 화합물, 예를 들면, 세포독성 화합물 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 화학치료제 또는 방사선치료 화합물을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) PDE9A의 활성을 직접적으로 억제하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 길항제; (b) PDE9A의 활성을 간접적으로 억제하는 화합물; (c) PDE9A 단백질의 우성 음성 형태 또는 이의 생물학적 활성 등가물; (d) PDE9A의 우성 음성 형태를 암호화하고 발현하는 핵산; (e) PDE9A에 대해 특이적인 miRNA; (f) PDE9A 안티센스 분자; (g) PDE9A에 대해 특이적인 siRNA; (h) PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머; (i) PDE9A 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 소 분자 또는 펩타이드모사체; 및 (j) PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 및/또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 억제성 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 것으로서 "PDE9A의 활성을 직접적으로 억제하는 화합물"은 PDE9A의 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 화합물은 PDE9A의 촉매 활성에 음성적 영향을 갖는, PDE9A의 특정의 직접적인 상호작용인자일 수 있다. 이러한 화합물은 바람직하게는 PDE9A의 촉매 활성의 길항제일 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 "PDE9A의 활성을 간접적으로 억제하는 화합물"은 PDE9A의 직접적인 상호작용인자와의 상호작용에 의해 PDE9A의 활성을 감소시킬 수 있는 화합물("간접적인 상호작용인자") 또는 PDE9A와의 상호작용을 포함하지 않는 간접적인 작업 경로를 통해 PDE9A의 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 화합물은 PDE9A의 상호작용인자의 특정의 직접적인 상호작용인자일 수 있다. PDE9A의 상호작용인자의 직접적인 상호작용인자에 의해 전달된 효과는, 상호작용인자 자체가 PDE9A의 활성에 음성 효과를 가지는 경우 음성일 수 있거나, 상호작용인자 PDE9A가 PDE9A의 활성에 양성 효과를 가지는 경우 양성일 수 있다.
포스포디에스테라제의 억제제, 특히, 본원에 언급된 PDE9 동형의 억제제가 특히 바람직하다. 본 발명의 억제성 약제학적 조성물에 포함될 단독 또는 특정의 조합일 수 있는 적합한 포스포디에스테라제 억제제의 예에는 BAY 73-669, SCH51866 및 자프리나스트가 있다. 적합한 억제제의 추가의 예는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 또한 본 발명에 의해 예측된다. 억제제의 구조, 효능, 적합한 제형 등의 세부사항은 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고/있거나 적합한 교재 또는 공보, 예를 들면, Joseph A. Beavo, Sharron H. Francis, Miles D Houslay, Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase in Health and Disease, CRC Press 2006으로부터 기원할 수 있다.
상기 정의한 바와 같은 억제제 화합물은 본원에 제공된 세부사항에 따라 제형화하거나, 투약되거나, 사용되거나 투여될 수 있다. 특히, 억제제의 다음 표는 필수적인 IC50 농도의 측정 및 제조업자를 위해 사용될 수 있다:
억제제의 표(실시예):
Figure 112011098449741-pct00001

달리는, 이러한 음성적으로 작업하는 간접적인 인티그레이터(integrator)는 단백질을 직접적으로 결합하는 결합 행위의 변형을 유발하여, PDE9A의 감소된 활성을 유발할 수 있다. 통상적으로 음성적으로 작업하는 간접적인 상호작용인자는 PDE9A의 활성화제에 있어 억제 효과를 가질 수 있다. 이러한 상호작용인자의 예는 PDE9A의 활성인자를 분해하는 효소 활성, 또는 PDE9A의 활성인자에 결합하여 이를 켄칭시킬 수 있는 단백질이다. 달리는, 이러한 상호작용인자는 PDE9A의 분해를 초래하는 활성, 예를 들면, 프로테이나제를 양성적으로 조절할 수 있다. 추가의 예 및 이들의 보충사항은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
달리는, PDE9A의 활성의 간접적인 억제는 PDE9A의 내인성 유전자(들)의 발현을 탈활성화시키거나, 방해하거나 차단하는 화합물에 의해 전달될 수 있다. 이러한 화합물의 예는 전사 인자의 결합을 억제하고/하거나 저지하는 PDE9A의 전사 인자의 특이적인 상호작용인자 및 PDE9A 유전자의 프로모터에 대한 기본적인 전사 기구, PDE9A의 mRNA(들)의 특이적인 탈안정화 활성 또는 PDE9A에 대해 특이적인 스플라이싱 인자를 억제하는 인자이다. 추가의 예 및 이들의 보충은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 것으로서 "종양 마커의 단백질의 우성 음성 형태를 암호화하고 발현하는 핵산"은 천연적으로 존재하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 돌연변이체 형태를 발현할 수 있는 특정의 핵산을 말한다. 따라서, 당해 용어는 안티모르픽(antimorphic) 변형을 포함하는, 특히 PDE9A에 역 영향을 미치는, PDE9A의 변이체(들)을 암호화하는 핵산을 말하다. 통상적으로 이러한 행위는, 안티모르픽 변이체가 PDE9A와 상호작용하지만 이의 기능의 일부 양태을 차단하는 경우 발생할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 변이체는 PDE9A의 특이적인 도메인, 예를 들면, 하나 이상의 단백질-단백질 상호작용 또는 이합체화 도메인, 복합체 조립 도메인, 하나 이상의 막-관련 도메인 등을 포함하거나 결여할 수 있다.
용어 "PDE9A에 대해 특이적인 miRNA"는 PDE9A의 유전자 발현을 조절하는, 통상적으로 길이가 18 내지 27개 뉴클레오타이드인 짧은 단일쇄 RNA 분자를 말한다. miRNA는 이의 DNA로부터의 유전자에 의해 암호화되며, 이들은 전사되지만 단백질로 해독되지 않는다. 천연 상태에서, miRNA는 우선 주요 전사체 또는 캡(cap)과 폴리-A 테일이 있는 프리(pri)-miRNA로서 전사되며 세포 핵내에서 프레(pre)-miRNA로 공지된 짧은, 70개 뉴클레오타이드 스템-루프(stem-loop) 구조로 프로세싱된다. 당해 프로세싱은 동물내에서 뉴클레아제 드로샤(Drosha) 및 이중쇄 RNA 결합 단백질 파샤(Pasha)로 이루어진, 마이크로프로세서 복합체로 공지된 단백질 복합체에 의해 수행된다. 이후에, 이들 프레-miRNA는 세포질에서, RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)의 형성을 또한 개시하는, 엔도뉴클레아제 다이서(Dicer)와의 상호작용에 의해 성숙한 miRNA로 프로세싱된다. 활성 RISC 복합체로 통합된 후, miRNA는 이들의 상보성 mRNA 분자와 염기 쌍을 이룰 수 있으며 해독을 억제하거나 RISC 복합체의 촉매적으로 활성인 구성원, 예를 들면, 아르고너트(argonaute) 단백질에 의해 mRNA 분해를 유도할 수 있다. 성숙한 miRNA 분자는 통상적으로 본 발명의 발현 생성물에 상응하는 mRNA 분자에 적어도 부분적으로 상보성이며, 유전자 발현을 완전히 또는 부분적으로 하향-조절한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 miRNA는 이들의 표적 서열에 대해 100% 상보성일 수 있다. 달리는, 이들은 예를 들면, 말단 잔기 또는 분자의 중심 부분에서 1, 2 또는 3개의 미스매치를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 miRNA 분자는, 길이가 약 18 내지 27개 뉴클레오타이드, 예를 들면, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27개 뉴클레오타이드일 수 있다. 21 내지 23량체가 바람직하다.
100% 상보성인 miRNA가 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산의 분해에 사용될 수 있는 반면, 100% 미만의 상보성을 나타내는 miRNA는 바람직하게는 해독 공정을 차단하는데 사용될 수 있다.
용어 "PDE9A 안티센스 분자"는 서열 번호 1 또는 6에 포함된 서열 또는 이의 상보성 쇄에 상응하는 핵산을 말한다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 분자는 본 발명에 따른 PDE9A 발현 생성물 중 적어도 일부에 대해 상보성인 서열을 포함한다. PDE9A의 암호화 영역 서열에 대해 상보성인 안티센스 분자가 사용될 수 있는 반면, 전사되고 해독되지 않은 영역에 대해 상보성인 것들이 바람직하다.
일반적으로, 안티센스 기술을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해서, 또는 삼중-나선 형성을 통해서 유전자 발현을 조절, 예를 들면, 감소시키거나 종결시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 안티센스 분자는 내부적으로 유기체에 의해, 예를 들면, 외인성 서열로부터 전사에 의해 세포내적으로 생성될 수 있다. 벡터 또는 이의 부분은 전사되어 본 발명의 안티센스 핵산을 생산할 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명의 안티센스 핵산을 암호화하는 서열을 함유할 수 있다. 이러한 벡터는, 전사되어 목적한 안티센스 분자를 생산할 수 있는 한, 에피소옴으로 유지되거나 염색체적으로 통합될 수 있다. 상응하는 벡터는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 재조합체 DNA 기술 방법에 의해 작제될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 척추동물 세포내에서 복제 및 발현에 사용된, 당해 분야에 공지된 다른 것들, 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 벡터일 수 있다.
다른 양태에서, 안티센스 분자는 독립적으로 투여될 수 있다. 예로서, 본 발명에 따른 PDE9A 핵산의 5' 암호화 부분을 사용하여 길이가 약 6 내지 50개 뉴클레오타이드인 안티센스 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는, 길이가 적어도 10개 뉴클레오타이드, 적어도 17개 뉴클레오타이드, 적어도 25개 뉴클레오타이드 또는 적어도 50개 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 안티센스 핵산은 통상적으로 목적한 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 대해 상보성인 서열을 포함한다. 그러나, 비록 바람직하다고 해도, 절대적인 상보성이 필요하지는 않다. 본원에 언급된 것으로서 "RNA 전사체의 적어도 하나의 부분에 대해 상보성인" 서열은, 이중쇄 안티센스 핵산의 경우에 안정한 듀플렉스(duplex) 트리플렉스 (triplex) 형성을 형성하는, RNA와 하이브리드화할 수 있기에 충분한 상보성을 가진 서열을 의미한다. 하이브리드화하는 능력은 상보성 정도 및 안티센스 핵산의 길이 둘다에 의존할 것이다. 일반적으로, 하이브리드화 핵산이 길수록, 본 발명의 RNA 서열과의 염기 미스매치가 더 크며 이는 안정한 듀플렉스 또는 트리플렉스를 함유하고 여전히 형성할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 표준 과정을 사용함으로써 미스매치의 허용되는 정도를 추정하여 하이브리드화된 복합체의 융점을 측정할 수 있다.
바람직하게는, 전사체의 5' 말단에 대해 상보성인 안티센스 분자, 예를 들면, AUG 개시 코돈까지 및 이를 포함하는 5' 해독되지 않은 서열을 해독의 억제를 위해 사용할 수 있다. 추가의 바람직한 양태에서, mRNA의 3' 해독되지 않은 서열에 대해 상보성인 서열을 또한 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 분자는 단일쇄 또는 이중쇄의, DNA 또는 RNA 또는 키메라 혼합물 또는 이의 유도체 또는 변형된 버젼일 수 있다. 안티센스 분자, 바람직하게는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 특정의 추가의 안티센스 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 siRNA 분자는 염기 잔기, 당 잔기, 또는 포스페이트 골격에서 변형되어 예를 들면, 분자의 안정성, 하이브리드화 등을 개선시킬 수 있다. 분자는 펩타이드(예를 들면, 생체내에서 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위한), 또는 세포막을 횡단하는 수송을 촉진시키는 제제 또는 혈액-뇌 장벽 하이브리드화 트리거된 분해제 또는 인터컬레이팅 제제와 같은 다른 첨부된 그룹을 포함할 수 있다. 따라서, 분자는 다른 분자, 예를 들면, 펩타이드, 하이브리드화 트리거된 교차-연결제, 수송제, 하이브리드화-트리거된 분해제 등에 접합될 수 있다.
안티센스 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA- 또는 siRNA 분자는, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이폭산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-카복시메틸-아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸 구아닌, 3-메틸 사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸 구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, 및 2,6-디아미노푸린을 포함하는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 변형된 염기 잔기를 포함할 수 있다. 분자는 또한 아라비노즈, 2-플루오로아라비노즈, 크실룰로즈 및 헥소즈를 포함하나, 이에 한정되지 않는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 변형된 당 잔기를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 분자는 달리는 또는 추가로 적어도 하나의 변형된 포스페이트 골격, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 포름아세탈 또는 이의 유사체를 포함한다.
다른 양태에서, 안티센스 분자, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 알파-아노머성 올리고뉴클레오타이드, 즉, 쇄가 서로 병행하는 상보성 RNA와 특이적인 이중쇄 하이브리드를 형성하는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
용어 "PDE9A에 대해 특이적인 siRNA"는 표 1에 따른 종양 마커의 유전자 발현을 음성적으로 조절하기 위해 RNA 방해(RNAi) 경로를 유도하는 특수 유형의 안티센스-분자, 즉, 소 억제성 RNA 듀플렉스를 말한다. 이들 siRNA 분자는 길이가 다양할 수 있으며 길이가 약 18 내지 28개 뉴클레오타이드일 수 있으며, 예를 들면, 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 당해 분자는, 길이가 21, 22 또는 23개 뉴클레오타이드이다. 본 발명에 따른 siRNA 분자는 이들의 표적 mRNA에 대한, 바람직하게는 안티센스 쇄내에서 다양한 정도의 상보성을 함유할 수 있다. siRNA는 센스 쇄 및/또는 안티센스 쇄의 5' 또는 3' 말단에서 쌍을 이루지 않은 오우버행(overhang) 염기를 가질 수 있다. 용어 "siRNA"는 2개의 독립된 쇄, 및 듀플렉스 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일쇄의 듀플렉스를 포함한다. 바람직하게는, siRNA는 이중쇄일 수 있으며, 여기서, 이중쇄 siRNA 분자는 제1 및 제2 쇄를 포함하고, siRNA 분자의 각각의 쇄는, 길이가 약 18 내지 약 23개 뉴클레오타이드이고, siRNA 분자의 제1 쇄는 RNA 방해를 통해 표적 RNA에 대해 충분한 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 siRNA 분자의 제2 쇄는 제1 쇄에 대해 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
제공된 표적 핵산에 대해 지시된 적합한 siRNA를 설계하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "발현 생성물에 대해 특이적이거나 PDE9A의 단백질에 대해 특이적인 압타머"는 PDE9A 단백질(들)과 상호작용할 수 있고 이에 특이적으로 결합할 수 있는 짧은 펩타이드(들)을 말한다. 펩타이드 압타머(들)은 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질(들) 또는 폴리펩타이드(들)에 특이적으로 결합할 수 있다. 펩타이드 압타머(들)은 또한 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열(들)에 의해 암호화된 아미노산 서열(들)을 포함하는 단백질(들) 또는 폴리펩타이드(들), 또는 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 통상적으로, 펩타이드 압타머(들)은 예를 들면, 10 내지 20개 아미노산을 포함하는 가변 펩타이드 루프(loop)이다. 본 발명과 관련하여, 펩타이드 압타머(들)은 바람직하게는 스캐폴드 구조에 대해 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착될 수 있다. 스캐폴드 구조는 우수한 가용성 특성을 갖는 특정 분자, 바람직하게는 단백질일 수 있다. 적합한 스캐폴드 분자는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 바람직한 스캐폴드 분자는 세균 단백질 티오레독신-A이다. 압타머 펩타이드 루프는 바람직하게는 스캐폴드 분자의 환원되는 활성 부위내에 삽입될 수 있다. 달리는, 스타필로코커스 단백질 A 및 이의 도메인 및 이들 도메인의 유도체, 예를 들면, 단백질 Z 또는 리포칼린은 본 발명과 관련하여 스캐폴드 구조로서 사용될 수 있다. 펩타이드 압타머는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 적합한 방법에 따라, 예를 들면, 효모 이중 하이브리드 시도를 통해 생성될 수 있다.
바람직한 양태에서, 상기 언급한 펩타이드 압타머는 PDE9A 단백질 또는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호 2에 상응하는 단백질 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있으며 이들/이 단백질(들)의 생물학적 활성 및/또는 효소 활성을, 처리되지 않은 샘플로부터 수득된 대조군 수준과 비교하는 경우, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 적어도 98% 또는 99% 까지 감소시킬 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 "PDE9A 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 소 분자"는 바람직하게는 생물학적 활성, 즉, 생물 분자이지만, 바람직하게는 중합체가 아닌 소 유기 화합물을 말한다. 이러한 유기 화합물은 특정의 적합한 형태 또는 화학적 특성을 가질 수 있다. 화합물은 천연 화합물, 예를 들면, 새로이 설계되어 생성된, 2차 대사물질 또는 인공 화합물일 수 있다. 본 발명의 양태에서, 소 분자는 PDE, 특히 PDE9A, 및 이의 상호작용인자 사이의 상호작용을 차단할 수 있다. 소 분자의 확인 및 제조 방법 및 기술, 및 소 분자의 시험을 위한 분석은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "PDE9A 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드모사체"는 펩타이드를 모사하도록 설계되어 PDE9A 단백질에 결합할 수 있는 소 단백질-유사 쇄를 말한다. 이러한 펩타이드모사체는 존재하는 펩타이드, 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 또는 펩타이드 압타머의 변형으로부터 유발되어, 분자의 특성을 변경시킬 수 있다. 펩타이드모사체는 분자의 안정성 또는 결합능을 변화시키는 변형으로부터 유발될 수 있다. 이러한 변형은 통상적으로 천연적으로 존재하지 않을 펩타이드에 대한 변화를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 펩타이드모사체는 펩타이드 골격을 변경시킬 수 있거나 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 펩타이드모사체는 포스포디에스테라제 분자, 특히 PDE9A, 또는 상호작용하거나 봉쇄하는 단백질을 나타낼 수 있다. 본 발명의 양태에서, 펩타이드모사체는 PDE, 특히 PDE9A 및 이의 상호작용인자 사이의 상호작용을 차단할 수 있다. 펩타이드모사체의 제조 방법 및 기술, 및 펩타이드모사체의 시험을 위한 분석은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 억제성 약제학적 조성물은 또한 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 및/또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 변이체, 예를 들면, 상기 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 항체 변이체를 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 이러한 항체 또는 항체 단편은 PDE9A의 생물학적 활성 및/또는 효소 활성을 억제할 수 있다.
숙련가는 또한 PDE9A에 대해 특이적인 접합된 항체에 의해 악성의, 호르몬-민감성 전립선 암 세포 및 조직을 표적화하여 이들을 파괴하는 가능성을 인지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특수 양태에서, 상기 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편은 치료제 또는 세포독성제에 접합될 수 있다. 용어 "치료제"는 세포, 조직 또는 전체 유기체에 치료학적 효과를 부여할 수 있는 특정 화합물, 약물, 소 분자 또는 약제를 말한다. 이러한 제제의 예는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 용어 "세포독성제"는 세포 또는 조직에 독성 효과를 부여할 수 있는 특정 화합물, 약물, 소 분자를 말한다. 이러한 제제는 예를 들면, 내인성 세포독성 효과인자 시스템, 및 방사선동위원소, 홀로독소(holotoxin), 변형된 독소, 독소의 촉매 소단위 또는 세포의 사멸을 유발하는 정의된 조건하에서 세포내에 또는 세포의 표면상에 일반적으로 존재하지 않는 특정 분자 또는 효소를 활성화시키는 화합물을 포함할 수 있다. 당해 용어는 또한 당해 분야에 공지된 방사선동위원소, 고유의 또는 유도된 내인성 세포독성 효과기 시스템을 결합시키는 추가의 항체(또는 이의 일부를 함유하는 상보체 고정), 티미딘 키나제, 엔도뉴클레아제, RNAse, 알파 독소, 리친, 아브린, 슈도모나스 외독소 A, 디프테리아 독소, 사포린, 모모르딘, 겔로닌, 포크위드 항바이러스 단백질, 알파-사르킨 및 콜레라 독소를 포함한다. 당해 용어는 또한 세포독성 프로드럭(cytotoxic prodrug)을 말한다. "세포독성 프로드럭"은 세포내에 일반적으로 존재하는 효소에 의해 세포독성 화합물로 전환되는 비-독성 화합물을 의미한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 세포독성 프로드럭은 벤조산 머스타드 알킬화제의 글루타밀 유도체, 에토포시드 또는 미토마이신 C의 포스페이트 유도체, 사이토신 아라비노시드, 다우노루비신, 및 독소루비신의 페녹시아세트아미드 유도체를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대해 특이적인 압타머, PDE9A의 활성을 직접 자극하거나 조절하는 화합물, PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제, PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제, 안타고미르(antagomir), PDE9A 특이적인 탈메틸화제, PDE9A 특이적인 포스포디에스테라제 대체 인자, PDE9A 특이적인 펩타이드모사체, 및 PDE9A 특이적인 소 분자 또는 상기 본원에 정의된 바와 같은 약물의 확인을 위한 스크리닝 과정 및 방법을 예측한다. 이러한 스크리닝 과정은 (a) 분비된 단백질 또는 세포 막 상의 폴리펩타이드로서, 또는 세포내 성분으로서 PDE9A를 발현하는 세포를 생산하는 단계, (b) 단계 (a)에서 생산된 폴리펩타이드를 상호작용하는 분자, 예를 들면, PDE9A 단백질, PDE9A의 활성을 직접 자극하거나 조절하는 화합물, PDE9A의 활성을 직접 자극하거나 조절하는 화합물, PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제, PDE9A 특이적인 포스포디에스테라제 대체 인자, PDE9A 특이적인 펩타이드모사체 또는 PDE9A 특이적인 소 분자 또는 약물에 대해 특이적인 압타머를 잠재적으로 함유하는 시험 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (c) PDE9A의 결합 및/또는 활성의 억제 또는 조절을 관측함으로써 상호작용하는 분자를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
달리는, 이러한 스크리닝 과정은 (a) 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 분자, 예를 들면, PDE9A 전사체에 대해 특이적인 압타머, PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제, 안타고미르, PDE9A 특이적인 탈메틸화제, PDE9A 특이적인 포스포디에스테라제 대체 인자, PDE9A 특이적인 펩타이드모사체 또는 PDE9A 특이적인 소분자 또는 약물을 잠재적으로 함유하는 시험 샘플을 전사체로서 PDE9A를 발현하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 단계, (b) 상기 서열의 발현 수준을 검출하는 단계; 및 (c) PDE9A의 결합 또는 발현 수준의 조절 또는 감소를 관측함으로써 상호작용하는 분자를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대해 특이적인 압타머, PDE9A의 활성을 직접적으로 자극하거나 조절하는 화합물, PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제, PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제, 안타고미르, PDE9A 특이적인 탈메틸화제, PDE9A 특이적인 포스포디에스테라제 대체 인자, PDE9A 특이적인 펩타이드모사체, 및 PDE9A 특이적인 소 분자 또는 상기 본원에 기술된 바와 같은 스크리닝 과정 또는 방법에 의해 수득가능하거나 수득된 약물을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방, 특히 전립선 암의 치료를 위한 상기 본원에 정의된 바와 같은 자극성 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 또 다른 양태에서, 본 발명은, 암, 특히 전립선 암의 치료 또는 예방, 바람직하게는 호르몬-내성 전립선 암의 치료용의 자극성 약제학적 조성물의 제조를 위한, (a) PDE9A의 활성을 직접적으로 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제; (b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물; (c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물; (d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산; (e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA; (f) 탈메틸화제; 및/또는 (g) 포스포디에스테라제 대체 인자, 바람직하게는 펩타이드, 펩타이드모사체, 소 분자, 항체 또는 압타머의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) PDE9A의 활성을 직접적으로 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A의 알로스테릭 효능제 효소 활성; (b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물; (c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물; (d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산; (e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA; (f) 탈메틸화제; 및/또는 (g) 포스포디에스테라제 대체 인자, 바람직하게는 펩타이드, 펩타이드모사체, 소 분자, 항체 또는 압타머를 개체, 특히 암을 앓거나 암으로 진행되는 것으로 예측되는 개체에게 투여함을 포함하는, 암, 특히 전립선 암의 치료 또는 예방, 바람직하게는 호르몬-내성 전립선 암의 치료 방법에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에서, 상기 정의한 바와 같은 억제성 약제학적 조성물 또는 상기 정의한 바와 같은 자극성 약제학적 조성물은 PDE9A의 발현 수준에 의존하여 전립선 암의 치료에 사용될 수 있으며, 여기서, 상기 발현 수준은
(a) 샘플 중의 PDE9A의 수준을 측정하는 단계;
(b) 샘플 중의 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계에 따라 측정되고/되거나 모니터링된다. PDE9A의 수준은 상기 본원에 기술된 바와 같은 핵산, 단백질 또는 활성 수준에서 측정될 수 있다. PDE9A 전사체(들) 및/또는 단백질의 양의 측정이 바람직하다. 또한, 샘플내 상기 본원에 정의된 바와 같은 표준 유전자의 수준이 측정될 수 있다. 당해 양태와 관련하여 바람직한 표준 유전자는 상기 본원에 기술된 바와 같은 PDE4D5이다.
용어 "PDE9A의 발현 수준에 의존하여"는, 억제성 약제학적 조성물 또는 자극성 약제학적 조성물의 투여를 위한 선택이, 샘플내 PDE9A의 수준이 측정된 후, 바람직하게는 PDE4D5와 같은 표준 유전자와 비교하여 이루어질 수 있음을 의미한다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 증가되고/되거나 증가하는 수준의 PDE9A의 경우 본 발명에 따른 억제성 약제학적 조성물이 투여되어야 하며, 감소되고/되거나 감소되는 수준의 PDE9A의 경우 본 발명에 따른 자극성 약제학적 조성물이 투여되어야 한다.
이와 관련하여 사용된 것으로서 용어 "증가된"은, 시험 샘플 속의 PDE9A 유전자 발현의 수준이 대조군 샘플내 PDE9A 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상 상승되거나, 대조군 샘플내 PDE9A 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상 상승됨을 의미하거나; 또는 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플내 표준 유전자의 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상 상승되거나, 표준 유전자의 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상 상승되는 경우를 의미한다. 특수 양태에서, 표준 유전자의 발현은 또한 추가의 유전자 또는 마커, 예를 들면, 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 정규화되거나 조절될 수 있다. 바람직한 대조군 샘플 또는 참조 점으로서, 비-암성 대조군, 건강한 조직, 또는 건강한 개체 또는 양성 종양 조직으로부터 기원한 조직 또는 이로부터 기원한 데이터 등을 사용할 수 있다. 달리는 특정의 다른 대조군 샘플 또는 대조군 점을 또한 사용할 수 있다.
용어 "증가하는"은 특정 기간에 걸쳐 증강되는 경향이 있는, 즉 반복된 측정 단계, 예를 들면, 매 4주, 6주, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 12개월, 1.5년, 2년, 2.5년 등 후에 보다 높아지는, 상응하게 측정된 발현 값을 말한다. 따라서, "증가하는" PDE9A 발현 수준은 매 시험 기간내에 0.5 내지 100% 이상까지 상승, 바람직하게는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 등까지 상승될 수 있다. 증가 자체는 흔히 시험 횟수에 의존하며, 따라서, 유의성은, 당해 분야의 숙련가가 인식하는 바와 같이, 조절될 수 있다.
바람직한 양태에서, 증가된 또는 증가하는 PDE9A 수준은 전립선 암 발달의 조기 단계에서, 즉, 호르몬-민감성 전립선 암의 종양 단계까지 측정될 수 있다. 달리는, 조직학적 측정은 전립선 종양의 단계에서 독립된 정보를 제공할 수 있다. 이러한 독립적인 측정에 의존하여 양성 전립선 종양 단계 또는 호르몬-의존성 종양 단계가 진단될 수 있다. 당해 상황에서, 증가되거나 증가하는 PDE9A 수준(비-암성 또는 건강한 대조군 또는 단계와 비교하여)은 본 발명에 따른 억제성 약제학적 조성물의 투여를 개시할 수 있다.
달리는, PSA의 수준을 또한 측정할 수 있다. 2.0 내지 3.0 ng/ml 미만의 낮은 PSA 수준에 직면하는 경우에, 증가되거나 증가하는 수준의 PDE9A는 본 발명에 따른 억제성 약제학적 조성물의 투여를 개시할 수 있다.
이와 관련하여 사용된 것으로서 용어 "감소된"은, 시험 샘플내 PDE9A 유전자 발현의 수준이 대조군 샘플내 PDE9A 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상 감소되거나, 대조군 샘플내 PDE9A 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상 감소되거나; 또는 PDE9A 유전자 발현이 대조군 샘플내 표준 유전자의 발현과 비교하여 예를 들면, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상까지 감소되거나, 표준 유전자의 발현과 비교하여 적어도 0.1배, 적어도 0.2배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상 감소되는 경우를 의미한다. 특수 양태에서, 표준 유전자의 발현은 또한 추가의 유전자 또는 마커, 예를 들면, 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 정규화하거나 조절할 수 있다. 바람직한 대조군 샘플 또는 참조 점으로서, 암성 대조군, 특히 호르몬-민감성 또는 호르몬-의존성 전립선 암 조직 또는 이로부터 기원한 데이터 등을 사용할 수 있다. 달리는, 특정의 다른 대조군 샘플 또는 대조군 점을 또한 사용할 수 있다.
용어 "감소하는"은 특정의 기간에 걸쳐 더 낮아지는 경향이 있는, 즉, 반복된 측정 단계, 예를 들면, 매 4주, 6주, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 12개월, 1.5년, 2년, 2.5년 등 후에 더 낮아지는, 상응하게 측정된 발현 값을 말한다. 따라서, "증가하는" PDE9A 발현 수준은 매 시험 기간내에 0.5 내지 100% 이상까지 상승, 바람직하게는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 등까지 상승될 수 있다. 감소 자체는 흔히 시험 횟수에 의존하며, 따라서, 유의성은, 당해 분야의 숙련가가 인식하고 있는 바와 같이, 조절될 수 있다.
바람직한 양태에서, 감소된 또는 감소하는 PDE9A 수준은, 호르몬-민감성 전립선 암의 종양 단계까지 PDE9A의 증가가 이미 측정된 후 측정될 수 있다. 달리는, 조직학적 측정은 전립선 종양의 단계에서 독립된 정보를 제공할 수 있다. 이러한 독립적인 측정에 의존하여, 호르몬-민감성 종양 단계가 진단될 수 있다. 당해 상황에서, 감소된 또는 감소하는 PDE9A 수준(종양 개시 단계와 비교하여)은 본 발명에 따른 자극성 약제학적 조성물의 투여를 개시할 수 있다.
달리는, PSA의 수준을 또한 측정할 수 있다. 약 20 ng/ml 및/또는 그 이상의 PSA 수준에 직면하는 경우에, 감소된 또는 감소하는 수준의 PDE9A는 본 발명에 따른 자극성 약제학적 조성물의 투여를 개시할 수 있다.
추가의 특이적인 양태에서, 본 발명은 특정 기간, 즉, 반복된 측정 단계, 예를 들면 매 4주, 6주, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 12개월, 1.5년, 2년, 2.5년, 3년, 4년 또는 특정의 다른 적합한 기간 등 후에 걸쳐 바람직하게는 상기 본원에 기술된 바와 같은 표준 유전자의 측정과 함께, PDE9A의 측정을 포함하는, 전립선 암의 발달을 모니터링하는 방법을 예측한다. 당해 방법은 대조군, 예를 들면, 비-암성 대조군, 암성 대조군 또는 동일한 개체로부터 수득된 조기 데이터와 비교하여 PDE9A의 수준의 증가 또는 감소를 나타내는 데이터를 제공할 수 있다. 이들 데이터는 시간에 걸쳐 PDE9A 발현을 묘사하거나 개발하는데 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적합한 통계학적 방법의 도움으로, 상기 곡선내 위치를 측정할 수 있다. 상기 곡선내, 즉, 상기 곡선의 증강 부분 또는 하강 부분내 위치에 의존하여, 호르몬-의존성/호르몬-민감성 전립선 암 또는 호르몬-내성 전립선 암의 존재 또는 미래의 진행이 진단될 수 있다. 상응하게, 본 발명에 따른 억제성 약제학적 조성물, 또는 본 발명에 따른 자극성 약제학적 조성물의 사용이 예측된다. 바람직하게는, 특정의 이러한 측정은 2차 바이오마커, 예를 들면, 전립선 암용 마커, 특히 PSA의 측정과 결합될 수 있다. 낮은 PSA 수준(4.0 내지 10.0ng/ml 까지)의 경우에 PDE9A 데이터는 조기 전립선 암, 즉, 양성 또는 호르몬-의존성/호르몬-민감성 전립선 암과 관련하여 분석될 수 있다. 보다 높은 PSA 수준(약 4.0 내지 약 10.0 ng/ml보다 높은, 보다 바람직하게는 약 20ng/ml보다 높은)의 경우에, PDE9A 데이터는 보다 진행된 전립선 암, 즉, 호르몬-내성 전립선 암과 관련하여 분석될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 각종 전달 시스템의 도움으로, 예를 들면, 리포좀내 봉입, 미세입자, 미세캅셀, 화합물을 발현할 수 있는 재조합체 세포, 수용체-매개된 세포내이입, 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 작제 등을 통해 환자, 대상체 또는 개체에게 투여될 수 있다. 도입 방법은 국소, 장내 또는 비경구일 수 있고 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 흡입, 경막외 및 경구 경로를 포함할 수 있다. 조성물은 특정의 편리한 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 볼내 주사에 의해, 상피 또는 점막 라이닝(lining)(예를 들면, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 또는 흡입에 의해 투여될 수 있으며 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 국소 투여의 바람직한 방법은 직접적인 주입이다.
다른 양태에서, 약제학적 조성물은 내부 기관, 체강 등에 목적 부위로 직접 주사되는 침을 안내하는데 사용된 영상 장치의 사용에 의해 직접 전달될 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 외과 시술 시기에 질환 부위에 또한 투여될 수 있다. 또 다른 양태에서, 조성물은 조절된 방출 시스템으로 전달될 수 있다.
바람직하게는 약제학적 조성물은 경구, 국소 또는 전신계 투여에 적합한 형태이다. 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 국소적으로, 경구적으로 또는 전신계적으로 투여된다.
본 발명의 특수 양태에서, 자극성 또는 억제성 약제학적 조성물은 개체를 등급화하기 위한 면역분석 후 투여될 수 있거나, 상기 본원에 기술된 바와 같은 전립선 암에 대한 적격성에 대해 개체를 동정하는 방법이 특히 PDE9A의 감소된 수준을 갖는 개체의 분류시 수행된다.
추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 상기 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물의 성분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 및 보다 특히 사람에서 사용하기 위해 규제 기관 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 의해 승인됨을 의미한다. 용어 "담체"는, 치료제가 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 말한다. 이러한 담체는 약제학적으로 허용되는데, 즉, 사용된 용량 및 농도에서 수용체에 대해 무-독성이다.
일반적으로, 성분은 예를 들면, 앰플과 같은 밀폐 밀봉된 용기 내 무수 동결건조된 분말 또는 수 유리된 농축물 또는 활성제의 양을 나타내는 사쉐로서, 별도로 공급되거나 단위 용량형으로 함께 혼합된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 적합한 부형제와 함께 또는 직접 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물, 바람직하게는 포유동물에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 "포유동물"은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지는 것으로 의도된다. 특히, "포유동물"은 사람을 포함한다.
용어 "투여된"은 상술한 조성물의 치료학적 유효 투여량의 투여를 의미한다. "치료학적 유효량"은 이것이 투여되기 위한 효과를 생산하는 투여량을 의미하며, 바람직하게는 당해 효과는 PDE9A의 유도 및 향상이다. 정확한 투여량은 치료 목적에 의존할 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 추정될 것이다. 당해 분야에 공지되고 상기 기술된 바와 같이, 전신계 대 국재화된 전달, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 상태의 중증도에 대한 판단일 필요할 수 있으며, 당해 분야의 숙련가에 의해 통상의 실험으로 추정가능할 것이다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 활성 성분 또는 화합물의 농도는 또한 의도된 용량 섭생, 의도된 사용 기간, 조성물의 모든 성분의 정확한 양 및 비 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 추가의 인자 및 매개변수에 대해 추가로 조절될 수 있다.
본 발명에 따른 활성제 또는 화합물은 단독으로 또는 다른 치료와 함께 투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 항-호르몬 치료, 예를 들면, 항-안드로겐 치료와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 방부제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제제는 또한 이들의 작용을 보충하거나 향상시키기 위한, 항산화성, 유리-라디칼 스캐빈저, 항홍반, 소염 또는 항알레르기 작용을 가진 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 상기 본원에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물의 활성 성분은 적합한 담체 단백질, 예를 들면, Ig Fc 수용체 단백질 또는 중합체성 Ig 수용체에 융합될 수 있다. 바라직하게는 상기 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A 또는 생물학적 활성 등가물을 융합 단백질로서 제공할 수 있다. 융합 파트너는 N- 또는 C-말단에서 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물이 상기 본원에 정의된 바와 같이 생 세포 또는 생 치료제의 형태로 투여되어야 하는 경우, 형질전환되고 제조된 세포를 환자에게 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 형태로도 투여할 수 있다. 바람직하게는 생 치료제는 미생물, 예를 들면, 상술한 바와 같은 락토바실러스를 102 내지 1012 세포, 바람직하게는 103 내지 108 세포의 양으로 포함하는 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물 또는 약제내 2개 이상의 성분 사이의 비는 숙련가의 지식에 따라 적합하게 조절될 수 있다.
적합한 분석을 임의로 사용하여 본 발명의 약제학적 조성물의 성분에 대한 최적 비 및/또는 용량 범위의 확인을 도울 수 있다. 제형에 사용될 상기 본원에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물의 성분들 사이의 정확한 투여량 및 비는 특히, 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 정확한 유형에 의존할 것이며, 숙련의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정될 수 있다. 유효 투여량 또는 성분 비는 시험관내 또는 (동물) 모델 시험 시스템으로부터 기원한 투여량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다.
대표적인 투여량은 예를 들면 0.001 내지 1000 mg의 범위일 수 있으나; 당해 예시적인 범위 미만 또는 초과의 투여량도 특히 상술한 인자를 고려하여 예상된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 억제성 또는 자극성 약제학적 조성물의 성분을 포함하는 의학 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 (a) PDE9A의 활성을 직접적으로 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제; (b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물; (c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물; (d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산; (e) PDE9A mRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제; (f) 탈메틸화제; 및 (g) 포스포디에스테라제 대체 인자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 암, 특히 전립선 암, 바람직하게는 호르몬-내성 전립선 암의 치료 또는 예방용 의학 키트에 관한 것이다.
의학 키트는 상기 본원에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물의 투여와 관련하여 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 키트는 암, 특히 전립선 암, 바람직하게는 호르몬-내성 전립선 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 의학 키트의 성분은 하나 이상의 용기 속에 또는 별개의 개체 속에 포함될 수 있다. 이들은 바람직하게는 약제학적 조성물 또는 약제로서 제형화될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 이들은 본 발명의 약제학적 조성물과 관련하여 상기 본원에 기술된 바와 같이 제형화될 수 있는데, 예를 들면, 이들은 적합한 약제학적 담체 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물과 관련하여 상기 본원에 언급된 바와 같은 국소 투여용 제형이 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 의학 키트는 임의로 또한 의학 키트 및 이의 성분의 사용 또는 고용을 나타내는 문서를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 의학 키트에 포함된 지시는 추천된 치료 선택, 용량 섭생 등을 포함할 수 있다. 의학 키트는 또한 지시 전단을 포함하고/하거나 사용, 용량 등에 있어 추가의 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 의학 키트는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적합한 용량 섭생에 따라서 환자에게 투여될 수 있다. 의학 키트 또는 키트 성분은 달리 나타내지 않는 한, 바람직하게는 주당 1회, 보다 바람직하게는 주당 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 및 가장 바람직하게는 매일 또는 하루에 2회 이상 제공될 수 있다. 치료의 진행 동안 용량은 훨씬 보다 긴 시간 간격으로 제공될 수 있으며 필요시 보다 짧은 시간 간격, 예를 들면, 하루에 수회 제공될 수 있다. 바람직한 경우에, 치료에 대한 반응은 본원에 기술된 방법 및 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된 추가의 방법을 사용하여 모니터링할 수 있으며 따라서, 용량은 예를 들면, 시간, 양 및/또는 조성물에 있어 최적화될 수 있다. 진행은 주기적인 평가로 모니터링할 수 있다. 자극성 의학 장치는 공-치료요법 시도로, 즉, 다른 의약 또는 약물, 예를 들면, 항생제, 항바이러스 약제 또는 IgG 또는 IgA 면역글로불린, 항암 약제 및, 바람직하게는, 항-호르몬 약제, 보다 바람직하게는 상기 본원에 언급된 바와 같은 항-안드로겐과 함께 공-투여로 사용됨이 예상된다.
또한, 본 발명의 특수 양태는 상기 본원에 정의된 바와 같은 전립선 암, 특히 호르몬-내성 전립선 암의 치료용 의학 키트의 성분과 함께 본원에 정의된 바와 같은 PDE9A의 발현의 측정용 성분을 포함하는 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 진단되거나, 검출되거나, 모니터링되거나 예측되어야 하는, 또는 이의 진행이 진단되거나, 검출되거나, 모니터링되거나 예측되는, 또는 상기 언급한 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 치료 방법에 의해 치료되어야 하는 암은 전립선 암이다.
본 발명의 다른 특히 바람직한 양태에서, 진단되거나, 검출되거나, 모니터링되거나 예측되어야 하는, 또는 이의 진행이 진단되거나, 검출되거나, 모니터링되거나 예측되는, 또는 상기 언급한 자극성 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 치료 방법에 의해 치료되어야 하는 암은 호르몬-내성 전립선 암이다. 용어 "호르몬-내성 전립선 암"은, 전립선 암 또는 전립선 암 세포주의 성장 및 증식이 남성 성 호르몬 자극에 대해 내성임을 의미한다. 당해 용어는 또한 항-호르몬의 투여, 바람직하게는 상기 본원에 정의된 바와 같은 항-안드로겐으로 더 이상 치유되지 않는 말기 전립선 암 발달 단계에 관한 것이다.
통상적으로, 전립선 암 진행은 췌장에 대한 엔도크린 조절 및 궁극적으로 오토크린 대조군 상의 신뢰에 있어서의 이동에 의해 동반되며 당해 복잡한 공정은 세포 대조군의 분자 수준에서 발생하는 변화의 결과인 것으로 여겨진다. 당해 단계에서 종양의 전이성 확산 가능성으로 인하여, 호르몬-내성 전립선 암은 본 발명에 따른, 특히 상기 제공된 양태에 따른 진단 및 치료에 대한 주요 표적이다.
다음 실시예 및 도면은 나열의 목적으로 제공된다. 따라서, 실시예 및 도면은 제한하는 것으로 이해되어서는 안됨이 이해된다. 당해 분야의 숙련가들은 본원에 놓인 원리의 추가의 변형을 명확히 예측할 것이다.
실시예
실시예 1 - 정량적인 RT-PCR 분석
도 1에 나타낸 세포주 및 사람 조직 이종이식편[추가의 세부사항에 대해서는 문헌: Marques et al., 2006, Eur. Urol., 49(2):245-57 참조]으로부터 RNA를 분리하고 표준 과정에 의해 cDNA내로 전사시켰다. 세포 주인 샘플 "LNCaP" 내지 "DuCaP" 및 이종이식편인 샘플 "PC-EW" 내지 "PC374"의 제조된 cDNA를 PDE9A의 발현 수준에 대해 시험하였다.
qRT-PCR: 물질 및 방법
RNA 샘플을 DNase로 처리하여 DNA 오염이 없음을 보증하였다. cDNA 합성 전에 RNA 샘플을 DnaseI(제조원: In Vitrogen)으로 30분 동안 37℃에서 처리하였다. 이후에, 1㎍의 RNA 샘플을 슈퍼스크립트 빌로(Superscript Vilo)(제조원: In Vitrogen)로 처리하여 제조업자의 지시에 따라 qPCR 분석용 제1 쇄 DNA를 합성하였다. 이후에, DNA 샘플을 RnaseH1으로 30분 동안 37℃에서 처리하였다.
수득되는 DNA를 50 내지 60 ng/μl의 최종 농도로 희석시키고, 이중 5μl를 96-웰 광학 반응 플레이트의 각각의 반응 웰에 가하였다.
정량적인 PCR 반응을 ABI 프리즘 7300 머쉰(ABI Prism 7300 machine)을 다음 프로토콜에 따라 15μl의 반응 용적으로 사용하여 수행하였다:
7.5μl ROX를 지닌 플라티늄 qPCR 슈퍼믹스(SuperMix)-UDG(제조원: In Vitrogen)
2.2μl 뉴클레아제가 없는 물
0.1μl 100 pmol / μl 프로브
0.1μl 100 pmol / μl 상부 프라이머
0.1μl 100 pmol / μl 역 프라이머
각각의 반응 웰내 총 용적은 cDNA를 포함하여 15μl 였다.
PCR 자체는 다음 프로그램하에 40주기에 걸쳐 수행하였다:
단계 반복 온도(℃) 시간
1 1 50 2 초
2 1 95 2 분
3 40 95 15 초
60 1 분
qRT-PCR 프라이머 및 프로브(제조원: TAQMAN)
다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 PDE9A에 대한 RT-PCR용으로 사용하였다:
상부 프라이머 5'-CGAGGAGCTGAAGCGGATA-3'(서열 번호 41),
71 길이의 생성물을 제공하는 역 프라이머 5'-CCCCAGACGTCAAGCTGTC-3'(서열 번호 42).
프로브로서 서열 5'-TGACGCCATGAAAGAGTTACA-3'(서열 번호 43)를 사용하였다.
프로브-세트를 설계하여 PDE 동형의 보존된 C-말단 영역을 표적화하였다. 암플리콘을 설계하여 ABI 프리즘 기술상의 태크만 분석용의 최적 범위내에 있도록 하였다. 모든 분석을 4회 수행하여 데이터 진실성을 최대화하였다. 모든 보존적 데이터가 참조된 GAPDH 참조 프로브가 또한 포함되었다.
qRT-PCR: 데이터 분석
-ddCt 시도를 수행하여 상이한 RT-PCR 실험을 정규화하고 비교하였다. Ct 값을 수동 역치 관측으로 수득하였으며, 여기서, 각각의 프로브-세트는 비교가능한 효능에서 대수적으로 증폭되었다. 특히, 다음 단계를 수행하였다:
1.) 참조 및 목적 유전자 사이에 주기 수(Ct)에 있어서의 차이(목적 유전자로부터 감해진 GAPDH)를 계산하여 실험 샘플(ES) dCt를 제공하였다.
2.) 하나의 샘플을 (LNCaP)( C )에 대해 비교할 표준물로서 선택하고 이의 dCt를 계산하였다.
3.) 주기 수 차이에 있어서의 변화를 dCt(ES) - dCt( C ) = ddCt로 유도할 수 있다.
4.) 최종의 비교가능한 발현 값은 각각의 주기 후에 DNA가 배가됨으로써 LNCaP와 비교하여 mRNA의 양을 나타내는것을 고려하기 위해 2-ddCt로 유도할 수 있었다.
당해 작업은 LNCaP에 대한 비교시 값(이는 1의 값을 가질 것이다)을 제공하였는데, 즉, 특정의 >1 값은 발현에 있어서의 증가인 것으로 고려되었으며, <1의 값은 발현에 있어서의 감소로 고려되었다.
따라서, 모든 PCR 반응의 연장 효능은 특정 범위내에 있어, 1의 값을 초래하는 것으로 추정되었다.
상이한 RT-PCR 실험을 정규화하고 비교하기 위한 퍼센트 시도
각각의 프로브-세트에 대해 Ct(주기 수) 값을 수득하였다. 이는 이들의 대수상 동안 증폭 곡선을 교차한 기본선을 발견함으로서 생성되었다. 기본선은 각각의 실험에서 수득한 곡선에 따라 역학적으로 생성되었다. 이후에, GOI의 Ct(교차 또는 주기) 값을 GAPDH 표준의 Ct 값으로부터 감하였다.
식 Ct(GAPDH) - Ct(GOI) = dCt에 따라서, GOI Ct 값은 항상 참조 서열보다 크므로 dCt 값은 음성 값, 즉, -dCt 값을 초래하였다.
각각의 주기 및 절대적인 값의 배가 효과를 기초로 하여 비교 발현 값 = 2-dCt에 따라 측정하였다. 당해 계산으로부터 수득된 매우 작은 값으로 인하여, 당해 값은 취급 목적을 위해 1000을 곱하였다.
당해 시도에 의해 수득된 PDE9A에 대한 발현 수준은 도 2 내지 7에 나타낸다.
도 2 내지 7에 나타낸 결과는, 사람 전립선 암 세포주 및 조직에서 PDE9A의 전사가 제공된 세포 유형의 안드로겐 수용체 활성의 상태에 의존적임을 나타낸다. AR 및 안드로겐/호르몬 자극에 대한 세포의 민감성이 존재하는 경우에 유의적인 PDE9A 전사가 관측될 수 있는 반면, 활성 AR의 부재하에서 PDE9A 전사는 매우 최소이다.
실시예 2 - 사람 조직 샘플을 사용한 정량적인 RT-PCR 분석
사람 PDE9A의 상대적인 유전자 발현을 호르몬-민감성/반응성을 지닌 환자 대 호르몬-불응성/거세(castration)-내성 환자로부터 기원한 전립선 암 조직에서 평가하였다.
물질 및 방법
PDE 유전자 발현 실험의 qPCR 측정에 사용된 샘플에 있어서의 세부사항은 하기 표 1에 제공한다:
[표 1]
실험에 사용된 환자 정보
Figure 112011098449741-pct00002

모든 샘플은 남성 환자(치료시 49 내지 90세 연령)으로부터 기원하였다. 컬럼 "조직"은 준비(staging)용 전립선 조직 또는 림프절에서 수술 동안 취한 조직을 정의한다. 컬럼 "조직 유형"은 조직 절제술의 시도를 기술한다. 달리 나타내지 않는 경우, 조직은 전립선 수술(전립선절제술) 동안 절제하였다. TURP는 요도식 전립선 절제술로 정의된다.
당해 cDNA 패널은 호르몬-민감성 전립선 암을 지닌 환자로부터 기원한 6개 샘플 및 호르몬-불응성 전립선 암을 지닌 환자로부터 기원한 8개 샘플을 포함한다.
사람 PDE9A에 사용된 프라이머 및 프로브 서열:
센스 프라이머 서열: GCAGAGCGACCGTGAGAAG (서열 번호 45)
안티센스 프라이머 서열: AGGACAAACTTGATGAACCCAATC (서열 번호 46)
프로브 서열: CCTGTGGCACCGTTCATGGACCGAGACTCACAGG (FAM-표지된) (서열 번호 47).
PDE9A 특이적인 프라이머를 FAM 프로브와 예비혼합하여 정량적인 실시간 PCR(qPCR)을 수행하고 제조업자(PrimerDesign, UK)의 기술에 따라 1:20 희석으로 사용하였다. 사람 cDNA 샘플(연구를 위해 본 발명자들이 사용한 샘플 기술에 있어서 세부사항에 대해서는 표 1 및 2를 참조)를 표준의, qPCR-준비, 96-웰 미세역가(MT) 플레이트에서 배열한다.
16명의 상이한 환자로부터 기원한 16개 조직 샘플을 96-웰 MT 플레이트당 배열하며, 플레이트당 사용된 16개 웰 각각은 약 2-3 ng의 RNA 역전사된 cDNA를 함유하였다.
MT 플레이트의 사용된 웰 각각에 15μL의 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)의 GeneAmp 마스터믹스(mastermix)(2x), 13.5μL의 RNAse/DNAse 유리수(free water) 및 2μL의 프라이머디자인 퍼펙트프로브 프라이머믹스(PrimerDesign PerfectProbe primermix)(제조원: PrimerDesign, UK)을 가하였다. 모든 샘플을 다음 PCR 프로토콜을 사용하여 분석하였다: 형광성을 기록하는 동안 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 50℃에서 30초, 72℃에서 15초 및 마지막 3개 단계를 50회 반복하였다.
모든 계산 상대적인 유전자 발현 값에 대해, 다음 과정을 사용하였다: 40 이상 또는 16 미만의 CT 값은 불량한 품질 이유로 배제하였다(여기서 실험한 유전자는 ~33의 평균 CT-값을 가졌다).
CT 값을 정규화하기 위해, 본 발명자들은 다음 시도를 사용하였다: 본 발명자들은 CT 값은 교정 곡선을 기초로 하여 상대적인 유전자 카피 수로 전환하였다. 교정 곡선은 cDNA의 상이한 희석에서 독립적으로 측정하였다. 후속적으로, 본 발명자들은 PDE-9a 카피 수를 집안 유전자(household gene)(글리세린알데하이드-3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPDH), 및 포르포빌리노겐 데아미나제(PBGD))의 평균 카피 수로 나누어 PDE-9a 발현을 정규화하였다.
사람 림프절 절제된 조직 샘플을 포함하는 사람 전립선 조직(호르몬-반응성 대 호르몬-내성)에서 사람 PDE9A의 상대적인 발현
사람 PDE9A 동형의 유전자 발현 수준을 상기 기술한 바와 같이 사람 전립선 조직에서 측정하였다. 상대적인 발현 수준은 토우(tow) 정의된 전립선 조직("호르몬-반응성", "호르몬-불응성")에서 측정하였다. 사람 PDE9A 발현 상태의 초기 조사를 위해, 본 발명자들은 주요 전립선 암 샘플만을 포함시켰는데, 즉, 림프절 절제로부터 기원한 모든 샘플은 무시하였다.
도 8 및 9로부터 유도된 바와 같이, 호르몬-내성 전립선 종양에서 PDE9A 발현은 일반적으로 호르몬-반응성 전립선 종양과 비교하여 일반적으로 감소된다. 따라서, cAMP/cGMP-PDE 활성의 감소된 수준은 향상된 세포 증식에 유리한 것으로 결론지을 수 있다. 안드로겐 수용체 유전자 돌연변이 또는 유전자 증폭 이후에, 다른 세포 시그날링 경로의 활성화는 호르몬-반응성에서 호르몬-독립적인 세포 성장의 이전을 지지할 수 있음이 오랫동안 추측되어 왔다. cAMP-PKA 경로는 호르몬 관련된 성장의 이러한 이전을 암시하는 경로 중 하나이다. 호르몬-민감성에서 호르몬-불응성 사람 전립선 조직까지 PDE9A 발현에 있어서의 변화는 이러한 관점을 지지한다.
실시예 3 - 사람 조직 샘플(오리젠 사람 전립선 암 조직 패널 I 및 II)를 사용한 정량적인 RT-PCR 분석에 있어서 PDE9A 및 PDE4D5의 검출
사람 PDE9A 및 표준 유전자로서 사람 PDE4D5의 상대적인 유전자 발현을 각종 환자 패널에서 평가하였다.
물질 및 방법
PDE 유전자 발현 실험의 qPCR 측정에 사용된 샘플에 대한 세부사항은 하기 표 2 및 3에 제공된다:
[표 2]
오리젠 사람 전립선 암 조직 패널 I(HPRT501, Origene Inc)
Figure 112011098449741-pct00003
Figure 112011098449741-pct00004
[표 3]
오리젠 사람 전립선 암 조직 패널 II(HPRT502, Origene Inc)
Figure 112011098449741-pct00005
Figure 112011098449741-pct00006
다음에 기술된 실험에 사용된 오리젠 사람 전립선 암 조직 패널 I 및 II는 모두 남성 환자(연령; 48 내지 87세)로부터 모두 기원한 샘플을 포함한다. 컬럼 "조직"은 수술 동안 취한 조직을 정의한다. 컬럼 "외관"은 RNA를 분리하는데 사용되고, qPCR 측정에 최종적으로 사용된 조직 단면의 병리학적 상태를 나타낸다. 이와 관련하여 "정상"은 외과재료(일반적으로 근치 전립선절제술 또는 TURP(요도식 전립선 절제술)에 의한)로부터 취한 조직이나 정상/건강한 형태학 및 조직학을 나타냄으로써 대조군으로 사용된 정상의, 인접 조직(NAT)을 의미한다. "병변"의 정의는 다음과 같다: 정상이 아닌, 즉, 병리학적 진단의 비정상(종양은 아님)의 일부 유형이 있는 비-신생물 조직. 이는 염증 또는 양성 증식(예: 대장염, 크론병(Crohn's disease), 자궁내막증, 폐기종, 기관지염)과 같은 조직병리학을 포함한다. "종양"은 병리학 진단(예를 들면, 선종, 선암종, 육종)을 기준으로 양성 또는 악성일 수 있는 신생물 조직으로 정의된다. 컬럼 "진단"은 수술을 위한 계획된 이유(예: 환자 9의 경우 방광암이지만, 전립선 암 조직도 또한 제거하였다)를 기술한다. 컬럼 "종양 등급"은 경우에 따라(즉, 암 조직의 경우) 글리슨 점수를 기술한다. 컬럼 "정상", "병변" 및 "종양"은 RNA 분리에 사용된 조직 단면내 조직학에서 발견된 상응하는 조직의 퍼센트로 정의한다. 오리젠 사람 전립선 암 조직 패널 I은 7명의 정상 샘플(정상의 인접한 조직, NAT), 11명의 과다형성 샘플(BPH-양성 전립선 과다형성), 20명의 병변 샘플 및 10명의 전립선 종양 샘플을 포함한다. 종양 샘플중, 7개는 7 이상의 글리슨 점수를 가진 종양으로부터 기원한다. 오리젠의 사람 전립선 암 조직 패널 II는 8명의 정상 샘플(정상의 인접 조직), 1명의 과다형성 샘플(BPH-양성 전립선 과다형성), 및 39명의 전립선 종양 샘플을 포함한다. 종양 샘플 중, 10명은 6이하의 글리슨 점수로 평가된 공여자로부터 기원하며, 29개는, 글리슨 점수가 7 이상인 종양으로부터 기원한다.
사람 PDE4D5에 사용된 프라이머 서열:
센스 프라이머 서열: GCAGCATGAGAAGTCCAAGA (서열 번호 48),
안티센스 프라이머 서열: TGTATGTGCCACCGTGAAAC (서열 번호 49)
프로브 서열: TCGGTTTCTCCCAAGCTCTCTCCAGTGAT AAACCGA (FAM-표지된)(서열 번호 50).
사람 PDE9A에 사용된 프라이머 및 프로브 서열:
센스 프라이머 서열: GCAGAGCGACCGTGAGAAG (서열 번호 45)
안티센스 프라이머 서열: AGGACAAACTTGATGAACCCAATC (서열 번호 46)
프로브 서열: CCTGTGGCACCGTTCATGGACCGAGACTCACAGG (FAM-표지된)(서열 번호 47).
PDE9A 특이적인 프라이머를 FAM 프로브와 예비혼합하여 정량적인, 실시간 PCR(qPCR)을 수행하고, 제조업자의 기술(PrimerDesign, UK)에 따라 1:20 희석으로 사용하였다. 사람 cDNA 샘플(샘플 기술에 대한 세부사항은 상기 표 2 및 3 참조)를 표준, qPCR-준비, 96-웰 미세역가(MT) 플레이트에 배열하였다. 48명의 상이한 환자로부터 기원한, 48개의 조직 샘플을 96-웰 MT 플레이트에 배열하고, 48개 웰 각각을 약 2 내지 3 ng의 RNA 역 전사된 cDNA를 함유하는 플레이트당 사용하였다.
각각의 웰의 cDNA 함량을 베타-액틴, GAPDH, 베타-2-마이크로글로불린과 같은 '하우스키핑' 유전자 상에서 qPCR을 기준으로 하여 정규화함으로써, cDNA 함량의 추가의 정규화가 필요하지 않도록 하였다.
사용된 MT 플레이트의 웰 각각에 15μL의 어플라이드 바이오시스템스 GeneAmp 마스터믹스(2x), 13.5μL RNAse/DNAse 유리수 및 2μL 프라이머디자인 퍼펙트프로브 프라이머믹스(PrimerDesign, UK)를 가하였다. 모든 샘플을 다음 PCR 프로토콜을 사용하여 분석하였다: 형광성을 기록하면서 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 50℃에서 30초, 72℃에서 15초 및 마지막 3개 단계는 50회 반복하였다. 모든 계산 상대적인 유전자 발현 값에 대해, 다음 과정을 사용하였다: 40 이상 또는 16 미만의 CT 값은 불량한 품질 이유로 배제하였다(여기서 실험한 유전자는 ~32의 평균 CT-값을 가졌다). 상이한 qPCR 플레이트에 따른 CT 값을 정규화하기 위해, "정상" 조직 샘플의 중간 CT 값을 계산하고, 당해 값에 대해 상대적인 "병변", "과다형성" 및 "종양" 샘플에 대한 상대적인 발현 값을 "병변", "과다형성" 및 "종양" 샘플의 CT 값과 "정상" 조직 샘플의 CT 값 사이의 비를 계산하여 측정하였다. 통상적으로, 이는 ~1의 상대적인 발현 값을 초래하였다. 유전자 발현을 다수(동일한 패널의 다중 플레이트를 사용하여) 분석하는 경우, 각각의 개체 샘플의 상대적인 발현 값을 평균내었다.
사람 전립선 조직에서 사람 PDE9A의 상대적인 발현
사람 PDE-9a 동형의 유전자 발현 수준을 상기 기술한 바와 같이 사람 전립선 조직에서 측정하였다. 상대적인 발현 수준은 4개의 정의된 전립선 조직("정상", "병변", "과다형성", "종양")에서 측정하였다. 그룹 "병변", "과다형성", 및 "종양"에 대해 나타낸 발현 수준은 "정상" 그룹의 중간 CT 값에 대해 "병변", "과다형성", "종양" 그룹의 개개 환자 조직 각각에 대한 CT 값의 비를 형성함으로써 정규화된 값으로 상기 요약한 바와 같이 계산하였다. 동일하게 "정상" 그룹의 개체 환자의 조직 각각에 대해 수행함으로써 당해 그룹에 대한 중간 발현 값이 1이 되도록 하였다.
스튜던츠 t-시험을 수행하여, 사람 PDE9A 유전자 발현이 정상의 전립선 조직과 비교하여 상이한 종양 조직에서 평균 유의적으로 상승되는지를 조사하였다. 쌍-식 비교로부터 기원한 p-값은 정상대 종양의 T-시험: p = 0.02였다.
도 10 및 도 11로부터 유도될 수 있는 바와 같이, 사람 PDE9A에 대한 상이한 발현은 정상의 전립선 조직과 비교하여 상이한 종양 조직에 대해 검출될 수 있었다.
PDE9A 발현의 수용체-오퍼레이터-곡선(Receiver-Operator-Curve: ROC) 분석
후속적으로, 수용체-오퍼레이터-곡선(ROC) 분석을 수행하여 상이한 쌍-식 비교용 AUC(곡선하 면적)을 측정하였다. 진단력을 평가하기 위한 PDE9A 유전자 발현의 수용체 작동 특징 곡선을 도 12에 나타낸다. ROC 분석은, 정상 및 악성 전립선 조직 사이의 구별이 가능하게는 사람 PDE9A의 발현의 측정을 기초로 한다는 증거를 제공하였다.
전립선 PDE-지표(PPI) - 양성 및 악성 전립선 질환 사이를 효과적으로 구별하기 위한 사람 PDE4D5에 대해 정규화된 사람 전립선 조직에서 사람 PDE9A의 상대적인 발현
사람 PDE9A 및 사람 PDE4D5 동형의 유전자 발현 수준을 상기 기술한 바와 같이 사람 전립선 조직에서 측정하였다. 상대적인 발현 수준은 4개의 정의된 전립선 조직("정상", "병변", "과다형성", "종양")으로 측정되었다. PDE9A의 상대적인 발현 수준은 PDE4D5에 대한 개체의 CT 값으로부터 개체의 CT 값 PDE9A를 감함으로써 계산하였다. 통상적으로, 이는 0 주변(-1 내지 +1 상이)의 "정상" 발현 값의 분포를 이끈다. 또한, 비-종양("정상", "병변", "과다형성") 및 종양("종양") 샘플 사이의 최적 컷오프 값은 -1 내지 +1 사이이다.
당해 시도는 내부 대조군, 즉, PDE4D5에 대한 PDE9A CT 값의 비교를 유리하게 허용한다. 따라서, 실제 시험 셋팅에 항상 이용가능하지 않을 수 있는 정상 샘플의 수에 대한 상대적인 임상 환자 그룹의 샘플을 정규화할 필요가 없다. 당해 시험은 내부 참조 대조군으로서 사람 PDE4D5를 사용한 단순한 분석으로 수행하여 델타(CT[사람 PDE4D5] - CT[사람 PDE9A])로 정의된 전립선 PDE-지표를 형성할 수 있다.
스튜던츠 t-시험을 수행하여 사람 델타 델타(CT[사람 PDE4D5] - CT[사람 PDE9A]) 유전자 발현이 정상 전립선 조직과 비교하여 상이한 종양 조직에서 평균적으로 유의적으로 상승하는지를 관측하였다. 쌍-식 비교로부터 유도된 p-값은 정상 대 종양의 T-시험: p = 0.024이었다.
도 13 및 14로부터 유도될 수 있는 바와 같이, 사람 PDE9A에 대한 유의적인 상이한 발현은 정상 전립선 조직과 비교하여 상이한 종양 조직에 대해 검출될 수 있다.
PDE9A 발현의 수용체-오퍼레이터-곡선(ROC) 분석
후속적으로, 수용체-오퍼레이터-곡선(ROC) 분석을 수행하여 상이한 쌍-식 비교에 대한 AUC(곡선하 영역)을 측정하였다. 진단력을 평가하기 위한 PDE9A 유전자발현의 수용체 작동 특징 곡선은 도 15에 나타낸다. ROC 분석은, 정상 및 악성 전립선 조직 사이의 구별이 사람 PDE9A의 발현의 측정을 기준으로 가능하다는 증거를 제공하였다.
본원은 다음의 추가의 양태를 포함한다:
항목 1: 암 마커로서 사용하기 위한 포스포디에스테라제 9A(PDE9A).
항목 2: PDE9A 발현 생성물 또는 단백질에 대한 핵산 친화성 리간드 및/또는 펩타이드 친화성 리간드를 포함하는, 암 또는 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 조성물.
항목 3: 핵산 친화성 리간드 또는 펩타이드 친화성 리간드가 조영제로 기능하도록 변형된 항목 2의 조성물.
항목 4: 친화성 리간드가 PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 세트, PDE9A 발현 생성물에 대해 특이적인 프로브, PDE9A 발현 생성물 또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 압타머, PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 및/또는 PDE9A 단백질에 대해 특이적인 항체 변이체인 항목 2의 조성물.
항목 5: 암 또는 암의 진행을 진단하거나, 검출하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 마커로서 PDE9A의 용도.
항목 6: 샘플 중의 PDE9A의 수준을 측정하는 단계를 적어도 포함하는 암 또는 암의 진행을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 방법.
항목 7: 측정 단계가 PDE9A의 생물학적 활성의 측정에 의해 또는 핵산 또는 단백질 수준의 측정에 의해 달성되는 방법.
항목 8: 측정된 핵산 또는 단백질 수준 또는 측정된 생물학적 활성을 대조군 수준과 비교하는 추가의 단계를 포함하는, 항목 7의 방법.
항목 9: (a) 개체에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 측정된 발현을 대조군 수준에 대해 비교하는 단계를 적어도 포함하는 데이터 획득 방법.
항목 10: 진단, 검출, 모니터링, 예측 또는 데이터 획득이 개체로부터 수득된 샘플에서 수행되는, 항목 2의 용도, 또는 항목 6 내지 9 중의 어느 하나의 방법.
항목 11: (a) 개체로부터 수득된 샘플에서 PDE9A의 발현을 시험하는 단계,
(b) 대조군 샘플 중의 PDE9A의 발현을 시험하는 단계,
(c) 단계 (a) 및 (b)의 PDE9A의 발현에 있어서의 차이를 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득된 결과를 기준으로 암의 존재 또는 단계, 또는 암의 진행을 결정하는 단계를 적어도 포함하며, 여기서, 상기 시험 단계들은 PDE9A에 특이적으로 결합하는 항체의 용도를 기준으로 하는, 암 또는 암의 진행을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나 또는 예측하기 위한 면역분석.
항목 12: 샘플이 조직 샘플, 뇨 샘플, 뇨 침강 샘플, 혈액 샘플, 타액 샘플, 정액 샘플, 또는 순환하는 암 세포를 포함하는 샘플인, 항목 10의 용도 및 방법 또는 항목 11의 면역분석.
항목 13: (a) PDE9A의 활성을 직접적으로 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제;
(b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물;
(c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물;
(d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산;
(e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제;
(f) 탈메틸화제; 및
(g) 포스포디에스테라제 대체 인자, 바람직하게는 펩타이드, 펩타이드모사체, 소 분자, 항체 또는 압타머의 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
항목 14: (a) PDE9A의 활성을 직접적으로 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A의 알로스테릭 효능제;
(b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물;
(c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물;
(d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산;
(e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제;
(f) 탈메틸화제; 및
(g) 포스포디에스테라제 대체 인자, 바람직하게는 펩타이드, 펩타이드모사체, 소 분자, 항체 또는 압타머의 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
항목 15: 암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한,
(a) PDE9A의 활성을 직접적으로 자극하거나 조절하는 화합물, 바람직하게는 PDE9A 효소 활성의 알로스테릭 효능제;
(b) PDE9A의 활성을 간접적으로 자극하거나 조절하는 화합물;
(c) PDE9A 단백질 또는 이의 생물학적 활성 등가물;
(d) PDE9A를 암호화하고 발현하는 핵산;
(e) PDE9A miRNA에 대해 특이적인 miRNA 억제제;
(f) 탈메틸화제; 및/또는
(g) 포스포디에스테라제 대체 인자, 바람직하게는 펩타이드, 펩타이드모사체, 소 분자, 항체 또는 압타머의 용도.
항목 16: 암이 전립선 암인, 항목 1의 포스포디에스테라제, 항목 2 내지 4 중의 어느 하나의 조성물, 항목 5, 10 또는 12의 용도, 항목 6 내지 10 또는 12 중의 어느 하나의 방법, 항목 11 또는 12의 면역분석, 항목 13 또는 14의 약제학적 조성물, 또는 항목 15의 용도.
항목 17: 전립선 암이 호르몬-내성 전립선 암인, 항목 16의 포스포디에스테라제, 용도, 조성물, 방법, 면역분석, 또는 약제학적 조성물.
SEQUENCE LISTING <110> Koninklijke Philips Electronics N.V. The University Court of the University of Glasgow <120> PHOSPHODIESTERASE 9A AS PROSTATE CANCER MARKER <130> PH012904-WO1 <150> EP09159957.1 <151> 2009-05-12 <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2103 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> Genbank / NM_002606.2 <309> 2008-10-24 <313> (1)..(2103) <400> 1 tcccgcggcg gctggcgtcg ggaaagtaca gtaaaaagtc cgagtgcagc cgccgggcgc 60 aggatgggat ccggctcctc cagctaccgg cccaaggcca tctacctgga catcgatgga 120 cgcattcaga aggtaatctt cagcaagtac tgcaactcca gcgacatcat ggacctgttc 180 tgcatcgcca ccggcctgcc tcggaacacg accatctccc tgctgaccac cgacgacgcc 240 atggtctcca tcgaccccac catgcccgcg aattcagaac gcactccgta caaagtgaga 300 cctgtggcca tcaagcaact ctccgctggt gtcgaggaca agagaaccac aagccgtggc 360 cagtctgctg agagaccact gagggacaga cgggttgtgg gcctggagca gccccggagg 420 gaaggagcat ttgaaagtgg acaggtagag cccaggccca gagagcccca gggctgctac 480 caggaaggcc agcgcatccc tccagagaga gaagaattaa tccagagcgt gctggcgcag 540 gttgcagagc agttctcaag agcattcaaa atcaatgaac tgaaagctga 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cgtctggctt 780 tgggagccca atgagatgct gagctgcctg gagcacatgt accacgacct cgggctggtc 840 agggacttca gcatcaaccc tgtcaccctc aggaggtggc tgttctgcgt ccacgacaac 900 tacagaaaca accccttcca caacttccgg cactgcttct gcgtggccca gatgatgtac 960 agcatggtct ggctctgcag tctccaggag aagttctcac aaacggatat cctgatccta 1020 atgacagcgg ccatctgcca cgatctggac catcccggct acaacaacac gtaccagatc 1080 aatgcccgca cagagctggc ggtccgctac aatgacatct caccgctgga gaaccaccac 1140 tgcgccgtgg ccttccagat cctcgccgag cctgagtgca acatcttctc caacatccca 1200 cctgatgggt tcaagcagat ccgacaggga atgatcacat taatcttggc cactgacatg 1260 gcaagacatg cagaaattat ggattctttc aaagagaaaa tggagaattt tgactacagc 1320 aacgaggagc acatgaccct gctgaagatg attttgataa aatgctgtga tatctctaac 1380 gaggtccgtc caatggaagt cgcagagcct tgggtggact gtttattaga ggaatatttt 1440 atgcagagcg accgtgagaa gtcagaaggc cttcctgtgg caccgttcat ggaccgagac 1500 aaagtgacca aggccacagc ccagattggg ttcatcaagt ttgtcctgat cccaatgttt 1560 gaaacagtga ccaagctctt ccccatggtt gaggagatca tgctgcagcc actttgggaa 1620 tcccgagatc gctacgagga gctgaagcgg atagatgacg ccatgaaaga gttacagaag 1680 aagactgaca gcttgacgtc tggggccacc gagaagtcca gagagagaag cagagatgtg 1740 aaaaacagtg aaggagactg tgcctgagga aagcgggggg cgtggctgca gttctggacg 1800 ggctggccga gctgcgcggg atccttgtgc agggaagagc tgccctgggc acctggcacc 1860 acaagaccat gttttctaag aaccattttg ttcactgata caaaaaaaaa aaaaggaatt 1920 catgatgctg tacagaattt tatttttaaa ctgtctttta aataatatat tcttatacgg 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2025 <210> 19 <211> 1853 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> Genbank / NM_001001584.2 <309> 2008-10-24 <313> (1)..(1853) <400> 19 tcccgcggcg gctggcgtcg ggaaagtaca gtaaaaagtc cgagtgcagc cgccgggcgc 60 aggatgggat ccggctcctc cagctaccgg cccaaggcca tctacctgga catcgatgga 120 cgcattcaga agcactccgt acaaagtgag acctgtggcc atcaagcaac tctccgcaaa 180 agaatgcaga ttttgcatta tctaaagagg cggttccgtg agcccactgt gctgagtcac 240 atatattcca tcggtagaga gaagaattaa tccagagcgt gctggcgcag gttgcagagc 300 agttctcaag agcattcaaa atcaatgaac tgaaagctga agttgcaaat cacttggctg 360 tcctagagaa acgcgtggaa ttggaaggac taaaagtggt ggagattgag aaatgcaaga 420 gtgacattaa gaagatgagg gaggagctgg cggccagaag cagcaggacc aactgcccct 480 gtaagtacag ttttttggat aaccacaaga agttgactcc tcgacgcgat gttcccactt 540 accccaagta cctgctctct ccagagacca tcgaggccct gcggaagccg acctttgacg 600 tctggctttg ggagcccaat gagatgctga gctgcctgga gcacatgtac cacgacctcg 660 ggctggtcag ggacttcagc atcaaccctg tcaccctcag gaggtggctg ttctgcgtcc 720 acgacaacta cagaaacaac cccttccaca acttccggca ctgcttctgc gtggcccaga 780 tgatgtacag catggtctgg ctctgcagtc tccaggagaa gttctcacaa acggatatcc 840 tgatcctaat gacagcggcc atctgccacg atctggacca tcccggctac aacaacacgt 900 accagatcaa tgcccgcaca gagctggcgg tccgctacaa tgacatctca ccgctggaga 960 accaccactg cgccgtggcc ttccagatcc tcgccgagcc tgagtgcaac atcttctcca 1020 acatcccacc tgatgggttc aagcagatcc gacagggaat gatcacatta atcttggcca 1080 ctgacatggc aagacatgca gaaattatgg attctttcaa agagaaaatg gagaattttg 1140 actacagcaa cgaggagcac atgaccctgc tgaagatgat tttgataaaa tgctgtgata 1200 tctctaacga ggtccgtcca atggaagtcg cagagccttg ggtggactgt ttattagagg 1260 aatattttat gcagagcgac cgtgagaagt cagaaggcct tcctgtggca ccgttcatgg 1320 accgagacaa agtgaccaag gccacagccc agattgggtt catcaagttt gtcctgatcc 1380 caatgtttga aacagtgacc aagctcttcc ccatggttga ggagatcatg ctgcagccac 1440 tttgggaatc ccgagatcgc tacgaggagc tgaagcggat agatgacgcc atgaaagagt 1500 tacagaagaa gactgacagc ttgacgtctg gggccaccga gaagtccaga gagagaagca 1560 gagatgtgaa aaacagtgaa ggagactgtg cctgaggaaa gcggggggcg tggctgcagt 1620 tctggacggg ctggccgagc tgcgcgggat ccttgtgcag ggaagagctg ccctgggcac 1680 ctggcaccac aagaccatgt tttctaagaa ccattttgtt cactgataca aaaaaaaaaa 1740 aaggaattca tgatgctgta cagaatttta tttttaaact gtcttttaaa taatatattc 1800 ttatacggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1853 <210> 20 <211> 1977 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> Genbank / NM_001001585.1 <309> 2008-10-24 <313> (1)..(1977) <400> 20 tcccgcggcg gctggcgtcg ggaaagtaca gtaaaaagtc cgagtgcagc cgccgggcgc 60 aggatgggat ccggctcctc cagctaccgg cccaaggcca tctacctgga catcgatgga 120 cgcattcaga aggaacacga ccatctccct gctgaccacc gacgacgcca tggtctccat 180 cgaccccacc atgcccgcga attcagaacg cactccgtac aaagtgagac ctgtggccat 240 caagcaactc tccgctggtg tcgaggacaa gagaaccaca agccgtggcc agtctgctga 300 gagaccactg agggacagac gggttgtggg cctggagcag ccccggaggg aaggagcatt 360 tgaaagtgga caggtagagc ccaggcccag agagccccag ggctgctacc aggaaggcca 420 gcgcatccct ccagagcatt caaaatcaat gaactgaaag ctgaagttgc aaatcacttg 480 gctgtcctag agaaacgcgt ggaattggaa ggactaaaag tggtggagat tgagaaatgc 540 aagagtgaca ttaagaagat gagggaggag ctggcggcca gaagcagcag gaccaactgc 600 ccctgtaagt acagtttttt ggataaccac aagaagttga ctcctcgacg cgatgttccc 660 acttacccca agtacctgct ctctccagag accatcgagg ccctgcggaa gccgaccttt 720 gacgtctggc tttgggagcc caatgagatg ctgagctgcc tggagcacat gtaccacgac 780 ctcgggctgg tcagggactt cagcatcaac cctgtcaccc tcaggaggtg gctgttctgc 840 gtccacgaca actacagaaa caaccccttc cacaacttcc ggcactgctt ctgcgtggcc 900 cagatgatgt acagcatggt ctggctctgc agtctccagg agaagttctc acaaacggat 960 atcctgatcc taatgacagc ggccatctgc cacgatctgg accatcccgg ctacaacaac 1020 acgtaccaga tcaatgcccg cacagagctg gcggtccgct acaatgacat ctcaccgctg 1080 gagaaccacc actgcgccgt ggccttccag atcctcgccg agcctgagtg caacatcttc 1140 tccaacatcc cacctgatgg gttcaagcag atccgacagg gaatgatcac attaatcttg 1200 gccactgaca tggcaagaca tgcagaaatt atggattctt tcaaagagaa aatggagaat 1260 tttgactaca gcaacgagga gcacatgacc ctgctgaaga tgattttgat aaaatgctgt 1320 gatatctcta acgaggtccg tccaatggaa gtcgcagagc cttgggtgga ctgtttatta 1380 gaggaatatt ttatgcagag cgaccgtgag aagtcagaag gccttcctgt ggcaccgttc 1440 atggaccgag acaaagtgac caaggccaca gcccagattg ggttcatcaa gtttgtcctg 1500 atcccaatgt ttgaaacagt gaccaagctc ttccccatgg ttgaggagat catgctgcag 1560 ccactttggg aatcccgaga tcgctacgag gagctgaagc ggatagatga cgccatgaaa 1620 gagttacaga agaagactga cagcttgacg tctggggcca ccgagaagtc cagagagaga 1680 agcagagatg tgaaaaacag tgaaggagac tgtgcctgag gaaagcgggg ggcgtggctg 1740 cagttctgga cgggctggcc gagctgcgcg ggatccttgt gcagggaaga gctgccctgg 1800 gcacctggca ccacaagacc atgttttcta agaaccattt tgttcactga tacaaaaaaa 1860 aaaaaaggaa ttcatgatgc tgtacagaat tttattttta aactgtcttt taaataatat 1920 attcttatac ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1977 <210> 21 <211> 593 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> Genbank / NM_002606.2 <309> 2008-10-24 <313> (1)..(593) <400> 21 Met Gly Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Arg Pro Lys Ala Ile Tyr Leu Asp 1 5 10 15 Ile Asp Gly Arg Ile Gln Lys Val Ile Phe Ser Lys Tyr Cys Asn Ser 20 25 30 Ser Asp Ile Met Asp Leu Phe Cys Ile Ala Thr Gly Leu Pro Arg Asn 35 40 45 Thr Thr Ile Ser Leu Leu Thr Thr Asp Asp Ala Met Val Ser Ile Asp 50 55 60 Pro Thr Met Pro Ala Asn Ser Glu Arg Thr Pro Tyr Lys Val Arg Pro 65 70 75 80 Val Ala Ile Lys Gln Leu Ser Ala Gly Val Glu Asp Lys Arg Thr Thr 85 90 95 Ser Arg Gly Gln Ser Ala Glu Arg Pro Leu Arg Asp Arg Arg Val Val 100 105 110 Gly Leu Glu Gln Pro Arg Arg Glu Gly Ala Phe Glu Ser Gly Gln Val 115 120 125 Glu Pro Arg 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(1)..(466) <400> 23 Met Asp Ala Phe Arg Ser Thr Pro Tyr Lys Val Arg Pro Val Ala Ile 1 5 10 15 Lys Gln Leu Ser Glu Arg Glu Glu Leu Ile Gln Ser Val Leu Ala Gln 20 25 30 Val Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ala Phe Lys Ile Asn Glu Leu Lys Ala 35 40 45 Glu Val Ala Asn His Leu Ala Val Leu Glu Lys Arg Val Glu Leu Glu 50 55 60 Gly Leu Lys Val Val Glu Ile Glu Lys Cys Lys Ser Asp Ile Lys Lys 65 70 75 80 Met Arg Glu Glu Leu Ala Ala Arg Ser Ser Arg Thr Asn Cys Pro Cys 85 90 95 Lys Tyr Ser Phe Leu Asp Asn His Lys Lys Leu Thr Pro Arg Arg Asp 100 105 110 Val Pro Thr Tyr Pro Lys Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Thr Ile Glu Ala 115 120 125 Leu Arg Lys Pro Thr Phe Asp Val Trp Leu Trp Glu Pro Asn Glu Met 130 135 140 Leu Ser Cys Leu Glu His Met Tyr His Asp Leu Gly Leu Val Arg Asp 145 150 155 160 Phe Ser Ile Asn Pro Val Thr Leu Arg Arg Trp Leu Phe Cys Val His 165 170 175 Asp Asn Tyr Arg Asn Asn Pro Phe His Asn Phe Arg His Cys Phe Cys 180 185 190 Val Ala Gln Met Met Tyr Ser Met Val Trp Leu Cys Ser Leu Gln Glu 195 200 205 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Met Val Glu Glu Ile Met Leu Gln Pro Leu Trp Glu Ser Arg Asp Arg 485 490 495 Tyr Glu Glu Leu Lys Arg Ile Asp Asp Ala Met Lys Glu Leu Gln Lys 500 505 510 Lys Thr Asp Ser Leu Thr Ser Gly Ala Thr Glu Lys Ser Arg Glu Arg 515 520 525 Ser Arg Asp Val Lys Asn Ser Glu Gly Asp Cys Ala 530 535 540 <210> 26 <211> 492 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> Genbank / NM_001001571.1 <309> 2008-10-24 <313> (1)..(492) <400> 26 Met Asp Ala Phe Arg Arg Asn Thr Thr Ile Ser Leu Leu Thr Thr Asp 1 5 10 15 Asp Ala Met Val Ser Ile Asp Pro Thr Met Pro Ala Asn Ser Glu Arg 20 25 30 Thr Pro Tyr Lys Val Arg Pro Val Ala Ile Lys Gln Leu Ser Glu Arg 35 40 45 Glu Glu Leu Ile Gln Ser Val Leu Ala Gln Val Ala Glu Gln Phe Ser 50 55 60 Arg Ala Phe Lys Ile Asn Glu Leu Lys Ala Glu Val Ala Asn His Leu 65 70 75 80 Ala Val Leu Glu Lys Arg Val Glu Leu Glu Gly Leu Lys Val Val Glu 85 90 95 Ile Glu Lys Cys Lys Ser Asp Ile Lys Lys Met Arg Glu Glu Leu Ala 100 105 110 Ala Arg Ser Ser Arg Thr Asn Cys Pro Cys Lys Tyr Ser Phe Leu Asp 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<210> 36 <211> 526 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> Genbank / NM_001001581.1 <309> 2008-10-24 <313> (1)..(526) <400> 36 Met Asp Ala Phe Arg Ser Thr Pro Tyr Lys Val Arg Pro Val Ala Ile 1 5 10 15 Lys Gln Leu Ser Ala Gly Val Glu Asp Lys Arg Thr Thr Ser Arg Gly 20 25 30 Gln Ser Ala Glu Arg Pro Leu Arg Asp Arg Arg Val Val Gly Leu Glu 35 40 45 Gln Pro Arg Arg Glu Gly Ala Phe Glu Ser Gly Gln Val Glu Pro Arg 50 55 60 Pro Arg Glu Pro Gln Gly Cys Tyr Gln Glu Gly Gln Arg Ile Pro Pro 65 70 75 80 Glu Arg Glu Glu Leu Ile Gln Ser Val Leu Ala Gln Val Ala Glu Gln 85 90 95 Phe Ser Arg Ala Phe Lys Ile Asn Glu Leu Lys Ala Glu Val Ala Asn 100 105 110 His Leu Ala Val Leu Glu Lys Arg Val Glu Leu Glu Gly Leu Lys Val 115 120 125 Val Glu Ile Glu Lys Cys Lys Ser Asp Ile Lys Lys Met Arg Glu Glu 130 135 140 Leu Ala Ala Arg Ser Ser Arg Thr Asn Cys Pro Cys Lys Tyr Ser Phe 145 150 155 160 Leu Asp Asn His Lys Lys Leu Thr Pro Arg Arg Asp Val Pro Thr Tyr 165 170 175 Pro Lys Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Thr Ile Glu 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Leu Gln Lys Lys Thr Asp Ser Leu Thr Ser Gly Ala Thr 355 360 365 Glu Lys Ser Arg Glu Arg Ser Arg Asp Val Lys Asn Ser Glu Gly Asp 370 375 380 Cys Ala 385 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence <400> 41 cgaggagctg aagcggata 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence <400> 42 ccccagacgt caagctgtc 19 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe oligonucleotide <400> 43 tgacgccatg aaagagttac a 21 <210> 44 <211> 125000 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank / AB017602.1 <309> 2000-06-06 <313> (1)..(125000) <400> 44 tgtgcatggg atcatgcaac cccttgaagg gctgaagaga acaagaaggc agaggaagga 60 ggaacttgcc tctttcctcc cacctgcctg cttgggctgg gacactggcc ttctcctgcc 120 ctgggactgg gtccccacca tcagctcccg ggtgctgccc tcaggcttgc actggagcca 180 caccaccagc tttcccgggg ctccggcttg caggcggtag ctggcaggac ttctcagcct 240 ccgtcctcat gtgagccaac tcctcactat tggtctgctt ctctgaagga ccccaactca 300 tgggtccacc tgaccgtggt ccaagtccca tcacactttg caaagctgac tgcagctgct 360 gctcactggc ctccctgcct ggccccttcc atgcaccctc ctccagcatc caagaggatc 420 ctgtgaaaac ccacgtcaga ccatggccct ctgcaccgcc tcctgcaagg catgcagtgg 480 aggaagagtg acctcaagtc actcgtgtga ccacgcgggg ttgcccccgt cacctctctg 540 acctcacagc ccactacggt cccccacagc ccactccctc cctccgctct ggccacgtgg 600 cctcctgcat aaggctgctt ctgtgccaga acgtccttcc ctctgacaca cacaggctcc 660 ttgctcctaa cacctgtaag atccctcctc ctatgtgacc ttttgcctgg ccactttctc 720 taaaattcca actccctcac actgcacatt ccctcacact gcacattcta tatccccttc 780 cccgcaggat ttttcttttt tagagatggg gtctcactat ggatttttct tctttgcctt 840 aatttttatc caacacccta cacattctat ttatttatac catcgtgtct gtcttcccca 900 gagaatgcca gcttcttcag gccagggatc tctgcttatt ctgttcacta ctgaattccc 960 agtgcccaga acagcaccca acacgcagta atgagattgt tgacgaatgg aagaccgcac 1020 tgctccatgg ggatctggga gaggaaaggg ttcctctcta ggcagctgct gaggcctcat 1080 cgatccagta tctacacagg ggtccagtcc agctcctaaa agtgcaaagt aattatagat 1140 gcgattattc tcctgagcac agaatcagcc aggcagtgtg aggggccagc ctgcactggt 1200 gctggacgca cacagagtct cagagccaca ccctccaccc tcctggggaa ctgccctgca 1260 gaaccacccc ccatgggcgg gcactcgtcc ttctggggct cttggaggaa atggttacag 1320 aagactaggc cagatgacaa taagggatgg agaataacta agtgccaagc caatgagcca 1380 tctgctggta agaactccat gccaggcagc acaggcggtc ccaacagcac gatctctgga 1440 ttagcccaaa tagcatcgga acatttgaca acaaattgaa ctactagtaa tagtgctcac 1500 ttcaatgagc cggggacaca gtatccccat ggcgagtcag ctggcccgct gtaaccaccc 1560 agctgggtct ccccacccca aaggcctcca ggctgtcccc ttctcatcct gtcacttgaa 1620 aagcacaact catggtgcca aagctctgac acggactcca ctggagctgt gggcaggggg 1680 tgccaaggta ccgagttcca agccgttgtt atttgagagc gtgccccccg ccatgagagc 1740 aggtgggggg acataaagtg acacaggatg gactggccaa aggctgagga cgatcactta 1800 cctcacagga tgatgccacc cccacggaca ggcaaggagc tctcaccttc cccaggaccc 1860 cagctgccac cagagctcca gatggccctg ggggtgtctg taaagcctgt gaccgtccac 1920 caggtggaga ccaggctggc caggggaggg agaggaagtg accactggcc ctggcactgg 1980 ctggccggct ccagcaggcc cgaaggggag ggaggagcct gggtgcacca gactctctca 2040 ataagcagca cccagacact taacagatgg aaagcggtgg cttggaactc acttccaacg 2100 aaacaatagc acatgctccg gctggctttg acacttgctt ccaaaggcga cctgcaccca 2160 gggccaggac cacggcatct gagcctcctc ccccagccgc caaccccatt cccaatggag 2220 gagcccagga gaactggggg cggccaaggc agcccttccc tgctccgcag atccagagga 2280 tgcccacagc ccccttcccc tcccgccttt cccacactcc ctgtagcaat tcacacaagc 2340 ggggagggga cgaaactgct gaatccagca gatagcttgt ggcggggtaa tcctcggtcc 2400 ggccccatac aggacagaaa taaaatcgcc atttcagctc cgggcgcagc tggaggaggc 2460 tgacgccccc tagttagggg aaggctgtgg gtgaccgaga aggaactttt cccgttttct 2520 attcaaatga aatgagggtg gcggtcgcag cagggagaga ggagcgaggg gagttttccc 2580 ggcggggctg gggggtccac agcggcgcgg ccacgctcag cccagcgctg gcttaggagg 2640 gacgggctgc gtggggaggc gacggctccg ggccgaaggg gtcgctcagg gctctgcaca 2700 gctgtccagg gggcatcggg agataggcag ccgaccgggg gctggagtca agggaagaag 2760 aaagaggggg aagggaggtg cagggagtga agaggagggg agagaggaga gacgggggag 2820 ggagggggga ggggggaggg ggaggggcgg gcgggcggcc gggaggagga gcgcgcgagc 2880 cggagtcgga gcccgagccc gagcgcgagc cgagcggagg agaccctgcg gcgcgcggcg 2940 gcggctcccg ggcgtcccgg gcccggtggc ggcgcggctg tggttggctg agcgccgcgg 3000 gccgcccccc gcccgccccc tcccctgctc ccctcccccg cctcccgcgg cggctggcgt 3060 cgggaaagta cagtaaaaag tccgagtgca gccgccgggc gcaggatggg atccggctcc 3120 tccagctacc ggcccaaggc catctacctg gacatcgatg gacgcattca gaaggtagcc 3180 cctcccccac ccagacaccc cctcctcccc ccgggtgaca gcgccggggc cgggcgcggc 3240 ggggcgggac tgtccgtgcg tctgccggtc caggctgcgg cctccgtgcg ctccgccagc 3300 tctggtcggg ggcgggggtc cccacgcgcc ggctccccgg ggaaaggggc gactcgccct 3360 ggggggtggg gggtgggggg gcgggctagt gtttccgttt cacaggcaga gcttttcttt 3420 ttgaaaatct gattaggctg agtttttaca ttcaagggct ggcacatgaa gcctttaatt 3480 tccggtggat cggcccgccg ggcagccccg gggtcgtggt ccgcggaggg ggcgagcagc 3540 cgccgcttcc tgtcgcgcgg gggcaggtgc ggggggcgcc ggcggggaca ctgctccccc 3600 gcaggtgagt agctccgact gcagaggggg actcgggccg ctgcacctcc ggggccccgc 3660 ggagagcctg gggggcagcg 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cactttttct gcccgataga tgagaatgta tcaaagacct 4560 gcctttaaaa gcaaaagtct ttttaaagtg agttgtcacc agatcaacag tagcaggtcc 4620 gtcctaagaa cttcctaaag atgtcccggg agcagctctc ttggaagcag gtgaaaagtg 4680 gaggagagct tcaggagggg tgggaggagg acgctgggca tggcaggcca ggctgttatt 4740 gtgggcaggg tagcttttca cagtggacac gctgaggttg gggtgatctc cagaaaagca 4800 gcctgcaggt gggccctggg gaagacatgg catgtggcac ctttgcgggg gagaggcgga 4860 ttgactgcca gctctaccac ttcctgtacc acgagcaagc ccctgggctc cccaagctgg 4920 catccccgtc cataaagaag ggataataaa atctgcttta tagactggaa tgagaaggga 4980 atgagtgaat gtaaacactg cctggaacac tgcagaacac gatgagcatt attcttccct 5040 cagttccttc cataaacgtc cttttgtggt gcaaacaggg aggcgccaga cgggtctcca 5100 acccccaccc cgccccccat ctccacgagg tctgttgctt gctcctgagc tgcccccgcc 5160 ctctgcccct tgctgtgaac cccgttggaa gctcctagct ggactgtgag tcctggttga 5220 agctgaatcg tttgcccaag ccatgtgccg ggcaaagcat gataacttct cgctcacctc 5280 ccaggctgca cacccagcag tgctgtcacg gatgggttgc accgggctca gctgagagca 5340 ctttcagtgc cgctgccatc 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tttcctgtgg ctgcaggcat ctctgctcaa ttgtgcaggg 7920 ctgcgtcccc cggccacact gactcctctc caggtttctc ggctccagca ccactgtctg 7980 cgccctcctt cccaggtgga cggcggctct cctcgccatc ctctccactt ccagcctatc 8040 atctgtctgc ctgttacatg tttgtaactt ttgaccttta aattggtata aaaatggtac 8100 tgtaagttca ctgaaccaag aaaatctgct gaaggaaggg ggtcagtcac acccttttgg 8160 ggtttccagt gtatgaatgg agggggtggc ggtggtggag ggacagggag caatgagagt 8220 tgccagcctt attgctgtcc tgacccctgg ctggggacga ctcccctgtc tccacctgaa 8280 ttgaagctgg gctgtgaaaa gtagtaagaa ccctcggttt ttggttcctt tttcaaccag 8340 caatcagcca tgaagtgcct gaccacttga gagctacagc aggtgctgtc tcggagaggg 8400 cacaggaaac tgggcccttc ccaattttag cccaagggtg ccgaaaagtc agggagctgc 8460 tggcctccac actccttccc attggtgtgg tccgaattcc cctttagcca gacatttcca 8520 atgtccagag gcccaggagg ggacagctgg aagccagaag cccacctgac gccatcagga 8580 atttccatga atgacctgga aacctctcag actaaaccaa tgccgcccaa tctgggaatc 8640 caggagggct ggtcccatag agtggtgggg acatggtgct gagacggaca gcctcgcctc 8700 atccgccttt cccacttgcc agccgggagg cctgggcaaa atcactttct ccccagggaa 8760 gtggaggctc actgtgcagt ccacgcggag caatggggtg aagtttccag agcagggcag 8820 ggcatgtggg gaggctcagg aatgccaccc ttgccctcag gcctgggcac agcatagccc 8880 ccatgacgct tctctcatcc tggacccatc agcccggaag actctggaag cagcagtggc 8940 agcaccttcc tgtcacttgt cttgtcactc cccgagtcca ctgtgagcta gaaccacagg 9000 ctcccatgaa gaaggagcca gaaccacagg ccccatgagc ccaggtccca cagcccgcac 9060 cttcgtcttc cagccagcct ctccggagct cagtgtgggt ggaggggctg tctggcctca 9120 gaaatgggca aaagacagct ctcgttgtca gcgaggtaaa tctagcgcag aggaagggca 9180 cactgtcccc gtcagacgcc tcagatgaac tgacatgcaa atgagagatg aaacggggac 9240 gagccgggca gctgatctca gtgcagcaac tgggacacct cggggcataa gccgggcagg 9300 gaggcggcag gaactgggcc ccagggggcc aagacttcct gagaggctgg gcccggtagc 9360 ccagtcctgg gcttgcttcc cagggggtgg tgggcaaccc tgaaccctct ctcacccaat 9420 cacctgctcc cctgggtgca ggtgacccag caagccgcac tcctgggaaa tttcagaagg 9480 ttttgggcaa gaagggccca gagagccccc agagaccaga cggcacagcc cgatagctgg 9540 gcctgcccca gacaaagcgt gtctgcactc cttggctttc tccccagaca aacccaccct 9600 gagctcagga tccctccagc ttccaggagc aggtgcgggg cctgcaggga cggctcgcag 9660 agaaggcagt ttgcgagtca gtgcctggct tgtggaggtt gagaccaagg ccagttgggt 9720 gcttgcattt ccaggggtcc aaatattttt gagaagaaaa tgttctaaga aagtgcacag 9780 ggtggtggat gaaagaccac gctctgggta ccgtgtacac cgctcgggtg acagtgcacc 9840 agaatctcag aaatcaccac taaagaactt acccatgtaa ccaaacacca ccccttcccc 9900 aaacactatt ggaattaaaa aaaaaaaaaa agattaaaat ggttaaaaat agaaagtgca 9960 caagcaaggg tccatctgca ggagttggag gagcgcatgc ctgtattcct ggcactgcgg 10020 gcacagtcat gccatgggca ccagggacgc ccagtgcact cagccaccca ggggtggctc 10080 ccaacatttt caagctcaaa aagaaatatt ttcacttgag ggtgcaactt atttgtcttg 10140 aacccatccc tgactgcctg tctcccccct caccctgacc acatctcccc aaatcccgaa 10200 gctggtcacg caacgggagc attggccctg aacagaaacc cgcagtaccc ctgaaaactc 10260 ggtctagaaa caactaaaag aagaaccaca gcattttatt ccgtttgctt tagattctct 10320 gccaattttt tttttttttt gagatggagt ctcgctctgt cgcccaggct agagtgcagt 10380 ggcgtgatct cggctcactg caacctccgc ctcccaggtt caaggaattc tcctgcctca 10440 gcctccggag tagctgggac tacaggcgcc tgccaccagg cccggctaat tttttatttt 10500 tagtagagac ggggtttcag caccttgacc aggctggtct cgaactcctg accatgtgat 10560 ccgcccgcct cagcctccca aagtgctggg attataggcg tgagccacca cgcccagcct 10620 tttttttttt tttaatttta aattgtggta aaatatatga acaataaacc ctccctcccc 10680 atccccctcc cccagcccct gacccccact gtacattccg ctttctatct ccatgaaact 10740 gctgagtgcg gggacctcac agaagtggaa tcacacagga tcgccctgct gtgcctggcc 10800 tccttcactc ggatcatgcc ctcaggtgca tccatgttgt agcacgtgtc cgaatttcct 10860 gcctttttaa ggccgagcgg tattccattg tgtgcgtgga ccacattttg tgtttccatt 10920 caaaacggat gaatcgatga aactgcctga tatttttaaa gcctcagtca ttttcattct 10980 tagttcttca gtttgcaaag ggccggcctg ttgtgatggg tttattgttg catcttctga 11040 aaaactttgt gagttcccga aggcctctcc acgtcttgag tcatggctgt gctgctttgc 11100 gaagctgtgt gcatgtctgt ggtgtagcct gtgtacagcc tgtgatgcgt cgcagcggaa 11160 gggtaggggg ctgcccaggg aagacagatg cgccaggttc cgctccacgg agctcagcta 11220 ccagccctgg 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acacacacca cacacacaca ccaagcacac acacaccaca cacacgcaca cacacgcaca 12120 cacccaccac acaccacaca catgcacatc acacacgtac acaccacaca cagcacacac 12180 aaaaacacac cacacacacc atgcacatgc acatcacaca catgcacacc acgcacacgc 12240 acatcacatg cacacgccac gcgcctcaca cacaagaaca cacaccacac acacgcacac 12300 cacacacacg cacatatcac acacatgcac atcacataca tgcacacacc acacttacac 12360 acatgcacat cacacacaag aatgcacacc acatacacgc acatcacaca catgcacaca 12420 ccacacatgc acatcacaca cctgcatata catcacacac acatcacaca catccacatg 12480 caccacaccc accacacaca tgcacgcacc taccacacat gcatatcaca cacatgcaca 12540 cacaccacac acaagcacat cacaaacacc acacaggcac atcacacaca tacatacaca 12600 ccgcgcacac atcacacaca tgcacacaca ccacacacgc acagtatgaa gatgacagag 12660 aagtcagcag agcccctggg ggtttcagga gttgagtggg gacgaggcag gtggccacac 12720 agctcggagg gagggcagaa ggcacccgtc ttcgcagagt cacagtgggg cttgcctcct 12780 atacgtgccg gaagggtgaa gccccttatc tcattgcccg atgtgatgag gtttgaagtg 12840 gttgagcttg gagggtatgg gctgagccca cagcagacag gcctggcagt gccccccgtc 12900 ttcccaccct gcggtcatgc agcccgactc ttgggggcgg ggtgccaccg tgatgtgccg 12960 tcacttgcag cagtatgtcc tcatgccagg ctgagaccag cactgtgtga ccagcctgcc 13020 ccatgtccct cagcgctgtg tcacactcca cactgaggcc ccactgaagc atgccaggcc 13080 ccatcctatt tcttccaggt agtcgtctgc ccagcacctc ccctcccagg ccttgcccta 13140 aagcccaggc ctctcagcat ccaggactct ggaatctccc aggtgttgat ggctgaggtc 13200 atcagctgga tgccaggaca cccaggatgc tccaggtcct tgctggggtc tggagtttgt 13260 gattcagcct cagtccctgt ggtgagtcca ccatgtgtcc tcagacaatg gatcagagag 13320 cccccagagg acggcccggg gccgagtcgg gtccagatgc caaaggggct tctcgaggca 13380 tctccagctc ccacctgccc ctcggagtgc caggcttggc ttctggaaga gaaagctggg 13440 ggtttagtga ctccagccaa ctgctgtgag cccaaggcat caaactaaaa atagcgaggc 13500 caagagggag tctttgtgtt cggctcagtg ggcaatggtg cctcacctcg cagcatgaca 13560 cagggctgat gacacggggc acgttggtca caaagtgcca gtctcagcct ggcacaggga 13620 cgtgccacct gcaggtgatg acacatcaca gtggcagccg ctcctgatgg tgctgctgca 13680 ttgagtagga gcccagatcc agggagacag ttgcagcaga 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caaagcccag tgtaaaaaac tgaagtcagt gaagcatttg gggaagctcc gaggaagcag 113220 catgctccct gggacggggc cctgaggcat cacggcctct tgcgaaattg tcaaatgcca 113280 ccatgtgcca gaggcagagg tgggcagaac caggctgtgg ttcattggga tgctgtggtc 113340 aaggcctctg ctggcctgtg ctgtgccagc cactgtgagt gtgaaatgag caggagaaca 113400 gatgggtgtg catggtgatg gccccgggag gagcgccgac agccgcacct cagaacccac 113460 tcggcgctga catacggcgg cagcgctctc gggcctgtga tgacatcatt gcacaaacat 113520 acacaattca atagacaatt tacagtcatt attgaatcac tggttcccag tacagttatc 113580 tcccctttat ctataggctc tctggcctct cctccatgtt tgtgcccctc cccaccctgc 113640 aagcaggtgc cctgtgtggc tacgataagc tgtggcaaat cttcgtctgc agtaggtcaa 113700 ggagcaaccg tgaagagaga acgctgcatc tgccactgct accccagtgg ggagctcctc 113760 cagggacagg acctggggaa tcaaagcaag tgaacgcccc ttagtgtagg cctcgtccca 113820 ctgagccatg tcggagagca tcccgcaaga gaaggaggcg gcacctgatt ggaggagcag 113880 ccgctctgca caggggatcg ttctcgtgcc catccaccgt ggggacacac cagcattggc 113940 ctgcttcaaa tgcttcactg actgcaaaat atgactctcc tctgggggta aaattagttg 114000 tcccactttt ttaaaaatat attttgtcat ggaagatttc aggaataact gaataaatgc 114060 ttcactaata acacaattaa atgtttacag gaaaattgaa taattcaaga tacaagtgat 114120 ccccccaaaa aaatatatat atatacagtt gaaatgacct agattgatgg gtttgggttt 114180 tgtatctgat gcttgttgtt ttattttctt ggaagaggaa aacatcatac ctggcacaga 114240 gatgtgttct gtaaatgctt gtggggtggg tgggtggatg gatggatgga tggatggatg 114300 gatggatgga tgggtggatg ggtggatgga caaatggatg gaagggtgga tggatggatg 114360 ggtggatggg tggatgaatg gacagatgga taaatgggtg gaaggatgga tggataaatg 114420 gatggaaggg cagatggatg ggtggatggg tagatggatg gaggatgaat gggtggatgg 114480 atggatgaat ggatgggttt ttgggtgggc agatggatgt gtggacaaat ggatgggtga 114540 tggatgcaca tatgaatcgg aataagagat acatgaaata atgtgtgcag ggggctcagt 114600 acacagtagg cctccgctga ataattgttc agactatacc cgtgttaaca cgttgttctc 114660 tcgctattta gggaatgatc acattaatct tggccactga catggcaaga catgcagaaa 114720 ttatggattc tttcaaagag aaaatggaga attttgacta cagcaacgag gagcacatga 114780 ccctggtgag tggcttattc tgcctgggtg ggcagccagg cggtgggctg gcgaagcagg 114840 tcatccatcc agctcacact ggaagccaag aagctgaaat tattagtctt cttggaacaa 114900 ggtgtctata aatctggttt tcaaggtcat gactcttact aggaaagtcc gggcagggcc 114960 tccctcctga tgggtcctcc ttcatggtca gaggcagcat tctcccattc ctccatctct 115020 tttggatttg aaggagataa gtgggtgaag gccgtgcatc tcgctctgct ttccagagaa 115080 taaaaccagc tctcccatga aggcacagcc ccagcatggc actctgaaag cccacctatg 115140 tgggggcaac tccaacacag ctcccgctcc ccaagccagc atcccccacc aggcccacac 115200 catagcccag cacccctcca taaccaggac aaggtggcca gagaaggggt agggggcctc 115260 ccccatgaga aggtgcactt aggttgccca gcatctgcct tttggaaagg acaggcactg 115320 ggcacaccaa ggcacacaag gaccagagca cgactcatgc ctggaatcca gcactttggg 115380 aggccacggc aggaggattg cttgagtcca aaagtttgag accagtctga gcaatattag 115440 caagactcca tctccacaaa aaaagaaaga aaaataaaaa aatcagtgca tatctgtggt 115500 cccaactgct tgggaggcag aggtgggagg atcgctggag cccaggtcca ggctgcagtg 115560 agccatggtc gttccactgc actccagcct gggcaacaga gcaagggtct gtctcagata 115620 acagagagag agagaggtgc atgagaactg ccctcccggc cttcagagag aaagctggtt 115680 ttgtggagcc ttgtctaagc atcaggtgca cccctggcat tcttactctg aaatttgatt 115740 atctgtttaa aatcaatagc atcactttcc acctccagag aggttgaaag atagggaact 115800 ctcggctcag gctgaccttc taaccatcca gtcccagtag gtagagtcat taggactcat 115860 cgctctctgg agctgaggtg cagttaattc ccaaagactg tgcgagagga tgggagctcc 115920 cgcaggcaag ggctggacag caggcaaacc tccccaggcc agggccacca gaagcccctt 115980 ccctaagagg gaaacagtca catagagcgg cttcctggca agcaagtttc ttgctcctga 116040 aaaaccaagg gaaggaggga ggcgccgcct tgtcctctaa gatatgagga aggcagagat 116100 ggacctgcag tcaggggtga cccaggcccc gccgatgcct tcctcctctg aggtgggagg 116160 agaggtcagg gaagagacgg ggaggggcag gatgccagag gatcgggtgc caggtggtca 116220 ggacaagtga acccagctga aggtccccac tcccacccca cccccagcct tacacactgc 116280 agctgtgcag accagaggca aagcgaggct cagagcccag ggttccgttt atcccaacga 116340 cctgcaccgc ggggtcagat gacaagcagc acggccaggc atcgtctcac tgctacggag 116400 ccccagacgg ggctttatga acacgggtgg aggacagagg ttggggtaag gtctcggggg 116460 aaaggttctg attcaaaatg ggccccaata gggaggcctc tgaggatagt gcgggccagc 116520 gtgggaggtg tgaggtgcag ggagtgtggc cggcagggcc tgggaccttg accttcccca 116580 gagacactgc tgccctggcc ctgccctagg tctggtgtcg ggacagctcc actgaggccg 116640 gccaggcaca ggctagtcat tgcctctgat ctggagccgg actccacaga ggagtcaaag 116700 aaaggcctga atggcttcct gggaactgat agggcaggga aaggaagggc gaccacagca 116760 ggatcccttc gaggtcctgc cgaggttgga aggcaggatc caccaagcat catgcagact 116820 ccgagctgaa ctgagctgct cctcacctag tcacgttccc caaaccagca ggtgcagccc 116880 gcagcccggg ggcatgtgcc tcagctgggc tttcctgtct aatcagcttc agagcctgga 116940 tggcaaccaa cactttggtc tggaaacctg gtgattccag acactcattt gtgcccggtg 117000 caggcagggc cacgggacgc cagccctcca cctcttgtcc tatggcgaca tccgggctag 117060 tttgggtgga agctgctgca ttcctgggcc tgccctatct cctcctgaag ctcctatggc 117120 atgcccaacc ctggccaagc tgagacagag ctacctgtcc cctgggaaga tgagcaatgc 117180 acccacctag ggaacagcag aaaatagggg gtgaccaggc acagggcagt gcttcagggg 117240 atatcacctg ggctggggtg gccagaaagg ctggaaggag gggacccaaa caggaccttg 117300 aaggttcatt ctccattgag aagggagcct gtcctccctg aaggcagcca agctcagttg 117360 catggtccag caggtcctcc gtctcttcct gcctgtaatg gcaagtccag acccgagcag 117420 cagcagcagg cccgtgttct acctcctgtt acctcaattc caaaatctct tctttcagct 117480 gaagatgatt ttgataaaat gctgtgatat ctctaacgag gtccgtccaa tggaagtcgc 117540 agagccttgg gtggactgtt tattagagga atattttatg caggtaagag tcttgcagag 117600 caatcaagcc tccagccact cttattagcc ccacttagta agggtttgcg ttaaacgagc 117660 acgcctgggt ggtcccgcat attccccggg ctgccgacag ttcagcctcc agaaagcctt 117720 cagggtaagc gtacatcaga aacaaaatag gttataattt gagacctgaa agacagtaac 117780 aatccagaaa agctaatact ctaaaactgt cacctgtcac tgctaattga gccattatta 117840 caagcagcct tgtcaaacaa attgcctgaa agtcaagaag caaggactgc agaagcagga 117900 gggggcccag gagggccgag acccagcagg tcagctcaca cagatggcca cggggaaggt 117960 cggggacata gaaaaccaag ccagctgaaa acaaccacca aatattaata caacagcttg 118020 atgaacccta ggagaagtcg ggaggctttc tgcaggacgc tgctgccgtc ctgggataca 118080 tccatccaac tcacctctgc ctatctctca ggtcggtctt cccagctaga cctgcacgcc 118140 cagctctgtt tagcactgaa gatagggtca ccttctcctt gttcttactg agacacattt 118200 gtggtgtggt ttggttggtt ggtggttaac tggcgcatct tgtctttctc tgagaacagc 118260 gatctggtta tggggcattt ctgtctctaa tgtcactgtc tgctgcattc cctgcagagc 118320 gaccgtgaga agtcagaagg ccttcctgtg gcaccgttca tggaccgaga caaagtgacc 118380 aaggccacag cccagattgg gttcatcaag tttgtcctga tcccaatgtt tgaaacagtg 118440 accaaggtga gtaactgtca ccacatgtca cacttgctta cactcagata catgcatgca 118500 cacacaggca cacacacata tacacatatg cacacaggta cacacagaca cacactcatg 118560 cacacacgta cacagataca cacagacgca catacaggca catacacata tacacacacg 118620 cacacagcta cacacaggca cacacacagg cacacacttg tgcacacagg tacacaggca 118680 cacaaatgca cacacacggc acacacaggc acacactcgt gcacacacat gtacacaggc 118740 acacacaggc acacaaatgt gcatgcaggt acacatgcac acaaggcacg caggtacaca 118800 tgcacacaag gcacacaggc acacacaggc acacaaatgc acacacaggc acacacacac 118860 acacacatgc acacaggtac acacaggcac acaaatgcac atgcaggtac acatgcacac 118920 acaggcacac acagggacac acaggcacac ataggcacac aaatgcacac acaggcacac 118980 acatacacac atgcacacag gtacacgcag gcacacacgt acagaggcac acacatgcac 119040 acacaggtat gcacatgcac gcacacaggt acacacaggc acacctgcac acctgcacat 119100 cctgagcagc ctcttccccg gctgtcgtgg tgaccgctgt ccctgttcca tccagagcct 119160 gctccccaca gcctggcccg tgaccccagc atctcccact ctgtgctgca ctccctgcct 119220 tgccttgctg ggccctgggg ggcccctcac tgccctcacc catcgctgcc ggccttcagg 119280 accctggagg cagcactggc tgtggactct cctgtcccca ctctgcgtcc cagttcctca 119340 cctgtggagg aacccctgag ctctgtgccc tcgagctgtg aagcccctgt ccagctccca 119400 gtctcaccgc acccagccac cgagaccttg ctccttgcac acagctcgtt cctgcccagc 119460 tccccccagg gcctctgagc tgcctgtggc cccctgccaa ggcccccacc tcaaggcacc 119520 cccagcatgt ccaaaacagg cccatctctt gttccccccg gggatctggg ctcacagcct 119580 cacaccctcc gaccttcctg ggctcctacg ctgcgcatcc ttctgctcta gggcatctct 119640 tggagccaac ccacccactt cccactccca ggaccctcag ccgggaggct gtcagctcct 119700 ttcccctgcc ccgtgtcttt gtaagaacct cccaacctgt cccccaccct catctcacgg 119760 gcacggggga cacaggaggc aggaagggga ctttctgtag gacctcatgg agggtgatga 119820 gggccagaga cagagccgca gtgggtggag gcagcagagc cggcacgagg gtgtccagga 119880 gctgggactg gcccagaggt ttccgcacgg agcacctgac acctgttttt ctccgacgtt 119940 tcccattgcc ttaagaacga gggactctga ataaatccgt gtgtctctcc cagctcttcc 120000 ccatggttga ggagatcatg ctgcagccac tttgggaatc ccgagatcgc tacgaggagc 120060 tgaagcggat agatgacgcc atgaaagagg taaaacacac tgagaagagc ctgccttcct 120120 tgcggcaagc aggcacgctg ccctccgcac tcccgactcc agaagcttgg acgtgccaag 120180 cagggcacca ctgaaggccc cgtggacagg cacacgtgta ccttccatca gaaagcctgg 120240 ctcagtaaaa ttagggaatg cgatgaggga aaccaaaact gcattcgcca agaacacgtc 120300 aggtctcagt accttcgagg gagtttactg gccgtgccct tcacaagaat cacaactgtc 120360 acccacacct gtggacaccc aggtgtcttt gggtgtatca gccgccgtta gagcatctgg 120420 gacccctcag agtacagtgc ctggcctggc cccagggctg acttgttcag aggaggccat 120480 ggggtagaaa ggggccctcc cctggcacgg ggacaaagcg accacccacc tgccagctcc 120540 cgggcccaga acacacaccg gcacctctca ggggccaggg agcctggggc tggctttagg 120600 ttgctgctgg atagatatca ttttggagga aggggtccag gtcacagcct cagggcccac 120660 gcagtctttc tacggattcc ccacggctgt ctgctgtcct gctgcccatg gtgtggcctc 120720 tgcccctccc agcctcctgc ctcctccctc cagcgccccc aggcagctag aacagtctta 120780 ctactcctgc agggtttgac ccctcctggc cttggccggt gttgcctctg ccacccccgc 120840 tccccacagt gccactgaag caccctccaa ggcccgtcag tcagggctcc cctagttact 120900 gtgcccacca ccccgtcttt tctgcctggg cgctcctgaa gcccatgtgg cccacaatgc 120960 ccttttgagc actgagccat tttccaggcg tagccttggg ttggtctcat ctccctcgac 121020 tgacggcccc gtgctcccca tgcccacacc cgcctggagc gccatgccag gcacatggta 121080 ggcgctcagc aattgcttag gagtccactg aaaatccaga ccagctgccc tgacttctcc 121140 agttgatgtc tcctactgga aagtcacaga aaggtctcta aacctctgga aggctgagag 121200 cacttatgca gagggacaga tgtagcaaga aggcttcccc cactccacaa ccccgcaaga 121260 gagctgaagg ggcttctgcc tctctcgtgg gccctccgag agccatagcc ctgatggcct 121320 tgagtctcta gtcctgagcc ctgctgccca gtaggggata gtagggttcc ttaaggcctc 121380 tgccttcccc cctgtcagcc cccacaaaaa ggagagacac gccaaagagg tgaaaaggcc 121440 aagcccaagc cgcaggctct gcacacacca ccagtccccg cggctgtggt ggctgcagct 121500 gggtgagctc actgtccagg ccccagatga ggcaccaagg gtagcgggac agggtatgca 121560 gagctgcctc tgaaaagccc atgtcaggag tgcttgggct cagaggggct ggggaccaca 121620 ggctttcacg ttgcagcacc tccaggcaac agaagctgct gggagagagg cagacactcc 121680 cctgctgtct cctgctccct gacttggcct tctctgtact ctgttccagt tacagaagaa 121740 gactgacagc ttgacgtctg gggccaccga gaagtccaga gagagaagca gagatgtgaa 121800 aaacagtgaa ggtaatgctt gctctgctga agtggcatct cagcgcatac aatgattctg 121860 acaaaggaca gaaggaaaga ggaaggggag aaaatctgaa ttttggaata cctttaaatg 121920 aatggaactt tttttttttt tgaaactaag tctcgctctt gttgcccagg ttggagtgcg 121980 atggcacgat ctcagctcac tacaacctct gtctcctgag ttcaagtgat tctcctgcct 122040 cagcccccta agtagctggg attacaggca tgagccacca tgcctggcta gtttttctat 122100 ttttagtaga gatggggttt caccatgttg gccaggctgg tcttgaactc ctgacctcag 122160 gtgatccacc cacctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggtgtgaga ttgcgcctga 122220 ccaaatgaat ggaaatttta tttcttgcaa ctaatcatta gaattaggct cttaaggctg 122280 gtggctcatg cctgcaatcc cagcactttg ggaggccaag gtgggcggat cacttgaggt 122340 caggagttca agacccagct tggccaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa 122400 aaattagcca ggtgttgtgg cgtgcacctg tagtcccagc tacttgggag gctgaggcag 122460 gagagtcact tgaacctggg aggtggaggt tgcagtgagc ccacattgcg ccactgccct 122520 ccagcctgga gaacagtgag actccatctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gtgaggctct 122580 taaagaaggg gaacatgctt tagttaatag aaaaacatca ataattagca tatgtatcac 122640 ttataagagt aagtactttt taaaagtgca attgaagtac tgaaaacttt tcacaaatca 122700 cgtgtttgct ttatatggct ttgagcattt tcctctgtac ttgttgatac tagtcattca 122760 gctcacgggg aatgcagagc agccgtttgt tcacctcata ataaggtcac actaatggcc 122820 aggcacggtg gctcacgcct gtaatccaag cactttggga ggccaaggcg gcggatcacg 122880 aggagatcga gaccatcctg gctaacacgg tgaaaccccg tctctacttt aaacacaaaa 122940 aattagccgg gcgtggtggc gggtgcctgt agtcccagct acttgagagg ctgaggcagg 123000 agaatggagt gaacccagga ggcggagatt gccgtgagcc aagatcgcgc cactgcactc 123060 cagcctgggc aacagagcga gacttcgtct caaaaaataa aaataaataa ataagccggg 123120 cgcagtggct catgcctgta gtcccagcac tttgggaggc caaggtggac ggatcacaag 123180 gtcaggagat cgagaccatc ctggctaaca cggtgaaacc cttctctact aaaaatacaa 123240 aaaaaattag ccgggcgtgg tggtgggtgc ctgtattccc agctactcgg gaggctgagg 123300 cggagcttgc agtgagccaa gatcgtgcca ctgcactcca gcctgggtga cagagcgaga 123360 ctctgtctca aaaaaaatat aaataaataa gtaaataata aataaggtca gactccatct 123420 caaaaaaata taaataaata aataaacaat aaataaggtc acactctcca tgtctaacag 123480 ataattcaag agatagtgca tcaagcatgc aaggctcagg gcaggacaaa cgggacatgg 123540 ctcataagag gagctgcaac aggctttggc atccaacaca cctggttttg agtccaggct 123600 tgccaattac aagccgagag atgtgcacaa gtgtcccagc ctctctgaac ctcagagccc 123660 cagtctctaa gccagaggca ataataccat tgttactgct gttttagtga ttaaacagtc 123720 aaagtgcttg tctggtcccg atgaagtgct cagtcaatgt tgccatttaa tttttaagtc 123780 agttcatatt tttcagtggg tcagaaaaga gatcaatatt gttttacttt gtctaaatgt 123840 gttcagcaat atatctgatg gcctctttct tttaaaatgg tctgtgtgtc ggccgggcac 123900 ggtggttcac acctgtaatc ccagaacttt gggaggctga ggtgggcaga tcacttgagg 123960 tcaggagttc taaaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc catctctact aaaaacacaa 124020 aaattagcca gctgtagtgg cgtgcacctg taatcccagc tacttgggag ccagaggcag 124080 gagaattgct tgaacccagg aggcggaggt tgcagtgagc cgagatcacg ccactgcacc 124140 ccaacctggg caacagagca agactccatc tcaaaaaaaa aaaaaaaagt ctgtgtataa 124200 tcctgtaacg tttctgcgac tgctggcact tttttttttc cttcttttgt gagacggagt 124260 ctcgctctgt tgcccaggct ggagtgcagt ggtgcaatct cggctcactg caatctccac 124320 ctcccgggtt caagcaattc tcctgtctca gcctcccgag tagctgggat tacaggtgtg 124380 tgccaccacg cctggctaat ttttctattt ttagtagaga cagggtttca ccatgttggt 124440 cagcctggtc tcgaactcct gacctcgtga tccacccacc ttggtctctc aaagtgctgg 124500 gattaaaggt gtgagccacc gcgccctaat tctaacaaaa acaaatcagt catcgtttcc 124560 cttcttccag gagactgtgc ctgaggaaag cggggggcgt ggctgcagtt ctggacgggc 124620 tggccgagct gcgcgggatc cttgtgcagg gaagagctgc cctgggcacc tggcaccaca 124680 agaccatgtt ttctaagaac cattttgttc actgatacaa aaaaaaaaaa aggaattcat 124740 gatgctgtac agaattttat ttttaaactg tcttttaaat aatatattct tatacggaaa 124800 tgggtactgt acttcttctt tggtagagtt gtgtatgctg cttccggtaa gttctctcat 124860 ggagacgaag gacactgtgc ttttccccca gatgtatctt agagcaattg accagtgtga 124920 tgcggtgcgt acgtccctgt aaattcagca ttaaatgtca gcacggtgcc ctgagtgcaa 124980 ggacatgcac gggtcctgtg 125000 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 45 gcagagcgac cgtgagaag 19 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 46 aggacaaact tgatgaaccc aatc 24 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence <400> 47 cctgtggcac cgttcatgga ccgagactca cagg 34 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 48 gcagcatgag aagtccaaga 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 49 tgtatgtgcc accgtgaaac 20 <210> 50 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence <400> 50 tcggtttctc ccaagctctc tccagtgata aaccga 36

Claims (24)

  1. 호르몬-내성 전립선 암을 진단하거나, 모니터링하거나, 예측하기 위한 또는 호르몬-내성 전립선 암으로의 진행을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하거나, 예측하기 위한 데이터 획득 방법으로서,
    상기 방법은 호르몬-민감성 전립선 암과 호르몬-내성 전립선 암을 구별하고,
    (a) 샘플 중의 포스포디에스테라제 9A(PDE9A)의 수준을 측정하는 단계;
    (b) 샘플 중의 표준 유전자(reference gene)의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화(normalizing)하는 단계; 및
    (d) 상기 정규화된 발현 수준을, 호르몬-민감성 전립선 암이 배제되도록 선택된 미리 결정된 컷오프(cutoff) 값과 비교하는 단계(여기서, 컷오프 값 미만의 정규화된 발현 수준은 호르몬-내성 전립선 암을 나타내며, 여기서 상기 컷오프 값은 2 내지 15이다)
    를 포함하는, 방법.
  2. (a) 샘플에서 PDE9A의 수준을 측정하는 단계;
    (b) 샘플에서 표준 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (c) 측정된 PDE9A의 발현 수준을 표준 유전자의 발현에 대해 정규화하는 단계; 및
    (d) 정규화된 발현 수준을 호르몬-민감성 전립선 암이 배제되도록 선택된 미리 결정된 컷오프 값과 비교하는 단계(여기서, 컷오프 값 미만의 정규화된 발현 수준은 호르몬-내성 전립선 암을 나타내며, 여기서 상기 컷오프 값은 2 내지 15이다)를 포함하는, 호르몬-민감성 전립선 암과 호르몬-내성 전립선 암을 구별하기 위한 면역분석법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 발현의 상기 측정이 핵산 또는 단백질 수준의 측정에 의해, 또는 PDE9A 또는 표준 유전자의 생물학적 활성의 측정에 의해 달성되거나, 추가로 달성되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 측정된 핵산 또는 단백질 수준 또는 측정된 생물학적 활성을 대조군 수준과 비교하는 추가의 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제1항, 제3항 및 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 표준 유전자가 β-액틴, 글리세린알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 포르포빌리노겐 데아미나제(PBGD), 리보솜 단백질 P1, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, 및 PDE4D9로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  6. 제1항, 제3항 및 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 전립선 특이적인 항원(PSA)의 수준을 측정하는 추가의 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 증가된 수준의 PDE9A 발현 및 2.5ng/ml 초과 내지 10 ng/ml 이하의 증가된 수준의 PSA로 분류되거나 시험된 개체가 악성, 호르몬 민감성 전립선 암을 앓고 있는 것으로 확인되고, 감소된 수준의 PDE9A 발현 및 10 ng/ml 초과의 증가된 수준의 PSA를 갖는 것으로 분류되거나 시험된 개체가 호르몬 내성 전립선 암을 앓고 있는 것으로 확인되는, 방법.
  8. 제1항, 제3항 및 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 조직 샘플, 요(urine) 샘플, 요침사(urine sediment) 샘플, 혈액 샘플, 타액 샘플, 정액 샘플, 순환성 종양 세포를 함유하는 샘플, 또는 전립선 분비된 엑소좀을 함유하는 샘플인, 방법.
  9. 제2항에 있어서, 전립선 특이적인 항원(PSA)의 수준을 측정하는 추가의 단계를 포함하는, 면역분석법.
  10. 제9항에 있어서, 증가된 수준의 PDE9A 발현 및 2.5ng/ml 초과 내지 10 ng/ml 이하의 증가된 수준의 PSA로 분류되거나 시험된 개체가 악성, 호르몬 민감성 전립선 암을 앓고 있는 것으로 확인되고, 감소된 수준의 PDE9A 발현 및 10 ng/ml 초과의 증가된 수준의 PSA를 갖는 것으로 분류되거나 시험된 개체가 호르몬 내성 전립선 암을 앓고 있는 것으로 확인되는, 면역분석법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 샘플이 조직 샘플, 요 샘플, 요침사 샘플, 혈액 샘플, 타액 샘플, 정액 샘플, 순환성 종양 세포를 함유하는 샘플, 또는 전립선 분비된 엑소좀을 함유하는 샘플인, 면역분석법.
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