KR20130048240A - Ｐｃｂｐ―１ 항원에 대한 모노클로날 항체, 및 그의 용도 - Google Patents

Ｐｃｂｐ―１ 항원에 대한 모노클로날 항체, 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCBP-1 항원에 대해 특이적이거나 우선적으로 선택적인 모노클로날 항체 (MoAb 또는 mAb), 이러한 PCBP-1 항체 또는 항체 단편을 분비하는 하이브리도마 세포주, 및 PCBP-1 항원, 특히 암 세포에 의해 발현하는 상기 항원을 검출하기 위한 이같은 항체 및 항체 단편의 용도를 제공하고, 이들을 포함한다. 본 발명은 가용성 형태의 PCBP-1에 대해 특이적이거나 이에 대한 우선적인 결합을 나타내는 항체를 또한 포함한다. 추가로 본 발명은 키메라 및 인간화 항체, 재조합 DNA 기술을 사용하여 모노클로날, 키메라 및 인간화 항체를 생산하는 방법, 및 그의 치료 용도, 특히 암 진행의 치료 또는 진단에서의 용도를 포함한다. 추가로 본 발명은 PCBP-1 항원을 발현하는 샘플에 대한 세포의 면역검출 및 면역요법을 위한 방법 및 키트를 포함한다.

Description

ＰＣＢＰ―１ 항원에 대한 모노클로날 항체, 및 그의 용도{MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PCBP-1 ANTIGENS, AND USES THEREFOR}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2010년 7월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/364,362를 우선권으로 청구하고, 이는 본원에 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록
크기가 258,048 바이트이고, 2010년 7월 14일에 생성되었으며, 본원에 전문이 참고로 포함되는 파일명 P33725WO00.txt의 파일을 포함하여 서열 목록은 이에 의해 전문이 참고로 포함된다.
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 PCBP-1 항원에 대해 특이적이거나 우선적으로 선택적인 모노클로날 항체 (MoAb 또는 mAb), 이러한 PCBP-1 항체 또는 항체 단편을 분비하는 하이브리도마 세포주, 및 PCBP-1 항원, 특히 암 세포가 발현하는 것을 검출하기 위한 이같은 항체 및 항체 단편의 용도를 제공하고, 이들을 포함한다. 본 발명은 가용성 형태의 PCBP-1 (sPCBP-1)에 대해 특이적이거나 이에 대한 우선적인 결합을 나타내는 항체를 또한 포함한다. 추가로 본 발명은 키메라 및 인간화 항체, 재조합 DNA 기술을 사용하여 모노클로날, 키메라 및 인간화 항체를 생산하는 방법, 및 이러한 항체의 치료 용도, 특히 암 처치에서의 용도를 포함한다. 추가로 본 발명은 본 발명의 PCBP-1 항원을 발현하는 샘플에 대한 세포의 면역검출 및 면역요법을 위한 방법 및 키트를 포함한다.
2. 배경
인간 암종 종양 항원 중 하나는 PCBP-1 (폴리(rC) 결합 단백질-1)이다. Pcbp-1은 완전히 프로세싱된 PCBP-2 mRNA의 역전위(retrotransposition)에 의해 생성된 것으로 보고된, 인트론이 없는 인간 유전자이다. 이는 2번 염색체 (70.17-70.17 Mb) 상에 위치하는 것으로 또한 보고된다. Pcbp -1 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 보고된 다기능적 단백질이다. PCBP-1은, PCBP-2 및 hnRNPK와 함께, 주요 세포성 폴리(rC)-결합 단백질을 형성하는 것으로 보고된다. Pcbp -1의 서열이 분석되었다. 유니프롯(UniProt) Q15365, Q53SS8, Q14975; OMIM 601209; NCBI 유전자(Gene) 5093; NCBI 기준서열(RefSeq) NP_006187; NCBI 기준서열 NM_006196, NP_006187; NCBI 유니진(UniGene) 5093; 및 NCBI 등록 번호 AK130439, AAA91317 참조. 마우스 (NCBI 유니진 23983; 유니프롯 P60335; 및 NCBI 기준서열 NM_011865, NP_035995 참조), 개 및 래트에서의 Pcbp -1의 상동체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 Pcbp -1의 상동체들이 또한 보고되어 있다.
PCBP-1은 소수의 개별적인 프로모터로부터의 전사를 조절하는 것으로, HIV-1 및 폴리오바이러스의 대사 및 유전자 발현에 중요한 것으로, 그리고 시험관 내에서 및 생체 내에서 IRES-매개 번역 개시를 자극하는 것으로 또한 보고되었다 (문헌 [Mitchell et al., 2003]). 이는 노인 개체들의 표피에서 약간 증가되는 것으로 또한 보고되었다 (문헌 [Gromov et al., Mol Cell Proteomics 2(2):70-84, 2003]).
1개 또는 2개의 양성 결절이 있는 여성의 유방암-특이적 생존율은 장기 생존 가능성이 유사한 것으로 발견되었다; 그러나, 양성 결절이 3개인 여성은 결절이 1개 또는 2개인 이들에 비교하여 유의하게 감소된 생존을 겪었다. (문헌 [Tai, P., et al., Prognostic Significance of Number of Positive Nodes: A Long-Term Study of One to Two Nodes Versus Three Nodes in Breast Cancer Patients, International Journal of Radiation Oncology; 77 (1) p. 180-187 (May 2010)]). 따라서, 특히 양성 결절이 3개 이상인 여성에 대해, 림프절 상태를 넘어서는, 전체 생존의 추가적인 분자 마커가 요구된다. 임의의 림프절이 수반되는 여성에서의 관상 유방암의 전이 상태를 결정하기 위한 분자 마커가 또한 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 PCBP-1의 세포내 위치(subcellular location)를 결정하는 단계이며, 이때 샘플의 세포 세포질에서의 상기 PCBP-1의 국소화가 세포성 전이를 지시하는 것인 단계를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 PCBP-1의 세포내 위치를 결정하는 단계이며, 이때 PCBP-1과 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 또는 ER 및 PR의 세포내 공동-국소화의 부재가 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법을 포함한다. 이러한 측면에서, 공동-국소화의 부재는 PCBP-1 염색이 관상 유방암 세포 세포질에 존재하는 경우의 ER 또는 PR 염색의 결여를 포함할 수 있다.
본 발명은 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; 및 PCBP-1의 발현 수준을 결정하는 단계이며, 이때 샘플 내의 상기 PCBP-1의 더 많은 발현이 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 유방암 환자에 대한 생존 가능성을 결정하는 방법을 포함한다.
본 발명은 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 pcbp-1을 검출할 수 있는 DNA 프로브와 접촉시키는 단계; 및 pcbp -1의 염색체 국소화를 결정하는 단계이며, 이때 샘플에서의 상기 pcbp -1의 2개 초과의 카피의 검출이 전체 생존과 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 유방암 환자에 대한 생존 가능성을 결정하는 방법을 포함한다.
본 발명은 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 조직 시료를 본 발명의 PCBP-1 항체 또는 그의 항체 단편과 접촉시키는 단계, 및 상기 조직 시료를 면역조직화학 염색으로 염색하는 단계를 포함하는, Pcbp -1 및 그의 상동체의 유전자 산물의 발현을 특징으로 하는 질환을 앓고 있는 환자의 생존 가능성을 결정하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 세포의 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항원의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 세포의 상태를 결정하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 세포의 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항원의 국소화를 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 세포의 상태를 결정하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 환자로부터 수득된 샘플 내의 PCBP-1의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 결정하는 단계; (b) 상기 유방암이 관 암종인지 또는 소엽성 암종인지를 결정하는 단계; (c) 상기 유방암이 HER2-양성인지 또는 HER2-음성인지를 결정하는 단계; (d) 상기 유방암이 에스트로겐 수용체-양성인지 또는 에스트로겐 수용체-음성인지를 결정하는 단계; 및 (e) 상기 유방암이 프로게스테론 수용체-양성인지 또는 프로게스테론 수용체-음성인지를 결정하는 단계를 포함하는, 유방암 진단을 필요로 하는 환자에서 유방암을 진단하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 환자로부터의 시료를 서열 45, 서열 46 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 갖는 모노클로날 항체와 접촉시킴으로써, 상기 시료 내에 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계; 시료를 항원-항체 복합체에 대해 특이적인 표지로 표지하는 단계; 및 (d) 항원-항체 복합체의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 검출하는 단계를 포함하는, 유방암의 세포병리학의 결정을 필요로 하는 환자에서 유방암의 세포병리학을 결정하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 시료를 서열 45, 서열 46 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 갖는 모노클로날 항체와 접촉시킴으로써, 상기 시료 내에 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계; 시료를 항원-항체 복합체에 대해 특이적인 표지로 표지하는 단계; (b) 항원-항체 복합체의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 검출하는 단계; 및 (c) 항원-항체 복합체의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 상기 환자 내에 존재하는 유방암의 유형과 상관시키는 단계를 포함하는, 유방암 시료가 유방 관 암종으로부터의 것인지 또는 유방 소엽성 암종으로부터의 것인지를 결정하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 시료를 서열 45, 서열 46 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 갖는 모노클로날 항체와 접촉시킴으로써, 상기 시료 내에 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계; 시료를 항원-항체 복합체에 대해 특이적인 표지로 표지하는 단계; 및 (b) 항원-항체 복합체의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 검출하는 단계를 포함하는, 유방암 시료가 유방 관 암종으로부터의 것인지 또는 유방 소엽성 암종으로부터의 것인지를 결정하기 위한 면역검정법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 샘플을 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; (b) 상기 항원의 국소화를 결정하는 단계; 및 (c) 상기 항원의 국소화를 유방 관 암종 또는 유방 소엽성 암종과 상관시키는 단계를 포함하는, 유방암 샘플이 유방 관 암종인지 또는 유방 소엽성 암종인지를 결정하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 샘플을 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; (b) 상기 항원의 수준을 결정하는 단계; 및 (c) 상기 항원의 수준을 유방 관 암종 또는 유방 소엽성 암종과 상관시키는 단계를 포함하는, 유방암 샘플이 유방 관 암종인지 또는 유방 소엽성 암종인지를 결정하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 환자로부터 수득된 샘플 내의 PCBP-1의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 결정하는 단계; (b) 상기 유방암이 관 암종인지 또는 소엽성 암종인지를 결정하는 단계; (c) 상기 유방암이 HER2-양성인지 또는 HER2-음성인지를 결정하는 단계; (d) 상기 유방암이 에스트로겐 수용체-양성인지 또는 에스트로겐 수용체-음성인지를 결정하는 단계; 및 (e) 상기 유방암이 프로게스테론 수용체-양성인지 또는 프로게스테론 수용체-음성인지를 결정하는 단계; 및 (f) 상기 환자에게 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 유방암 치료를 필요로 하는 환자에서 유방암을 치료하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 (a) 유방암이 관상인지 또는 소엽성인지를 결정하는 단계; 및 (b) 상기 유방암이 관상인지 또는 소엽성인지를 기초로 적합한 치료를 선택하는 단계를 포함하는, 치료 선택을 필요로 하는 환자에 대해 치료를 선택하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 a) 전이-전(pre-metastatic) 종양 세포의 확인을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 샘플의 세포 내의 상기 PCBP-1의 세포내 위치를 결정하는 단계이며, 이때 상기 세포의 세포 세포질에서의 상기 PCBP-1의 국소화가 전이-전 종양 세포의 존재를 지시하는 것인 단계를 포함하는, 조직 샘플 내의 전이-전 종양 세포를 확인하는 방법을 또한 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 혈장 필라민-A 수준을 효소-결합 면역흡착 효소 검정법으로 측정하였다. 숫자는 필라민-A 수준에 대한 혈장 판독치의 광학 밀도 (OD) 값을 나타낸다. 맨-휘트니(Mann Whitney) 테스트를 사용하여 P-값이 유도되었고, 이는 대조군과 비-전이성 군과 전이성 군 사이의 유의한 차이를 나타냈다 (p<0.001). ANOVA에 의한 대조군과의 비교에 의해 P 값이 결정되었다. 데이터는 삼중으로 수행된 4개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 2. 유방암 환자로부터의 혈장 샘플을 항-PCBP-1 모노클로날 항체를 사용하여 ELISA 분석에 적용하였다. 숫자는 PCBP-1 수준에 대한 혈장 판독치의 광학 밀도 (OD) 값을 나타낸다. 맨-휘트니 테스트를 사용하여 P-값이 유도되었다. 대조군과 전이성 군은 유의한 차이를 나타냈다 (p<0.001). 대조군과 비-전이성 군은 유의한 차이를 나타내지 않았다. 비-전이성 군과 전이성 군 사이에 유의한 차이가 있었다 (p<0.001). ANOVA에 의한 대조군과의 비교에 의해 P 값이 결정되었다. 데이터는 삼중으로 수행된 4개의 독립적인 실험을 대표한다. 도 2a는 이중 ELISA 결과의 막대 그래프이다. 도 2b는 평균화된 ELISA 결과의 박스 플롯(box plot)이다.
도 3. 인간 정상 유방 상피 세포 (HMEC), SKBR3 세포 (인간 비-전이성 유방암 세포) 및 MDA-MB-231 세포 (인간 전이성 유방암 세포)를 유리 슬라이드 상에 시딩(seeding)하고 성장시켰다. 세포를 포르말린 (10％ + 0.1％ 트리톤(Triton)-X)으로 고정하고, PBS로 세척하고, 항-PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로 염색하였다. 그 후, 세포를 FITC-표지 2차 염소-항-마우스 항체로 표지하고, 레이저 공초점 현미경검사에 적용하였다. 간접적 면역형광 염색이 HMEC의 세포질에서 관찰되었다. SKBR3 세포는 세포질 및 핵 염색을 나타냈다. MDA-MB-231 세포는 세포질 염색을 나타냈다.
도 4. 건강한 대상체 및 자궁경부암 환자의 팹(pap) 도말 표본으로부터 수득된 자궁경부 세포를 유리 슬라이드 상에 시딩하고 성장시켰다. 세포를 포르말린 (10％ + 0.1％ 트리톤-X)으로 고정하고, PBS로 세척하고, 항-PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로 염색하였다. 그 후, 세포를 FITC-표지 2차 염소-항-마우스 항체로 표지하고, 레이저 공초점 현미경검사에 적용하였다. 간접적 면역형광 염색이 정상 자궁경부 세포의 세포질 및 핵에서 관찰되었다. 자궁경부암 세포 (CIN III)는 세포질 염색만 나타냈다.
도 5. 약 2 ㎍의 정제된 알퍼(Alper) PCBP-1 마우스 mAb (7SK로 식별됨)를 PBS에 현탁시키고, 비-환원 조건 (끓이지 않고, 베타-메르캅토에탄올이 없음) 및 환원 조건 (10％ SDS 및 베타-메르캅토에탄올 + 샘플 완충제에서 3분 동안 끓임) 하에 6％ 및 8％ 트리스(Tris)-글리신 겔에 적용하고, 120 볼트에서 러닝(running)시켰다. 그 후, 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue) (0.1％ (w/v) 쿠마시 블루 R350, 20％ (v/v) 메탄올, 및 10％ (v/v) 아세트산)로 염색하고, 수중 50％ (v/v) 메탄올 + 10％ (v/v) 아세트산으로 염색을 제거하고, 겔의 영상을 찍었다. 분자량 마커가 오른쪽에 제시된다. 6％ 트리스-글리신 겔은 비-환원 조건 하에 약 150 kDa에서 알퍼 PCBP-1 마우스 IgG1 항체 (7SK)를 나타냈다 (도 5A). 8％ 트리스-글리신 겔은 약 50 kDa에서 알퍼 PCBP-1 마우스 IgG1 항체 (7SK)의 중쇄를 나타냈다 (도 5B).
도 6. 약 1 ㎍의 정제된 알퍼 PCBP-1 마우스 mAb (7SK로 식별됨)를 PBS에 현탁시키고, 환원 조건 (10％ SDS 및 베타-메르캅토에탄올 + 샘플 완충제에서 3분 동안 끓임) 및 비-환원 조건 (끓이지 않고, 베타-메르캅토에탄올이 없음) 하에 8％ 트리스-글리신 겔에 적용하고, 120 볼트에서 러닝시켰다. 그 후, 겔을 쿠마시 블루 (0.1％ (w/v) 쿠마시 블루 R350, 20％ (v/v) 메탄올, 및 10％ (v/v) 아세트산)로 염색하고, 수중 50％ (v/v) 메탄올 + 10％ (v/v) 아세트산으로 염색을 제거하고, 겔의 영상을 찍었다. 분자량 마커가 왼쪽에 제시된다. 변성 조건 하에, 알퍼 PCBP-1 마우스 IgG1 Ab (7SK)의 중쇄가 약 50 kDa에서 검출되고, 알퍼 PCBP-1 마우스 IgG1 (7SK)의 경쇄가 약 25 kDa에서 검출되었다. 비-환원 겔에서는, 150 kDa에서 무손상 알퍼 PCBP-1 마우스 IgG1 (7SK)가 검출되었다.
도 7. SKBR3 세포를 10％ 글루타르알데히드로 고정하고, 0.1％ 트리톤-X100으로 투과성이게 만들었다. 그 후, PCBP-1 발현을 알퍼 PCBP-1 마우스 mAb (7SK) 및 2차 FITC-표지 항-마우스 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베이니아주 웨스트 그로브)로 가시화하였다. DAPI 염색 (몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes), 오리건주 유진)으로 핵을 가시화하였다. 63× 대물 렌즈가 장착된 올림푸스(Olympus) 현미경을 사용하여 영상을 분석하였다.
도 8a 내지 8c. 대조군 및 환자 군으로부터 수득된 혈장 샘플 (C: 대조군 유방 혈액 샘플, NM: 비-전이성 유방 혈액 샘플, M: 전이성 유방 혈액 샘플)을 PBS로 1:100의 비로 희석하였다. 혈장 PCBP-1 수준을 효소-결합 면역흡착 효소 검정법으로 측정하였다. ELISA 플레이트 (날지 눈크 인터내셔널(Nalge NUNC International), 뉴욕주 록체스터)를 100 ㎕/웰의 희석된 혈장으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 혈액 혈장 샘플을 맹검 방식으로 분석하였다. 웰을 PBS로 세척하고, 차단 완충제 (PBS 내의 5％ BSA)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 희석 완충제 (PBS 완충제, 1％ BSA, 0.01％ 트윈(Tween)-20) 내의 1차 항체 7SK (클론 명칭: 알퍼-pCBP-1) (45 ㎍/㎖)를 첨가하였다. 웰을 PBS/0.03％ 트윈-20으로 세척하고, 100 ㎕/웰의 1:3000으로 희석된 2차 항체 (HRP-당나귀 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노리서치, 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 후, 100 ㎕의 이뮤노퓨어(Immunopure) TMB 기질 용액 (피어스(Pierce), 일리노이주 록퍼드)을 첨가하였다. 100 ㎕/웰의 1N H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, ELISA 판독기로 분석을 수행하였다. 숫자는 PCBP-1 수준에 대한 혈장 판독치의 광학 밀도 (OD) 값을 나타낸다.
도 9a 내지 9c. 대조군 및 환자 군으로부터 수득된 혈장 샘플 (C: 대조군 유방 혈액 샘플, NM: 비-전이성 유방 혈액 샘플, M: 전이성 유방 혈액 샘플)을 PBS로 1:100의 비로 희석하였다. 혈장 PCBP-1 수준을 효소-결합 면역흡착 효소 검정법으로 측정하였다. ELISA 플레이트 (날지 눈크 인터내셔널, 뉴욕주 록체스터)를 100 ㎕/웰의 희석된 혈장으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 혈장 샘플을 맹검 방식으로 분석하였다. 웰을 PBS로 세척하고, 차단 완충제 (PBS 내의 5％ BSA)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 희석 완충제 (PBS 완충제, 1％ BSA, 0.01％ 트윈-20) 내의 1차 항체 알퍼 PCBP-1 마우스 mAB (7SK) (클론 명칭: 알퍼-pCBP-1) (45 ㎍/㎖)를 첨가하였다. 웰을 PBS/0.03％ 트윈-20으로 세척하고, 100 ㎕/웰의 1:3000으로 희석된 2차 항체 (HRP-당나귀 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노리서치, 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 후, 100 ㎕의 이뮤노퓨어 TMB 기질 용액 (피어스, 일리노이주 록퍼드)을 첨가하였다. 100 ㎕/웰의 1N H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, ELISA 판독기로 분석을 수행하였다. OD로 광학 밀도가 표시되고, 이는 혈장 내의 PCBP-1 수준을 나타낸다. 시리즈 1-2는 대조군을 나타내고, 시리즈 3-4는 비-전이성 혈장 샘플을 나타내며, 시리즈 5-6은 전이성 혈장 샘플을 나타낸다. 1: 전이성, 2: 비-전이성, 3: 대조군 혈장 샘플.
도 10a 내지 10f. 다중 서열 정렬. PCBP-1 mAb (7SK)의 중쇄의 FWR 및 CDR이고, 이때가장 윗줄에서 제공된 폴리펩티드 서열 (서열 16)은 PCBP-1 mAb의 서열에 상응한다. 문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda (NIH Publication No. 91-3242)]의 관례를 사용하여 아미노산 잔기의 번호가 매겨진다. 밑줄친 텍스트에 기재된 볼드체 잔기는 특이성 결정 잔기 (SDR)를 가리킨다 (서열 17).
도 11a 내지 11f. 다중 서열 정렬. PCBP-1 mAb (7SK)의 경쇄의 FWR 및 CDR이고, 이때 가장 윗줄에서 제공된 폴리펩티드 서열은 PCBP-1 mAb의 서열에 상응한다. 문헌 [Kabat et al.]의 관례를 사용하여 아미노산 잔기의 번호가 매겨진다. 밑줄친 텍스트에 기재된 볼드체 잔기는 특이성 결정 잔기 (SDR)를 가리킨다 (서열 32).
도 12. PCBP-1 영역들 (서열 1-14)의 실험 질량, 계산 질량 및 서열.
도 13. 정상 대 암 조직에서 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 검출된 바와 같은 PCBP-1 발현 차트.
도 14. 소엽성 및 관 암종 환자로부터의 샘플의 면역조직화학 염색. YTMA 49-10 결절-양성/결절-음성 침습성 유방 암종 조직 마이크로어레이 (예일 암 센터 병리학과 조직 마이크로어레이 기관(Yale Cancer Center Department of Pathology Tissue Microarray Facility)로부터 수득됨)를 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로 염색하였다. 그 후, 샘플을 FITC-표지 2차 염소-항-마우스 항체로 표지하고, 레이저 공초점 현미경검사에 적용하였다. 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로의 염색량을 기초로 샘플에 값을 할당하였다 (0, 1+, 2+ 또는 3+). 높은 값 (2+ 또는 3+)의 간접적 면역형광 염색이 소엽성 암종 환자의 약 50％에서 관찰되었다. 높은 값의 간접적 면역형광 염색이 관 암종 환자의 약 70％에서 관찰되었다.
도 15. (A) 음성 (0), 낮은 값 (1+) 및 높은 값 (2+ 또는 3+)의 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로의 면역조직화학 염색을 나타내는 관 및 소엽성 암종 샘플의 개수. (B) 음성, 낮은 값 및 높은 값의 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로의 면역조직화학 염색을 나타내는 관 및 소엽성 암종 샘플의 개수의 그래프. 소엽성 암종 환자에서에 비해 더 높은 백분율의 관 암종 환자가 높은 수준의 PCBP-1을 발현하였다.
도 16. 음성 (0)의 알퍼 항-PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로의 면역조직화학 염색을 나타내는 방광 조직 샘플의 예.
도 17. 낮은 값 (1+) 및 높은 값 (2+ 또는 3+)의 알퍼 항-PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로의 면역조직화학 염색을 나타내는 소엽성 암종 샘플의 예.
도 18. 낮은 값 (1+) 및 높은 값 (2+ 또는 3+)의 알퍼 항-PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로의 면역조직화학 염색을 나타내는 관 암종 샘플의 예.
도 19. 인간 유방암 세포주에서의 PCBP-1에 대한 FISH 분석: 전이성 MDA 231 세포주, 전이성 C2T2 세포주, 및 비-전이성 SK-BR 3 세포주.
도 20. 더 높은 PCBP-1 발현 수준이 관상 유방암 환자의 전체 생존의 감소와 상호관련된다.
도 21. 양성 림프절이 3개를 초과하는 환자로부터의 더 높은 PCBP-1 발현 수준이 이러한 관상 유방암 환자의 전체 생존의 감소와 상호관련된다.
도 22. 관 침습성 유방 암종 환자로부터의 전체 조직 샘플로부터의 ER 및 PCBP-1의 핵 세포내 국소화. 백색 막대는 50 ㎛ (20×) 및 10 ㎛ (60×)이다.
상세한 설명
1. 정의
항체: 이는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 헤테로 이뮤노글로불린 클래스에 속하는 단일쇄, 2쇄, 및 다쇄 단백질 및 당단백질을 지칭한다 (모노클로날 항체가 바람직함); 이는 이러한 이뮤노글로불린들의 합성 및 유전자 조작 변이체를 또한 포함한다. "항체 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 뿐만 아니라 원하는 표적 에피토프 또는 에피토프들에 대한 특이성이 있는 임의의 항체 일부분을 포함한다.
모노클로날 항체: 이는 모두 단일 모 세포의 클론들인, 한가지 유형의 면역 세포에 의해 생산되기 때문에 동일한 항체들을 지칭한다. 본 발명의 모노클로날 항체는 CDR들이 항원 결합 부위를 형성하고 있는 VH-VL 쌍을 함유하는, 무손상 모노클로날 항체, 항체 단편, 접합체, 또는 융합 단백질을 포함할 수 있다.
키메라 항체: 이는 2개의 상이한 항체 (전형적으로, 상이한 종의 것임)로부터 유래된 서열들을 포함하는 항체를 지칭한다. 가장 전형적으로, 키메라 항체는 인간 및 비-인간 항체 단편, 일반적으로는 인간 불변 영역 및 비-인간 가변 영역을 포함한다.
인간화 항체: 이는 모 항체의 항원-결합 성질을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하지만 인간에서 덜 면역원성인 인간 항체, 및 비-인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체 접합체, 융합 단백질, 및 이중특이적 항체: 이들은 화학적 방법에 의해 방사성핵종, 약물, 거대분자 또는 기타 작용제와 접합된 모노클로날 항체를 지칭한다.
항원: 이는 항체가 이에 결합할 수 있고 추가적으로 동물이 이러한 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하게 유도할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 지칭한다. 항원에는 1개 또는 1개 초과의 에피토프가 있을 수 있다. 상기에서 지칭된 특이적 반응은 항원이 고도로 선택적인 방식으로 그의 상응하는 항체와 반응할 것이고 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 다수의 다른 항체와는 그렇지 않을 것임을 가리키도록 의도된다.
에피토프: 이는 항체가 인식할 수 있고 결합할 수 있는, 임의의 분자의 일부분을 지칭한다. 일반적으로, 에피토프는 분자들, 예를 들어, 아미노산들 또는 당 측쇄들의 화학적으로 활성인 표면 배치(grouping)로 이루어지고, 특이적인 3차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성이 있다. 본 발명은 아미노산들을 포함하고 있는 에피토프를 포함한다.
상보성 결정 영역, 또는 CDR: 이는 천연 이뮤노글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 규정하는 아미노산 서열들을 지칭한다. 이뮤노글로불린의 경쇄 및 중쇄에는 각각 3개의 CDR이 있다. 정의에 의하면, 문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda (NIH Publication No. 91-3242)]에 서술된 번호매김 관례를 사용하여, 경쇄의 CDR들은 위치 30 및 34 (CDR1), 49 및 65 (CDR2), 75 및 88 (CDR3)의 잔기에 의해 경계지워지고; 중쇄의 CDR들은 위치 22 및 36 (CDR1), 52 및 58 (CDR2), 및 70 및 77 (CDR3)의 잔기에 의해 경계지워진다.
프레임워크 영역 또는 FWR: 이는 CDR들 사이에 개재된 아미노산 서열들을 지칭한다. 항체의 이러한 부분은 CDR들을 항원 결합을 위한 적합한 배향으로 유지시키는 구실을 한다.
특이성 결정 잔기, 또는 SDR: 이는 항원 접촉에서 직접적으로 수반될 수 있는 이뮤노글로불린의 아미노산 잔기들을 지칭한다.
불변 영역: 이는 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자의 일부분을 지칭한다. 중쇄 불변 영역은 5가지 이소형(isotype) 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다; 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤. 다양한 서브클래스의 중쇄 (예컨대 중쇄의 IgG 서브클래스)가 상이한 이펙터 기능들을 담당한다. 따라서, 원하는 중쇄 불변 영역을 선택함으로써, 원하는 이펙터 기능이 있는 인간화 항체가 생산될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 유형의 것일 수 있고, 바람직하게는 카파 유형이다.
면역원성: 수용자에게 투여되었을 때 면역 반응 (체액성 또는 세포성)을 이끌어내는 표적화 단백질 또는 치료 모이어티(moiety)의 능력의 척도. 본 발명은 PCBP-1에 대한 항체의 면역원성에 관련된다.
면역반응성: 특이적 항원을 인식하고 이에 결합하는 이뮤노글로불린의 능력의 척도.
PCBP-1 항체 또는 PCBP-1 mAb: 이는 PCBP -1 유전자 및 PCBP -1 유전자의 상동체의 발현 생성물에 대해 특이적인 항체를 지칭하고, 암 세포에 의해 생산된 변형된 형태의 이러한 발현 생성물에 대해 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 변이체, 예컨대 키메라 변이체, 인간화 변이체 및 당업자에게 공지된 기타 변이체를 포함할 수 있다. 그 때의 85％ 이상의 경우, 그 때의 90％ 이상의 경우, 또는 바람직한 측면에서는 그 때의 95％ 이상의 경우에 PCBP-1 항원에 대한 우선적인 결합을 나타낸다면 PCBP-1 항체가 PCBP-1 항원에 대해 특이적이라고 한다. 이같은 항체의 예는 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 (7SK)이다.
본 발명의 PCBP-1 항체는 PCBP-1 항원에 대해 특이적이고, 도 10a 내지 10f에 기재된 바와 같은 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 CDR1 (서열 45), CDR2 (서열 46) 및 CDR3 (서열 47), 및 도 11a 내지 11f에 기재된 바와 같은 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 CDR1 (서열 48), CDR2 (서열 49) 및 CDR3 (서열 50)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 PCBP-1 항체는 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 (서열 45-47), 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 (서열 48-50)을 포함할 수 있다.
본 발명은 항체 분자의 중쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자를 또한 포함하고, 이때 상기 항체 분자는 PCBP-1에 대한 특이성이 있고, 상기 중쇄의 가변 도메인은 도 10a 내지 10f에 기재된 항원 결합 부위 서열 CDR1 (서열 45), CDR2 (서열 46) 및 CDR3 (서열 47)이 있는 CDR을 포함한다.
본 발명은 항체 분자의 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자를 또한 포함하고, 이때 상기 항체 분자는 PCBP-1에 대한 특이성이 있고, 상기 중쇄의 가변 도메인은 도 11a 내지 11f에 기재된 항원 결합 부위 서열 CDR1 (서열 48), CDR2 (서열 49) 및 CDR3 (서열 50)이 있는 CDR을 포함한다.
PCBP-1 항원: 이는 PCBP-1 항체에 대한 항원, 표적 분자, 바이오마커 또는 이들의 임의의 조합물로서 사용될 수 있는, PCBP-1에 의해 생성된 발현 생성물을 지칭한다. PCBP-1 항원은 PCBP-1 유전자 또는 PCBP-1 유전자의 상동체에 의해 생산될 수 있고, PCBP-1 항원을 발현하는 세포, 예컨대 암 세포에 의해 도입된 다양한 변형을 포함할 수 있다.
실질적으로 유사한 결합 성질: 이는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 항체 단편을 생산하는데 사용된 모 PCBP-1 항체가 인식하는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 키메라 또는 인간화 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 바람직하게는, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 항체 단편의 친화도는 모 PCBP-1 항체의 친화도의 약 10％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 25％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 50％ 이상이다. 가장 바람직하게는, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 항체 단편은 모 PCBP-1 항체의 친화도의 약 75％ 이상인 항원-결합 친화도를 나타낸다. 항원-결합 친화도를 검정하는 방법이 당업계에 공지되어 있고, 최대-절반(half-maximal) 결합 검정법, 경쟁 검정법, 및 스캐차드(Scatchard) 분석이 이에 포함된다. 바람직한 측면에서, 경쟁 검정법을 사용하여 항원-결합 친화도를 검정한다. 이같은 비교는 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 (7SK)에 대해 상대적일 수 있다.
실질적으로 상동성임: 기준 이뮤노글로불린과 적어도 약 85％의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90％의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95％의 동일성을 나타내는 이뮤노글로불린 서열을 지칭하고, 이때 ％ 동일성은 2개의 이뮤노글로불린 사이의 동일한 아미노산 잔기의 개수를 비교함으로써 결정되고, 아미노산 잔기의 위치는 카바트(Kabat) 번호매김 체계를 사용하여 지시된다.
모노클로날 항체 생성물에 대한 동일성: 모노클로날 항체들 및 이들의 생성물의 동일성을 결정하기 위한 목적으로, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역이 모노클로날 항체 생성물의 주요 분자 구조 특색이다. CDR들의 아미노산 서열이 동일하다면, 또는 이들 사이에 미미한 아미노산 차이만 있다면, 2개의 모노클로날 항체가 동일한 것으로 간주될 수 있다. 아미노산 서열에서의 차이가 미미한 것인지 여부는 임의의 특정 잔기가 항원 결합에 중요한 것으로 확립되었는지 여부가 포함되는 (그러나 이에 한정되지는 않는) 요인들에 의해 결정될 수 있다. CDR들 외부에서의 아미노산 차이, 또는 글리코실화 패턴 또는 번역후 변형으로 인한 차이는 상이한 모노클로날 항체를 초래하지 않는다. 동일한 CDR이 있는 2개의 모노클로날 항체 생성물 사이의 차이를 구성하지 않는 항체 구조에서의 차이에는 FWR에서의 변화 (즉, 비-인간에서 유래된 모노클로날 항체를 인간화시키는 것, 또는 항원 접촉 또는 결합 부위 안정화에 중요한 특정 프레임워크 잔기를 조작하는 것), 또는 불변 영역에서의 변화 (즉, 불변 영역의 클래스 또는 서브클래스를 변화시키는 것, 이펙터 기능을 변경시킬 수 있는 특정 아미노산 잔기를 변화시키는 것, 또는 불변 영역이 유래되는 종을 변화시키는 것)가 포함된다.
실질적으로 순수함: 본 발명의 목적을 위해, 실질적으로 순수함은 바람직하게는 PCBP-1 항체 또는 항체 단편, 또는 기타 화학적 또는 생물학적 작용제의 균질한 제제를 지칭한다. 균질성이 80％ 이상인 실질적으로 순수한 이뮤노글로불린이 바람직하고, 약 90％ 내지 약 95％의 균질성이 더욱 바람직하며, 98％ 내지 99％ 또는 이를 초과하는 균질성이 가장 바람직하고, 일반적으로 제약 용도로 허용될 수 있는 것으로 간주된다.
2. 항체 및 항체 단편
본 발명은 10-8 M 내지 10-11 M의 특이적 친화도로 가용성 형태의 PCBP-1에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편; 세포 내의 가용성 형태의 PCBP-1에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편; 세포 내의 가용성 PCBP-1의 활성을 선택적으로 감소시킬 수 있는 항체 또는 항체 단편; 및 가용성 형태의 PCBP-1에 우선적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편이 포함되는, PCBP-1 항원에 대해 특이적인 항체 및 항체 단편을 제공한다.
가용성 형태의 PCBP-1을 본 발명의 PCBP-1 항체로 관상 암 세포의 세포질에서 확인할 수 있다. PCBP-1은 건강한 유방 조직 상피 세포 내의 핵에서 높은 양으로 국소화 및 발현될 수 있다. 세포에서 형질전환이 진행됨에 따라, PCBP-1 발현이 더욱 세포질 발현이 될 수 있고, 이때 약간의 핵 발현도 있고, 건강한 세포에서보다 전체적으로 발현이 증가된다. 관 암종 세포가 전이성이 됨에 따라, PCBP-1 발현은 전적으로 세포의 세포질 내에서 일어나고, 핵에서는 염색되지 않는다. 임의의 특정 메커니즘에 한정되지 않으면서, PCBP-1 단백질이 정상 관상 상피 세포에서 핵으로부터 이동하고, 세포가 형질전환됨에 따라, 약간의 핵 발현이 있으면서 PCBP-1이 더욱 세포질성이게 된다. 관상 상피 암 세포가 전이성이 됨에 따라, PCBP-1이 전적으로 세포의 세포질 내에 국소화될 수 있다.
본 발명은 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; 및 PCBP-1의 발현 수준을 결정하는 단계이며, 이때 샘플 내의 상기 PCBP-1의 더 많은 발현이 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 유방암 환자에 대한 생존 가능성을 결정하는 방법을 포함한다. 한 측면에서, 정상, 비-전이성 및 전이성 유방암 관상 상피 세포 샘플 영상이 표준 병리학적 방법에 따라 0 내지 3+로 채점된다. 특정 측면에서, PCBP-1 염색 검정물을 독립적인 실험실로 보내서, 샘플들을 맹검식으로 채점한다.
한 측면에서, 침습성 종양 세포에서 염색이 관찰되지 않은 것에 "0"점이 지시될 수 있다. "1+"점은 약한 핵 염색이 임의 비율의 침습성 종양 세포에서 관찰되는 것, 또는 약한 세포질 염색이 샘플 내의 세포의 30％ 미만에서 관찰되는 것에 지시될 수 있다. "2+"점은 약한 세포질 염색이 세포의 50％ 이상에서 관찰되는 것 또는 침습성 종양 세포에서 30％ 초과에서 강한 세포질 염색이 관찰되는 것일 수 있다. "3+"점은 강한 세포질 염색이 종양 세포의 50％ 초과에서 관찰되는 것일 수 있다. 바람직한 측면에서, 관상 유방암 샘플에서의 0/+1과 +2/+3 사이의 차이가 +2 또는 +3점의 배열된 조직 샘플들의 더 높은 양의 세포질 염색에서 특히 명확할 수 있다. 바람직한 측면에서, 강한 염색은 10× 대물렌즈로 쉽게 가시화될 수 있고, 약한 염색은 가시화에 40× 대물렌즈를 필요로 할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 더 높은 수준의 PCBP-1 발현 (PCBP-1 점수 +2 또는 +3)은 PCBP-1 발현이 더 낮은 수준 (PCBP-1 점수 0 또는 +1)인 관상 유방암 환자와 비교하여 관상 유방암 환자의 전체 예후 또는 생존의 감소와 상호관련될 수 있다. 이에 상응하여, 낮은 수준의 PCBP-1 발현은 관상 유방암 샘플에서의 높은 수준의 PCBP-1 발현보다 관상 유방암 환자에 대한 더 양호한 예후를 지시한다.
또 다른 측면에서, 더 높은 수준의 PCBP-1 발현은 3개 이상의 양성 림프절이 있는 관상 유방암 환자의 전체 예후에서의 감소와 상호관련될 수 있다. 1개 또는 2개의 양성 결절이 있는 여성들의 유방암-특이적 생존율은 장기 생존이 유사한 것으로 확인되었다; 그러나, 양성 결절이 3개인 여성은 1개 또는 2개의 양성 결절이 수반되는 이들과 비교하여 유의하게 감소된 생존을 겪었다 (문헌 [Tai, P., et al., 상기 문헌]). 따라서, PCBP-1 발현 수준의 검출을 관상 유방암 환자의 전체 생존을 추정하는데 사용할 수 있다.
본 발명은 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 PCBP-1의 세포내 위치를 결정하는 단계이며, 이때 샘플의 세포 세포질에서의 상기 PCBP-1의 국소화가 세포성 전이를 지시하는 것인 단계를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법을 포함한다. 한 측면에서, 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체는 서열 45, 서열 46 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 갖는 모노클로날 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 PCBP-1, 및 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 또는 ER 및 PR의 세포내 위치를 결정하는 단계이며, 이때 샘플 내의 상기 PCBP-1의 더 많은 발현이 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 PCBP-1, 및 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 또는 ER 및 PR의 세포내 위치를 결정하는 단계이며, 이때 PCBP-1과 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 또는 ER 및 PR의 유사한 세포내 국소화가 전체 생존, 비-전이, 또는 전체 생존 및 비-전이와 양성으로 상호관련되는 것인 단계를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법을 포함한다. 이러한 측면들에서, 유사한 국소화 패턴, 즉, 공동-국소화의 부재는 PCBP-1 염색이 관상 유방암 세포 세포질에 존재하는 경우의 ER 또는 PR 염색의 결여를 포함할 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 본 발명의 PCBP-1 항체의 임의의 항체 또는 항체 단편일 수 있고, 비-제한적으로, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 그의 항체 접합체일 수 있다.
한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 척추동물의 혈액 또는 기타 체액에서 발견되고 숙주 면역계가 외래 물질, 예컨대 박테리아 및 바이러스를 확인하고 중화하는데 사용하는 임의의 감마 글로불린 단백질일 수 있다. 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 항체 접합체로부터 선택될 수 있다. 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 임의 유형의 이뮤노글로불린 단백질, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM일 수 있다.
한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 PCBP-1의 활성을 감소시킬 수 있다. PCBP-1 활성은 샘플의 폴리(rC) 결합을 측정함으로써 결정된다. 한 측면에서, 폴리(rC)-결합 검정법은 문헌 [Ausubel FM, (1994). Current Protocols in Molecular Biology. Chichester: John Wiley and Sons] ("문헌 [Ausubel]")에 기술된 바와 같은 겔-시프트(gel-shift) 검정법을 사용하여 수행된다.
항체 또는 항체 단편은 PCBP-1에 대해 특이적이거나 우선적으로 선택적인 것을 포함하고, 가용성 형태의 PCBP-1 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다. 가용성 PCBP-1 단백질은 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정 시 분자량이 약 35-40 kDa이다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 가용성 형태의 PCBP-1 단백질에 우선적으로 결합할 수 있다. 이러한 측면에서, PCBP-1에 대한 이같은 우선적인 결합은 임의의 단백질에 대해 상대적일 수 있다. 특정 측면에서, PCBP-1에 대한 이같은 우선적인 결합은 막에 결합 또는 회합된 PCBP-1에 대해 상대적일 수 있다. 또 다른 특정 측면에서, PCBP-1에 대한 이같은 우선적인 결합은 핵막에 결합 또는 회합된 PCBP-1에 대해 상대적일 수 있다.
본원에서 사용되는 경우에, 막에 회합된 단백질은 세포 검사 시 막과 국소화화되어 발견될 수 있는 단백질이다. 막에 결합된 단백질은 적어도 부분적으로 지질 이중층과 계면을 이루는 것이다. 한 측면에서, 이는 이온성 상호작용을 통해 막에 결합된다. 또 다른 측면에서, 막에 결합된 단백질은 공유결합 상호작용을 통해 막에 결합된다. 바람직한 측면에서, 막에 결합된 단백질은 수소 결합을 통해 막에 결합된다.
본 발명의 한 측면에서, 우선적인 결합은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 100배, 1,000배, 10,000배 또는 1,000,000배이다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 막 형태의 PCBP-1에 비교하여 가용성 형태의 PCBP-1에 우선적으로 결합한다. 특정 측면에서, 본 발명의 항체는 핵막 형태의 PCBP-1에 비교하여 가용성 형태의 PCBP-1에 우선적으로 결합하거나, 또는 또 다른 측면에서는 반대이다. 임의의 방식으로 항체의 결합을 측정할 수 있고, 바람직한 방법은 문헌 [Ausubel]에 기재된 겔-시프트 검정법이다.
한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 또는 10-11 M 초과, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 및 10-10 M 내지 10-11 M의 특이적 친화도로 PCBP-1 또는 특정 형태의 PCBP-1 예컨대 가용성 형태 또는 막 결합 형태에 결합한다. 바람직한 측면에서, 문헌 [Ausubel]에 기재된 바와 같은 경쟁적 결합 검정법을 사용하여 특이적 활성이 측정된다.
임의적으로 항체 및 항체 단편이 고체 상에 고정되거나, 검출가능하게 표지되거나, 또는 세포독성 방사성핵종, 세포독성 약물 또는 세포독성 단백질 등에 접합될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 단편은 세포, 바람직하게는 인간 세포, 더욱 바람직하게는 인간의 암 세포, 가장 바람직하게는 인간의 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 혈액, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌 암 세포에 의한 가용성 PCBP-1 항원의 발현을 표적화할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 인간 유방 세포는 유방 소엽성 암종 세포일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 인간 유방 세포는 유방 관 암종 세포일 수 있다. 발현된 PCBP-1 항원은 임의 형태의 유전자 산물을 포함할 수 있지만, 특히 바람직한 측면은 가용성 또는 분비 형태의 PCBP-1의 검출에 관련된다. 이같은 항원은 Pcbp -1 유전자의 상동체의 유전자 산물 및 암 세포에 의해 발현된 변형된 PCBP-1 항원을 또한 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PCBP-1 발현 또는 국소화 상태를 생존 예후와 상관시키는데 또는 적합한 치료를 결정하는 것을 필요로 하는 환자의 적합한 치료를 결정하는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 PCBP-1의 세포질 염색이 건강한 대조군과 비교하여 높은 것은 낮은 환자 생존 가능성을 지시할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 핵 PCBP-1 염색이 정상인 것 (건강한 대조군에서 보이는 것과 유사함)은 더 높은 환자 생존 가능성을 지시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 PCBP-1 항체 또는 항체 단편은 PCBP-1 발현 또는 국소화 상태를 질환 유형과 상관시키는데 또는 적합한 치료를 결정하는 것을 필요로 하는 환자의 적합한 치료를 결정하는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편으로의 유방암 조직의 높은 (2+ 또는 3+) 세포질 면역조직화학 염색은 유방 관 암종을 지시할 수 있는 한편, 본 발명의 항체 또는 항체 단편으로의 유방암 조직의 음성 (0) 또는 낮은 (1+) 세포질 염색은 유방 소엽성 암종을 지시할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 면역조직화학 염색이 적절한 대조군과 비교하여 높거나 증가될 수 있다. 한 측면에서, 높거나 증가된 면역조직화학 염색에 염색 정량화의 목적을 위해 2+ 또는 3+의 값이 할당된다. 한 측면에서, 적절한 대조군은 동일한 조직 유형의 세포주, 건강한 개체 또는 상이한 세포병리학이 있는 환자로부터의 샘플, 또는 질환에 걸린 환자로부터의 건강한 샘플일 수 있고, 이때 건강한 샘플은 동일한 샘플 슬라이드 상에서 염색되지 않는다. 한 측면에서, 질환은 암일 수 있다. 또 다른 측면에서, 질환은 유방암일 수 있다. 또 다른 측면에서, 질환은 소엽성 또는 관상 유방암일 수 있다. 한 측면에서, 적절한 대조군과 비교했을 때의 증가는 2배, 4배, 10배 또는 20배 또는 이를 초과하는 배수이다. 또 다른 측면에서, 적절한 대조군과 비교했을 때의 증가는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99％ 초과이다. 또 다른 측면에서, 증가는 PCBP-1 항원-항체 복합체의 세포질 수준에서의 증가이다. 한 측면에서, PCBP-1 항원-항체 복합체의 세포질 수준에서의 증가는 유방 관 암종과 연관된다.
본 발명의 한 측면에서, 면역조직화학 염색이 적절한 대조군과 비교하여 낮거나 감소될 수 있다. 한 측면에서, 낮거나 감소된 면역조직화학 염색에 염색 정량화의 목적을 위해 0 또는 1+의 값이 할당된다. 한 측면에서, 낮거나 감소된 면역조직화학 염색은 10％ 미만의 세포의 세포질이 염색된다는 것을 의미한다. 바람직한 측면에서, 2+점은 조직 샘플 내의 암 세포의 50％ 초과의 세포질이 염색되지 않는 한편, 조직 샘플 내의 암 세포의 50％ 미만의 세포질이 염색된다는 것을 의미한다. 또 다른 측면에서, 2+점은 관상 유방암과 연관된다.
바람직한 측면에서, 3+점은 조직 샘플 내의 암 세포의 90％ 초과의 세포질이 염색되는 한편, 조직 샘플 내의 암 세포의 10％ 미만의 세포질이 염색되지 않는다는 것을 의미한다. 또 다른 측면에서, 3+점은 관상 유방암과 연관된다. 또 다른 측면에서, 3+점이 할당된 조직 샘플은 염색된 세포의 개수가 더 높을 것이고, 2+점이 할당된 조직 샘플에서 보이는 것보다 더 높은 강도로 세포가 염색될 것이다.
한 측면에서, 적절한 대조군은 동일한 유형의 정상적인 시판되는 세포주 (예컨대 SKBR3 세포 또는 MDA-MB-231 세포), 건강한 개체로부터의 샘플, 또는 질환에 걸린 환자로부터의 건강한 샘플일 수 있다. 한 측면에서, 질환은 암일 수 있다. 또 다른 측면에서, 질환은 유방암일 수 있다. 또 다른 측면에서, 질환은 소엽성 또는 관상 유방암일 수 있다. 한 측면에서, 적절한 대조군과 비교했을 때의 감소는 2배, 4배, 10배 또는 20배 또는 이를 초과하는 배수이다. 또 다른 측면에서, 적절한 대조군과 비교했을 때의 감소는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99％ 초과이다. 또 다른 측면에서, 감소는 PCBP-1 항원-항체 복합체의 세포질 수준에서의 감소이다. 한 측면에서, PCBP-1 항원-항체 복합체의 세포질 수준에서의 감소는 유방 소엽성 암종과 연관된다. 한 측면에서, 본 발명은 도 10a 내지 10f에 기재된 바와 같은 중쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열 CDR1 (서열 45), CDR2 (서열 46) 및 CDR3 (서열 47), 및 도 11a 내지 11f에 기재된 바와 같은 경쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열 CDR1 (서열 48), CDR2 (서열 49) 및 CDR3 (서열 50)을 포함하는, PCBP-1 항원에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 (서열 45-47), 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 (서열 48-50)을 포함하는, PCBP-1 항원에 대해 특이적인 항체를 또한 제공한다.
본 발명은 도 10a 내지 10f 및 11a 내지 11f에 기술된 바와 같은 항원 결합 부위 CDR1 (서열 45), CDR2 (서열 46), 및 CDR3 (서열 47), 중쇄 및 경쇄 둘 모두가 있는 PCBP-1 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명은 이들과 실질적으로 상동성이거나 또는 실질적으로 유사한 결합 성질을 초래하는 항원 결합 부위를 함유하는, PCBP-1 발현 생성물에 대해 특이적인 항체 및 항체 단편을 또한 포함한다. 본 발명은 신규 하이브리도마 세포주, 및 이들이 분비하는, 정상 또는 암 세포가 발현하는 PCBP-1 항원에 대해 특이적인 모노클로날 항체 분자를 또한 포함한다. 본 발명은 키메라 및 인간화 항체 및 항체 단편을 또한 포함하고, 기타 변형 항체 및 항체 단편을 또한 포함한다.
도 10a 내지 10f 및 11a 내지 11f에 기재된 중쇄 및 경쇄의 항원 결합 부위의 특이적인 아미노산 서열에 더하여, 본 발명은 PCBP-1에 대해 특이적이지만 도 10a 내지 10f 및 11a 내지 11f에 기재된 것들과 동일하지 않은 FWR 및/또는 CDR 항원 결합 부위 뉴클레오티드 서열 (서열 19-29 및 34-44)이 있는 항체 및 항체 단편을 또한 포함한다. PCBP-1 항원에 대해 특이적이거나 우선적으로 선택적이면, 바람직하게는 PCBP-1 항원에 대해 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 85％ 이상만큼 특이적이면, 더욱 바람직하게는 90％ 이상만큼 특이적이면, 가장 바람직하게는 95％ 이상만큼 특이적이면, 이같은 항체 및 항체 단편이 선호된다. 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 변이체는 본 발명의 비-변이체 항체 또는 항체 단편만큼 PCBP-1 항원에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 더욱 특이적일 수 있다.
PCBP-1에 대해 특이적이지만 도 10a 내지 10f 및 11a 내지 11f에 기재된 것들과 동일하지 않은 FWR 및/또는 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열이 있는 항체 및 항체 단편은 도 10a 내지 10f 및 11a 내지 11f의 FWR 및/또는 CDR (서열 17 및 32)이 포함하는 것 (이러한 도면들에서 볼드체의 밑줄친 텍스트에 기재됨)과 동일한 또는 상이한 특이성 결정 영역 (SDR)을 지닐 수 있다.
도 10a 내지 10f (중쇄) 및 도 11a 내지 11f (경쇄)에 기재된 항원 결합 부위 CDR1 (각각 서열 45 및 48), CDR2 (각각 서열 46 및 49), 및 CDR3 (각각 서열 47 및 50)의 아미노산 서열에 대한 변형이 FWR 및 CDR 서열 중 하나 또는 양쪽에서 일어날 수 있다. 본 발명의 특정 측면에 따르면, 항체 또는 항체 단편에서의 변동은 이들이 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경우, 항체들이 실질적으로 유사한 결합 성질을 갖는 경우, 또는 둘 모두에 일어날 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 인간화 변이체는, 뮤린(murine) 항체 또는 항체 단편과 비교했을 때, 감소된 뮤린 함량을 함유할 수 있고, 잠재적으로는 감소된 면역원성을 함유할 수 있다. 인간화 변이체는 원래의 항체 또는 항체 단편의 것과 실질적으로 유사한 결합 친화도를 보유하는 것들을 포함한다. 본 발명의 한 측면은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 (3개의 중쇄 및 3개의 경쇄)의 CDR이 인간화된, 인간화 PCBP-1 항체 또는 항체 단편의 CDR 변이체를 제공한다. 본 발명의 제2 측면은 PCBP-1 항체 및 항체 단편으로부터의 하나 이상의 CDR의 특이성 결정 영역 (SDR)만 인간화 항체 내에 존재하는, 인간화 PCBP-1 항체 및 항체 단편의 SDR 변이체를 제공한다. SDR은 표 1 또는 표 2로부터 선택된다.
알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 중쇄 (서열 17) 내의 특이성 결정 잔기
위치 잔기
-1 Q
4 Q
5 Q
23 A
30 S
알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 경쇄 (서열 32) 내의 특이성 결정 잔기
위치 잔기
-2 D
-1 I
1 V
2 L
21 C
38 Y
47 K
53 A
93 S
인간화 PCBP-1 항체 및 항체 단편의 하나 이상의 CDR을 인간 항체로부터의 상응하는 CDR로 교체함으로써 CDR 변이체가 형성될 수 있다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR이 인간 항체로부터의 상응하는 CDR로 교체된 CDR 변이체는 모 PCBP-1 mAb의 결합 친화도와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유한다. 본 발명의 CDR 변이체의 결합 친화도는 모 PCBP-1 항체 또는 항체 단편의 결합 친화도의 25％ 이상, 더욱 바람직하게는 50％ 이상, 가장 바람직하게는 75％ 또는 90％ 이상일 수 있다.
본 발명의 PCBP-1 항체 및 항체 단편으로부터의 6개 모두 (3개의 중쇄 및 3개의 경쇄)의 CDR을 인간 항체 및 항체 단편의 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 프레임워크 상에 그라프팅(grafting)시킴으로써, PCBP-1 항체 및 항체 단편과 비교했을 때 면역원성이 변경된 CDR 변이체가 형성될 수 있다. 그러나, 인간화 항체가 활성을 보유하도록 여전히 허용하면서, 본 발명의 PCBP-1 항체 및 항체 단편의 6개 모두보다 적은 CDR이 존재할 수 있다. 항원 접촉에서 직접적으로 수반되는 잔기인 특이성 결정 잔기 (SDR)가 정련될 수 있다. PCBP-1 항체 또는 항체 단편의 하나 이상의 SDR을 인간 항체로부터의 상응하는 위치에서의 잔기로 교체함으로써 SDR 변이체가 형성된다. 모든 CDR이 SDR을 포함하지 않는다는 것을 주지하여야 한다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편의 변이체는 면역원성이 감소되고 결합 친화도가 PCBP-1에 대한 모 항체 또는 항체 단편의 것과 실질적으로 유사한 변이체가 생성되는 CDR 및/또는 SDR 치환의 조합을 포함한다.
본원에 구체적으로 기술된 변이체들에 더하여, 기타 "실질적으로 상동성인" 변형된 이뮤노글로불린을 다양한 재조합 DNA 기술을 사용하여 쉽게 디자인 및 제작할 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역 (FWR)이 1차 구조 수준에서 변할 수 있다. 또한, 다양한 상이한 인간 프레임워크 영역들이 단독으로 또는 조합되어 변이체에 대한 기초로 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자 변형은 다양한 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
별법적으로, 1차 항체 구조의 일부분만 포함하는 폴리펩티드 단편이 생산될 수 있고, 이때 이러한 단편은 변이체의 면역반응성을 실질적으로 보유한다. 이같은 폴리펩티드 단편은 무손상 항체의 단백질분해성 절단에 의해 생산된 단편 또는 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 원하는 위치에서 뉴클레오티드 서열에 정지 코돈을 삽입하는 것에 의해 생산된 단편을 포함한다. 변이체의 면역반응성 단편을 적어도 포함하는 단일쇄 항체 및 융합 단백질이 본 발명의 범주 내에 또한 포함된다.
치료 활성이 있는 이펙터 모이어티에 본 발명에 따른 항체 및 그의 변이체가 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 적절한 이펙터 모이어티에는 사이토카인, 세포독소, 방사성핵종, 약물, 면역조정제, 치료 효소, 항증식제 등이 포함된다. 항체를 이같은 이펙터에 부착시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 암, 예컨대 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 혈액, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌의 암이 포함되는, PCBP-1의 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물이 포함되는 임의의 조성물 내로 이러한 접합된 항체들이 혼입될 수 있다. 제약 조성물은, 이러한 질환을 치료하기 위해, 이같은 치료를 필요로 하는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간 환자에게 바람직하게 투여된다.
항체 및 항체 단편은 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 항체는 이러한 인간화 항체와 반응성인 다른 표지된 항체 (2차 항체), 예컨대 인간 이뮤노글로불린 불변 영역에 대해 특이적인 항체와 조합되어 사용될 수 있다. 별법적으로, 항체가 직접적으로 표지될 수 있다. 광범위한 표지, 예컨대 방사성핵종, 플루오르, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드 (특히 합텐) 등이 사용될 수 있다. 수많은 유형의 면역검정법이 이용가능하다.
3. 핵산 분자 및 숙주 세포
임의의 본 발명의 항체 또는 항체 단편이 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명은 이같은 분자, 이같은 분자의 단편, 및 벡터 등 내에 포함된 이같은 분자를 포함한다. 핵산 분자는 이같은 핵산 분자의 상보물을 또한 포함한다. DNA 및 RNA 분자 둘 모두가 핵산 분자의 예이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 분자의 중쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열이고, 이때 상기 항체 분자가 PCBP-1 항원에 대한 특이성이 있고, 상기 중쇄의 가변 도메인이 도 10a 내지 10f에 기재된 항원 결합 부위 아미노산 서열 CDR1, CDR2 및 CDR3이 있는 CDR을 포함하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 분자의 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열이고, 이때 상기 항체 분자가 PCBP-1 항원에 대한 특이성이 있고, 상기 경쇄의 가변 도메인이 도 11a 내지 11f에 기재된 항원 결합 부위 아미노산 서열 CDR1, CDR2 및 CDR3이 있는 CDR을 포함하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 내의 핵산 분자를 포함하고, 이를 제공한다. 이같은 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있거나, 또는 벡터 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터 상에 존재할 수 있다. 이같은 숙주 세포 내에 핵산 분자가 일시적으로 존재할 수 있다. 한 측면에서, 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli); 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 포함되는 바실루스(Bacillus); 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 슈도모나스(Pseudomonas)가 포함되는 엔테로박테리아과(enterobacteriacae), 사카로미세스(Saccharomyces)가 포함되는 효모; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); Sf9 곤충 세포; Sp2/0, VERO 및 HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주; W138, BHK, COS-7 및 MDCK 세포주의 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, 숙주 세포는 유방암 세포주 예컨대 SKBR3, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, 및 ZR75B 세포로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 숙주 세포는 전립선암 세포주 예컨대 PC3, DU145 및 LNCap 세포로부터 선택된다.
4. PCBP -1 항체 또는 항체 단편을 제조하는 방법
본 발명의 PCBP-1 항체 또는 항체 단편을, 예를 들어, 인간 유방암 세포주 SKBR3 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 ATCC 번호 HTB30으로 입수가능)을 사용하여 개발할 수 있다.
본 발명은 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간화 항체가 포함되는 모노클로날, 키메라 항체를 생산하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Press, 1988)] 참조.
본 발명의 PCBP-1 항체 또는 항체 단편은 PCBP-1에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편을 생산하는 뮤린 하이브리도마를 생성시키는 것이 비제한적으로 포함되는 임의의 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 하이브리도마는, 예를 들어, PCBP-1에 대해 면역화된 마우스로부터의 비장 세포와 마우스 융합 파트너 세포의 융합에 의해 형성될 수 있다. 관심 항원을 함유하는 미정제(crude) 또는 반-정제 제제로 마우스를 면역화시킬 수 있다. 마우스를 면역화시키기 위해, 다양한 상이한 통상적인 프로토콜을 따를 수 있다. 예를 들어, 마우스에게 항원 제제의 1차 및 부스팅(boosting) 면역화를 제공할 수 있다.
면역학 분야의 당업자에게 공지된 임의의 절차에 의해 세포 융합을 달성할 수 있다. 융합 파트너 세포주, 및 하이브리도마를 융합시키고 선별하며, 항체 또는 항체 단편을 스크리닝하는 방법이 공지되어 있다.
예를 들어, 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 마우스의 복막강 내로 주사하고, 적당한 시간 후, 높은 역가의 항체 또는 항체 단편을 함유하는 복수액을 수확하고, 이로부터 항체 또는 항체 단편을 단리하는 것에 의해, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 다량으로 생산할 수 있다. 별법적으로, 하이브리도마 세포를 시험관 내에서 배양하고, 분비된 항체 또는 항체 단편을 세포 배양 배지로부터 단리하는 것에 의해 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
적합한 DNA 서열을 이러한 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 후 숙주 내에서 발현시키는 것에 의해 본 발명의 PCBP-1 항체 또는 항체 단편을 또한 생산할 수 있다. 이같은 발현 벡터는 종종 숙주 생물 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제될 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원을 종종 함유한다. 또한, 발현 벡터는 유전자 발현을 제어하기 위한 프로모터를, 임의적으로는 오퍼레이터 서열과 함께, 포함할 수 있고, 전사 및 번역의 개시 및 완료를 위해 리보솜 결합 부위 서열 등이 있을 수 있다. 적절한 프로모터에는 폴리헤드린 프로모터, 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 프로모터 시스템, 베타-락타마제(lactamase) 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 비제한적으로 포함된다. 발현 벡터는 선별 마커를 또한 함유할 수 있다. PCBP-1 항체 및 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 서열들은 별도의 발현 벡터들 내로 또는 동일한 발현 벡터 내로 통합될 수 있다.
적절한 숙주에는 원핵생물 균주 예컨대 이. 콜라이; 바실루스 서브틸리스가 포함되는 바실루스; 살모넬라, 세라티아 및 슈도모나스가 포함되는 엔테로박테리아과가 비제한적으로 포함된다. 적절한 숙주에는 진핵생물 숙주 예컨대 사카로미세스가 포함되는 효모; 피키아 파스토리스; Sf9 곤충 세포; Sp2/0, VERO 및 HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주; W138, BHK, COS-7 및 MDCK 세포주가 또한 포함된다. 기타 적절한 숙주가 공지된 발현 기술과 함께 또한 사용될 수 있다.
관심 DNA 절편을 함유하는 벡터는 세포성 숙주의 유형에 따라 변하는 임의의 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염, 인산칼슘 처리, 전기천공 또는 양이온성 리포솜 매개 형질감염 (예컨대 DOTAP). 리간드에 대한 수용체의 결합을 검출하기 위한 다양한 기술에 의해, 성공적으로 형질전환된 세포를 확인할 수 있다.
발현된 유전자 산물을 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 및 겔 전기영동이 비제한적으로 포함되는 임의의 방법에 따라 정제할 수 있다. 균질성이 80％ 이상인 실질적으로 순수한 이뮤노글로불린이 바람직하고, 약 90％ 내지 약 95％ 균질성이 더욱 바람직하며, 98％ 내지 99％ 또는 이를 초과하는 균질성이 가장 바람직하고, 일반적으로 제약 용도로 허용될 수 있는 것으로 간주된다.
단리 또는 정제된 DNA 서열을 클로닝 또는 발현 벡터 내로 혼입할 수 있고, 차례로 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환된 숙주 세포는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 이들이 생산하는 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는, PCBP-1 항원에 대한 특이성이 있는 항체 분자를 생산하기 위한 방법에서 사용될 수 있다.
5. 진단 방법, 검정법, 및 키트
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 포함하는, PCBP-1 항원을 검출하기 위한 면역검정법을 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열 (서열 45-47), 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열 (서열 48-50)이 있는 모노클로날 항체에 결합하는 PCBP-1 항원을 검출하기 위한 면역검정법을 제공한다.
본 발명은 (a) 유효 결합량의, 서열 45, 서열 46, 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 PCBP-1 항원에 대해 특이적인 항체와 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) PCBP-1 항원에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 상기 항원을 검출하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열 (서열 45-47), 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열 (서열 48-50)이 있는 모노클로날 항체에 결합하는 PCBP-1 항원을 검출하기 위한 면역검정법을 제공한다. 본 발명은 (a) 유효 결합량의, 서열 45, 서열 46, 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 포함하는 PCBP-1 항원에 대해 특이적인 항체와 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) PCBP-1 항원에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 상기 항원을 검출하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 (서열 45-47), 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열 (서열 48-50)이 있는 모노클로날 항체에 결합하는 PCBP-1 항원을 검출하기 위한 면역검정법을 또한 제공한다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 면역검정법은 적합한 치료를 결정하는 것을 필요로 하는 환자의 적합한 치료를 결정하는데 사용되고, 이때 상기 환자는 Pcbp -1 및 그의 상동체의 유전자 산물의 발현을 특징으로 하는 질환의 증상이 있다. 환자 생존 가능성을 예측하기 위해, 시험관내 분석을 이를 필요로 하는 환자로부터 수득된 조직 시료 상에서 수행할 수 있다.
이같은 면역검정법은 (a) 샘플을 유효 결합량의 본 발명의 항체 또는 항체 단편 중 하나와 접촉시키는 단계; 및 (b) PCBP-1 항원에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 상기 항원을 검출하는 단계를 포함하는 것이 비-제한적으로 포함되는 임의의 적절한 방식으로 사용될 수 있다. 본 발명의 면역검정법은 PCBP-1 항원을 발현하는 암 세포, 특히 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 혈액, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌 암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 암, 종양, 암종 세포 또는 신생물성 질환 세포를 검출하는데 사용될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항체 또는 항체 단편; 및 (b) 검출가능한 표지에 접합된 2차 항체를 포함하는, 암종의 면역조직화학적 검출을 위한 키트를 제공한다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 키트는 에스트로겐 수용체 (ER)를 인식할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항체 또는 항체 단편; 및 (b) 검출가능한 표지에 접합된 2차 항체를 포함하는, 생존 가능성에 관해 예후하는 것을 필요로 하는 암종 환자의 생존 가능성에 관해 예후하기 위한 또는 적합한 치료 선택권을 결정하는 것을 필요로 하는 환자에 대한 적합한 치료 선택권을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 키트는 에스트로겐 수용체 (ER)를 인식할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항체 또는 항체 단편; 및 (b) 검출가능한 표지에 접합된 2차 항체를 포함하는, 질환 상태에 관해 예후하는 것을 필요로 하는 유방 암종 환자에서 질환 상태에 관해 예후하기 위한 키트를 제공한다. 한 측면에서, 이러한 키트는 유방 관 암종과 유방 소엽성 암종을 구별할 수 있다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 키트는 에스트로겐 수용체 (ER)를 인식할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열, 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열이 있는 모노클로날 항체; 및 (b) 검출가능한 표지에 접합된 2차 항체를 포함하는, 암종의 면역조직화학적 검출을 위한 키트를 제공한다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 키트는 에스트로겐 수용체 (ER)를 인식할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함한다.
한 측면에서, 유리 슬라이드 상에서 면역조직화학적 분석이 수행될 수 있다. 또 다른 측면에서, 플라스틱 슬라이드 상에서 면역조직화학적 분석이 수행될 수 있다. 또 다른 측면에서, 유리 또는 플라스틱 이외의 물질로 제조된 슬라이드 상에서 면역조직화학적 분석이 수행될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 정상 세포, 비-전이성 암 세포 및 전이성 암 세포 내의 pcbp -1 유전자 서열의 카피 개수를 결정하기 위한 pcbp -1 유전자의 형광 계내 혼성화 (FISH: Fluorescence In Situ Hybridization)를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 방법을 사용하여 결정된 바와 같은 PCBP-1 단백질의 증가된 발현에 pcbp-1 유전자의 중복/증폭이 동반될 수 있다. 또 다른 측면에서, pcbp -1 유전자의 중복이 본 발명에서 제공되는 바와 같이 PCBP-1 단백질 발현의 변화에 선행할 수 있다. FISH는 염색체 수준에서 유전자를 분석하는 방법이고, 유전적 변화 예컨대 유전자/염색체 증폭/중복, 결실, 전위, 재배열, 및 유전자 및/또는 염색체와 연관된 기타 이상을 검출 및 특성화할 수 있다. 일반적으로 용어 "계내 혼성화"는 세포학적 또는 조직학적 제제의 일부분인 핵산 표적에 대한 핵산 프로브의 혼성화를 지칭한다. 전형적으로, FISH 방법은 하기의 단계들을 수반한다: (a) 조사 중인 조직, 배양물로부터의 세포 또는 기타 생물학적 물질을 지지체 (예를 들어, 유리 슬라이드 또는 미량역가 웰의 벽)에 고정시키는 단계, (b) 표적 DNA에 대한 프로브 DNA의 접근성을 증가시키기 위해 조직 또는 물질을 처리하는 단계 (예를 들어, 세포를 투과성이게 만듦, 표적 DNA를 변성시킴, 및 표적 DNA 내의 반복 서열을 차단함), (c) 표적 DNA를 함유하는 조직 또는 물질을 프로브와 접촉시켜, 특이적 혼성화 복합체를 형성시키는 단계, (d) 혼성화 후 복합체를 세척하여, 표적에 특이적으로 혼성화되지 않은 프로브를 선택적으로 제거하는 단계, 및 (e) 표적 DNA 분자와 혼성화 복합체를 형성한 프로브를 검출하는 단계 (예를 들어, 형광 표지된 DNA 프로브를 직접적으로 가시화함으로써 또는 2차 형광 프로브를 사용함으로써). FISH의 장점은 개별적인 세포들을 분석할 수 있고 염색체 상의 위치를 가시화할 수 있다는 것이다. FISH는 세포에서 소정의 DNA 프로브 서열의 카피 개수를 결정할 수 있을 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열의 중복, 전위 및 결실을 확인할 수 있다. FISH용 방법이 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Gall and Pardue, (1981) Methods of Enzymology 21:470-480]; [Henderson, (1982) International Review of Cytology, 76:1-46]; 및 [Angerer, et al., (1985) Genetic Engineering: Principles and Methods (Setlow and Hollaender, Eds.) vol. 7, pp. 43-65, Plenum Press, New York]가 포함되는 다수의 자료에 기술되어 있다.
FISH 방법은 샘플의 염색체 스프레드(spread) 상에서 수행된다. 한 측면에서, FISH 샘플은 환자로부터 수득된 샘플로부터의 유방 세포 또는 조직으로부터 수득된 조직학적 제제일 수 있다. 한 측면에서, 염색체 스프레드는 당업자에게 공지된 확립된 세포주로부터 또는 환자의 샘플로부터 제조된 1차 배양물이 포함되는 세포 배양물로부터 수득된다. 염색체 스프레드는 간기 또는 중기 스프레드일 수 있거나, 또는 샘플에 세포 주기의 다양한 단계에 있는 세포들이 있을 수 있다.
프로브 크기가 중요한데, 더 긴 프로브는 더 짧은 프로브보다 덜 특이적으로 혼성화하기 때문이다. 중첩이 검출가능한 특색의 해상도를 규정한다. 예를 들어, 실험 목표가 전위의 중단점을 검출하는 것이면, 프로브들의 중첩 (한 DNA 서열이 인접한 프로브들 내에 함유되는 정도)이 중단점이 검출될 수 있는 최소 창을 규정한다.
프로브 서열들의 혼합물이 프로브가 검출할 수 있는 특색의 유형을 결정한다. 완전한 염색체를 따라 혼성화하는 프로브들이 특정 염색체의 수를 계수하는데, 전위를 나타내는데, 또는 염색질의 염색체외 단편을 확인하는데 사용된다. 이는 종종 "전체 염색체 페인팅(whole-chromosome painting)"으로 칭해진다. 모든 가능한 프로브가 사용되면, 모든 염색체 (전체 게놈)가 형광으로 표지될 것이고, 이는 개별적인 서열들의 특색을 결정하는데 특별히 유용하지 않을 것이다. 그러나, DNA의 특정 영역 (유전자좌)에 대해 특이적인, 더 작은 프로브들의 혼합물이 생성될 수 있다; 이러한 혼합물들은 결실 돌연변이를 검출하는데 사용된다. 특이적인 색상과 조합되는 경우, 유전자좌-특이적 프로브 혼합물이 매우 특이적인 전위를 검출하는데 사용된다.
다양한 기타 기술들이 상이한 색상의 프로브들의 혼합물들을 사용한다. 형광 염료들의 혼합물 내의 광범위한 색상들을 검출할 수 있고, 따라서 각각의 인간 염색체를 전체 염색체 프로브 혼합물 및 다양한 색상비를 사용하여 특징적인 색상에 의해 확인할 수 있다. 쉽게 구별할 수 있는 형광 염료 색상보다 더 많은 염색체가 있지만, 프로브 혼합물들의 비를 사용하여 2차 색상을 생성시킬 수 있다. 비교 게놈 혼성화와 유사하게, 동일한 염색체에 대한 상이한 색상의 프로브들의 정확한 비의 2개의 세트를 혼합함으로써 2차 색상들에 대한 프로브 혼합물이 생성된다. 이러한 기술은 때때로 M-FISH로 칭해진다. 다양한 색상을 M-FISH용으로 가능하게 하는 것과 동일한 물리학이 사용될 수 있다. 반대의 상황 (2차 색상의 부재가 병리학적인 경우)에서는, 중단점들 중 오직 1개만 공지되어 있거나 또는 일정한 경우의 전위를 조사하기 위해 사용되는 검정법에 의해 설명된다. 유전자좌-특이적 프로브들이 중단점의 한쪽 측면 및 다른 무손상 염색체에 대해 제조된다. 정상 세포에서는 2차 색상이 관찰되지만, 전위가 발생했을 때는 1차 색상만 관찰된다. 이러한 기술은 때때로 "브레이크-아파트(break-apart) FISH"로 칭해진다.
본 발명의 한 측면에서, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론 번호 RP11-175A7 (진뱅크(Genbank) 번호 AC016700, 177995 bp, 서열 55)을 FISH를 사용하여 샘플 내의 pcbp -1 유전자의 존재, 카피 개수 및 염색체 위치를 검출하는데 사용할 수 있다. 한 측면에서, 증가된 카피 개수가 FISH에 의해 검출될 수 있고, 이는 본 발명의 면역학적 기술을 사용하여 검출된 PCBP-1 단백질의 증가된 발현과 상호관련된다. 또 다른 측면에서, 카피 개수 또는 염색체 위치에서의 변화가 PCBP-1 단백질의 세포 위치에서의 변화 (예를 들어, 핵 대 세포질)에 상응할 수 있다. 또 다른 측면에서, pcbp -1 유전자의 증가된 카피 개수를 전이성이게 될 가능성이 증가된 조직 샘플 내의 세포를 확인하는데 사용할 수 있다.
추가적인 측면에서, pcbp -1 유전자의 FISH 분석을 위한 DNA 프로브가 당업자에 의해 제조될 수 있다. 한 측면에서, 추가적인 프로브들이 pcbp -1 유전자의 cDNA 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 유니프롯 Q15365, Q53SS8, Q14975; OMIM 601209; NCBI 유전자 5093; NCBI 기준서열 NP_006187; NCBI 기준서열 NM_006196, NP_006187; NCBI 유니진 5093; 및 NCBI 등록 번호 AK130439, AAA91317으로 이루어진 군으로부터 수득가능한 핵산 서열을 사용할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, pcbp -1 유전자를 검출할 수 있는 핵산 서열의 FISH 프로브 (예를 들어, 검출가능한 표지를 함유하는 DNA 프로브)가 틈(nick) 번역에 의해 제조될 수 있다. 틈 번역은 당업자에게 주지되어 있다. 간략하게, 틈 번역은 DNA 서열의 뉴클레오티드들 중 일부를 이들의 표지된 유사물로 교체하도록 DNA 폴리머라제(polymerase) I을 사용하여, FISH 또는 기타 혼성화 기술에서 프로브로 사용될 수 있는 태그(tag)-부착 DNA 서열을 생성시키는 분자 생물학에서의 태그 부착 기술이다. 프로세싱될 DNA가 DNase로 처리되어 단일 가닥 "틈"이 생산되기 때문에 이러한 프로세스가 틈 번역으로 칭해진다. 틈이 생긴 부위에서의 DNA 폴리머라제 I에 의한 교체가 이어지고, 이는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 뉴클레오티드들을 제거하고 이들을 dNTP로 교체하면서 3' 히드록실 말단에서 신장시킨다. 블롯팅(blotting) 절차에서 프로브로 사용하기 위해 DNA 단편을 방사성으로 표지하기 위해, 반응에서 제공된 혼입된 뉴클레오티드들 중 하나가 알파 포스페이트 위치에서 방사성으로 표지된다. 유사하게, 형광 표지를 위해 형광단이 또는 면역검출을 위해 항원이 대신 부착될 수 있다. DNA 폴리머라제 I이 결국 DNA로부터 탈착될 때, 이는 포스페이트 백본 내에 또 다른 틈을 남긴다. 이러한 틈은 폴리머라제의 프로세스성에 따라 "번역된" 약간의 거리가 있다. 이러한 틈은 DNA 리가제(ligase)에 의해 막힐 수 있거나, 또는 그의 3' 히드록실 기가 추가적인 DNA 폴리머라제 I 활성에 대한 주형 구실을 할 수 있다. 소유권이 있는 효소 혼합물이 단일 인큐베이션에 이러한 절차 내의 모든 단계를 수행하도록 시판된다. 틈 번역은 이중-가닥 DNA 중단을 야기할 수 있지만, 이는 계내 혼성화에서 표지된 프로브의 성능에 영향을 미치지 않는다.
한 측면에서, 형광 표지된 뉴클레오티드로 직접적으로 DNA 서열에 태그가 부착될 수 있다. 추가적인 측면에서, 변형된 뉴클레오티드를 혼입시키는 뉴클레오티드로 DNA 서열이 간접적으로 표지될 수 있다. 한 측면에서, 적어도 약간의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드, 예컨대 비오틴, 디곡시게닌, 플루오레세인 또는 시아닌을 포함하도록 변형된 뉴클레오티드를 사용하는 중합에 의해 검출가능한 표지가 도입될 수 있다. 또 다른 측면에서, 무작위-프라이밍(priming) 및 중합에 의해 검출가능한 표지가 도입된다. 기타 예로는 틈 번역 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 인디애나주 인디애나폴리스; 인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드) 및 화학적으로 표지하는 것 (크레아테크 유엘에스(Kreatech ULS), 네덜란드 암스테르담)이 포함된다. 핵산을 검출가능하게 표지하는 것이 당업계에 주지되어 있고, DNA를 표지하는데 적합한 임의의 표지 방법을 사용할 수 있다.
먼저, 프로브를 구축한다. 프로브는 그의 표적에 특이적으로 혼성화하기에 충분히 커야 하지만, 혼성화 프로세스를 방해하도록 크지는 않아야 한다. 형광단, 항체에 대한 표적, 또는 비오틴으로 프로브에 직접적으로 태그가 부착된다. 태그 부착은 다양한 방식, 예컨대 틈 번역, 또는 태그가 부착된 뉴클레오티드를 사용하는 PCR로 행해질 수 있다.
그 후, 간기 또는 중기 염색체 제제를 생산한다. 염색체를 기판, 일반적으로는 유리에 단단하게 부착시킨다. 짧은 DNA 단편을 샘플에 첨가하는 것에 의해 반복 DNA 서열을 차단하여야 한다. 그 후, 프로브를 염색체 DNA에 적용하고, 약 12시간 동안 인큐베이션하면서 혼성화시킨다. 수회의 세척 단계로 혼성화되지 않거나 부분적으로 혼성화된 프로브를 모두 제거한다. 그 후, 염료를 여기시킬 수 있고 영상을 기록할 수 있는 현미경을 사용하여 결과를 가시화하고 정량한다.
한 측면에서, 형광 신호가 약하면, 현미경의 검출 역치를 넘기 위해 신호 증폭을 사용할 수 있다. 형광 신호 강도는 프로브 표지 효율, 프로브 유형 및 염료 유형과 같은 다수의 요인에 좌우된다. 형광성으로 태그가 부착된 항체 또는 스트렙타비딘이 염료 분자에 결합된다. 이러한 2차 성분들은 강한 신호가 있도록 선택된다. 추가적인 측면에서, 세포 및 조직 내에서의 유전자 발현을 검출하거나 국소화하도록 디자인된 FISH 실험은 형광 신호를 제공하기 위해 리포터 유전자, 예컨대 녹색 형광 단백질을 발현하는 리포터 유전자를 사용하는 것에 의존할 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열, 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열이 있는 모노클로날 항체; 및 (b) 검출가능한 표지에 접합된 2차 항체를 포함하는, 생존 가능성에 관해 예후하는 것을 필요로 하는 암종 환자의 생존 가능성에 관해 예후하기 위한 키트를 제공한다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 키트는 에스트로겐 수용체 (ER)를 인식할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열, 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열이 있는 모노클로날 항체; 및 (b) 검출가능한 표지에 접합된 2차 항체를 포함하는, 유방 암종 환자에서의 질환 상태에 관해 예후하기 위한 키트를 제공한다.
키트는 PCBP-1 항원에 대해 샘플을 검정하기 위한 시약들을 포함할 수 있고, 이때 이같은 키트는 PCBP-1 항원 특이적 친화성 시약, 예컨대 항체, 또는 그의 단편 또는 모방체, 및/또는 이를 포함하는 면역검정법 장치; 신호 생산 시스템의 구성원, 예컨대 항체, 효소 기질 등; 대상 검출 검정법을 수행하는 것에서 사용하기 위한 다양한 완충제; 샘플 내의 PCBP-1 항원의 양을 결정하기 위한 기준 물질 등을 포함할 수 있다. 키트 또는 키트 양식의 기타 예가 알퍼의 미국 공개 번호 2008/0293162, 및 문헌 [Scoring Guide for the Interpretation of Ventana Pathway HER2 - Staining of Breast Carcinomas (Ventana Medical Systems, Inc., Tuscon, AZ, USA)]에서 확인되고, 이들은 둘 모두 전문이 본원에 참고로 포함된다. 추가적인 측면에서, PCBP-1 항원에 대해 샘플을 검정하기 위한 시약들을 포함하는 키트가 에스트로겐 수용체 (ER)를 인식할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함할 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 암에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터의 시료를 본 발명의 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; (b) 상기 시료를 표지하는 단계; 및 (c) 상기 표지에 의해 항원-항체 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 인간에서 암을 진단하는 방법을 제공한다. 이같은 암 진단 방법은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 한 측면에서, 암은 유방암일 수 있다. 또 다른 측면에서, 유방암은 소엽성 또는 관상 유방암일 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 암에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터의 시료를 본 발명의 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; (b) 상기 시료를 표지하는 단계; 및 (c) 상기 표지에 의해 항원-항체 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 생존 가능성을 예후하는 것을 필요로 하는 암 환자의 생존 가능성을 예후하거나 또는 적합한 치료 선택권을 결정하는 것을 필요로 하는 환자에 대해 적합한 치료 선택권을 결정하는 방법을 제공한다. 이같은 암 진단 방법은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 한 측면에서, 이러한 방법은 항체-항원 복합체의 세포성 국소화를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 암은 유방암일 수 있다. 또 다른 측면에서, 유방암은 소엽성 또는 관상 유방암일 수 있다. 한 측면에서, 항체-항원 복합체의 세포성 국소화는 세포질이다.
한 측면에서, 이러한 방법은 세포질 내의 항원-항체 복합체의 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 도 15에 제시된 바와 같이, 0 (음성) 또는 1+ (낮음)의 수준은 소엽성 유방암을 지시할 수 있는 한편, 2+ 또는 3+ (높음)의 수준은 관상 유방암을 지시할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 2+ 또는 3+의 수준인 환자의 50％ 초과, 60％ 초과 또는 70％ 초과가 관상 유방암이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 2+ 또는 3+의 수준인 환자의 60％ 미만, 50％ 미만, 또는 40％ 미만이 소엽성 유방암이다. 한 측면에서, 소엽성 유방암으로의 진단은 관상 유방암의 진단보다 더 높은 생존 가능성을 지시할 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 암에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터의 시료를 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열, 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열이 있는 모노클로날 항체와 접촉시키는 단계; (b) 상기 시료를 표지하는 단계; 및 (c) 상기 표지에 의해 항원-항체 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 인간에서 암을 진단하는 방법을 제공한다. 이러한 암 진단 방법은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 한 측면에서, 암은 유방암일 수 있다. 또 다른 측면에서, 유방암은 소엽성 또는 관상 유방암일 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 암에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터의 시료를 하나 이상의 도 10a 내지 10f에 기재된 중쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열, 및 하나 이상의 도 11a 내지 11f에 기재된 경쇄 CDR 항원 결합 부위 아미노산 서열이 있는 모노클로날 항체와 접촉시키는 단계; (b) 상기 시료를 표지하는 단계; 및 (c) 상기 표지에 의해 항원-항체 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 생존 가능성을 예후하는 것을 필요로 하는 암 환자의 생존 가능성을 예후하는 방법을 제공한다. 암에 걸린 환자의 적합한 치료를 결정하는 이러한 방법은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 한 측면에서, 이러한 방법은 항체-항원 복합체의 세포성 국소화를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 항체-항원 복합체의 세포성 국소화는 세포질이다.
진단되는 암에는 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌의 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것들이 포함된다. 한 측면에서, 유방암은 관상 또는 소엽성 유방암이다. 추가적인 측면에서, 본 발명은 Pcbp -1 및 그의 상동체에 의해 발현되는 유전자 산물을 확인하는 단계, 및 상기 유전자 산물을 특이적으로 표적화하는, PCBP-1 항체 및 항체 단편, 억제 펩티드, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 백신 및 화학적 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 약물의 개발 및 확인에서 상기 유전자 산물을 바이오마커로 이용하는 단계를 포함하는, Pcbp -1 및 그의 상동체의 유전자 산물의 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하거나, 진단하거나, 또는 치료 및 진단하는데 유용한 약물을 개발하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, a) 적합한 치료 선택권을 결정하는 것을 필요로 하는 환자의 조직 시료를 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; b) 상기 조직 시료를 면역조직화학 염색으로 염색하는 단계; 및 c) 상기 조직 시료의 염색의 강도 및/또는 국소화를 결정하는 단계이며, 이때 상기 염색의 강도 및/또는 국소화가 상기 환자의 생존과 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 적합한 치료 선택권을 결정하는 것을 필요로 하는, Pcbp -1 및 그의 상동체의 유전자 산물의 발현을 특징으로 하는 질환의 증상이 있는 환자의 적합한 치료 선택권을 결정하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 PCBP-1의 높은 세포질 염색 (2+ 또는 3+의 값이 할당됨)은 낮은 환자 생존 가능성을 지시할 수 있다. 또 다른 측면에서, 적절한 대조군과 비교하여 음성이거나 낮은 PCBP-1 염색 (0 또는 1+)은 높은 환자 생존 가능성을 지시할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 상기 염색의 강도는 적절한 대조군의 염색 강도에 비교하여 측정된다. 본 발명의 한 측면에서, 상기 질환은 암이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 암은 유방암이다. 또 다른 측면에서, 유방암은 관상 또는 소엽성 유방암이다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 PCBP-1의 높은 세포질 염색 (2+ 또는 3+의 값이 할당됨)은 관상 유방암을 지시할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 PCBP-1의 음성 또는 낮은 세포질 염색 (0 또는 1+의 값이 할당됨)은 소엽성 유방암을 지시할 수 있다. 도 15에 제시된 바와 같이, 0 (음성) 또는 1+ (낮음)의 수준은 소엽성 유방암을 지시할 수 있는 한편, 2+ 또는 3+ (높음)의 수준은 관상 유방암을 지시할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 2+ 또는 3+의 수준인 환자의 50％ 초과, 60％ 초과 또는 70％ 초과가 관상 유방암이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 2+ 또는 3+의 수준인 환자의 60％ 미만, 50％ 미만, 또는 40％ 미만이 소엽성 유방암이다. 한 측면에서, 소엽성 유방암으로의 진단은 관상 유방암의 진단보다 더 높은 생존 가능성을 지시할 수 있다. 본 발명의 추가적인 측면에서, 면역조직화학 염색은 당업계에 공지된 방법들 중 임의의 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 PCBP-1의 세포내 위치를 결정하는 단계이며, 이때 샘플의 세포 세포질에서의 상기 PCBP-1의 국소화가 세포성 전이를 지시하는 것인 단계를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; 및 PCBP-1의 발현 수준을 결정하는 단계이며, 이때 샘플 내의 상기 PCBP-1의 더 많은 발현이 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 유방암 환자에 대한 생존 가능성을 결정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 pcbp-1을 검출할 수 있는 DNA 프로브와 접촉시키는 단계; 및 pcbp-1의 염색체 국소화를 결정하는 단계이며, 이때 샘플에서의 상기 pcbp-1의 2개 초과의 카피의 검출이 전체 생존과 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 유방암 환자에 대한 생존 가능성을 결정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 pcbp-1을 검출할 수 있는 DNA 프로브와 접촉시키는 단계; 및 pcbp-1의 염색체 국소화를 결정하는 단계이며, 이때 샘플에서의 상기 pcbp-1의 2개 초과의 카피의 검출이 전체 생존과 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 유방암 환자에 대한 생존 가능성을 결정하는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 상기 pcbp-1의 2개 초과의 카피는 세포 내의 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과의 개수의 카피일 수 있다. 또 다른 측면에서, 카피 개수는 정상적인 비-암성 세포에서 발견되는 2개의 카피보다 많을 수 있다. 한 측면에서, 카피 개수는 인간의 2번 염색체에서 발견되지 않는 임의의 추가적인 카피일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PBCP-1의 발현을 특징으로 하는 질환, 예컨대 암의 진단에서 또한 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PBCP-1의 발현을 특징으로 하는 질환, 예컨대 암의 증상이 있는 환자의 적합한 치료 선택권을 결정하는데 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 암은 유방암이다. 또 다른 측면에서, 유방암은 관상 또는 소엽성 유방암이다. 예를 들어, PBCP-1을 발현하는 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 혈액, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌의 고형 종양의 생체내 진단 및 영상화를 본 발명의 방법에 따라 수행할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 시험관 내에서, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편을 사용하여 체액 또는 조직 샘플 내의 암 마커 PBCP-1의 존재를 검출하는 것에 의해, PBCP-1의 발현을 특징으로 하는 질환의 진단, 적합한 치료 선택권의 결정, 또는 환자의 생존 가능성에 관한 예후를 위해 또한 사용될 수 있다.
PCBP-1의 존재에 대해 체액, 예컨대 혈청, 가래, 삼출물, 소변, 뇌척수액 등을 스크리닝하기 위한 면역검정법에서 항체 및 항체 단편을 사용할 수 있다. 적합한 방사성표지로 표지된 경우에, 항체 및 항체 단편을 종양 세포의 1차 또는 전이 병소를 검출하기 위해 스캐닝 또는 방사성영상화에 사용할 수 있다. 추가로, 질환에서의 림프절 수반을 검출하기 위한 림프섬광조영술에서 항체가 유용하다.
한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PCBP-1 발현의 증가를 검출하는데 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PCBP-1 발현의 감소를 검출하는데 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PCBP-1의 세포성 국소화에서의 변화를 검출하는데 사용될 수 있다. PCBP-1-관련 유전자 산물에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편, 및/또는 그의 키메라, 인간화 또는 기타 변이체 중 임의의 것 또는 모두가 포함될 수 있는 PCBP-1 항체 또는 항체 단편이 치료적으로, 또는 검정법, 생체내 또는 시험관내 진단 절차의 개발 및 수행, 및 영상화에서 사용될 수 있다. 항체는 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체 제형 또는 진단 또는 예후 담체 제형과 조합되어 사용될 수 있다. PCBP-1 항체 또는 항체 단편은 제약상 또는 진단상 허용되는 비-독성 무균성 담체 내로 현탁액 또는 용액으로서 혼입될 수 있다. 이들은 따로따로 투여되는 조성물로서 사용될 수 있거나, 또는 화학요법제 또는 면역억제제와 함께 제공될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 치료, 진단 및 예후 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 항체 분자를 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 치료, 진단 또는 예후 조성물의 제조 방법을 또한 포함한다. 항체 분자는 치료, 진단 또는 예후 조성물 내의 단독 활성 성분일 수 있거나, 또는 기타 항체 성분, 예를 들어 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체, 또는 비-항체 성분 예컨대 잔틴이 포함되는 기타 활성 성분을 동반할 수 있다. 조성물은 고형 종양, 특히 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌의 고형 종양이 비제한적으로 포함되는, PCBP-1의 발현을 특징으로 하는 질환을 진단 또는 치료하거나 질환 결과를 예측하기 위한 키트 내로 혼입될 수 있다. 특히 바람직한 측면에서, 암은 유방암이다. 한 측면에서, 본 발명은 유방암이 관상인지 또는 소엽성인지를 결정하기 위한 치료, 진단 및 예후 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 샘플 내의 PCBP-1 또는 PCBP-1을 보유하는 세포를 검출 또는 정량하는 면역검정법에 유용하다. 이같은 면역검정법은 생물학적 샘플을 검출가능하게 표지된, 종양 항원을 확인할 수 있는 본 발명의 항체의 존재 하에 인큐베이션하는 단계, 및 샘플 내의 결합된 표지된 항체를 검출하는 단계를 전형적으로 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, PCBP-1의 하나 이상의 형태의 수준, 국소화 또는 둘 모두가 대상체로부터의 세포, 세포 선집 또는 샘플의 상태를 결정하거나, 확증하거나 또는 지시할 수 있다. 본원에서 사용되는 경우에, "확증하다"는 세포, 세포 선집 또는 샘플, 대상체 등 내의 PCBP의 하나 이상의 형태의 수준, 국소화 또는 둘 모두를 기초로, 세포, 세포 선집, 샘플 또는 대상체 등의 상태를 특성화하는 충분한 기초를 제공함을 의미한다. 본원에서 사용되는 경우에, "확증하다"는 세포, 세포 선집 또는 샘플, 대상체 등 내의 PCBP의 하나 이상의 형태의 수준, 국소화 또는 둘 모두를 기초로, 다른 분석과 함께 세포, 세포 선집, 샘플 또는 대상체 등의 상태를 특성화하는 기초를 제공함을 의미한다. 본원에서 사용되는 경우에, "지시하다"는 세포, 세포 선집 또는 샘플, 대상체 등 내의 PCBP의 하나 이상의 형태의 수준, 국소화 또는 둘 모두를 기초로, 세포, 세포 선집, 샘플 또는 대상체 등의 상태가 특정 상태라는 것을 결정하는 것의 가능성이 50％를 초과한다는 것을 제공함을 의미한다. 한 측면에서, 유방암 샘플의 높은 (2+ 또는 3+) 세포질 염색은 환자가 관상 유방암이라는 것을 지시할 수 있는 한편, 유방암 샘플의 음성 (0) 또는 낮은 (1+) 세포질 염색은 환자가 소엽성 유방암이라는 것을 지시할 수 있다.
세포 또는 세포 선집의 상태는 임의의 측면을 포함할 수 있고, 한 측면에서는 세포, 세포 선집, 샘플 등이 전이성 종양 세포인지, 비-전이성 종양 세포인지 또는 정상 세포인지이다. 대상체의 상태는 분석이 대상체에 전이성 암이 존재하는지 또는 비-전이성 종양이 존재하는지에 대한 정보를 제공하는지를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 대상체의 상태는 유방암이 관상인지 또는 소엽성인지를 포함할 수 있다.
확증하는데 또는 개시된 것들과 조합하여 사용될 수 있는 확증적 분석, 검정법, 테스트 등의 예로는 알퍼의 미국 공개 번호 2008/0293162에 기재된 것들, 뿐만 아니라 샘플의 조직학적 검사가 비제한적으로 포함된다.
본 발명의 한 측면에서, PCBP-1의 하나 이상의 형태의 수준, 국소화 또는 둘 모두는 질환 또는 결과 가능성에 대해 진단성 또는 예후성이다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 PCBP-1의 세포질 염색이 적절한 대조군과 비교하여 높은 것 (2+ 또는 3+)은 낮은 환자 생존 가능성을 지시할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 핵 PCBP-1 염색이 적절한 대조군과 비교하여 음성 (0)이거나 낮은 것 (1+)은 더 높은 환자 생존 가능성을 지시할 수 있다. 또 다른 측면에서, 유방암 샘플의 높은 세포질 염색 (2+ 또는 3+)은 환자가 관상 유방암이라는 것을 지시할 수 있는 한편, 유방암 샘플의 음성 (0) 또는 낮은 (1+) 세포질 염색은 환자가 소엽성 유방암이라는 것을 지시할 수 있다. 한 측면에서, 적절한 양성 대조군은 SKBR3 세포 또는 MDA-MB-231 세포일 수 있고, 적절한 음성 대조군은 건강한 방광 세포일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 세포, 세포 선집 또는 샘플 내의 가용성 형태의 PCPB-1의 감소된 수준이 이것이 전이성 조직으로부터 유래된다는 것을 진단, 예후, 모니터링, 결정, 확증 또는 지시할 수 있다. 한 측면에서, "감소된"은 대조군과 비교하여 감소된 것을 의미할 수 있고, 이때 대조군은 비-전이성인 동일한 유형의 정상 세포이다. 이러한 측면에서, 감소는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99％ 초과일 수 있다. 또 다른 측면에서, 감소는 2배, 4배, 10배, 또는 20배, 또는 이를 초과하는 배수일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 세포, 세포 선집 또는 샘플 내의 가용성 형태의 PCPB-1의 증가된 수준이 이것이 전이성 조직으로부터 유래된다는 것을 진단, 예후, 모니터링, 결정, 확증 또는 지시할 수 있다. 한 측면에서, "증가된"은 대조군과 비교하여 증가된 것을 의미할 수 있고, 이때 대조군은 비-전이성인 동일한 유형의 정상 세포이다. 이러한 측면에서, 증가는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99％ 초과일 수 있다. 또 다른 측면에서, 증가는 2배, 4배, 10배, 또는 20배, 또는 이를 초과하는 배수일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 면역조직화학에 이어지는 정량적 방법을 사용하여 PCBP-1 발현을 측정한다. 한 측면에서, 정량적 방법은 소프트웨어 예컨대 아쿠아날리시스(AQUANALYSIS)™ 소프트웨어 (히스토알엑스 인크(HistoRx, Inc.), 미국 코네티컷주 뉴헤이번)일 수 있다. 또 다른 측면에서, 아쿠아날리시스™ 소프트웨어와 같은 정량적 방법이 실시예 13에 기술된 방법에 더하여 사용될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, PCBP-1 발현은 정상 대조군에서의 PCBP-1 발현에 대해 상대적이다. 또 다른 측면에서, 암 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 대조군에서의 PCBP-1 발현의 백분율로서 표현될 수 있다. 스튜던트(Student) t-테스트를 사용하여 PCBP-1 발현에서의 차이의 통계적 유의성을 측정할 수 있다. 한 측면에서, t=0.99이다. 또 다른 측면에서, t=0.95이다. 또 다른 측면에서, t=0.90이다.
본 발명의 한 측면에서, PCBP-1의 "강한 발현"은 정상 조직과 비교했을 때 PCBP-1 발현에서의 적어도 3배, 4배, 5배 또는 이를 초과하는 배수의 증가일 수 있다. 또 다른 측면에서, PCBP-1의 "중등도 발현"은 정상 조직과 비교했을 때 PCBP-1 발현에서의 적어도 2배 내지 3배의 증가일 수 있다. 또 다른 측면에서, PCBP-1의 "중등도 발현"은 정상 조직과 비교했을 때 PCBP-1 발현에서의 2배 내지 3배의 증가일 수 있다. 또 다른 측면에서, PCBP-1의 "약한 발현"은 정상 조직과 비교했을 때 PCBP-1 발현에서의 1배 이하의 증가일 수 있다. 또 다른 측면에서, PCBP-1의 "약한 발현"은 정상 조직과 비교했을 때 PCBP-1 발현의 감소일 수 있다.
PCBP-1의 정량적 또는 반-정량적 검출을 환자의 임상 병력 및 적격인 병리학자에 의해 평가된 기타 진단 테스트의 정황에서 평가할 수 있다. 한 측면에서, 유방암을 PCBP-1 발현을 기초로 암종으로 진단하는 것은 잘 보존된 세포의 전체 집단으로부터의 염색된 세포의 백분율 및 염색 강도를 기초로 행해진다. PCBP-1 염색을 위한 적절한 양성 대조군에는 SKBR3 및 MDA-MB-231 세포주가 포함된다. PCBP-1 염색을 위한 적절한 음성 대조군에는 방광 세포가 포함된다. 한 측면에서, 세포 염색 강도는 염색되지 않음 내지 희미한 염색 내지 약한 염색 내지 강한 염색의 범위일 수 있다. 또 다른 측면에서, 잘 보존된, 염색된 세포의 백분율은 0％, 50％ 미만, 10％ 초과, 30％ 초과, 40％ 초과, 50％ 초과, 60％ 초과, 70％ 초과 또는 90％ 초과이다. 본 발명의 한 측면에서, 염색은 세포질에 국소화된다. 또 다른 측면에서, 핵 염색이 여전이 존재할 수 있지만, 이러한 염색은 양성의 결정에서 포함되지 않는다. 한 측면에서, 조직 시료를 PCBP-1 발현에 대해 낮은 해상도 (10-20×)에서 현미경검사를 통해 분석하여, 잘 보존되고 잘 염색된 면적을 국소화할 수 있다. 확인된 잘 보존되고 잘 염색된 면적을 세포질 염색의 강도를 결정하는데 사용할 수 있다. 잘 보존된 염색된 세포의 백분율은 0％, 50％ 미만, 또는 10％ 초과, 30％ 초과, 40％ 초과, 50％ 초과, 60％ 초과, 70％ 초과 또는 90％ 초과로 추정될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 단일한 대표적인 구역의 세포가 사용되고, 단일한 대표적인 구역의 면적을 본 발명의 방법에 따른 결정을 내리는데 사용된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 검사된 세포의 개수는 50개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 및 500개 이상 또는 그 초과의 개수이다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법에 따른 결정을 내리는데 사용된 세포의 개수는 세포 100개 이상이다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 항체, 바람직하게는 알퍼 PCBP-1 항체 또는 염색 패턴이 알퍼 PCBP-1 항체와 같은 임의의 항체로 염색된 세포에 0 내지 3+의 값을 할당함으로써 PCBP-1 발현의 정량이 결정될 수 있다. 한 측면에서, 세포 염색의 정량을 위한 기준은 하기와 같다: 0: 염색이 관찰되지 않음; 1+: 희미한 부분적인 세포질 염색이 관찰됨; 2+: 샘플 내의 세포의 50％ 초과의 약한 완전한 세포질 염색이 관찰됨; 3+: 샘플 내의 세포의 50％ 초과의 강한 완전한 세포질 염색이 관찰됨. 관상 및 소엽성 유방암 세포의 음성 샘플 및 1+, 2+ 및 3+ 염색의 예가 도 16-18에서 제시된다.
한 측면에서, 2+점은 세포질이 염색된 조직 샘플 내의 잘 보존된 세포의 백분율이 50％ 초과인 한편, 세포질이 염색되지 않은 조직 샘플 내의 잘 보존된 세포의 백분율이 50％ 미만인 샘플을 포함한다. 또 다른 측면에서, 2+점 또는 이를 초과하는 점수는 관상 유방암과 연관된다.
또 다른 측면에서, 3+점은 세포질이 염색된 조직 샘플 내의 잘 보존된 세포의 백분율이 90％ 초과인 한편, 세포질이 염색되지 않은 조직 샘플 내의 잘 보존된 세포의 백분율이 10％ 미만인 샘플을 포함한다. 또 다른 측면에서, 3+점은 관상 유방암과 연관된다. 또 다른 측면에서, 3+점이 할당된 조직 샘플은 염색된 세포의 개수가 더 높을 것이고, 2+점이 할당된 조직 샘플에서 보이는 것보다 더 강한 강도로 세포가 염색될 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, PCBP-1 발현의 증가가 전체적으로 세포 또는 조직에서의 증가로 표현될 수 있다. 또 다른 측면에서, PCBP-1 발현의 증가가 세포의 세포질에서의 증가로 표현될 수 있다. 또 다른 측면에서, PCBP-1 발현의 증가가 세포의 핵에서의 증가로 표현될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, PCBP-1 발현의 감소가 전체적으로 세포 또는 조직에서의 감소로 표현될 수 있다. 또 다른 측면에서, PCBP-1 발현의 감소가 세포의 세포질에서의 감소로 표현될 수 있다. 또 다른 측면에서, PCBP-1 발현의 감소가 세포의 핵에서의 감소로 표현될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 결장암 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 결장 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가된다. 또 다른 측면에서, 결장암 세포가 정상 결장 세포와 비교하여 강한 세포질 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 편평 암종 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 피부 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가된다. 또 다른 측면에서, 편평 암종 세포가 정상 피부 세포와 비교하여 세포질 PCBP-1 발현의 3배를 초과하는 증가를 나타낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 흑색종 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 피부 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가된다. 또 다른 측면에서, 흑색종 세포는 강한 세포질 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있는 한편, 정상 피부 세포는 PCBP-1의 약한 핵 발현을 나타낼 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 다형성 교모세포종 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 뇌 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가된다. 또 다른 측면에서, 다형성 교모세포종 세포는 PCBP-1의 중등도의 세포질 발현을 나타낼 수 있는 한편, 뉴런 및 성상세포는 어떠한 PCBP-1 발현도 나타내지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 성상세포종 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 뇌 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가된다. 또 다른 측면에서, 성상세포종 세포는 PCBP-1의 중등도의 세포질 발현을 나타낼 수 있는 한편, 뉴런 및 성상세포는 어떠한 PCBP-1 발현도 나타내지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 난소암 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 피부 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 감소된다. 또 다른 측면에서, 난소암 세포는 PCBP-1의 핵 및/또는 세포질 발현을 거의 나타내지 않거나 나타내지 않을 수 있는 한편, 정상 난소 세포는 PCBP-1의 강한 핵 및 세포질 발현을 나타낼 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 자궁내막암 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 자궁내막 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가된다. 또 다른 측면에서, 자궁내막암 세포는 강한 핵 및 세포질 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있는 한편, 정상 자궁내막 세포는 PCBP-1의 세포질 발현을 거의 나타내지 않거나 나타내지 않을 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 육종 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 근육 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가된다. 또 다른 측면에서, 육종 세포는 정상 근육 세포와 비교하여 중등도 내지 높은 수준의 세포질 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 방광암 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 방광 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가된다. 또 다른 측면에서, 방광암 세포가 정상 방광 세포와 비교하여 중등도 내지 높은 수준의 세포질 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 유방암 세포에서의 PCBP-1 발현이 정상 유방 세포에서의 PCBP-1 발현과 비교하여 증가될 수 있다. 또 다른 측면에서, 유방암 세포는 강한 세포질 PCBP-1 발현 및 중등도로 강한 핵 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있는 한편, 정상 유방 세포는 약한 핵 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있다. 또 다른 측면에서, 유방암 세포는 강한 세포질 PCBP-1 발현 및 중등도로 강한 핵 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있는 한편, 정상 유방 세포는 강한 핵 PCBP-1 발현을 나타낼 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 관 암종 세포에서의 세포질 PCBP-1 발현이 유방 소엽성 암종 세포에서의 세포질 PCBP-1 발현보다 더 높을 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 정상 대조군에 대해 유사한 수준의 세포, 세포 선집 또는 샘플 내의 가용성 형태의 PCBP-1은 이같은 세포가 비-전이성 조직으로부터 유래된다는 것을 진단, 예후, 모니터링, 결정, 확증 또는 지시할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 세포 핵에서의 가용성 형태의 PCPB-1의 국소화의 결여는 이것이 전이성 조직으로부터 유래된다는 것을 진단, 예후, 모니터링, 결정, 확증 또는 지시할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 정상 대조군에 비하여 세포, 세포 선집 또는 샘플 내의 가용성 형태의 PCPB-1의 국소화는 이것이 비-전이성 조직으로부터 유래된다는 것을 진단, 예후, 모니터링, 결정, 확증 또는 지시할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 진단 또는 예후 방법 또는 기타 방법은 전이 상태를 지시하고, 이때 핵 PCBP-1의 수준이 세포 또는 조직의 전이 상태를 지시한다. 한 측면에서, 비-전이성 대조군 조직 또는 세포보다 낮은 핵 PCBP-1 수준이 전이 능력을 지시한다. 이러한 측면에서, 지시성 수준은 대조군의 1％, 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 95％ 미만, 또는 대조군의 1％ 미만 내지 20％ 미만일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 진단 또는 예후 방법 또는 기타 방법은 전이 상태를 지시하고, 이때 세포질 PCBP-1의 수준이 세포 또는 조직의 전이 상태를 지시한다. 한 측면에서, 비-전이성 대조군 조직 또는 세포보다 높은 세포질 PCBP-1 수준이 전이 능력을 지시한다. 이러한 측면에서, 지시성 수준은 대조군의 1％, 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 95％ 초과, 또는 대조군의 1％ 초과 내지 20％ 초과일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 진단 또는 예후 방법 또는 기타 방법은 비-전이 상태를 지시하고, 이때 핵 PCBP-1의 수준이 세포 또는 조직의 비-전이 상태를 지시한다. 한 측면에서, 비-전이성 대조군 조직 또는 세포와 유사한 핵 PCBP1 수준이 비-전이 능력을 지시한다. 이러한 측면에서, 지시성 수준은 대조군과 동일하거나 대조군의 1％, 5％, 또는 10％ 이내일 수 있거나, 또는 대조군과 동일하거나 대조군의 1％ 및 10％ 초과 이내일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 진단 또는 예후 방법 또는 기타 방법은 비-전이 상태를 지시하고, 이때 PCBP-1과 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 또는 ER 및 PR의 세포내 국소화가 유사하다. 이러한 측면에서, 유사한 국소화의 부재는 PCBP-1 염색이 관상 유방암 세포 세포질에 존재하는 경우의 ER 또는 PR 염색의 결여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵 내의 ER 및 핵 내의 PCBP-1이 정상 또는 비-전이성 관상 유방암 세포를 지시한다.
한 측면에서, 본 발명의 진단 또는 예후 방법 또는 기타 방법은 비-전이 상태를 지시하고, 이때 세포질 PCBP-1의 수준이 세포 또는 조직의 비-전이 상태를 지시한다. 한 측면에서, 비-전이성 대조군 조직 또는 세포와 유사한 세포질 PCBP1 수준이 비-전이성 능력을 지시한다. 이러한 측면에서, 지시성 수준은 대조군과 동일하거나 대조군의 1％, 5％, 또는 10％ 이내일 수 있거나, 또는 대조군의 0％ 내지 10％ 미만일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 PCBP-1의 세포내 위치를 결정하는 단계이며, 이때 PCBP-1과 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 또는 ER 및 PR의 유사한 세포내 공동-국소화가 전체 생존, 비-전이, 또는 전체 생존 및 비-전이와 양성으로 상호관련되는 것인 단계를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법을 포함한다. 이러한 측면에서, 공동-국소화의 부재는 PCBP-1 염색이 관상 유방암 세포 세포질에 존재하는 경우의 ER 또는 PR 염색의 결여를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 PCBP-1의 세포내 위치 패턴을 결정하는 단계이며, 이때 PCBP-1과 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 또는 ER 및 PR의 유사한 세포내 국소화의 부재가 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 단계를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법을 포함한다. 이러한 측면에서, 유사한 국소화 패턴의 부재는 PCBP-1 염색이 관상 유방암 세포 세포질에 존재하는 경우의 ER 또는 PR 염색의 결여를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 세포, 세포 선집 또는 샘플은 자궁경부 또는 유방 세포의 세포 선집 또는 샘플이다.
본 발명의 한 측면에서, 세포, 세포 선집 또는 샘플은 소엽성 유방 세포의 세포 선집 또는 샘플이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 세포, 세포 선집 또는 샘플은 관상 유방 세포의 세포 선집 또는 샘플이다.
본 발명의 항체 및 항체 단편은 전이 잠재력의 평가, 치료법에 대한 예상되는 반응, 및 전체 예후를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 면역병리학적 분석, 예컨대 종양 유형의 차별 진단, 및 종양의 PCBP-1 발현을 기초로 하는 종양의 하위 분류에 또한 유용하다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편을 사용하는 면역병리학적 분석은 유방암 샘플이 관상 유방암인지 또는 소엽성 유방암인지를 지시할 수 있다.
PCBP-1 항체 및 항체 단편은 성장 중인 종양 내에 존재하는 이종성 세포들 사이에서 종양 세포의 부차 집단(subpopulation)의 정의를 허용하고, 예를 들어, 수술 시점 및 치료법 이전 둘 모두에, 유동 세포측정법에 의한 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 종양 세포 "세포주"의 유형 결정 및 교차 시험(cross-matching)에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 및 일련의 추가적인 항체 또는 항체 단편으로의 종양 세포 집단 또는 부차 집단의 분석은 (a) 어떤 항원 제제가 특이적인 활성 면역요법에 가장 적합할지, (b) 어떤 항체 또는 항체 단편 또는 키메라 항체가 특정 암에 대해 효과적일지; 및 (c) 어떤 항체, 또는 항체 또는 항체 단편의 조합물이 재발성 또는 전이성 종양에 대한 검색에서 더 늦은 날짜에 환자를 영상화하는데 사용되어야 하는지를 정의하는데 사용될 수 있다.
생물학적 샘플을 니트로셀룰로스, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질 또는 당단백질을 고정할 수 있는 기타 고체 지지체 또는 담체로 처리할 수 있다. 그 후, 지지체를 적절한 완충제로 세척하고 나서, 검출가능하게 표지된 본 발명의 항체로 처리한다. 그 후, 고체 상 지지체를 완충제로 2차로 세척하여, 미결합 항체를 제거할 수 있다. 그 후, 상기 고체 지지체 상의 결합된 표지의 양을 통상적인 수단에 의해 검출할 수 있다.
본 발명의 항체를 검출가능하게 표지할 수 있는 방식들 중 하나는 이를 효소에 연결시키고 효소 면역검정법 (EIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)에서 사용하는 것에 의한 것이다. 이러한 효소는, 그 후에 그의 기질에 노출되었을 때, 기질과 반응하여, 화학적 모이어티를 생성시킬 것이며, 이를 예를 들어 분광측정법, 형광측정법 또는 시각적인 수단에 의해 검출할 수 있다. 별법적인 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 결합 파트너를 표지하는데 효소가 사용된다. 이같은 결합 파트너는 본 발명의 항체의 불변 또는 가변 영역에 대한 항체, 예컨대 이종성 항-마우스 이뮤노글로불린 항체일 수 있다. 별법적으로, 결합 파트너는 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 비-항체 단백질일 수 있다.
본 발명의 항체를 방사성으로 표지함으로써, 방사면역검정법 (RIA)의 사용을 통해 PCBP-1을 검출할 수 있다. 감마 계수기 또는 섬광 계수기의 사용과 같은 수단에 의해 또는 자가방사선술에 의해 방사성 동위원소를 검출할 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소가 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 항체를 형광 화합물로 표지하는 것이 또한 가능하다. 형광으로 표지된 항체가 적합한 파장의 빛에 노출되면, 형광으로 인해 그의 존재를 검출할 수 있다. 화학발광 화합물에 커플링시킴으로써 본 발명의 항체를 또한 검출가능하게 표지할 수 있다. 그 후, 화학발광성으로 표지된 항체의 존재를 화학 반응 과정 동안 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 결정한다. 생물발광 화합물을 본 발명의 항체를 표지하는데 또한 사용할 수 있다. 생물발광은 생물학적 시스템에서 발견되는 화학발광 유형이고, 이때 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시킨다. 발광의 존재를 검출함으로써 생물발광 단백질의 존재가 결정된다. 표지 목적을 위한 중요한 생물발광 화합물은 루시페린(luciferin), 루시퍼라제(luciferase) 및 에쿼린(aequorin)이다.
항체, 단편 또는 유도체의 검출을 섬광 계수기 (예를 들어, 검출가능한 표지가 방사성 감마 방출물인 경우), 또는 형광측정기 (예를 들어, 표지가 형광 물질인 경우)에 의해 달성할 수 있다. 효소 표지의 경우, 효소에 대한 기질을 사용하는 색측정 방법에 의해 검출이 달성될 수 있다. 유사하게 제조된 표준물질과의 비교에서 기질의 효소 반응 정도를 시각적으로 비교하는 것에 의해 검출이 또한 달성될 수 있다. 별법적으로, 형광 영상의 강도 및 픽셀 개수를 계수함으로써 검출이 달성될 수 있다.
환자로부터 시료를 제거하고, 표지된 항체, 또는 표지되지 않은 항체 + 표지된 결합 파트너를 이같은 시료에 제공함으로써 계내 검출이 달성될 수 있다. 이같은 절차의 사용을 통해, 항원의 존재뿐만 아니라, 검사 조직 내의 그의 분포를 결정할 수 있다. 본 발명을 사용하여, 당업자는 광범위한 조직학적 방법 중 임의의 것 (예컨대 염색 절차)이 이같은 계내 검출을 달성하기 위해 변형될 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 이같은 방법에는, 예를 들어, 면역조직화학 염색 절차가 포함된다. 한 측면에서, 아비딘-비오틴 이뮤노퍼옥시다제(immunoperoxidase) 염색 시스템이 사용될 수 있고, 이러한 시스템을 이용하는 키트가 또한 구상되지만, 본 발명의 방법은 당업계에 공지된 임의의 적절한 염색 절차를 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 해동에 의해 또는 액체 비히클 내의 현탁에 의해 재구성될 동결 또는 동결건조 항체를 포함할 수 있다. 키트는 담체 또는 완충제를 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 항체의 재구성 및 사용을 위한 설명서를 또한 포함한다. 본 발명의 항체 (키메라 및 인간화 항체 포함)를 사용하는 키트는 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 혈액, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌의 암이 포함되는 암의 면역조직화학적 평가에 사용될 수 있다.
면역조직화학적 분석에 필요한 시약들을 포함하는 키트가 하기와 같이 제공될 수 있다: a) 본 발명의 PCBP-1 항체 또는 항체 단편, 또는 그의 키메라 또는 인간화 변이체; b) 차단 시약 (예를 들어, 염소 혈청의 형태) 및 2차 항체 (예를 들어, 염소 항-마우스 항체); c) 검출가능한 마커 (예를 들어, 이뮤노퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제); 및 d) 발색 시약. 1차 항체 (PCBP-1 항체 또는 항체 단편 또는 그의 변이체)는 1개 초과의 2차 항체에 결합할 수 있는 항원 구실을 한다. 2차 항체는 1차 항체와 검출가능한 마커 및 발색 시약에 의해 형성된 복합체 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제-항-퍼옥시다제 복합체) 사이의 "다리"를 형성한다.
임의의 적절한 검출 시스템을 본 발명의 방법 및 키트에 따라 사용할 수 있다. 이같은 검출 시스템은 면역형광 용도에서 광범위하게 사용되고, 유동 세포측정법, 현미경검사, 웨스턴 블롯팅 및 ELISA를 포함하지만 이에 한정되지 않는 기술을 사용하여 이를 영상화할 수 있다. 적절한 검출 시스템은 1차 단백질로부터의 신호를 증폭시키기 위해 2차 항체의 접합체, 콜로이드성 금의 접합체, 또는 2차 단백질의 접합체를 이용할 수 있고 (본 발명의 정황에서, 증폭될 1차 단백질 신호는 결합된 PCBP-1 항체이고, 이는 예를 들어 비오틴과 같은 단백질로 표지되거나 표지되지 않을 수 있다), 1차 단백질은 차례로 특이적 표적을 검출하는데 사용되고 있다 (본 발명의 정황에서, 표적은 PCBP-1 발현 생성물이다).
본 발명의 방법 및 키트에서 사용하기 위한 적절한 2차 접합체는 2차 항체와 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소의 효소 접합체; 아비딘 또는 스트렙타비딘과 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소의 효소 접합체; 단백질 A 또는 단백질 G와 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소의 효소 접합체; 콜로이드성 금과 2차 항체의 접합체; 콜로이드성 금과 아비딘 또는 스트렙타비딘의 접합체; 자기 입자와 2차 항체의 접합체; 및 2차 항체와 형광 염료 및 비오틴과 같은 표지의 접합체를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템에 한정되지 않고, 이러한 검출 시스템 또는 기타 검출 시스템을 본 발명에 따라 이용하는 것은 당업자의 능력 내인 것으로 간주된다. 이러한 2차 접합체 (본 발명의 정황에서 표지로 또한 지칭됨)는 항원-항체 복합체를 가시화하는데 유용하다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 "2-부위" 또는 "샌드위치" 검정법으로 또한 공지된 면역측정 검정법에서 이용하기 위해 또한 개조될 수 있다. 전형적인 면역측정 검정법에서, 테스트되는 체액에서 불용성인 고체 지지체에 다량의 표지되지 않은 항체 (또는 항체 단편)가 결합되고, 다량의 검출가능하게 표지된 가용성 항체가 첨가되어, 고체-상 항체와 항원과 표지된 항체 사이에 형성된 3원 복합체의 검출 및/또는 정량을 허용한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용하는 결장, 유방, 난소 및 기타 암의 생체내 영상화를 목적으로, 다수의 상이한 표지 및 표지 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지 유형의 예로는 방사성 동위원소, 상자성 동위원소, 및 양전자 방출 단층촬영술 (PET)에 의해 영상화될 수 있는 화합물이 포함된다.
6. 제약 조성물 및 치료 방법
본 발명의 또 다른 측면은 이러한 항체들 중 임의의 것을, 임의적으로는 제약상 허용되는 담체와 조합하여, 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 임의적으로 하나 이상의 활성제, 약물 또는 호르몬과 조합된다.
본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 항체, 또는 치료 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, PBCP-1을 발현하는 암, 예컨대 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌의 고형 종양을 앓고 있거나 그의 위험이 처한 인간 또는 동물 대상체를 치료하는 방법을 또한 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 치료를 필요로 하는 임의의 대상체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효량"은 표적 질환 또는 상태를 치료하거나, 호전시키거나 또는 예방하는데, 또는 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는데 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 항체에 대해, 세포 배양 검정법에서 또는 동물 모델, 일반적으로는 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 초기에 치료 유효 용량이 추정될 수 있다. 동물 모델은 적합한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데 또한 사용될 수 있다. 그 후, 이같은 정보를 인간에서의 투여를 위한 유용한 용량 및 경로를 결정하는데 사용할 수 있다.
인간 대상체에 대한 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시기 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감도, 및 요법에 대한 허용성/반응에 좌우될 수 있고, 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있으며, 임상의에 의해 판단된다. 일반적으로, 유효 용량은 0.01 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 15 ㎎/㎏일 것이다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어 투여될 수 있다. 일부 측면에 따르면, 항체가 이러한 작용제들과 접합될 수 있다. 본 발명의 항체가 치료적으로 사용될 수 있는 방식의 요약은 보체 또는 이펙터 세포에 의해 매개되거나 항-종양 약물, 독소 및 방사성핵종에 접합된, 항체에 의한 직접적인 세포독성을 포함한다. 항체는 순환 또는 골수로부터의 종양 세포의 생체외 제거에 또한 사용될 수 있다.
세포독성 단백질에는 리신(Ricin)-A, 슈도모나스 독소, 디프테리아 독소, 및 종양 괴사 인자가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 진단성 방사성핵종 및 세포독성제 예컨대 세포독성 방사성핵종, 약물 및 단백질이 또한 본 발명의 항체에 접합될 수 있다. 항체에 커플링될 수 있고 생체 내에서 선택적으로 항원 부위로 전달될 수 있는 방사성핵종의 예로는 212Bi, 131I, 186Re, 및 90Y가 특히 포함된다. 방사선요법 업계에 공지된 바와 같이, 방사성핵종은 국소적으로 세포에 방사선을 조사하여 다양한 세포내 병변에 이르는 것에 의해 그의 세포독성 효과를 발휘할 수 있다. 항체에 접합될 수 있고 이어서 생체내 요법에 사용될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 다우노루비신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 미토마이신 C가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 세포독성 약물은 DNA, RNA, 및 단백질 합성이 포함되는 중대한 세포 프로세스를 방해할 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 투여되는 용량은 치료될 상태의 성질, 및 항체 분자가 예방적으로 사용되는지 또는 현존하는 상태를 치료하는데 사용되는지에 좌우된다. 예방적으로, 즉 백신으로서 투여된다면, 항체는 대상체에서 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로 투여된다.
항체 분자의 반감기가 짧으면 (예를 들어, 2 내지 10시간), 하루에 1회 이상의 용량을 제공하는 것이 필요할 수 있다. 별법적으로, 항체 분자의 반감기가 길면 (예를 들어, 2 내지 15일). 투여량을 하루에 1번, 일주일에 1번, 또는 심지어 1 또는 2개월마다 1번 제공하는 것만이 필요할 수 있다.
제약 조성물은 항체 투여를 위해 제약상 허용되는 담체를 또한 함유할 수 있다. 담체는 담체 자체가 조성물이 제공되는 개체에게 해로운 항체의 생산을 유도하지 않아야 하고, 독성이지 않아야 한다. 적절한 담체는 당업계에 공지된 것들을 포함하고, 천천히 대사되는 대형 거대분자 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자로부터 선택될 수 있지만, 적절한 담체는 이러한 예에 한정되지 않는다.
투여에 바람직한 형태에는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여에 적절한 형태가 포함된다. 제품이 주사 또는 주입용인 경우에, 이는 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀션 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 별법적으로, 항체 분자는 사용 전에 적합한 멸균 액체로 재구성하기 위한 건조 형태일 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물이 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 조성물이 인간 대상체에게 투여하기 위해 개조되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제약 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 뇌실내, 경진피, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(hypospray) 또한 본 발명의 제약 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사제로서 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 내에 용해 또는 현탁시키기에 적절한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 달성될 것이거나, 또는 조직의 사이질 공간에 전달될 것이다. 투여량 치료는 단일 용량 일정 또는 다중 용량 일정일 수 있다.
항체 또는 항체 단편 조성물이 위장관을 사용하는 경로에 의해 투여되는 경우, 조성물은 분해로부터 항체를 보호하지만 일단 흡수되면 항체를 위장관으로부터 방출하는 추가적인 작용제를 함유할 수 있다. 이같은 추가적인 작용제들은 당업자에게 주지되어 있다.
본 발명의 항체는 유전자 요법을 수행하는 방법에서 또한 투여될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 적합한 DNA 성분의 제어 하에 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열이 환자 내로 도입되어, 항체 사슬들이 이러한 DNA 서열로부터 발현되고 계내에서 조립된다.
본 발명의 항체 및 항체 단편은 암 치료를 필요로 하는 환자에서의 암 치료에 또한 사용될 수 있다. 한 측면에서, 암은 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 혈액, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 또는 뇌 암이다. 한 측면에서, 암은 유방암이다. 또 다른 측면에서, 유방암은 관상 또는 소엽성 유방암이다.
또 다른 측면에서, 유방암 치료를 필요로 하는 환자에서의 유방암 치료 방법은 (a) 상기 환자를 유방암으로 진단하는 단계; (b) 상기 환자로부터 수득된 샘플 내의 PCBP-1의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 결정하는 단계; (c) 상기 유방암이 관 암종인지 또는 소엽성 암종인지를 결정하는 단계; (d) 상기 유방암이 HER2-양성인지 또는 HER2-음성인지를 결정하는 단계; (e) 상기 유방암이 에스트로겐 수용체-양성인지 또는 에스트로겐 수용체-음성인지를 결정하는 단계; (f) 상기 유방암이 프로게스테론 수용체-양성인지 또는 프로게스테론 수용체-음성인지를 결정하는 단계; 및 (g) 상기 환자에게 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 하나 이상의 화학요법제는 아로마타제(aromatase) 억제제, 호르몬 요법 작용제, 탁산, 알킬화제, 안트라사이클린, 항-폴레이트, 피리미딘 유사체, 및 모노클로날 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 아로마타제 억제제는 엑스메스탄, 아나스트로졸 및 레트로졸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 호르몬 요법은 타목시펜, 파레스톤(Fareston)™, 아리미덱스(Arimidex)™, 아로마신(Aromasin)™, 페마라(Femara)™, 졸라덱스(Zoladex)™, 메게이스(Megace)™ 및 할로테스틴(Halotestin)™으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 탁산은 도세탁셀 및 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 알킬화제는 시클로포스파미드, 메클로르에타민, 우라무스틴, 멜팔란, 클로람부실, 이포스파미드, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 티오테파 및 부술판으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 안트라사이클린은 다우로루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신 및 미톡산트론으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 항-폴레이트는 메토트렉세이트, 트리메토프림, 피리메탄 및 페메트렉세드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 피리미딘 유사체는 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 시토신 아라비노시드 및 젬시타빈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 모노클로날 항체는 헤르셉틴, 알퍼 PCBP-1 항체 및 알퍼 HER2 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
7. 약물 개발 표적으로서의 PCBP -1 발현 생성물
또한, 본 발명은 Pcbp -1 및 그의 상동체가 다양한 질환, 예컨대 암, 더욱 구체적으로는 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 결장, 위, 신장, 간, 두부, 경부, 폐, 췌장, 피부, 고환, 갑상선 및 뇌의 고형 종양을 앓고 있는 환자에서 세포에 의한 PCBP-1 항원의 발현을 야기할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 이러한 PCBP-1 항원 발현은 약물 개발 표적을 제시할 수 있고, 따라서 본 발명은 본 발명의 PCBP-1 항체 또는 항체 단편뿐만 아니라 다양한 기타 분자, 예컨대 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 백신 및 화학적 화합물이 또한 표적으로 할 수 있는 바이오마커로서의 이같은 PCBP-1 항원의 용도에 또한 관련된다.
Pcbp -1 및 그의 상동체의 유전자 산물의 발현을 특징으로 하는 질환을 치료 및/또는 진단하는 것에서 유용한 약물을 개발하는 방법은 질환에 걸린 대상체에서 Pcbp-1 및 그의 상동체에 의해 발현되는 유전자 산물을 확인하는 단계 및 이러한 유전자 산물을 이를 특이적으로 표적화하는 약물의 개발 및 확인에 관하여 이용하는 단계를 포함할 수 있다.
일단 PCBP-1 항원을 기초로 후보 약물이 개발되었으면, PCBP-1 발현 생성물을 제시하는 질환 세포에 대해 원하는 수준의 특이성을 나타내는 약물 후보를 확인하기 위해, 본 발명의 PCBP-1 항체 및 항체 단편 및 PCBP-1 항원을 다양한 약물 후보를 스크리닝하는 것을 돕는데 사용할 수 있다.
하기의 실시예들은 비-제한적인 설명적인 예이다.
실시예 1
종양 절제 전에, 난소암 또는 유방암 환자로부터 10 ㎖의 혈액 샘플을 EDTA-함유 튜브 내로 수집하고, 바로 얼음 상에 놓았다. 수집한 지 2시간 이내에, 혈액 샘플을 1000×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 백혈구 연층 및 적혈구 층을 제거하고, 분석할 때까지 혈장을 250-500 ㎕ 분취량으로 -70℃에서 보관하였다. II기, III기, 및 IV기 난소암 또는 유방암 환자가 이러한 연구에 선택되었다. 대조군은 브리검 앤 위민즈 병원(Brigham and Women's Hospital)의 혈액 은행에 혈액을 기증한 암에 걸리지 않은 건강한 여성으로부터 수득하였다. 유방암 환자로부터의 혈액을 시트르산나트륨 튜브 (벡톤-디킨슨((Becton-Dickinson))에 수집하고, 제조사의 설명서에 따라 프로세싱하였다. 혈장 샘플을 분취하고, 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
II-IV기 난소암 환자 20명으로부터 단리된 혈장 샘플을 브리검 앤 위민즈 병원으로부터 수득하였다. 대조군 및 환자 군으로부터 수득된 혈장 샘플 (C: 대조군 유방 혈액 샘플, NM: 비-전이성 유방 혈액 샘플, M: 전이성 유방 혈액 샘플)을 PBS로 1:100의 비로 희석하였다. 가용성 혈장 필라민-A 수준에서의 증가가 암과 연관되는 것으로 보고되었다. 혈장 필라민-A 수준을 효소-결합 면역흡착 효소 검정법으로 측정하였다. ELISA 플레이트 (날지 눈크™ 인터내셔날, 뉴욕주 록체스터)를 100 ㎕/웰의 희석된 혈장으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 혈액 혈장 샘플을 맹검 방식으로 분석하였다. 웰을 PBS로 세척하고, 차단 완충제 (PBS 내 5％ BSA)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 희석 완충제 (PBS 완충제, 1％ BSA, 0.01％ 트윈-20™) 내의 1차 항체 A-FLNA (45 ㎍/㎖)를 첨가하였다. 웰을 PBS/0.03％ 트윈-20™으로 세척하고, 100 ㎕/웰의 1:3000으로 희석된 2차 항체 (HRP-당나귀 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노리서치, 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 후, 100 ㎕의 이뮤노퓨어 TMB™ 기질 용액 (피어스, 일리노이주 록퍼드)을 첨가하였다. 100 ㎕/웰의 1N H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, ELISA 판독기로 분석을 수행하였다. 숫자는 필라민-A 수준에 대한 혈장 판독치의 광학 밀도 (OD) 값을 나타낸다. 맨-휘트니 테스트를 사용하여 P-값이 유도되었고, 이는 대조군, 비-전이성 군 및 전이성 군 사이의 유의한 차이를 나타냈다 (p<0.001). ANOVA에 의한 대조군과의 비교에 의해 P 값이 결정되었다. 데이터는 삼중으로 수행된 4개의 독립적인 실험을 대표한다. 모든 분석은 맹검 조건 하에 수행되었다. 도 1 참조.
유방암 환자로부터의 혈장 샘플을 항-PCBP-1 모노클로날 항체를 사용하는 ELISA 분석에 적용하였다. 대조군 및 환자 군으로부터 수득된 혈장 샘플 (C: 대조군 유방 혈액 샘플, NM: 비-전이성 유방 혈액 샘플, M: 전이성 유방 혈액 샘플)을 PBS로 1:100의 비로 희석하였다. 혈장 PCBP-1 수준을 효소-결합 면역흡착 효소 검정법으로 측정하였다. ELISA 플레이트 (날지 눈크 인터내셔날, 뉴욕주 록체스터)를 100 ㎕/웰의 희석된 혈장으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 혈액 혈장 샘플을 맹검 방식으로 분석하였다. 웰을 PBS로 세척하고, 차단 완충제 (PBS 내 5％ BSA)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 희석 완충제 (PBS 완충제, 1％ BSA, 0.01％ 트윈-20™) 내의 1차 항체 항-PCBP-1 (45 ㎍/㎖)를 첨가하였다. 웰을 PBS/0.03％ 트윈-20로 세척하고, 100 ㎕/웰의 1:3000으로 희석된 2차 항체 (HRP-당나귀 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노리서치, 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 후, 100 ㎕의 이뮤노퓨어 TMB™ 기질 용액 (피어스, 일리노이주 록퍼드)을 첨가하였다. 100 ㎕/웰의 1N H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, ELISA 판독기로 분석을 수행하였다. 숫자는 PCBP-1 수준에 대한 혈장 판독치의 광학 밀도 (OD) 값을 나타낸다. 맨-휘트니 테스트를 사용하여 P-값이 유도되었다. 대조군과 전이성 군은 유의한 차이를 나타냈다 (p<0.001). 대조군과 비-전이성 군은 유의한 차이를 나타내지 않았다. 비-전이성 군과 전이성 군 사이에 유의한 차이가 있었다 (p<0.001). ANOVA에 의한 대조군과의 비교에 의해 P 값이 결정되었다. 데이터는 삼중으로 수행된 4개의 독립적인 실험을 대표한다. 모든 분석은 맹검 조건 하에 수행되었다. 도 2a 및 2b 참조.
실시예 2
인간 유방암 세포에서의 PCBP -1의 세포성 국소화
인간 정상 유방 상피 세포 (HMEC), SKBR3 세포 (인간 비-전이성 유방 암 세포) 및 MDA-MB-231 세포 (인간 전이성 유방암 세포)를 유리 슬라이드 상에 시딩하고 성장시켰다. 세포를 포르말린 (10％ + 0.1％ 트리톤™-X)으로 고정하고, PBS로 세척하고, 항-PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로 염색하였다. 그 후, 세포를 FITC-표지 2차 염소-항-마우스 항체로 표지하고, 레이저 공초점 현미경검사에 적용하였다. 간접적 면역형광 염색이 HMEC의 세포질에서 관찰되었다. SKBR3 세포는 세포질 및 핵 염색을 나타냈다. MDA-MB-231 세포는 세포질 염색을 나타냈다. 도 3 참조.
실시예 3
인간 자궁경부 세포에서의 PCBP -1의 세포성 국소화
건강한 대상체 및 자궁경부암 환자의 팹 도말 표본으로부터 수득된 자궁경부 세포를 유리 슬라이드 상에 시딩하고 성장시켰다. 세포를 포르말린 (10％ + 0.1％ 트리톤-X)으로 고정하고, PBS로 세척하고, 항-PCBP-1 마우스 모노클로날 항체로 염색하였다. 그 후, 세포를 FITC-표지 2차 염소-항-마우스 항체로 표지하고, 레이저 공초점 현미경검사에 적용하였다. 간접적 면역형광 염색이 정상 자궁경부 세포의 세포질 및 핵에서 관찰되었다. 자궁경부암 세포 (CIN III)는 세포질 염색만 나타냈다. 도 4 참조.
실시예 4
약 2 ㎍의 정제된 7SK mAb를 PBS에 현탁시키고, 환원 조건 (10％ SDS 및 베타-메르캅토에탄올 + 샘플 완충제에서 3분 동안 끓임) 및 비-환원 조건 (끓이지 않고, 베타-메르캅토에탄올이 없음) 하에 6％ 및 8％ 트리스-글리신 겔에 적용하고, 120 볼트에서 러닝시켰다. 그 후, 겔을 쿠마시 블루 (0.1％ (w/v) 쿠마시 블루 R350, 20％ (v/v) 메탄올, 및 10％ (v/v) 아세트산)로 염색하고, 수중 50％ (v/v) 메탄올 + 10％ (v/v) 아세트산으로 염색을 제거하고, 겔의 영상을 찍었다. 분자량 마커가 오른쪽에 제시된다. 6％ 트리스-글리신 겔은 비-환원 조건 하에 약 150 kDa에서 IgG1 항체 (7SK)를 나타냈다. 8％ 트리스-글리신 겔은 약 50 kDa에서 IgG1 항체 (7SK)의 중쇄를 나타냈다. 도 5 참조.
실시예 5
약 1 ㎍의 정제된 7SK mAb를 PBS에 현탁시키고, 환원 조건 (10％ SDS 및 베타-메르캅토에탄올 + 샘플 완충제에서 3분 동안 끓임) 및 비-환원 조건 (끓이지 않고, 베타-메르캅토에탄올이 없음) 하에 8％ 트리스-글리신 겔에 적용하고, 120 볼트에서 러닝시켰다. 그 후, 겔을 쿠마시 블루 (0.1％ (w/v) 쿠마시 블루 R350, 20％ (v/v) 메탄올, 및 10％ (v/v) 아세트산)로 염색하고, 수중 50％ (v/v) 메탄올 + 10％ (v/v) 아세트산으로 염색을 제거하고, 겔의 영상을 찍었다. 분자량 마커가 왼쪽에 제시된다. 변성 조건 하에, IgG1 Ab (7SK)의 중쇄가 약 50 kDa에서 검출되고, IgG1 (7SK)의 경쇄가 약 25 kDa에서 검출되었다. 비-환원 겔에서는, 150 kDa에서 무손상 IgG1 (7SK)이 검출되었다. 도 6 참조.
실시예 6
SKBR3 세포를 10％ 글루타르알데히드로 고정하고, 0.1％ 트리톤-X100으로 투과성이게 만들었다. 그 후, PCBP-1 발현을 7SK mAb 및 2차 FITC-표지 항-마우스 항체 (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베이니아주 웨스트 그로브)로 가시화하였다. DAPI 염색 (몰레큘러 프로브즈, 오리건주 유진)으로 핵을 가시화하였다. 63× 대물 렌즈가 장착된 올림푸스 현미경을 사용하여 영상을 분석하였다. 도 7 참조.
실시예 7
스팟(spot) 1을 트립신으로 소화시키고, MALDI-MS로 분석하였다. 확인된 주요 단백질은 폴리(rC)-결합 단백질 1, 스위스프롯(SwissProt) Q15365였다. 알부민 (단편) 및 헤모글로빈 알파 및 베타가, 아마도 오염물로서, 또한 존재하였다.
실시예 8
대조군 및 환자 군으로부터 수득된 혈장 샘플 (C: 대조군 유방 혈액 샘플, NM: 비-전이성 유방 혈액 샘플, M: 전이성 유방 혈액 샘플)을 PBS로 1:100의 비로 희석하였다. 혈장 PCBP-1 수준을 효소-결합 면역흡착 효소 검정법으로 측정하였다. ELISA 플레이트 (날지 눈크 인터내셔널, 뉴욕주 록체스터)를 100 ㎕/웰의 희석된 혈장으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 혈액 혈장 샘플을 맹검 방식으로 분석하였다. 웰을 PBS로 세척하고, 차단 완충제 (PBS 내의 5％ BSA)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 희석 완충제 (PBS 완충제, 1％ BSA, 0.01％ 트윈-20) 내의 1차 항체 7SK (클론 명칭: 알퍼-pCBP-1) (45 ㎍/㎖)를 첨가하였다. 웰을 PBS/0.03％ 트윈-20으로 세척하고, 100 ㎕/웰의 1:3000으로 희석된 2차 항체 (HRP-당나귀 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노리서치, 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 후, 100 ㎕의 이뮤노퓨어 TMB 기질 용액 (피어스, 일리노이주 록퍼드)을 첨가하였다. 100 ㎕/웰의 1N H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, ELISA 판독기로 분석을 수행하였다. 숫자는 PCBP-1 수준에 대한 혈장 판독치의 광학 밀도 (OD) 값을 나타낸다. 도 8a 내지 8c 참조.
실시예 9
대조군 및 환자 군으로부터 수득된 혈장 샘플 (C: 대조군 유방 혈액 샘플, NM: 비-전이성 유방 혈액 샘플, M: 전이성 유방 혈액 샘플)을 PBS로 1:100의 비로 희석하였다. 혈장 PCBP-1 수준을 효소-결합 면역흡착 효소 검정법으로 측정하였다. ELISA 플레이트 (날지 눈크 인터내셔널, 뉴욕주 록체스터)를 100 ㎕/웰의 희석된 혈장으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 혈장 샘플을 맹검 방식으로 분석하였다. 웰을 PBS로 세척하고, 차단 완충제 (PBS 내의 5％ BSA)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 희석 완충제 (PBS 완충제, 1％ BSA, 0.01％ 트윈-20) 내의 1차 항체 7SK MoAb (클론 명칭: 알퍼-pCBP-1) (45 ㎍/㎖)를 첨가하였다. 웰을 PBS/0.03％ 트윈-20으로 세척하고, 100 ㎕/웰의 1:3000으로 희석된 2차 항체 (HRP-당나귀 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노리서치, 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 후, 100 ㎕의 이뮤노퓨어 TMB 기질 용액 (피어스, 일리노이주 록퍼드)을 첨가하였다. 100 ㎕/웰의 1N H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 정지시키고, ELISA 판독기로 분석을 수행하였다. OD로 광학 밀도가 표시되고, 이는 혈장 내의 PCBP-1 수준을 나타낸다. 시리즈 1-2는 대조군을 나타내고, 시리즈 3-4는 비-전이성 혈장 샘플을 나타내며, 시리즈 5-6은 전이성 혈장 샘플을 나타낸다. 1: 전이성, 2: 비-전이성, 3: 대조군 혈장 샘플. 도 9a 내지 9c 참조.
실시예 10
가장 윗줄에서 제공된 폴리펩티드 서열이 PCBP-1 mAb의 서열에 상응하는, PCBP-1 mAb 7SK의 중쇄의 FWR 및 CDR. 문헌 [Kabat et al.]의 관례를 사용하여 아미노산 잔기의 번호가 매겨진다. 밑줄친 텍스트에 기재된 볼드체 잔기는 특이성 결정 잔기 (SDR)를 가리킨다. 도 10a 내지 10f 참조.
실시예 11
가장 윗줄에서 제공된 폴리펩티드 서열이 PCBP-1 mAb의 서열에 상응하는, PCBP-1 mAb 7SK의 경쇄의 FWR 및 CDR. 문헌 [Kabat et al.]의 관례를 사용하여 아미노산 잔기의 번호가 매겨진다. 밑줄친 텍스트에 기재된 볼드체 잔기는 특이성 결정 잔기 (SDR)를 가리킨다. 도 11a 내지 11f 참조.
실시예 12
SKBR3 세포로부터의 세포 용해물을 2D 폴리아크릴아미드 겔 상에 러닝시키고, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막에 PCBP-1 mAb를 프로빙(probing)하였다. PCBP-1에 상응하는 스팟 1을 상응하는 쿠마시-블루로 염색된 2D 겔에서 절단하고, 트립신 소화에 적용하였다. 트립신 처리된 펩티드를 MALDI-TOF로 분석하여, 소화된 펩티드의 서열을 결정하였다. 소화로부터 수득된 모든 펩티드의 서열이 PCBP-1의 서열에 상응하였다. 도 12 참조.
실시예 13
다양한 정상 및 인간 암 조직의 조직 샘플을 함유하는 조직 어레이를 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 (7SK)를 사용하는 면역조직화학에 적용하였다. 117-2 다중 조직 어레이, YTMAF96 어레이 및 YTMAF179-3의 슬라이드에서 파라핀을 제거하고, 증류수로 재수화시켰다. 열-유도 에피토프 복구를 pH 6.0의 시트레이트 완충제에서 20분 동안 95-101℃에서 수행한 후, 슬라이드를 실온으로 냉각되게 하고, 트리스 완충제로 헹궜다. 퍼옥시다제 블록을 5분 동안 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 다시 트리스 완충제로 헹궜다. 백그라운드 스나이퍼(BACKGROUND SNIPER)™ (바이오케어 메디컬 프로덕츠(Biocare Medical Products), 캘리포니아주 콩코드)를 5분 동안 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 트리스 완충제로 헹궜다. 그 후, 알퍼 PBCP-1 마우스 모노클로날 항체의 1:50 희석물을 실온에서 30분 동안 어레이 슬라이드에 적용하고 나서, 트리스 완충제로 헹궜다. MACH 3™ 프로브 (바이오케어 메디컬 프로덕츠, 미국 캘리포니아주 콩코드)를 15분 동안 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 트리스 완충제로 헹군 후, MACH 3™ 중합체 (바이오케어 메디컬 프로덕츠, 미국 캘리포니아주 콩코드)를 15분 동안 슬라이드에 첨가하였다. 트리스 완충제로 헹군 후, 디아미노벤젠테트라히드로클로라이드를 5분 동안 슬라이드에 적용하였다. 그 후, 슬라이드를 헤마톡실린 대조염색물과 접촉시켰다. 조직 어레이를 현미경검사를 통해 염색 강도에 대해 분석하였다. 결과가 도 13에 요약된다. 정상 대조군에 비교하여 결장암, 흑색종, 편평 암종, 교모세포종, 자궁내막암, 육종 및 방광암에서는 PCBP-1 염색 강도가 증가된 한편, 정상 대조군과 비교하여 난소암에서는 PCBP-1 강도가 감소되었다.
정상 유방 상피 세포는 핵 염색 강도에서의 1배 내지 3배 증가를 나타낸 한편, 유방암 세포는 PCBP-1에 대해 3배 세포질 염색 강도 및 때때로 2배 내지 3배 핵 염색 강도를 나타냈다. PCBP-1에 대한 증가된 세포질 염색 강도를 나타내는 유방암 세포는 핵 염색이 정상인 유방 세포보다 더 낮은 환자 생존 가능성과 연관되었다. 유방 소엽성 암종 세포는 유방 관 암종 세포와 비교하여 더 낮은 PCBP-1 세포질 염색 강도를 나타냈다.
결장암 조직 상피 세포는 정상 결장 조직 상피 세포에 비해 세포질 PCBP-1 염색 강도에서의 3배 증가를 나타냈다. 세포질 염색 강도에서의 3배 증가가 흑색종 및 편평 암종 세포 양쪽에서 관찰된 한편, 정상 피부 세포는 PCBP-1에 대한 약한 핵 염색을 나타냈다. 세포질 염색에서의 2배 증가가 다형성 교모세포종 및 성상세포종에서 관찰된 한편, 정상 뇌 뉴런 및 성상세포에서는 염색이 관찰되지 않았다. 육종 및 방광암 세포는 정상 근육 및 정상 방광 세포에 비교하여 세포질 염색에서의 2배 내지 3배 증가를 나타냈다. 정상 자궁내막 세포는 PCBP-1에 대한 음성 또는 약한 세포질 염색을 나타낸 한편, 자궁내막암 세포는 PCBP-1에 대한 핵 및 세포질 염색에서의 3배 증가를 나타냈다. 난소암 세포는 정상 난소 세포에 비교했을 때 PCBP-1에 대한 세포질 및 핵 염색에서의 3배 증가를 나타냈다.
실시예 14
가용성인 천연 형태의 PCBP-1을 SKBR3 인간 유방암 세포 조건화 배지로부터 정제하였다. 천연 PCBP-1 항원을 정제하기 위해 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체가 세파로스 (즉, CNBr-활성화 세파로스 또는 유사한 키트 (지이 헬스케어 바이오-사이언시즈 코포레이션(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) (미국 뉴저지주 피스카타웨이) 또는 피어스 케미컬 컴패니(Pierce Chemical Co.) (미국 일리노이주 록퍼드)로부터 입수가능함))에 가교된 친화도 접근법을 이용하였다. 조건화 배지가 생성되었고, PCBP-1의 친화도 정제를 수행하였다.
정제된 PCBP-1을 크기 (SDS-PAGE), 순도 (SDS-PAGE, SEC-HPLC, 웨스턴 블롯), 및 응집 (웨스턴 블롯)에 관하여 특성화하였다. 정제된 PCBP-1 제제의 안정성을 경시적으로 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의해 모니터링하였다. 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 수성 상 분획화 및/또는 역류 크로마토그래피를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는 비-친화도 기술을 사용하여 정제 규모를 증가시킬 수 있다.
실시예 15
정제된 PCBP-1을 3-5개월의 기간에 걸쳐 코흘러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 원형 주사 및 통상적인 모노클로날 항체 생산 기술을 사용하여 6주령 Balb/c 마우스 및 6파운드 NZW 토끼에게 iv, ip, 또는 근육내 경로를 통해 주사하였다 (문헌 [Kohler et al., Nature 256(5517): 495-497, 1975]). 주사 동안, 특정 시간 간격으로 여러 테스트 채혈을 수행하여 마우스 및 토끼에서 면역학적 반응, 뿐만 아니라 항체 생산을 테스트하였다. 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 생산을 ELISA, 웨스턴 블롯 및 면역형광 염색 기술을 사용하여 테스트하였다.
실시예 16
700개의 샘플을 함유하는 결절-양성 및 결절-음성 침습성 유방 암종 조직 마이크로어레이인 YTMA 49-10 어레이를 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 (7SK)를 사용하는 면역조직화학에 적용하였다. 크실렌에 2회 함침시키고 15분 동안 인큐베이션하는 것에 의해 YTMA 49-10 다중-조직 어레이의 슬라이드에서 파라핀을 제거하였다. 그 후, 슬라이드를 크실렌:에탄올의 1:1 용액에 5분 동안 함침시켰다. 그 후 슬라이드를 100％ 에탄올에 5분 동안 함침시키고 나서, 95％, 75％ 및 50％ 에탄올에 각각 3분 동안 함침시켰다. 슬라이드를 시약 품질의 물로 5분 동안 헹구고, 항원 복구를 수행할 준비가 될 때까지 증류수에 함침시킴으로써 재수화시켰다. 열-유도 에피토프 복구를 pH 6.0의 시트레이트 복구 완충제에서 40분 동안 95-100℃에서 수행한 후, 슬라이드를 실온으로 냉각되게 하고, 트리스 완충제 (트리스 완충 염수 + 트윈 20, pH 7.6)로 헹궜다. 퍼옥시다제 블록 (3％ 과산화수소)을 5분 동안 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 다시 트리스 완충제로 헹궜다. 백그라운드 스나이퍼™ (바이오케어 메디컬 프로덕츠, 캘리포니아주 콩코드: 카탈로그 번호 BS966 G) 차단 시약을 5분 동안 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 트리스 완충제로 헹궜다. 그 후, 알퍼 PBCP-1 마우스 모노클로날 항체의 1:50 희석물을 실온에서 1시간 동안 어레이 슬라이드에 적용하고 나서, 트리스 완충제로 3회 헹궜다. MACH 3™ 프로브 (바이오케어 메디컬 프로덕츠, 미국 캘리포니아주 콩코드; 카탈로그 번호 M3M530)를 15분 동안 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 트리스 완충제로 3회 헹군 후, MACH 3™ 중합체 (바이오케어 메디컬 프로덕츠, 미국 캘리포니아주 콩코드; 카탈로그 번호 M3M530)를 15분 동안 슬라이드에 첨가하였다. 트리스 완충제로 3회 헹군 후, 디아미노벤젠테트라히드로클로라이드 (DAB)를 슬라이드에 적용하고, 원하는 염색 강도가 발색될 때까지 슬라이드를 인큐베이션하였다. 그 후, 원하는 경우 슬라이드를 헤마톡실린 대조염색물과 접촉시켰다. 그 후, 70％ 에탄올, 80％ 에탄올, 95％ 에탄올 및 100％ 에탄올에 각각 2분 동안 함침시키고 나서, 2분 동안 크실렌에 2회 함침시켜 슬라이드를 고정하였다. 조직 어레이를 낮은 해상도 (10-20×)에서 현미경검사를 통해 분석하여, 잘 보존되고 잘 염색된 면적의 위치를 알아냈다. 확인된 잘 보존되고 잘 염색된 면적을 사용하여, PCBP-1 발현의 강도를 결정하였다. 염색된 세포의 백분율이 잘 보존된 세포의 총 개수의 0％, 50％ 미만, 또는 50％ 초과로서 추정되었다. 그 후, 염색된 세포를 염색 강도에 대해 검정하였고, 이는 음성 내지 희미함 내지 약함 내지 강함의 범위일 수 있다. 결과가 도 14 및 15에서 요약된다. 관상 및 소엽성 유방암 세포에서의 음성 및 1+, 2+ 및 3+ 염색의 예가 도 16-18에서 제시된다.
실시예 17
A. RP11-175A7 BAC 클론의 표지
호모 사피엔스(Homo sapiens) BAC 클론 RP11-175A7 (서열 51; 진뱅크 등록 번호 AC016700.8)의 DNA를 표준 프로토콜을 사용하여 틈 번역에 의해 형광으로 표지하였다. BAC 클론 RP11-175A7로부터의 DNA를 표준 방법으로 제조하였다. BAC DNA (8 ㎕), dNTP (5 ㎕), 10× 틈 번역 완충제 (5 ㎕), 10× 베타-메르캅토에탄올, 오렌지-dUTP (1 ㎕), DNA 폴리머라제 (2 ㎕), DNAse (3 ㎕의 1:1000 희석물), 뉴클레아제(nuclease)가 없는 H2O (21 ㎕)를 포함하는 틈 번역 반응을 준비하고, 15℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 1 ㎕의 0.5 M EDTA로 반응을 정지시켰다. 10 ㎕의 연어 정자 DNA, 40 ㎕ Cot-1 DNA, 10 ㎕의 3 M NaOAc, pH 5.2 및 200 ㎕의 100％ EtOH을 첨가한 후 -80℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 반응물을 에탄올 침전시켰다. 침전된, 오렌지-dUTP로 표지된 DNA를 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 수집하였다. 펠릿을 건조시키고, 32 ㎕의 뉴클리아제가 없는 물, 8 ㎕의 20× SSC 및 40 ㎕의 포름아미드 내의 20％ 덱스트란 술페이트에 재현탁시켜, 80 ㎕의 혼성화 혼합물을 제조하였다.
B. 혼성화
유방암 세포주 SK-BR 3, MDA-MB-231 및 C2T2의 중기의 염색체 DNA의 슬라이드를 제조하고, 염색체 DNA를 변성시키고 반복 DNA에 대한 비-특이적 혼성화를 차단하도록 예비처리하였다. 상기 단계 A에서 제조된 혼성화 프로브를 비등에 이어지는 신속한 냉각에 의해 간단하게 변성시키고, 염색체 슬라이드 제제에 적용하고, 약 12시간 동안 인큐베이션하여 혼성화되도록 하였다. 혼성화된 슬라이드를 표준 방법에 따라 세척하여 혼성화되지 않은 프로브 및 부분적으로 혼성화된 프로브를 제거하였다. 형광 현미경검사에 의해 결과를 가시화 및 정량하였다. 3가지 세포주 각각에 대한 개별적인 세포의 염색체 스프레드의 영상이 기록되었고, 도 19에서 제시된다.
실시예 18
상기 실시예 16에서 열거된 염색 프로토콜을 건강한 대상체, 비-전이성 관상 암 환자 및 전이성 관상 암 환자로부터의 약 300개의 미처리 유방 조직 샘플 상에서 사용하였다. 염색된 조직 샘플은 '유방의 정상 인접 조직 및 암 조직 어레이(Breast normal adjacent tissue and cancer tissue array)' (바이오맥스(Biomax) #BRN801a)에 포함되었다. BRN801a 어레이에는 정상 및 유방 암종 병리학 진단 둘 모두의 조직 샘플이 있었다. 이러한 어레이는 인접한 정상 유방 조직의 사례 70개 + 상이한 샘플로부터 수득된 악성 침습성 유방 관 암종 조직의 조직 절편 10개를 포함하였다. 상기 실시예 16에서 열거된 염색 프로토콜을 '유방의 침습성 관 암종 및 매칭되는 전이성 암종 조직 마이크로어레이(Breast invasive ductal carcinoma and matched metastatic carcinoma tissue microarray)' (바이오맥스 BR10010)에서 또한 사용하였다. BR10010 어레이는 유방 암종의 샘플 50개 (46개의 침습성 관 암종, 1개의 미세유두 암종, 2개의 침습성 소엽성 암종, 1개의 신경내분비 암종), 및 림프절로부터 수득된 매칭되는 전이된 유방 암종 50개로부터의 조직 절편을 함유하였다. 이러한 염색 프로토콜을 '유방 종양 조직 어레이(Breast Tumor Tissue Array)' (바이오체인 인스티튜트 인크(Biochain Institute, Inc); Z7020009)에서 또한 사용하였다. Z7020009 어레이에는 정상 유방 조직, 과다형성 유방 조직, 섬유선종 유방 조직, 침습성 관 암종, 침습성 소엽성 암종 및 파제트병이 포함되는 6개의 병리학적 조직 유형으로부터 수술에 의한 절제로 수득된 이중 조직 샘플이 있었다.
결과는 PCBP-1이 건강한 유방 조직 상피 세포에서 핵에서 높은 양으로 국소화 및 발현된다는 것을 나타낸다. 세포에 형질전환이 진행됨에 따라, PCBP-1 발현이 더욱 세포질성이 되고, 이때 약간의 핵 발현도 있으며, 건강한 세포에서보다 전체적으로 발현이 증가되었다. 관 암종 세포가 전이성이 됨에 따라, PCBP-1 발현은 전적으로 세포의 세포질 내였고, 핵에서는 염색되지 않았다. 전이성 관상 유방암의 사례 100개 중에서, PCBP-1의 핵 발현은 관찰되지 않았다.
실시예 19
상기 실시예 16에서 열거된 염색 프로토콜을 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 (7SK) 및 예일 유방암 코호트(Yale Breast Cancer Cohort) YTMA 49_9 어레이와 함께 사용하였다. 예일 암 센터/병리학 조직 마이크로어레이 기관에서 조직 샘플 상에서의 병리학적 분석이 수집 및 제공되었고, 샘플이 슬라이드 상에 배열되었다. 이 기관은 연구원들이 결과를 암 병리학에 상호관련시킬 수 있도록 (관상 암의 결정 포함), 배열된 샘플의 지도를 제공하였다. 이러한 샘플들을 PCBP-1 염색에 대해 맹검식으로 분석하였다. 결과는 더 높은 수준의 PCBP-1 발현 (PCBP-1 점수 +2 또는 +3)이 PCBP-1 발현이 더 낮은 수준 (PCBP-1 점수 0 또는 +1)인 관상 유방암 환자와 비교하여 관상 유방암 환자의 전체 예후 또는 생존의 감소와 상호관련된다는 것을 나타낸다. 도 20 참조. 이러한 상관관계는 0.0243의 p-값으로 통계적으로 유의하였다. 맹검 분석에서 PCBP-1 점수가 결정되었고, 이때 0점 또는 +1점은 낮은 수준의 PCBP-1 염색이다. 관상 암 샘플에서의 0/+1과 +2/+3 사이의 차이가 +2 또는 +3점의 배열된 조직 샘플들의 더 높은 양의 세포질 염색에서 특히 명확하였다.
일반적인 지침은 하기와 같고, 표준 병리학 지침에 따라 샘플들을 채점할 수 있었다.
0점 = 침습성 종양 세포에서 염색이 관찰되지 않음
1+점 = 약한 핵 염색이 임의 비율의 침습성 종양 세포에서 관찰됨, 또는 약한 세포질 염색이 세포의 30％ 미만에서 관찰됨
2+점 = 약한 세포질 염색이 세포의 50％ 이상에서 관찰됨 또는 침습성 종양 세포에서 30％ 초과에서 강한 세포질 염색이 관찰됨
3+점 = 강한 세포질 염색이 종양 세포의 50％ 초과에서 관찰됨
실시예 20
상기 실시예 16에서 열거된 프로토콜을 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 (7SK) 및 예일 유방암 코호트 YTMA 49_9 어레이와 함께 사용하였다. 예일 기관이 환자 병리학 (림프절 상태 포함)의 지도화를 제공하였다. 결과는 더 높은 수준의 PCBP-1 발현이 3개 이상의 양성 림프절이 있는 관상 유방암 환자의 전체 예후에서의 감소와 상호관련된다는 것을 나타냈다. 도 21 참조. 이러한 상관관계는 0.0277의 p-값으로 통계적으로 유의하였다. 맹검 분석에서 PCBP-1 점수가 결정되었고, 이때 0점 또는 +1점은 낮은 수준의 PCBP-1 염색이다. 0/+1과 +2/+3 사이의 차이가 +2 또는 +3점의 배열된 조직 샘플들의 더 높은 양의 세포질 염색에서 특히 명확하였다.
실시예 21
상기 실시예 16에서 열거된 프로토콜을 알퍼 PCBP-1 마우스 모노클로날 항체 (7SK) 및 사이톨로지 서비스 오브 메릴랜드(Cytology Services of Maryland)로부터의 정상 유방 조직 및 미처리 비-전이성 유방암 조직의 어레이와 함께 사용하였다. 시판되는 항체를 사용하여 사이톨로지 서비스 오브 메릴랜드가 이러한 어레이에 대한 에스트로겐 수용체 (ER) 및 프로게스테론 수용체 (PR) 세포내 국소화의 검출을 제공하였다. 결과는 미처리 비-전이 유방암 환자 및 대조군에서 ER (핵) 양성과 PCBP-1 (핵) 양성 사이의 강한 양성 상관관계를 나타냈고, 이러한 상관관계는 ER 및 PCBP-1에 대한 핵에서의 >75％의 염색이었다. 도 22 참조. 높은 수준의 PR 염색 (2+/3+)과 높은 수준의 PCBP-1 염색 (2+/3+) 사이에 발현 및 염색 강도에서의 강한 양성 상관 관계가 또한 있었고, 이때 PR 및 PCBP-1 (39/41)에 대해 핵에서의 염색이 81％였다.
SEQUENCE LISTING <110> ALPER BIOTECH, LLC <120> MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PCBP-1 ANTIGENS, AND USES THEREFOR <130> P33725WO00/23440.019 <150> US 61/364362 <151> 2010-07-14 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile Arg Glu Glu Ser Gly Ala Arg 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Asn Ile Ser Glu Gly Asn Cys Pro Glu Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ile Ile Thr Leu Thr Gly Pro Thr Asn Ala Ile Phe Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Phe Ala Met Ile Ile Asp Lys Leu Glu Glu Asp Ile Asn Ser Ser 1 5 10 15 Met Thr Asn Ser Thr Ala Ala Ser Arg Pro Pro Val Thr Leu Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Val Val Pro Ala Thr Gln Cys Gly Ser Leu Ile Gly Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Ser Thr Gly Ala Gln Val Gln Val Ala Gly Asp Met Leu Pro Asn 1 5 10 15 Ser Thr Glu Arg 20 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ile Thr Ile Ala Gly Val Pro Gln Ser Val Thr Glu Cys Val Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Ile Cys Leu Val Met Leu Glu Thr Leu Ser Gln Ser Pro Gln Gly 1 5 10 15 Arg <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Val Met Thr Ile Pro Tyr Gln Pro Met Pro Ala Ser Ser Pro Val Ile 1 5 10 15 Cys Ala Gly Gly Gln Asp Arg 20 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Gln Ser His Phe Ala Met Met His Gly Gly Thr Gly Phe Ala Gly 1 5 10 15 Ile Asp Ser Ser Ser Pro Glu Val Lys 20 25 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Tyr Trp Ala Ser Leu Asp Ala Ser Thr Gln Thr Thr His Glu Leu 1 5 10 15 Thr Ile Pro Asn Asn Leu Ile Gly Cys Ile Ile Gly Arg 20 25 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Ala Asn Pro Val Glu Gly Ser Ser Gly Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Val Thr Ile Thr Gly Ser Ala Ala Ser Ile Ser Leu Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Leu Ile Asn Ala Arg 20 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Ser Ser Glu Lys Gly Met Gly Cys Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 345 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 15 gtg cag ctg gag gag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gcc tca 48 Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 gtg aag att tcc tgc aaa gtt tct ggc tac gca ttc agt agg tct tgg 96 Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser Trp 20 25 30 atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggt ctt gag tgg att gga 144 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 cgg atc tat cct gga gat gga gat act aac tac aat ggg aag ttc aag 192 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 50 55 60 ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agt aca gcc tac atg 240 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 cag ctc agc agc ctg acc tct gtg gac tct gcg gtc tat ttc tgt gca 288 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 aga tcg gaa cta tgg tca aaa atg ttt gct tac tgg ggc caa ggg acc 336 Arg Ser Glu Leu Trp Ser Lys Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 acg gtc aca 345 Thr Val Thr 115 <210> 16 <211> 115 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser Trp 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Glu Leu Trp Ser Lys Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr 115 <210> 17 <211> 294 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(294) <400> 17 cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgc aaa gct tct ggc tac gca ttc agt agc tct 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30 tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggt ctt gag tgg att 144 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga cgg att tat cct gga gat gga gat act aac tac aat ggg aag ttc 192 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg acc tct gtg gac tct gcg gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga 294 Ala Arg <210> 18 <211> 98 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 19 <211> 291 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 19 gttcagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 60 tgcaaggctt ctggctacgc attcagtagc tcctggatga actgggtgaa gcagaggcct 120 ggaaagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat 180 gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctact tctgtgcaag a 291 <210> 20 <211> 291 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 20 gttcagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 60 tgcaaggctt ctggctacgc attcagtagc tcctggatga actgggtgaa gcagaggcct 120 ggaaagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat 180 gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctact tctgtgcaag a 291 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 21 gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cac 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 22 tttgactact ggggccaagg caccactctc aca 33 <210> 23 <211> 291 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 23 gttcagctgc agcagtctgg ggctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 60 tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 120 ggaaagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatac taactacaac 180 ggaaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240 cagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag a 291 <210> 24 <211> 291 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 24 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaggatatcc 60 tgcaaggctt ctggctacac cttcacaagc tactatatac actgggtgaa gcagaggcct 120 ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tatcctggaa atgttaatac taagtacaat 180 gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240 cagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag a 291 <210> 25 <211> 290 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 25 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 60 tgcaaggctt ctggctacac cttcacaagc tactatatac actgggtgaa gcagaggcct 120 ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tatcctggag atggtagtac taagtacaat 180 gagaagttca agggcaagac cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240 ttgctcagca gcctgacctc tgaggactct gcgatctatt tctgtgcaag 290 <210> 26 <211> 288 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 26 cagctgcagc agtctggacc tgagctggtg aagcctgggg cttcagtgaa gatatcctgc 60 aaggcttctg gctacacctt cactgactac tatataaact gggtgaagca gaggcctgga 120 cagggacttg agtggattgg atggatttat cctggaagcg gtaatactaa gtacaatgag 180 aagttcaagg gcaaggccac attgactgta gacacatcct ccagcacagc ctacatgcag 240 ctcagcagcc tgacctctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaaga 288 <210> 27 <211> 291 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 27 gttcagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggctttagt gaagatatcc 60 tgcaaggctt ctggttacac cttcacaagc tacgatataa actgggtgaa gcagaggcct 120 ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tatcctggag atggtagtac taagtacaat 180 gagaaattca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240 cagctcagca gcctgacttc tgagaactct gcagtctatt tctgtgcaag a 291 <210> 28 <211> 291 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 28 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaaacctg gggcttcagt gcggatatcc 60 tgcaaggctt ttgggtacac cttcacaagc tactatatac actgggtgaa gcagaggcct 120 ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tatcctggaa atgttaatac taagtacaat 180 gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240 cagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag a 291 <210> 29 <211> 246 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 29 tcagtgaaga tttcctgcaa agcttctggc tacgcattca gtagctactg gatgaactgg 60 gtgaagcaga ggcctggaaa gggtcttgag tggattggac agatttatcc tggagatggt 120 gatactaact acaacggaaa gttcaagggc aaggccacac tgactgcaga caaatcctcc 180 agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acctctgagg actctgcggt ctatttctgt 240 gcaaga 246 <210> 30 <211> 325 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (3)..(320) <400> 30 tt ctg atg acc cag tct cct gct tcc tta gct gta tct ctg ggg cag 47 Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 agg gcc acc atc tca tac agg gcc agc aaa agt gtc agt aca tct ggc 95 Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly 20 25 30 tat agt tat atg cac tgg aac caa cag aaa cca gga cag cca ccc aga 143 Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg 35 40 45 ctc ctc atc tat ctt gta tcc aac cta gaa tct ggg gtc cct gcc agg 191 Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60 ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc aac atc cat cct 239 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro 65 70 75 gtg gag gag gag gat gct gca acc tat tac tgt cag cac att agg gag 287 Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu 80 85 90 95 ctt aca cgt tcg gag ggg gga cca agc tgg aaa taaaa 325 Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys 100 105 <210> 31 <211> 106 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 31 Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg 1 5 10 15 Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val 65 70 75 80 Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu 85 90 95 Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys 100 105 <210> 32 <211> 294 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(294) <400> 32 gac att gtg ctg aca cag tct cct gct tcc tta gct gta tct ctg ggg 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc atc tca tgc agg gcc agc aaa agt gtc agt aca tct 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 ggc tat agt tat atg cac tgg tac caa cag aaa cca gga cag cca ccc 144 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc atc tat ctt gca tcc aac cta gaa tct ggg gtc cct gcc 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc aac atc cat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 cct gtg gag gag gag gat gct gca acc tat tac tgt cag cac agt agg 288 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 gag ctt 294 Glu Leu <210> 33 <211> 98 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 33 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu <210> 34 <211> 290 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 34 ttgtgctaac acagtctcct gcttccttag ctgtatctct ggggcagagg gccaccatct 60 catgcagggc cagccaaagt gtcagtacat ctagctatag ttatatgcac tggtaccaac 120 agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tcaagtatgc atccaaccta gaatctgggg 180 tccctgccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac atccatcctg 240 tggaggagga ggatactgca acatattact gtcagcacag ttgggagatt 290 <210> 35 <211> 287 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 35 ttgtgctgac ccaatctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagagg gccaccatct 60 cctgcaaggc cagccaaagt gttgattatg atggtgatag ttatatgaac tggtaccaac 120 agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatgctgc atccaatcta gaatctggga 180 tcccagccag gtttagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac atccatcctg 240 tggaggagga ggatgctgca acctattact gtcagcaaag taatgag 287 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 36 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 36 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 37 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 33 <210> 38 <211> 287 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 38 ttgtgctgac ccaatctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagagg gccaccatat 60 cctgcagagc cagtgaaagt gttgatagtt atggcaatag ttttatgcac tggtaccagc 120 agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatcttgc atccaaccta gaatctgggg 180 tccctgccag gttcagtggc agtgggtcta ggacagactt caccctcacc attgatcctg 240 tggaggctga tgatgctgca acctattact gtcagcaaaa taatgag 287 <210> 39 <211> 287 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 39 ttgtgctgac ccaggcccct ccttccttgg atgtttctca agggtagagg gccaccatct 60 cctgcaggac cagcaaaagt gtcagaacat ctagctatag ttatatgcac tggtaccaac 120 agaaaccagg tcagccgccc aaactcctca atctatgtgc atccaaccaa gtatctaggg 180 tcccagccag gttcagtggc agtggatctg ggacagactt caccctcaaa atccatcctg 240 tggaggagga ggatgctgca acctatttct gtcagcaaag taatgag 287 <210> 40 <211> 287 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 40 ttgtgctgac ccaatctcca gcttctttgg ctgtgtctct aggacagaga gccactatct 60 tctgcagagc cagccagagt gtcgattata atggaattag ttatatgcac tggttccaac 120 agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatgctgc atccaaccta gaatctggga 180 tccctgccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac atccatcctg 240 tggaggagga agatgctgca acctattact gtcagcaaag tattgag 287 <210> 41 <211> 287 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 41 ttgtgctgac ccaatctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagagg gccaccatat 60 cctgcagagc cagtgaaagt gttgatagtt atggcaatag ttttatgcac tggtaccagc 120 agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatcgtgc atccaaccta gaatctggga 180 tccctgccag gttcagtggc agtgggtcta ggacagactt caccctcacc attaatcctg 240 tggaggctga tgatgttgca acctattact gtcagcaaag taatgag 287 <210> 42 <211> 290 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 42 ttgtgctgac ccaatctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagagg gccaccatct 60 cctgcagagc cagcgaaagt gttgataatt atggcattag ttttatgaac tggttccaac 120 agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatgctgc atccaaccaa ggatccgggg 180 tccctgccag gtttagtggc agtgggtctg ggacagactt cagcctcaac atccatccta 240 tggaggagga tgatactgca atgtatttct gtcagcaaag taaggaggtt 290 <210> 43 <211> 286 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 43 ttgtgctgac ccaatctcca gcttctttgg ctgtgtctct aggacagagg gccaccatat 60 cctgccaagc cagcgaaagt gtcagttttg ctggtacaag tttaatgcac tggtaccaac 120 agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatcgtgc atccaaccta gaatctggag 180 tccctgccag gttcagtggc agtgggtctg agtcagactt cactctcacc atcgatcctg 240 tggaggaaga tgatgctgca atgtattact gtatgcaaag tatgga 286 <210> 44 <211> 290 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 44 ttgtgctcac ccaatctcca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagaga gccaccatct 60 cctgcagagc cagtgaaagt gttgaatatt atggcacaag tttaatgcag tggtaccaac 120 agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatgctgc atccaacgta gaatctgggg 180 tccctgccag gtttagtggc agtgggtctg ggacagactt cagcctcaac atccatcctg 240 tggaggagga tgatattgca atgtatttct gtcagcaaag taggaaggtt 290 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 45 Arg Ser Trp Met Asn 1 5 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 46 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 47 Ser Glu Leu Trp Ser Lys Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 1 5 10 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 48 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 49 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 50 Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu 1 5 <210> 51 <211> 177995 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 gaattcactc aggtatccac aagataatgc aggtctgagg aagggagtgg agattttacc 60 aaaagtgcag aaaacattta cataaacctc ccaccccgcc aaagaaaaat aaccaaagtc 120 atcaaatatc atcagtccct ggacataagt agaaggaccc ttagagatca tttaatctct 180 tgctttataa aagggagaac tgaaaccctg acagatgagt tgtagaagtc tcagagctag 240 acaggggcag agctaggact agggcccaga gcctcagatt ccaaggtcca atgacctctt 300 tgccagacca cagcatcacc caaggtgtct gtatgacatg ttaccaaccc caagacacat 360 tacaatttaa ccaacgtcca aacgtgggct accgaaggga gaaactgtta agactctcgg 420 ggaaggaggg aggctaagag ctggggaagc tgggaaaggg aaggcttcac tgaggaggtg 480 cactaagtcc caggagtaca taacaggaaa ttatggaaat atttcagtag gtagtcttgg 540 aaagaaagac ctgacagata aaattttctc tagagaaaag aaataagtta gatttaaaag 600 accagaagaa ggctttgttt gaacattcct tgattatatg caatttagtc cttttgttgt 660 cacctgagtt tctaacactt ggtaatattt ttaattccct catctattct gtctccctat 720 gagacaggac tctctgcaga gaccacatcc agtttagtgg ttaagaatgg agtctctgga 780 ctcagattgc ctaaattcaa atccttgctt taccacttaa tagctgtgtg accttggata 840 aattccttca ctaatctgta cctctgtaaa actgacctaa tatcaccacc catttcagga 900 ggttttgtga ggattaaatg tgtataagcg gtcacaactt attaatgggt ttttaatcac 960 tttataatgt gtccttttta tatataaaga atagaaatta cccaagtaca tatactgcat 1020 gtagtaacaa atattgtttt gcaaaaattt tgttacatat gtgtgcataa atgtcttaaa 1080 tcataatgta aaatttgttt cttagtggtt tttttaaaaa tgtgagacac tgaatacata 1140 aaataaggct tagaacaatg cccagcacac agtaagcacc tagtgctgta actgtcatcg 1200 ttgctgttat gtacctatta aatgttcgta gagttatata aactaacatg aaaccacttt 1260 ggaaaatata tctgatagta acataagtta aaggcaaaaa gcccttctct ttgtctctca 1320 tatccacaca caatcagagc cctgctcagg caccagtttg ttgcttggcc cactagctac 1380 gtgttgcatt gaactgaaga gtccacagac tgacctaaca 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agtaacttat ctcattcctt 2280 aaattaaaca gaggtttcta aatgctttgg tactgtgggg acccaaatta tcccttgata 2340 ctgcccccct attatccact attaagcttt aaaaaggcga gagattaaat attgtgccca 2400 cattttacag tcattcgcgt tcccgtttca aattaaaggg aggaaaacgc gttaaaatta 2460 ggcctccgac cttcagacca gcctgtgggc ttttttaagt cataaaactc gcggaggtgg 2520 aaggccccgg ggaggaagag gggtgcattc tagagctttc gggccgaccc caatttctcg 2580 ttggcgacga atgctaacca cgtgtcgcca ttttgtgttc aggaaacatg gcggccgccc 2640 caagggtaag gaacagggga ggcggagtag cgccacgtta gccgctttcc ctgagagatt 2700 gtgaagcacg ttgcgcacgg ggccctttct ggtctggctt agcccaagga ggaaggggaa 2760 aaggcagaaa tcacaactca taggccagcg tcttgagcga cacttcctca gcgggaagaa 2820 ccggcaaaaa aggccttcca agatggcggg ccctgacggg gccgcccccc ttgagcctgg 2880 cgcagtggct gcgcccatgg gcccgaaaag cagccgcggg agcccaggcc gcgcggggaa 2940 agccgcagaa acgtcctgaa gccctggccg gcagcccctg aacaaacgag gcctccacag 3000 gcgtacacta ttgtttctaa tgtcggaaaa gggtgccgcg gtggaaacga cacaagggca 3060 ggaggtgggg tttctgtggc tttaaccgaa agaaacttgc 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aacattttct tcacctcaaa aaggaaaccc gtagcaatta gcagacactc cctgtccctc 167580 atcccattcc atgtcccagc cactagtctt tctgccccta tagatttgcc tattctagac 167640 atttcatata aatggaagca tgtaatatat ggtttcttgt aactgactta tttcacttaa 167700 cattatgctt ttcagggtca tctatgttgt aacgtgtatc ggtacttcat tcctttttat 167760 tcccaaataa aactccatta tatggatatt gcacaagtac tttttttaaa gtagttttta 167820 agttacaaaa gtacaacgtg cttagtgtta caaatgaaat gaaatggata cataaggaaa 167880 atattaaaaa tgtatcttct tcctcctttt gaggtaagta atattaatag attcatctgt 167940 aatattccac attttactct atacagatgc acatgtatac acttgggatt tttagggttt 168000 ttttttttgt tttttgtttt ttttttacag agtgtcaccc agagtgacag tgtcttggct 168060 cactgtgaac tctgtctcct gggctcaagc gtttcttgtg cctcagcctc cagagtagtt 168120 gggattacag gtgtgagcca ccacacctgg ctagtttttt tttttgagac agagtttcgc 168180 tcttgttgcc caggctggag tgcaatggca tgatctcggc tcactgccac ctccacctcc 168240 cgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagtagg tgggattaca ggcatgtgcc 168300 accatgcccg gctaatttta tatttttagt agagatgggg tttctccgtg ttggtcaggc 168360 tggtcttgaa ttcctgacct cagatgatct gcctgcctcg gcctcccaaa gtgctgggat 168420 tacaggcgtg agccaccatg cccggcctaa ttttttttta tttttagtag agacaggatt 168480 tcaccatgat ggccaggctg gtctcaaact cctgacttca aatgatccac ccgcctgatc 168540 tcagctcact gcaacctctg cctcccaggt tcaagcgatt ttcctgcctc agcccgccta 168600 gtagctgaga ttacaggcgt gggccagcat gccccgctaa tttttgcatt ttttagtaga 168660 gatggggtgt caccatgttg gactgtctgg tctcaaactc ctaacctcaa gtgatccgcc 168720 caccttggcc tcccaaaatg ctgggattac aggtgtgagc cactgcgccg ggcttttttt 168780 tttttttttt tttttgagac agggtctcgc tctgttgccc aggctggagt gcagtggcaa 168840 tgatgtcagc tcactgcagc ctctgcctcc aggctcaggt gttcctgcta ccttagcctc 168900 ctgagtagct gggactacag gcacgtgcca ccatgcctgg ctaatttttt tttttttttg 168960 agatagagtt tcactcttgt tgcccaggct ggagtgcaat ggctcgatct cagctcactg 169020 caacctccac ctcccgggtt caagcaattc tcctgcctca gcctcctgag ttgctgggat 169080 tacaagcgcc tgccaccaca cccggccaat ttttgtattt ttagtagaga tggggtttca 169140 ccatattggc caggctggtc 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ttgggtgaag tattgtaatt acagaaatga gacttttttt ttttaaatga aaggcctcac 170040 atatttatta ctgaacccag ccaaccaatg cgttcataac agattcggag aggaaaacac 170100 gtcgaactct ccagataggg gtgacatttt cagcttgata tggtaacgtg atcgtgacct 170160 tcagacagca taaatatgtg tgccatctca tgtacaattc cttatagacc cagcttggtt 170220 cttctccaat gtctcctttt ggagttgtac ctgattttat ttccagtttt catccgaatc 170280 cactggggaa tgggacgatt ttgcttttgt ttcttgggca ggaatcactt aatcctgaaa 170340 gtcttgtgag aagacatggt gagggtggag tcaagaacac accacgatgg cagagaaagg 170400 aaaagaggca tgagatcatt ttatacccat catgcaacca caagcttttc tcaactgata 170460 atactaggac attagttata gacccatttt tttttttttt gagacggagt ctcactctgt 170520 cgcccaggtt ggagtgcagt ggcgtaatct tggctcactg cagcctctgc ctcctgggtt 170580 caagcaattg tcctgtctca gcgttcctga gtagctggga ttacaggtgt gcgctaccac 170640 gcctggctga tttttatatt tttagtagta gagacagggt ttcaccatgt tgaccagcct 170700 ggtctcaaat tcctgacctc aggtgatctg cctgcttcag cctcccaaag tgctgggatt 170760 acaggtgtga gccactgcgc caagctccaa cattcttttt ttgtaatttt tttttttttt 170820 gagatcagcc tgtcaggttg gagtgcagtg gtgcaatctc agctcactgc aaccttggcc 170880 tcccaagttc aagtgattct cctgcctcaa cctcccaagt aggtgggatt acaggcatgc 170940 atcaccacgc ccagctaatt tttgtattct tagtagaggc agagttttgc cacgttggcc 171000 aggctggtct tgaactcctg acctcagata ttctgcctgc cttggtctcc cagagtgctg 171060 ggattacagg cgtgagccac cgtgcctggc ttccttttaa tgcatgcata atgttctatt 171120 gtatggtatg ttggggagaa aaaaagagtt ttcctctacc cttccgaggt tttggttgtg 171180 atagacccct gtaacaaaag acagattaac aagaagaaaa caaacaggac caggcatggt 171240 ggctcatgcc tgtaatccca acactttggg agcccaggag ttccagacca gcctgggcaa 171300 tatggcaaaa aaccatctct acaaaaaatg taaaaattag ctgggcatgg tagtggatgc 171360 ctgtggtccc aggtactcta ctctggtggc tgaggtgggt ggatcgcttg agcccaggag 171420 cgagaggttg cagtgagccg tgatagtgcc attgcacttc agcctgggtg acagagcgaa 171480 gccatctcaa aataaataaa agaaagaaag aaaaaaagaa aaacagaaat ttaaaaacat 171540 gtacgtcacg tattcaaaag agagaccagg gaaatgagca aatctccaag aggtagcttt 171600 gaattcagga ttatacagca tcttcaaaaa agaacagtat atgtttagag aagtgttaag 171660 agaaccgggc acagtgactc acgcctgtaa ttccagcact ttgggaggcc gaggtgggcg 171720 gatcacctga ggtcgggagt tcgagaccag cctaaccaac acggagaaac cccatctcta 171780 ctaaaaatac aaaattagct gggtgtggtg gcgcttccct ataatcccag ctactcagga 171840 ggctgaggca ggagaattgc ttgaacccga gaggcggacg ttgccgtgag actgcgccat 171900 tgcactccag cctgggcaac aagagcgaaa cttcgtctca aaaaaaaaaa aaaaaagaaa 171960 gaaagaaaaa aaaagagaag tgttaagaga aggaaaatga ttttgagtct ctaggggtgg 172020 caaattatgg gaaggcaaat acgcgataga aaaaggctca ttaatgaagt ttgtcatgta 172080 gattcctggc tgataaaggt ttgtcaaaag acaaaattac aactaattta gtttaaagag 172140 cataattggc ttttagttgc gattgtagaa ttgtgcaaca cctcatttta taaaatcgaa 172200 tgagtgttcc tatgagttga gtggaggagg ttggctttca gaaagggctg aagaaagcag 172260 aaacagaaaa gtgcattggt tgtttcgagg ttactttcct tgaaaagttt aaagcagagg 172320 gtatttcctt atcatgtcac ttcaaactgg tctgtcggga atttggctat tatttttctt 172380 tctcctgatt tcttagaaag tcagatcgac aacttagttt tgaccttgtg atgtggaaca 172440 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agtgagctga gatcgcacca 173280 ctgcactcca gactgggcaa cagagcgaga ctccgtctca aaaaaaaaaa aaaaaagtaa 173340 gtgttcagag taatactttt ctacattata ctgagagaaa ttataaatta taaagtatat 173400 caaattatat tattttacta attttacttt tatgtaataa aatgcaatat atttaaaaat 173460 tgttaaaaaa ataaaattta tgtcctgctt ttaggcaaat ggggaaggcg gagaactttc 173520 cacccacgta tctacatcgt atctacatct tctcaattgt cttcggcttg aaataatcct 173580 taggctaaag aggcgtattt tggggtggca cattctggtg tccttacagg tacactactt 173640 ttattcatgt ctgttactac tattacaccc ccttcacctt gggccacccc atcctcagtc 173700 tccctcattt ttctttacag ttagcaccat ttacccattc acggagaacc ttacagttct 173760 cgcaacaggg tgatcactca gtaagtactg ttgtcccttt ggtctgtttc tggcagcgat 173820 tagctgtgcg cattctttga gaggagcgac ggagggaaca gaagagggta ctagtgaaga 173880 actaaggtgc ttcacccaaa tagataggga aggaggagga gagctgaggc gagcctcagc 173940 ttctgccttt tttttttttt tttttttttt gagacggagt ctggctctgt ctcccaggct 174000 ggagtgcagt ggcgcaatct cggctcactg caagctccgc ctcccgggtt cacgccattc 174060 tcctgcctca gcctcccgag 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ggaattggtg gcacttcagc 175740 agcctattac ctgcggcaga aatttgggaa agatgtgaag atagacctgt ttgaaagaga 175800 agaggtcggg ggccgcctgg ctaccatgat ggtgcagggg caagaatacg aggcaggagg 175860 ttctgtcatc catcctttaa atctgcacat gaaacgtttt gtcaaagacc tgggtatgta 175920 attttggtct tggagctcac cagattactg tgtgacatcc ccggatattt ttatcagatg 175980 gagaactgaa atttctgcct tgttaattgc cttacagaga cgttggtaaa actgttttcc 176040 tcactttctt gttagttggt actgcctgag ttaggagcag ttctgctgta atgggacact 176100 agttgtctgt atcttcagtt atctggaatt acagccatgg ggtgggggtg ggaatggctg 176160 ccattgtctt tttttttctt ttgaggagtt tcgctcttgt cgctcaggct ggagtgcaat 176220 ggtgcgatct tggctcactg caacctctgc ctcccgggtt caagcgattc tcctgcctta 176280 gcctcctgag tagctgggat tacaggtgcc tgccaccacg cccagctaat ttttgtattt 176340 tcagtagtga cggggtttca ccatgttggc cagctggtct tgaactcctg acctcaggtg 176400 atccgcctgc cttggccttc caaagtgctg ggattacagg ggtgagccac cgtgcccggc 176460 ctgtgttgtc tgttcttaaa attctgggtt tgtgttaaag aatcagagaa ggtttggaga 176520 tagtcatctc attgtgatca ttttgcagct gagtaaatga gacccagaga cttgaattgt 176580 ctggctcaaa gtcactcaca tatggccatg gccagggtca gtggctcatg cctgtaatcc 176640 cagcactttg ggaggccgag gcagaggatc acttgagccc aggagttaga aaccagtctg 176700 ggcaacatag tgagatcctg tctttactaa aaataaaaaa gttagcctgg tgtgatggca 176760 caaacctgta gtcccagctt cttgggaggc agaggcagga ggatcccttg agcctgggag 176820 atagaagctg cagtgagcct tgcatgccac tgcactccag cctgggcaac aaagtgagac 176880 cctatcaaaa caaaccacca ccaacaaaac aaactccgtc acacagctgt ggatgcagac 176940 acgtgcctag aacttgggat gtgcaactgc tgccctgaca gcagaggagc tggataggtc 177000 atggggaaag tctgacaggc ctctggaggc cctttcggca gggagtattt tgtaactttg 177060 gcctccttcc agttatctga aatatccagt tttgcaaaat aggattctca caggaatgga 177120 agtgcctcag ctgccttcca catcctctgt agatgctgcc tctgcttccg tttcctccac 177180 gagggcgaag gtatacccag aacaaattat gccacgaaga tgcatgtctg acatctttgt 177240 ttttaaattg aattcagttg gtactctggc ttttttcctt tgactatcca gtttttttag 177300 acttttagtc taaaaatagc caggtaaaaa tatatctact tttgatatat taatatttac 177360 atgatcatct gacccatcgc ctagcaaatc tgcttttgga cagtgtagtg aaagtatagt 177420 gtttcacact gttccaaaga tagagctcct ttatgtgtct cctgagaact gagggaagcc 177480 ccaaattcac tcagattacg ttctttcatt tgatcagcat agacaccact gacttagctg 177540 tgctttatgt ttttgcaggt ctctctgctg ttcaggcctc tggtggccta ctggggatat 177600 ataatggaga gactctggta tttgaggaga gcaactggtt cataattaac gtgattaaat 177660 tagtttggcg ctatggattt caattcctcc gtatgcacat gtgggtagag gacgtgttag 177720 acaagttcat gaggtaattt tttttccttc catttaacct aagatctttt aatttaggtt 177780 aaattaaact tgatgaactt taggaattat gatttcttgt aagcattttc tacctcacag 177840 caaggcctgt ttataacatt gttaggcaaa atgttttgta gaaactatgc agactatttg 177900 cttggatatt gaaaggttgg tttatttttg cttctgaagt gtattttgca aatgcttctt 177960 tagtgttgcc agatactgtt agatgccttg aattc 177995 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 gtgatctgag cattttccca 20

Claims (39)

  1. a. 유방 세포 또는 조직의 전이 상태의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1 단백질을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; 및
    b. 상기 PCBP-1 단백질의 세포내 위치(subcellular location)를 결정하는 단계이며, 이때 상기 샘플의 세포 세포질에서의 상기 PCBP-1의 국소화가 세포성 전이를 지시하는 것인 단계
    를 포함하는, 샘플 내의 유방 세포 또는 조직의 전이 상태를 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플의 상기 항체 염색이 2+ 또는 3+의 점수를 갖는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열 45, 서열 46 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 갖는 모노클로날 항체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 PCBP-1 단백질이 적어도 50％ 이상의 세포에서의 약한 세포질 염색으로서 또는 임의의 종양 세포의 30％ 초과에서의 강한 세포질 염색으로서 상기 항체에 의해 검출되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 샘플을 핵 및 세포질 에스트로겐 수용체 (ER)를 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 ER의 부재가 세포성 전이를 지시하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 세포 세포질에서의 상기 ER의 국소화가 세포성 전이를 지시하는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 세포 핵에서의 상기 ER 및 상기 PCBP-1의 국소화가 비-전이를 지시하는 것인 방법.
  9. 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1 단백질을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; 및
    PCBP-1 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계이며, 이때 상기 샘플 내의 상기 PCBP-1 단백질의 더 많은 발현이 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 단계
    를 포함하는, 유방암 환자에 대한 생존 가능성을 결정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 샘플을 핵 및 세포질 에스트로겐 수용체 (ER)를 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 ER의 부재가 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 세포 세포질에서의 상기 ER의 국소화가 전체 생존과 역의 상관관계가 있는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 세포 핵에서의 상기 ER 및 상기 PCBP-1의 국소화가 전체 생존과 상관관계가 있는 것인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 PCBP-1 발현 수준이 2+ 또는 3+인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 항체가 서열 45, 서열 46 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 갖는 모노클로날 항체인 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 유방암 환자가 3개 이상의 양성 림프절을 갖는 환자인 방법.
  17. 생존 가능성의 결정을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 pcbp -1을 검출할 수 있는 DNA 프로브와 접촉시키는 단계; 및
    pcbp -1의 염색체 국소화를 결정하는 단계이며, 이때 상기 샘플에서의 상기 pcbp-1의 2개 초과의 카피의 검출이 전체 생존과 상관관계가 있는 것인 단계
    를 포함하는, 유방암 환자에 대한 생존 가능성을 결정하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 2개 초과의 카피가 상기 pcbp -1의 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과의 개수의 카피로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 DNA 프로브가 형광으로 표지된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 카피 개수가 상기 형광 표지의 강도에 의해 계산된 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 카피 개수가 표지된 부위로서 검출되고, 상기 표지된 부위가 인간의 2번 염색체 상에 존재하지 않는 것인 방법.
  22. a) Pcbp -1 및 상동체의 유전자 산물의 발현을 특징으로 하는 질환을 앓고 있는 환자의 조직 시료를 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계;
    b) 상기 조직 시료를 면역조직화학 염색으로 염색하는 단계; 및
    c) 상기 조직 시료의 염색의 강도를 결정하는 단계이며, 이때 상기 염색의 강도가 상기 환자의 생존과 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, Pcbp -1 및 상동체의 유전자 산물의 발현을 특징으로 하는 질환을 앓고 있는 환자의 생존 가능성을 결정하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 질환이 암인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 상기 항체가 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 개수의 아미노산 변화를 갖는 pcbp-1 유전자의 대립유전자를 검출하는 것인 방법.
  25. (a) 유방암의 세포병리학의 결정을 필요로 하는 환자로부터 수득된 샘플에서 PCBP-1의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 결정하는 단계;
    (b) 상기 유방암이 관 암종인지 또는 소엽성 암종인지를 결정하는 단계;
    (c) 상기 유방암이 HER2-양성인지 또는 HER2-음성인지를 결정하는 단계;
    (d) 상기 유방암이 에스트로겐 수용체-양성인지 또는 에스트로겐 수용체-음성인지를 결정하는 단계; 및
    (e) 상기 유방암이 프로게스테론 수용체-양성인지 또는 프로게스테론 수용체-음성인지를 결정하는 단계
    를 포함하는, 유방암의 세포병리학의 결정을 필요로 하는 환자에서 유방암의 세포병리학을 결정하는 방법.
  26. (a) 시료를 서열 45, 서열 46 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 갖는 모노클로날 항체와 접촉시킴으로써, 상기 시료 내에 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계;
    (b) 시료를 항원-항체 복합체에 대해 특이적인 표지로 표지하는 단계;
    (c) 표지를 검출함으로써 항원-항체 복합체의 수준 및/또는 국소화를 검출하는 단계; 및
    (d) 항원-항체 복합체의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 상기 환자 내에 존재하는 유방암의 유형과 상관시키는 단계
    를 포함하는, 유방암이 유방 관 암종인지 또는 유방 소엽성 암종인지를 결정하는 방법.
  27. (a) 시료를 서열 45, 서열 46 및 서열 47로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR 항원 결합 부위 서열, 및 서열 48, 서열 49 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR 항원 결합 부위 서열을 갖는 모노클로날 항체와 접촉시킴으로써, 상기 시료 내에 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계;
    (b) 시료를 항원-항체 복합체에 대해 특이적인 표지로 표지하는 단계; 및
    (c) 표지를 검출함으로써 항원-항체 복합체의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 검출하는 단계
    를 포함하는, 암 세포의 검출을 필요로 하는 환자에서 암 세포를 검출하는 방법.
  28. (a) 유방암 샘플을 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 항원의 국소화를 결정하는 단계; 및
    (c) 상기 항원의 국소화를 유방 관 암종 또는 유방 소엽성 암종과 상관시키는 단계
    를 포함하는, 유방암 샘플이 유방 관 암종인지 또는 유방 소엽성 암종인지를 결정하는 방법.
  29. (a) 유방암 샘플을 가용성 형태의 PCBP-1 항원을 우선적으로 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 항원의 수준을 결정하는 단계; 및
    (c) 상기 항원의 수준을 유방 관 암종 또는 유방 소엽성 암종과 상관시키는 단계
    를 포함하는, 유방암 샘플이 유방 관 암종인지 또는 유방 소엽성 암종인지를 결정하는 방법.
  30. (a) 환자를 유방암으로 진단하는 단계;
    (b) 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 PCBP-1의 수준, 국소화, 또는 둘 모두를 결정하는 단계;
    (c) 상기 유방암이 관 암종인지 또는 소엽성 암종인지를 결정하는 단계;
    (d) 상기 유방암이 HER2-양성인지 또는 HER2-음성인지를 결정하는 단계;
    (e) 상기 유방암이 에스트로겐 수용체-양성인지 또는 에스트로겐 수용체-음성인지를 결정하는 단계;
    (f) 상기 유방암이 프로게스테론 수용체-양성인지 또는 프로게스테론 수용체-음성인지를 결정하는 단계; 및
    (g) 상기 환자에게 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 단계
    를 포함하는, 환자에서 유방암을 치료하는 방법.
  31. a) 전이-전(pre-metastatic) 종양 세포의 확인을 필요로 하는 환자로부터의 샘플을 핵 및 세포질 PCBP-1을 검출할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 샘플의 세포에서 상기 PCBP-1의 세포내 위치를 결정하는 단계이며, 이때 상기 세포의 세포 세포질에서의 상기 PCBP-1의 국소화가 전이-전 종양 세포의 존재를 지시하는 것인 단계
    를 포함하는, 조직 샘플 내의 전이-전 종양 세포를 확인하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 조직 샘플이 유방 조직 샘플인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 세포의 개수가 50개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 및 500개 또는 그 초과의 개수로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 세포의 30％ 미만이 강한 세포질 염색을 갖는 것이 전이-전 종양 세포가 존재할 위험이 낮은 것을 지시하는 것인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 세포의 30 내지 50％가 강한 세포질 염색을 갖는 것이 전이-전 종양 세포가 존재할 위험이 중등도인 것을 지시하는 것인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 세포의 50％ 초과가 강한 세포질 염색을 갖는 것이 전이-전 종양 세포가 존재할 위험이 높은 것을 지시하는 것인 방법.
  37. 제31항에 있어서, 상기 세포의 개수가 50개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 및 500개 또는 그 초과의 개수로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  38. 제31항에 있어서, 상기 염색이 형광 표지인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 형광 염색이 상기 형광 표지의 강도에 의해 측정되는 것인 방법.
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