CN115398239A - 帕金森氏病诊断用生物标记物及利用其的帕金森氏病诊断方法 - Google Patents

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Abstract

为了测量针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B)蛋白的自身抗体的水平，本发明提供了帕金森氏病诊断用的组合物、帕金森氏病诊断用的生物标记物和使用其诊断帕金森氏病的方法，所述组合物包含与自身抗体特异性结合的ATG4B蛋白。本发明通过确认在帕金森氏病患者组中呈现出高ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B)蛋白的自身抗体水平，从而提供针对其的帕金森氏病诊断用生物标记物，可以预先筛选出以后发病为帕金森氏病的可能性高的高危人群及发病患者，从而能够非常有用地使用于提供早期诊断和治疗帕金森氏病的基础。此外，根据本发明的提供帕金森氏病诊断用的信息的方法可以通过检测ATG4B蛋白的自身抗体来更准确且早期地诊断帕金森氏病。

Description

帕金森氏病诊断用生物标记物及利用其的帕金森氏病诊断 方法
技术领域
本发明涉及一种帕金森氏病诊断用生物标记物及利用其的帕金森氏病的诊断方法。
背景技术
帕金森氏病是以震颤(颤抖)、僵硬、徐动症(行动缓慢)、姿势步态障碍等为主要症状的疾病，是因脑中名为多巴胺的神经传达物质的不足而产生的慢性疾病，是中枢神经系统退行性疾病之一，并且是由中脑的黑质致密部(Substantia nigra pars compacta)的变形而开始的具有脑的体积的减少、α-突触核蛋白(α-synuclein，αSyn)的凝集等作为病理生理症状的疾病，表现出步行的不完整、手颤、僵硬的行动等。
执行与这种帕金森氏病的诊断相关的检查包括PET检查、MRI检查、针对内科疾病的检查等。
多巴胺转运体正电子发射断层显像(dopamine transporter PET，positronemission tomography)检查作为能够确认多巴胺能细胞是否受损的检查，如果进行脑多巴胺转运体正电子发射断层显像，则能够确认由非帕金森氏病的其他原因引起的帕金森症状。对药物诱发性帕金森综合征、血管性帕金森综合征、阿尔茨海默病中伴随的帕金森症状、特发性震颤中伴随的帕金森症状而言，可以确认到虽然呈现出与帕金森症状相似的震颤等情况，但多巴胺能神经细胞是正常的。
在呈现帕金森症状的情况下，重要的是区分与帕金森氏病相似的疾病，为了与继发性帕金森综合症及非典型性帕金森综合症等进行区分，首先需要进行脑磁共振成像(MRI)检查。针对帕金森氏病的情况而言，MRI结果是正常，而其他疾病呈现特征性的MRI结果。
在诊断帕金森氏病的方法中，针对内科疾病的检查(血液检查、尿液检查、心电图、胸部X射线检查)方法而言，存在因内科疾病引起全身脆弱感而被误认为是帕金森症状的情况，为了对此进行确认，需要进行用于确认是否存在其他内科疾病的检查。
所述帕金森氏病诊断方法存在费用昂贵且诊断步骤复杂的问题。并且，患有帕金森氏病的患者每年大幅增加，治疗剂市场也与此成比例地大幅增长，但实际上帕金森氏病诊断市场的发展尚不尽如人意。
因此，迫切开发一种能够将帕金森氏病和与其相似的疾病区分开并能够快速且经济地诊断帕金森氏病的技术以及能够同时进行治疗的技术，这是实情。
另外，自身抗体(autoantibody)普遍存在于所有人的血液中，已知自身抗体的量随着年龄的增长而增加。已知自身抗体作为对自身进行对抗的(self-reactive)抗体，其参与适应性碎片清除机制(adaptive debrisclearance mechanism)。例如，已知自身免疫疾病是由针对自身的特定细胞或组织构成物进行对抗的自身抗体所引起的疾病或症状的恶化。
最近，已知自身抗体与帕金森氏病密切相关。对此，自身抗体作为用于诊断阿尔茨海默病和预测其发作的生物标志物而受到关注。
对此，本发明人试图从患者的血液中发掘能够用于帕金森氏病的诊断及预测发病的自身抗体，并从帕金森氏病患者的血液中分析自身抗体，筛选并验证了帕金森氏病特异性的自身抗体。
发明内容
技术问题
本发明提供一种帕金森氏病诊断用组合物、帕金森氏病诊断用生物标记物及利用其的帕金森氏病的诊断方法，所述组合物为了测量针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B))蛋白的自身抗体的水平而包含与所述自身抗体特异性结合的ATG4B蛋白。
技术方案
根据本发明的一个方面的帕金森氏病诊断用组合物，为了测量针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B))蛋白的自身抗体的水平而包括特异性结合于所述自身抗体的ATG4B蛋白。
并且，所述ATG4B蛋白可以包括由序列号1表示的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，提供一种包括所述帕金森氏病诊断用组合物的帕金森氏病诊断用试剂盒。
并且，所述试剂盒可以检测针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteineprotease ATG4B))蛋白的自身抗体(autoantibody)。
并且，所述自身抗体的检测可以通过选自由酶联免疫吸附测定法(ELISA：Enzyme-linked immunosorbent assay)、放射免疫分析法(RIA：Radioimmnoassay)、夹心分析法(Sandwich assay)、蛋白质印迹法(Western Blot)、免疫印迹分析法(Immunoblot assay)以及免疫组织化学染色法(Immnohistochemical staining)组成的组中的一种以上来执行。
根据本发明的另一个方面的一种用于帕金森氏病诊断的信息提供方法，包括如下步骤：测量分离自受试者的生物试料中针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteineprotease ATG4B))蛋白的自身抗体的水平；将所述测量的自身抗体水平与从分离自正常人个体的生物试料中测量的针对ATG4B蛋白的自身抗体水平进行比较；以及在所述受试者的自身抗体水平高于所述正常人个体的自身抗体水平的情况下，判定受试者为帕金森氏病阳性。
并且，所述生物试料可以选自由血液、血浆以及血清组成的组。
此外，针对所述ATG4B蛋白的自身抗体水平可以利用与所述自身抗体之间的抗原-抗体反应来测量。
根据本发明的又一方面的一种用于提供帕金森氏病诊断信息的检测自身抗体的方法，可以包括如下步骤：将分离自受试者的生物试料加入于涂覆有ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B)蛋白的固定体中，并进行抗原-抗体反应；利用显色底物溶液检测通过上述步骤生成的抗原-抗体反应物；以及判定相比于正常人个体所述检测量增加的受试者患有帕金森氏病或患有帕金森氏病可能性高。
并且，所述固定体可以选自由硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、利用聚乙烯或聚苯乙烯树脂合成的孔板以及利用玻璃形成的载玻片组成的组。
根据本发明的另一个方面，提供一种帕金森氏病的诊断方法，包括如下步骤：测量分离自受试者的生物试料中针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine proteaseATG4B))蛋白的自身抗体的水平；将上述测量的自身抗体水平与从分离自正常人个体的生物试料测量的针对ATG4B蛋白的自身抗体水平进行比较；以及在所述受试者的自身抗体水平高于所述正常人个体的自身抗体水平的情况下，判定受试者为帕金森氏病阳性。
发明的效果
本发明通过确认在帕金森氏病患者组中呈现出高ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B))蛋白的自身抗体水平，从而提供针对其的帕金森氏病诊断用生物标记物，可以预先筛选出以后发病为帕金森氏病的可能性高的高危人群及发病患者，从而能够非常有效地使用于提供早期诊断和治疗帕金森氏病的基础。
此外，根据本发明的用于诊断帕金森氏病的信息提供方法可以通过检测ATG4B蛋白的自身抗体来更准确且早期地诊断帕金森氏病。
附图说明
图1是示出利用6000个蛋白质芯片的帕金森氏病患者和正常组的自身抗体(Autoantibody)反应方法(实施例1)。
图2是示出帕金森氏病患者组中增加的蛋白质的图(实施例1)。
图3是示出帕金森氏病患者组中减少的蛋白质的图(实施例1)。
图4是示出在晚期(Advanced)患者组和早期(Early)患者组中表现出彼此不同特征的蛋白质的图(实施例1)。
图5是实施例2中制备的微型芯片(Mini-Chip)的模式图。
图6是示出在实施例2中涂覆的蛋白质名称的表。
图7是示出实施例2的试验筛选结果的图。
图8是示出实施例3的第二次筛选结果的图。
最优实施方式
本发明可以施加多种变换且可以具有多种实施例，并且欲将特定实施例示例于附图中而进行详细地说明。然而，这并非意欲将本发明限定于特定的实施形态，而应当理解为包括包含在本发明的构思及技术范围的所有变换、等同物乃至替代物。在说明本发明时，当判断为对相关公知技术的具体说明可能会混淆本发明的要旨时，省略对该公知技术的详细地说明。
根据本发明的一个方面的帕金森氏病诊断用组合物为了测量针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B))蛋白的自身抗体的水平而包括特异性结合于所述自身抗体的ATG4B蛋白。
根据本发明的一个方面，提供一种包括所述帕金森氏病诊断用组合物的帕金森氏病诊断用试剂盒。
根据本发明的另一个方面的一种用于帕金森氏病诊断的信息提供方法，包括如下步骤：由分离自受试者的生物试料测量针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteineprotease ATG4B))蛋白的自身抗体的水平；将所述测量的自身抗体水平与从分离自正常人个体的生物试料中测量的针对ATG4B蛋白的自身抗体水平进行比较；以及在所述受试者的自身抗体水平高于所述正常人个体的自身抗体水平的情况下，判定受试者为帕金森氏病阳性。
以下，对根据本发明的具体实现例的帕金森氏病诊断用生物标记物及利用其的帕金森氏病的诊断方法进行更详细的说明。
现有的帕金森氏病的诊断方法存在费用昂贵且诊断步骤复杂的问题，患者每年大幅增加，而治疗剂市场也与此成比例地大幅增长，但实际情况为帕金森氏病的诊断市场的发展尚不尽如人意。
对此，本发明人试图从患者的血液中发掘能够用于帕金森氏病的诊断及预测发病的自身抗体，并从帕金森氏病患者的血液中分析自身抗体，筛选并验证了帕金森氏病特异性自身抗体。
本发明的术语“自身抗体(autoantibodies)”作为抗体的一种，是指通过对个体所具有的个体自身的蛋白质的免疫反应而生成的抗体。已知许多自身免疫疾病产生这种自身抗体。虽然单一类型的自身抗体检查本身不具有诊断性，但可以针对是否存在特定疾病的可能性提供线索。每种自身抗体结果应单独来考虑或作为总体病史的一部分来考虑。
本发明的术语“诊断”包括判定个体对特定疾病或病症的易感性(susceptibility)、判定个体目前是否患有特定疾病或病症或者监测个体的状态以提供关于治疗功效的信息。就本发明的目的而言，诊断是用于确认帕金森氏病的发病与否或帕金森氏病的发病阶段。
根据本发明的一个方面的帕金森氏病诊断用组合物为了测量针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B))蛋白的自身抗体的水平而包括特异性地结合于所述自身抗体的ATG4B蛋白。
本发明的帕金森氏病诊断用组合物通过利用当帕金森氏病患者与正常个体比较时在针对所述ATG4B蛋白的自身抗体的表达方面呈现显著的差异这一点，能够获得用于帕金森氏病的诊断或预测预后的有用的信息。这是迄今尚未公开的，作为通过本发明的首次公开，在能够以高敏感度及特异度诊断帕金森氏病或预测预后这一点上，其意义重大。
在本发明中，ATG4B蛋白是指NCBI参考序列：NP_037457.3的半胱氨酸蛋白酶ATG4B异形体(或“半胱氨酸蛋白酶ATG4B异构体”)(cysteine protease ATG4B isoform)。所述ATG4B蛋白可以包括由序列号1表示的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，提供一种包括所述帕金森氏病诊断用组合物的帕金森氏病诊断用试剂盒。
本发明的帕金森氏病诊断用试剂盒可以检测针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B))蛋白的自身抗体(autoantibody)。
本发明的帕金森氏病诊断用试剂盒可以将ATG4B蛋白的自身抗体作为靶抗原，并以与所述ATG4B蛋白的自身抗体进行特异性结合的抗原-抗体反应方式实施。此时，所述抗原-抗体反应可以利用与本发明的ATG4B蛋白的自身抗体进行特异性结合的抗体或适配体(aptamer)来实施。
本发明中使用的抗原是ATG4B蛋白，其可以通过本领域通常实施的方法(例如，融合方法或重组DNA方法)来制备。
在本发明的诊断用试剂盒中，所述自身抗体的检测可以通过选自由酶联免疫吸附测定法(ELISA：Enzyme-linked immunosorbent assay)、放射免疫分析法(RIA：Radioimmnoassay)、夹心分析法(Sandwich assay)、蛋白质印迹法(Western Blot)、免疫印迹分析法(Immunoblot assay)以及免疫组织化学染色法(Immnohistochemical staining)组成的组中的一种以上来执行。
所述试剂盒可以包括：用于固定所述ATG4B蛋白或其片段等的固定体；结合有与针对所述ATG4B的自身抗体进行特异性结合的显色标记物的二次抗体结合物(Conjugate)；用于与所述标记物进行显色反应的显色底物溶液、洗涤液及酶反应终止溶液。
作为用于所述抗原-抗体结合反应的固定体，可以使用硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、利用聚乙烯(Polyvinyl)树脂或聚苯乙烯(Polystyrene)树脂合成的孔板(Well plate)以及利用玻璃构成的载玻片(Slide glass)等。
所述二次抗体的标记物优选为进行显色反应的通常的显色剂，可以使用辣根过氧化物酶(HRP：Horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、胶体金(Coloid gold)、聚L-赖氨酸-荧光素异硫氰酸酯(FITC：Poly L-lysine-fluoresceinisothiocyanate)、罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC：Rhodamine-B-isothiocyanate)等的荧光物质(Fluorescein)及色素(Dye)等的标记物。
诱导所述显色的基质(显色基质)优选根据进行显色反应的标志物而使用，可以使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB：3,3',5,5'-tetramethyl benzidine)、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS：2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid))、邻苯二胺(OPD：ophenylenediamine)等。
通常，主要使用化学发光法(Chemiluminescence)，此时，诸如Luminol之类的显色基质被使用为二次抗体接合体的标记物的HRP分解而生成3-氨基邻苯二甲酸(3-aminophthalate)，并通过425nm波长的光来确认其发光体的程度，从而检测ATG4B蛋白的自身抗体的存在与否。
洗涤液优选包含磷酸盐缓冲溶液、NaCl及吐温20(Tween 20)的洗涤液，更优选为由0.02M磷酸盐缓冲溶液、0.13M NaCl及0.05％吐温20(Tween 20)构成的缓冲溶液(PBST)。对洗涤液而言，可以在抗原-抗体结合反应后，使抗原-抗体结合体与二次抗体反应，然后将适当量添加至固定体中，并洗涤3次至6次。
根据本发明的用于诊断帕金森氏病的信息提供方法可以包括如下步骤：测量分离自受试者的生物试料中针对ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B))蛋白的自身抗体的水平；将上述测量的自身抗体水平与从分离自正常人个体的生物试料测量的针对ATG4B蛋白的自身抗体水平进行比较；以及在所述受试者的自身抗体水平高于所述正常人个体的自身抗体水平的情况下，判定受试者为帕金森氏病阳性。
本发明的术语“个体”或“受试者”是指诊断帕金森氏病或待预测帕金森氏病的预后的对象。此时，所述个体包括人等，且只要是可能病发帕金森氏病的动物(狗、马、牛、大鼠、山羊、兔、鸡、鸭、鹅等)就可以无限制地包括在其中。
本发明的术语“生物试料”不受限制，可以包括从疑似患有帕金森氏病的个体到分离的组织、细胞、全血、血清、血浆，除此之外还可以包括诸如唾液、痰、脑脊液或尿液之类的试料等。尤其，在本发明中，优选地，所述生物试料可以选自由血液、血浆及血清组成的组。
本发明的术语“正常人个体”是指未被诊断患有帕金森氏病的个体，并且可以通过从分离自正常人个体的试料和分离自待诊断帕金森氏病或预测帕金森氏病的预后的个体的试料中测量和比较上述蛋白质的自身抗体水平，从而准确地预测疑似患有帕金森氏病的个体是否患有帕金森氏病或者帕金森氏病的预后。
此外，针对所述ATG4B蛋白的自身抗体水平可以利用与所述自身抗体的抗原-抗体反应来测量。所述抗原-抗体反应可以包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀法、荧光免疫法、酶底物显色法、抗原-抗体凝集法等。
提供用于本发明的帕金森氏病诊断的信息的方法中，针对从分离自疑似患有帕金森氏病的个体的生物试料中测量的针对ATG4B蛋白的自身抗体的水平的测量结果，如果其显著高于或低于从分离自正常人个体的试料中测量的水平，则可以判定帕金森氏病的发病风险高或其预后差。
根据本发明的又一方面的一种用于提供帕金森氏病诊断信息的检测自身抗体的方法，包括如下步骤：将分离自受试者的生物试料加入于涂覆有ATG4B(半胱氨酸蛋白酶ATG4B(cysteine protease ATG4B))蛋白的固定体中，并进行抗原-抗体反应；利用显色底物溶液检测通过上述步骤生成的抗原-抗体反应产物；以及判定所述检测量相比于正常人个体有增加的受试者已患有帕金森氏病或者患帕金森氏病可能性高。
诱导所述显色的基质(显色基质)优选根据进行显色反应的标记物来使用，可以使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB：3,3',5,5'-tetramethyl benzidine)、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS：2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid))、邻苯二胺(OPD：ophenylenediamine)等。
通常，主要使用化学发光法(Chemiluminescence)，此时，诸如Luminol之类的显色基质被使用为二次抗体接合体的标记物的HRP分解而生成3-氨基邻苯二甲酸(3-aminophthalate)，并通过425nm波长的光确认其发光体的程度，从而检测ATG4B蛋白的自身抗体的存在与否。
所述固定体可以选自由硝酸纤维素膜、PVDF膜、利用聚乙烯树脂或聚苯乙烯树脂合成的孔板以及利用玻璃构成的载玻片组成的组中。
具体实施方式
以下将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的具备普通知识的人员来说是显而易见的。
实验例1：利用蛋白质芯片的微阵列(初步筛选)
确保包含基因转录调节因子的约6000余种的基因后，将附着有GST标签的重组蛋白种植于玻璃板来制备蛋白质芯片。然后，将正常组、早期阶段患者、晚期阶段患者中的各两名患者的血清以1:2000的比例加入至PBST缓冲液(PBS，0.5％吐温20，pH7.4)中，然后使其在室温下与蛋白质芯片反应2小时以与抗原结合。
然后，在10分钟用PBST进行三次的洗涤过程，之后以1:5000的比例与hIgG-488(绿色荧光)二次抗体(Invitrogen，A-10530)反应，从而确认了患者血清内存在自身抗体(autoantibody)。为了对血清内自身抗体反应程度进行定量化，利用了所种植的蛋白的GST标签(GST tag)。在室温下使GST抗体(Santa cruz，sc-33613)反应2小时，并经过相同的洗涤过程之后，通过rIgG-594(红色荧光)的二次抗体(Invitrogen，A-32740)测量了种植于蛋白质芯片的蛋白含量。
此时，在通过绿色荧光和红色荧光的蛋白质芯片的抗原抗体反应测量中均使用了微阵列(Microarray)读取器。
初步筛选的患者信息如下表1所示。
[表1]
Figure BDA0003874721460000091
实验例2：重组蛋白纯化
将重组蛋白纯化载体(pDEST15)转化(transformation)至BL21大肠杆菌菌株。在37℃的摇动器(shaker)中培养100ml包含载体的BL21大肠杆菌菌株，使得光密度(O.D.，Optical density)达到0.6，然后向其中加入IPTG，使得最终浓度为0.4mM。在37℃下诱导(inducation)3小时后，收获BL21，并在常温下用细胞裂解B缓冲液(Cell lytic B buffer)(0.5％细胞裂解B(cell lytic B)，0.1％曲拉通X-100(TritonX-100)，0.07％β-巯基乙醇(β-ME)，1X脱氧核糖核酸酶(Dnase1)，蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)，PBST中的溶菌酶(lysozyme in PBST))反应10分钟以裂解(lysis)。之后，将GST标记的重组蛋白利用附着有GST抗体的磁珠(bead)100μl(GE，17075601)在4℃下反应3小时后，下拉(pull-down)所需的蛋白。
利用色谱法(Chromatography)(Biorad，731-1550)和离心机在4℃下以5分钟收获GST磁珠(bead)200g，用洗涤缓冲液1(Wash buffer 1)(50mM Tris pH 7.5，500mM NaCl，1mM EGTA，10％甘油(glycerol)，0.1％曲拉通X-100(TritonX-100)，1mM PMSF，0.07％tor)洗涤三次，然后用洗涤缓冲液2(Wash buffer 2)(50mM Hepes pH 7.5，100mM NaCl，1mMEGTA，10％甘油(glycerol))洗涤三次。
然后，为了仅提取所需的蛋白，使用100μl洗脱缓冲液(Elution buffer)(50mMHEPES，100mM NaCl，30％甘油(glycerol)，40mM还原型谷胱甘肽(reduced glutathione)，0.03％曲拉通X-100)通过与应用磁珠在4℃下反应1小时而解吸三次，然后通过蛋白浓缩器(Protein concentrator)(Amicon，UFC5003)进行了纯化。利用考马斯染色(Coomassiestaining)技术测量纯化的蛋白含量，以BSA标准(BSA standard)为基准来判断纯化的蛋白含量。
实验例3：试验筛选
使用通路克隆(Gateway cloning)技术而以先前获得的27种克隆作为对象构建蛋白纯化载体。使用LR克隆酶(clonase)(英杰(Invitrogen)公司，11791020)将27种入门克隆(Entry clone)转移到pDEST15载体(vector)中，并利用细胞裂解B(Cell lytic B)方法纯化蛋白。
利用点印迹(Dot-blot)法将0.1μg等量的蛋白涂覆于硝酸纤维素膜后，患者血清以1:2000的比率在常温下反应2小时，使血清内的自身抗体与抗原蛋白结合。
然后，在附着次级hIgG-HRP(secondary hIgG-HRP)后，通过HRP反应呈现的化学发光强度(Chemiluminescence intensity)将自身抗原抗体反应数值化。为了实现整个实验的归一化，使用阳性对照组及抗原的蛋白含量，i)作为阳性对照组，涂覆相同量的hIgG来对其量进行定量化，ii)涂覆的蛋白含量通过GST标签及抗体反应来确认，该值用于对数值进行定量化。
试验筛选的患者信息如下表2所示。
[表2]
Figure BDA0003874721460000111
实验例4：第二次筛选
以初级蛋白质芯片微阵列及试验筛选(pilot screening)为对象，在30名以上的实验组中筛选了在患者组中导出了显著变化的ATG4B蛋白的自身抗体。
将相同量的GST蛋白和GST-ATG4B蛋白涂覆于硝酸纤维素膜，使正常组及患者组的血清以1:2000的比率在常温下反应2小时，之后，通过利用hIgG-HRP的化学发光(Chemiluminescence)反应来确认其结果，使用GST抗体来确认相同量的GST及GST-ATG4B的涂覆。
使用了总共31名的正常组和42名的患者组，测量了按各个人的ATG4B自身抗体保留量，将GST蛋白用作阴性对照组，从而防止出现不必要的信号，并能够确认准确的结果。
第二次筛选的患者信息如下表3所示。
[表3]
Figure BDA0003874721460000121
Figure BDA0003874721460000131
Figure BDA0003874721460000141
实施例1：使用利用蛋白质芯片的微阵列的初步筛选结果
从正常组及早期阶段和晚期阶段PD(帕金森氏病)患者组中分别选择2名，并与种植有6000个蛋白的蛋白质芯片(protein chip)进行反应。
图1示出了利用6000个蛋白质芯片的帕金森氏病患者和正常组的自身抗体(Autoantibody)反应方法。
其结果，可以看出，包括仅在早期阶段(Early stage)PD患者中发生变化的蛋白在内的共44种蛋白在患者组中发生变化。
首先，在患者组中增加的18种蛋白被确定为RAD23B、VAMP4、VAMP3、PKNOX1、CSAG2、VAMP2、C6orf106、MUTYH、PMF1、LARP7、SNPR70、RAB10、C14orf106、TIMM44、ZNF503、HSF1、ATF6、POLR1A，并且可以确认，在大多数情况下，与早期阶段(Early Stage)相比，在晚期(Advanced)PD患者组中有增加(图2)。
在患者组中呈现为减少的蛋白的数量为14种，包括STK24、NDUFV2、FLJ37087、ANXA2、LACTTB2、CLIC1、MSRA、YWHAE、ACOX1、G6PD、MRPS36、ATP5L、HSPA8、ZNF516，并且在两个患者组中均呈现为减少的趋势(图3)。
第三，12种蛋白在早期PD患者和晚期PD患者中表现出彼此不同的特征。
数量在早期阶段减少但在晚期阶段增加的蛋白为SF3B4、SOD1、MPP1、DHODH、PECI、ZYX、ATG4B、OGG1、CBX1、GRHPR、FHL3。对SMARCA1而言，呈现了在早期阶段其量增加，但在晚期PD患者中减少的模式(图4)。
实施例2：试验筛选结果
在以第一次微阵列(Microarray)筛选为对象确认的44种蛋白中，将已确保的27种蛋白转移到蛋白纯化载体来提取该蛋白，之后，确立GST蛋白作为阴性对照组，hIgG作为阳性对照组，来制备利用27种蛋白的迷你芯片(Mini-chip)(图5及图6)。分别制备20个迷你芯片(Mini-chip)，以正常组及患者组各10名为对象确认了其结果。
此时，为了确认患者组的基于性别的变化，比较了以男、女各5名为对象的结果。
此时，在患者组中增加的蛋白为8种，呈现为PECI、ATG4B、RAB10、ATP5L、GRHRP、LACTTB2、G6PD、OGG1，减少的19种蛋白为MPP1、C6orf106、FHL3、SNRP70、MRPS36、ATF6、RAD23B、VAMP2、ANXA2、ACOX1、ZNF503、HSPA8、LARP7、NDUFV2、CLIC1、CSAG2、VAMP3、YHWAE、STK24，且没有根据性别的明显的差异。
作为试验筛选的结果，可以确认ATG4B蛋白在患者组中显著增加，并且ATG4B蛋白是在初步筛选中也在患者组呈现为增加的蛋白，其在患者组中呈现出共同增加的趋势(图7)。
ATG4B蛋白是参与细胞的自噬(Autophagy)的蛋白，已知其功能在包括帕金森氏病在内的许多退行性脑疾病中发生了改变，并且本研究团队以通过初步筛选和试验筛选发现的ATG4B蛋白为中心，对30名以上的患者组进行了验证程序。
实施例3：第二次筛选结果
对31名的正常组和42名的患者组进行ATG4B蛋白的第二次筛选。上述第二次筛选实验以盲法(Blind)进行，以使实验者的介入最小化。
此外，在实验之后，通过确认患者信息来确认了对ATG4B反应的各种因素。
作为第二次筛选的结果，可以确认，在90％以上的PD患者中存在高量的ATG4B自身抗体(ATG4B autoantibody)，并且在性别和年龄分布中均表现出均匀的较高的反应性(图8)。
如图8所示，当将ATG4B信号设定为截止值(cut-off value)时，正常组31名中的2名被检测为阳性，帕金森患者组42名中的38名被检测为阳性。因此，测得对正常组的特异性为93.5％，灵敏度为90.5％(表4，正常组和患者组中的自身抗体测试结果)。
[表4]
疾病阳性 疾病阴性 全部
测试阳性 38 2 40
测试语音 4 29 33
全部 42 31 73
通过本研究，可以确认早期和晚期PD患者特异性变化的自身抗体(Autoantibody)，并且认为通过基于患者的疾病进展信息和患者信息的研究可以实现与患者相匹配的诊断。
以上，详细说明了本发明内容的特定部分，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，这种具体说明仅为优选实施方式，本发明的范围并不限定于此是显而易见的。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。
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<213> 人类（Homo sapiens）
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<221> 肽（PEPTIDE）
<222> (1)..(393)
<400> 1
Met Asp Ala Ala Thr Leu Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Phe Ala Glu Phe
1 5 10 15
Glu Asp Phe Pro Glu Thr Ser Glu Pro Val Trp Ile Leu Gly Arg Lys
20 25 30
Tyr Ser Ile Phe Thr Glu Lys Asp Glu Ile Leu Ser Asp Val Ala Ser
35 40 45
Arg Leu Trp Phe Thr Tyr Arg Lys Asn Phe Pro Ala Ile Gly Gly Thr
50 55 60
Gly Pro Thr Ser Asp Thr Gly Trp Gly Cys Met Leu Arg Cys Gly Gln
65 70 75 80
Met Ile Phe Ala Gln Ala Leu Val Cys Arg His Leu Gly Arg Asp Trp
85 90 95
Arg Trp Thr Gln Arg Lys Arg Gln Pro Asp Ser Tyr Phe Ser Val Leu
100 105 110
Asn Ala Phe Ile Asp Arg Lys Asp Ser Tyr Tyr Ser Ile His Gln Ile
115 120 125
Ala Gln Met Gly Val Gly Glu Gly Lys Ser Ile Gly Gln Trp Tyr Gly
130 135 140
Pro Asn Thr Val Ala Gln Val Leu Lys Lys Leu Ala Val Phe Asp Thr
145 150 155 160
Trp Ser Ser Leu Ala Val His Ile Ala Met Asp Asn Thr Val Val Met
165 170 175
Glu Glu Ile Arg Arg Leu Cys Arg Thr Ser Val Pro Cys Ala Gly Ala
180 185 190
Thr Ala Phe Pro Ala Asp Ser Asp Arg His Cys Asn Gly Phe Pro Ala
195 200 205
Gly Ala Glu Val Thr Asn Arg Pro Ser Pro Trp Arg Pro Leu Val Leu
210 215 220
Leu Ile Pro Leu Arg Leu Gly Leu Thr Asp Ile Asn Glu Ala Tyr Val
225 230 235 240
Glu Thr Leu Lys His Cys Phe Met Met Pro Gln Ser Leu Gly Val Ile
245 250 255
Gly Gly Lys Pro Asn Ser Ala His Tyr Phe Ile Gly Tyr Val Gly Glu
260 265 270
Glu Leu Ile Tyr Leu Asp Pro His Thr Thr Gln Pro Ala Val Glu Pro
275 280 285
Thr Asp Gly Cys Phe Ile Pro Asp Glu Ser Phe His Cys Gln His Pro
290 295 300
Pro Cys Arg Met Ser Ile Ala Glu Leu Asp Pro Ser Ile Ala Val Gly
305 310 315 320
Phe Phe Cys Lys Thr Glu Asp Asp Phe Asn Asp Trp Cys Gln Gln Val
325 330 335
Lys Lys Leu Ser Leu Leu Gly Gly Ala Leu Pro Met Phe Glu Leu Val
340 345 350
Glu Leu Gln Pro Ser His Leu Ala Cys Pro Asp Val Leu Asn Leu Ser
355 360 365
Leu Asp Ser Ser Asp Val Glu Arg Leu Glu Arg Phe Phe Asp Ser Glu
370 375 380
Asp Glu Asp Phe Glu Ile Leu Ser Leu
385 390

Claims (12)

1.一种帕金森氏病诊断用组合物，为了测量针对ATG4B(cysteine protease ATG4B)蛋白的自身抗体的水平而包括特异性结合于所述自身抗体的ATG4B蛋白。
2.根据权利要求1所述的帕金森氏病诊断用组合物，所述ATG4B蛋白包括由序列号1表示的氨基酸序列。
3.一种包括根据权利要求1或2所述的组合物的帕金森氏病诊断用试剂盒。
4.根据权利要求3所述的帕金森氏病诊断用试剂盒，其中，
所述试剂盒检测针对ATG4B(cysteine protease ATG4B)蛋白的自身抗体(autoantibody)。
5.根据权利要求4所述的帕金森氏病诊断用试剂盒，其中，
所述自身抗体的检测通过选自由酶联免疫吸附测定法(ELISA：Enzyme-linkedimmunosorbent assay)、放射免疫分析法(RIA：Radioimmnoassay)、夹心分析法(Sandwichassay)、蛋白质印迹法(Western Blot)、免疫印迹法(Immunoblot assay)以及免疫组织化学染色法(Immnohistochemical staining)组成的组中的一种以上来执行。
6.一种用于帕金森氏病诊断的信息提供方法，包括如下步骤：
测量分离自受试者的生物试料中针对ATG4B(cysteine protease ATG4B)蛋白的自身抗体的水平；
将所述测量的自身抗体水平与从分离自正常人个体的生物试料中测量的针对ATG4B蛋白的自身抗体水平进行比较；以及
在所述受试者的自身抗体水平高于所述正常人个体的自身抗体水平的情况下，判定受试者为帕金森氏病阳性。
7.根据权利要求6所述的用于帕金森氏病诊断的信息提供方法，其中，
所述生物试料选自由血液、血浆以及血清组成的组。
8.根据权利要求6所述的用于帕金森氏病诊断的信息提供方法，其中，
针对所述ATG4B蛋白的自身抗体水平利用与所述自身抗体之间的抗原-抗体反应来测量。
9.根据权利要求6所述的用于帕金森氏病诊断的信息提供方法，其中，
所述ATG4B蛋白包括由序列号1表示的氨基酸序列。
10.一种用于提供帕金森氏病诊断信息的检测自身抗体的方法，包括如下步骤：
将分离自受试者的生物试料加入于涂覆有ATG4B(cysteine protease ATG4B)蛋白的固定体中，并进行抗原-抗体反应；
利用显色底物溶液检测通过上述的步骤生成的抗原-抗体反应产物；以及
判定所述检测量相比于正常人个体有增加的受试者患有帕金森氏病或者患帕金森氏病可能性高。
11.根据权利要求10所述的一种用于提供帕金森氏病诊断信息的检测自身抗体的方法，其中，
所述固定体选自由硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜、利用聚乙烯树脂或聚苯乙烯树脂合成的孔板以及利用玻璃构成的载玻片组成的组。
12.根据权利要求10所述的一种用于提供帕金森氏病诊断信息的检测自身抗体的方法，其中，
所述ATG4B蛋白包括由序列号1表示的氨基酸序列。
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