KR102475427B1

KR102475427B1 - 파킨슨병 진단용 바이오 마커 조성물

Info

Publication number: KR102475427B1
Application number: KR1020210003400A
Authority: KR
Inventors: 장재락; 윤정한
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2022-12-08
Also published as: KR20220150865A; KR102525637B1; KR20220101416A

Abstract

본 발명은 파킨슨병 진단용 바이오 마커 조성물에 관한 것으로, 파킨슨병 환자에서 특이적으로 변화를 나타내는 혈장 단백질 바이오 마커에 관한 것으로, 파킨슨병 환자에서 특이적을 변화를 나타내는 혈장 단백질 수준을 분석하고, 특이적 변화를 나타내는 BAG2, BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 D(cathepsin D), LAMP1, LAMP2, 및 WDFY3의 7개 단백질을 분석하였으며, 특히, BAG2 및 카텝신 D(cathepsin D, CTSD)의 수준이 대조군에 비해 파킨슨병 환자에게서 유의하게 낮은 수준으로 나타나는 것을 확인하고, BAG2 및 CTSD의 혈장 수준의 조합으로 건강한 지원자와 파킨슨병 환자를 구별하는 성능이 우수하다는 것을 평가함으로써, 혈장 BAG2 및 CTSD의 수준을 이용하여 파킨슨병 환자를 진단하는 방법을 제공한다.

Description

파킨슨병 진단용 바이오 마커 조성물{Biomarker composition for diagnosis of Parkinson's disease}

본 발명은 파킨슨병 진단용 바이오 마커 조성물에 관한 것으로, 파킨슨병 환자에서 특이적으로 변화를 나타내는 혈장 단백질 바이오 마커에 관한 것이다.

파킨슨병은 진전(떨림), 경직, 서동증(행동이 느려짐), 불안정한 자세 유지 등을 주증상으로 하는 병으로 뇌에서 도파민이라는 신경전달물질이 부족하게 되어 생기는 만성질환이고, 중추신경계 퇴행성질환의 하나이며, 중뇌의 흑색질 밀집부(Substantia nigra pars compacta)의 변형을 시작으로 뇌의 부피의 감소, 알파-시누클레인(α-synuclein, α-Syn)의 응집 등을 병태생리적 증상으로 갖는 질환으로 보행의 불완전, 손떨림, 강직된 행동 등을 보인다. 이러한 파킨슨병의 진단과 관련하여 수행되는 검사로는 PET 검사, MRI 검사, 내과적 질환에 대한 검사 등이 있다.

뇌 도파민 운반체 양전자 단층 촬영(dopamine transporter PET, positron emission tomography) 검사는 도파민성 세포의 손상 여부를 알 수 있는 검사로서, 뇌 도파민 운반체 양전자 단층 촬영을 하게 되면 파킨슨병 때문이 아닌 다른 원인들에 의한 파킨슨증상을 확인할 수 있다. 약물 유발성 파킨슨증후군, 혈관성 파킨슨증후군, 알츠하이머병에서 동반되는 파킨슨증상, 본태성 진전에서 동반되는 파킨슨증상의 경우 일견 파킨슨증상과 유사한 떨림 등을 보이는 경우가 있으나, 도파민성 신경세포는 정상임을 확인할 수 있다.

파킨슨 증상을 보이는 경우에 파킨슨병과 유사한 질환들과 구분하는 것이 중요하고, 이차성 파킨슨증후군 및 비전형성 파킨슨증후군 등과 구분하기 위해서는 먼저 뇌 자기공명영상(MRI) 검사가 필요하다. 파킨슨병의 경우에는 MRI가 정상소견인 반면에 다른 질환들은 특징적인 MRI 소견을 보인다. 또한, 파킨슨병 진단 방법 중 내과적 질환에 대한 검사(혈액검사, 소변 검사, 심전도, 가슴 엑스선 검사)방법은 내과적 질환이 전신 위약감을 일으키면서, 파킨슨 증상으로 오인하는 경우가 있는데 이를 확인하기 위해서는 다른 내과적인 질환이 없는지 확인하기 위한 검사가 필요하다.

상기 파킨슨병 진단 방법들은 고가이고 진단 절차가 복잡한 문제가 있다. 또한, 파킨슨병을 앓고 있는 환자는 해마다 크게 증가하고 치료제 시장도 이에 비례하여 크게 성장하고 있지만, 정작 파킨슨병 진단 시장의 발전은 미진한 실정이다. 따라서, 파킨슨병을 그 유사질환과 구분하여 신속하고 경제적으로 진단할 수 있는 기술 및 이와 동시에 치료를 병행할 수 있는 기술에 대한 개발이 시급한 상황이다.

한국등록특허 제10-2120794호 (2020. 06. 03. 공고)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 파킨슨병 환자에게서 특이적으로 변화를 나타내는 혈장 단백질을 파킨슨병의 진단용 바이오 마커로 제공하는 것으로, 정상 대조군에 비해 파킨슨병 환자에서 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 및 카텝신 D(cathepsin D)의 혈장 수준이 낮게 나타나는 것을 확인하여 혈장 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 및 카텝신 D(cathepsin D)를 파킨슨병 진단용 바이오 마커로 제공하는 것이다.

본 발명은 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 및 카텝신 D(cathepsin D)를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2)의 단백질 수준을 측정하는 제제 및 카텝신 D(cathepsin D)의 단백질 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 대상체 유래의 생물학적 시료에서 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 및 카텝신 D(cathepsin D)의 단백질 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 단백질들의 수준을 건강한 대조군과 비교하는 단계; 및 (3) 상기 BAG2 및 카텝신 D의 수준이 건강한 대조군에 비해 낮은 수준이면 파킨슨병이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 파킨슨병의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 파킨슨병 환자에서 특이적을 변화를 나타내는 혈장 단백질 수준을 분석하고, 특이적 변화를 나타내는 BAG2, BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 D(cathepsin D), LAMP1, LAMP2, 및 WDFY3의 7개 단백질을 분석하였으며, 특히, BAG2 및 카텝신 D(cathepsin D, CTSD)의 수준이 대조군에 비해 파킨슨병 환자에게서 유의하게 낮은 수준으로 나타나는 것을 확인하고, BAG2 및 CTSD의 혈장 수준의 조합으로 건강한 지원자와 파킨슨병 환자를 구별하는 성능이 우수하다는 것을 평가함으로써, 혈장 BAG2 및 CTSD의 수준을 이용하여 파킨슨병 환자를 진단하는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 대조군 및 파킨슨병(PD) 환자의 혈장에서 알부민 및 IgG를 제거하고 폴리 아마이드 겔에서 단백질을 분리한 결과이다.
도 2는 대조군 및 파킨슨병(PD) 환자의 혈장에서 BAG2, BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 D(cathepsin D), LAMP1, LAMP2, 및 WDFY3의 7개 단백질에 대한 면역블로팅 분석한 결과이다.
도 3은 대조군 및 파킨슨병(PD) 환자의 혈장에서 BAG2, BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 D(cathepsin D), LAMP1, LAMP2, 및 WDFY3의 7개 단백질에 대한 발현 수준을 비교 분석한 결과이다.
도 4는 대조군 및 파킨슨병(PD) 환자의 혈장에서 BAG2 및 카텝신 D(cathepsin D, CTSD)의 수준을 비교 분석한 결과이다.
도 5는 BAG2 항체를 검증하기 위해, CRISPR-Cas9 시스템으로 유전적 녹아웃(knock-out)을 유도하고 면역블로팅 분석한 결과이다.
도 6은 검증된 BAG2 항체를 이용하여 대조군 및 파킨슨병(PD) 환자의 혈장에서 BAG2의 수준을 분석한 결과이다.
도 7은 검증된 BAG2 항체를 이용하여 대조군 및 파킨슨병(PD) 환자의 혈장에서 BAG2의 수준을 비교한 결과이다.
도 8은 파킨슨병 환자에서 나이(a), 성별(b), 교육 기간(c), MMSE(Mini Mental State Examination) 점수(d), 발병 연령(e), 질병 기간(f), UPDRS-III(Unified PD Rating Scale Part III) 점수(g), 후각소실 여부(h), RBD(rapid eye movement sleep behavior disorder) 병력(i), 비정상적인 깊은 백질 유무(j) 등의 임상적 특징과 혈장 BAG2의 수준의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 9는 CTSD 항체를 검증하기 위해, CRISPR-Cas9 시스템으로 유전적 녹아웃(knock-out)을 유도하고 면역블로팅 분석한 결과이다.
도 10은 검증된 CTSD 항체가 분비된 CTSD도 검출할 수 있는지 확인하기 위해, 세포 또는 조절 배지에서 면역블로팅 분석한 결과이다.
도 11은 검증된 CTSD 항체를 이용하여 대조군 및 파킨슨병(PD) 환자의 혈장에서 CTSD의 수준을 분석한 결과이다.
도 12는 검증된 CTSD 항체를 이용하여 대조군 및 파킨슨병(PD) 환자의 혈장에서 CTSD의 수준을 비교한 결과이다.
도 13은 혈장 BAG2 및 CTSD에 대하여 파킨슨병의 진단용 바이오 마커의 가능성을 평가한 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 파킨슨병 환자에서 특이적으로 변화를 나타내는 혈장 단백질들을 분석하였고, 이를 토대로 정상 대조군 대비 파킨슨병 환자에서 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 및 카텝신 D(cathepsin D)의 수준이 낮 게 나타나는 것을 확인하여, 혈장 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 및 카텝신 D(cathepsin D)를 파킨슨병 진단용 바이오 마커로 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 조성물은 BAG3(BAG family molecular chaperone regulator 3), 카텝신 B(cathepsin B), LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1), LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2), 및 WDFY3(WD repeat and FYVE domain-containing protein 3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 또는 카텝신 D(cathepsin D)에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 항체는 상업적으로 구입 가능한 항체를 포함할 수 있다.

상기 키트는 BAG3(BAG family molecular chaperone regulator 3), 카텝신 B(cathepsin B), LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1), LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2), 및 WDFY3(WD repeat and FYVE domain-containing protein 3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 또는 소변일 수 있다.

상기 정보 제공 방법은 상기 (1) 단계 이후에, (1-1) BAG3(BAG family molecular chaperone regulator 3), 카텝신 B(cathepsin B), LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1), LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2), 및 WDFY3(WD repeat and FYVE domain-containing protein 3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 단계; 상기 (3)단계 이후에, (3-1) 상기 BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 또는 LAMP1의 수준이 건강한 대조군에 비해 높으면 파킨슨병이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계; 및 (3-2) 상기 LAMP2, 및 WDFY3의 수준이 건강한 건강한 대조군에 비해 낮으면 파킨슨병이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계;를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예> 실험 재료 및 방법

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 환자 및 연구 승인

실험에 사용된 샘플들은 2017년 03월부터 2018년 06월까지 아주대학교 병원 파킨슨 센터를 방문한 총 114명의 파킨슨병 환자로부터 수집되었다. [¹⁸F]FP-CIT PET 스캔([¹⁸F] N-(3-fluoropropyl)-2β-carbomethoxy-3β-(4-iodophenyl)nortropane photon emission tomography scans) 또는 3T 뇌 MRI(magnetic resonance imaging)를 진단하지 않은 32명의 환자와 2년 이내에 추적 관찰되지 않은 21명의 환자는 실험에서 제외하였다. 또한, 추적 기간 동안 비정형 파킨슨 증후군 (n = 24) 또는 파킨슨병 치매 (n = 14)의 징후를 보인 환자는 제외되었다. MRI에서 국소 뇌 병변을 보인 3명의 환자도 제외되었다. 최종적으로 총 20명의 특발성 파킨슨병 환자가 실험에 등록되었다. 파킨슨병 진단은 영국 PD Society Brain Bank 임상 진단 기준을 사용하였으며, 파킨슨병 운동증상은 UPDRS-III (Unified PD Rating Scale Part III)를 사용하여 평가되었다. 수전증(essential tremor)이 있는 20대 환자 17명이 대조군으로 등록되었다. 모든 참가자의 연령, 성별, 투여 이력, 흡연 이력 및 지질 프로필에 대한 데이터를 수집하였다. 파킨슨병에 등록된 환자는 [¹⁸F]FP-CIT PET 스캔([¹⁸F] N-(3-fluoropropyl)-2β-carbomethoxy-3β-(4-iodophenyl)nortropane photon emission tomography scans) 또는 3T 뇌 MRI(magnetic resonance imaging)을 진단받았다. 본 실험은 아주대학교병원 기관연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)로부터 승인(AJIRB-MED-SMP-17-322)을 받았으며, 헬싱키 선언 및 한국 임상 진료 지침에 따라 수행되었다. 환자를 등록하기 전에 연구의 세부 목적을 서면 동의한 모든 환자에게 설명되었으며, 지역기관 검토위원회에서 승인한 절차를 준수하였다.

2. 샘플 준비 및 면역블롯팅

알부민(Albumin) 및 면역글로불린 G(IgG)는 Hi-Bind Albumin-IgG depletion beads (Biovision Cat #7933)를 사용하여 혈장에서 분리하였다. 비드를 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 5 회 세척한 후, 비드에 플라즈마를 적용하고 실온에서 2 시간 동안 회전시켰다. 상층액을 수집하고, 2x SDS(sodium dodecyl sulfate)-로딩 완충액과 혼합하고, 95℃에서 10분 동안 가열하였다.

면역블롯팅(immunoblotting)을 수행하기 위해, 샘플을 SDS- 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에서 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막은 0.05 % Tween-20 함유 Tris 완충 식염수(TBST)에 3% 탈지유를 처리하여 브로킹하였다. 블롯은 TBST에 3% 소 혈청 알부민을 함유하는 TBST에 희석된 1차 항체로 처리되고, TBST로 세척되고, 3% 탈지유를 함유하는 TBST에서 호스래디시 과산화효소(horseradish peroxidase)와 결합된 2차 항체로 처리되었다. BCL2-관련 특이적인 1차 항체인 athanogene (BAG2; Bethyl Cat #A304-751A), BAG3 (Bethyl Cat #A302-807A), cathepsin B (Abcam Cat #ab58802), cathepsin D (Calbiochem Cat #IM-03), LAMP1 (Abcam Cat #ab25630), LAMP2 (Proteintech Cat #66301-1-Ig), WDFY3 (Bethyl Cat #A301-869A), 및 α-Tubulin (Abcam Cat #ab18251)를 구입하여 사용하였다. 면역 반응성 단백질은 ChemiDoc Gel Imaging System (Bio-rad)로 검출하였다. 밴드 강도는 Image Lab software (Bio-rad)를 사용하여 측정하였다.

3. 항체 검증

BAG2 또는 카텝신 D(CTSD)의 유전자 편집을 위해, E-CRISP에서 권장하는 목록에서 대상을 선택하였다. 타겟 서열을 하기 표 1과 같다.

타겟	염기서열	서열번호
BAG2-CR1	5′-ACATGAGGCAGATCAGTGA-3′	1
BAG2-CR2	5′-CCTCATGTCCTGGCTATTT-3′	2
CTSD-CR1	5′-TCCAGGTGGACCTGCCAGT-3′	3
CTSD-CR2	5′-GCCTACTGGCAGGTCCACC-3′	4

pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) vector (Addgene, #48139)의 표적에 특정한 가이드 RNA(gRNA)를 클로닝한 후, 구조물은 36 시간 동안 Avalanche-Omni 시약 (EZ Biosystems)으로 Hela 세포에 형질감염시키고, 2 μg/mL 퓨로마이신으로 24 시간 동안 처리되었다. 추가 배양 후, 세포를 용해시키고, 1x SDS 용해 완충액으로 가열한 후, 면역블로팅을 수행하였다.

4. 통계 분석

데이터는 평균 ± SD 또는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 로지스틱 회귀 분석 및 ROC(receiver operating characteristic) 곡선 분석에 이어 Pearson의 χ2 테스트를 수행하여 바이오 마커의 진단 정확도를 평가하였다. GraphPad Prism 7 또는 Microsoft Excel Office 365를 사용하여 통계 데이터를 분석하고 그래프로 그렸다. 그룹 간 비교의 유의 수준은 Student 's t-test에 의해 결정되었다. P 값 <0.05는 유의미한 것을 간주되었다.

실시예 1. 인구 통계

실험군으로 지난 3년 동안 파킨슨병이 발병된 20명의 환자가 모집되었고, 대조군으로 임상적으로 파킨슨병이 진단되지 않고 수전증이 있는 동일 연령대 20명의 환자가 모집되었다(표 2). 하기 표 2와 같이, 임상 조사 및 평가에 따르면 두 그룹의 환자는 교육 기간이 비슷했으며, 인지 기능 테스트에서 유사한 결과를 나타냈다. 파킨슨병이 발병되는 연령은 50세 중반(55.1 ± 8.5 세)으로 확인되었으며, 지난 23.2 ± 10 개월 동안 파킨슨병을 경함 것으로 나타났다. 파킨슨병 환자 20명 중, 6명은 후각 장애가 있었고, 7명은 파킨슨병의 주요 전조 비운동성 증상인 RBD(Rapid eye movement sleep behavior disorder)증상이 있는 것으로 나타났다. MRI 스캔 결과, 환자의 약 절반이 깊은 백질 구조에 결함이 있는 것으로 나타났다. Lewy 신체로 인한 교감성 심장 탈신경을 측정하는 MIBG(Cardiac metaiodobenzylguanidine) 스캔으로 파킨슨병 환자 11을 측정하였다.

	나이	성별(남/여)	교육기간(년)	MMSE
Control (n = 20)	59.3 ± 6.4	7/13	12.2 ± 4.3	28.5 ± 3.2
PD (n = 20)	56.6 ± 8.2	11/9	11.7 ± 5.5	26.1 ± 5.1
	발병 나이	질병 기간(개월)	UPDRS-III	MIBG (n = 11)
PD (n = 20)	55.1 ± 8.5	23.2 ± 10.0	18.3 ± 6.2	1.8 ± 0.4
	CC-SIT (정상/후각소실)	RBD 기록	비정상 백질
PD (n = 20)	14/6	7	9

MMSE, Mini-Mental State Examination; PD, Parkinson’s disease; UPDRS-III, Unified Parkinson’s Disease Rating Scale; MIBG, metaiodobenzylguanidine; CC-SIT, Cross-Cultural Smell Identification Test; RBD, rapid eye movement sleep behavior disorder.

실시예 2. 바이오 마커 후보 단백질 스크리닝

파킨슨병을 진단하는 바이오마커를 분석하기 위해, 면역블롯팅을 이용하여 바이오 마커 후보 단백질의 수준을 분석하였다. 혈장은 용해된 염, 순환하는 RNA, 및 단백질과 같은 여러 구성 요소를 포함한다. 따라서 혈장의 단백질 수준을 분석하기 전에 먼저 혈장의 주요 단백질인 일부민과 혈장 샘플의 IgG를 제거하고, 폴리아크릴아마이드 겔에서 선택된 단백질을 적절하게 분리하였다(도 1).

혈장에서 파킨슨병(PD) 특이적인 바이오 마커를 선별하기 위해, 자가포식(autophagy) 경로와 관련된 30개의 단백질을 선택하였다. 각 피시험자로부터 동일한 양의 혈장 샘플을 채취하고, 30개의 단백질 수준을 분석하였다. 30개의 단백질 중에서 BAG2, BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 D(cathepsin D), LAMP1, LAMP2, 및 WDFY3의 7개 단백질에 대해 특이적인 항체로 면역블롯팅을 실시하고, 정량화 수준을 측정하였다(도 2). 측정된 각 단백질의 밴드 강조를 정량적으로 분석하고, 파킨슨병 환자에서 변화 수준을 대조군과 비교하여 대비 그래프로 나타냈다(도 3).

도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 파킨슨병 환자에서 BAG2, BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 D(cathepsin D), LAMP1, LAMP2, 및 WDFY3의 수준이 다르게 나타났다. 대조군에 비해 파킨슨병 환자에서 BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 및 LAMP1의 수준은 높은 수준으로 나타났으며, BAG2, 카텝신 D(cathepsin D), LAMP2, 및 WDFY3의 수준은 낮은 수준으로 나타났다. 특히, 7개의 단백질 중에서 BAG2 및 카텝신 D(cathepsin D, CTSD)의 수준은 대조군과 비교하여 파킨슨병 환자에서 20% 이상 낮은 수준으로 나타났다.

실시예 3. 파킨슨병 환자에서 BAG2 수준

면역블롯팅에서 사용된 BAG2 항체를 검증하기 위해, 항체의 특이성을 조사하여 개별 샘플에서 대조군과 PD 환자군 사이의 단백질이 다른 수준으로 나타나는지 확인하였다. CRISPR-Cas9 시스템으로 유전적 녹아웃(knock-out)을 유도하는 BAG2 유전자 특이적 gRNA를 HeLa 세포에 형질 감염 시키고, BAG2 항체가 형질감염에 의해 감소된 특정 BAG2 밴드를 검출할 수 있는지 확인하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 형질 감염에 의해 BAG2 수준이 현저히 감소함을 확인하였고, 상기 항체는 특정 밴드(~ 25 kDa)를 감지하는 것으로 나타났다. 세포의 유전적 이질성으로 인해 잔류 BAG2 단백질이 gRNA로 형질 감염된 세포에서 검출되었지만, 상기의 결과는 실험에 사용된 BAG2 항체가 신뢰할 수 있을 만큼 특이적임을 입증한다.

상기의 BAG2 항체를 이용하여 혈장 샘플에서 알부민 및 IgG를 제거하고 면역블로팅으로 분석하여 각 혈장 샘플의 BAG2의 수준을 분석하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, BAG2의 수준은 파킨슨병 환자에서 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 혈장 샘플에서 검출된 가장 강한 BAG2 신호는 kDa이고, 밴드의 강도는 25 kDa와 높은 상관 관계가 있으므로, 상기 두 밴드가 혈장에 존재하는 BAG2임을 입증한다. 또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군의 BAG2 수준은 이질적으로 나타나는 반면, 파킨슨병 환자의 BAG2 수준은 균일하게 낮은 수준으로 나타났다. 파킨슨병 환자에서 BAG2 수준의 상대적 평균 값은 대조군의 14%에 불과했다. 상기 결과는 혈장 BAG2 단백질의 양이 파킨슨병의 발병 및 진행과 관련이 있음을 입증한다.

실시예 4. 파킨슨병 환자의 임상 특성과 BAG2 수준의 관련성

파킨슨병 환자에서 BAG2 수준과 임상 특성 사이의 연관성을 확인하기 위해, BAG2 수준과 인구 통계학적 특성 사이의 상관 관계를 분석하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 나이(a), 성별(b), 교육 기간(c), MMSE(Mini-Mental State Examination) 점수(d), 발병 연령(e), 질병 기간(f), UPDRS-III(Unified PD Rating Scale Part III) 점수(g), 후각소실 여부(h), RBD(rapid eye movement sleep behavior disorder) 병력(i), 비정상적인 깊은 백질 유무(j) 등의 임상 특성과 BAG2 수준을 비교하였다. 파킨슨병 환자의 혈장 내 BAG2 수준은 나이(a), 성별(b), 교육 기간(c), MMSE(Mini-Mental State Examination) 점수(d)와 관련이 없었다. 또한, 발병 연령(e), 질병 기간(f), UPDRS-III(Unified PD Rating Scale Part III) 점수(g), RBD(rapid eye movement sleep behavior disorder) 병력(i), 비정상적인 깊은 백질 유무(j) 등의 임상 특성과 BAG2 수준이 관련이 없는 것으로 나타났다. 다만, 후각소실이 나타난 파킨슨병 환자의 혈장 BAG2 수준은 정상 후각을 갖는 파킨슨병 환자의 혈장 BAG2 수준 보다 현저히 낮은 것(P = 0.045)으로 나타났다.

실시예 5. 파킨슨병 환자에서 카텝신 D 수준

카텝신 D(cathepsin D, CTSD)는 용해성 리소좀 아스파틱 엔도펩티다아제로, endolysosomal 구획 내에서 mature 형태로 처리되고, 신경 퇴행성 질환과 관련이 있다. 분자량이 52 kDa인 Pro-CTSD는 단백질 분해를 거쳐 활성 중간물 pro-CTSD 및 pre-CTSD(~ 42 kDa)의 생성으로 이어진다. 활성 중간물 CTSD는 성숙한 형태로 추가 처리된다.

상기 실시예 2에 나타난 바와 같이, 파킨슨병 환자의 혈청에서 카텝신 D(cathepsin D, CTSD)은 대조군에 비해 낮은 수준으로 나타났다. 개별 혈장 샘플에서 CTSD 수준을 조사하기 위해, CRISPR-Cas9 시스템을 통해 CTSD에 특이적인 항체를 검증하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, pro-CTSD, pre-CTSD, 및 가공된 CTSD 중쇄 사슬의 수준은 CTSD-gRNA의 형질 감염에 의해 감소되었다.

한편, 혈장 검체에서 검출된 CTSD가 분비형이라는 점을 감안할 때, 항체가 분비된 CTSD도 검출할 수 있는지 확인하였다. Hela 세포 또는 HEK293T 세포 조절 배지를 사용하여 면역 블롯 분석을 수행한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 분비된 CTSD는 비교적 약 50 kDa보다 약간 높은 분자량을 갖는 것으로 나타났다. 상기 결과는 항체는 분비된 CTSD에도 사용될 수 있음을 입증한다.

면역 블롯 분석을 통해 개별 혈장 샘플을 분석하였다. 도 11 및 12에 나타난 바와 같이, CTSD의 수준은 대조군에 비해 파킨슨병 환자의 혈장 샘플에서 유의하게 낮은 수준으로 나타났다. 혈장 샘플에서 약 50 kDa로 검출되는 밴드는 CTSD의 분비 형태이며, 혈장 CTSD 수준은 임상적 특성과 관련이 없는 것으로 나타났다.(데이터 미포함) 상기의 결과는 파킨슨병 환자의 CTSD 수준의 변화는 임상적인 특성보다는 파킨슨병의 일반적인 병인과 관련이 있음을 시사한다.

실시예 6. 파킨슨병의 진단용 바이오 마커로서 혈장 BAG2 및 CTSD 수준 평가

혈장 BAG2 및 CTSD에 대하여 파킨슨병의 진단용 바이오 마커의 가능성을 평가하였다. 혈장 BAG2 및 CTSD 수준, 통계적 예측 모델, ROC 곡선을 사용하였다. ROC 곡선은 특이성의 함수로서 민감도를 나타내고, 곡선 아래 영역(AUC)는 두 그룹을 구별할 모델의 정확도를 나타낸다.

도 13 및 표 3에 나타난 바와 같이, 혈장 BAG2 수준에서 AUC는 0.840 민감도는 85%, 특이성은 55%(P = 0.0002)였으며, 혈장 CTSD 수준에서 AUC는 0.760, 민감도는 65%, 특이성은 60%(P = 0.0049)로 나타났다. BAG2 및 CTSD 수준을 사용하는 통합 다변량 모델에서 AUC는 0.875, 민감도는 85%, 특이성은 75%(P < 0.0001)로 높은 진단 정확도를 나타냈다. 상기의 결과는 BAG2 및 CTSD의 혈장 수준의 조합이 건강한 지원자와 파킨슨병을 구별하는 성능이 높다는 것을 나타낸다.

Control vs. PD	AUC	민감도 %	특이성 %	P value	AUC의 95% CI
BAG2	0.840	85.00	55.00	0.0002	0.717 ~ 0.963
Cathepsin D	0.760	65.00	60.00	0.0049	0.609 ~ 0.911
BAG2 + cathepsin D	0.875	85.00	75.00	< 0.0001	0.763 ~ 0.987

종합하면, 상기의 결과들은 BAG2 및 CTSD의 혈장 수준은 파킨슨병을 진단하는 새로운 진단 바이오 마커임을 입증한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarker composition for diagnosis of Parkinson's disease <130> ADP-2020-0615 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAG2-CR1 <400> 1 acatgaggca gatcagtga 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAG2-CR2 <400> 2 cctcatgtcc tggctattt 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTSD-CR1 <400> 3 tccaggtgga cctgccagt 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTSD-CR2 <400> 4 gcctactggc aggtccacc 19

Claims

BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 및 카텝신 D(cathepsin D)를 유효성분으로 포함하며, BAG2 및 카텝신 D의 발현 수준은 파킨슨병이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 환자의 생물학적 시료에서 발현이 모두 감소되는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 진단용 바이오 마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 BAG3(BAG family molecular chaperone regulator 3), 카텝신 B(cathepsin B), LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1), LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2), 및 WDFY3(WD repeat and FYVE domain-containing protein 3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병의 진단용 바이오 마커 조성물.
◈청구항 3은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2)의 단백질 수준을 측정하는 제제 및 카텝신 D(cathepsin D)의 단백질 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하며, BAG2 및 카텝신 D의 발현 수준은 파킨슨병이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 환자의 생물학적 시료에서 발현이 모두 감소되는 것을 특징으로 하는 파킨슨병의 진단용 키트.
◈청구항 4은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제3항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 또는 카텝신 D(cathepsin D)에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 파킨슨병의 진단용 키트.
◈청구항 5은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제3항에 있어서, 상기 키트는 BAG3(BAG family molecular chaperone regulator 3), 카텝신 B(cathepsin B), LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1), LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2), 및 WDFY3(WD repeat and FYVE domain-containing protein 3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병의 진단용 키트.
◈청구항 6은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

(1) 대상체 유래의 생물학적 시료에서 BAG2(BAG family molecular chaperone regulator 2) 및 카텝신 D(cathepsin D)의 단백질 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 단백질들의 수준을 건강한 대조군과 비교하는 단계; 및
(3) 상기 BAG2 및 카텝신 D의 수준이 건강한 대조군에 비해 낮은 수준이면 파킨슨병이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 파킨슨병의 진단을 위한 정보 제공 방법.
◈청구항 7은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 또는 소변인 것을 특징으로 하는 파킨슨병의 진단을 위한 정보 제공 방법.
◈청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제6항에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 상기 (1) 단계 이후에,
(1-1) BAG3(BAG family molecular chaperone regulator 3), 카텝신 B(cathepsin B), LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1), LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2), 및 WDFY3(WD repeat and FYVE domain-containing protein 3)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 단계;
상기 (3)단계 이후에,
(3-1) 상기 BAG3, 카텝신 B(cathepsin B), 또는 LAMP1의 수준이 건강한 대조군에 비해 높으면 파킨슨병이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계; 및
(3-2) 상기 LAMP2, 및 WDFY3의 수준이 건강한 건강한 대조군에 비해 낮으면 파킨슨병이 발병하였거나 발병될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계;를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병의 진단을 위한 정보 제공 방법.