KR102478021B1 - 혈장을 이용한 알츠하이머병의 진단 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자의 말초혈액 유래 혈장에서 카텝신 D의 수준을 측정하여, 정상인 유래 혈장보다 카텝신 D 수준이 낮은 경우 알츠하이머로 진단하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 병의 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 환자의 혈장 유래의 마커를 이용하여 알츠하이머를 진단할 수 있어, 기존의 MRI나 PET과 같은 고가의 장비나 통증이 따르는 척수액 샘플을 이용한 알츠하이머 진단방법보다 간편하고 저렴하게 알츠하이머를 진단할 수 있다.

Description

혈장을 이용한 알츠하이머병의 진단{Diagnosis of Alzheimer's disease Using Plasma}

본 발명은 바이오마커를 이용하여 알츠하이머병을 진단하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 환자의 말초혈액 유래 혈장에서 카텝신 D(cathepsin D)의 수준을 측정하여, 정상인 유래 혈장보다 카텝신 D 수준이 낮은 경우 알츠하이머로 진단하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 병의 진단방법에 관한 것이다.

치매는 기억과 사고 능력의 점진적인 감소와 관련된 증상을 나타내는 질병으로, 노화된 집단에서는 치매가 더 빈번하게 발생하기 때문에 평균 수명이 길어지면 치매의 유병율이 높아져서 사회적 비용이 증가할 수밖에 없다. 치매의 원인으로는 다양한 유전적 및 환경적 요인이 알려져 있으며, 잘 알려진 치매의 유형으로는 알츠하이머 병(AD)과 혈관성 치매가 있다. 알츠하이머병은 세포 외 아밀로이드 베타(Aβ)플라그의 축적과 뇌의 세포 내 신경섬유성 타우 단백질(tau protein)의 엉킴이 나타나는 것을 특징으로 하며, 시냅스 기능 장애와 신경세포 손실을 일으킨다. 알츠하이머는 초기에 수년에 걸쳐 명백한 증상이 없기 때문에 잠복기의 조기 진단은 예후가 좋은 치료를 위해 필수적이다.

현재, 구조적 자기공명영상(MRI), 아밀로이드 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 스캔 및 뇌척수액 (CSF)에서 아밀로이드 베타(Aβ) 또는 총 타우 단백질 (T-tau) 및 인산화된 타우(p-tau) 수준을 분석하는 것이 임상평가에 도움이 되는 신뢰할 수있는 AD 진단 방법으로 간주된다. 그러나 이러한 방법은 고가이고, 침습적 요추 천자가 필요하다. 따라서, AD 진단을 위한 보다 편리하고, 저렴하며, 비침습적 진단 방법을 개발하기 위해 혈액 기반 바이오마커를 찾으려는 노력이 계속되고 있다. 그러나, 확립된 CSF의 AD 바이오마커에 대한 이전의 연구는 AD 진단을 위한 혈장 바이오 마커로서의 유용성에 상충되는 결과를 보여 주었다. 예를 들어, AD 환자에서 뇌척수액 (CSF)에서의 Aβ42 수준은 유의하게 감소한 반면, AD 환자에서 혈청 또는 혈장 Aβ42 수준은 대조군과는 크게 다르지 않았다(Olsson B et al., Lancet Neurology. 15:673, 2016). 그럼에도 불구하고, 편리하고 간편하면서 저렴한 장점 때문에 많은 사람들이 알츠하이머 진단을 위한 신뢰할 수 있는 새로운 혈장 바이오 마커를 개발하고자 노력하고 있다.

이에, 본 발명자들은 알츠하이머를 간편하고, 저가로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 혈액 유래 혈장의 카텝신 D 수준이 알츠하이머 환자에서 유의적으로 감소하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 알츠하이머를 간편하고, 저가로 진단할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 환자의 말초혈액 유래 혈장에서 카텝신 D의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 카텝신 D의 수준이 정상대조군의 수준보다 낮은 경우 알츠하이머로 진단하는 단계를 포함하는 알츠하이머의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 환자의 혈장 유래의 마커를 이용하여 알츠하이머를 진단할 수 있어, 기존의 MRI나 PET과 같은 고가의 장비나 통증이 따르는 척수액 샘플을 이용한 알츠하이머 진단방법보다 간편하고 저렴하게 알츠하이머를 진단할 수 있다.

도 1은 환자 혈장 시료의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것으로, (a)는 알부민 및 면역 글로불린 G을 제거한 혈장의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이고, (b) 알부민/IgG 제거한 대조군 및 환자 혈장 샘플의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 AD 환자 혈장에서 카텝신 D의 수준을 면역 블롯팅 분석한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 면역 블롯분석을 위한 카텝신 D 항체를 검증한 결과를 나타낸 것으로, HeLa 세포를 빈벡터 또는 CTSD 유전자에 특이적인 gRNA를 갖는 벡터 (CTSD-gRNA1, CTSD-gRNA2, CTSD-gRNA1 + 2)로 형질감염시킨 후, 세포 용해물을 카텝신 D 항체로 면역 블롯팅한 결과를 나타낸 것이다. (b) 및(c)는 대조군 및 환자의 혈장에서 카텝신 D 수준을 분석한 결과를 나타낸 것으로, (b)는 알부민/IgG 제거 혈장 샘플을 카텝신 D 항체로 면역 블롯팅한 결과를 나타낸 것으로, Ponceau S 염색은 각 레인에 동일한 양의 혈장 단백질이 로딩되었음을 보여준다. 제한된 수의 레인으로 인해 샘플을 별도의 겔에 로딩하였지만, 모든 SDS-PAGE 및 면역 블롯 분석은 노출시간을 포함하여 동일한 조건 하에서 동시에 수행하였다. (c)는 (b의 화살표)의 특정 밴드의 강도를 정량적으로 분석하고, 대조군과 비교하여 각 그룹의 접힘 수준 변화를 나타내었다. 각 색상의 점은 카텝신 D 수준을 나타낸다.
도 3은 혈장 내 카텝신 D의 수준과 환자의 연령, 교육 기간, APOE 대립 유전자의 존재 또는 WMH 점수와의 관련성을 확인한 결과를 나타낸 것으로, 연령 (a), 교육 기간 (b), APOE4 유전자의 존재 (c) 및 WMH 점수 (d)와 혈장 카텝신 D 수준의 상관 관계를 분석하였다. 각 점은 각 대조군 또는 환자 혈장의 카텝신 D 수준을 나타낸다. (a) 및 (b)는 선형 회귀의 피어슨 상관계수(r) 및 P- 값(Kruskal-Wallis 테스트)을 각 패널에 표시하였다 (c) 및 (d)는 평균± SD를 각 그룹에서 수평선으로 표시하였다.
도 4는 혈장 카텝신 D의 수준과 CDR-SB 점수와 상관 관계를 확인한 결과를 나타낸 것으로, MMSE 점수 (a), CDR 점수 (b) 및 CDR-SB 점수 (c)와 혈장 카텝신 D 수준의 상관관계를 분석 하였다. 각 점은 각 대조군 또는 환자 혈장의 카텝신 D 수준을 나타낸다. (a) 및 (c)는 선형회귀의 피어슨 상관 계수(r) 및 P-값(Kruskal-Wallis 테스트)을 각 패널에 표시하였고, (b)는 평균± SD를 각 그룹에서 수평선으로 표시하였다.
도 5는 AD 환자 혈장에서 카텝신 D의 수준을 ELISA 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것으로, 카텝신 D에 대한 ELISA 분석은 대조군 및 환자 혈장으로 수행하였다. 각각의 컬러 도트는 ELISA에 의해 분석된 각 환자 혈장의 카텝신 D 수준을 나타낸다. 평균± SD는 각 그룹에서 수평선으로 표시하였다. * p <0.05 (Kruskal-Wallis 테스트).
도 6은 AD환자 그룹과 비환자 그룹을 구별하여 혈장 카텝신 의 바이오마터로서의 성능을 분석한 결과를 나타낸 것으로, A는 로지스틱 회귀 분석을 위해 분류 된 그룹을 나타낸 것이고, B~D는 변수 조합 (연령, 성별, ApoE, 카텝신 D) 간의 ROC 곡선을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)을 보다 편리하고 간편하게 진단할 수 있는 시스템을 확립하기 위해, 면역 블롯팅 및 ELISA를 사용하여 환자의 혈장 내의 카텝신 D 수준을 평가하였다. AD 환자 혈장에서의 카텝신 D의 수준이 면역 블롯팅 및 ELISA의 결과에 기초한 건상인의 대조군 대상의 수준보다 유의하게 낮은 것을 확인하였다. 또한, 혈장 카텝신 D의 수준은 인지능력 감소와 관련이 있는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 (a) 환자의 말초혈액 유래 혈장에서 카텝신 D 또는 카텝신 D의 중간체의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 카텝신 D 또는 카텝신 D의 중간체의 수준이 정상대조군의 수준보다 낮은 경우 알츠하이머로 진단하는 단계를 포함하는 알츠하이머의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

카텝신 D는 다양한 전구체 및 성숙한 형태로 존재하므로, 본 발명에서는 상이한 크기의 단백질을 구별하기에 적합한 면역 블롯팅 분석법을 사용하기로 결정하였다. 세포 내 단백질의 분석과 비교하여, 혈장은 매우 복잡한 성분으로 구성되고 혈장 단백질의 면역블롯 기반식별이 완전히 확립되지 않았기 때문에 혈장 샘플로 면역블롯 결과의 해석은 매우 신중하게 이루어져야한다.

본 발명에 있어서, 상기 카텝신 D는 카텝신 D의 중간체인 것을 특징으로 할 수 있다. 카텝신 D는 엔도좀에서 리소좀으로 전달되면서 순차적인 절단 과정을 거쳐 성숙된다. 먼저 엔도좀에서 N-말단의 44개의 아미노산이 제거됨으로써 카텝신 D 전구체 (52 kDa) 가 카텝신 D 중간체 (48 kDa) 로 전환된다. 이어서 카텝신 B 또는 카텝신 L에 의해 추가로 절단됨으로써 카텝신 D 중간체로부터 두 종류의 카텝신 D 성숙체 (14kDa, 34kDa) 가 형성된다.

본 발명에 있어서, 상기 혈장은 알부민 및 IgG가 제거된 혈장인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (b) 단계의 카텝신 D의 수준 측정은 면역 블럿팅 또는 ELISA 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 알츠하이머의 진단은 혈관성 치매와 알츠하이머 병을 구별하는 진단인 것을 특징으로 할 수 있다.

한편, CTSD 유전자에 의해 코딩되는 카텝신 D는 리소좀 아스파르트산 프로테아제이다. 이는 골지 복합체에서 디글리코실화된 전구체 형태(프로-카텝신 D)로서 존재한다. 전구체는 억제 신호펩티드를 잃고 리소좀에서의 추가 처리과정을 통해 성숙한 활성효소 형태가 된다. 리소좀 카텝신 D는 세포 내 이입 또는 자가 포식으로부터 전달되는 언폴디드 단백질 응집체의 분해를 매개한다. 자가 포식-리소좀 경로는 Aβ 및 타우(tau) 단백질에 대한 주요 클리어런스 시스템인 것으로 생각된다. 카텝신 D는 APP 및 tau의 처리에 관여하기 때문에 알츠하이머(AD)의 병인에 관여한다.

또한, 카텝신 D는 AD 환자의 사후 뇌의 피질 및 해마 뉴런에서 높게 발현된다. 카텝신 D 수치는 AD 환자의 뇌와 뇌척수액(CSF)의 아밀로이드 플라크에서 비정상적으로 상승한다. 이들 연구는 카텝신 D가 AD에 대한 신뢰할 수 있는 바이오 마커 일 수 있음을 강력하게 시사하지만, AD 환자의 혈액 샘플에서 카텝신 D 수준을 검사한 후에 불일치한 결과가 존재한다. 이전 연구와 일관되게, AD 환자의 혈장 시료를 사용한 연구에서 카텝신 D의 증가된 수준이 보고되었다(Morena F et al., Int J Mol Sci. 18(8), 2017). 반대로, 또 다른 연구는 AD 환자로부터 유래된 섬유아세포에서 카텝신 D 수준이 하향조절된다는 보고가 있다[Urbanelli L et al., Neurobiol Aging. 29:12, 2008). 카텝신 D의 감소된 발현은 AD 환자의 단핵구에서도 관찰되었다[Tian L et al J Alzheimers Dis. 42:511, 2014). 따라서, 카텝신 D가 AD에 대한 혈장 바이오마커로서 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 AD 환자의 혈장에서 카텝신 D 수준에 대한 이러한 상충되는 결과를 해결하기 위한 추가 연구가 필요하였다.

AD에 대한 혈장 바이오마커를 탐색하려는 10년 이상의 수많은 노력에도 불구하고, 우리는 여전히 뇌척수액(CSF) 바이오마커와 비교할 만한 결과를 얻지 못했다. 본 발명에서는 카텝신 D를 AD 진단을 위한 혈장 바이오마커로 사용할 수 있다는 것을 확인하였다. 면역 블롯팅 및 ELISA에 의해, 본 발명자들은 아밀로이드 결함이 있는 AD 환자에서 혈장 카텝신 D의 수준이 감소한 것을 확인하였다. 또한, 혈장 카텝신 D의 수준은 AD 진단을 위해 일반적으로 사용되는 임상인지 표준 중 하나 인 CDR-SB 점수와 음의 상관관계가 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 혈장 카 텝신 D의 수준이 AD 진단을 위한 새로운 바이오마커로 사용할 수 있음을 시사한다.

카텝신 D 발현수준의 변화는 AD 환자의 혈액 및 CSF 샘플을 사용한 연구에서 종종 보고되었다(Uddin MS et al., Front Aging Neurosci., 10:04, 2018). 또한, 카텝신 D는 Aβ의 분해와 tau의 처리에 직접적으로 관련되어 있기 때문에 AD의 발병과 명확하게 관련되어있다. AD 바이오마커로서 카텝신 D의 가능성을 조사하기 위한 시도가 있었으나 결과들이 일치하지 않았다. 면역 블롯팅에 의해 CSF 샘플에서 리소좀 효소의 수준을 분석한 연구를 제외하고, 대부분의 연구에서 카텝신 D 수준을 평가하기 위해 ELISA 분석이 수행되었다. 본 발명에서는 이전 연구의 불일치가 여러 형태의 카텝신 D의 존재로 인한 것일 수 있다고 추측했다. 따라서, 우리는 다양한 형태의 카텝신 D의 분리를 허용하는 면역 블롯팅을 수행하였으며, 결과적으로, AD 그룹에서 크게 감소하는 단일 주요 카텝신 D 형태를 검출할 수 있었으며, ELISA 분석결과에서도 일관된 감소가 확인되었다.

이전의 연구에서는 카텝신 D의 수준이 AD 환자의 뇌 조직 및 CSF에서 상승된 것으로 나타났으며, 카텝신 D 수준의 증가가 AD 바이오마커로서 사용될 수 있다는 것을 시사하였다(Strittmatter WJ et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90:1977, 1993). 그러나, 섬유아세포 및 환자의 단핵구를 사용한 보다 최근의 연구는 AD 환자에서 카텝신 D 수준의 감소를 보고하였다(Urbanelli L et al., Neurobiol Aging. 2008;29(1):12-22, 2008; Tian Let al.J Alzheimers Dis. 42:511, 2014).

본 발명에서는 말초혈액의 혈장 내 카텝신 D 수준이 뇌의 카텝신 D 수준과 다를 수 있다는 것을 최초로 확인하였다.

본 발명에서는 통계적 예측 모델인 ROC 곡선 분석을 사용하여 혈장 카텝신 D 수준의 성능을 평가하였을 때, ApoE4 대립 유전자의 존재에 대한 유전 정보를 포함시켰을 때의 AUC는 0.652에서 0.702로 증가했으며 혈장 카텝신 D 수준을 포함하는 경우, 더욱 증가하였다 (도 6C, D; AUC = 0.795). 따라서 카텝신 D가 AUC에 긍정적인 영향을 미쳐 바이오 마커 모델의 성능을 향상시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 혈장 카텝신 D가 AD 진단을 위한 바이오 마커로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.

본 발명에서 상기 카텝신 D 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 카텝신 D에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 상기, "카텝신 D 수준 측정"이란 알츠하이머(치매)를 포함하는 본 발명의 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 진단용 마커인 카텝신 D의 수준을 확인하는 과정을 의미한다.

상기 카텝신 D의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 웨스턴 블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 단백질 칩 분석, 면역측 정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 및 LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 카텝신 D에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 카텝신 D의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J Mol Biol, 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991)"Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thyminesubstituted polyamide" Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며,앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al, Nature 355(6360):5646(1992);Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine" J Mol Med 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library" Proc Natl Acad Sci USA 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에 따른 카텝신 D의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

본 발명의 일양태에서는 진단용 키트를 이용하여 상기 알츠하이머를 진단할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트를 사용하는 경우, 정상군과 알츠하이머 환자군을 구별하여 검출 또는 진단할 수 있다. 던 췌장염 및 담도암을 췌장암과 구분하여 정확히 검출 또는 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

하기 실시예에서 분석 결과는 평균 ± SD (표준 편차)로 표시하였다. GraphPad Prism 7 또는 Microsoft Excel Office 365를 사용하여 통계 데이터를 분석하고 그래프로 나타내었다.

실시예 1: SDS-PAGE 분석을 위한 환자 혈장 시료 준비

아주대학교병원에서 대조군과 알츠하이머 환자를 모집하였으며, 모든 연구 참가자에 대하여, 아밀로이드 PET, MRI 및 임상인지 검사를 수행하여, 다음 기준에 따라 4 개의 그룹으로 분류하였다(표 1). 정상적인 아밀로이드 PET 스캔 결과를 나타내고, 백질 고강도 신호(White Matter hyperintensity, WMH) 점수가 1인 경미한 인지손상(mild cognitive impairment, MCI) 환자를 MCI 그룹으로 하였다. WMH는 한국 치매임상연구센터(CREDOS) 등급 척도를 사용하여 평가하였다. 결함이 있는 아밀로이드 PET 스캔 결과를 나타내면서, WMH 점수가 1인 환자를 AD 그룹(알츠하이머 그룹)으로 하였다. 정상 아밀로이드 PET 스캔 결과를 가지면서, WMH 점수가 2~3인 환자를 VaD(vascular dementia) 그룹으로 하였으며, 연령에 맞는 건강한 대상을 대조군으로 분류하였다. 이 연구는 아주 기관 검토위원회 (AJIRB-BMR-KSP-19-014)에 의해 승인받아 수행하였다.

MMSE:최소 정신상태시험(Mini-Mental State Examination); CDR: 임상 치매등급(Clinical Dementia Rating); CDR-SB, CDR 박스의 합(Sum of Boxes); WMH: 백질 고강도(White Matter Hyperintensities)

AD 진단을 위한 편리하고 쉬운 분석 시스템을 확립하기 위해, 면역 블롯팅 및 ELISA를 사용하여 혈장 카텝신 D 수준을 평가하였다.

혈장 카텝신 D의 정량 분석 전에, 혈장의 주요 성분인 알부민 및 면역 글로불린이 폴리아크릴아미드겔에서 샘플의 분해 및 면역 블롯팅에 의한 특정 밴드의 검출을 방해할 수 있기 때문에, 알부민과 면역글로불린을 혈장에서 제거하였다. Hi-Bind Albumin-IgG 제거 비드(Biovision)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 혈장에서 알부민과 IgG를 제거하였으며, 알부민 / IgG 제거 혈장 샘플은 겔에 로딩하였을 때 성공적으로 전개되었다.(도 1a).

실시예 2: AD 환자 혈장에서 카텝신 D의 수준 감소 확인

실시예에서 사용할 카텝신 D 항체의 특이성을 검증하기 위해, CRISPR / Cas9-매개 녹아웃 시스템을 이용하였다. 대조군 세포 및 카텝신 D- 특이적 gRNA- 형질감염된 세포로부터의 용해물을 카텝신 D에 대한 면역 블롯팅에 의해 분석하였다.

먼저, 카텝신 D의 유전자 편집을 위해, E-CRISP 프로그램 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP)에 의한 리스트 중 2개의 표적(CR1 : TCCAGGTGGACCTGCCAGTAGG:서열번호 1); CR2 : GCCTACTGGCAGGTCCACCTGG: 서열번호 2)을 선택하였다. 표적에 특이적인 gRNA를 pSpCas9 (BB)-2A-Puro(PX459)벡터(Addgene, # 48139)로 클로닝한 후, 구조물을 Avalanche-Omni 시약 (EZ Biosystems)으로 36시간 동안 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 이어서, 세포를 2㎍ g/ml의 퓨로마이신과 함께 24시간 동안배양 하였다. 추가 성장 후, 세포를 용해시키고 1X SDS 용해 완충제로 끓인 후 면역블롯팅을 수행하였다.

그 결과, 전구체, 중간체 및 성숙한 형태에 상응하는 3 개의 밴드가 대조군 세포에서 카텝신 D 항체에 의해 검출되었다(도 2a). 카텝신 D가 제거된 세포에서는 모든 밴드가 희미하게 검출되어, 항체가 내인성 수준에서 카텝신 D를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였다.

다음으로, 혈장 카텝신 D 수준을 대조군과 환자유래 샘플에서 확인하였다.

알부민 및 IgG가 제거된 혈장샘플을 2X SDS-로드 완충액과 혼합한 다음 95℃에서 10분 동안 끓였다. 면역 블럿팅은 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 트랜스퍼시킨 후, 막을 3% 탈지유를 포함하는 0.05% 트윈20 Tris 버퍼 식염수(TBST)를 사용하여 블러킹 시켰다. 블럿은 3% BSA를 포함하는 TBST로 희석된 1차 항체와 함께 반응시킨 후, TBST로 세척하고, 3 % 탈지유를 포함하는 TBST에서 horseradish peroxidase와 접합된 2차 항체와 함께 배양하였다. 1차항체로는 카텝신 D(Calbiochem) 및 β-Tubulin(abcam)에 특이적인 1차 항체를 구입하였다. 면역 반응성 단백질은 ChemiDoc 겔 이미징 시스템 (Bio-rad)으로 검출히였으며, 밴드 강도는 Image Lab 소프트웨어 (Bio-rad)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 인간 혈장 샘플에서, 카텝신 D 항체는 48 kDa에서 하나의 주요 밴드가 검출되었으며, 이는 카텝신 D의 중간체에 해당한다(도 2b). 성숙한 형태의 카텝신 D에 상응하는 밴드는 일부 샘플에서만 매우 희미하게 검출되었다. 따라서, 본 발명자들은 카텝신 D 항체에 의해 검출된 48 kDa 밴드가 혈장에 존재하는 카텝신 D의 주요 가공된 형태인 것으로 결론을 내렸고, 그룹 간의 혈장 카텝신 D 단백질 수준을 비교하기 위해 밴드의 강도를 측정하였다.

상대 혈장 카텝신 D 수준은 대조군(1.00 ± 0.64)과 비교하여 AD 그룹 (0.65 ± 0.48)에서만 감소하는 것으로 나타났다 (도 2b 및 도 2c). MCI 그룹은 대조군과 비교하여 감소된 카텝신 D 수준(0.80 ± 0.50)을 보여 주었지만, 두 그룹 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. VaD 그룹의 혈장 카텝신 D 수준은 대조군과 유사하였다. 이러한 결과는 카텝신 D의 수준이 AD 환자의 혈장에서 현저하게 감소되는 것을 나타낸다.

실시예 3: 혈장 카텝신 D의 수준과 AD의 임상적 특성과의 관련성 확인

혈장 카텝신 D 수준과 AD와 잠재적으로 관련된 임상 특성 사이의 관계를 확인하였다. 나이는 후기 발병 AD와 밀접한 관련이 있다. 이전 연구에 따르면 노인의 혈청 카텝신 D 수치가 상대적으로 감소하는 것으로 보고되었다[Zhong Y et al., Aging Clin Exp Res. 28:641, 2016). 그러나, 혈장 카텝신 D 수준은 혼합된 그룹을 대상으로 한 실험 결과, 연령과는 특별한 상관관계가 없었다 (도 3a 및 표 1). 또한, 대상자의 교육 기간과도 상관관계가 없는 것으로 나타났다 (도 3b 및 표 1).

아포리포 단백질 E (APOE)의 ε4 대립유전자는 많은 연구에서 AD에 대해 가장 잘 확립된 유전적 위험 인자이다. 가족성 AD의 약 80%와 산발적 AD 후기 발병 사례의 64%는 적어도 하나의 APOE4를 가진다(Corder EH et al., Science. 261:921, 1993). APOE4 운반체의 혈장 카텝신 D 수준(0.76±0.65)은 비 APOE4 운반체보다 낮았다(도 3c).

또한 본 실시예에서는 VaD 그룹 결정을 위한 인자로 사용된 혈장 카텝신 D 수준과 백질고강도 WMH) 점수 사이의 관계를 조사하였다. 혈장 카텝신 D 수준은 WMH = 2 인 그룹에서 유의하게 증가했지만(1.98 ± 1.57), WMH = 3 인 그룹에서는 증가가 지속적으로 확인되지 않았다(0.84 ± 0.79) (도 3d). 따라서, 혈장 카텝신 D의 수준은 백질 결함과 상관관계가 있다는 결론을 내릴 수 없었다.

실시예 4: 혈장 카텝신 D의 수준과 CDR-SB 점수와의 관계

치매 환자의 전형적인 증상인 인지장애가 AD 진단의 표준으로 널리 사용되어 왔기 때문에 인지능력과 혈장 카텝신 D 수준의 상관관계를 조사하였다.

그 결과, MMSE 점수와 혈장 카텝신 D 수준 사이에 상관관계가 없는 것을 확인하였다(도 4a, 표 1). 혈장 카텝신 D의 평균수준은 CDR (임상 치매 등급) 점수가 증가함에 따라 감소하는 경향이 있었지만, 감소는 각 그룹에서 제한된 수의 대상으로 인해 통계적으로 유의하지 않았다(도 4b). CDR은 6 개 영역에서 인지 및 기능적 성능의 평가에 기초하여 0에서 3까지의 종합 점수이지만 CDR-SB (CDR Sum of Box)는 6 개 영역 각각의 총합이다. 따라서 CDR-SB는 치매의 중증도를 정확하게 단계화하는 도구로 사용된다. 흥미롭게도, 혈장 카텝신 D의 수준은 CDR-SB 점수와 음의 상관관계가 있었다(도 4c, r = -0.232, p = 0.043). 이러한 결과는 혈장 카텝신 D의 수준이 인지 능력과 부분적으로 관련되어 있음을 나타낸다.

실시예 5: ELISA 분석을 통한 AD 환자의 혈장 카텝신 D의 감소 확인

AD 그룹에서 혈장 카텝신 D 감소를 면역 블롯팅보다 일반적이고 편리한 방법인 ELISA 방법으로 측정하였다.

카텝신 D용 ELISA 분석 키트(Wuhan USCN Business Co., Ltd., SEB280Hu)를 이용하여, 제조사의 지침에 따라 분석을 수행하였다. 간략하게, 혈장 샘플을 DPBS로 1/5로 희석하고 표준용액을 연속희석에 의해 제조하였다. 샘플 및 표준용액을 1 시간 동안 항체-코팅된 웰과 함께 반응시켰다. 용액을 버린 후, 웰을 검출시약 A와 함께 1시간 동안 배양하고, 3회 세척하고, 검출시약 B와 함께 30분 동안 배양하고, 5 회 세척하였다. 최종적으로, 청색이 충분히 나타날 때까지 기질 용액을 각 웰에 적용하였다. 이어서 정지용액을 첨가하여 반응을 정지시키고 플레이트 판독기 (Synergy H1, BioTek)를 사용하여 450nm의 파장에서 플레이트를 즉시 판독하였다.

그 결과, AD 그룹(1836 ± 1744 pg / mL)이 대조군 (4219 ± 3011 pg/mL)보다 혈장 카텝신 D 수준이 유의하게 낮음을 보여 주었다 (도 5). MCI 그룹(2748 ± 3427 pg/mL) 및 VaD 그룹(3098 ± 1698 pg/mL)은 대조군보다 더 낮은 카텝신 D 수준을 나타내었으나, 통계적으로 유의하지는 않았다.

요약하면, AD 환자 혈장에서의 카텝신 D의 수준이 면역 블롯팅 및 ELISA의 결과에 기초한 대조군 대상의 수준보다 유의하게 낮음을 확인하였다. 또한, 혈장 카텝신 D의 수준은 인지능력 감소와 관련이 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 혈장 카텝신 D가 AD 진단에 대한 바이오 마커로 개발 될 수 있는 것을 의미한다.

실시예 6: 다변량 ROC 곡선 분석을 이용한 AD에 대한 바이오마커로서 혈장 카텝신 D의 검증

마지막으로 통계적 예측 모델인 ROC 곡선 분석을 사용하여 혈장 카텝신 D 수준의 성능을 평가하였다. ROC 곡선은 특이성의 함수로서 감도를 나타내고 곡선 아래 영역 (AUC)은 두 그룹을 구별할 모델의 정확도를 나타낸다.

AD 진단을 위한 혈장 카텝신 D 수준의 성능을 평가하기 위해 로지스틱 회귀 분석과 ROC 곡선 분석을 수행하였다.

먼저, 분석대상을 하기 두 그룹으로 다시 그룹화하였다(도 6A).

1) 대조군, MCI 및 VaD를 포함한 비 AD 그룹;

2) 다변량 모델링을위한 AD 그룹.

상기 두 그룹을 사용하여 먼저 ROC 곡선을 플로팅하고 연령 및 성별과 같은 공변량으로 AUC(area under the curve)를 계산하였다(도 6B, D; AUC = 0.652). ROC 곡선 분석에서 AUC는 ELISA 결과의 혈장 카텝신 D 수준을 추가한 커브에서 더 높았다(도 6B, D; AUC = 0.780). ApoE4 대립 유전자의 존재에 대한 유전 정보를 포함시켰을 때의 AUC는 0.652에서 0.702로 증가했으며 혈장 카텝신 D 수준을 포함하는 경우, 더욱 증가하였다 (도 6C, D; AUC = 0.795). 따라서 AUC 해석 기준 (0.9-1.0 = 우수, 0.8-0.9 = 매우 좋음, 0.7-0.8 = 양호, 0.6-0.7 = 충분, 0.5-0.6 = 나쁨, <0.5 = 유용하지 않음)에 따라 카텝신 D가 AUC에 긍정적인 영향을 미쳐 바이오 마커 모델의 성능을 향상시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 혈장 카텝신 D가 AD 진단을 위한 바이오 마커로 사용될 수 있음을 시사한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 균등물에 의해 정의된다.

<110> Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Diagnosis of Alzheimer's disease Using Plasma <130> P19-B214 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target CR1 <400> 1 tccaggtgga cctgccagta gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target CR2 <400> 2 gcctactggc aggtccacct gg 22

Claims (4)

1. 다음 단계를 포함하는 알츠하이머의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법;
   (a) 환자의 말초혈액에서 알부민 및 IgG가 제거된 혈장에서 카텝신 D 또는 카텝신 D의 중간체의 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 측정된 카텝신 D 또는 카텝신 D의 중간체의 수준이 정상대조군의 수준보다 낮은 경우 알츠하이머로 진단하기 위한 정보를 제공하는 단계.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, (b) 단계의 카텝신 D 또는 카텝신 D의 중간체의 수준 측정은 면역 블럿팅 또는 ELISA 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머의 진단은 혈관성 치매와 알츠하이머 병을 구별하는 진단인 것을 특징으로 하는 방법.
   

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