KR20090054520A - 헤모글로빈-알파 서브유닛을 바이오 마커로 이용한 뇌졸중진단방법 - Google Patents

헤모글로빈-알파 서브유닛을 바이오 마커로 이용한 뇌졸중진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤모글로빈-알파 서브유닛을 바이오 마커로 이용한 뇌졸중의 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 혈청에 포함된 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량을 SELDI-TOF 분석 및 웨스턴 블랏을 통해 측정함으로써 뇌졸중을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 헤모글로빈 알파 서브유닛의 혈청 내 농도를 결정함으로써 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
Figure P1020070121219
헤모글로빈 알파 서브유닛, 뇌졸중 진단 마커, SELDI-TOF-MS

Description

헤모글로빈-알파 서브유닛을 바이오 마커로 이용한 뇌졸중 진단방법{Method for diagnosis of stroke using hemoglobin-alpha subunit as bio-marker}
본 발명은 헤모글로빈-알파 서브유닛을 바이오 마커로 이용한 뇌졸중의 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈청에 포함된 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량을 SELDI-TOF 분석 및 웨스턴 블랏을 통해 측정함으로써 뇌졸중을 진단하는 방법에 관한 것이다.
뇌졸중은 700,000여 명의 환자들이 새롭게 뇌졸중에 걸리거나 또는 재발함으로써 고통받는 일반적이고 중대한 질병이다. 2003년 미국에서 뇌졸중-관련 질병에 의해 158,000여 명이 사망하였다. 미국에서는 뇌졸중은 540만여 명에게서 널리 발견된다. 이 중, 88%는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)이고 9%는 뇌내출혈(Intracerebral Hemorrhage)이며 3%는 지주막하출혈(subarachnoid hemorrhage)이다.
현재 뇌졸중의 진단방법은 뇌의 CT(computerized tomography; 컴퓨터단층촬영)와 MRI(magnetic resonance imaging)를 포함하는 과거력(historical data), 신 경학적 검진(Neurologic examination) 및 신경조영술(neuroimaging)에 의존하고 있다. 상기 방법들은 다소의 제한 점이 있다. 즉, 첫째로 상기 방법들은 뇌졸중 발생 후 특히 처음 한 시간 안에 수행되어야 하며, 두 번째로 상기 방법들은 비용이 높고 오직 전문 병원에서만 가능하다. 최근에 급성 심근 경색증(Acute Myocardial Infarction)의 바이오 마커를 발굴하기 위한 많은 연구들이 많이 진행되고 있다. 예를 들면, 뇌졸중의 신경세포성 마커로서 tau, NSE(neuron-specific enolase) 및 B-형 신경영양 성장 인자(B-type neurotrophic growth factor)가 보고되었고, 뇌졸중의 신경교세포 마커로서 성상 아교 세포 단백질(astroglial protein) S-100b 및 신경교원섬유 산단백(glial fibrillary acidic protein; GFAP)이 기술되었다. 또한, 뇌졸중 진단용 대리 마커로서 C-반응성 단백질(C-reactive protein), 아밀로이드 A(amyloid A), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), 혈관 및 세포간 세포 부착 분자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 및 인터루킨(인터루킨-1, -6 및 -8)과 같은 염증 매개자들이 연구되었다.
이에 본 발명자들은 SELDI-TOF 검사를 이용하여 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자 및 정상인(대조군)의 혈청에서 차별적인 발현량을 보이는 단백질을 선별하여 상기 단백질이 뇌졸중 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중을 진단할 수 있는 뇌졸중 진단 마커를 동정하고, 상기 뇌졸중 진단 마커를 이용하여 뇌졸중을 초기에 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헤모글로빈 알파 서브유닛으로 이루어진 뇌졸중 진단 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 헤모글로빈 알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 뇌졸중 진단 마커 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뇌졸중 진단 마커 검출용 진단 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중의 전조 증상을 보이는 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 발현량과 정상인에게서의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량을 비교하여 정상인 보다 높은 발현량을 보이는 개체를 확인하는 단계를 포함하는 뇌졸중 진단 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 헤모글로빈 알파 서브유닛으로 이루어진 뇌졸중 진단 마커를 제공한다.
헤모글로빈-알파 서브유닛은 정상인에 비해 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자에게서 그 발현량이 현저히 증가하므로, 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 진단용 마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 SELDI-TOF를 이용하여 표 1에서 그 특징이 제시된 정상인과 상기 뇌졸중 환자의 혈청 내에서의 단백질의 양을 비교한 결과, 뇌졸중 환자에게서 상대적으로 과발현되는 24 종의 단백질을 확인하였고(도 1 및 표 2 참조), 그 중 분자량 15.1 kDa에 해당하는 단백질/펩티드가 뇌졸중 환자에게서 정상인보다 더 높은 발현량을 나타내었다(도 2 참조). 상기 15.1 kDa의 단백질/펩티드는 이전에 헤모글로빈 알파 서브유닛으로 밝혀진 바 있다(Woong-Shick A et al ., Cancer Sci 96:197-201, 2005). 또한, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서 상기 헤모글로빈-알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏의 방법으로 정상인과 여러 증상의 환자들의 혈청 내에서의 단백질의 양을 비교한 결과, 뇌졸중 환자에게서 상대적으로 과발현되는 것을 확인하였고(도 3 참조), 주동맥 죽상경화증 환자에게서는 그 발현량이 적었으나, 뇌내출혈 환자에게서는 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 고혈압, 당뇨성 고지혈증 및 비만이 없는 정상인, 동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자, BMI 25 이상의 비만환자, 고지혈증 환자, 고지혈증 및 비만 환자들 에게서의 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량을 비교한 결과, 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자에게서 그 발현량이 가장 높은 것을 확인하였다(도 5 참조). 아울러, 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 발병 후 기간별로 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량을 확인한 결과, 발병 후 시간이 지난 후에도 그 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(도 6 및 표 3 참조). 즉, 상기 헤모글로빈-알파 서브유닛이 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자의 혈청 내에서 특이적으로 과발현되는 것을 확인하였고, 뇌졸중 진단용 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 헤모글로빈 알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 뇌졸중 진단 마커 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 포함한다. 또한, 완전한 분자뿐만 아니라 에피토프와 결합할 수 있는 단편, 예를 들면 Fab, F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다.
다클론 항체는 헤모글로빈 알파 서브유닛을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.
단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이에 한정되는 것은 아 니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al ., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).
또한 헤모글로빈 알파 서브유닛에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작제하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al ., Science 254: 1275-1281, 1989).
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뇌졸중 진단 마커 검출용 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트에는 추가로 면역학적 분석에 사용되는 도구 및 시약이 포함될 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중의 전조 증상을 보이는 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 발현량과 정상인에게서의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량 을 비교하여 정상인 보다 높은 발현량을 보이는 개체를 확인하는 단계를 포함하는 뇌졸중 진단 방법을 제공한다.
단계 1)의 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 더욱 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
단계 2)의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량의 측정은 SELDI-TOF를 이용하여 측정하는 방법, 2-D 젤 전기영동법에 의해 측정하는 방법, LC-MS를 이용하여 측정하는 방법, 헤모글로빈-알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정하는 방법 등이 있을 수 있다. 상기 헤모글로빈-알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정하는 방법에는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법 등이 있을 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SELDI-TOF 방법을 이용하여 혈청 내의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량의 변화를 측정하였고(도 1, 도 2, 도 4, 도 5 및 표 2 참조), 웨스턴 블랏 방법에 의해 헤모글로빈-알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 간접적으로 발현량의 변화를 검증하였다(도 3, 도 4 및 표 3 참조).
본 발명의 방법에 따라 헤모글로빈 알파 서브유닛의 혈청 내 농도를 결정함으로써 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> SELDI - TOF 를 이용한 혈청 내의 단백질 발현량 분석
<1-1> 혈청 시료의 준비
소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자(N=34) 및 고혈압, 당뇨성 고지혈증 및 비만이 없는 정상인(N=64)을 모집하여 상기 환자들 및 정상인으로부터 혈액을 제공받았다. 상기 혈액을 2,000 rpm으로 10분간 원심분리함으로써 혈청을 수득하였다. 상기 환자들 및 정상인들의 일반적 특성을 조사하였고, 그 결과는 표 1에 나타난 바와 같다.
모집한 환자들 및 정상인들의 일반적 특성
정상인(N=64) 환자(N=34) p value
성별(남/여) 29/35 18/16 0.528
나이 61.52 ±(5.78) 63.88 ±(11.55) 0.268
체중(kg) 57.94 ±6.19 62.84 ±10.60 0.017
BMI(kg/m2) 22.36 ±1.59 23.94 ±3.48 0.051
허리둔부 둘레비 0.856 ±0.048 0.952 ±0.081 < 0.001
백혈구 5.36 ±1.41 7.80 ±2.26 < 0.001
적혈구 4.40 ±0.35 4.55 ±0.51 0.120
헤모글로빈 13.44 ±1.18 14.00 ±1.54 0.045
헤마토크리트 38.86 ±3.36 41.75 ±4.41 < 0.001
혈소판 235.27 ±49.53 272.79 ±58.57 0.001
AST 28.09 ±13.84 25.59 ±20.43 0.474
ALT 26.50 ±17.85 25.71 ±23.90 0.853
총콜레스테롤 187.63 ±29.46 183.71 ±44.63 0.603
트리글리세라이트 114.44 ±40.15 158.91 ±111.15 0.030
HDL-콜레스테롤 51.69 ±10.74 35.03 ±8.59 < 0.001
<1-2> SELDI-TOF
뇌졸중 진단 바이오 마커를 발굴하기 위하여, 실시예 1-1의 방법으로 수득한 환자 및 정상인 각각의 혈청 10 ㎕를 U8 완충액(8M 우레아/1% CHAPS)으로 희석하였다. 이 후, 결합 완충용액[binding buffer: 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 50 mM Tris-Cl 완충용액(pH 9.0)]으로 10배 희석하여 200 ㎕를 약 강이온-교환 칩(strong anion-exchange, Q10 어레이; Ciphergen Biosystmes, USA) 표면에 집적하였다. 상기 칩을 습기가 주어진 상태에서 30분 동안 반응시킨 후 결합 완충용액으로 2 회, 3차 증류수로 2 회 세척 후 공기 중에서 완전히 건조시켰다. 건조된 칩의 표면에 1 ㎕의 포화 에너지 흡수 물질[energy absorbing material, 3,5-디메톡시-4-하이드록시신남산(sinapinic acid)]을 처리한 후 건조하여 시페젠 단백질칩 판독기(Ciphergen PreteinChip reader; Ciphergen Biosystems, USA)로 읽고 CiphergenExpress 소프트웨어(version 3.1, Ciphergen Biosystems, USA)로 분석하였다.
질량 피크의 선택 및 스펙트럼의 비교는 바이오마커 위저드(Biomarker Wizard, Ciphergen Biosystem, USA)를 이용하였고, 이때 0.3% 범위 내의 질량 차이는 동일한 피크로 인식하였다. SNR(Signal to Noise Ratio)<5.0의 피크들(대략 50%)은 정성분석 의해 제거되었다. Wilcoxon signed-rank 테스트를 통해 일치하는 쌍들을 비교 분석하였다.
상기 과정을 통하여 뇌졸중 환자에게서 유의하게 발현량의 증가(p<0.05)를 보이는 24개의 단백질을 확인하였다(표 2 및 도 1).
뇌졸중 환자에게서 발현량이 증가한 단백질
번호 M/Z 정상인(N=64) 환자(N=34) 증가비 p value
1 M1009_72 0.866 ±2.543 9.434 ±9.456 10.899 <0.001
2 M1229_53 0.202 ±1.040 5.433 ±7.353 26.834 <0.001
3 M5083_78 0.544 ±1.346 11.455 ±9.545 21.054 <0.001
4 M6040_90 0.891 ±1.484 14.514 ±12.518 16.286 <0.001
5 M7475_11 3.894 ±2.673 71.535 ±28.212 18.369 <0.001
6 M7576_62 1.378 ±1.048 27.722 ±19.480 20.124 <0.001
7 M7845_71 5.334 ±3.008 80.578 ±24.759 15.107 <0.001
8 M7910_93 1.355 ±1.005 34.877 ±24.706 25.731 <0.001
9 M7944_81 1.877 ±1.161 46.265 ±25.277 24.643 <0.001
10 M7993_49 0.928 ±1.078 19.899 ±15.870 21.443 <0.001
11 M12571_4 0.368 ±0.379 4.904 ±3.345 13.307 <0.001
12 M14996 _0 5.720 ±1.978 81.020 ±31.251 14.164 <0.001
13 M15151_1 1.702 ±0.464 23.811 ±17.707 13.990 <0.001
14 M15198_4 1.988 ±0.568 35.036 ±24.062 17.624 <0.001
15 M15365_2 1.044 ±0.414 12.477 ±9.941 11.954 <0.001
16 M15415_2 0.809 ±0.340 12.079 ±9.349 14.933 <0.001
17 M15736_9 4.758 ±2.324 89.119 ±28.666 18.730 <0.001
18 M15849_1 1.396 ±0.663 51.682 ±32.399 37.026 <0.001
19 M15901_3 1.399 ±0.598 53.371 ±31.403 38.151 <0.001
20 M15930_8 1.628 ±0.820 57.080 ±31.392 35.070 <0.001
21 M16036_7 0.645 ±0.358 28.861 ±19.296 44.741 <0.001
22 M16355_2 1.073 ±0.610 24.311 ±12.690 22.659 <0.001
23 M16416_6 0.526 ±0.391 16.415 ±10.437 31.205 <0.001
24 M31627_9 0.465 ±0.232 5.511 ±7.634 11.845 0.001
< 실시예 2> 증상별 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량
<2-1> 혈청 시료의 준비
소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자(N=4), 고혈압, 당뇨성 고지혈증 및 비만이 없는 정상인(N=4), 주동맥 죽상경화증 환자(N=2) 및 뇌내출혈 환자(N=2)의 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량 변화를 확인하기 위하여, 상기 환자들 및 정상인으로부터 혈액을 제공받았다. 상기 혈액을 2,000 rpm으로 10분간 원심분리함으로써 혈청을 수득하였다.
<2-2> 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량
실시예 1-2의 방법으로 SELDI-TOF 분석한 결과, 분자량 15.1 kDa의 단백질/펩티드가 뇌졸중 환자에게서 정상인보다 더 높은 발현량을 나타내었다(도 2). 상기 15.1 kDa의 단백질/펩티드는 이전에 헤모글로빈 알파 서브유닛으로 밝혀진 바 있다(Woong-Shick A et al ., Cancer Sci 96:197-201, 2005).
이에, 여러 질환의 증상별 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량을 비교하기 위해 실시예 2-1의 방법으로 수득한 혈청을 대상으로 헤모글로빈 알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(H-80, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
우선 실시예 2-1의 방법으로 수득한 혈청을 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액을 5×SDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였고, 상기 단백질을 20V, 400A이하의 조건으로 1시간 동안 전기영동 하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에 1차 항체[래빗 항-헤모글로빈 알파 서브유닛 항체(H-80, Santa Cruz Biotechnology, USA)] 및 2차 항체(항토끼-IgG-HRP; Amersham Bioscience, UK)를 순차적으로 결합시킨 후, ECL 검출 키트(Amersham Biosciences, UK)로 발광반응을 유발하고 Hyperfilm-MP(Amersham Biosciences, UK)에 노출시켜 결합 반응을 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자에게서 정상인에 비해 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이 주동맥 죽상경화증 환자에게서는 그 발현량이 적었으나, 뇌내출혈 환자에게서는 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.
<실시예 3> 뇌경색 및 타질병에서의 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량
<3-1> 혈청 시료의 준비
혈소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자(N=34) 및 고혈압, 당뇨성 고지혈증 및 비만이 없는 정상인(N=64), 비만환자(N=22), 고지혈증 환자(N=24) 및 과체중과 고지혈증이 있는 환자(N=22)를 모집하여 상기 환자들 및 정상인으로부터 혈액을 제공받았다. 비만환자는 BMI 25 이상인 사람을 대상으로 하였으며, 고지혈증 환자는 동맥지질 경화학회의 고지혈증 기준에 따라 혈중 전체 콜레스테롤 240 ㎎/dL 이상 또는 혈중 중성지방(triglyceride) 200 ㎎/dL 이상인 사람을 고지혈증 환자로 규정하였다. 상기 혈액을 2,000 rpm으로 10분간 원심분리함으로써 혈청을 수득하였다.
<3-2> 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량
실시예 3-1의 방법으로 수득한 혈청을 대상으로 실시예 1-2에서 사용한 SELDI-TOF 방법으로 혈청 단백질을 분석하였으며, 분자량 15.1 kDa의 헤모글로빈 알파 서브유닛의 질환별 발현량을 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자에게서 정상인에 비해 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 반면에 비만 및 고지혈증이 있는 환자에게서의 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량은 정상인과 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다.
< 실시예 4> 기간별 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량
<4-1> 혈청 시료의 준비
실시예 1에서 분석한 정상인 및 환자들을 제외한 고혈압, 당뇨성 고지혈증 및 비만이 없는 정상인(N=52) 및 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자들 중 발병 1주일 이내(N=53), 1 내지 2주일(N=15), 2 내지 4주일(N=12) 및 4주 경과(N=9)의 환자들을 추가 모집하여 상기 환자들 및 정상인으로부터 혈액을 제공받았다. 상기 혈액을 2,000 rpm으로 10분간 원심분리함으로써 혈청을 수득하였다.
<4-2> 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량
실시예 4-1의 방법으로 수득한 혈청을 대상으로 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량을 실시예 1-2와 동일한 SELDI-TOF 방법을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 6 및 표 3에 나타난 바와 같이 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자에게서 정상인에 비해 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량이 많았으며, 발병 후 시간이 지날수록 발현량이 조금씩 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
기간별 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량
기간 개체수 M14995_3 표준편차 에러 p value
정상인 52 12.11571 3.884434 0.538674 -
1주 이내 53 34.66434 23.29188 3.199386 3.20E-09
1 내지 2주 15 33.65555 19.4907 5.032476 0.000761
2 내지 4주 12 25.28552 13.36422 3.857919 0.005822
4주 경과 9 26.69458 15.05806 5.019353 0.019783
도 1은 정상인 및 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자의 혈청의 SELDI-TOF 결과를 나타낸 도이다(X 축: 각 피크들의 정규질량(normalized mass; m/z), Y 축: 세기, 빨간색 막대: 정상인, 파란색 막대: 환자).
도 2는 정상인 및 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자의 혈청 단백질 중 10 내지 20 kDa의 단백질/펩티드의 SELDI-TOF 결과를 나타낸 도이다(X 축: 각 피크들의 정규질량(normalized mass; m/z), Y 축: 세기, 빨간색 막대: 정상인, 파란색 막대: 환자).
도 3은 정상인 및 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자에게서의 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 고혈압, 당뇨성 고지혈증 및 비만이 없는 정상인, 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자, 주동맥 죽상경화증 환자 및 뇌내출혈 환자에게서의 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 고혈압, 당뇨성 고지혈증 및 비만이 없는 정상인, 동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자, 당뇨성 고지혈증 환자, 고지혈증 환 및 당뇨/고지혈증 환자들에게서의 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 발병 기간별 헤모글로빈 알파 서브유닛의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 도이다.

Claims (10)

  1. 헤모글로빈 알파 서브유닛으로 이루어진 뇌졸중 진단 마커.
  2. 제 1항에 있어서, 헤모글로빈-알파 서브유닛은 정상인에 비해 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중 환자에게서 그 발현량이 현저히 증가하는 것을 특징으로 하는 진단 마커.
  3. 헤모글로빈 알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 뇌졸중 진단 마커 검출용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3항의 조성물을 포함하는 뇌졸중 진단 마커 검출용 진단 키트.
  6. 1) 소동맥 폐색증을 동반하는 뇌졸중의 전조 증상을 보이는 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량을 측정하는 단계;
    2) 단계 1)의 발현량과 정상인에게서의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량을 비교하여 정상인 보다 높은 발현량을 보이는 개체를 확인하는 단계를 포함하는 뇌졸중 진단 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 개체는 척추동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 개체는 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 단계 2)의 헤모글로빈-알파 서브유닛의 발현량의 측정은 ELDI-TOF를 이용하여 측정하는 방법, 2-D 젤 전기영동법에 의해 측정하는 방법, LC-MS를 이용하여 측정하는 방법 및 헤모글로빈-알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정하는 방법 중의 어느 하나에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 헤모글로빈-알파 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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