JP5281397B2 - 脳損傷関連障害の診断法 - Google Patents
脳損傷関連障害の診断法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5281397B2 JP5281397B2 JP2008520966A JP2008520966A JP5281397B2 JP 5281397 B2 JP5281397 B2 JP 5281397B2 JP 2008520966 A JP2008520966 A JP 2008520966A JP 2008520966 A JP2008520966 A JP 2008520966A JP 5281397 B2 JP5281397 B2 JP 5281397B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- csf
- proteins
- gstp
- protein
- stroke
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
Description
対して固有のアドレス可能な場所を有し、それによって各個々のポリペプチドまたはポリペプチドの任意の組み合わせに対する分析読み出しが可能である。
プチドマーカーは、体液サンプル中で、例えばそれに対する抗体を用いて測定される。マーカーは簡単に検出され、および/またはその濃度を測定することもある。マーカーは、ポリペプチドに対する特異抗体を用いて、抗原(ポリペプチド)/抗体の相互作用の程度を測定する免疫測定によって測定することが好ましい。抗体はモノクローナル抗体もしくは改変(キメラ)抗体である可能性がある。ポリペプチドに対する抗体は既知であり市販されている。また、抗体産生には通常のKohler-Milstein法が用いられる。より好ましくはないが、抗体はポリクローナル抗体であってもよい。本発明との関連において、用語“抗体”は、一本鎖もしくはFab断片などの抗体の結合断片も含む。
は4-ヨードフェノールもしくは4-ヒドロキシ桂皮酸である。
チドの量が有意に異なることを単に意味するのみであることを理解されたい。従って、実験サンプル中のポリペプチドの“欠如”とは、ポリペプチドが実際には存在するのに、比較実験サンプルのそれよりも有意に低い量である可能性も含む。本発明によれば、診断はポリペプチドの存在もしくは欠如に基づいて行われ、このことは、比較(もしくは対照)実験サンプルに対して有意に低い、あるいは有意に高い量のポリペプチドが存在することを含む。
<略語>
CSF:脳脊髄液、H-FABP:心臓由来脂肪酸結合タンパク質、NDKA:ヌクレオシド二リン酸キナーゼA、CJD:クロイツフェルトヤコブ病、OGE:オフゲル(off-gel)電気泳動、UFD1:ユビキチン融合分解タンパク質1、GST-P:グルタチオンS-トランスフェラーゼP、SBPs:スペクトリン分解産物。
脳脊髄液(CSF)タンパク質の一次元ゲル電気泳動(1-DE)分離、および質量分析技術
を用いて、表1に挙げた58のポリペプチドが、重度の脳障害のモデルとして用いた死亡した患者のCSFにおいて、増加あるいは減少したことがわかった。
脳損傷関連障害のマーカーを発見することを目的として、プロテオミクスに基づいた方法に20のCSFサンプルを用いた。これらのサンプルのうちの5は、中枢神経系の病変を持たない死亡患者から、死後6時間後に剖検時に採取した。他の15は、脳損傷と無関係な良性症状(非定型頭痛および特発性末梢性顔面神経麻痺)の神経学的精密検査を受けた生きている患者から、腰椎穿刺によって収集した。CSFサンプルは収集後直ちに遠心分離機にかけ、分注し、-80℃で凍結し、分析まで保存した。
ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビン、IgG、IgAおよびアンチトリプシンの免疫除去(Immunodepletion)を、Multiple Affinity Removal System (Agilent Technologies, Wilmington, USA)を用いて行った。限外ろ過(10 kDa MWCO, Vivascience)を用いて3 mlのCSFを約300μlまで濃縮した。メーカーの使用説明書に従って、免疫除去のためにCSFを200μlの一定分量に分けた。除去後の画分をあわせて、限外ろ過を用いて濃縮した。600μg/μlと900μg/μlの間の、最終的なCSFタンパク質濃度をBradford分析を用いて測定した。オフゲル(off-gel)電気泳動(OGE)のための全ての試薬と装置は、他で詳細に記載されている(Ros, A., et al., Protein purification by Off-Gel electrophoresis. Proteomics, 2002. 2(2):p. 151-6)。免疫除去したCSFサンプル750μlを、OGEの板(strip)上の全てのウェルにのせた(1ウェルあたり50μlずつ)。サンプルを合計31.6 kVhrs(100 Vで1時間、500 Vで1時間、1000 Vで1時間、2000 Vで15時間)で集束させた。電流は50μAに制限し、温度は20℃に制御した。画分(20-100μl)を各ウェルから収集し、SDS-PAGEの前に-20℃で保存した。
OGEからの画分をLaemmli'sバッファーの5倍濃縮溶液(0.125 M Tris-HCl、4% SDS、40% グリセロール、0.1% ブロモフェノールブルー、pH 6.8)と70μlになるまで混合し、95℃で5分間加熱した。サンプルを14000gの遠心分離機にかけ、上清を12.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル上にのせた。泳動はTris-Glycine-SDS pH 8.3バッファー内で行った。その後ゲルを、Blum由来のMS対応銀染色を用いて染色した(Blum, H., Beier, H. and Gross, H. J., Electrophoresis 1987, 8, 93-99)。ゲルは最初に、50%(v/v)メタノール10%(v/v)酢酸で最低30分間固定し、その後15分間5%(v/v)メタノールで固定した。その後ゲルをmilli-Q水で5分間3回洗浄し、0.2 g/L(w/v)の新鮮なチオ硫酸ナトリウム(Na2S2O3, 5H2O)内で2分間インキュベートした。ゲルをmilli-Q水でさらに30秒間3回洗浄し、染色液、すなわち2 g/Lの硝酸銀(AgNO3)溶液内で25分間インキュベートした。ゲルをmilli-Q水で1分間3回洗浄し、現像液(炭酸ナトリウムNa2CO330 g/L(w/v)、37% HCOH(v/v)を0.05%、新鮮な0.2 g/L(w/v)チオ硫酸ナトリウム(Na2S2O3, 5H2O)を2%(v/v))内で最大10分間インキュベートした。milli-Q水で洗浄する前に、14 g/l(w/v)Na2-EDTA溶液を10分間用いてゲルの現像を止めた。見かけの分子量を、2μgの広範囲分子量スタンダード(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を流すことで決定した。ゲルをAgfa Fotolook version 3.6ソフトウェアを搭載したArcus II Agfaスキャナーでスキャンした。同定すべきバンドを切り出し、Eppendorfチューブに入れて脱染した。各ゲル片を30μlの脱染液(30 mM K3FeCN6、100 mM Na2S2O3)内で、時折攪拌しながらゲルが完全に脱染されるまでインキュベートした(5-10分)。ゲル片を最低100μlのmilli-Q水で10分間2回洗浄し、その後10%エタノール(v/v)内で4℃で保存した。
ゲル片を50 mMの炭酸水素アンモニウム200μlで10分間洗浄した。その後ゲル片を100μ
lの100% CH3CNで脱水し、真空遠心分離機(HETO, Allerod, Denmark)で乾燥させた。トリプシン消化を前述のように行った(Scherl, A., Coute, Y., Deon, C., Calle, A., Kindbeiter, K., et al., Mol Biol Cell 2002, 13, 4100-9)。NanoLC-ESI-MS/MSを、LC-PALオートサンプラー(CTC Analytics, Zwingen, Switzerland)とRheos 2000 Micro HPLC
Pump(Flux Instruments, Basel, Switzerland)に連結したLCQ DecaXP イオントラップ(Thermofinnigan, San Jose, CA)で行った。各実験装置に対し、サンプル5μlを含む5%CH3CN、0.1%ギ酸を、院内で5μmのZorbax 300Extend-C18(Agilent Technologies, Wilmington USA)を充填したC18逆相カラム(75μm内径)に注入した。0.1%ギ酸の存在下で、CH3CN勾配を利用してカラムからペプチドを溶出した。ペプチドの溶出にあたっては、アセトニトリル濃度を15分で8から47%に増加させた。フロースプリッターを用いて、流速を40μl/分から約0.2μl/分に下げた。1.8 kVの電位をナノエレクトロスプレーキャピラリー(New Objective, Woburn, MA)に印加した。衝突ガスとしてヘリウムを用いた。衝突エネルギーは最大の35%に設定した。MS/MSスペクトルは、MSモードとMS/MSモードを自動的に切り替えることによって得られた。各MSスキャンから二つの最高ピークをMS/MSに選んだ。動力学的除外(Dynamic exclusion)を、繰り返し回数2回、繰り返し期間0.5分で行った。同じ前駆体においてこれら二つのMSMS収集を受けて、前駆体をMSMS分析から1.0分間除外した。スペクトルをDTAファイルに変換し、院内ソフトウェアを用いて再編成し、さらにMASCOT 1.8(http://www.matrixscience.co.uk/)を用いてデータベース検索を行った。前駆体に対して2.0 Da、断片に対して1.0 Daの許容差を選択した。計器としてESI-TRAPを選択した。種を限定せずにUniProt Swiss-Protデータベースで検索した。これらの条件において、有意性の閾値はMascotによるスコア42以上から得た。さらに、Phenyxプログラム(http://www.phenyx-ms.com/)を用いてUniProt SwissProtデータベースに対してデータを検索した。閾値以上のペプチド三種未満に該当するタンパク質を手動で認証した。データをさらにTremblデータベースで検索し、さらに22のタンパク質を同定するに至った。その結果を表1に示す。
[序論]
死亡したCSFで上方制御されたことが同定されたタンパク質の一つは、脳損傷関連障害の一例である脳血管疾患のバイオマーカーになる可能性があると評価された。脳卒中患者の調査を行い、その結果を図5から図7に示す。患者、および陰性対照患者の血漿サンプルにおいて、ユビキチン融合分解タンパク質1同族体(UFD1)のELISA強度信号を測定した。血漿サンプルは、患者が救急病院に到着後0-24時間の間、および/または72時間後に採取し、対照患者から採取したサンプルと年齢/性別を一致させた。
Wt. 9000-10,000(Aldrich, Milwaukee, WI, USA)、MOPS(3-[N-モルフォリノ]プロパンスルホン酸)(Sigma)、NaCl、MgCl2(Sigma)、ZnCl2(Aldrich)、pH 6.90、BSA 30%溶液、製造等級(Serological Proteins Inc., Kankakee, IL))に調製した50μlのビオチン標識抗体(2μg/ml)を加え、37℃で1時間インキュベートした。その後プレートをプレート洗浄機でBBSで3回洗浄した。それから50μlの抗原を加え、37℃で1時間インキュベートした。検量線を作るために、組み換えタンパク質を希釈バッファーAで100、50、25、12.5、6.25 ng/mlに希釈した。血漿サンプルを希釈バッファーAで適当な濃度に希釈した。洗浄ステップの後、50μlのアルカリホスファターゼ標識抗体を、バッファーAに適当
な希釈で加え、37℃で1時間インキュベートした。その後96-ウェルプレートをプレート洗浄機でBBSで3回洗浄し、50μlのAttophos(登録商標)AP蛍光基質(Promega, Madison, WI)を加えた。プレートを直ちにSpectraMax GEMINI-XS蛍光光度計マイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, U.S.A.)(λ励起=444
nmおよびλ放射=555 nm)上で読み取った。結果はRFUであらわされ、終点モード(一回の読取のみ)または10分間の動態モードで測定できる。動態モードでは、6フラッシュ(ウェルあたり)を用いて記録するようにプレートリーダーをセットし、その後平均にまとめた。このやり方で、各読取の間の時間間隔を最小にして各ウェルを6回分析した。この最小時間間隔は読取間の2分の遅れとなった。勾配を計算し、各ウェルの最終値を決定するために用いた。対照群と脳卒中群(虚血性プラス出血性、または虚血性vs.出血性)を区別するために最適なカットオフ値を、GraphPad Prism 4ソフトウェアで作成したROC曲線を用いて決定した。
対照患者と比較して、脳卒中患者の血漿ではUFD1が過剰発現していることが、図5から明らかである。統計分析を行い、1-特異度の関数として実験の感度を示すROC曲線(GraphPad Prism 4ソフトウェア)を描画した(図6)。脳卒中患者と対照患者とを区別する最適カットオフ値は、このROC曲線から推測した。それぞれ94.4%および77.8%の感度および特異度は、最適カットオフ値を用いて得られた。ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定によって脳卒中群と対照群とを比較した。非常に低いp値(<0.0001)が得られ、脳卒中群と対照群との差異が非常に有意であることが示唆された。
この実施例は、脳卒中患者と対照患者のUFDP1血漿レベルを示す追加データを提供する。追加データは、患者と対照の二集団、ジュネーブからの小規模な集団と、米国からのより広範囲な集団から得られた。
555 nm)上で読み取った。
本研究では、ヒト死後CSFプロテオームの特性をさらに明らかにするために、2-DEの代替法を用いた。死後CSFサンプル(n=5)のプールを、四つのステップのプロトコルを用いて分析した。(i)豊富なCSFタンパク質(アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、アンチトリプシン、ハプトグロビン)の免疫除去、(ii)オフゲル電気泳動(OGE)(24)を用いたpIによるCSFタンパク質の分画、(iii)SDS-PAGEによるOGEから得られた画分の分析、(iv)LC-MS/MSによるタンパク質の同定。死後CSFで同定された、選択されたタンパク質は、個々の死後CSFサンプルと生前CSFサンプルのWestern blotsを用いて確認した。死後CSFで同定されたタンパク質の、脳損傷のバイオマーカーとしての潜在的な関心について検討する。
材料:
全ての化学物質は、特に明記しない限り、Sigma Aldrich(St. Louis, MI, USA)から購入し、入手できる最高純度のものであった。CH3CNはBiosolve(Westford, MA, USA)から購入した。
5人の異なる患者からの死後CSFサンプルを、剖検時、平均で死後6時間後、脳室穿刺によって収集した。死亡した患者は、いずれの精神医学的疾患または神経学的疾患の病歴、症候、もしくは徴候もなかった。死因は中枢神経系または末梢神経系のいずれの機能障害とも無関係であり、脳の神経病理学的データは、関連病変のない加齢に関連した変化と一致した。対照生前CSFサンプルをWestern blot検証に用いた。このサンプルは、脳損傷と無関係な良性症状(非定型頭痛および特発性末梢性顔面神経麻痺)のために神経系の精密検査を受けた5人の生きている患者から、診断的腰椎穿刺によって収集した。登録前に、各患者または患者の親類からインフォームドコンセントを得た。非侵襲的CSFサンプルを収集後直ちに遠心分離機にかけ、分注し、-80℃で凍結し、分析まで保存した。
ジュネーブ大学病院から得た血漿サンプルは、GST-P1のレベルの評価のために用いた。地元公共団体の倫理委員会の理事会は臨床試験計画書を承認した。ジュネーブ大学病院救急室に入院している7人の継続脳卒中患者および対照患者が本実験に登録された。登録された7人の継続患者のうち、3人は神経学的疾患ではないと診断され、対照サンプルとして分
類し(男性2人と女性1人、平均年齢70.26歳)、虚血性脳卒中2人と脳内出血性脳卒中1人を含む4人は脳卒中であると診断された(男性3人と女性1人、平均年齢71.81歳)。脳卒中の診断は熟練した神経科医によって行われ、局所神経障害の突然の出現と、それに引き続いて症候と一致する病巣の脳CTまたはMRI画像における描写に基づいて行われた。対照群は癌(n=2)および胃腸障害(n=1)の患者を含んでいた。各患者に対して、症状発現後3時間の時間枠以内に、乾燥ヘパリン含有チューブの挿入時に血液サンプルを収集した。4℃、1500gで15分間の遠心分離の後、サンプルを分注し、分析まで-80℃で保存した。分析は凍結サンプルで行った。
プールした死後CSFサンプルを、10 kDa MWCO限外ろ過装置(Vivaspin UF4, Vivascience,
Germany)を用いて300μlに濃縮した。タンパク質量はおおよそ1.6 mgであった。サンプルをその後MARSバッファーA(Agilent, Palo Alto, CA, USA)に1:5に希釈し、0.22μmフィルターに通した。一定分量200μlを4.6 x 100 mm MARSカラム(Agilent)に注入した。通過画分を収集し、プールしてさらに限外ろ過を用いておおよそ1 mlに濃縮した。これらの濃縮画分を10 mM NH4HCO3で二回洗浄した。Bradford法(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いてタンパク質濃度分析を行った。
OGE分画はHeller, M., Michel, P.E., Morier, P., Crettaz, D., Wenz, C., Tissot, J.D., Reymond, F., and Rossier, J.S. (2005) Two-stage Off-Gel isoelectric focusing: protein followed by peptide fractionation and application to proteome analysis
of human plasma. Electrophoresis 26, 1174-1188にあるように行った。尿素、チオ尿素、DTTを、それぞれ終濃度7M、2M、65 mMまで加えることで、除去したCSFをOGEのために調製した。IPGストリップ(13 cm、pH 4.0-7.0)を、7M尿素、2Mチオ尿素、65 mM DTT、0.5%(v/v)両性電解質(pH 4.0-7.0)、5%グリセロールを含む溶液で再水和した。その後15ウェル装置を再水和したIPGの上に置き、50μlのサンプルを全ストリップにわたり各ウェルにのせた。いくつかのマルチウェル装置を並行して用いて、全サンプルの分画が一回の実験でできるようにした。電圧は100 V(1時間)で始め、その後500 V(1時間)、1000
V(1時間)まで増加させ、最終的には2000 Vまで増加させて15時間維持した。焦点調節は20℃で50 mAの電流制限下で行った。ウェルそれぞれから画分を回収した。
OGE画分から得られたタンパク質を、自家製の12% T Tris-Glycineゲル(8 x 5 x 0.15 cm)でSDS-PAGEによって分離した。おおよそ60μlの各画分をゲルにのせた。泳動後、ゲルをMS-対応銀染色(Blum, H., Beier, H., and Gross, H.J. (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 8, 93-99)で染色した。銀染色したゲルから切り出したバンドを、15 mMのK3Fe(CN6)、50 mMのNa2S2O3で脱染し、MilliQ水(Millipore, Billerica, MA, USA)(26)で洗った。ゲル片をその後100% CH3CNで脱水し、真空遠心分離機で乾燥させた。タンパク質は標準プロトコルを用いてゲル内消化した(Scherl, A., Coute, Y., Deon, C., Calle, A., Kindbeiter, K., Sanchez, J.C., Greco, A., Hochstrasser, D., and Diaz, J.J. (2002) Functional proteomic analysis of human nucleolus. Mol. Biol. Cell 13, 4100-4109)。1% TFA、その後50% CH3CN、0.1% TFAでペプチドを抽出した。総抽出物を真空遠心分離機で濃縮した。
ゲル内消化後に抽出したペプチドを、9μlの5% CH3CN、0.1%ギ酸に溶かし、5μlをLC-MS/MS分析に用いた。プレカラム(100μm内径、2 - 3.5 cm長)を分析カラム(75μm内径、9
- 10 cm長)に直接接続した。両カラムは院内で5μmの3Å Zorbax Extend C-18(Agilen
t)で充填した。溶媒Aにおいて4から56%の勾配の溶媒B(溶媒A:5% CH3CN、0.1%ギ酸、溶媒B:80% CH3CN、0.1 %ギ酸)を、おおよそ300 nl/minの流速で15分以上展開した。溶媒Bの濃度は、カラムの再平衡化のために初期状態に戻る前に、95%まで増加した。溶出液をLCQ DecaXPイオントラップ質量分析器(Thermo Finnigan, San Jose, CA)のnano-ESIソース内に、1.8 - 2.2 kVのスプレー電圧で直接噴霧した。データ依存収集(data dependent
acquisition)を用いて、各MSスペクトルからMS/MSのための二つの前駆体を自動的に選択した(m/z 範囲400-1600)。MS/MSスペクトルは、35%の正規化衝突エネルギー、0.25のQ値(activation Q)、4 m/zの分離幅で取得した。活性化時間は30ミリ秒とした。繰り返し回数2回、排除時間30秒、排除ピーク幅±1.5 Daで動的排除(dynamic exclusion)を実行した。広帯域活性化(Wideband activation)も実行した。MS取得およびMS/MS取得に対しそれぞれ50ミリ秒と200ミリ秒の最大導入時間を用いた。さらに対応する自動ゲインコントロール対象(automatic gain control targets)を108に設定した。
Bioworks 3.1ソフトウェア(Thermo Finnigan, San Jose, CA)を用いてピークリストを作成した。各分析から得られたデータファイルは、自動的に一つのテキストファイルにまとめられた。得られたピークリストを、ローカルサーバ上で作動するMascot(version 1.8, Matrix Sciences, U.K.)とPhenyx Virtual Desktop(Gene Bio, Switzerland)を用いて、UniProt/Swiss-Protデータベースに対し種制限無しで検索した。Mascotは、前駆体の質量誤差は2.0 Da、およびペプチドの質量誤差は1.0 Daとして、平均質量を選択するのに用いた。切断ミスの可能性が1であるトリプシンを酵素として選択した。機器の種類としてESIイオントラップを選択し、可変修飾(variable modification)として酸化メチオニンを選択した。Phenyxにおいては、機器の種類としてイオントラップを選択し、アルゴリズムはLCQを選択した。2ラウンドの検索を行い、両方とも酵素としてトリプシンを選択し、可変修飾として酸化メチオニンを選択した。最初のラウンドでは、1つの切断ミスを許容し、標準切断モードを用いた。このラウンドは“ターボ”検索モードで選択した。二番目のラウンドでは、2つの切断ミスを許容し、切断モードは半切断(half-cleaved)に設定した。両方の検索ラウンドにおいて、許容する最小ペプチド長は6アミノ酸で、親イオンの許容値は2.0 Daとした。許容基準は二番目の検索ラウンドにおいてわずかに低くなった(ラウンド1:ACスコア7.0、ペプチドZスコア7.0、ペプチドp値1E-6、ラウンド2:ACスコア7.0、ペプチドZスコア6.0、ペプチドp値1E-5)。MascotとPhenyxの両方から、3以上の高得点のペプチドを持つヒトタンパク質と同定されたタンパク質を、正確に一致したものとして認めた。“高得点のペプチド”は、Mascot検索の閾値以上(このスコア以上の各ペプチドに対し誤合致の可能性5%)、ならびにLCQ採点アルゴリズムを用いたPhenyx検索でペプチドスコア8.5以上であるペプチドに一致した。一致したペプチドが3より少ないものは手動で認証した。一致したペプチドが1のものは、それが両プログラムからの結果において高得点のペプチドである場合、ならびに、データがペプチドの配列にうまく一致すると認められた場合にのみ、含むこととした。
ピークリストも、Phenyx Virtual Desktop(Gene Bio, Switzerland)を用いて、UniProt併用Swiss-ProtとTrEMBLデータベースに対して、ヒトの登録データに制限して検索した。許容基準はSwiss Protデータベースのみの検索よりも厳しくなった(ラウンド1:ACスコア16.0、ペプチドZスコア8.0、ペプチドp値1E-7、ラウンド2:ACスコア10.0、ペプチドZスコア7.0、ペプチドp値1E-6)。
体積30μlの未処理のCSFもしくは除去したCSFを、120μlの再水和溶液に混合した。最終溶液は8Mの尿素、4%(w/v)のCHAPS、65 mMのDTT、2%(v/v)のResolytes 3.5-10、および微量のブロモフェノールブルーを含むものとした。おおよそ6μgのタンパク質に相当する全サンプルを、市販の7 cm非線形pH 3-10 IPGストリップ(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)の再水和に用いた。IEFを実行した。二次元目の分離は院内で作製したSDS-PAGEゲ
ル(9 x 8 x 0.15 cm、12% T、2.6% C)上で行った。その後ゲルをアンモニア銀で染色した。
死後CSFサンプルと生前CSFサンプル(20μl)を、自家製12% T Tris-Glycineゲル(8 x 7
x 0.1 cm)にのせた。次の陽性対照を用いた。100 ngの組み換えカルシフォシン(Scientific Proteins, Switzerland)、100 ngの組み換えユビキチン融合分解タンパク質1(UFD1)(Biosite, San Diego, CA, USA)、14-3-3タンパク質アイソフォームベータのための1μlのU373細胞株抽出物、およびグルタチオンS-トランスフェラーゼP(GST-P)のための5μlのHeLa細胞株抽出物。SDS-PAGEによって分離されたタンパク質を、Towbin et al.によって記載されているように(Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354)、PVDF膜上に電気ブロットした。膜をAmido-Blackで染色し、水で脱染して乾燥させた。特異抗体とBM Chemiluminescence Western Blotting Kit(Roche, Basel, Switzerland)を用いて免疫検出を行った。次の抗体を用いた。1/1000希釈した抗ヒトカルシフォシンウサギポリクローナル抗体(Scientific Proteins, Witterswil, Switzerland)、1/1000希釈した抗ヒトUFD1マウスOmniclonal(登録商標)抗体(Biosite, San Diego, CA, USA)、1/500希釈した抗ヒト14-3-3βウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)、1/1000希釈した抗ヒトGST-Pマウスモノクローナル抗体(Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA)。
死後CSFおよび生前CSFプールから得られたOGE画分5μlを、自家製の12% T Tris-Glycineゲル(8 x 7 x 0.1 cm)上にのせた。未処理の死後CSFおよび生前CSFプール5μlを、それぞれ陽性対照と陰性対照として用いた。1-DEで分離されたタンパク質を、Towbin et al.(30)によって記載されているようにPVDF膜状に電気ブロットした。膜をAmido-Blackで染色し、水で脱染して乾燥させた。1/500希釈した抗ヒト14-3-3ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)とBM Chemiluminescence Western Blotting Kit(Roche, Basel, Switzerland)を用いて免疫検出を行った。
GST-P1の検出に利用可能な市販のキットが無いため、自家製のELISA試験を開発した。熟練した検査技師が分析を実行し(非盲検法で)、係数変動は15%未満であった。96-ウェルReacti-Bind(商標)NeutrAvidin(商標)coated Black Plates(Pierce, Rockford, IL)を用いてサンドイッチELISAを行った。プレートを最初に、NOVAPATH(商標)洗浄機(Bio-Rad, Hercules, CA)上でpH 8.4のホウ酸緩衝食塩水(BBS)(100 mMのH3BO3、25 mMのNa2B4O7(Sigma, St Louis, MO, USA)、75 mMのNaCl(Merck, Darmastadt, Germany))ですすいだ。その後、pH 7の希釈バッファーA(DB、ポリビニルアルコール、80%加水分解、Mol. Wt. 9000-10,000(Aldrich, Milwaukee, WI, USA)、MOPS(Sigma)、NaCl、MgCl2(Sigma)、ZnCl2(Aldrich)、pH 6.90、BSA 30%溶液、製造等級(Serological Proteins Inc., Kankakee, IL))に調製した50μlのビオチン標識GST-P1モノクローナル抗体(2μg/mL)を加え、37℃で1時間インキュベートした。その後プレートをプレート洗浄機でBBSで3回洗浄した。血液サンプルまたはCSFサンプル50μlを二回希釈し、37℃で1時間インキュベートした。各サンプルを二回分析し、プレート上に無作為に分配した。組み換えGST-P1タンパク質(Invitrogen)を、希釈バッファーAで100 ng/mLに希釈した。検量線は同じプレートで100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、および0μg/Lの濃度で作製した。洗浄ステップの後、50μlのアルカリホスファターゼ標識GST-P1モノクローナル抗体を希釈バッファーAに適当な希釈で加え、37℃で1時間インキュベートした。96-ウェルプレートをその後プレート洗浄機でBBSで3回洗浄し、50μlの蛍光Attophos(登録商標)AP
蛍光基質(Promega, Madison, WI)を加えた。プレートを直ちに、終点モード相対蛍光単位(RFU)(λ励起= 444 nmおよびλ放出= 555 nm)を用いてSpectraMax GEMINI-XS(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, U.S.A.)蛍光光度計マイクロタイタープレートリーダー上で読み取った。検量線は、曲線の直線範囲における直線回帰を用いて作成した。タンパク質レベルは、最初は相対蛍光単位(RFU)であらわし、さらに濃度を検量線によって計算した。
豊富なタンパク質の除去:
CSFなどの体液の分析は、高ダイナミックレンジ(high dynamic range)のタンパク質濃度に関して難題をもたらす。アルブミンや免疫グロブリンなどの特定のタンパク質が優勢なために、それよりも少量のタンパク質の多くは、2-DEや質量分析などの従来技術では検出されないままになっていた。従って、少量のタンパク質の範囲を広げるために、最も豊富なCSFタンパク質のいくつか(アルブミン、血清トランスフェリン、IgG、IgA、ハプトグロビン、アルファ-1-アンチトリプシン)の免疫除去を行った。豊富なタンパク質の除去の結果を利用するために、免疫親和性除去(immunoaffinity subtraction)の前後でCSFサンプルの2-DEを行った。ゲルは除去の前後で広範囲にわたる類似性を示し、いくつかの豊富なタンパク質を除去することで少量のスポットの検出が可能になったことを裏付けている。死後CSFサンプルに対して得られたこの結果は、Maccarrone et al.によって示された結果を完全に再現しており(Maccarrone, G., Milfay, D., Birg, I., Rosenhagen, M., Holsboer, F., Grimm, R., Bailey, J., Zolotarjova, N., and Turck, C.W.(2004)Mining the human cerebrospinal fluid proteome by immunodepletion and shotgun mass spectrometry. Electrophoresis 25, 2402-12)、生前CSFに対しては、実行毎に同じ除去の再現性を示す(データ無し)。
豊富なタンパク質の除去に引き続いて、死後CSFサンプルをpIに従ってOGEで分画した。OGEは4.0から7.0の範囲のpH勾配を用いて行った。OGEから得られた画分を、その後SDS-PAGEによって分離した。図2は銀染色した死後CSFサンプルのSDS-PAGEゲルを示す。OGE分画の結果、複数の画分でいくつかのバンドがあらわれ、その他のバンドは一つまたは二つの画分に集中した。OGE分画の精度を確かめるためにWestern blotsも用いた。プールした死後CSFのサンプルを、サンプルのOGEから得られた各画分と共にSDS-PAGEによって分離した。例えば、14-3-3タンパク質ガンマは未分画の死後CSFサンプルではっきりと見られ、死後CSFサンプルのOGEの後では一つの画分において見られた(画分3)。これらの結果は、MSとデータベース検索で得られた同定に一致した。14-3-3タンパク質ガンマは、死後CSF分画から得られた画分3の一つのバンドにおいて同定された(表2参照)。生前CSFサンプルはガンマ14-3-3タンパク質のバンドを全く示さなかった。
タンパク質はゲルから切り出したバンドから同定された。バンドは、死後CSFのゲルと生前CSFのゲル両方の同じ領域から切り出した。死後サンプルと生前サンプルのいずれにおいてもバンドが現れなかったレーンの部分のみ、切り出しを行わなかった。この実験において全部で316のタンパク質が同定され、これらの結果を表2と表3に列挙する。表2はUniProt/Swiss-Protデータベース(全ての種で検索した)から同定されたタンパク質を含み、表3はUniProt TrEMBLデータベース(ヒトに限定した分類で検索した)から同定されたタンパク質を含む(補足データ参照)。同定された全タンパク質のうち、294はSwiss Protデータベースから同定され、さらに22はヒトTrEMBL検索から同定された。死後CSF画分から同定された299のタンパク質のうち、201は死後CSFにおいて特異的に同定された。全部で115のタンパク質が生前CSF画分で同定され、これらのタンパク質のうち17は生前CSF画分に特異的であった。同定された全タンパク質のうち、98は死後CSF画分と生前CSF画分
の両方に存在していた。
死後CSF画分のみで同定されたタンパク質や、脳障害と関連すると知られているタンパク質などの特定のタンパク質を、免疫ブロット法を用いてさらに詳細に調べた。図8は、死後画分のみで同定された四つのタンパク質のWestern blotsを示す。方法の部分で述べたように、未分画のCSFサンプルをSDS-PAGEゲル上で分離し、その後PVDF膜上に電気ブロットした。その後、特異抗体を用いて特定のタンパク質を探して膜を調べた。14-3-3タンパク質ベータ、カルシフォシン、GST-P、およびUFD1の結果を図8に示す。最初の三つのタンパク質においては、それぞれの死後CSFサンプルにおいては強いシグナルが見られたが、生前サンプルでは見られなかったことから、生前CSFと比較して死後CSFではそれらの濃度が増加していることが明らかである。UFD1の結果はそれより明らかではなかったが、このタンパク質の濃度が死後CSFサンプルでは増加したことがやはり明らかである。14-3-3タンパク質の他のアイソフォーム(イプシロン、ガンマ、テータ、ゼータ)についても実験し、アイソフォームベータと同じ結果が得られた(データは示さない)。
Swiss-Protデータベースから同定されたタンパク質を文献検索することで、その推定上の局在性と機能によりタンパク質を分類することができる。古典的循環タンパク質(51%)と分泌タンパク質(9%)は、共に生前CSF画分で同定されたタンパク質の大部分を示した。対照的に、死後CSFサンプルで同定されたタンパク質のほとんどは、推定上細胞内局在性を有し(57.5%)、古典的循環タンパク質(21%)と分泌タンパク質(3%)の割合は低かった。死後CSF画分のみで同定されたタンパク質を考慮すると、75%以上が推定上細胞内局在性を有することがわかった。これらのデータは、これらのタンパク質のほとんどが、組織漏出によって死後CSFで生じたことを強く示唆する。死後CSFと比較して、生前CSFで同定されたタンパク質によって示された機能における違いも顕著であった。生前CSFでは、多数のタンパク質が、タンパク質結合と輸送、凝固、免疫、もしくは炎症に関わることがわかった。死後CSFでは、これらの機能分類の割合ははるかに低く、一方酵素、構造タンパク質、およびシグナル伝達タンパク質などの機能分類の割合はより高かった。死後CSFプールで特異的に同定されたタンパク質の大部分は、代謝酵素、構造タンパク質、およびシグナル伝達経路とタンパク質代謝に関わるタンパク質を含む、細胞内機能に関連していた。
前に行った2-DE実験では、生前CSFと比較して死後CSFでいくつかのタンパク質の濃度が増加していることが同定された。さらなる検証実験では、これらのタンパク質のいくつかが、様々な神経障害のバイオマーカーとなる可能性が示された。本研究の目的は、脳損傷の新たなマーカーの候補を同定するために、死後CSFプロテオームの特性をさらに明らかにすることであった。
く制御した。タンパク質除去のために、免疫親和性除去クロマトグラフィー(immunoaffinity subtraction chromatography)に基づく非常に特異的な方法を用いた。このシステムは、非特異的なタンパク質除去の危険性を最小化する。CSFタンパク質を、さらにOGEを用いてpIに従って分画した。OGE技術は、0.15 pH単位までの分解能でタンパク質を確実に分離することがわかっている。14-3-3タンパク質のガンマアイソフォームが、OGE後に死後画分の一つの画分でのみ免疫検出されたことから、この技術の分解能が確認された。生前CSFサンプルと死後CSFサンプルの複製分画のSDS-PAGEと2-DEゲル分析も、OGEの高い再現性を裏付けた(データは示さない)。本研究では、測定間変動を避けるために、マルチウェル装置を用いて生前サンプルと死後サンプルのOGE分画を同時に行った。OGEから得られた画分はSDS-PAGEによって分離した。対応する生前タンパク質と死後タンパク質の画分は常に同じゲル上にのせた。銀染色の後、対応する生前画分と死後画分に対して同一のパターンを用いて、ゲルのレーンを切り出した。ゲル内タンパク質消化とペプチド抽出を、対応する生前画分と死後画分に対して同時に行った。プロトコルの最終段階で、イオントラップ質量分析計を用いたLC-ESI-MS/MS分析によってタンパク質を同定した。データ依存LC-ESI-MS/MS分析は、しばしば複製データ収集間では再現性が低いとみなされている。これは一般的に、非常に複雑なタンパク質サンプルを研究する大規模なプロテオーム研究の場合である。本研究では、小さなSDS-PAGEゲルのバンドから抽出したペプチドに対してLC-ESI-MS/MS分析を行った。このやり方は、分析するペプチド混合物の複雑性を軽減し、タンパク質同定のミスの危険性を減らした。生前と死後のタンパク質のリスト間の差異が、タンパク質濃度の差異に本当に対応しているかを確認するために、免疫ブロット実験を行った。未分画CSFサンプルとOGE画分の両方から得られた結果は、LC-ESI-MS/MS分析の結果を裏付けた。
患で産生される。これは特に安定性が高く、外傷性脳損傷の潜在的CSFマーカーとして提案された。本研究で同定された断片は、カスパーゼ-3タンパク質分解によって産生される特有のSBPに一致する、約120 kDaの分子量を有していた。
の脳損傷のマーカーとしての有用性が決定される。
<実施例5>
年齢(1911年から1935年に出生)と性別(7人の女性と3人の男性)を一致させた、10人の対照患者と10人の脳卒中患者に対応する血漿サンプルを収集し、ジュネーブで実験を行った。脳卒中患者と対照患者は、ジュネーブ大学病院救急室に入院し、1996年8月から1997年1月まで本研究に参加した。各患者について、入院の時点で乾燥ヘパリン含有チューブに血液サンプルを収集した。4℃、1500gで15分間、遠心分離機にかけた後、血漿サンプルを分注し、分析まで-20℃で保管した。対照群(7人の女性と3人の男性、平均年齢78.3歳、年齢の範囲66-89歳)は、癌、胃腸疾患、整形外科および眼科の病状を含む、様々な病状または外科症状を罹患する患者から構成される。対照群の患者に、過去または最近に脳血管イベントの病歴を持つ者はいない。
29人の対照患者と39人の脳卒中患者が本研究に参加した(表5)。実験は血清サンプルで行った。脳卒中群は10人の出血性患者と29人の虚血性患者を含んだ。虚血性の集団は、(i)心原性、そのうち部分的前方循環梗塞(n=5)および完全前方循環梗塞(n=4)、(ii)アテローム血栓性、そのうち部分的前方循環梗塞(n=5)および完全前方循環梗塞(n=5)、(iii)ラクナ梗塞(n=5)およびTIA(n=5)に分類した。39人の脳卒中患者は、症状の発現後24時間以内に実験に参加し、18人の患者に対して正確な時間を得た。これらの患者に対する神経学イベントから最初の採血までの平均時間間隔は、10.0時間(30分から6.25日に及ぶ)であった。
[Western blottingを用いた、アルツハイマー病診断マーカーとしてのAPO-AIV断片の検証]
アポリポタンパク質A-IV(ApoA-IV)は、上述の実施例4で述べたCSFのプロテオーム解析で最初に同定された。脳損傷関連障害の診断におけるこれの有用性を評価するため、アルツハイマー病(AD)の患者の血漿におけるこれの存在を、Western blottingを用いて調べた。
抗-ApoA-IV(N-末端特異的)、Santa Cruz Biotechnology, Inc.
抗-ApoA-IV(C-末端特異的)、Santa Cruz Biotechnology, Inc.
両抗体は、ヒト由来のApoA-IVのアミノ末端(N-末端)またはカルボキシ末端(C-末端)
付近に位置するペプチドに対して作製した、アフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体である。N-末端およびC-末端に対してプローブすることで、ApoA-IVタンパク質および/または断片の検出の可能性が増すため、これらの抗体を選択した。この分析の結果は図10に示す。
[Western blottingを用いた、アルツハイマー病診断マーカーとしての補体因子Hの検証]
補体因子H(CFH)は、上述の実施例4で述べたCSFのプロテオーム解析で最初に同定された。脳損傷関連障害の診断におけるこれの有用性を評価するため、アルツハイマー病(AD)の患者の血漿におけるこれの存在を、Western blottingを用いて調べた。
SDSゲル電気泳動を、Fisher Scientific 36ウェル、1.5 mmゲルを用いて行った(全溶液はNational Diagnosticsから購入した)。サンプルを、4%濃縮ゲルを含む10%分離ゲル上に分離した(全溶液はNational Diagnosticsから購入した)。サンプル(20μl)を、最初に110 Vで30分間分離し、その後150 Vで60分間、染料の最前部がちょうど泳動バッファーに入り始めるまで分離した。
15 Vで45分間のSemi-dry transblot(Bio-Rad)を用いて、PVDF膜(Amersham Biosciences)にゲルを転写した。その後膜を5%ミルクメイドを含むPBS-Tweenでブロッキングし、補体因子H一次抗体(Abcam, UK)で4℃で一晩プローブした。化学発光Western検出キット(ECL+, Amersham Biosciences)でバンドを検出し、Storm蛍光スキャナー(Amersham Biosciences)を用いて膜をスキャンした。
免疫反応性のバンドが139 kDaに観察され(CfH)、Image Quant(Amersham Biosciences)ソフトウェアを用いて光学密度を定量化した。SPSSパッケージを用いたノンパラメトリックマン‐ホイットニー検定によって分析した。
128人のNINCDS-ADRDA推定AD患者と、78人の健常な年配の対照者から採取した血漿から、Western blotデータを得た。ADの場合、CFHは32%増加した(マン‐ホイットニー検定、表6)。
[アルツハイマー病の診断マーカーとしての補体因子3aの検証]
この実験では、血漿サンプルについて、アルツハイマー病(AD)患者のC3aペプチドの濃度が変化することを示すことができた。
C3は、補体系の構成要素としてはたらく180 kDaの糖タンパク質である。C3は補体系を活性化し、ジスルフィド結合でつながれたαとβの二つの鎖を形成するために、四つのアルギニン残基の除去によって処理される。タンパク質分解イベントにおいて、77アミノ酸残基の4 kDaの長いC3aペプチド(アナフィラトキシン)は、α鎖から続いて放出される。C3aは、G-タンパク質共役受容体であるC3aRに結合する、前炎症性および抗炎症性のメディエータであることがわかっている。
この実験の目的は、対照群と症例(AD)群から採取したヒト血漿サンプルにおけるC3aペプチドの定量的な測定であった。
これらの実験では、BD Biosciences(San Diego, CA 92121(USA))から購入した市販のC3a ELISAアッセイ(BD OptEIA Cat. No. 550499)を用いてヒト血漿サンプルを分析した。プレートをTecan GmbH(Crailsheim, Germany)から購入したPowerwasher384機器で洗浄し、その後引き続いて、Tecan GmbH(Crailsheim, Germany)から購入したGeniosPro吸
光度リーダーで、450/620 nmで1ウェルあたり10回の読み取りで測定した。全手順はメーカーの説明書に従って行った。ヒト血漿サンプルは分析の前に1:500に希釈した。
個々の吸光度値の間で、対照群と症例群の両方について有意な生物学的変化が観察された(実験VL050802における変動係数:26および27%、実験VL051012における変動係数:37および30%)。図11の散布図は、最初のELISA実験で測定した値を示す。両方の実験において、二群間の差異は0,005および0,003の確率値によって示される通り、統計的に有意であることがわかった。C3aの存在量に対して計算した比率(対照/AD)は、二つのELISA実験において0,77と0,76であった(表8参照)。これらの比率は、AD患者の血漿サンプルではC3aの発現の調節が弱いことを意味する。
死後CSFで観察されたタンパク質のリストを、上述の実施例1と4に基づいて提供した。
アルツハイマー病に関連して研究された遺伝子導入マウス(PRO-TAMADプロジェクト)などの、他の実験的パラダイムにおいて発現が変化することが既に知られていたタンパク質を見つけ出すために、このリストを分析した。
表9はヒトの死後CSFで観察されたタンパク質の一部を示し、これらはまた、PRO-TAMADプロジェクトにおいて研究された遺伝子導入マウスから単離した海馬の構成要素において特異的な発現を示す。この点において、WO 2006/021810を参照する。
脳損傷の結果として、本実施例の死後のCSFで循環するタンパク質についての知識は、極めて有用な情報資源である。これらのタンパク質の様々な集団を、他の神経学的状態に容易に結びつけることができ、この実施例は、長年にわたるデータ(legacy data)を単に再検討するだけで、特定の疾患のバイオマーカーとしての主要な候補タンパク質を裏付けるさらなる証拠がもたらされ得る様を示している。
アルツハイマー病群と対照群で異なるタンパク質を同定するために、血漿の二次元ゲル電気泳動分析、その後質量分析を用いて、症例対照研究(case-control study)を行った。これらの結果をその後western blottingによって確認した。プロテオミクス分析のために、50人のAD患者を二次サービス(secondary services)を介して採用し、50人の健常な年配の対照者を一次医療(primary care)を介して採用した。検証を目的として、全部で511人のADおよび他の神経変性疾患の患者と、健常な年配の対照者を調べた。
子Hとアルファ-2-マクログロブリンに対する受診者動作特性曲線(ROC)である。
[1] Vaagenes P, Urdal P, Melvoll R, Valnes K: Enzyme level changes in the cerebrospinal fluid of patients with acute stroke. Arch Neurol 1986;43:357-362.
[2] Lampl Y, Paniri Y, Eshel Y, Sarova-Pinhas I: Cerebrospinal fluid lactate dehydrogenase levels in early stroke and transient ischemic attacks. Stroke 1990;21:854-857.
[3] Matias-Guiu J, Martinez- Vazquez J, Ruibal A, Colomer R, Boada M, Codina A: Myelin basic protein and creatine kinase BB isoenzyme as CSF markers of intracranial tumors and stroke. Acta Neurol Scand 1986;73:461-465.
[4] Persson L, Hardemark HG, Gustafsson J, Rundstrom G, Mendel-Hartvig I, Esscher T, Pahlman S: S-100 protein and neuron-specific enolase in cerebrospinal fluid
and serum: markers of cell damage in human central nervous system. Stroke 1987;18:911-918.
[5] Cunningham RT, Young IS, Winder J, O'Kane MJ, McKinstry S, Johnston CF, Dolan OM, Hawkins SA, Buchanan KD: Serum neurone specific enolase (NSE) levels as an
indicator of neuronal damage in patients with cerebral infarction. Eur J Clin Invest 1991;21:497-500.
[6] Herrmann M, Vos P, Wunderlich MT, de Bruijn CH, Lamers KJ: Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke: A comparative analysis of serum concentrations of protein S-100B and glial fibrillary acidic protein. Stroke 2000;31:2670-2677.
[7] Bitsch A, Horn C, Kemmling Y, Seipelt M, Hellenbrand U, Stiefel M, Ciesielczyk B, Cepek L, Bahn E, Ratzka P, Prange H, Otto M: Serum tau protein level as a marker of axonal damage in acute ischemic stroke. Eur Neurol 2002;47:45-51.
[8] Watson MAScott MG: Clinical utility of biochemical analysis of cerebrospinal
fluid. Clin Chem 1995;41 :343-360.
[9] Hochstrasser DF, Frutiger S, Paquet N, Bairoch A, Ravier F, Pasquali C, Sanchez JC, Tissot JD, Bjellqvist B, Vargas R, et al.: Human liver protein map: a reference database established by microsequencing and gel comparison. Electrophoresis 1992;13:992-1001.
[10] Sanchez J-C, Chiappe D, Converset V, Hoogland C, Binz P-A, Paesano S, Appel
RD, Wang S, Sennitt M, Nolan A, Cawthorne MA, Hochstrasser DF: The mouse SWISS-2D PAGE database: a tool for proteomics study of diabetes and obesity. Proteomics 2001;1:136-163.
[11] Hochstrasser DFMerril CR: 'Catalysts' for polyacrylamide gel polymerization
and detection of proteins by silver staining. Appl Theor Electrophor 1988;1:35-40.
[12] Appel RD, Palagi PM, Walther D, Vargas JR, Sanchez JC, Ravier F, Pasquali C, Hochstrasser DF: Melanie II--a third-generation software package for analysis of two- dimensional electrophoresis images: I. Features and user interface. Electrophoresis 1997; 18:2724-2734.
Claims (8)
- 脳卒中もしくはその可能性を、その罹患の疑いのある被験者において検査する方法であり、グルタチオンSトランスフェラーゼP(GSTP-1)、またはその異型、変異体、もしくはアイソフォームを、前記被験者から採取した体液サンプルにおいて検出することを含み、
前記体液サンプルは、血清、血漿、血液から選択されることを特徴とする、
対照と比較して増加したGSTP-1のレベルを用いて脳卒中の可能性を検査する方法。 - 脳卒中と事前に診断された被験者において、脳卒中の進行、退行、または安定化を追跡する方法であり、前記脳卒中の進行、退行、または安定化を検査するために、GSTP-1、またはその異型、変異体、もしくはアイソフォームのレベルを、前記被験者から異なる時間に採取した複数の体液サンプルにおいて測定すること、以前に検査したサンプルにおけるレベルと比較して、最近検査したサンプルにおける前記GSTP-1のレベルの変化を測定することを含み、
前記体液サンプルは、血清、血漿、血液から選択されることを特徴とする方法。 - 前記GSTP-1に対する抗体が濃度の検出もしくは測定に用いられる、請求項1もしくは2に記載の方法。
- 前記GSTP-1の一つ以上の特定のアイソフォームが測定される、請求項1から3のいずれか一つに記載の方法。
- 前記GSTP-1の特定のアイソフォームの異なるレベルに基づいて検査が行われる、請求項4に記載の方法。
- 前記GSTP-1が、それに対する一種以上の自己抗体の測定によって検出される、請求項1から5のいずれか一つに記載の方法。
- 前記GSTP-1に対する複数の抗体から選択される二種以上のマーカーがELISAマイクロタイタープレートの単一ウェル中で使用される、請求項1から6のいずれか一つに記載の方法。
- GSTP-1および一種以上の他のポリペプチドが別々に分析され、予測アルゴリズムが検査に使用され、前記一種以上の他のポリペプチドは、健康なドナーから採取した脳脊髄液と比較して、死亡した患者から採取した脳脊髄液ではそのレベルが増加しているか減少しているかのいずれかである、請求項1から7のいずれか一つに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0514435A GB2428240A (en) | 2005-07-14 | 2005-07-14 | Diagnostic method for brain damage-related disorders |
GB0514435.7 | 2005-07-14 | ||
PCT/GB2006/050207 WO2007007129A2 (en) | 2005-07-14 | 2006-07-14 | Diagnostic method for brain damage-related disorders |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013011339A Division JP2013092538A (ja) | 2005-07-14 | 2013-01-24 | 脳損傷関連障害の診断法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009501333A JP2009501333A (ja) | 2009-01-15 |
JP2009501333A5 JP2009501333A5 (ja) | 2009-06-18 |
JP5281397B2 true JP5281397B2 (ja) | 2013-09-04 |
Family
ID=34897198
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008520966A Active JP5281397B2 (ja) | 2005-07-14 | 2006-07-14 | 脳損傷関連障害の診断法 |
JP2013011339A Pending JP2013092538A (ja) | 2005-07-14 | 2013-01-24 | 脳損傷関連障害の診断法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013011339A Pending JP2013092538A (ja) | 2005-07-14 | 2013-01-24 | 脳損傷関連障害の診断法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9028825B2 (ja) |
EP (1) | EP1902319B1 (ja) |
JP (2) | JP5281397B2 (ja) |
AT (1) | ATE456055T1 (ja) |
AU (1) | AU2006268034B2 (ja) |
CA (1) | CA2613991C (ja) |
DE (1) | DE602006011896D1 (ja) |
ES (1) | ES2336946T3 (ja) |
GB (1) | GB2428240A (ja) |
WO (1) | WO2007007129A2 (ja) |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9929140D0 (en) * | 1999-12-10 | 2000-02-02 | Univ Geneve | Diagnostic assay for stroke |
US8492107B2 (en) | 2004-04-15 | 2013-07-23 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Neural proteins as biomarkers for nervous system injury and other neural disorders |
PL2021792T3 (pl) | 2006-05-09 | 2013-08-30 | Univ British Columbia | Rozpuszczone białkowe markery zapalenia stawów |
DE102006048201A1 (de) * | 2006-10-11 | 2008-04-17 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Autoantigene zur verbesserten Diagnose, Prognose und Therapie von entzündlichen neurologischen Erkrankungen |
US20090104639A1 (en) * | 2007-09-12 | 2009-04-23 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Biomarkers for motor neuron disease |
KR20180090396A (ko) | 2008-01-18 | 2018-08-10 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 체액 내에서 질병 또는 병태의 시그너쳐의 검출 방법 |
CN102171569A (zh) * | 2008-05-09 | 2011-08-31 | 杜克大学 | 检测和治疗癌症的自身抗体 |
WO2010084327A2 (en) * | 2009-01-26 | 2010-07-29 | Electrophoretics Limited | Methods |
WO2010086697A1 (en) * | 2009-01-30 | 2010-08-05 | Bio-Rad Pasteur | Method for the in vitro diagnosis of stroke |
PL2406633T3 (pl) | 2009-03-11 | 2019-07-31 | Augurex Life Sciences Corp. | Kompozycje i sposoby do charakterystyki chorób zapalnych stawów |
ES2704030T3 (es) | 2009-08-07 | 2019-03-13 | Affinimark Tech Inc | Métodos para la identificación inmunológica de líquido cefalorraquídeo |
HUE040281T2 (hu) | 2009-09-14 | 2019-03-28 | Banyan Biomarkers Inc | Autoantitest markerek traumás agysérülés diagnózisára |
WO2011106322A2 (en) * | 2010-02-23 | 2011-09-01 | The Govt. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services. | Biomarkers for acute ischemic stroke |
GB201008541D0 (en) * | 2010-05-21 | 2010-07-07 | Univ Geneve | Diagnostic methods |
EP4303584A3 (en) | 2010-07-23 | 2024-04-03 | President and Fellows of Harvard College | Methods for detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids |
KR20130041962A (ko) | 2010-07-23 | 2013-04-25 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 식작용 세포를 사용하여 질환 또는 상태를 검출하는 방법 |
WO2012012694A2 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of detecting autoimmune or immune-related diseases or conditions |
US20130203624A1 (en) | 2010-07-23 | 2013-08-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of Detecting Prenatal or Pregnancy-Related Diseases or Conditions |
EP2628013B1 (en) | 2010-10-14 | 2019-06-12 | The Johns Hopkins University | Biomarkers of brain injury |
EP3101426B1 (en) | 2010-12-16 | 2019-05-15 | National Institute of Advanced Industrial Science And Technology | Alpha2-macroglobulin from cerebrospinal fluid as an index marker for neuromyelitis optica |
WO2012152970A1 (es) * | 2011-05-06 | 2012-11-15 | Fundació Institut D'investigació En Ciències De La Salut Germans Trias I Pujol | Método de diagnóstico del ictus isquémico |
JP2014518624A (ja) | 2011-05-12 | 2014-08-07 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | ニューログラニン診断キットのためのアッセイ試薬 |
WO2013044244A1 (en) | 2011-09-22 | 2013-03-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Systems and methods for biochemical data analysis |
DK2768851T3 (en) | 2011-10-21 | 2017-09-18 | Augurex Life Sciences Corp | ANTIGENS DERIVED BY CITRULLINATED 14-3-3 AND APPLICATIONS THEREOF IN THE DIAGNOSIS OF RHEUMATOID ARTHRITIS |
US20140370531A1 (en) * | 2011-12-14 | 2014-12-18 | University Of Rochester | Method of diagnosing mild traumatic brain injury |
US9709573B2 (en) | 2012-03-13 | 2017-07-18 | The Johns Hopkins University | Citrullinated brain and neurological proteins as biomarkers of brain injury or neurodegeneration |
US9733261B2 (en) * | 2012-04-24 | 2017-08-15 | Astute Medical, Inc. | Methods and compositions for diagnosis and prognosis of stroke or other cerebral injury |
KR20150035821A (ko) | 2012-06-15 | 2015-04-07 | 해리 스타일리 | 질환 또는 병태를 검출하는 방법 |
CA2876711A1 (en) | 2012-06-15 | 2013-12-19 | Harry Stylli | Methods of detecting diseases or conditions using circulating diseased cells |
NZ771629A (en) | 2013-03-09 | 2022-12-23 | Harry Stylli | Methods of detecting cancer |
US11585814B2 (en) | 2013-03-09 | 2023-02-21 | Immunis.Ai, Inc. | Methods of detecting prostate cancer |
KR101850827B1 (ko) * | 2013-06-28 | 2018-05-31 | 가부시키가이샤 엠씨비아이 | 인지기능장애질환의 바이오 마커 및 당해 바이오 마커를 사용하는 인지기능장애질환의 검출방법 |
WO2015009907A1 (en) | 2013-07-17 | 2015-01-22 | The Johns Hopkins University | A multi-protein biomarker assay for brain injury detection and outcome |
MA40636A (fr) | 2014-09-11 | 2015-09-11 | Colleen Kelly | Procédés pour détecter le cancer de la prostate |
FI20155280A (fi) * | 2015-04-15 | 2016-10-16 | Medicortex Finland Oy | Aivovamman prognostisia ja diagnostisia glykaanipohjaisia biomarkkereita |
CN105506083B (zh) * | 2015-12-24 | 2018-10-19 | 孙梅芬 | Capg在制备诊断帕金森症产品中的用途 |
JP6947451B2 (ja) * | 2016-06-29 | 2021-10-13 | 学校法人自治医科大学 | バイオマーカー、診断用組成物、及び診断用キット |
WO2018002362A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Randox Laboratories Ltd | Measurement of fabp for diagnosis |
CN109791139A (zh) * | 2016-08-09 | 2019-05-21 | 大塚制药株式会社 | 使用尿液生物标记的阿兹海默氏症的辅助诊断方法 |
US10914748B2 (en) | 2016-09-08 | 2021-02-09 | UNIVERSITé LAVAL | Erythrocyte-derived extracellular vesicles as a biomarker for clinically assessing Parkinson's disease |
KR102466369B1 (ko) * | 2020-08-04 | 2022-11-14 | 서울대학교병원 | 자가면역 뇌염의 진단 방법 |
JP2022116453A (ja) * | 2021-01-29 | 2022-08-10 | 国立大学法人東北大学 | 認知症診断用のバイオマーカー |
CN114966045A (zh) * | 2022-05-07 | 2022-08-30 | 浙江大学 | 检测抗肌球蛋白轻链1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用 |
CN115166260B (zh) * | 2022-07-11 | 2023-06-13 | 东南大学 | 血浆脑细胞来源外泌体中维生素d结合蛋白在诊断抑郁症中的应用 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4017A (en) * | 1845-05-01 | Reid r | ||
US3015A (en) * | 1843-03-21 | Improvement in gilding, silvering | ||
GB225245A (en) * | 1923-11-23 | 1924-12-24 | British Thomson Houston Co Ltd | Improvements in and relating to elastic fluid turbines |
GB322063A (en) * | 1928-10-29 | 1929-11-28 | Godwin Stanley Oliver | Improvements relating to automatic vehicle-controlled track-signalling devices |
JPH09110713A (ja) * | 1995-10-13 | 1997-04-28 | Nippon Green Ueebu Kk | グルタチオン−s−トランスフェラーゼ活性化剤並びにそれを含む医薬品及び飲食物 |
JP2000512482A (ja) * | 1996-06-17 | 2000-09-26 | マックス―プランク―ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | 新規ptp20、pcp―2、bdp―1、clk、およびsirpタンパク質並びに関連する生成物および方法 |
US6541615B1 (en) * | 1996-11-15 | 2003-04-01 | Max-Planck-Gellschaft Zur Foderung Der Wissenschaften E.V. | SIRP proteins and uses thereof |
CA2263063C (en) * | 1999-02-26 | 2004-08-10 | Skye Pharmatech Incorporated | Method for diagnosing and distinguishing stroke and diagnostic devices for use therein |
WO2001040307A1 (de) * | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Antikörper gegen signal-regulator-proteine |
GB9929140D0 (en) | 1999-12-10 | 2000-02-02 | Univ Geneve | Diagnostic assay for stroke |
GB2360089A (en) * | 2000-03-10 | 2001-09-12 | Univ Geneve | Diagnostic assay for transmisible spongiform encephalopathies |
AU5828201A (en) * | 2000-03-10 | 2001-09-17 | Univ Geneve | Diagnostic assay for transmissible spongiform encephalopathies |
US7608406B2 (en) * | 2001-08-20 | 2009-10-27 | Biosite, Inc. | Diagnostic markers of stroke and cerebral injury and methods of use thereof |
WO2004040316A2 (en) | 2002-10-30 | 2004-05-13 | Proteome Sciences Plc. | Diagnostic method for transmissible spongiform encephalopathies (prion diseases) |
EP2357477B1 (en) * | 2003-09-20 | 2017-11-08 | Electrophoretics Limited | Diagnostic method for brain damage-related disorders based on the detection of NDKA |
JP2007518062A (ja) * | 2003-09-29 | 2007-07-05 | バイオサイト インコーポレイテッド | 敗血症を診断する方法および診断するための組成物 |
GB0419124D0 (en) | 2004-08-27 | 2004-09-29 | Proteome Sciences Plc | Methods and compositions relating to Alzheimer's disease |
GB0421639D0 (en) | 2004-09-29 | 2004-10-27 | Proteome Sciences Plc | Methods and compositions relating to alzheimer's disease |
EP1825274B1 (en) | 2004-12-07 | 2009-11-18 | Electrophoretics Limited | Monitoring Huntington's disease |
-
2005
- 2005-07-14 GB GB0514435A patent/GB2428240A/en not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-07-14 WO PCT/GB2006/050207 patent/WO2007007129A2/en not_active Application Discontinuation
- 2006-07-14 US US11/995,501 patent/US9028825B2/en active Active
- 2006-07-14 EP EP06765356A patent/EP1902319B1/en active Active
- 2006-07-14 AU AU2006268034A patent/AU2006268034B2/en active Active
- 2006-07-14 AT AT06765356T patent/ATE456055T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-07-14 CA CA2613991A patent/CA2613991C/en active Active
- 2006-07-14 DE DE602006011896T patent/DE602006011896D1/de active Active
- 2006-07-14 ES ES06765356T patent/ES2336946T3/es active Active
- 2006-07-14 JP JP2008520966A patent/JP5281397B2/ja active Active
-
2013
- 2013-01-24 JP JP2013011339A patent/JP2013092538A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2007007129A2 (en) | 2007-01-18 |
JP2009501333A (ja) | 2009-01-15 |
ES2336946T3 (es) | 2010-04-19 |
EP1902319A2 (en) | 2008-03-26 |
EP1902319B1 (en) | 2010-01-20 |
CA2613991A1 (en) | 2007-01-18 |
AU2006268034A1 (en) | 2007-01-18 |
DE602006011896D1 (de) | 2010-03-11 |
GB2428240A (en) | 2007-01-24 |
GB0514435D0 (en) | 2005-08-17 |
CA2613991C (en) | 2017-03-07 |
WO2007007129A3 (en) | 2007-05-31 |
JP2013092538A (ja) | 2013-05-16 |
ATE456055T1 (de) | 2010-02-15 |
AU2006268034B2 (en) | 2012-02-02 |
US9028825B2 (en) | 2015-05-12 |
US20080220013A1 (en) | 2008-09-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5281397B2 (ja) | 脳損傷関連障害の診断法 | |
Fujii et al. | Autoantibodies against the amino terminal of α-enolase are a useful diagnostic marker of Hashimoto's encephalopathy | |
JP5019878B2 (ja) | 脳障害関連疾患の診断のためのマーカーの検出に関する方法 | |
DK2389587T3 (en) | Diagnostic and prognostic methods related Alzheimer's Disease | |
Begcevic et al. | Targeted mass spectrometry-based assays for relative quantification of 30 brain-related proteins and their clinical applications | |
DK2444814T5 (en) | Biomarker for mental disorders, including cognitive disorders, and method of using the biomarker for detecting mental disorders, including cognitive disorders | |
WO2011005628A1 (en) | Detection of neurodegenerative disease | |
Thouvenot et al. | Enhanced detection of CNS cell secretome in plasma protein-depleted cerebrospinal fluid | |
Tanaka et al. | ITIH4 and Gpx3 are potential biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis | |
AU2013285362B2 (en) | Tropomyosin isoforms related to Alzheimers disease and Mild Cognitive Impairment | |
US20160018416A1 (en) | New dual biomarker of neurodegeneration and of neuroregeneration | |
WO2020032027A1 (ja) | アルツハイマー病の判定薬および判定方法 | |
KR102513533B1 (ko) | 샤르코마리투스 질환의 진단용 조성물 및 이의 진단을 위한 정보 제공 방법 | |
JP7470041B2 (ja) | アルツハイマー病の判定薬および判定方法 | |
CA2932077C (en) | Diagnostic method for brain damage-related disorders | |
JP2024054181A (ja) | アルツハイマー病の判定薬および判定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090414 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090414 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20110303 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110308 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110606 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110613 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110705 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120309 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120925 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130124 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20130328 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130507 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130524 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5281397 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |