JP2014518624A - ニューログラニン診断キットのためのアッセイ試薬 - Google Patents

Abstract

本発明は、バイオマーカーの分野に関する。より具体的には、本発明は、ニューログラニンの検出に有用なアッセイ試薬に関する。特定の実施態様では、本発明は、ニューログラニンに特異的に結合する単離抗体またはそのフラグメントを提供する。別の実施態様では、本発明は、ニューログラニンに特異的に結合するポリヌクレオチドアプタマーを提供する。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１１年５月１２日に出願された米国仮出願第６１／４８５，３７５号の利益を主張し、それは、その全体で参照により本明細書中に援用される。

［政府権益の声明］

本発明は、助成金Ｎｏ．ＮＨＬＢＩ １ Ｒ０１ ＨＬ０９１７５９−０２およびＮＨＬＢＩ ５Ｕ５４ＨＬ０９０５１５−０２の下で、米国政府の支援により行われた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。

［本発明の分野］
本発明は、バイオマーカーの分野に関する。より具体的には、本発明は、バイオマーカーの検出に有用なアッセイ試薬に関する。

［電子的に提出された資料の参照援用］
本出願は、配列リストを含む。それは「Ｐ１１５４６−０２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された。配列リストは３，１４６バイトのサイズであり、２０１２年５月１０日に作成された。それは、その全体で参照により本明細書中に援用される。

脳損傷は複雑であり、多くの深刻な臨床転帰を有し得る。脳および脊髄の損傷は、頭部外傷、脳卒中、出生時外傷、心臓手術、心停止、および、補助人工心臓または体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）での心血管系の補助が必要な患者に起因し得る。さらに、無症状の脳損傷の検出は、特に子供および出生に関する損傷を有する新生児において、困難である。加えて、鎌状赤血球症を有する子供は、無症状の脳損傷の危険性が高い。子供における未治療の無症状の脳損傷は、顕性の脳卒中、神経障害、学習障害および記憶喪失に進行し得る。

残念なことに、身体検査のような臨床手段、およびイメージング（ＣＴスキャンまたはＭＲＩ）は主観的であり、広く利用可能ではなく、精度または特異性が十分でなく、およびまたは、脳損傷を有する幼児、子供または大人を特定するのにコストがかかりすぎる。脳損傷および特に無症状の損傷を有する患者を同定することは、これらの幼児、子供および大人は、顕性の脳卒中への進行、そして、認知および動作障害の進行、および認知症の重大な危険性があるため、大きな臨床的必要性が存在する。

本発明は、少なくとも一部には、ニューログラニンに結合するアプタマーおよび抗体の開発に基づく。一実施態様では、本発明は、ニューログラニンに特異的に結合する、単離抗体またはそのフラグメントを提供する。特定の実施態様では、単離抗体またはそのフラグメントは、配列番号４のアミノ酸１−７８に特異的に結合する。さらに特定の実施態様では、単離抗体またはそのフラグメントは、配列番号４のアミノ酸５５−７８に特異的に結合する。特定の実施態様では、抗体またはそのフラグメントはポリクローナルである。他の実施態様では、抗体またはそのフラグメントはモノクローナルである。特定の実施態様では、抗体またはそのフラグメントは哺乳類のものである。前記抗体またはそのフラグメントはヒトのものであり得る。特定の実施態様では、本発明は、本発明に記載の抗体またはフラグメントを産生するハイブリドーマ細胞を提供する。

抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｖフラグメント；および単鎖フラグメントからなる群から選択され得る。前記単離抗体またはそのフラグメントは、抗体に結合された検出可能物質をさらに含み得る。特定の実施態様では、前記の検出可能物質は、酵素；蛍光ラベル；ラジオアイソトープ；および化学発光ラベルからなる群から選択される。

一実施態様では、前記単離抗体またはそのフラグメントは、ＥＬＩＳＡにおいてニューログラニンに特異的に結合する。別の実施態様では、前記単離抗体またはそのフラグメントは、競合結合アッセイにおいてニューログラニンに特異的に結合する。さらに別の実施態様では、前記単離抗体またはそのフラグメントは、ラジオイムノアッセイにおいてニューログラニンに特異的に結合する。さらなる実施態様では、前記単離抗体またはそのフラグメントは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイにおいてニューログラニンに特異的に結合する。

別の態様では、本発明は、ニューログラニンの検出に有用なキットを提供する。ニューログラニンを検出するためのキットは、（ａ）本明細書に記載の単離抗体；および（ｂ）ニューログラニンへの、単離抗体の結合を検出するための少なくとも１つの構成要素を含んでよい。

別の実施態様では、本発明は、ニューログラニンで免疫化された動物から得られる単離抗体を提供し、ここで、前記抗体は、ニューログラニンの、抗原性エピトープを有するポリペプチドフラグメントに特異的に結合する。特定の実施態様では、本発明は、ニューログラニンに特異的に結合する、３０．５．２と指定されたモノクローナル抗体を提供する。別の実施態様では、本発明は、ハイブリドーマによって産生される抗−ニューログラニンモノクローナル抗体を提供する。

別の態様では、本発明は、ニューログラニンに結合するアプタマーを提供する。特定の実施態様では、本発明は、ニューログラニンに特異的に結合するポリヌクレオチドアプタマーを提供する。別の実施態様では、前記ニューログラニンはヒトニューログラニンである。特定の実施態様では、前記アプタマーは、約１０００ｎΜ未満のＫｄでニューログラニンに結合する。さらに特定の実施態様では、前記アプタマーは、約１００ｎＭ未満のＫｄでニューログラニンに結合する。さらなる実施態様では、前記アプタマーは、約２０ｎＭ未満のＫｄでニューログラニンに結合する。本発明のポリヌクレオチドアプタマーは、約１０〜約１００ヌクレオチドからなることができる。別の実施態様では、前記ポリヌクレオチドアプタマーは、約２０〜約８０ヌクレオチドからなる。さらに別の実施態様では、前記ポリヌクレオチドアプタマーは、約３０〜約５０ヌクレオチドからなる。特定の実施態様では、前記ポリヌクレオチドアプタマーはＲＮＡアプタマーである。

特定の実施態様では、前記ポリヌクレオチドアプタマーは、配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントと少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含む。別の実施態様では、前記ポリヌクレオチドアプタマーは、配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ポリヌクレオチドアプタマーは、配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。

別の実施態様では、ポリヌクレオチドアプタマーは、配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドアプタマーは、配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列からなる。前記ポリヌクレオチドアプタマーは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間リンカーを含んでよい。他の実施態様では、前記ポリヌクレオチドアプタマーは、少なくとも１つの末端ブロッカー含んでよい。本発明のポリヌクレオチドアプタマーは、コンジュゲートに結合してよい。

本発明はさらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドアプタマーをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明はさらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドアプタマーを含む細胞を提供する。細胞は、２以上の異なるポリヌクレオチドアプタマーを含んでよい。本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび本発明に記載のベクターを提供する。

別の態様では、本発明は、対象でのニューログラニンと関連する疾患または障害を診断する方法を提供する。特定の実施態様では、前記方法は、ニューログラニンをポリヌクレオチドアプタマーと結合させ、ニューログラニンに結合したアプタマーの量を決定することにより、前記対象でのニューログラニンのレベルを測定するステップを含む。特定の実施態様では、前記結合は、対象から得られるサンプル中で生じる。他の実施態様では、サンプル中のニューログラニンの量を決定するための方法は、三連四重極質量分析計およびマルチプルリアクションモニタリングを用いて、ニューログラニンに特異的なペプチドを検出するステップを含み、ここで、前記のニューログラニンに特異的なペプチドは、配列番号７を含む。

特定の実施態様では、本発明は、以下の配列：ＴＣＴＡＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＣＧＧＡＴ（配列番号４）を含む配列を有するニューログラニンＲＮＡアプタマー（ＮＲＧＮ−Ａ１）を提供し、それはニューログラニンタンパク質に結合することができて、検出アッセイに有用である。別の実施態様では、本発明は、以下の配列：ＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＡＣＣＴＴＡＴ（配列番号６）を含む配列を有するニューログラニンＲＮＡアプタマー（ＮＲＧＮ−Ａ６）を提供し、それはニューログラニンタンパク質に結合することができて、検出アッセイに有用である。

別の実施態様では、本発明は、ヒトニューログラニンに対する、３０．５．２として同定されたモノクローナル抗体を提供し、これは脳損傷の診断的検出アッセイに有用である。さらなる実施態様では、哺乳類の対象での脳損傷の診断的アッセイにおける、ニューログラニンＲＮＡアプタマーを使用する方法は、（ａ）脳損傷を有する疑いがある対象からサンプルを得るステップ、および（ｂ）サンプル中のニューログラニンのレベルを検出するために、前記アプタマーを用いてアッセイを行うステップを含み、ここで、そのサンプル中のニューログラニンのレベルが、脳損傷を有さないコントロール対象から得られたサンプル中と有意に異なるものを、脳損傷の診断とする。さらに別の実施態様では、哺乳類の対象での脳損傷の診断的アッセイにおいてニューログラニンモノクローナル抗体を用いる方法は、（ａ）脳損傷を有する疑いがある対象からサンプルを得るステップ、および（ｂ）サンプル中のニューログラニンのレベルを検出するために、前記抗体を用いてアッセイを行うステップを含み、ここで、そのサンプル中のニューログラニンのレベルが、脳損傷を有さないコントロール対象から得られるサンプル中と有意に異なるものを、脳損傷の診断とする。そのような方法では、脳損傷は、無症状の脳損傷および顕性の脳損傷からなる群から選択される。最後に、本発明は、ニューログラニンの捕捉試薬および検出試薬を含む、脳損傷の診断／予後キットを提供する。

ニューログラニンタンパク質の検出のために必要なニューログラニンアプタマーの最小限の量を示すゲルである。 ニューログラニンアプタマーを用いたプルダウンアッセイの結果を示す。 ＡＢＩ Ｓｃｉｅｘ Ｑｔｒａｐ ４０００三連四重極質量分析計を用いた、ニューログラニンシグネチャペプチドおよびラベル化スタンダードペプチドのシグナルを表す。 クーマシー染色後の、ＰＡＧＥゲル上のＨｉｓ−ＮＲＧＮを示す。Ｈｉｓ−ＮＲＧＮの予測分子量は８．５Ｋｄである。 マウスモノクローナル抗体３０．５．２を用いた、組み換えＮＲＧＮのダイレクトＥＬＩＳＡの検量線を示す。濃度範囲は０．００２〜１０ｎｇ／ｍｌである。 ニューログラニンに対する抗−ヒトモノクローナル抗体を用いた、組み換えＮＲＧＮのダイレクトＥＬＩＳＡの検量線を示す。濃度範囲は７５ｎｇ／ｍｌである。 先天性心疾患の外科的修復のための心肺バイパスを受けている患者由来の、ニューログラニンおよびＧＦＡＰのレベルを示す。 ニューログラニンは急性脳損傷の循環バイオマーカーであり、急性脳卒中の公知の循環バイオマーカーであるグリア線維酸性タンパク質よりも早く循環中に現れることを示すグラフである。 鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を有する子供（ｎ＝１１５）および同年齢の非ＳＣＤコントロール（ｎ＝４６）での、血漿ニューログラニン濃度のログプロットである。破線は、４６の非ＳＣＤコントロール間の９５ｔｈパーセンタイル値を示す。バーは中央値を示す。 ＳＣＤおよびＳＣＩを有する子供（ｎ＝６４）、ＳＣＤを有しＳＣＩを有さない子供（ｎ＝５１）、および同年齢の非ＳＣＤコントロール（ｎ＝４６）での、血漿ニューログラニン濃度のログプロットである。破線は、６０の健常な小児コントロール間の９５ｔｈパーセンタイル値を示し、パーセントは、健常コントロールの９５ｔｈパーセンタイルより上の比率を示す。

本発明は、本明細書に記載の特定の方法および構成要素などに制限されず、変更し得ることが理解されよう。また、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のみのために使用され、本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるものである。本明細書および添付の請求項において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数形の言及を含むことを留意しなければならない。このように、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」との言及は、１つまたは複数のタンパク質との言及であり、当業者等に知られるそれらの同等物を含む。

別段に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。特定の方法、デバイス、および材料を記載するが、本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。

全ての雑誌論文、本、マニュアル、公開された特許出願、および付与特許を含む、本明細書が引用する全ての刊行物は、参照により本明細書に援用される。さらに、本明細書、実施例、および添付の請求項で用いられる特定の用語および語句の意味が与えられる。定義は実際に制限することを意図せず、本発明の特定の態様の、より明確な理解を与えるために役立つ。

Ｉ．定義
用語「脳損傷」は、脳がある事象に起因する傷害により損傷している状態を指す。本明細書において用いられる「損傷」とは、細胞または分子の完全性、活性、レベル、ロバスト性、状態における変化、またはある事象に起因し得る他の変化である。例えば、損傷は、細胞または分子の特性の、物理的、機械的、化学的、生物学的、機能的、感染性、または他のモジュレーターを含む。事象は、衝突（衝撃）のような物理的外傷、または血管の遮断または漏出のいずれかにより生じる脳卒中のような生物学的異常を含み得る。事象は、場合により、感染因子による感染である。当業者は、用語「損傷」または「事象」により含められる非常に多くの同等の事象を認識する。

より具体的には、用語「脳損傷」は、その病態生理学的基礎に関わらず、中枢神経系の傷害をもたらす状態を指す。最も高頻度の「脳損傷」起源は、脳卒中および外傷性脳損傷である。「脳卒中」は、出血系および非出血系に分類される。出血系脳卒中の例は、脳溢血、くも膜下出血、および脳動脈奇形に続発する頭蓋内出血を含み、一方で、非出血系脳卒中の例は、脳梗塞を含む。

用語「外傷性脳損傷」または「ＴＢＩ」は、物理的外傷が脳傷害を引き起こす場合に生じる脳への外傷性損傷を指す。例えば、ＴＢＩは、非開放性頭部損傷または穿通性頭部損傷に起因し得る。「非外傷性脳損傷」は、虚血または機械的外力に関わらない脳損傷（例えば、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脳出血、脳感染症、脳腫瘍など）を指す。

用語「脳損傷」はまた、無症状の脳損傷、脊髄損傷、および無酸素性虚血性脳損傷を指す。用語「無症状の脳損傷」（ＳＣＩ）とは、脳損傷の顕性の臨床的証拠がない脳損傷を指す。脳損傷が実際に存在する場合に脳損傷の臨床的証拠がないことは、損傷の程度、損傷のタイプ、意識レベル、および薬剤、特に鎮静剤および麻酔薬に起因し得る。

用語「脊髄損傷」とは、脊椎の破砕または脱臼に起因して、脊髄が圧縮／磨滅を受けて機能障害を引き起こす状態を指す。本明細書において用いられる用語「無酸素性虚血性脳損傷」は、脳機能障害をもたらす、脳組織への酸素供給の欠乏を指し、脳低酸素症を含む。例えば、無酸素性虚血性脳損傷は、局所脳虚血、全脳虚血、低酸素性低酸素症（すなわち、環境中の制限された酸素が脳機能の低下を引き起こす。例えば、潜水士、飛行士、登山者、および消防士などでは、それらの全てに、この種の脳低酸素症の危険性がある）、肺での閉塞（例えば、窒息、狭窄、気管の圧挫から生じる低酸素症）を含む。

本明細書において用いられる用語「比較する」とは、患者由来のサンプル中の１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞局在が、どのように、標準またはコントロールサンプル中の対応する１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞局在に関連するかを評価することを指す。例えば、「比較する」は、患者由来のサンプル中の１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベル、または細胞局在が、標準またはコントロールサンプル中の対応する１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベル、または細胞局在と同じか、それより多いか少ないか、または異なるかどうかを、評価することを指し得る。より具体的には、その用語は、患者由来のサンプル中の１つまたは複数のバイオマーカーの割合、レベル、または細胞局在が、例えば、無症状の脳損傷（ＳＣＩ）を有する患者、ＳＣＩを有さない患者、ＳＣＩの治療に反応する患者、ＳＣＩの治療に反応しない患者、特定のＳＣＩ治療に反応する可能性がある／ない患者、または、他の疾患または状態を有する／有しない患者に対応する、事前に定義されたバイオマーカーレベルの割合、レベル、または細胞局在と同じか、それより多いか少ないか、異なるか、またはさもなければ対応する（または対応しない）かどうか、評価することを指し得る。特定の実施態様では、用語「比較する」は、患者由来のサンプル中の本発明の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルが、コントロールサンプル中の同一バイオマーカーのレベル（例えば、非感染の個体と相関する事前に定義されたレベル、標準のＳＣＩレベルなど）と同じか、それより多いかまたは少ないか、異なるか、さもなければ対応する（または対応しない）かどうか、評価することを指す。

本明細書において用いられる用語「示す（ｉｎｄｉｃａｔｅｓ）」または「相関する（ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ）」（または、文脈に応じて「ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ」または「ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ」、または、「ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ」または「ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ」）は、パラメーター、例えば、患者由来のサンプル中での調節された割合、レベル、または細胞局在に関して、その患者がＳＣＩを有することを意味し得る。特定の実施態様では、そのパラメーターは、本発明の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを含んでよい。１つまたは複数のバイオマーカーの量の特定のセットまたはパターンは、患者がＳＣＩを有することを示し得る（すなわち、ＳＣＩを有する患者と相関する）。他の実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの量の特定のセットまたはパターンは、非罹患者に相関し得る（すなわち、患者がＳＣＩを有さないことを示す）。特定の実施態様では、本発明により用いられる「示す」または「相関する」は、診断の評価、ＳＣＩまたはＳＣＩの進行の予測、臨床治療の有効性評価、特定の治療計画または医薬品に反応し得る患者の同定、治療の進行のモニタリングのための、および、スクリーニングアッセイの関連においては抗−ＳＣＩ治療の同定のための、スタンダード、コントロールまたは比較値に対するバイオマーカーレベル間の関係を定量する任意の線形法または非線形法によるものであり得る。

用語「患者」、「個体」または「対象」は、本明細書において交換可能に用いられ、哺乳類、特にヒトを指す。患者は、軽度、中度または重度の疾患を有してよい。患者は、未治療であってよく、任意の形態の治療に反応し、または難治性であってよい。患者は、治療を必要とする個体、または特定の症状または家族歴に基づく診断を必要とする個体であってよい。ある場合には、この用語は、制限されないが、マウス、ラット、およびハムスターを含む齧歯類；および霊長類を含む、実験動物での、獣医用途での、および疾患に関する動物モデルの開発での治療を指してよい。

用語「測定する」および「決定する」は、全体にわたって交換可能に用いられ、患者サンプルを得るステップおよび／またはサンプル中のバイオマーカー（単数または複数）のレベルを検出するステップを含む方法を指す。一実施態様では、その用語は、患者サンプルを得るステップおよびサンプル中の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを検出するステップを指す。別の実施態様では、用語「測定する」および「決定する」は、患者サンプル中の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを検出するステップを意味する。測定は、当技術分野で知られている方法および本明細書にさらに記載される方法により達成することができる。用語「測定する」はまた、用語「検出する」と全体にわたって交換可能に用いられる。

用語「サンプル」、「患者サンプル」、「生物学的サンプル」などは、患者、個体、または対象から得られる様々なサンプルタイプを含み、診断またはモニタリングアッセイで用いることができる。患者サンプルは、健常な対象、病気の患者、またはＳＣＩと関係がある症状を有する患者から得てよい。さらに、患者から得られるサンプルは分けることができ、一部のみを診断に用いてよい。さらに、サンプルまたはその一部は、後の分析のためにサンプルを維持する条件下で保管することができる。定義は、特に、血液および生物学的起源の他の液体サンプル（制限されないが、血漿、血清、末梢血、脳脊髄液、尿、唾液、排泄物および滑液を含む）、固形組織サンプル、例えば生検材料または組織培養またはそれら由来の細胞およびそれらの産物を含む。特定の実施態様では、サンプルは血液サンプルを含む。別の実施態様では、血清サンプルが用いられる。定義はまた、例えば遠心分離、濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー、試薬処理、洗浄、または特定の細胞集団の濃縮により、調達後に任意の方法で操作されたサンプルを含む。その用語はさらに臨床サンプルを含み、また、例えば培地中、細胞上清中、組織サンプル中、臓器中の細胞も含む。サンプルはまた、新鮮凍結および／またはホルマリン固定の、パラフィン包埋された組織ブロック、例えば、臨床的または病理学的バイオプシーから調製された、病理学的分析または免疫組織化学による試験のために調製されたブロックを含んでよい。

本発明に関する様々な方法論は、値、レベル、特徴、特性、特質などを、「適したコントロール」または「コントロールサンプル」と本明細書で交換可能に言及される「適切なコントロール」との比較を含むステップを含む。「適切なコントロール」、「適したコントロール」または「コントロールサンプル」は、比較目的に有用な、当技術分野における通常の知識を有する者になじみのある任意のコントロールまたはスタンダードである。一実施態様では「適切なコントロール」または「適したコントロール」は、細胞、臓器、または患者において決定される値、レベル、特徴、特性、特質などであり、例えば正常の形質を示す、コントロールまたは正常の細胞、臓器、または、患者などである。例えば、本発明のバイオマーカーは、非罹患者（ＵＩ）または正常のコントロールの個体（ＮＣ）（両方の用語は、本明細書において交換可能に用いられる）由来のサンプル中のレベルに関して評価されてよい。別の実施態様では、「適切なコントロール」または「適したコントロール」は、患者に対して治療（例えば、ＳＣＩ治療）を行う前に決定される値、レベル、特徴、特性、特質などである。さらに別の実施態様では、転写率、ｍＲＮＡレベル、翻訳率、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特性または特質、遺伝子型、表現型などは、細胞、臓器、または患者への治療の投与前、投与中、または投与後に決定することができる。さらなる実施態様では、「適切なコントロール」または「適したコントロール」は、事前に定義された値、レベル、特徴、特性、特質などである。「適切なコントロール」は、ＳＣＩと相関する本発明の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルのプロファイルまたはパターンであってよく、それに対して患者サンプルを比較することができる。患者サンプルはまた、ネガティブコントロール、すなわち、ＳＣＩを有さないことに相関するプロファイルと比較することもできる。

用語「単離された」は、その元の環境（天然に存在する環境）から取り出された生物学的材料（核酸またはタンパク質）を指す。例えば、植物または動物中に天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、天然に存在する隣接核酸から分離された同一のポリヌクレオチドは「単離された」とみなされる。用語「精製された」は、他の化合物の存在を除き、その材料が絶対的な純度を示す形態で存在することを要求するのではない。それはむしろ相対的な定義である。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形状または二本鎖へリックスのいずれかでの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー型、またはそれらの任意のリン酸エステルアナログ、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルを指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡへリックスがあり得る。核酸分子、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次構造および二次構造のみを指し、いかなる特定の三次構造にも限定しない。このように、この用語は、とりわけ、線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミド、およびクロモソームでみられる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について論じる場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同の配列を有する鎖）に沿って５’から３’への方向での配列のみ与える通常の慣習に従って、本明細書中に記載され得る。「組み換えＤＮＡ分子」は、分子の生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。

用語「フラグメント」は、参照核酸と比較して減少した長さのヌクレオチド配列を意味し、共通部分にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むことが理解されよう。本発明による、そのような核酸フラグメントは、適切な場合、当該フラグメントが構成要素の一部であるより長いポリヌクレオチド中に含まれてよい。そのようなフラグメントは、本発明による核酸の、少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００または１５００個の連続したヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドを含むか、あるいは、そのようなオリゴヌクレオチドからなる。

当技術分野で知られている、用語「パーセント（％）同一性」または「パーセント（％）同一」は、配列を比較することにより決定される、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野において、「同一性」はまた、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関係の程度も意味し、場合により、そのような配列の鎖間をマッチングさせることにより決定される。「同一性」および「類似性」は、公知の方法により容易に計算することができ、制限されないが、以下に記載のものを含む：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）。同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間のベストマッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、一般に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アライメントおよびパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて行なってよい。配列のマルチプルアライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌのアライメント方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を用いてデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で行なってよい。Ｃｌｕｓｔａｌの方法を用いた、ペアワイズのアライメントに関するデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ １、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５と選択してよい。

用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販されるか、独立に開発されてよい。典型的な配列解析ソフトウェアは、制限されないが、ＧＣＧ ｓｕｉｔｅのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１５ ＵＳＡ）を含む。本出願の関連において、配列解析ソフトウェアが解析に用いられる場合、解析の結果は、別段の定めのない限り、参照プログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されよう。本明細書において用いられる「デフォルト値」は、最初の初期化時にソフトウェアに元々ロードされた値またはパラメーターの任意のセットを意味する。

用語「に特異的に結合する」、「に特異的」および関連する文法上の異形は、共有結合または非共有結合の相互作用、または、共有結合と非共有結合の相互作用の組み合わせにより仲介され得る、抗体／抗原、アプタマー／標的、酵素／基質、受容体／アゴニストおよびレクチン／糖のようなペア種の間に生じる結合を指す。２種の相互作用が、非共有結合の複合体を生じさせる場合、生じる結合は典型的に、静電気、水素結合、または親油性相互作用の結果である。したがって、特定の実施態様では、「特異的な結合」は、２つの間に相互作用が存在するペア種の間に生じ、抗体／抗原または酵素／基質などの相互作用の特性を有する結合複合体を生じさせる。特に、特異的な結合は、ペアのうちの１つのメンバーが特定の種に結合して、結合メンバーの対応メンバーが属する化合物ファミリー内の他の種には結合しないことにより特徴付けられる。このように、例えば、抗体は典型的に単一のエピトープに結合して、タンパク質ファミリー内の他のエピトープには結合しない。一部の実施態様では、抗原と抗体の間の特異的な結合は、少なくとも１０^−６Ｍの結合親和力を有する。他の実施態様では、抗原と抗体は、少なくとも１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ〜１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ、または１０^−１２Ｍの親和力で結合する。特定の実施態様では、その用語は、任意の非標的と比べて少なくとも５倍高い親和力、例えば、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い親和力で、標的（例えばタンパク質）に結合する分子（例えばアプタマー）を指す。

「随意的」または「場合により」は、その後に記載される事象または状況が、生じ得るまたは生じ得ないこと、および、その記載が、事象または状況が生じる事例およびそれが生じない事例を含むことを意味する。

「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、脂質などの標的を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられるその用語は、最も広い意味で用いられ、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメントなど）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つの無傷の抗体から生産される二重特異性抗体などの多重特異性抗体、抗体部位を含む融合タンパク質、および、抗体が所望の生物学的活性を示す限りにおいて抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を含む。抗体は、免疫グロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、または、それらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかであってよく、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる、それらの重鎖定常ドメインの同一性に基づく。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる、そして良く知られたサブユニット構造および三次元立体配置を有する。抗体は、裸の（ｎａｋｅｄ）抗体であっても、トキシン、ラジオアイソトープなどの他の分子にコンジュゲートされていてよい。

本明細書において用いられる用語「抗体フラグメント」、「フラグメント」、または「その（それらの）フラグメント」は、無傷の抗体の一部分を指す。抗体フラグメントの例は、限定されないが、線状抗体；単鎖抗体分子；ＦｃまたはＦｃ’ペプチド、ＦａｂおよびＦａｂフラグメント、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。ほとんどの実施態様では、その用語はまた、標的分子（例えばニューログラニン）の抗原に結合するフラグメントを指し、「抗原結合フラグメント」と呼ばれ得る。

本明細書において用いられる、非ヒト（例えばミューリン）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、または含まない、キメラ抗体である。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基により置換されている。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内またはドナー抗体内に見られない残基を含むことができる。これらの修飾は通常、抗体の能力をさらに高めるために施される。一般に、ヒト化抗体は、実質的に少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むこともでき、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものである。ヒト化抗体を生産するために用いられる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号に記載されている。

本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体、または、当技術分野で知られている技術のいずれかを用いて作製される、ヒトにより産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、無傷の、または全長の抗体、そのフラグメント、および／または、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、ミューリン軽鎖ポリペプチドとヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。

「ハイブリッド抗体」は、２つの異なるエピトープまたは２つの異なる抗原が、結果として生じる四量体により認識されて結合されるように、異なる抗原決定領域を有する抗体由来の重鎖および軽鎖のペアがアセンブルされた、免疫グロブリン分子である。

用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、２以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および能力を有する哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の１つの種に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で、定常領域は、その種における免疫応答を引き起こすことを避けるために、別の（たいていヒト）に由来する抗体における配列と同種である。

用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、本明細書において交換可能に用いられ、特定の抗体により認識されて特異的に結合されることが可能な抗原の一部を指す。抗原がポリペプチドである場合は、エピトープは、タンパク質三次元フォールディングにより並置された連続アミノ酸と不連続アミノ酸の両方により形成され得る。連続アミノ酸により形成されるエピトープは典型的に、タンパク質変性時に維持されて、一方、三次元フォールディングにより形成されるエピトープは典型的に、タンパク質変性時に失われる。エピトープは典型的に、少なくとも３つの、より通例では少なくとも５つまたは８〜１０のアミノ酸を、固有の空間構造中に含む。抗原決定基は、無傷の抗原（すなわち、免疫応答を引き起こすために用いられる「免疫原」）と、抗体に対する結合に関して競合することができる。

ＩＩ．ニューログラニンアプタマー
本発明は、ニューログラニンに特異的に結合するポリヌクレオチドアプタマーに関する。特定の実施態様では、アプタマーは、ニューログラニンの検出のために用いられる。本発明のポリヌクレオチドアプタマーの配列は本明細書に開示され、さらなるアプタマーの実施態様は、当技術分野で知られている任意の方法により選択され得る。一実施態様では、アプタマーは、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）のような反復選択方法により選択してよい。このタイプの方法では、オリゴヌクレオチドのランダムプール（例えば、約１０^５〜約１０^１５のランダムオリゴヌクレオチド）が標的タンパク質に曝されて、標的に結合するオリゴヌクレオチドが単離されて突然変異がされて、その方法が、標的に対して所望の親和力で結合するオリゴヌクレオチドが同定されるまで繰り返される。別の実施態様では、アプタマーは、本明細書に記載のアプタマーの配列および構造上の要求から始めて、その配列を修飾して他のアプタマーを生産することにより選択してよい。

本発明の一実施態様では、アプタマーは、哺乳類のニューログラニンタンパク質に関する。さらなる実施態様では、アプタマーは、ヒト、マウスまたはラットのニューログラニンに関し得る。別の実施態様では、アプタマーは、ヒト、マウスおよびラットのニューログラニンに関する。特定の実施態様では、アプタマーは、約１０００ｎＭ未満、例えば、約５００、２００、１００、５０、または２０ｎＭ未満のＫ_ｄでニューログラニンに結合し得る。アプタマーは、ニューログラニンの任意のアイソフォームまたは翻訳後修飾形態、または、アイソフォームや翻訳後修飾形態などの任意の組み合わせに関し得る。

本発明のアプタマーの長さは、制限されないが、典型的なアプタマーは、約１０〜約１００ヌクレオチド、例えば約２０〜約８０ヌクレオチド、約３０〜約５０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施態様では、アプタマーは、５’および／または３’末端に結合されたさらなるヌクレオチドを有してよい。さらなるヌクレオチドは、例えば、プライマー配列、制限エンドヌクレアーゼ配列、またはアプタマーの生産に有用なベクター配列の一部であってよい。

本発明のポリヌクレオチドアプタマーは、リボヌクレオチドのみ（ＲＮＡアプタマー）、デオキシリボヌクレオチドのみ（ＤＮＡアプタマー）、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせからなり得る。ヌクレオチドは、天然起源のヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）または修飾ヌクレオチドであってよい。修飾ヌクレオチドとは、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンなどの塩基が、１つまたは複数の原子または基の置換または付加により修飾されたものを含むヌクレオチドを指す。塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドを含み得る、修飾のタイプのいくつかの例は、限定されないが、様々な組み合わせでのアルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、またはアセチル化塩基を含む。より具体的な例は、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジンおよび５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば、２−チオウリジンおよび４−チオウリジンおよび２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えば、アミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇ−クランプヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８−置換アデニン類およびグアニン類、５−置換ウラシル類およびチミン類、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドはまた、糖部分に関して修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド）、および、糖類またはリボシルではないそのアナログを有するヌクレオチドを含む。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、および他の糖類、ヘテロ環、または炭素環であってよく、またはこれらに基づいてよい。用語ヌクレオチドはまた、ユニバーサル塩基として当技術分野で知られているものを含むことを意味する。例として、ユニバーサル塩基は、限定されないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、またはネブラリンを含む。修飾ヌクレオチドは、標識ヌクレオチド、例えば、放射能で、酵素的に、または発色により（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）標識されたヌクレオチドを含む。

本発明の一実施態様では、アプタマーはＲＮＡアプタマーであり、配列番号４−６のいずれかと同一のヌクレオチド配列を含む。別の実施態様では、ＲＮＡアプタマーは、配列番号４−６のいずれかと同一のヌクレオチド配列からなる。さらなる実施態様では、ＲＮＡアプタマーは、配列番号４−６のいずれかと少なくとも７０％同一の、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、ヌクレオチド配列を含む。別の実施態様では、アプタマーは、配列番号４−６のいずれかと少なくとも７０％同一の、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、ヌクレオチド配列からなる。異なる実施態様では、アプタマーは、配列番号４−６のいずれかの少なくとも１０個連続したヌクレオチド、例えば、少なくとも約１５個、２０個、２５個、３０個、または３５個連続したヌクレオチドのフラグメントと同一のヌクレオチド配列を含む。さらなる実施態様では、アプタマーは、配列番号４−６のいずれかの少なくとも１０個連続したヌクレオチド、例えば、少なくとも約１５個、２０個、２５個、３０個、または３５個連続したヌクレオチドのフラグメントと少なくとも７０％同一の、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％；９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一実施態様では、上述のＲＮＡアプタマー中の１つまたは複数のリボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドにより置換される。別の実施態様では、配列番号４−６のアプタマーのフラグメントおよび／またはアナログは、配列番号４−６のアプタマーの１つまたは複数と実質的に類似する結合および／または阻害活性を有する。本明細書で用いられる「実質的に類似する」とは、配列番号４−６のアプタマーの１つまたは複数の少なくとも約２０％の結合および／または阻害活性である、１つまたは複数のニューログラニン機能に対する結合および／または阻害活性を指す。

アプタマー配列、例えば配列番号４−６の変更は、ニューログラニンに対するアプタマーの結合のための構造上の要求に基づいて施され得る。構造上の要求は、開示のアプタマー間の共通配列を解析することにより、および／または、開示のアプタマーに突然変異を起こさせてニューログラニンの結合親和力を測定することにより、当業者により容易に決定され得る。例えば、ＮＲＧＮ−Ａ１、ＮＲＧＮ−Ａ２、ＮＲＧＮ−Ａ３、ＮＲＧＮ−Ａ４およびＮＲＧＮ−Ａ５のそれぞれは、ＣＣにより隔てられた２Ｔリッチのモチーフを含み、この配列が結合活性に重要であることを示している。

アプタマーは、当業者に公知の任意の方法により合成されてよい。一実施態様では、アプタマーは、オリゴヌクレオチドの化学合成、および／または、より短いオリゴヌクレオチドのライゲーションにより生産されてよい。本発明の別の実施態様は、本発明のアプタマーをコードするポリヌクレオチドに関する。そのポリヌクレオチドを用いて、例えばインビトロ転写、ポリメラーゼ連鎖反応増幅、または細胞の発現により、アプタマーを発現してよい。そのポリヌクレオチドはＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。一実施態様では、そのポリヌクレオチドは、アプタマーを発現するために用いられ得るベクターである。そのベクターは、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターであってよく、任意のタイプの細胞、例えば、哺乳類、昆虫、植物、真菌、または細菌の細胞での使用に適していてよい。そのベクターは、アプタマーを発現するために必要な１つまたは複数の調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写調節エレメントなどを含んでよい。本発明の一実施態様は、本発明のアプタマーをコードするポリヌクレオチドを含む細胞に関する。別の実施態様では、本発明は、本発明のアプタマーを含む細胞に関する。その細胞は、任意のタイプの細胞、例えば、哺乳類、昆虫、植物、真菌、または細菌の細胞であってよい。

本発明の一態様は、診断目的のための、本発明のアプタマーの使用に関する。アプタマーは、対象でのニューログラニンのレベルを測定するためのアッセイにおいて、結合剤として用いることができる。そのような測定は、ニューログラニンのレベルが異常かどうか決定するために用いることができる。そのような測定は、さらに、ニューログラニンと関連する、例えば、ニューログラニンの過剰発現または過小発現と関連する疾患または障害を診断するために用いることができる。他の実施態様では、アプタマーは、ニューログラニン受容体の競合結合アッセイにおいて、ニューログラニン受容体の存在量および／または受容体に対するニューログラニンの結合親和性および特異性を測定するために用いることができる。アプタマーはまた、インビボのイメージングまたは組織学的分析のために用いることができる。非常に多くの適切な結合アッセイが、当業者によく知られている。診断的アッセイは、研究目的のために、単離された細胞または細胞株上で、インビトロで行うことができる。診断的アッセイはまた、対象由来のサンプル（例えば、組織サンプル（バイオプシー、吸引液（ａｓｐｉｒａｔｅｓ）、スクレーピング（ｓｃｒａｐｉｎｇｓ）など）または身体の液体サンプル（血液、血漿、血清、唾液、尿、脳脊髄液など））上で行うことができ、またはインビボで行うことができる。アプタマーは、制限されないが、蛍光性、発光性、リン光性、放射性、および／または比色性化合物を含む、当技術分野で知られている方法およびラベルを用いて標識することができる。

一態様では、本発明は、ニューログラニンに結合させるために本発明のポリヌクレオチドアプタマーを用いるステップを含む、対象でのニューログラニンのレベルを測定する方法に関する。別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドアプタマーを用いて対象でのニューログラニンのレベルを測定するステップを含む、対象でのニューログラニンと関連する疾患または障害を診断する方法に関する。ニューログラニンのレベルは、ニューログラニンと関連する疾患または障害の存在または不存在と相関し得る。

上述のそれぞれの方法に関して、その方法はニューログラニンを標的とする単一のアプタマーを用いて実施してよい。別の実施態様では、その方法は、ニューログラニンを標的とする２以上の異なるアプタマー、例えば、３、４、５、または６の異なるアプタマーを用いて実施してよい。

ＩＩＩ．ニューログラニン抗体
一態様では、本発明は、診断またはスクリーニング目的に有用な、ニューログラニンに対する抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明に記載の抗体は単離される。特定の実施態様では、本発明に記載の抗体は実質的に純粋である。

一部の実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、抗体はキメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。本発明はさらに二重特異性抗体を提供する。特定の実施態様では、抗体はＦａｂフラグメントのような抗体フラグメントである。

特定の実施態様では、本発明は、ニューログラニンに対する単離抗体を提供する。特定の実施態様では、前記抗体は配列番号１１に特異的である。他の実施態様では、前記抗体は、配列番号１１のアミノ酸５５−７８に特異的に結合する。前記抗体またはその抗体フラグメントは、ニューログラニンを特異的に認識する任意のモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。一部の実施態様では、本発明は、ニューログラニンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを提供する。一部の実施態様では、前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ニューログラニンまたはそのエピトープまたは抗原決定基に特異的に結合するキメラまたはヒト化抗体である。

ニューログラニンに対する抗体は、本発明に記載の実験的および診断的方法での用途を見いだす。特定の実施態様では、本発明の抗体は、例えば、組織、血液、血漿、血清、脳脊髄液サンプルなどの生物学的サンプル中のニューログラニンタンパク質の発現を検出するために用いられる。組織バイオプシーを切開して、ニューログラニンタンパク質を、例えば、免疫蛍光または免疫組織化学を用いて検出することができる。あるいは、サンプル由来の各細胞を単離して、ＦＡＣＳ分析により固定細胞または生細胞上にタンパク質発現を検出する。さらに、抗体をタンパク質アレイ上で用いて、例えば、細胞上、細胞溶解物中、または他のタンパク質サンプル中のニューログラニンの発現を検出することができる。

ポリクローナル抗体は、任意の公知の方法で調製することができる。ポリクローナル抗体は、場合により、滅菌生理食塩水中に希釈されたキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、血清アルブミンなどに結合され、および、アジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）と組み合わせて安定したエマルションを形成させて、関連抗原（精製ペプチドフラグメント、全長組み換えタンパク質、融合タンパク質など）の複数回の皮下または腹腔内注射により動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ロバなど）を免疫化することにより高めることができる。ポリクローナル抗体は、それから、そのように免疫化された動物の血液、腹水などから回収される。回収血液は凝固されて、血清が静かに移され、遠心分離により澄まされて、抗体力価に関して分析される。ポリクローナル抗体は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などを含む、当技術分野で標準的な方法により、血清または腹水から精製することができる。

モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５により記載されるもののようなハイブリドーマ方法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ方法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は上述のように免疫化されて、免疫抗原に特異的に結合する抗体の、リンパ球による産生を引き起こす。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化することができる。免疫化に続いて、リンパ球を単離して、ポリエチレングリコールなどを用いて適切な骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマ細胞を形成してから、融合されていないリンパ球および骨髄腫細胞から選択することができる。免疫沈降、イムノブロッティング、またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定される、選択抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、それから、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）を用いてインビトロ培養で、または動物での腹水腫瘍としてインビボでのいずれかで、増殖することができる。モノクローナル抗体は、それから、上記にポリクローナル抗体に関して記載のように、培養培地または腹水液から精製することができる。

あるいはモノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組み換えＤＮＡ法を用いて作成することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞などから、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲなどにより単離され、そして、それらの配列は従来法を用いて決定される。重鎖および軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドはそれから、適切な発現ベクターにクローニングされて、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞にトランスフェクトされると、モノクローナル抗体は宿主細胞により産生される。また、所望の種の組み換えモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、記載（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）のようにファージディスプレイライブラリーから単離することもできる。

モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（単数または複数）は、組み換えＤＮＡ技術を用いた多くの異なる方法でさらに修飾して、代替的な抗体を生産することができる。一実施態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、１）例えば、ヒト抗体のこれらの領域に置換してキメラ抗体を産生する、または２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換して融合抗体を産生することができる。他の実施態様では、定常領域をトランケートまたは除去して、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを産生する。さらに、可変領域の部位特異的または高密度の突然変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。

本発明の一部の実施態様では、ニューログラニンに対するモノクローナル抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、可変領域内に、非ヒト（例えばミューリン）抗体由来の最小限の配列を含む抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的に、最小限の非ヒト配列を有するヒト抗体である。ヒト抗体は、ヒトにより産生される抗体またはヒトにより産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。

ヒト化抗体は、当技術分野で知られている様々な技術を用いて生産することができる。抗体は、ヒト抗体のＣＤＲを、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）のものと置換することにより、ヒト化することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）。ヒト化抗体は、Ｆｖフレームワーク領域内および／または置換された非ヒト残基内のいずれかを、さらなる残基の置換によりさらに修飾して、抗体の特異性、親和性、および／または能力を高めて、そして最適化することができる。

ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技術を用いて、直接調製することができる。インビトロで免疫化された、または免疫化個体から単離された、標的抗原に対する抗体を産生する不死化ヒトＢリンパ球を生産することができる（例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照）。また、ヒト抗体は、ファージライブラリーがヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択することができる（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ，９５：６１５７−６１６２；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１）。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウス内で作成することもでき、内因性の免疫グロブリン産生の不存在下で、免疫化の際にヒト抗体の全レパートリーを産生することが可能である。この方法は、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号に記載されている。

本発明の特定の実施態様では、無傷の抗体よりむしろ、抗体フラグメントを用いる方が望ましくあり得る。抗体フラグメントの生産に関して、様々な技術が知られている。伝統的には、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク質分解により得られる（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１）。しかしながら、これらのフラグメントは、現在では典型的に、上述のように組み換え宿主細胞により直接生産される。したがって、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ抗体フラグメントは全て、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞で発現されて分泌することができ、したがって、これらのフラグメントの大量生産が可能である。あるいは、そのような抗体フラグメントは、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。抗体フラグメントはまた、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載の線状抗体であってよく、単一特異性または二重特異性であってよい。抗体フラグメントの生産に関する他の技術は明らかであろう。

本発明は、本明細書に記載の、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体、またはそれらの抗体フラグメントと実質的に相同の変異体および同等物をさらに含む。これらは、例えば保存的置換変異、すなわち、類似アミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸の置換を含み得る。例えば、保存的置換とは、例えば、１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸で、１つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸で、または１つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸により置換されるように、アミノ酸が、同一の一般的な分類内の別のアミノ酸で置換されることを指す。保存的アミノ酸置換により意図されることは、当技術分野でよく知られている。

本発明はさらに、１つまたは複数の抗体を含む、製造キットおよび製品を提供する。特定の実施態様では、そのキットは、少なくとも２つの抗体を含む。特定の実施態様では、そのキットは、ニューログラニンタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。

ＩＶ．ニューログラニンおよび他のバイオマーカーの検出
Ａ．質量分析による検出
一態様では、本発明のバイオマーカーは、質量分析計を用いて気相イオンを検出する方法である質量分析により検出され得る。質量分析計の例は、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電セクタ分析機器、前述の複合型または組み合わせなどである。特定の実施態様では、質量分析方法は、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を含む。別の実施態様では、方法はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦタンデム質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ）を含む。さらに別の実施態様では、質量分析は、当技術分野における通常の知識を有する者により検討され得る別の適切な方法（単数または複数）と組み合わせることができる。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを、本明細書に記載のようにトリプシン消化およびタンデム質量分析とともに使用することができる。別の実施態様では、質量分析技術は、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）または定量ＭＲＭである。

代替の実施態様では、質量分析技術は、例えば、米国特許第６，２２５，０４７号および第５，７１９，０６０号に記載の表面エンハンス型レーザー脱離イオン化または「ＳＥＬＤＩ」を含む。手短には、ＳＥＬＤＩは、脱離／イオン化気相イオン分光分析（例えば質量分析）の方法を指し、分析物（ここでは、１つまたは複数のバイオマーカー）は、ＳＥＬＤＩ質量分析プローブの表面上に捕捉される。使用がされ得る様々なバージョンのＳＥＬＤＩが存在し、制限されないが、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＳＥＡＣ）とも呼ばれる）、および、プローブ表面に化学的に結合されたエネルギー吸収分子を含むプローブ（ＳＥＮＤプローブ）の使用を含むＳｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｎｅａｔ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ（ＳＥＮＤ）が含まれる。別のＳＥＬＤＩ方法は、Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（ＳＥＰＡＲ）と呼ばれ、表面に結合された部分を有するプローブの使用を含み、それは分析物に共有結合することができ、そして、光、例えば、レーザー光への曝露後に、その部分での感光性の結合を切断することにより、その分析物を放出する（米国特許第５，７１９，０６０号参照）。ＳＥＰＡＲおよび他の形態のＳＥＬＤＩは、本発明に従って、バイオマーカーまたはバイオマーカーパネルの検出に容易に適用される。

別の質量分析方法では、バイオマーカーは、このバイオマーカーを結合するクロマトグラフィー特性を有するクロマトグラフィー樹脂上に最初に捕捉され得る。例えば、ＣＭ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂などのカチオン交換樹脂上にバイオマーカーを捕捉して、樹脂を洗浄して、バイオマーカーを溶出してＭＡＬＤＩにより検出することができる。あるいは、この方法は、カチオン交換樹脂への適用の前に、アニオン交換樹脂上でサンプルの分画を先に行うことができる。別の代替では、アニオン交換樹脂上で分画して、ＭＡＬＤＩにより直接検出することができる。さらに別の方法では、このバイオマーカーを結合する抗体を含むイムノクロマトグラフィー樹脂上にバイオマーカーを捕捉して、樹脂を洗浄して、結合していない物質を除去して、樹脂からバイオマーカーを溶出して、ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩによって溶出バイオマーカーを検出することができる。

Ｂ．イムノアッセイによる検出
他の実施態様では、本発明のバイオマーカーは、イムノアッセイにより検出および／または測定することができる。イムノアッセイは、バイオマーカーを捕捉するための、抗体のような生体特異性の捕捉試薬を必要とする。多くの抗体が市販されている。抗体はまた、当技術分野でよく知られている方法によって、例えば、バイオマーカーで動物を免疫化することによって生産することもできる。バイオマーカーは、その結合特性に基づいてサンプルから単離することができる。あるいは、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列が公知ならば、そのポリペプチドを合成して用い、当技術分野でよく知られている方法により抗体を生産することができる。

本発明は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは蛍光に基づくイムノアッセイを含むサンドイッチイムノアッセイ、イムノブロット、ウエスタンブロット（ＷＢ）、および他の酵素イムノアッセイを含む、伝統的なイムノアッセイを企図する。ネフェロメトリ―は液相内で行われる分析であり、抗体は溶液中に存在する。抗体への抗原の結合は吸光度の変化をもたらし、それが測定される。ＳＥＬＤＩに基づくイムノアッセイでは、バイオマーカーに関する生体特異性の捕捉試薬は、ＭＳプローブの表面、例えば、事前に活性化されたタンパク質チップアレイに結合される。それから、バイオマーカーは、この試薬を介してバイオチップ上に特異的に捕捉されて、捕捉されたバイオマーカーは質量分析により検出される。

抗体は、その広範囲の特性のため有用であるが、本発明のバイオマーカーに特異的に結合する任意の他の適切な物質（例えば、ペプチド、アプタマー、または有機小分子）が、場合により、上述のイムノアッセイでの抗体の代わりに使われる。例えば、ニューログラニン全部および／または１つまたは複数のその分解産物に特異的に結合するアプタマーを用いてよい。アプタマーは、特異的なリガンドに結合する核酸ベースの分子である。特定の結合特異性を有するアプタマーを作製するための方法は、米国特許第５，４７５，０９６号；第５，６７０，６３７号；第５，６９６，２４９号；第５，２７０，１６３号；第５，７０７，７９６号；第５，５９５，８７７号；第５，６６０，９８５号；第５，５６７，５８８号；第５，６８３，８６７号；第５，６３７，４５９号；および第６，０１１，０２０号に記載されるように公知である。

Ｃ．電気化学発光アッセイによる検出
様々な実施態様において、本発明のバイオマーカーは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｒｂｕｒｇ，ＭＤ）により開発された電気化学発光アッセイを用いて検出してよい。電気化学発光の検出は、電気化学的に刺激されると発光するラベルを用いる。刺激のメカニズム（電気）がシグナル（光）から切り離されているため、バックグラウンドシグナルは最小限である。ラベルは安定で非放射性であり、便利な結合化学（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）の選択を提供する。それらは約６２０ｎｍで発光し、消色の問題をなくす。米国特許第７，４９７，９９７号；第７，４９１，５４０号；第７，２８８，４１０号；第７，０３６，９４６号；第７，０５２，８６１号；第６，９７７，７２２号；第６，９１９，１７３号；第６，６７３，５３３号；第６，４１３，７８３号；第６，３６２，０１１号；第６，３１９，６７０号；第６，２０７，３６９号；第６，１４０，０４５号；第６，０９０，５４５号；および第５，８６６，４３４号を参照。また、米国特許出願公開第２００９／０１７０１２１号；第２００９／００６３３９号；第２００９／００６５３５７号；第２００６／０１７２３４０号；第２００６／００１９３１９号；第２００５／０１４２０３３号；第２００５／００５２６４６号；第２００４／００２２６７７号；第２００３／０１２４５７２号；第２００３／０１１３７１３号；第２００３／０００３４６０号；第２００２／０１３７２３４号；第２００２／００８６３３５号；および第２００１／００２１５３４号も参照。

Ｄ．バイオマーカーを検出するための他の方法
本発明のバイオマーカーは、他の適切な方法により検出することができる。この目的を達成するために用いることができる検出方法論は、光学的方法、電気化学的方法（ボルタメトリーおよびアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡、および無線周波数方法、例えば、多極性共鳴分光法を含む。光学的方法の具体例は、共焦点および非共焦点の両方の顕微鏡に加えて、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、格子結合導波管法（ｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｒ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）または干渉法）である。

さらに、サンプルはまた、バイオチップを用いて分析してもよい。バイオチップは通常、固体基板を含み、一般に平面表面を有し、捕捉試薬（吸着剤またはアフィニティ試薬とも呼ばれる）がそれに結合している。しばしば、バイオチップの表面は複数のアドレス可能な場所を含み、そのそれぞれが、そこに結合された捕捉試薬を有する。タンパク質バイオチップは、ポリペプチドの捕捉に適したバイオチップである。多くのタンパク質バイオチップが当技術分野で説明されている。これらは、例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｇ，ＣＡ）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＰｒｏｃｏｇｎｉａ（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により生産されるタンパク質バイオチップを含む。そのようなタンパク質バイオチップの例は、以下の特許または公開特許出願：米国特許第６，５３７，７４９号；米国特許第６，３２９，２０９号；米国特許第６，２２５，０４７号；米国特許第５，２４２，８２８号；ＰＣＴ国際公開ＷＯ００／５６９３４；およびＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０４８７６８に記載されている。

Ｖ．ニューログラニンおよび他の脳損傷バイオマーカーの検出のためのキット
別の態様では、本発明は、脳損傷の状態を認定するためのキットを提供し、そのキットは、ニューログラニンおよび他のバイオマーカーを検出するために用いられる。特定の実施態様では、そのキットは、ニューログラニンに対する抗体を含むＥＬＩＳＡキットとして提供される。他の実施態様では、キットは、ＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３の１つまたは複数に対する抗体を含み得る。

ＥＬＩＳＡキットは、固体支持体、例えば、チップ、マイクロタイタープレート（例えば９６ウェルプレート）、ビーズ、またはバイオマーカー捕捉試薬が結合した樹脂を含んでよい。キットはさらに、バイオマーカーを検出するための手段、例えば、抗体、および、二次抗体−シグナル複合体、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート型ヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体およびＨＲＰの基質としてのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含んでよい。

他の実施態様では、脳損傷の状態を認定するためのキットは、抗体が固定化された膜を含むイムノクロマトグラフィーストリップとして、および、例えば金粒子結合抗体を検出するための手段として提供され得て、ここで膜はＮＣ膜およびＰＶＤＦ膜を含む。キットは、サンプルアプリケーションパッド、ガラス繊維フィルター上に一時的に固定化された金粒子結合抗体、抗体バンドおよび二次抗体バンドが固定化されたニトロセルロース膜、および吸収剤パッドが、血清の連続的な毛管流を維持するために、その上に連続して配置されるプラスチックプレートを含んでもよい。

特定の実施態様では、患者は、患者由来の血液または血清をキットに添加して、抗体と特異的に結合される関連バイオマーカーを検出することにより、具体的には、（ｉ）患者から血液または血清を回収するステップ；（ｉｉ）患者の血液から血清を分離するステップ；（ｉｉｉ）患者由来の血清を診断キットに添加するステップ；および、（ｉｖ）抗体と結合するバイオマーカーを検出するステップを含む方法により、診断することができる。この方法では、抗体は、患者の血液と接触させられる。サンプル中にバイオマーカーが存在すれば、抗体は、サンプル、またはその一部に結合する。他のキットおよび診断の実施態様では、血液または血清は、患者から回収する必要はない（すなわち、すでに回収されている）。さらに、他の実施態様では、サンプルは、組織サンプルまたは臨床サンプルを含んでよい。

キットはまた、洗浄液または洗浄液を作るための説明書も含むことができ、捕捉試薬と洗浄液の組み合わせは、例えば抗体または質量分析による後の検出のための、固体支持体上のバイオマーカーの捕捉を可能にする。さらなる実施態様では、キットは、ラベルまたは別個の挿入物の形態で適切な操作パラメーターに関する説明書を含むことができる。例えば、説明書は、サンプル回収の仕方、プローブの洗浄の仕方、または検出すべき特定のバイオマーカーなどについて、消費者に情報を提供し得る。さらに別の実施態様では、キットは、キャリブレーション用のスタンダード（単数または複数）として用いられるバイオマーカーサンプルを有する１つまたは複数の容器を含むことができる。

さらなる苦労なく、当業者は上述の説明を用いて、本発明を最大限に利用することができることが確信される。以下の実施例は説明のためのみであって、いかなる場合においても開示の残部を限定しない。

以下の実施例は、本明細書および特許請求の範囲に記載の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が、どのように作製および評価されるかについて、完全な開示および説明を、当技術分野における通常の知識を有する者に提供するために提示され、純粋に説明を目的とし、発明者らが彼らの発明だと考える範囲を限定することを意図しない。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証する努力をしているが、いくらかの誤差および偏差が本明細書で考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度はセ氏温度または周囲温度であり、そして圧力は大気圧または大気圧付近である。反応条件、例えば、構成要素の濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、および、記載の方法から得られる産物の純度および収率を最適化するために用いることができる他の反応範囲および条件の、非常に多くのバリエーションおよび組み合わせがある。合理的で日常的な実験のみが、そのような方法の条件を最適化するために必要とされる。

（実施例１）ニューログラニンのアッセイの開発
ヒトＮＲＧＮ特異的アプタマーの同定。Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）の方法を用いて、ヒトＮＲＧＮ特異的アプタマーを同定した。手短には、特異的アプタマーは、フィルター固定化により、一本鎖ＲＮＡのプールから選択した。ＲＮＡ−ＮＲＧＮ標的複合体は、ニトロセルロースフィルターに結合することができ、フリーのＲＮＡは濾過を通過した。特異的アプタマーをフィルターから回収してＰＣＲ増幅した。数回もの選択後、ＮＲＧＮと最も高い親和力を有する特異的アプタマーを富化して配列同定した。

選択のためにライブラリーを調製する。一本鎖ＤＮＡオリゴプールを、化学的に合成した。ＤＮＡオリゴは、２つの定常配列が隣接した４０ｍｅｒのランダムなセントラルコアを有し、ライブラリーは、ライブラリーの５’および３’保存末端を標的とするプライマーペアにより増幅することができる。ライブラリーの配列は、５’−ＴＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＴＣＧＴＣＴＧ（Ｎ４０）ＣＣＧＣＡＴＣＧＴＣＣＴＣＣＣＴＡ−３’（配列番号１）である。

ＲＮＡライブラリーの生産。一本鎖ＤＮＡライブラリーは、インビトロ転写のためのＴ７プロモーターを含んで配列が５’−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧ−３’（配列番号２）である、Ｓｅｌ２ ５’プライマーで最初にアニールさせた。ギャップは、３７℃で１．５時間のＫｌｅｎｏｗ反応により埋めた。反応を、フェノール：クロロホルム：イソアミル（２５：２４：１）およびクロロホルム：イソアミル（２４：１）のそれぞれ一回抽出により精製し、さらに、４℃にてセントリコン３０で濃縮した。濃縮行程中に、ｐＨ７．４のＴＥバッファーを用いて反応を２回洗浄した。最終ＯＤ２６０を測定して濃度を決定した。

上記のアニールオリゴプールを用いて、メーカーの反応条件に従ってＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，ＤＳ０１０９１０）を用いたインビトロ転写により、ＳＥＬＥＸのためのＲＮＡライブラリーを作成した。２’−フッ素−ＣＴＰ（２’−Ｆ−ｄＣＴＰ）および２’−フッ素−ＵＴＰ（２’−Ｆ−ｄＵＴＰ）を用いて転写反応でＣＴＰおよびＵＴＰを置換した。最終のＤｕｒａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡ（２’−フッ素−修飾ＲＮＡ）はＲＮａｓｅＡに完全に耐性である。インビトロ転写後、ＤＮａｓｅＩを用いて反応を処理し、フェノール：クロロホルム：イソアミル（２５：２４：１）およびクロロホルムそれぞれ１回でＲＮＡを抽出して、続けて濃縮し、４℃にてセントリコン３０で脱塩した。

変性ＰＡＧＥ（１２％、７Ｍ尿素）ゲル精製によりＲＮＡをさらに精製した。ＲＮＡバンドをＰＡＧＥゲルから切り取り、４℃にて一晩、ＲＮＡを２ｍｌのＴＥバッファー中に溶出した。再びセントリコン３０を用いて純粋なＲＮＡを濃縮し、従来の方法を用いてＲＮＡ濃度を決定した。

ニトロセルロースフィルターの事前洗浄。１３ｍｍのＳｗｉｎ−Ｌｏｋフィルターホルダー（Ｗｈａｔｍａｎ）（直径１３ｍｍ）、０．４５μｍのポアサイズのＨＡＷＰニトロセルロースディスクフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を組み立てた。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む、１ｍｌ洗浄バッファーで、フィルターを事前に湿らせた。５００ｐｍｏｌのＲＮＡを、１００μｌの１×結合バッファー（組成は、０．１％ＢＳＡを加えた以外、洗浄バッファーと同じ）中に希釈して、フィルターホルダーの容器内にアプライした。フィルターホルダーを５０ｍｌ円錐管中に密封して、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍｌシリンジを用いてフィルターユニットを通すことによりＲＮＡを回収し、１００μｌの１×結合バッファーを用いて一度洗浄した。フィルターを通ったＲＮＡを回収した；事前に浄化されたＲＮＡの全量は約１８０μｌであった。

結合反応。５０ｐｍｏｌのヒトＮＲＧＮタンパク質を、事前に浄化されたＲＮＡに、ＲＮＡ：タンパク質の分子比を約１０：１で添加することにより、結合反応を構築した。全量は１×結合バッファー中、２００μｌであった。反応は、３７℃で１５分間インキュベートした。新しいフィルターホルダーを組み立てて、上記のように事前に湿らせて、フィルターに対する結合反応を適用して、５ｍｌシリンジを用いて結合サンプルを押し通して、５ｍｌの洗浄バッファーでフィルターを洗浄した。

選択ＲＮＡを回収する。フィルターホルダーを解体して、６００μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミル（２５：２４：１）を含む１．５ｍｌ遠心分離菅内へフィルターを移した。チューブをおよそ１分間激しくボルテックスし、それから、ＲＴで３０分間インキュベートした。２００μｌのＨ_２Ｏを加えて再度ボルテックスし、それから、１４，０００ｒｐｍで１０分間、回転させた。回収ＲＮＡを含む上清を４００μｌのクロロホルムで一度抽出して、それから、５００μｌのエタノール、２０μｌの３Ｍ ＮａＡｃｅｔａｔｅ（ｐＨ ５．２）および３μｌのＧｌｙｃｏｇｅｎ ｂｌｕｅ（Ａｍｂｉｏｎ，５ｍｇ／ｍｌ）を加えることにより沈殿させて、それから、−８０℃で一晩インキュベートした。４℃で２０分間、１４０００ｒｐｍでの遠心分離によりＲＮＡを回収し、それから、１ｍｌの７５％エタノールで一度洗浄し、遠心分離およびＲＮＡの風乾を続けた。乾燥ＲＮＡペレットを、２０μｌのＨ_２Ｏ中に溶解させた。

ＲＴ−ＰＣＲによって、選択ＲＮＡを増幅する。５ｍｌの回収ＲＮＡを用いてＤＮＡの第一鎖を合成した。２μＭのプライマーＳｅｌ２ ３’を反応に加えた。Ｓｅｌ２ ３’プライマーの配列は：５’−ＴＣＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＣ−３’（配列番号３）である。Ｒｏｃｈｅからの逆転写酵素（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０ １０９ １１８ ００１）を、メーカーにより推奨される条件で反応に用いた。

ＰＣＲ反応は以下のように構築した：５μｌの第一鎖ＤＮＡ（上記のステップによる）、３μｌの各１０μＭプライマー（上記ステップによるＳｅｌ２ ３’および上記ステップによるＳｅｌ２ ５’）、３９μｌのＨ_２Ｏおよび５０μｌの２×ＴｏｐＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）。全部で８反応（８００μｌ）を行なった。ＰＣＲサイクルの条件は以下であった：９４℃／５分−−>（９４℃／３０秒−−>５５℃／３０秒−−>７２℃／３０秒）×２０サイクル−−>４℃。３％アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を確認して、ＰＣＲ産物の残りを脱塩して、４℃でセントリコン３０を用いて濃縮した。ＯＤ／２６０ｎｍを測定することにより、ＰＣＲ産物の濃度を決定した。

選択を反復する。上述のようにインビトロ転写のプロトコルに従って、１μｇの濃縮ＰＣＲ産物を用いて、次ラウンドの選択のためのＲＮＡを生産した。全部で１０回の選択を行なった。

１０ラウンドの選択後、高塩結合バッファーを用いて別の３ラウンドの選択を行なって選択ストリンジェンシーを高めた。１×結合バッファーＦおよび洗浄バッファーＦの組成は、ＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭに増加した以外は、上述のバッファーと同一である。他の詳細の方法は上述のものと同一である。

１３ラウンドの選択後の最終ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングして、ＤＮＡシーケンシングにより富化アプタマーを同定した。ＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブサイトでのＣｌｕｓｔａｌＷ２を用いて、プライマー全長および４０ｍｅｒのインサートを含むクローンをアライニングした。

同定された、ヒトＮＲＧＮ特異的アプタマー。６つのクローンをシーケンシング用に選択し、全ての配列の質は非常に高かった。ＤＮＡアライメント解析後、６つのクローンのうちの５つは、ＮＲＧＮ−Ａ４が１ヌクレオチドの違い（下線）を有する以外、ほぼ同一であった。他の良くアライニングされた５つのクローンと比較してあまり似ていないものはＮＲＧＮ−Ａ６であり、それらの全てが、ＣＣ／ＣＡ（四角で囲った）により隔てられた２Ｔ−リッチのモチーフを有することを示した。ＮＲＧＮ−Ａ１とＮＲＧＮ−Ａ６を、検証のための標的として選択した。以下にアプタマーのアライメントを示した：

(配列番号4)
(配列番号4)
(配列番号4)
(配列番号4)
(配列番号5)
(配列番号6)

アプタマー−ＮＲＧＮ相互作用の検証。ＲＮＡの３’末端にビオチンリンカーを付加して、同定された配列に基づいてＮＲＧＮ−Ａ１およびＮＲＧＮ−Ａ６ ＲＮＡを化学的に合成した。２つの異なるストラテジーを用いて、ＮＲＧＮアプタマーとＮＲＧＮ組み換えタンパク質の相互作用を試験した。詳細を以下に示す。

ドットブロットを用いて、ニトロセルロース上のＲＮＡタンパク質複合体を検出する。ＳＥＬＥＸ方法で使用したものと同一のメカニズムに基づいて、ＲＮＡ−タンパク質複合体をニトロセルロース膜上に保持することができ、ドットブロットを用いてビオチンラベル化ＲＮＡアプタマーを検出した。最初に、１０ｐｍｏｌ〜０の範囲のタンパク質量で、２倍希釈系列のＨｉｓ−ＮＲＧＮ組み換えタンパク質を作製し；それから、各サンプルを１ｐｍｏｌのＮＲＧＮアプタマーＲＮＡと混合した。最終の結合反応液の容量を、１×結合バッファーＦ中２０μｌに維持し、３７℃で１５分間、反応をインキュベートした。

その間、ドットブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃１７０−６５４５）をセットアップした。ニトロセルロース膜を切断して、使用前に、１×洗浄バッファーＦ中で３０分間振とうさせた。ニトロセルロース膜を、事前に湿らせたワットマン紙の上部に置いて、装置の底部に設置し、それからバキュームを組み立てて取り付けた。ウェルあたり１００μｌの１×洗浄バッファーＦで膜を１回洗浄して、それから、結合反応液をアプライした。反応液が通過後、２００μｌの１×洗浄バッファーＦで膜を１回洗浄して、それから吸引により排水した。それから膜をＵＶクロスリンクした（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃１６５−５０３１）。

化学発光核酸検出モジュール（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ，＃８９８８０）を用いて、メーカーの説明書に従って、ニトロセルロース上に保持されたビオチンラベル化ＲＮＡアプタマーを検出した。手短には、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートとともに膜をインキュベートして、ＨＲＰの化学発光基質で検出した。

結果として、ＮＲＧＮ−Ａ１とＡ６の両方のＮＲＧＮアプタマーがＮＲＧＮタンパク質に結合して、この方法を用いた検出に必要な最少タンパク質量は、それぞれ１．２５ｐｍｏｌおよび０．６３ｐｍｏｌであった。コントロールとして同モルのヒトアルブミンを使用した場合は、使用したアルブミンの量にかかわらずシグナルが検出できなかった。この結果は、これらの２つのアプタマーの両方が、Ｈｉｓ−ＮＲＧＮタンパク質に特異的に結合することを示した。図１参照。

プルダウンアッセイ。ビオチンラベル化アプタマーをストレプトアビジン粒子上に固定化して、プルダウンアッセイを行なった。ＴＥＮ１００バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に、アプタマーを１ｐｍｏｌ／μｌに希釈して、６５℃で５分間加熱し、それから、ＲＴで２０分間放置して、ＲＮＡをその天然コンフォメーションにフォールディングさせた。ストレプトアビジン磁性粒子（Ｒｏｃｈｅ，１１６４１７７８００１）を、２倍量のＴＥＮ１００バッファーで３回洗浄し、それから、アプタマーサンプルを加えて、ＲＴで３０分間、回転させながらインキュベートした。インキュベーション後、粒子をＴＥＮ１００バッファーで３回洗浄して、それから、１×結合バッファーＦで１回平衡化した。異なる量のＮＲＧＮタンパク質（０〜２ｎｍｏｌ）を１×結合バッファー中に希釈し、アプタマー固定化磁性粒子中に添加して、それから３７℃で１５分間インキュベートした。

結合インキュベーションの後、粒子をＴＥＮ１００バッファーで２回洗浄した。室温で１０分間、２６μｌの溶出バッファー（１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中でインキュベートすることにより、アプタマータンパク質複合体を解離させた。溶出タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質バンドをクーマシー染色により可視化した。ヒトアルブミンタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。典型的な染色ゲルを図２に示す。

ドットブロットとプルダウンアッセイの両方が、アプタマーがヒトＮＲＧＮ組み換えタンパク質に特異的に結合することを示した。

ニューログラニンのマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）アッセイの開発。質量分析定量ＭＲＭアッセイのために、ニューログラニンシグネチャペプチドを開発した。ペプチド配列およびトランジションを以下の表に示す。ラベル化ＧＰＧＰＧＧＰＧＧＡＧＶＡＲ（配列番号７）をサンプル中に入れて、シグネチャペプチドＧＰＧＰＧＧＰＧＧＡＧＶＡＲ（配列番号７）の濃度を測定するための検量線を作成した。トリプシン消化に切断ミスがないことを確実にするために、ペプチドＫＧＰＧＰＧＧＰＧＧＡＧＶＡＲ（配列番号８）もモニターする。

ＡＢＩ Ｓｃｉｅｘ Ｑｔｒａｐ ４０００三重四極質量分析計を用いた、ニューログラニンシグネチャペプチドとラベル化スタンダードペプチドのシグナルを図３に示す。

Ｈｉｓ−ＮＲＧＮ組み換えタンパク質の生産。ヒトＮＲＧＮ ｃＤＮＡクローンは、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＣ２０１２０９）から購入した。制限酵素（Ｓｇｆ Ｉ＋Ｍｌｕ Ｉ）フラグメントスワッピングにより、デスティネーションベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ，ｐＥＸ−Ｎ−Ｈｉｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＳ１０００３０）にコーディング配列をクローン化して、ｐＥＸ−Ｎ−Ｈｉｓ−ＮＲＧＮ発現プラスミドを作製した。コーディング配列およびリーディングフレームを、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。

ｐＥＸ−Ｎ−Ｈｉｓ−ＮＲＧＮプラスミドを、Ｒｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ ＃７１３９７）に、メーカーの説明書に従って形質転換した。細菌を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ ＃７１４９１）中で、３７℃で１６〜１８時間培養してから採集して、ＴＥＮバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ ＮａＣｌ）中に懸濁した。１％ ＮＰ−４０、２５ｍｇリゾチームおよびコンプリートプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を添加して３０分間氷上に置いて細胞を溶解し、それから１回凍結融解した。溶解物を遠心分離により浄化して、それから、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を上清に添加し、４℃で１時間回転させた。洗浄バッファー（２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＫＣｌおよび０．５Ｍ ＮａＣｌ）でビーズを３回洗浄した。溶出バッファー（１００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ Ｋ_３ＰＯ_４および１６７ｍＭ ＮａＣｌ）中で、４℃で１０分間ビーズを回転させて、組み換えタンパク質をビーズから溶出させた。溶出タンパク質を３ＬのＰＢＳに対して一晩透析し、従来のタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を決定した。図４は、クーマシー染色後のＰＡＧＥゲル上の典型的なＨｉｓ−ＮＲＧＮを示し；Ｈｉｓ−ＮＲＧＮの予測分子量は８．５Ｋｄである。

ニューログラニンのモノクローナルの開発。ジョンズ・ホプキンスにて、上述の組み換えニューログラニンを用いて、モノクローナル抗体生産のためにマウスを免疫化した。３０のクローンをスクリーニングして、図５に示すダイレクトＥＬＩＳＡにおいて高希釈でニューログラニンに結合するクローン３０．５．２を同定した。

ニューログラニンに関するサンドイッチＥＬＩＳＡの開発。７５ｎｇ／ウェルの濃度でのニューログラニン抗−ヒトモノクローナル抗体（ジョンズ・ホプキンス）を捕捉抗体として用い、０．５μｇ／ｍｌの濃度でのニューログラニンに対するウサギポリクローナル（ジョンズ・ホプキンス）を検出として用いた。１μｇ／ｍｌの濃度でのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ウサギ抗体（ＭＳＤ Ｃａｔ＃Ｒ３２ＡＢ−１）を、１μｇ／ｍｌの濃度でラベル化レポーターとして用いた。ＧＳＴ＿ＮＲＧＮ組み換えタンパク質（ジョンズ・ホプキンス）を、２０ｎｇ／ｍｌの開始濃度で、その後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中での７倍希釈のために１：２で、スタンダードして用いた。ＰＢＳ／１％ＢＳＡをブランクとして用いた。このアッセイに関する検量線を図６に示す。

ニューログラニンは急性脳損傷のバイオマーカーである。心肺機能不全のための２７日間のＥＣＭＯサポートでの幼児由来の血清サンプルで、上述のニューログラニンサンドイッチアッセイを用いた。幼児は、通常の毎日の頭部超音波（ｎｏｒｍａｌ ｄａｉｌｙ ｈｅａｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄｓ）を受けて、死亡時には脳損傷を有していないと考えられた。検死解剖において、脳は、超音波では診断されなかった多発性皮質梗塞を有した。図８に示すように、ＥＣＭＯサポートの全コースの間、ＧＦＡＰレベルは変化しなかった。しかしながら、ニューログラニンレベルは、ＥＣＭＯサポートの１４日にわたって、ベースラインを越えて１５倍のピークまで増加した。ニューログラニンは灰白質であるので、神経マーカーは、白質損傷のマーカーＧＦＡＰよりも、皮質性灰白質損傷に感受性であった。これは、ニューログラニンは急性皮質性脳損傷の循環バイオマーカーであって、ＧＦＡＰと組み合わせて、脳に対する灰白質損傷から白質を区別することが可能であるという証拠を提供する。

（実施例２）脳タンパク質を同定するためのプロテオミクス研究は、鎌状赤血球症を有する子供におけるニューログラニンの上昇を明らかにする。
無症候性脳梗塞（ＳＣＩ）は、鎌状赤血球症での神経性損傷の最も一般的な形態である。それは、低下した神経認知機能、および、脳卒中および新規または進行性の病変を含む進行性の損傷に関する増加したリスクと関連する。ＳＣＩは、多重Ｔ２−強調型の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）上に見ることのできる任意の虚血性病変と定義され、局所神経障害を示唆する歴史または物理的試験と関連しない。これまでに、ＳＣＩに関する非侵襲で不偏の実験室試験は存在せず、ＳＣＩの危険性がある、ＳＣＤを有する子供を同定する能力は制限されたままである。さらに、ＳＣＩの診断はサーベイランスＭＲＩで行われ、コストがかかり、多くの機関で日常的には行われない。結果として、患者はしばしばＳＣＩ関連の障害を経験した後に診断される。

ＳＣＩのバイオマーカーとして使用できる血漿脳タンパク質の同定は、ＳＣＤを有する子供に関する検出および治療において重要な進歩を提供する。特に、これらの潜在的バイオマーカーは、ＳＣＩの危険性がある子供の同定に役立ち、早期診断のためにＭＲＩに対する費用効果的な代替を提供し、治療に対する反応のモニタリングを可能にする。重要なことには、ＳＣＩのバイオマーカーは、疾患に関与する病理学的メカニズムに対する識見を与える。質量分析（ＭＳ）に基づくプロテオミクス方法は、これらの潜在的バイオマーカーの同定、定量化および特性化に関するプラットフォームを提供する。

実際に、プロテオミクスは脳腫瘍、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、および脳卒中を含む多くの病状における脳タンパク質のバイオマーカー発見のために用いられている。また、質量分析に基づく方法は、ＳＣＤの病態生理学に対する識見を得るために用いられている。しかしながら、ＳＣＤにおける臨床バイオマーカー発見のために血漿プロテオミクスを用いた研究はほとんどなく、ＳＣＤおよび無症状の脳損傷に関して公表されたものはない。Ｋａｋｈｎｉａｓｈｖｉｌｉらは、二次元蛍光ディファレンスゲル電気泳動（２Ｄ ＤＩＧＥ）およびタンデムＭＳ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて赤血球（ＲＢＣ）膜プロテオームにおける量的変化を評価して、酸化ストレス後の修復に関与するタンパク質の増加について報告した。他は、表面エンハンス型レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）およびマトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）−ＴＯＦ ＭＳを用いて、肺高血圧症およびＳＣＤでの急性の痛みの発症のバイオマーカーに関して評価した。本研究の目的は、プロテオミクスを用いて、ＳＣＤを有する子供における血漿脳タンパク質を同定および確認することであった。本発明者らは、ＳＣＤおよびＳＣＩを有する子供が、脳損傷に関するサロゲートマーカーとして使用でき、疾患の病態生理学に対して識見を与える、循環する血漿脳タンパク質を有すると仮定した。

材料および方法
試験集団。試験集団は、３つのグループ：ＳＣＤおよびＳＣＩを有する子供、ＳＣＤを有しＳＣＩを有さない子供、および、ＳＣＤまたはＳＣＩを有さない健常で同年齢のコントロールから構成された。ＳＣＤおよびＳＣＩを有する７人の子供、および、ＳＣＩに関する危険因子の現在の知識に基づくＷＢＣ、年齢およびヘモグロビンが合致した、ＳＣＤを有するがＳＣＩを有さない６人の子供由来の血清を用いて、ならびに、６人の同年齢のアフリカ系アメリカ人コントロール（３人が鎌状赤血球形質［ＳＣＴ］を有する）について、プロテオミクス分析を行なった。ＳＣＤを有する合計１１５人の子供たち（６４人がＳＣＩを有し、５１人がＳＣＩを有さない）、および、４６人の同年齢のアフリカ系アメリカ人コントロール由来の横断的なの血漿サンプルを用いて、同定タンパク質の血漿濃度を測定した。

ＳＣＤを有する子供由来の血漿を、Ｓｉｌｅｎｔ Ｉｎｆａｒｃｔ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（ＳＩＴ）試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０００７２７６１）に登録されたものからランダムに抽出した。ＳＩＴ試験は、慢性の輸血が、５〜１４才のＳＣＤを有する子供において、脳卒中へのＳＣＩの進行を効果的に防ぐことができるかどうか決定するための、多施設での国際的な臨床試験である。急性または慢性の疾患（喘息、行動／気分障害、および肥満を除く）の証拠を有さない健常コントロールに関する血漿サンプルおよび臨床データを、２つの別々の治験審査委員会が承認した試験により得た。

サンプル調製。ＳＣＤを有する子供に由来するベースラインの定常状態の末梢全血を、初期スクリーニング時に、ＥＤＴＡバキュテイナチューブ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）内に採取し、室温で２４時間以内に、ジョンズ・ホプキンスのＳＩＴ Ｔｒｉａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙへ輸送した。到着時に、サンプルはプロトコルにより１５００ｇで８分間回転された；血漿を取り除いて、分析まで−８０℃で保管した。プロテオミクス分析に関して用いられる非ＳＣＤコントロールのための定常状態の末梢全血を、ＥＤＴＡバキュテイナチューブ内に採取して、１５００ｇ（４℃）で１２分間遠心分離して、それから分取して−８０℃で保管した。タンパク質候補を測定するために使用する健常コントロールのための血漿サンプルもまた、ＥＤＴＡバキュテイナチューブ内にアリコートして、ＳＩＴ試験プロトコルに従って処理した。

ヘモグロビンの欠乏。かなりの溶血が、ＳＣＤサンプルの発見において観察された。低含量のタンパク質を富化するために、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＳＣＤ血漿サンプル（ｎ＝１５）からヘモグロビンを欠乏させた。手短には、Ｎｉ−ＮＴＡビーズをＰＢＳ／０．３Ｍ ＮａＣＬで洗浄した後、５００μｌの５０％ニッケルビーズ（２５０μｌのＰＢＳ／０．３Ｍ ＮａＣｌ中、２５０μｌのビーズ）に５００μｌの血漿を添加して、４℃で２０分間回転させた。インキュベーションに続いて、遠心分離によりヘモグロビン欠乏サンプルからビーズを分離した。コントロールサンプルは、この欠乏ステップを行なわなかった。

タンパク質の定量化。クーマシーブルー色素タンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、タンパク質の定量化のために用いた。

タンパク質の富化および精製。ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＩｇＹ−１２ ＬＣ１０ カラムキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて、１２種の豊富な血漿タンパク質（アルブミン、ＩｇＧ、フィブリノゲン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＨＤＬ、アポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩ、ハプトグロビン、α１−アンチトリプシン、α１−酸糖タンパク質およびα２−マクログロブリン）の二次元分離および免疫親和性の喪失を、メーカーのプロトコルに従って行なった。ＰＦ ２Ｄプラットフォーム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）上で行われた４００μｇの富化プロテオームの三次元分離を、ＰＳ−ＨＰＲＰ ２Ｄ（４．６×３３ｍｍ）カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いて行なった。溶媒Ａは水中０．１％のＴＦＡであり、溶媒Ｂはアセトニトリル中０．０８％のＴＦＡであった。グラジエントは、１分で５〜１５％ Ｂ、２分で１５％〜２５％、２分で２５〜３１％、１０分で３１〜４１％、６分で４１〜４７％、４分で４７〜６７％、最後に３分で１００％ Ｂまで、１分間維持して、１分で５％まで戻して、流速１ｍＬ／分で行なった。結果として生じた３９のＲＰ−ＨＰＬＣ画分を、画分コレクターおよび９６ウェルプレートを用いて得た。ｓｐｅｅｄｖａｃシステムを用いて分画タンパク質を乾燥させて、ＭＳ／ＭＳ分析のためにトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で消化した。

タンパク質同定のためのＭＳ分析。以前に記載のように、オンラインｎａｎｏ−ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１２００ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を備えたＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で、タンデム（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の実験を行なった。ＬＴＱの生データを、非冗長のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ（ＩＰＩ）ペプチドデータベース（ヒト，３．１９）の、Ｘ！タンデムサーチ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ；ｖｅｒｓｉｏｎ ２００８．１２．０１）でＰＡＳＳ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて解析した。ペプチドの同定は、３５より大きなＭｏｗｓｅスコアに基づく確率論により、９５％より高い確率で実証でき、少なくとも２つのユニークな平均の同定スペクトルを含んだ場合に、承認された（ｐ<０．０５）。ペプチドの荷電状態における変化は、ユニークな同定とみなさなかった。ＣＤ−ＨＩＴで９０％配列相同性によりデータセットをフィルターした。

タンパク質、遺伝子、機能および臨床の関連性を、ＧｅｎｅＣａｒｄｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ）およびＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭ）を用いて調査し、検証した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ、Ｇｅｎｅｎｏｔｅ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉｇｅｎｅおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを再検討して、脳内で発現が増加したタンパク質を同定した。脳タンパク質の合成リストを作成し利用してＭＳデータをフィルターし、ＳＣＤを有するおよび有さない子供での脳タンパク質を同定した。

タンパク質は、ヒトの脳、肝臓、および、利用可能なマイクロアレイ、発現配列タグ（ＥＳＴ）および遺伝子発現の逐次分析法（ＳＡＧＥ）データにより評価された２６の他の正常ヒト組織での転写のそれらの相対的発現に基づいて、脳組織の特異性スコアが与えられた。具体的には、それぞれのタンパク質を、以下の基準に従ってスコアを付けた：マイクロアレイデータは、ベースラインを越えて１０倍より高い発現の増加を示し、ＥＳＴおよびＳＡＧＥデータは、２未満の他の組織での、そのタンパク質の存在を示す。タンパク質は、それぞれのカテゴリーに関して１または０のいずれかのスコアが付けられ、タンパク質が、マイクロアレイデータによって１０倍より高い発現の増加を有し、ＥＳＴおよびＳＡＧＥによって２未満の組織で見られた場合に、最大スコアの３を割り当てた。

ニューログラニンは、組織特異性を示し（脳組織特異性スコア＝３）、以前に脳損傷に関与し、同定された全脳タンパク質のうち最も高い全スペクトル数を有したので、検証に選択した。

Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）を用いて、ＭＳにより同定された存在度変化を有するタンパク質のパスウェイネットワークを解析した。タンパク質のアクセッションナンバーは、データを使用してＩｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイデータベースをナビゲートしてタンパク質間のネットワークを抽出するＩｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェア内に、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートファイルとしてアップロードされた。２よりも良好なスコアは、通常、有効なネットワークと考えられる。

イムノアッセイのプロトコルの開発。電気化学発光サンドイッチイムノアッセイが、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォーム（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてニューログラニンを測定するために開発された。実施例１に記載のモノクローナル抗−Ｎｒｇｎを、捕捉抗体（ａｂ）に用いた。ポリクローナル抗−Ｎｒｇｎ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）と抗−種Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の混合物を、検出に用いた。検量線は、１％ウシ血清アルブミン（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）中の精製ニューログラニンの段階希釈４０ｎｇ／ｍｌ〜０．０５５ｎｇ／ｍｌにより作製した。ニューログラニンを混ぜた血漿は、ウシ血清アルブミンで作成された検量線と比較して、１０ｎｇ／ｍＬで平均９９％の回収を示す。変動係数の２０％を超えない計算濃度での最低希釈として定義される定量化の下限は０．２ｎｇ／ｍＬであった。アッセイの特異性は、ＧＦＡＰ抗体を用いて試験した。

最終のニューログラニンアッセイのプロトコル。標準的な結合プレート（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１０００に希釈した３０μｌのモノクローナル抗−Ｎｒｇｎプールでコーティングした。プレートを一晩インキュベートしてから、各ウェルを５％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングして、室温で１時間、振とう（６００ｒｐｍ）しながらインキュベートした。４０ｎｇ／ｍｌのスタート濃度から、精製ニューログラニンを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：３に希釈した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて血漿サンプルを１：１に希釈してから、２５μｌのスタンダードおよび希釈サンプルをデュプリケートでプレートに加えた。振とうしながら２時間インキュベーション後、ＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）自動プレート洗浄機を用いて、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳ（洗浄バッファー）３００μｌ／ウェルでプレートを３回洗浄した。ポリクローナル抗−Ｎｒｇｎおよび抗−種Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：１０００に希釈して、１μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。続けて、２５μｌを各ウェルに添加し、各プレートを、３回洗浄する前に、振とうしながら１時間インキュベートした。それからプレートをＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。

組み換えニューログラニンタンパク質の生産。ニューログラニンｃＤＮＡを細菌発現ベクター内にクローニングして組み換えタンパク質を発現させるために、ＰＣＲクローニングストラテジーを用いた。ヒトニューログラニンｃＤＮＡ配列に基づいてプライマーを設計し、ＳｇｆＩ（フォワードプライマーでの）およびＭｌｕＩ（リバースプライマーでの）切断部位をそれぞれプライマー内に導入して、正しいリーディングフレームおよびクローニングの便宜を確保した。プライマーのための配列は：フォワード５’−ＧＡＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号９）およびリバース５’−ＧＣＧＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＴＣＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１０）である。ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとしてヒトニューログラニンｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ，ＲＣ２０１２０９）を用いた。ＰＣＲ産物をＳｇｆＩおよびＭｌｕＩで消化してゲル精製し、予め消化したベクターｐＥＸ−Ｎ−Ｈｉｓ−ＧＳＴ（Ｏｒｉｇｅｎｅ，ＰＳ１０００２８）およびｐＥＸ−Ｎ−Ｈｉｓ（Ｏｒｉｇｅｎｅ，ＰＳ１０００２９）のそれぞれにライゲーションした。ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８２６５０１７）を形質転換およびプラスミドＤＮＡ増殖に用いた。ポジティブクローンを制限酵素消化分析により同定し、ＤＮＡシーケンシングによりさらに確認した。それから、正しいニューログラニンｃＤＮＡを含む適正なプラスミドを用いて、タンパク質発現のためにＲｏｓｅｔｔａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）株を形質転換した。シングルポジティブのＲｏｓｅｔｔａクローンを、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ，＃７１４９１）で３７℃にて一晩培養した。Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ，＃３０６２２）を用いてＨｉｓ−Ｎｒｇｎタンパク質を精製し、グルタチオンスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，＃１６１０４）を用いてＨｉｓ−ＧＳＴ−Ｎｒｇｎタンパク質を精製した；全ての精製方法はメーカーの説明書に従った。組み換えタンパク質のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシー染色により可視化した；それから、タンパク質バンドを単離して、消化して質量分析により確認した。

モノクローナル抗体の生産。マウス抗−Ｎｒｇｎモノクローナル抗体は、ジョンズ・ホプキンス大学の神経科学科のＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＭＡＣＦ）で生産した。手短には、５匹の６週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を１００ｕｇのＨｉｓ−Ｎｒｇｎの腹腔内注射で免疫化して、同一経路で２１日にブーストした。それから、不完全フロイントアジュバント中の５０μｇのＨｉｓ−Ｎｒｇｎでマウスを２回皮下注射した。３回目の免疫化の後１０日に血液を採取した。Ｈｉｓ−ＧＳＴ−Ｎｒｇｎタンパク質を標的タンパク質として用いてダイレクトＥＬＩＳＡにより血清を試験した。ＥＬＩＳＡにおいて最も高い力価を有するマウスを、最後の静脈内ブーストに選択した。８９日にマウスを屠殺し、融合プロセスのために脾臓を取り出した。

ポリエチレングリコール（ＭＷ１５００，Ｓｉｇｍａ）を用いて、Ｐ３ｘ６５３．Ａｇ８マウス骨髄腫細胞を免疫化マウス由来の脾臓細胞と融合した。０．５ｍｌの不完全フロイントアジュバントで４日早く腹腔内に初回刺激を受けた正常ＢＡＬＡ／ｃマウスの腹膜から採取されたフィーダー細胞を含む９６ウェル組織培養プレート中に、融合細胞を散布した。選択培地（２０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ、補充の１×ＯＰＩ（Ｓｉｇｍａ）、１００μＭ ヒポキサンチン、０．４μＭ アミノプテリンおよび１６０μＭ チミジン）での１０日の静置培養後、上述のようにＥＬＩＳＡで上清を試験した。フィーダー細胞としての正常ＢＡＬＡ／ｃマウス由来の脾細胞上で、限界希釈によりポジティブコロニーを２回クローン化した。

１×ＯＰＩで補充された、１０％の定義済みＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ中で、クローン化ハイブリドーマ株（３０．５．２）を４〜６日間増殖した。それから、ハイブリドーマ細胞を血清フリー培地での増殖に適応させて、インビトロ系での抗体産生を可能にした。細胞が対数増殖期の時、２×１０^７細胞をインビトロ系に植え付けた。培養上清（抗体）を５日ごとに回収した。

統計。グループ間の臨床特性における違いを、不等分散での両側ｔ−検定を用いて評価した。ニューログラニンに関するグループ間の違いを、ノンパラメトリックなマンホイットニーのＵ検定を用いて比較した。クラスカル・ワリス検定を用いて、３グループ：ＳＣＩを有するＳＣＤ、ＳＣＩを有さないＳＣＤ、および健常コントロールにわたる血漿レベルの中央値を比較した。ニューログラニン濃度および他の変数間の相関を、ピアソンにより評価した。解析において、Ｐ値<０．０５を統計的に有意とした。統計解析はＳｔａｔａ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０（ＳｔａｔａＣｏｒｐ．Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）を用いて行なった。

結果
ＳＣＤを有する子供およびコントロールのベースライン特性。予想どおり、プロテオミクス解析に用いられた血漿サンプルの比較は、ＳＣＤを有する子供（ｎ＝１５）が、健常の非ＳＣＤ対照（ｎ＝６）と比較して有意に低いベースラインｈｂおよびヘマトクリット（ｈｃｔ）値を有することを示した（表１）。

ＷＢＣおよび網状赤血球数は、ＳＣＤを有する子供において、有意に、より高かった。表２は、プロテオミクス分析（ｎ＝７ ＳＣＩ、ｎ＝８ 非ＳＣＩ）およびニューログラニンの定量（ｎ＝６５ ＳＣＩ、ｎ＝５１ 非ＳＣＩ）に用いられた、ＳＣＩを有する、および有さない、ＳＣＤの子供に関するベースライン人口統計の情報を示す。ベースラインｈｂ、ＷＢＣ、血小板または網状赤血球数に有意差は無かった。ＳＣＩを有する患者は、ＳＣＩを有さないＳＣＤの子供と比較して、より高いレベルの総ビリルビンを有した。

ＳＣＤを有する子供の血漿プロテオーム特性。Ｈｂ除去、イムノアフィニティー分画、およびＨＰＬＣ分離の３連続の分離ステップを用いて、その後にタンデムＭＳおよびＩＰＩペプチドデータベースのＸ！タンデムサーチをして、ＳＣＩグループにおいて７５２のタンパク質を同定し、さらに３９０のタンパク質を非ＳＣＩグループにおいて同定し、ＳＣＤを有する子供の血漿プロテオーム内を循環する合計１１６２の固有タンパク質を同定した。健常コントロールにおいてさらに２３９のタンパク質を同定した（ｎ＝６３９ 非ＳＣＤの子供での総タンパク質）。ＳＣＤを有する子供において同定されたタンパク質の３０％（３４３／１１６２）がＳＣＩグループにおいて見られ、非ＳＣＤグループでは見られなかった。

ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイソフトウェアを用いた解析は、ＳＣＤおよび正常コントロールの両方で同定されたタンパク質が、多くの生物学的機能およびパスウェイ（細胞間シグナリングと細胞死、免疫細胞トラフィッキングおよび急性相反応シグナリングを含む）の顕著な過剰提示を示すことを明らかにした。神経疾患はＳＣＩおよび正常のグループでのトップ５の疾患にランクされたが、非ＳＣＩグループではそうではなかった。さらなる解析により、ＳＣＩグループのパスウェイに関与するタンパク質は、鎌状赤血球症、すなわち、虚血−再灌流障害、内皮障害、および、神経の損傷と死にすでに関与している、より特有の疾患過程に関与することが明らかになった。さらに、ＳＣＤおよびＳＣＩを有する子供では、神経性疾患に関連する特有の状態が正常コントロールとは異なり、タウオパシー（微小管結合タンパク質ｔａｕ、グリア線維酸性タンパク質）および脳アミロイド血管症（シスタチンＣ、ビメンチン）と関連するタンパク質はＳＣＩグループのみで見られた。加えて、神経突起の喪失はＳＣＩおよび正常グループの両方で見られたが、ＳＣＩグループのみが軸索の喪失と関係するタンパク質（微小管結合タンパク質ｔａｕ）を有し、細胞死に加えて神経損傷を示している。

脳タンパク質の同定。脳内でのタンパク質発現が増加したタンパク質のリストに対してＭＳデータをフィルターして、ＳＣＤを有する子供において見られる脳タンパク質の合成リストを作成した。この方法論を用いて、ＳＣＤを有する子供において合計２７の脳タンパク質を同定した（データ示さず）。これらのタンパク質のいずれも、非ＳＣＤコントロールにおいては同定されなかった。同定された脳タンパク質のうち、ニューログラニンは１０倍より高く脳での発現が増加していて、ＥＳＴおよびＳＡＧＥでは２未満の組織で発見された。それはまた、最も高い信頼性スコアおよび全スペクトル数を有した。

子供における血漿ニューログラニンレベル。シナプスの発達およびリモデリングに関与しているカルシウム感受性カルモジュリン結合性ニューロン特異的タンパク質であるニューログラニンは、ＳＣＩを有する、および有さない、ＳＣＤの子供において見出された。図９Ａに示すように、血漿ニューログラニンレベルの中央値は、非ＳＣＤコントロール（０．１２μｇ／ｍｌ）に比べて、ＳＣＤを有する子供において、有意に、より高かった（０．７２μｇ／ｍｌ）（Ｐ<．００１）。ＳＣＤを有する子供のうち、６３％のＳＣＩ（４０／６４）および非ＳＣＩ（３２／５１）の子供が、非ＳＣＤの値に関して９５^ｔｈパーセンタイルよりも上の、ニューログラニン値の中央値を有した（図９Ｂ）。ＳＣＩ（０．６９μｇ）と非ＳＣＩグループ（０．７３）との間に、ニューログラニンレベルの中央値における違いは無かった（Ｐ＝０．６、データ示さず）。ニューログラニンは、ＳＣＩに関する公知の危険因子、例えばｈｂ、ｈｃｔ、ＷＢＣ、血小板、および網状赤血球数、収縮期血圧およびｈｂ Ｆのパーセントと相関しなかった。

考察
ＳＣＤにおける無症状の脳損傷のバイオマーカーは、診断および分子標的治療の開発補助に必要であり、ならびに、疾患の反応をモニターするために必要である。プロテオミクスは、血漿のような複雑な混合物中のこれらの生化学的マーカーを発見する機会を提供する。しかしながら、ＳＣＤを有する子供における脳バイオマーカーの発見に関して実証された方法論は、以前に報告がされたことがない。プロテオミクスに基づく方法を用いて、ＳＣＤおよびＳＣＩを有する子供が、無症状の脳損傷と関連する、血漿プロテオームを循環する脳タンパク質を有するという仮説を試験した。一連の欠乏ステップのワークフローを用いて、続いてＲＰ−ＨＰＬＣによる分画およびＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計上でのラベルフリー定量化をして、１１６２のタンパク質を同定してＳＣＤを有する子供に特徴付けて、そのうち２７が脳内での高発現を有することが分かった。ニューログラニンを測定するために開発されたイムノアッセイを用いて、実験的な方法を検証した。

ＳＣＤを有する子供および同年齢の非ＳＣＤコントロールにおいてニューログラニンを測定して、ＳＣＤを有する子供は、有意に、より高い血漿レベルのニューログラニンを有することを見出した。実際に、６０％を超える、ＳＣＩを有するおよび有さないＳＣＤの子供は、非ＳＣＤコントロールにおいて観察されたニューログラニン値の９５^ｔｈパーセンタイルよりも高いニューログラニン値を有した。ニューログラニンは、ＳＣＤを有する子供において研究されたことはこれまでにない。実際に、これまでの研究は、神経分裂病およびアルツハイマー病を有する大人で主にされていて、ニューログラニンは学習および記憶における障害に関連付けられていた。ＳＣＤを有する子供における学力および記憶の神経認知障害がよく立証されている。兄弟姉妹および同年齢の同輩と比較すると、脳卒中を有するＳＣＤの学齢児童は、より多くの神経心理学的障害を有するようだったが、障害は、臨床的に軽度の疾患を有する患者でも見られた。ＳＣＤを有する子供における増加したニューログラニンのこれらの知見は、ＩＱにより測定されるように、これらの患者で見られる神経認知機能障害の病因と関連があり得る。既存の治療、例えば輸血およびヒドロキシ尿素が、ニューログラニンのレベルを調節するかどうか評価するためのさらなる研究は有益であり、そして、これらの治療が脳機能の維持を助けることができるか、または、もしかすると任意の機能喪失を覆しさえすることができるかどうか評価するための、測定可能な方法を提供し得る。

加えて、パスウェイ分析による結果は、ＳＣＤを有する子供は神経損傷および細胞死の危険性があることを裏付け、そして、タウオパシーおよび軸索喪失を含む損傷に関する特有のメカニズムを示唆する。分析は、脳卒中の公知のバイオマーカーである細胞内中間体線維タンパク質、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）が、ＳＣＤおよびＳＣＩを有する子供でのタウオパシーと関連することを示唆した。本発明者らは、ＧＦＡＰが、健常コントロールと比べてＳＣＤを有する患者において増加し、無症候性脳梗塞を含む虚血脳損傷と関連することを以前に示した。

要するに、本発明者らは、ＳＣＤを有する子供における、脳バイオマーカーの発見に関するプロテオミクスのワークフローを開発して検証した。本発明者らは、同年齢の非ＳＣＤコントロールと比較して、ＳＣＤを有する子供におけるニューログラニンの有意な増加を最初に報告し、そして、無症状の脳損傷の病態生理学に対するさらなる識見を提供する。まとめると、これらの知見は、ＳＣＤおよびＳＣＩを有する子供におけるバイオマーカーの発見のための臨床検査をサポートし、治療薬発見のための新規の潜在的な標的を提供する。

Claims (45)

1. 単離抗体またはそのフラグメントであって、
   ニューログラニンに特異的に結合する、
   単離抗体またはそのフラグメント。
2. 単離抗体またはそのフラグメントであって、
   配列番号４のアミノ酸１−７８に特異的に結合する、
   単離抗体またはそのフラグメント。
3. 単離抗体またはそのフラグメントであって、
   配列番号４のアミノ酸５５−７８に特異的に結合する、
   単離抗体またはそのフラグメント。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
   前記抗体またはそのフラグメントが、ポリクローナルであることを特徴とする、
   単離抗体またはそのフラグメント。
5. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
   前記抗体またはそのフラグメントが、モノクローナルであることを特徴とする、
   単離抗体またはそのフラグメント。
6. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
   前記抗体またはそのフラグメントが、哺乳類のものであることを特徴とする、
   単離抗体またはそのフラグメント。
7. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
   前記抗体またはそのフラグメントが、ヒトのものであることを特徴とする、
   単離抗体またはそのフラグメント。
8. ハイブリドーマ細胞であって、
   請求項５に記載の抗体またはそのフラグメントを産生する、
   ハイブリドーマ細胞。
9. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
   前記フラグメントは、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｖフラグメント；および単鎖フラグメントからなる群から選択されることを特徴とする、
   単離抗体またはそのフラグメント。
10. 請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
    抗体に結合した検出可能物質をさらに含むことを特徴とする、
    単離抗体またはそのフラグメント。
11. 請求項１０に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
    前記検出可能物質は、酵素；蛍光ラベル；ラジオアイソトープ；および化学発光ラベルからなる群から選択されることを特徴とする、
    単離抗体またはそのフラグメント。
12. 請求項１０に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
    ＥＬＩＳＡにおいてニューログラニンに特異的に結合することを特徴とする、
    単離抗体またはそのフラグメント。
13. 請求項１０に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
    競合結合アッセイにおいてニューログラニンに特異的に結合することを特徴とする、
    単離抗体またはそのフラグメント。
14. 請求項１０に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
    ラジオイムノアッセイにおいてニューログラニンに特異的に結合することを特徴とする、
    単離抗体またはそのフラグメント。
15. 請求項１０に記載の単離抗体またはそのフラグメントであって、
    蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイにおいてニューログラニンに特異的に結合することを特徴とする、
    単離抗体またはそのフラグメント。
16. ニューログラニンを検出するためのキットであって、以下：
    （ａ）請求項１から３のいずれか一項に記載の単離抗体；および
    （ｂ）ニューログラニンへの、単離抗体の結合を検出するための少なくとも１つの構成要素
    を含む、
    キット。
17. ニューログラニンで免疫化された動物から得られた単離抗体であって、
    前記抗体は、ニューログラニンの、抗原性エピトープを有するポリペプチドフラグメントに特異的に結合する、
    単離抗体。
18. モノクローナル抗体であって、
    ニューログラニンに特異的に結合する、３０．５．２と指定された、
    モノクローナル抗体。
19. 抗−ニューログラニンモノクローナル抗体であって、
    ３０．５．２と指定されたハイブリドーマにより産生される、
    抗−ニューログラニンモノクローナル抗体。
20. ポリヌクレオチドアプタマーであって、
    ニューログラニンに特異的に結合する、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
21. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    前記ニューログラニンが、ヒトニューログラニンであることを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
22. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    前記アプタマーは、約１０００ｎΜ未満のＫｄでニューログラニンに結合することを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
23. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    前記アプタマーは、約１００ｎＭ未満のＫｄでニューログラニンに結合することを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
24. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    前記アプタマーは、約２０ｎＭ未満のＫｄでニューログラニンに結合することを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
25. 請求項２０から２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    約１０〜約１００ヌクレオチドからなることを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
26. 請求項２５に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    約２０〜約８０ヌクレオチドからなることを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
27. 請求項２６に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    約３０〜約５０ヌクレオチドからなることを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
28. 請求項２０から２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    ＲＮＡアプタマーであることを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
29. 請求項２８に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントと少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
30. 請求項２９に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
31. 請求項３０に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
32. 請求項３１に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
33. 請求項３１に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    配列番号４−６のうちのいずれか１つまたはそれらの少なくとも１０個連続したヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列からなることを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
34. 請求項２０から３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間リンカーを含むことを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
35. 請求項２０から３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    少なくとも１つの末端ブロッカーを含むことを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
36. 請求項２０から３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドアプタマーであって、
    コンジュゲートに結合されていることを特徴とする、
    ポリヌクレオチドアプタマー。
37. ポリヌクレオチドであって、
    請求項２０から３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドアプタマーをコードする、
    ポリヌクレオチド。
38. ベクターであって、
    請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含む、
    ベクター。
39. 細胞であって、
    請求項２０から３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドアプタマーを含む、
    細胞。
40. 細胞であって、
    請求項２０から３６のいずれか一項に記載の、２以上の異なるポリヌクレオチドアプタマーを含む、
    細胞。
41. 細胞であって、
    請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含む、
    細胞。
42. 細胞であって、
    請求項３８に記載のベクターを含む、
    細胞。
43. 対象での、ニューログラニンと関連する疾患または障害を診断する方法であって、
    ニューログラニンを、請求項２０から３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドアプタマーと結合させ、ニューログラニンに結合したアプタマーの量を決定することにより、前記対象でのニューログラニンのレベルを測定するステップを含む、
    方法。
44. 請求項４３に記載の方法であって、
    前記結合は、対象から得られるサンプル内で生じることを特徴とする、
    方法。
45. サンプル中のニューログラニンの量を決定するための方法であって、
    三連四重極質量分析計およびマルチプルリアクションモニタリングを用いて、ニューログラニンに特異的なペプチドを検出するステップを含み、
    ここで、ニューログラニンに特異的な前記ペプチドは、配列番号７を含む、
    方法。