TWI465720B

TWI465720B - 預測神經發育、神經的或神經精神性病症治療之臨床效益之方法

Info

Publication number: TWI465720B
Application number: TW101130901A
Authority: TW
Inventors: Laurent Essioux; Carsten Horn; Johann Karl; Peter Kastner; Fabian Model; Giuseppe Palermo; Christina Rabe; Daniel Umbricht; Gabriel Vargas; Anne Vogt
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2014-12-21
Also published as: AU2012301127A1; KR20140041888A; EP2748610A1; WO2013030032A1; CN103748470A; US20140065610A1; RU2014108532A; ZA201400967B; BR112014003811A2; JP2014527175A; MX2014002144A; IL230753A0; CA2842529A1; NZ620075A; TW201314209A; AR087641A1

Description

預測神經發育、神經的或神經精神性病症治療之臨床效益之方法

本發明係關於預測用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物治療患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者之臨床效益的方法。

神經發育病症係腦或中樞神經系統之生長及發育之障礙。該術語之較狹義使用係指影響情感、學習能力及記憶及社會能力、技能及行為且隨個體成長而展現出來之腦功能之病症。認為當在嬰兒期及兒童期發生時為神經發育來源或具有神經發育後果之病症包括自閉症及泛自閉症病症(例如亞斯伯格症候群(Asperger syndrome))、創傷性腦損傷(包括先天性損傷，例如彼等引起腦性麻痺、溝通、言語及語言障礙者)、遺傳病症(例如脆弱X染色體症候群及唐氏症候群(Down syndrome))。通常，神經發育病症與差異很大之個體、家庭及社會之精神、情感、生理及經濟負擔程度有關。

神經病症係人體神經系統病症。腦、脊髓或神經中導致其或由其導致之結構、生化或電異常可造成諸如以下之症狀：麻痺、肌肉無力、協調性差、感覺喪失、癲癇、混亂、疼痛、淡漠及變異意識狀態。有許多公認神經病症，一些相對常見，但許多甚為罕見。2006年，世界衛生組織(World Health Organization)預計神經病症及其後遺症影響全世界多達十億人口，且確定健康不平等及社會烙印/歧視為促成相關失能及痛苦之主要因素。

神經精神病學係處理可歸因於神經系統疾病之精神病症之醫學分支，且其亦與精神病學及行為神經學領域密切相關，該領域係解決由腦損傷或腦疾病引起之認知及/或行為臨床問題之神經學之次專科。

神經發育、神經的或神經精神性病症包括精神分裂症、雙極性情感障礙、物質依賴(酒精、古柯鹼)、自閉症及強迫症(OCD)，該等係關於本發明之最佳適應症。

本發明揭示補體因子H家族之蛋白質作為用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物(例如用甘胺酸再吸收抑制劑)所治療患者之臨床效益之預測標記的用途。此外，其尤其係關於預測源自於個體之樣品之藥物反應的方法，其係藉由活體外量測該樣品中補體因子H家族之蛋白質來達成。

補體因子H家族意指其可係含有CFH、CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4A、CFHR4B及CFHR5之CFH蛋白質中之一個體或可係其混合物。

靶向GlyT1之甘胺酸再吸收抑制劑(GRI)係認為藉由提高甘胺酸之細胞外濃度來增強NMDA受體(NMDA-R)介導之傳遞之新穎化合物種類。已在過去15年中，自健康個體、精神病患者及動物中之研究以及自遺傳分析累積了關於在神經發育、神經的或神經精神性病症之病理生理學中涉及NMDA受體(NMDA-R)機能減退之證據。

在CNS中，甘胺酸具有控制感覺及較高腦功能之兩個主要作用：其係甘胺酸激導性神經元中之抑制性神經傳遞質及與麩胺酸鹽一起作為NMDA受體之麩胺酸激導性傳遞之共激動劑的興奮性神經傳遞質。

麩胺酸鹽係腦中之主要興奮性神經傳遞質並激活NMDA及非NMDA受體(配體閘控型離子通道，即AMPA、鉀鹽鎂礬及代謝型受體(即mGluR 1-8))。NMDA受體位於不同神經元上，例如麩胺酸激導性、多巴胺激導性及GABA能。NMDA受體從而可直接影響麩胺酸鹽、GABA及多巴胺。

NMDA受體係意指其需要活化麩胺酸鹽與甘胺酸二者之結合之配體閘門離子通道。甘胺酸用作麩胺酸鹽之調節劑：其增加麩胺酸鹽之效能，從而增強其對活化該受體之影響。在發育中腦中且在較小程度上在成熟腦中，NMDA受體在突觸發生中及在促進突觸維持及穩定(經由增加之突觸塑性)中起決定性作用。從而NMDA受體在成熟及發育中腦中之若干腦功能中涉及。

麩胺酸激導性神經傳遞之功能障礙係在情緒病症及精神分裂症之病理生理學中涉及。因此，NMDA受體甘胺酸調節位點可能係改善認知並減輕精神分裂症之負性症狀之治療標靶。

由於甘胺酸係NMDA-R複合物之專性共激動劑，增強NMDA-R介導之神經傳遞之一策略係提高NMDA受體之局部微環境中甘胺酸之細胞外濃度。甘胺酸提高可藉由抑制GRI來達成，後者為自突觸間隙之甘胺酸移除負責。優於現有神經的及神經精神性療法之可能優勢包括甘胺酸再吸收抑制劑具有良好效力之可能性，以及精神分裂症之負性及正性症狀、雙極性情感障礙、物質依賴(酒精、古柯鹼)、自閉症或強迫症(OCD)治療之經改善耐受性分佈。

GlyT1屬於神經傳遞質轉運體之超家族，如SERT、NET或DAT。GlyT1在前腦中環繞麩胺酸激導性突觸。在其於NMDA受體之NR1位點上之結合位點處，其維持突觸中之細胞外甘胺酸濃度低於飽和含量。在後腦區域及脊髓中，GlyT1控制麩胺酸激導性(經由NMDA受體)及甘胺酸傳遞二者。

已知甘胺酸再吸收抑制劑可用於治療神經發育、神經的或神經精神性病症，例如精神分裂症。

本發明之內容中所用之適宜甘胺酸再吸收抑制劑(GRI)係[4-(3-氟-5-三氟甲基-吡啶-2-基)-六氫吡嗪-1-基]-[5-甲磺醯基-2-((S)-2,2,2-三氟-1-甲基-乙氧基)-苯基]-甲酮。

精神分裂症係嚴重精神病症通常出現在青春晚期或成年早期，其全國盛行率係成年群體之大約1%，其具有巨大的社會及經濟影響。歐洲精神病學家協會(Association of European Psychiatrists，ICD)及美國精神病學協會(American Psychiatric Association，DSM)診斷精神分裂症之準則要求存在兩種或更多種特徵性症狀：妄想、幻覺、解構的言語、嚴重解構的或緊張性行為或負性症狀(失語症、情感平淡、動機缺乏、快感缺乏)，且存在其他要求，例如不包括情感病症及存在受損功能。總體而言，患有精神分裂症之人們具有可始於兒童期、繼續貫穿整個成年生活並使得大多數患者不能維持正常就業或否則具有正常社會功能之功能障礙。[2、3]。在抗精神病治療之前，其亦具有與一般群體相比縮短之壽命，且遭受增加之盛行率之眾多種其他神經精神性症候群，包括嚴重的藥物濫用、強迫症狀及自主不隨意運動。精神分裂症亦與廣泛範圍之認知障礙有關，其嚴重性限制患者功能，甚至當充分控制精神病症狀時亦如此。

與麩胺酸激導性傳遞有關之其他適應症係雙極性情感障礙、物質依賴(酒精、古柯鹼)、自閉症及強迫症(OCD)。

早就承認業內需要研發使CNS疾病(例如精神分裂症、雙極性情感障礙、物質依賴(酒精、古柯鹼)、自閉症及強迫症(OCD))之治療個體化之方法。

在研發目標疾病治療之情況下，尤其感興趣的是可提供標靶之分子譜之方法(即彼等預測臨床效益者)。

因此，本發明之目的係提供如下活體外方法：在相關疾病(其係精神分裂症、雙極性情感障礙、物質依賴(酒精、古柯鹼)、自閉症及強迫症(OCD))中預測靶向麩胺酸激導性路徑之化合物之臨床效益，例如識別將獲得用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物治療之臨床效益之個體。

出於此目的，必須發現循環中所存在之於體液(例如血液、血清或血漿)中可檢測之預測標記。

為了具有臨床效用，預測標記應能夠區分彼等將自用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物之治療獲得臨床效益之個體與彼等將不能獲得臨床效益之個體。藉由其接收器操作特性來最佳評估測試之預測靈敏度或特異性。

全血、血清或血漿係臨床例行工作中樣品之最廣泛使用來源。預測標記之識別將幫助識別可能對用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物治療精神分裂症及其他疾病起反應之個體，其可產生將極大幫助治療及管理該等疾病之方法。因此，臨床上急需改善對靶向麩胺酸激導性路徑之疾病、例如GRI相關之疾病之治療。

另外，本發明之目的係研究在體液樣品中活體外生化標記是否可識別何者可用於預測對靶向麩胺酸激導性路徑之化合物、例如對GRI之反應。

已意外地發現，活體外測定樣品中蛋白質CFH家族之濃度允許預測用GRI治療患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者之臨床效益。

在此上下文中，發現測定患者之血液、血清或血漿樣品中補體因子H家族成員之蛋白質濃度指示將自治療獲得臨床效益之患者。出於此目的，將補體因子H家族成員之蛋白質濃度與代表未自治療獲得臨床效益之患者群體之補體因子H家族成員之蛋白質濃度的值相比較，其中患者之血液、血清或血漿樣品中補體因子H家族成員之較高蛋白質濃度指示將自治療獲得臨床效益之患者。

提供預測患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者之反應之新的活體外方法，其中用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物、例如用GRI治療該患者，該方法包含：-測定患者之血液、血清或血漿樣品中補體因子H家族成員之蛋白質濃度，及-將補體因子H家族成員之蛋白質濃度與代表未自該治療獲得臨床效益之患者群體之補體因子H家族成員之蛋白質濃度的值相比較，其中患者之血液、血清或血漿樣品中補體因子H家族成員之較高蛋白質濃度指示將自該治療獲得臨床效益之患者。

在又一實施例中，本發明係關於在樣品中蛋白質補體因子H家族成員活體外評估某些CNS疾病(例如精神分裂症)之用途，其中蛋白質補體因子H家族成員之濃度高於參考濃度指示由於藥物治療該等疾病所導致之臨床效益。

補體因子H係選自一組189種蛋白質(Rules Based Medicine,Human Discovery Map 1.0版)。在基於Luminex之多重ELISA Human DiscoveryMap® 1.0版上分析來自用GRI治療之精神分裂症患者之基線及治療血清樣品。

DiscoveryMAP®係綜合的定量免疫分析測試，含有189種蛋白質分析物。其代表對細胞因子、趨化因子、代謝標記、激素、生長因子、組織重塑蛋白質、血管發生標記、急性期反應物、癌標記、腎毒性標記、CNS生物標記及其他重要血清蛋白質之10年分析研發之頂點。

發現，鑒於以下優勢補體因子H優於其他189種蛋白質分析物：-在治療群組中補體因子H在反應者與非反應者之間顯示極大區別； -在安慰劑群組中補體因子H未顯示預測效應；-在8週內補體因子H血清濃度不受利用GRI之治療影響；-補體因子H血清濃度隨時間而穩定。

補體因子H(亦稱為因子H)係含有唾液酸之糖蛋白，其在調控微生物防禦、免疫複合物加工、程式性細胞死亡及老年性黃斑變性中所涉及之補體介導之免疫系統中起積分作用。補體因子H係補體因子H蛋白質家族中經最佳表徵之成員。補體因子H家族係由以下成員組成：補體因子H(CFH)、補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)、補體因子H相關蛋白質2(CFHR2)、補體因子H相關蛋白質3(CFHR3)、具有同種型4A及4B(CFHR4A及CFHR4B)之補體因子H相關蛋白質4、補體因子H相關蛋白質5(CFHR5)。補體因子H相關蛋白質係於補體因子H基因之下游經編碼，並與補體因子H之子結構域共享高濃度之同源性。補體因子H相關蛋白質亦共享功能類似性[4]。

該補體系統係由體液中或細胞及組織表面上所存在之約40種蛋白質組成，且由3個主要路徑以類級聯方式激活[1]。以較低比率由中心組份C3之自發水解連續激活替代路徑，由識別微生物碳水化合物之甘露醇結合凝集素或纖維膠凝蛋白起始凝集素路徑，且藉由Clq與抗原結合免疫球蛋白結合來激活經典路徑。酶促步驟產生補體組份之活性片段並誘發進一步擴增。該3個路徑在C3之濃度下合併，C3在激活後裂解成C3a及C3b。

補體因子H保護宿主細胞免受無限制補體激活導致之損傷。補體因子H藉由具有因子I介導之C3b裂解之輔助因子活性及抵抗替代路徑C3轉化酶(C3bBb)之衰變加速活性來調控自身細胞上之補體激活。

補體因子H保護自身細胞免於補體激活，但不免於細菌/病毒。由於補體因子H在補體調控中起中心作用，因此存在許多由異常CFH活性引起之臨床意義。補體因子H基因中之突變與嚴重且不同之疾病有關，該等疾病包括罕見腎功能異常溶血性尿毒癥候群(HUS)及膜性增生性腎絲球腎炎(MPGN，亦稱為密度沈積病(DDD))、膜性增生性腎絲球腎炎II型或密度沈積病以及較頻發視網膜疾病老年性黃斑變性(AMD)。除了其補體調控活性外，補體因子H具有多種生理活性，且1)用作細胞外基質組份，2)結合至整合素類型之細胞受體，且3)與各種各樣之配體相互作用，例如C-反應性蛋白質、血小板反應蛋白、骨唾液酸蛋白、骨橋蛋白及肝素。

補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)係糖蛋白之因子H家族之43 kDa經分泌成員。其係由肝細胞產生，並以兩種以不同方式糖基化之同種型(37 kDa及43 kDa)形式循環。成熟人類CFHR1之長度係312 aa。其含有5個大約60 aa之SCR(短同源重複序列/CCP/SUSHI重複序列)，該等SCR基本上構成整個分子。CFHR1可在將LPS結合至嗜中性球之脂蛋白複合物中起作用。尚未報導CFHR1之齧齒動物對應體。在aa 19143之CFHR1前體中，人類CFHR2及CFHR5分別顯示98%及86% aa一致性。

如本文所使用

術語「生物標記或標記」意指用作生物學狀態(即生物學過程)或對相互作用之藥理學反應之指示劑之物質。生物標記或標記指示與疾病之風險或進展或與該疾病對所給治療之敏感性相關之蛋白質之表現或狀態的變化。

術語「基因」意指宿主生物體中之一段DNA。

基因表現係使用來自基因之資訊合成功能性基因產物(例如蛋白質)之過程。術語「表現濃度」意指特定基因於細胞、組織或生物體內表現之濃度。術語「表現濃度」在蛋白質之上下文中反映在某一時間細胞內存在之特定蛋白質之量。

術語「蛋白質」意指已自該基因合成之功能性基因產物。

術語「代表未自治療獲得臨床效益之患者群體之補體因子H家族成員之蛋白質濃度的值」係指對未自治療獲得臨床效益之患者群體之平均表現濃度之估算。臨床效益係定義為8週後與安慰劑相比具有可量測反應。

本文所用術語「樣品」或「測試樣品」係指出於活體外評估之目的自個體所獲得之生物樣品。在本發明之方法中，在本發明之實施例中樣品或患者樣品可包含任一體液。較佳樣品係諸如血液、血清或血漿等體液，其中血清或血漿最佳。

術語「混合物」係指由藉由一種蛋白質分析(例如夾心式分析)同時檢測之兩種或更多種蛋白質構成之蛋白質混合物。同時檢測可歸因於藉由夾心式分析中所用抗體檢測之蛋白質上存在類似表位。

術語「組合」係指對在較大蛋白質群組中量測之兩種或更多種蛋白質分析物之獨立量測，其中順序無所謂。藉由(例如)計算量測結果之比率以數學方式組合獨立量測結果。

在適當樣品中活體外測定補體因子H家族成員之蛋白質濃度、特定而言可溶形式之補體因子H家族成員(CFH、CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4A、CFHR4B及CFHR5或其混合物)之蛋白質濃度。較佳地，樣品來源於人類個體，例如精神分裂症患者或具有精神分裂症風險之人或懷疑患有精神分裂症之人。在血液、血清或血漿樣品中測定補體因子H家族成員之蛋白質濃度。

本發明包含預測患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者若用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物治療之反應的方法，其包含以下步驟i)測定患者之樣品中補體因子H家族之1個、2個、3個、4個、5個或6個成員或其混合物或組合之蛋白質濃度，ii)將步驟i)中所測定之蛋白質濃度與代表患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者中補體因子H家族之1個、2個、3個、4個、5個或6個成員之蛋白質濃度的值相比較，iii)其中患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者之樣品中來自補體因子H家族之1個、2個、3個、4個、5 個或6個成員之蛋白質濃度較高時表示該患者將自此治療獲得臨床效益，及iv)選擇此治療用於患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者。

更具體而言，本發明包含預測患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者若用甘胺酸再吸收抑制劑(GRI)治療之反應的活體外方法，其包含以下步驟i)測定患者之樣品中補體因子H家族之1個、2個、3個、4個、5個或6個成員或其混合物或組合之蛋白質濃度，ii)將步驟i)中所測定之蛋白質濃度與代表患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者中補體因子H家族之1個、2個、3個、4個、5個或6個成員之蛋白質濃度的值相比較，iii)其中患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者之樣品中來自補體因子H家族之1個、2個、3個、4個、5個或6個成員之蛋白質濃度較高時表示該患者將可利用GRI之治療獲得臨床效益，及iv)選擇GRI治療用於患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者。

補體因子H家族成員包括補體因子H(CFH)之蛋白質補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)、補體因子H相關蛋白質2(CFHR2)、補體因子H相關蛋白質3(CFHR3)、補體因子H相關蛋白質4ACFHR4A)、補體因子H相關蛋白質4B(CFHR4B)及補體因子H相關蛋白質5(CFHR5)。

本發明之一實施例係上文所提及之補體因子H家族成員或其混合物或組合。

本發明之一實施例係，補體因子H家族成員係補體因子H相關蛋白質1或補體因子H相關蛋白質1與補體因子H之混合物。

本發明之又一實施例係活體外方法，其中補體因子H家族成員係補體因子H相關蛋白質1。

本發明之又一實施例係活體外方法，其中補體因子H家族成員係補體因子H相關蛋白質1與補體因子H之組合。

本發明之一尤佳實施例係活體外方法，其中補體因子H家族成員係某比率之補體因子H相關蛋白質1與補體因子H。

本發明之一實施例進一步係活體外方法，其中補體因子H家族成員係補體因子H相關蛋白質3與補體因子H之組合。

本發明之一實施例進一步係活體外方法，其中補體因子H家族成員係某比率之補體因子H相關蛋白質3與補體因子H。

本發明之一實施例進一步係活體外方法，其中補體因子H家族成員係補體因子H相關蛋白質3或補體因子H相關蛋白質1與以下補體因子中之一者之組合：補體因子H相關蛋白質2、補體因子H相關蛋白質4A、補體因子H相關蛋白質4B、補體因子H相關蛋白質5及補體因子H。

本發明之一實施例進一步係活體外方法，其中補體因子 H家族成員係某比率之補體因子H相關蛋白質3或補體因子H相關蛋白質1與以下補體因子中之一者：補體因子H相關蛋白質2、補體因子H相關蛋白質4A、補體因子H相關蛋白質4B、補體因子H相關蛋白質5及補體因子H。

預測患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者之反應的方法包括精神分裂症之負性或正性症狀、雙極性情感障礙、物質依賴、自閉症及強迫症。

本發明之一實施例係其中患者受情感性分裂症影響之方法。

本發明之又一實施例係補體因子H家族之個別成員或其混合物或組合之蛋白質濃度係藉由基於ELISA之技術測定。

本發明進一步包含預測患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者若用靶向麩胺酸激導性路徑之可係甘胺酸再吸收抑制劑(GRI)之化合物治療之反應的活體外方法，其中補體因子H家族之個別成員或其混合物或組合之蛋白質濃度係藉由量測補體因子H家族成員之遺傳變體來測定[5]。

本發明進一步包含預測患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者若用甘胺酸再吸收抑制劑(GRI)治療之反應的活體外方法，其中CFHR1之蛋白質濃度係藉由量測CFHR1之遺傳變體(經由量測CFHR1之拷貝數差異或藉由量測作為缺失代替物之SNP)來測定。

本發明之又一實施例係特異性結合至補體因子H家族之蛋白質之抗體之用途。

該活體外方法包括使用GRI，其係[4-(3-氟-5-三氟甲基-吡啶-2-基)-六氫吡嗪-1-基]-[5-甲磺醯基-2-[[(2S)-1,1,1-三氟丙-2-基]氧基]苯基]甲酮。

本發明之又一實施例係補體因子H家族成員，其用作利用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物(例如利用甘胺酸再吸收抑制劑(GRI))治療之患者之預測標記。

本發明之一實施例係以補體因子H家族成員作為患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者若利用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物(例如利用甘胺酸再吸收抑制劑(GRI))治療之臨床效益之預測標記的用途。

本發明之又一實施例係補體因子H家族成員，其作為患有神經發育、神經的或神經精神性病症之患者若利用靶向麩胺酸激導性路徑之化合物(例如利用甘胺酸再吸收抑制劑(GRI))治療之臨床效益之預測標記。

本文所用術語「參考樣品」係指出於活體外評估之目的，由未自治療獲得臨床效益之參考患者群組提供之生物樣品。本文所用術語「參考濃度」係指在未自治療獲得臨床效益之參考患者群中所確定之值。

熟習此項技術者已知本發明方法之步驟(i)之量測結果將與參考濃度相比較。該參考濃度可使用陰性參考樣品、陽性參考樣品或包含該等對照類型中之一者或一者以上之混合參考樣品來測定。

熟習此項技術者咸了解，「將所測定濃度與參考濃度相比較」表示法僅係用於進一步闡釋。參考濃度係在對照樣品中建立。對照樣品可係內部或外部對照樣品。在一實施例中，使用內部對照樣品，即在測試樣品中以及在一或多個取自相同個體之其他樣品中評估標記濃度，以確定該(等)標記之濃度是否存在任何變化。在另一實施例中，使用外部對照樣品。對於外部對照樣品，將標記在源自該個體之樣品中之存在或量與其在已知患有給定病況或已知具有給定病況之風險之個體中；或已知沒有給定病況之個體(即「正常個體」)之存在或量相比較。例如，可將患者樣品中之標記濃度與已知與神經發育、神經的或神經精神性病症之具體時期有關之濃度相比較。

通常，樣品之標記濃度與診斷直接或間接相關，且該標記濃度係用於(例如)確定個體是否具有神經發育、神經的或神經精神性病症之風險。

或者，例如，可將樣品之標記濃度與已知與精神分裂症患者中對療法之反應、對精神分裂症之診斷、在選擇精神分裂症之適當藥物、判斷疾病進展之風險或對精神分裂症患者之跟進方面之指導有關之標記濃度相比較。視預期診斷用途而定，選擇適當對照樣品並於其中確定標記之對照或參考值。熟習此項技術者應瞭解，在一實施例中該對照樣品係自年齡匹配且無混同疾病之參考群體獲得。如熟習此項技術者亦顯而易見，對照樣品中所確定之絕對標記值將取決於所用之分析。較佳地，使用來自100個來自適當參考群體之充分表徵個體之樣品確定參考值。較佳參考群體亦可經選擇由20個、30個、50個、200個、500個或1000個個體組成。未自GRI治療獲得臨床效益之精神分裂症患者代表用於確定參考值之較佳參考群體。

未自GRI治療獲得臨床效益之精神分裂症患者可定義為治療後其症狀不顯示改善或僅顯示極小改善之患者。在一實施例中，症狀無改善或症狀之極小改善係定義為在正性及負性症狀量表(PANSS)中小於20%變化。在另一實施例中，症狀無改善或症狀之極小改善係定義為根據臨床總體印象量表(CGI)症狀更惡化、症狀無變化或改善極小。

具有CFH家族基因之特異基因型之精神分裂症患者代表用於確定對照值之另一較佳參考群體。在一實施例中，具有CFHR1及CFHR3基因之純合子缺失之精神分裂症患者代表用於確定參考值之較佳參考群體。在另一實施例中，具有CFHR1及CFHR3基因之純合子或雜合子缺失之精神分裂症患者代表用於確定參考值之較佳參考群體。

術語「量測」、「量測」或「測定」較佳包含定性、半定量或定量量測。在本發明中，補體因子H家族成員或其混合物之蛋白質係於體液樣品中量測。在較佳實施例中，量測係半定量量測，即測定補體因子H家族成員或其混合物之蛋白質之濃度是否高於或低於截止值。

如在對照群組或對照群體中所測定補體因子H家族成員或其混合物之蛋白質之值係用於(例如)確定截止值或參考範圍。認為高於該截止值之值指示對神經發育、神經的或神經精神性病症治療之臨床效益之預測。

在一實施例中，確定固定截止值。該截止值經選擇以匹配所關注之診斷問題。

在一實施例中，截止值經設定以導致90%之特異性，亦較佳地截止值經設定以導致95%之特異性，或亦較佳地截止值經設定以導致之98%特異性。

在一實施例中，截止值經設定以導致90%之靈敏度，亦較佳地截止值經設定以導致95%之靈敏度，或亦較佳地截止值經設定以導致98%之靈敏度。

在一實施例中，使用如在對照群組或對照群體中所測定補體因子H家族之蛋白質之值確定參考範圍。在較佳實施例中，若所測定值高於參考範圍之90%百分位數，則認為補體因子H家族之蛋白質之濃度升高。在其他較佳實施例中，若所測定值高於參考範圍之95%百分位數、96%百分位數、97%百分位數或97.5%百分位數，則認為補體因子H家族成員之蛋白質濃度升高。

高於截止值之值可指示(例如)神經發育、神經的或神經精神性病症治療之增加之臨床效益。

在又一較佳實施例中，補體因子H家族成員之蛋白質之量測係定量量測。在其他實施例中，補體因子H家族成員之蛋白質之濃度與神經發育、神經的或神經精神性病症治療之增加之臨床效益相關。

如熟習此項技術者應瞭解，活體外進行任一該評估。其後丟棄樣品(測試樣品)。該樣品僅用於本發明之活體外診斷方法，且並不將樣品材料轉移回患者之身體內。通常，該樣品係體液樣品，例如血清、血漿或全血。

本發明之方法係基於自個體獲得之液體或體液樣品，且基於該樣品中補體因子H家族成員或其混合物之蛋白質濃度之活體外測定。本文所用「個體」係指單個人類。

較佳地，藉由使用特異性結合劑自液體樣品活體外具體測定補體因子H家族成員之蛋白質濃度。

除非另外定義，否則本文所用之技術及科學術語的含義與本發明所屬領域內之熟習此項技術者所通常瞭解之含義相同。

Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第2版，John Wiley & Sons,New York,N.Y.(1994)；March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure，第4版，John Wiley & Sons,New York,N.Y.(1992)；Lewin,B.,Genes V，由Oxford University Press出版(1994),ISBN 0-19-854287 9；Kendrew,J.等人，(編輯)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science有限公司出版(1994),ISBN 0-632-02182-9；及Meyers,R.A.,(編輯)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers有限公司出版(1995),ISBN 1-56081-569 8)向熟習此項技術者提供對本申請案中所用之許多術語之一般指導。

檢測本發明所述各別基因之蛋白質表現之技術包括(但不限於)酶聯免疫吸附分析(ELISA)。

除非另有說明，否則本發明之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習用技術，其為熟習此項技術者所熟知。該等技術於科學文獻中充分解釋，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,second edition,(1989)；Gait,M.J.,(編輯)Oligonucleotide Synthesis(1984)；Freshney,R.I.,(編輯)，Animal Cell Culture(1987)；Methods in Enzymology(Academic Press有限公司)；Ausubel,F.M.等人，(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology(1987)and periodic updates；Mullis等人，(編輯)PCR：The Polymerase Chain Reaction(1994)。

本發明之方法係基於自個體獲得之液體或體液樣品，且基於該樣品中補體因子H家族成員之蛋白質濃度之活體外測定。本文所用「個體」係指單個人類。

在本發明之較佳實施例中，測定補體因子H家族成員之蛋白質濃度。在一實施例中，藉由使用特異性結合劑自樣品活體外具體測定補體因子H家族成員之蛋白質濃度。

特異性結合劑係(例如)補體因子H家族成員之受體、結合至補體因子H家族成員之凝集素、補體因子H家族成員之抗體、補體因子H家族成員之肽體、雙特異性雙重結合劑或雙特異性抗體型式。特異性結合劑對其相應標靶分子至少具有10⁷ l/mol之親和力。特異性結合劑對其標靶分子較佳具有10⁸ l/mol或亦較佳10⁹ l/mol之親和力。

熟習此項技術者應瞭解，術語特異性係用於指示樣品中存在之其他生物分子並不顯著結合至對SEQ ID NO：1之補體因子H蛋白質序列或SEQ ID NO：2-7之補體因子H相關蛋白質1-5具有特異性之結合劑。較佳地，至不同於標靶分子之生物分子之結合濃度導致結合親和力分別至多為對標靶分子之親和力之僅10%或更少、僅5%或更少、僅2%或更少或僅1%或更少。較佳特異性結合劑將滿足親和性以及特異性之上述最小準則。

特異性結合劑之實例係肽、肽模擬物、適配體、鏡像適配體(spiegelmer)、設計的錨蛋白重複蛋白(darpin)、錨蛋白重複蛋白、孔尼茲型結構域(Kunitz type domain)、抗體、單結構域抗體[6]及抗體之單價片段。

在某些較佳實施例中，特異性結合劑係多肽。

在某些較佳實施例中，特異性結合劑係抗體或單價抗體片段，較佳源自單株抗體之單價片段。

本文中術語「抗體」係以最廣泛含義使用且具體而言涵蓋單株抗體、多株抗體、自至少兩種完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段(只要其呈現期望生物學活性即可)。在某些較佳實施例中，特異性結合劑係抗體或單價抗體片段，較佳源自單株抗體之單價片段。

特異性結合劑較佳係抗體或一組與例如以下之補體因子H家族之成員或其組合具有反應性之抗體：補體因子H (SEQ ID NO：1)、補體因子H相關蛋白質1(SEQ ID NO：2)、補體因子H相關蛋白質2(SEQ ID NO：3)、補體因子H相關蛋白質3(SEQ ID NO：4)、補體因子H相關蛋白質4A(SEQ ID NO：5)、補體因子H相關蛋白質4B(SEQ ID NO：6)、補體因子H相關蛋白質5(SEQ ID NO：7)，線性表位或構象表位。

熟習此項技術者現應瞭解，已確定補體因子H家族成員之蛋白質濃度為可用於評估神經發育、神經的或神經精神性病症治療之臨床效益之標記。

為測定補體因子H家族成員之蛋白質濃度，利用補體因子H家族成員之特異性結合劑在適於在結合劑與補體因子H家族成員之間形成複合物之狀態下活體外培育自個體獲得之樣品。不需指定該等狀態，此乃因熟習此項技術者無需進行任何發明性努力即可容易地確定該等適當的培育狀態。在(例如)上文所述之酶聯免疫分析(ELISA)中測定結合劑與補體因子H家族成員之間之複合物之量[7]。

免疫分析為熟習此項技術者所熟知。實施該等分析之方法以及實際應用及程序概述於相關教科書中。相關教科書之實例係Tijssen,P.,Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates,Practice and theory of enzyme immunoassays，第221頁-第278頁，及Methods in Enzymology,Colowick之各卷，S.P.，及Caplan,N.O.(編輯)，Academic Press)，其涉及免疫學檢測方法，尤其第70卷、第73卷、第74卷、第84卷、第92卷及第121卷。

使用此分析格式，已顯示來自患者之樣品可用於評估患者藉由治療達成之臨床效益。結果顯示於本申請案之實例部分。

實例

現將於以下實例中進一步闡述本發明，該實例僅欲作為說明而非限制本發明之範圍。

患者及2期GRI精神分裂症試驗之研究設計

在患有主要具有負性症狀之精神分裂症之成人中實施II期研究。個體在臨床上穩定且處於利用第二代抗精神病藥物之穩定治療中。在Brazil、France、Germany、Hungary、Japan、Mexico、Poland、Russia及US之多個地點根據優良臨床試驗規範(good clinical practice)之ICH指導原則(ClinicalTrials.gov標識符：NCT00616798)實施該研究。該研究方案由每個國家之衛生局及每一地點之倫理委員會各別批准。所有323個患者已提供書面同意書來參加該研究，且224個患者已同意收集及使用血清樣品用於探索性生物標記分析。在篩查及4週導入期後，使患者隨機利用每天一次給予之安慰劑、10 mg、30 mg或60 mg GRI雙盲輔助治療，持續8週之持續時間，接著係4週跟進期。四個治療組中類似百分比之患者完成該研究。

2期GRI精神分裂症試驗之結果量度

在篩查時、第2週、基線時、第1週、第2週、第4週、第 6週、第8週、第10週及第12週評估患者。評估包括針對整體精神病理學56之PANSS、臨床總體印象-疾病嚴重性(CGI-S)及臨床總體印象-總體改善(CGI-I)、用於僅評估負性症狀57之負性症狀之CGI-S及CGI-I(CGI-S-N、CGI-I-N)及對錐體外症狀之標準檢查(BAS58、SAS59、AIMS60)。評估對負性症狀之效應之主要效力變數係PANSS負性症狀因素得分64相對於基線之變化。次要效力變數係i)顯示負性症狀之臨床反應(定義為PANSS負性症狀因素得分相對於基線之20%變化)之患者比例及ii)CGI-I-N。其他分析包括PANSS總得分、其餘PANSS因素得分64CGI-S及CGI-I之變化。

血清樣品之製備

在基線時及在治療第8週自已提供關於收集及使用血清樣品用於探索性生物標記分析之書面同意書的患者收集血清樣品。將樣品收集於無EDTA之真空採血管(plain tube)中並使其在室溫下靜置大約30 min或直至凝結為止。在60 min之血液收集中，將樣品轉移至離心機中，並在4℃下(或若不能獲得冷凍離心機則在室溫下)以1500 g旋轉10 min。離心後立即將上清液(即血清)轉移至剛剛預標記之管中並儲存於-70度下。

2期GRI精神分裂症試驗中來自患者之CFH之濃度的測定及結果

於Rules Based Medicine(Austin Texas)提供之基於Luminex之多重ELISA Human Discovery Map® 1.0版上分析基線血清樣品。將來自II期研究之經冷凍血清樣品隨機化，盲化並在乾冰上送至Rules Based Medicine以分析189種蛋白質分析物。以一批次實施蛋白質生物標記量測，且以量測單位(例如ng/ml)報告結果。

報告量測值是否在標準校準曲線內。使用校準極限輸入在校準曲線外面之值。在189種所量測蛋白質分析物中，對於70%以上之患者樣品，有26種報告低於最低校準物之量測值。自分析移除該等分析物。藉由求平均值來合計對2種相關分析物(前胰島素及胰島素)之量測，此乃因其顯示高度相關之量測值。預加工後，分析數據集中保留162種蛋白質分析物。

2期GRI精神分裂症試驗中生物標記子群對總研究隊列的人口統計學、基線精神病理學及功能

2期GRI精神分裂症試驗中323個患者中之224個已同意收集及使用血清樣品用於探索性生物標記分析。生物標記子群代表整個研究隊列。

用於反應預測之生物標記候選物之識別

在作為整體之臨床試驗中，主要分析終點係PANSS負性症狀因素得分相對於基線之變化[8]。此分析之反應變數係在基線與第8週之間PANSS負性症狀因素得分之變化。為識別用於反應預測之生物標記，如下分析藉由RBM量測之蛋白質分析物：此分析之唯一解釋變數係對個別蛋白質之基線量測，且對彙集之10 mg及30 mg生物標記群體使用PP(符合方案)群體實施該分析。對於每一蛋白質標記候選物，使用穩健線性模型之R^2作為測試統計量來測試PANSS之變化與蛋白質量測無關之零假設。針對所有所測定蛋白質標記測試零假設，同時校正多重測試。雖然表1顯示稱為「補體因子H」之分析物歸類為最佳實施標記，然而，調整多重測試後，其不產生統計顯著性。

作為臨床試驗中之次要終點，使用基線與第8週評估之間負性症狀之臨床總體印象(CGI)改善。將此結果量度視為二元變數。陽性群組由「極大改善」及「顯著改善」得分組成，陰性群組由「極小改善」、「無變化」、「極小惡化」、「顯著惡化」及「極度惡化」組成。對合併之安慰劑、10 mg及30 mg生物標記群體使用符合方案(PP)群體實施分析。此分析之解釋變數係對所有所量測蛋白質之基線量測、治療(安慰劑或彙集之10 mg/30 mg治療)及治療-蛋白質相互作用。使用邏輯斯回歸(logistic regression)模型作為預測器。

基於此，藉由在10 mg及30 mg治療組之CGI中區分具有改善之患者與無改善之患者之能力對該等分析標記分等。

RBM面板內稱為「補體因子H」之分析物已識別為校正多重測試後達到統計顯著性之唯一標記，其中經調整p值為0.006(參見表1)。

血清「補體因子H」基線位準預測臨床效應之能力與人口統計學及臨床共變數(包括基線PANSS)無關，且不同治療組之間「補體因子H」基線血清濃度不存在顯著差異。「補體因子H」顯示與安慰劑群組(PANSS或CGI-I)之反應無關。

對RBM分析中所用抗體之進一步表徵揭示捕獲及檢測抗體二者結合於CFH之最後3個短同源重複序列(SCR)內。此區域與補體因子H相關蛋白質1高度同源(CFHR1：SCR18、SCR19及SCR20與CFHR1之SCR3、SCR4及SCR5分別共享100%、100%及97%一致性[4])。

將人類CFH及CFHR1蛋白質自血清分離並純化。對RBM分析中之兩種蛋白質之表徵顯示CFHR1經確認CFHR1 10倍優先於CFH。

CFHR1特異性分析所用之抗體

為進行CFHR1特異性分析，使用以下單株抗體：MAB<CFH/CFHR1>M-L20/3(供應商：Thermo Scientific，目錄編號：GAU 020-03-02)及MAB<CFHR1>M-442127(供應商：R&D-systems，目錄編號：MAB4247)。

單株L20/3 Fab片段之生物素化，化學計量學1：1.3

使用木瓜酶(3 mU/mg IgG)消化單株小鼠IgG(純系：L20/3；供應商：Thermo Scientific，目錄編號：GAU 020-03-02)，以產生Fab片段。在DEAE瓊脂糖凝膠上藉由層析法消除經消化Fc片段。藉由Fcγ吸附其餘Fc、接著Superdex 200粒徑排阻來純化Fab。

向10 mg/ml L20/3-Fab片段存於100 mM KPO₄ 中之溶液中，每ml添加pH 8.5 50 μl生物素-N-羥基琥珀醯亞胺(3.6 mg/ml存於DMSO中)。在室溫下45 min後，將樣品於pH 7.2下針對100 mM KPO₄ 、150 mM NaCl透析並冷凍。

單株442127 IgG之釕標記，化學計量學1：3

向5 mg/ml單株小鼠IgG(純系442127，供應商：R&D-系統，目錄編號：MAB4247)存於100 mM KPO₄ 中之溶液(pH 8.5)中，添加125 μg釕-(bpy)2-bpyCO-Osu。在室溫下75 min後，藉由添加10 mM離胺酸來終止釕標記。為分離聚集體，藉助Superdex 200粒徑排阻層析法收集適當分率之樣品。

CFHR自人類血清之純化

為用作校準物材料，藉由免疫吸附使用對CFH及CFHR1具有特異性之單株抗體L20/3根據以下程序自人類血清純化天然CFHR1：使用MAB L20/3<CFH,CFHR1>M-IgG-Spherosil樹脂來自人類血清純化CFHR1。使預稀釋(1：4存於50 mM TrisHCl、150 mM NaCl中，pH 7.5)血清穿過Sartoclean CA(0.8 μm)及Sartobran P(0.2 μm)過濾器帽。洗滌裝載於管柱上之預處理血清(10 mM TrisHCl，500 mM NaCl，0.05% Tween20，pH 7.5)，接著經Q-瓊脂糖凝膠電泳緩衝液處理，並於溫和溶析緩衝液(Thermo Scientific)中溶析，以避免分析物及吸附劑降解。為分離共結合之CFHR1及CFH，使免疫吸附劑-洗出液流經用於尺寸依賴性溶析之MonoQ管柱。針對等電性在MonoS管柱上進一步分離含有在SDS-PAGE分析中在不同高度流出之CFHR1以及共純化蛋白質的洗出液，從而產生各分率之純CFHR1。純CFHR1在血清CFHR1值之Elecsys-ECLIA測試中作為用於測定CFHR1之校準物材料施加。

使用ECLIA免疫分析量測人類血清或血漿樣品中之CFHR1

CFHR1之ECLIA免疫分析經研發以使用Elecsys®分析儀具體量測人類血清或血漿樣品中之CFHR1。

以下闡述使用Elecsys®分析儀測定CFHR1之分析程序。

Elecsys CFHR1免疫分析係經由夾心原理起作用之電化學發光免疫分析(ECLIA)。該分析中包括兩種抗體-單株抗體L20/3-Bi(捕獲抗體)之生物素化Fab片段及釕標記之單株抗CFHR1抗體442127-Ru(檢測抗體)-其與樣品中之CFHR1形成夾心式免疫分析複合物。然後使複合物與鏈黴抗生物素塗覆之固相微米粒子結合。微米粒子以磁性方式捕獲至電極之表面上，且向電極施加電壓誘導化學發光發射，化學發光發射係藉由讀出用之光電倍增器量測。經由儀器專用校準曲線確定結果。

將樣品以1：400自動稀釋於稀釋劑(用於Elecsys之Roche多項分析稀釋劑，參考編號03609987-190)中。應用分析方案3，允許使10 μl經稀釋樣品與存於反應緩衝液(Hepes50 mM，NaCl 150 mM；Thesit/Polidocanol 0.1%；EDTA 1mM；牛血清白蛋白0.5%)中為0.5 μg/ml之80 μl釕標記<CFHR1>-442127一起預培育9 min，然後添加存於反應緩衝液中為1.5 μg/ml之80 μl生物素化<CFH,CFHR1>-L20/3加30 μl微米粒子並再培育9 min。在培育期間，形成與微米粒子結合之抗體-分析物-抗體夾心結構。最後，將微米粒子轉移至Elecsys系統之檢測室中用於信號產生及讀出。為了校準，在多項分析稀釋劑中製備經純化CFHR1之1：2連續稀釋液(125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.25 ng/ml、15.63 ng/ml、7.81 ng/ml、3.9 ng/ml、1.95 ng/ml、0 ng/ml)。校準曲線之方程係藉由非線性最小平方曲線擬合(RCM-Rodbard)計算並用於將信號讀出轉換成相應濃度值。使結果乘以預稀釋因子，從而得到各別樣品本身之濃度。

藉由量測可能使血清組份CFH、CFHL1、CFHR2、CFHR3、CFHR4及CFHR5交叉反應之不同濃度來測定所施加抗體夾心結構之交叉反應性。對於所施加之抗體夾心結構，未測定到對CFHL1、CFHR2、CFHR3、CFHR4、CFHR5具有交叉反應性，且僅測定到4.4%之對CFH之較弱識別。

對2期GRI精神分裂症試驗之血清樣品之量測確定內CHFR1之自然截止值

利用CFHR1 ECLIA免疫分析所量測之CFHR1濃度顯示與CFHR1基因之缺失狀態相關之多峰分佈。

圖1顯示II期血清樣品中CFHR1濃度之分佈。已識別三個群組：

．CFHR1濃度低於8 μg/ml之群組，其與攜帶CFHR1之純合子缺失之群組相關且從而不表現CFHR1。所量測之信號係由CFHR1 ECLIA免疫分析之與CFH之殘餘交叉反應性所致。

．CFHR1濃度高於8 μg/ml且低於28 μg/ml之群組。此群組攜帶CFHR1之雜合子缺失。

．CHFR1值高於28 μg/ml之群組。此群組不攜帶CFHR1之缺失。

約5%-17%之群體中缺失CFHR1，取決於族源[5、9]。在高加索人(Caucasians)中，約5%之群體帶有純合子缺失且約40%攜帶雜合子缺失。

使用CFHR1自然截止值之患者分層

分析圖1中所顯示三個群組中之每一群組內之CFHR1蛋白質濃度與治療反應之關聯：在攜帶純合子缺失之患者中，檢測不到CFHR1；殘餘信號係由該分析與CFH之交叉反應性所致。在攜帶CFHR1之雜合子缺失之患者中，CFHR1蛋白質濃度與治療反應無關。在未攜帶CFHR1之缺失之患者群組中，存在較高CFHR1濃度與較高治療反應相關之趨勢。此點表示實際上主要藉由CFHR1之遺傳狀態預測反應率，其中由CFHR1之雜合子或純合子缺失推斷為對GRI之較低反應。

因此，為了患者分層，選擇使用CFHR1專用之ECLIA免疫分析在28 μg/ml下確定之CFHR1基線血清濃度之自然截止值(圖1)。將CFHR1血清值低於或等於28 μg/ml之患者分層為「低CFHR1」，而CFHR1血清值高於28 μg/ul之患者分層為「高CFHR1」。表2顯示不同劑量群組內之高CFHR1及低CFHR1患者之分佈。

分析高CFHR1(N=75)及低CFHR1(N=75)子群之II期研究之主要終點及經選擇次要臨床終點，並與未分層之CFHR1血清樣品PP子群(N=150)相比。

圖2顯示對PANSS負性症狀因素得分(PANSS NFS)相對於基線隨時間之變化之分析。整個患者隊列之結果顯示於上圖中，低CFHR1患者之結果顯示於中圖中，且高CFHR1患者之結果顯示於下圖中。對於10 mg組，與未分層群組之-0.42相比，在高CFHR1群組中之效應程度係-1.01，且對於30 mg組，與未分層群組之-0.47相比，在高CFHR1群組中之效應程度係-0.76。

圖3顯示對PANSS負性症狀因素得分反應者率之分析，該率係次要臨床終點：8週治療後PANSS負性症狀因素得分自基線降低至少20%之患者定義為反應者：整個血清子群中所有四個治療組之反應率表示為白色條紋背景條，且對於高CFHR1及低CFHR1子群表示為灰色條。對於10 mg組，與未分層群組之69%相比，高CFHR1群組之反應率係88%，且對於30 mg組，與未分層群組之66%相比，高CFHR1群組之反應率係78%。

圖4顯示對另一次要臨床終點負性症狀反應者率之臨床總體印象(CGI)之分析：為分析CGI反應者率，彼等「改善」或「極大改善」之患者定義為反應者：整個血清子群中所有四個治療組之反應率表示為白色條紋背景條，且對於高CFHR1及低CFHR1子群表示為灰色條。對於10 mg組，與未分層群組之39%相比，高CFHR1群組之反應率係69%，且對於30 mg組，與未分層群組之45%相比，高CFHR1群組之反應率係67%。

CFH特異性分析所用之抗體

為進行CFHR1特異性分析，使用以下單株抗體：MAB<CFH/CFHR1>M-L20/3(供應商：Thermo Scientific，目錄編號：GAU 020-03-02)及MAB<CFH>OX-24(供應商：Thermo Scientific，目錄編號：MA1-70057)。

OX24 IgG之釕標記，化學計量學1：3

向5 mg/ml單株小鼠IgG(純系OX-24，Thermo Scientific，目錄編號：MA1-70057)5 mg/ml存於100 mM KPO4中之溶液(pH 8.5)中，添加且將125 μg釕-(bpy)2-bpyCO-Osu給予至IgG溶液中。在室溫下75 min後，藉由添加10 mM離胺酸來終止釕標記。為分離聚集體，藉助Superdex 200粒徑排阻層析法收集適當分率之樣品。

CFH自人類血清之純化

為用作參考校準物材料，藉由免疫吸附使用對CFH及CFHR1具有特異性之單株抗體L20/3根據以下程序自人類血清純化天然CFH：使用MAB L20/3<CFH,CFHR1>M-IgG-Spherosil樹脂來純化。使預稀釋(1：4存於50 mM TrisHCl、150 mM NaCl中，pH 7.5)血清穿過Sartoclean CA(0.8 μm)及Sartobran P(0.2 μm)過濾器帽。洗滌裝載於管柱上之預處理血清(10 mM TrisHCl，500 mM NaCl，0.05% Tween20，pH 7.5)，接著經Q-瓊脂糖凝膠電泳緩衝液處理，並於溫和溶析緩衝液(Thermo Scientific)中溶析，以避免分析物及吸附劑降解。為排除共結合之CFHR1，使來自免疫吸附劑之洗出液流經用於尺寸依賴性溶析之MonoQ管柱。純CFH在血清CFH值之Elecsys-ECLIA測試中作為用於測定CFH之校準物材料施加。

使用ECLIA免疫分析量測人類血清或血漿樣品中之CFH

CFH之ECLIA免疫分析經研發以使用Elecsys®分析儀具體量測人類血清或血漿樣品中之CFH。

以下闡述使用Elecsys®分析儀測定CFH之分析程序。

Elecsys CFH免疫分析係經由夾心原理起作用之電化學發光免疫分析(ECLIA)。該分析中包括兩種抗體-單株抗CFH抗體L20/3-Bi(捕獲抗體)之生物素化Fab片段及釕標記之單株抗CFH抗體OX-24-Bi Ru(檢測抗體)-其與樣品中之CFH形成夾心式免疫分析複合物。然後使複合物與鏈黴抗生物素塗覆之固相微米粒子結合。微米粒子以磁性方式捕獲至電極之表面上，且向電極施加電壓誘導化學發光發射，化學發光發射係藉由讀出用之光電倍增器量測。經由儀器專用校準曲線確定結果，該校準曲線係藉由2點校準及經由試劑條碼曲線所之提供主曲線產生。實施該分析所需之總時間係18分鐘。

將樣品以1：400自動稀釋於用於Elecsys之多項分析稀釋劑(Roche 03609987-190)中。遵照所應用之分析方案2，使均存於反應緩衝液(Hepes50 mM，NaCl 150 mM；Thesit/Polidocanol 0.1%；EDTA 1 mM；牛血清白蛋白0.5%)中之為1.5 μg/ml之80 μl生物素化<CFH,CFHR1>-L20/3及為1.5 μg/ml之80 μl釕標記<CFH>-OX24與10 μl樣品一起培育。在培育期間，形成與微米粒子結合之抗體-分析物-抗體夾心結構。最後，將微米粒子轉移至Elecsys 系統之檢測室中用於信號產生及讀出。為了校準，在多項分析稀釋劑中製備1：4稀釋系列之經純化CFH(1.25 μg/ml、312.5 ng/ml、78.1 ng/ml、19.5 ng/ml、0 ng/ml)(500 μg/ml、125 μg/ml、31.25 μg/ml、7.81 μg/ml、0 μg/ml)。校準曲線之方程係藉由非線性最小平方曲線擬合(RCM-Rodbard)計算並用於將信號讀出轉換成相應濃度值。使結果乘以預稀釋因子，從而得到各別樣品本身之濃度。

藉由量測可能使血清組份交叉反應之不同濃度來測定所施加之抗體夾心結構之交叉反應性。對於所施加之抗體夾心結構，已測定CFHR1之交叉反應性為2.9%。

對2期GRI精神分裂症試驗之血清樣品中所量測之CFHR1/CFH比率之量測證實自然截止值

利用CFHR1及CFH ECLIA免疫分析獨立地量測CFHR1濃度及CFH濃度並允許計算CFHR1/CFH比率。與圖1中所顯示之單獨CFHR1濃度類似，CFHR1/CFH比率顯示與CFHR1基因之缺失狀態相關之多峰分佈。

圖5顯示II期血清樣品中CFHR1/CFH比率之分佈。已識別三個群組：

．CFHR1/CFH比率低於0.01之群組，其與攜帶CFHR1之純合子缺失之群組相關且從而不表現CFHR1。所量測之殘餘信號係由CFHR1 ECLIA免疫分析之與CFH之低交叉反應性所致。

．CFHR1/CFH比率高於0.01且低於0.08之群組。此群組攜帶CFHR1之雜合子缺失。

．CHFR1/CFH比率高於0.08之群組。此群組不攜帶CFHR1之缺失。

使用CFHR1/CFH比率之患者分層

分析圖5中所顯示三個群組中之每一群組內之CFHR1/CFH比率與治療反應之關聯。出於此目的，低於0.01之CFHR1/CFH比率稱為低(「L」)，高於0.01且低於0.08之CFHR1/CFH比率稱為中等(「M」)，且高於0.08之CFHR1/CFH比率稱為高(「H」)。

圖6顯示對負性症狀反應者率之臨床總體印象(CGI)之分析：為分析CGI反應者率，彼等「改善」或「極大改善」之患者定義為反應者：整個血清子群中所有四個治療組之反應率表示為白色條紋背景條，且對於CFHR1/CFH比率子群L、M及H表示為灰色條。對於L群組，安慰劑組及10 mg及30 mg組之反應率係0%，而60 mg組中反應為100%。L群組係由小樣品尺寸組成，且從而結果需要慎重解釋。對於M子群，安慰劑組中為24%且60 mg組中為25%之反應率與未分層群組(陰影條，對於安慰劑為20%且對於60 mg組為34%)相當。然而，在10 mg及30 mg組中，與具有39%(對於10 mg)及45%(對於30 mg)之未分層群組相比，M子群顯示較低反應率，19%(對於10 mg)及28%(對於30 mg)。H子群顯示對於安慰劑組為20%且對於60 mg組為33%之反應率，其與未分層群組為20%(對於安慰劑)及34%(對於60 mg)之反應率相當。在兩個治療組10 mg組及30 mg組中， H子群顯示增加之治療反應率：對於10 mg組，與未分層群組之39%相比，H子群為69%之反應率，且對於30 mg組，與未分層群組之45%相比，H子群為67%之反應率。

DNA樣品之製備

自已提供關於收集及使用DNA樣品用於探索性生物標記分析之書面同意書的患者(320個患者中之170個)收集DNA樣品。以全血形式收集DNA樣品，將其收集於9 ml EDTA管中並儲存於-20℃下。對DNA樣品進行雙重編碼並注明姓名。使用Roche MagNA Pure 96 LC DNA分離系統自50-200 μL全血樣品提取基因組DNA。DNA分離之原理係基於磁珠技術。簡言之，首先藉由與含有離液鹽及蛋白酶K之緩衝液一起培育來溶解樣品，且然後添加磁性玻璃粒子(MGP)，且DNA與其表面結合。藉由若干洗滌步驟移除未結合之物質，且溶析經純化DNA。使用分光光度定量將所得DNA正規化至5 ng/μl之濃度。

測定CFHR1拷貝數之分析

定量即時PCR分析經設定以測定於染色體1：196796257-196796381(根據Genome 37版本Assembly GRCh37之座標)處之基因組位置處之拷貝數。寡核苷酸序列係在Seq.Id.No.8、Seq.Id.No.9及Seq.Id.No.10中給出。在5'端利用5'-螢光黃且在3'端利用3'端BlackHoleTM Dark Quencher-1修飾螢光探針。

參照利用可分離螢光報告基因標記之分析設定此CFHR1拷貝數分析，該可分離螢光報告基因檢測已知二倍體基因體中存在兩個拷貝之序列。作為參考分析，分別採用針對RNA酶P H1 RNA及hTERT基因之TaqMan拷貝數參考分析(Life Technologies,Carlsbad,California)。若自使用RNA酶P及hTERT參考分析之獨立雙重設置所得之CFHR1拷貝數匹配，則認為結果有效。

PCR反應含有最終濃度為0.9 μM之PCR寡核苷酸及最終濃度為0.25 μM之探針寡核苷酸。使用LightCyclerR 480 II即時PCR系統及以下循環參數實施即時PCR反應：10 min 95℃，40×[15 sec 95℃,1 min 60℃]，1 min 40℃。採用「絕對定量/二次導數最大值」儀器設置，計算臨限循環(C_T )值。使用比較相對定量分析△△CT[10]計算CFHR1標靶序列之拷貝數。

作為CFHR1之拷貝數之外部參考，使用來自細胞系NA07000(Coriell Institute for Medical Research,Camden,New Jersey)之DNA，其經闡述在CFHR3-1缺失內之位置處具有兩個拷貝[11]。在經闡述在CFHR3-CFHR1基因座處具有一個或零個拷貝之多個細胞系上測試該分析[11]，且證實該分析之特異性。

測定rs7542235之分析

DNA樣品係根據製造程序使用來自Illumina之Human 1M-Duo Beadchip(第3版)之基因型。然後分析樣品之SNP rs 7542235。

CFHR1拷貝數與多核苷酸多態性rs7542235之相關性

位於基因組位置Chr 1：196823613(Genome 37版本， Assembly GRCh37)之多核苷酸多態性(SNP)rs7542235已闡述為常見CFHR1-CFHR3缺失之代替[12]。顯示此關聯對於歐洲祖先種族之個體而言極高(r2=1.00)，但對於其他族群而言較不緊密[5、9]。

表3顯示定製拷貝數差異分析與SNP rs7542235等位基因之相關性：與文獻一致，主要A/A等位基因標記兩個CFHR1拷貝(表示為CFHR1 +/+)，等位基因A/G標記一個CFHR1拷貝(表示為CFHR1 +/-)且次要等位基因G/G標記零個CFHR1拷貝(表示為CFHR1 -/-)。

值得注意的係，具有CFHR1 -/-及rs7542235 A/A等位基因之兩個樣品為黑色非西班牙種族(non-hispanic ethnicity)，且具有CFHR1 +/-及rs7542235 A/A等位基因之5個患者中之4個為非歐洲種族。

CFHR1拷貝數與CFHR1蛋白質濃度之相關性

圖7顯示遺傳CFHR1狀態對使用RBM分析(故主要檢測CFHR1)所量測之蛋白質濃度之盒狀圖：CFHR1 +/+遺傳狀態與高CFHR1血清濃度相關，CFHR1 +/-遺傳狀態與較低CFHR1血清濃度相關，且CFHR1 -/-遺傳狀態與最低蛋白質信號(由該分析之與CFH之交叉反應性引起)相關。

SNP rs 7542235與CFHR1蛋白質濃度之相關性

圖8顯示SNP rs 7542235之等位基因狀態對使用RBM分析(故主要檢測CFHR1)所量測之蛋白質濃度之盒狀圖：rs7542235等位基因A/A與高CFHR1血清濃度相關，rs7542235等位基因A/G與較低CFHR1血清濃度相關，且 rs7542235等位基因A/A與最低蛋白質信號(由該分析之與CFH之交叉反應性引起)相關。

使用CFHR1遺傳分析之患者分層

圖9顯示對負性症狀反應者率之臨床總體印象(CGI)之分析：為分析CGI反應者率，彼等「改善」或「極大改善」之患者定義為反應者：彼等對DNA樣品同意之患者之反應率表示為白色條紋背景條，且對於CFHR1遺傳狀態表示為灰色條。對於10 mg組，與未分層群組之39%相比，CFHR1 +/+群組之反應率係57%，且對於30 mg組，與未分層群組之46%相比，CFHR1 +/+群組之反應率係67%。

序列(SEQ ID)之說明：

Seq.Id.No.1 ：顯示人類補體因子H之蛋白質序列。

Seq.Id.No.2 ：顯示人類補體因子H相關蛋白質CFHR1之蛋白質序列。

Seq.Id.No.3 ：顯示人類補體因子H相關蛋白質CFHR2之蛋白質序列。

Seq.Id.No.4 ：顯示人類補體因子H相關蛋白質CFHR3之蛋白質序列。

Seq.Id.No.5 ：顯示人類補體因子H相關蛋白質CFHR4A之蛋白質序列。

Seq.Id.No.6 ：顯示人類補體因子H相關蛋白質CFHR4B之蛋白質序列。

Seq.Id.No.7 ：顯示人類補體因子H相關蛋白質CFHR5之蛋白質序列。

Seq.Id.No.8 顯示定製CFHR1拷貝數分析中所用正向引子之寡核苷酸序列。

Seq.Id.No.9 顯示定製CFHR1拷貝數分析中所用之反向引子寡核苷酸序列。

Seq.Id.No.10 顯示定製CFHR1拷貝數分析中所用探針之寡核苷酸序列。

CFHR1低係基線CFHR1血清濃度28 μg/ml之患者，CFHR1高群組係基線CFHR1血清濃度>28 μg/ml之患者。

使用ECLIA CFHR1分析測定CFHR1。

參考文獻

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圖1 ：II期血清基線樣品中之CFHR1濃度之直方圖。三個曲線顯示來自叢集演算法(高斯(Gaussian)混合)之機率密度估算值。叢集分析基於CFHR1表現之遺傳狀態假設3個不同濃度群組。可使用CFHR1 ECLIA免疫分析確定2個自然截止值：在8 μg/ml下及在28 μg/ml下。28 μg/ml截止值(經箭頭標記)將具有CFHR1雜合子或純合子缺失之患者與彼等不攜帶缺失者分開，並用於患者分層。

圖2： 在所有患者(上圖)中及在低CFHR1-患者(中圖)及高CFHR1患者(下圖)中，PANSS負性症狀因素得分相對於基線之變化，其中使用CFHR1之自然截止值。將血清濃度28 μg/ml之患者分類為低CFHR1，且將血清濃度>28 μg/ml之患者分類為高CFHR1。預期反應之估算值及標準誤差條來自MMRM分析。點劃線及圓圈為安慰劑；實線及正方形為10 mg GRI；實線及指向上方之三角形為30 mg GRI；虛線及菱形為60 mg GRI。

圖3 ：對分PANSS負性症狀因素得分在第8週之反應率(反應定義為自基線下降20%)。陰影背景條係整個符合方案群體之反應率。實心灰色條係使用CFHR1之自然截止值之CFHR1分層子群的反應率。

圖4 ：對分CGI-I負性症狀分級得分在第8週之反應率(反應定義為「顯著改善」或「極大改善」)。陰影背景條係整個符合方案群體之反應率。實心灰色條係使用CFHR1之自然截止值之CFHR1分層子群的反應率。

圖5 ：II期血清基線樣品中之CFHR1/CFH比率分佈之直方圖。三個曲線顯示來自叢集演算法(高斯混合)之機率密度估算值。叢集分析基於CFHR1表現之遺傳狀態假設3個不同濃度群組。可使用CFHR1/CFH比率(藉由ECLIA分析所量測)確定2個自然截止值：0.01及0.08。CFHR1/CFH比率低於0.01之樣品指示CFHR1純合子缺失，CFHR1/CFH比率高於0.01且低於0.08之樣品指示CFHR1雜合子缺失，且CFHR1/CFH比率高於0.08之樣品指示無CFHR1缺失。

圖6 ：對分CGI-I負性症狀分級得分在第8週之反應率(反應定義為「顯著改善」或「極大改善」)。陰影背景條係整個符合方案群體之反應率。實心灰色條係使用CFHR1/CFH比率之CFHR1分層子群之反應率，且L(低)對應於低於0.01之CFHR1/CFH比率，M(中等)對應於高於0.01且低於0.08之CFHR1/CFH比率，且H(高)對應於高於0.08之CFHR1/CFH比率。

圖7 ：使用RBM分析(確認CFHR1：CFH比率為10：1)得到之CFHR1基因之遺傳狀態對CFHR1蛋白質濃度。

圖8 ：使用RBM分析(確認CFHR1：CFH比率為10：1)得到之SNP rs7542235之等位基因狀態對CFHR1蛋白質濃度。

圖9 ：對分CGI-I負性症狀分級得分在第8週之反應率(反應定義為「顯著改善」或「極大改善」)。陰影背景條係來自彼等對DNA樣品同意者之整個符合方案群體之反應。實心灰色條係使用CFHR1等位基因之遺傳狀態之CFHR1分層子群的反應率。

<110> 赫孚孟拉羅股份有限公司

<120> 預測神經發育、神經的或神經精神性病症治療之臨床效益之方法

<130> 27353 WO

<150> EP11179058.0

<151> 2011-08-26

<160> 10

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1231

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 變體

<222> (62)..(62)

<223> V由I取代

<220>

<221> 變體

<222> (78)..(78)

<223> R由G取代

<220>

<221> 變體

<222> (127)..(127)

<223> R由L取代

<220>

<221> 變體

<222> (224)..(224)

<223> 胺基酸224遺失

<220>

<221> 變體

<222> (325)..(325)

<223> C由Y取代

<220>

<221> 變體

<222> (400)..(400)

<223> Q由K取代

<220>

<221> 變體

<222> (402)..(402)

<223> Y由H取代

<220>

<221> 變體

<222> (431)..(431)

<223> C由S取代

<220>

<221> 變體

<222> (446)..(449)

<223> KTCS由SFTL取代

<220>

<221> 變體

<222> (450)..(1231)

<223> 胺基酸450-1231遺失

<220>

<221> 變體

<222> (493)..(493)

<223> T由R取代

<220>

<221> 變體

<222> (536)..(536)

<223> C由R取代

<220>

<221> 變體

<222> (551)..(551)

<223> I由T取代

<220>

<221> 變體

<222> (567)..(567)

<223> R由G取代

<220>

<221> 變體

<222> (609)..(609)

<223> V由I取代

<220>

<221> 變體

<222> (630)..(630)

<223> C由W取代

<220>

<221> 變體

<222> (673)..(673)

<223> C由S或Y取代

<220>

<221> 變體

<222> (850)..(850)

<223> E由K取代

<220>

<221> 變體

<222> (890)..(890)

<223> S由I取代

<220>

<221> 變體

<222> (893)..(893)

<223> H由R取代

<220>

<221> 變體

<222> (915)..(915)

<223> C由S取代

<220>

<221> 變體

<222> (936)..(936)

<223> E由D取代

<220>

<221> 變體

<222> (950)..(950)

<223> Q由H取代

<220>

<221> 變體

<222> (951)..(951)

<223> Y由H取代

<220>

<221> 變體

<222> (956)..(956)

<223> T由M取代

<220>

<221> 變體

<222> (959)..(959)

<223> C由Y取代

<220>

<221> 變體

<222> (978)..(978)

<223> W由C取代

<220>

<221> 變體

<222> (997)..(997)

<223> N由T取代

<220>

<221> 變體

<222> (1007)..(1007)

<223> V由I或L取代

<220>

<221> 變體

<222> (1010)..(1010)

<223> A由T取代

<220>

<221> 變體

<222> (1017)..(1017)

<223> T由I取代

<220>

<221> 變體

<222> (1021)..(1021)

<223> Y由F取代

<220>

<221> 變體

<222> (1043)..(1043)

<223> C由R取代

<220>

<221> 變體

<222> (1050)..(1050)

<223> N由Y取代

<220>

<221> 變體

<222> (1059)..(1059)

<223> I由T取代

<220>

<221> 變體

<222> (1076)..(1076)

<223> Q由E取代

<220>

<221> 變體

<222> (1078)..(1078)

<223> R由S取代

<220>

<221> 變體

<222> (1119)..(1119)

<223> D由G取代

<220>

<221> 變體

<222> (1134)..(1134)

<223> V由G取代

<220>

<221> 變體

<222> (1142)..(1142)

<223> Y由D取代

<220>

<221> 變體

<222> (1143)..(1143)

<223> Q由E取代

<220>

<221> 變體

<222> (1157)..(1157)

<223> W由R取代

<220>

<221> 變體

<222> (1163)..(1163)

<223> C由W取代

<220>

<221> 變體

<222> (1169)..(1169)

<223> I由L取代

<220>

<221> 變體

<222> (1183)..(1183)

<223> W由C、L或R取代

<220>

<221> 變體

<222> (1184)..(1184)

<223> T由R取代

<220>

<221> 變體

<222> (1189)..(1189)

<223> L由R取代

<220>

<221> 變體

<222> (1191)..(1191)

<223> S由L取代

<220>

<221> 變體

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<223> G由D取代

<220>

<221> 變體

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<221> 變體

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<223> E由A取代

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<221> 變體

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<221> 變體

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<220>

<221> 變體

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<220>

<221> 變體

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<223> YPTCAKR由FQS取代

<220>

<221> 變體

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<223> P由S取代

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<220>

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<223> H由Y取代

<220>

<221> 變體

<222> (159)..(159)

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<220>

<221> 變體

<222> (175)..(175)

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<220>

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<223> 胺基酸144-171由S取代

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<213> 智人

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<211> 569

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 變體

<222> (46)..(46)

<223> P由S取代

<220>

<221> 變體

<222> (216)..(216)

<223> N由S取代

<220>

<221> 變體

<222> (277)..(277)

<223> Y由N取代

<220>

<221> 變體

<222> (356)..(356)

<223> R由H取代

<220>

<221> 變體

<222> (379)..(379)

<223> V由L取代

<220>

<221> 變體

<222> (521)..(521)

<223> L由I取代

<220>

<221> 變體

<222> (529)..(529)

<223> L由R取代

<400> 7

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 8

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 9

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸探針

<400> 10

Claims

一種預測患有精神分裂症之負性或正性症狀之患者若利用甘胺酸再吸收抑制劑(GRI)治療之反應的活體外方法，其包含以下步驟i)測定患者之樣品中補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之蛋白質濃度，ii)將步驟i)中所測定之該蛋白質濃度與代表患有精神分裂症之負性或正性症狀之患者中補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之蛋白質濃度的值相比較，iii)其中該患有精神分裂症之負性或正性症狀之患者之該樣品中補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之蛋白質濃度較高時表示該患者將自此治療獲得臨床效益，及iv)選擇此治療用於患有精神分裂症之負性或正性症狀之患者。
如請求項1之活體外方法，其中該補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之該蛋白質濃度係藉由基於ELISA之技術來測定。
如請求項1之活體外方法，其中藉由量測補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之遺傳變體來測定補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之蛋白質濃度。
如請求項3之活體外方法，其中補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之該蛋白質濃度係經由量測CFHR1之拷貝數差異或藉由量測作為缺失替代物之SNP，從而量測CFHR1之遺傳變體來測定。
如請求項1至4中任一項之活體外方法，其中該患者罹患情感性分裂症。
如請求項1至4中任一項之活體外方法，其中該甘胺酸再吸收抑制劑係[4-(3-氟-5-三氟甲基-吡啶-2-基)-六氫吡嗪-1-基]-[5-甲磺醯基-2-[[(2S)-1,1,1-三氟丙-2-基]氧基]苯基]甲酮。
一種特異性結合補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之抗體於如請求項1至4中任一項之方法中之用途。
一種補體因子H相關蛋白質1(CFHR1)之蛋白質之用途，其用作接受甘胺酸再吸收抑制劑治療之患者之臨床效益的預測標記。